Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение функции гена insA в транспозиции элемента IS1

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение функции гена insA в транспозиции элемента IS1"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОЛШШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

ДУЖИИ Дмитрий Евгеньевич

ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИИ ГЕНАтзА В ТРАНСПОЗИЦИИ ЭЛЕМЕНТА 1Б1

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена в лаборатории генетики бактерий Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научные руководители:

проф., д. б. н. В. В. Суходолец к. б. н. В. Н. Данилевич

Официальные оппоненты:

д. б. н. Т. С. Ильина

к. б. н. В. А. Лившиц

Ведущее учреждение: Институт молекулярной генетики АН СССР.

Защита диссертации состоится « н » 1992 года

в часов на заседании Специализированного совета Д.025.01.01. при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный пр., д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке «ВНИИ Генетика».

Автореферат разослан « ^ » 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного ученого совета, кандидат биологических наук

В' И' ЩеРбаК°Ва

Актуальность теин. Транспозируемые элементы (ТЭ), к кото-рын относятся инсерциошше элемента (IS) и транспозоны (Til), представляют собой дискретные сегненты ДНК, способные к RecA-независиному перемещению из одного участка ДНК в другой как в пределах одного репликона, так и между различными репли-конами. Благодаря своей способности вызывать серьезные изменения в организации генома: объединение решшконов, делении и инверсии Фрагментов ДНК, дупликацию и анплиФикацию генов, ТЭ играют важную роль в эволюции живых организмов. Способность ТЭ вызывать геномные перестройки широко используется в генной инженерии. С этой точки зрения является актуальным изучение но-лекулярных механизмов транспозиции, оно важно также с чисто теоретической точки зрения - для понимания молекулярных механизмов сайт-специфической рекомбинации.

Состояние вопроса. Эленент IS1 длиной 768 н. п. является компонентом хромосомы Е. coli, а также плазмидных и Фаговых геномов. IS1 Фланкирован короткими инвертированными повторами <ИШ длиной 35 н.п. (ИД содержат сайта узнавания для Ферментов, вовлеченных в транспозицию) и в своей структуре содержит в открытых ранок считывания, кодирующих полипептиды длиной более 50 а. к. (рис. lHJaKowec et ai., 1988). Из них по данным ряда авторов в транспозиции эленента IS1 принимают участие три гена: insA, insB, й insC (Hachlda et al., 1982; JaKovec et al., 1988). Эти гены активны в шге-положении; два из них - insA и insB транскрибируются с одного пронотора. расположенного в левом инвертированном повторе (ИП); ген insC транскрибируется с конпленентарной нити ДНК, собственного промотора этот ген не имеет. По данным Ахмеда (Abmed, 1986), а также Данилевича и Костюченко (Данилевич, Костюченко, 1986) транспозиция элемента

ISJ и гостаьных транспозонов типа Тп9. состоящих из генв хло-рамФениколацетилтрансФеразы, фланкированного пряными повторами isit происходит решшкативным путем - через образование коин- • тегратных репликонов и их последующую диссоциацию (разрешение). По предварительным данным ген insC кодирует резолвазопо-добную Функцию (Braedt, 1988). Ген insB ответственен за образвание коинтегратов и, наиболее вероятно, кодирует транс-возазу (Hachida et al., 1982; JaKowec et al., 1988). Что же касается гена insA, то данные, полученные к началу нашей работа относительно его роли в транспозиции элемента IS1, нельзя было трактовать однозначно. Так, Начида с соавт. (Hachida et al., 1988), а также Хаковек с соавт. (JaKowec et al., 1988) получили в гене InsA ряд нутаций, приводящих к образованию внутри ранки считывания insA стоп-кодонов трансляции. Эти нутации вызывали снижение частоты образования коинтегратов, которое, однако, могло быть обусловлено полярным эффектом данных мутаций hi экспрессию гена insB (Brewster, Morgan, 1981).

Предметом нашего изучения, наряду с элементом IS1. явился транспозон Тп9'. Он принадлемгг к семейству транспозонов Тп9 и состоит из гена хдоранФениколадетилтрансФеразы, Фланкированного прямыни повторани элемента IS1 (рис. 2 ). По данный В. Н. Даниле -вича (Данидевич, 1987), транспозон Тп9' обладает способностью индуцировать эффективное разрешение опосредуемых нн коинтегратов и образование isi-прилежаиих деледий. Авторон был изолирован мутаятный вариант транспозона. Тп9' , обозначенный &Тп9', с деление» 50 н. п. центральной части у правой копии IS1, которая привела к стабилизации коинтегратов. сравнение свойств Тп9'идТп9' позволило предполоюпъ, что в делетированнон Фрагменте присутствует сигнал транскрипции, оказывающий влияние на

Ln.sE

Ш

тог.

"ЧВ!

зг

ЯГ

~?А9

а

т

Ьчк _

& . ^ШРК) 32$ 3?С 27 Ъ£

ииВ

ШВ'

¿ц(г

750 ~*?50

10!

Рис, 1. Открытые ранки считывания (ОРС), кодируемые элементом 1Э1. стрелкани показаны ОРС, кодирующие полипептгош длиной более 50 а. к., заштрихованннни треугольниками - концевые ИП эле-нента 151.

»ууумлллИ ^ 1 ) »ууууууууЬД ТПЗИ

Тп9

Б РЦ,

ГД I

щ

Б РР* Т О

1 , —и. 1пл

РЙгБ Е 5Я51С РЪ то'

т I . 11II.......м 1пз

рис. 2. рестриктазные карты транспозонов сенейства Тп9, Сокращения обозначают сайты узнавания рестриктаз: Р - РэН, Ру -руин, в - гаизл, е - есокь к - крш.

транспозюшонную активность правой копии эленента IS1. (Дани-левич и соавт.. 1990).

Дедь и задачи исследования. Целью работы являлось изучение Функции гена insA в транспозиции эленента IS1. В соответствии с этой целью были определены следующие задачи исследования:

I. Определить нукдеотидную последовательность сегмента ДНК из внутренней части транспозона Тп9\ прилежащего к правой копии эленента IS1, с целью выявления потенциальных сигналов транскрипции, влияющих на транспозиционную активность правой копии эленента IS1.

II. Сконструировать плазмида, производные PÜC19::Тп9' и PUC19:: IS1. содержащие олигонуклеотидные вставки различной длины в гене insA, сдвигающие, либо не сдвигающие ранку считывания.

III. Исследовать способность полученных мутантных вариантов злеиента ist н транспозона Тп9' образовывать простые гасерцик и коинтеграты.

IV. Изучить влияние олигонуклеотидных вставок в гене insA обеиз копий эленента IS1 транспозона Тп9' на разрешение коин-тегратов, опосредуемых Гп9*.

Научная новкзна результатов;

Определена нуклеотидная последовательность сегментов ДНК цент-

£

ральной части трансцозонов Тп9 и 'Гп9' ■ прилежащих к правой

ж

копии эленента IS1. Установлено, что транспозоны Тп9, Тп9 и Тп9' произошли из одного источника, показано, что ген insA несущественен для транспозиции элемента IS1 <Тп9'): в биплазмид-ной системе (pRP3.1)(риС19;:ТЭ) нутации в гене insA не влияют на частоту транспозшши элемента IS1 (Тп9'), в то вреня как в биплазнкдной системе (pRP3.1::ТЭ)(PUC19) они приводят к сни-

женик« частоты транспозиции ТЭ в 50 раз. Предложена модель Функционирования белка IrssA. По-випимоку, его роль заключается в пространственном сближении инвертированных повторов элемента ■ ТГИ на первом этапе транспозиции, показано, что иутзпии в г^не JnsA не подавлчг/г ррзолвазолодобную Функпир элемента TS1 : разрешение коинтегратов, опосредуемых мугянтннми транснозонами. происходит в основном "правильно", т, е, путем гомологичной рекомбинации между копияни ТЭ, присутствующими в составе коин-теграта. Установлено, что частота транспозиции элемента Тп9' дикого типа не зависит or структуры донорного репликона и от копийности ТЭ в клетке: в биллазмвдшвх системах (PRF3.1::ТЭ! (PÜC19) и (рЕРЗ. I ) (PUC19: :ТЭ) она одинакова.

Материалы и нетодн.

Бактериальные штакмн и пдазмиды. Использовали штамм» Е. coli К12: С600 rifR - устойчивый к рифамшишну нутант C&öO (ihr, leu, thl) (Bachniann, 1972); IIBíOi (met, pro, thi, r¿ m¿, str\ recA) (Bover, Rouland-Bussoix, 1969); AB1157 (thr, leu, thi. proA. his, arge, slrR) (Bachmann, 1972); TG1 (л(lac-pro), supe, thi, hsd /F'D5. traD36, proA+B+, lacl+). из коллекции ВНИИГенетика.

Плазниды: pRP3.1 (Тсг. йв1", Tra+, IncPi, Rep ) - делеци-онное Aps -производное RPltsia, содержит делению области з. 6 - 11. 5 т. п. н. карта RP1 (Данилевич и др., 1980); PBR322 (Арг, Тсг) - из коллекции ВНИИГенетика, pDK57(Cmr, Тсг) - производное PBR322 со вставкой травспозона Тп9' в точке с координатой 3350 н. п. (Данилевич, 1965); PUC19::IS1 (Арг) и püC19::Tn9' (Арг, СпГ) - инсерционные производные PUC19 со вставкой зле-

нента IS1 и транспозона Тп9' в один и тог же сайт с координатой 1600 п. н. - из коллекции В. Н. Данилевича.

Питательные среды, концентрации антибиотиков. Бактерии выращивали в бульоне и на агаре Хоттингера (производство ИЭН им. н. ф. Гамалеи), а также в L-бульоне и на L-arape (Ниллер, 1976). Клетки, несущие теннературо-чувствительную по репликации плаз-миду pRP3. 1 и ее производные, культивировали при 30°с.

Концентрации антибиотиков составляли: хлорамфеникола, ка-намицина - 25мкг/нл; тетрациклина - 20 нкг/нл; риФампицина, стрептомицина - too ккг/мл; айпицилина - 200 - 750 нкг/нл.

Нобилизация неконьюгативных плазмид. Клетки соответствующих биплазнидных штаммов, например, НВ101 (pRP3.1) (PUC19: :Тп9') ■ либо C.600(pRP3. 1) (PUC19::Тп9') рассевали на среде Хоттингера с добавками антибиотиков канамицина и ампициллина. По пять-семь колоний, выросших на этой среде, обьеди няли путем переноса петлей в пробирку с ю мл бульона Хотгин гера, суспендировали и скрашивали с аэрацией до титра 5-10 .

Одновременно до такой же плотности выращивали клетки реципиен-я.

тного штамма СбООгИ , либо АВ1157. Вырашенные культуры доноров и реципиента смешивали в отношении 1:10 и наносили из расчета 0,5 мл на чашки с агаром Хоттингера. Чашки инкубировали при зо°с в течение 18-24 ч, после чего газон выросших бактерии смывали Ь мл изотонического раствора хлорида натрия. Конымгационную снесь высевали затем из соответствующих разведении на чашки со стрептомицином и ампициллином (хлорамФенико-лом), а также стрептомипкнон и канямипином. и инкубировали при 30° С в течение ?А- чя ч, Частоту мобилизации маркера Арг либо

„ г

Cm определяли как отношение числа колонки транскончогзнтов

R R R.

Ар (Cm ), к числу колоний транс ко нь^га кто r № - Колонии

транпконьюгантов проверяли далее с поношью репликатора на наличке неселективннх плазкндных маркеров cmr (Ар11). Тс* и kmr. Аналогичнин образом с помошью' коньвгативных плазмид типа pRP3. 1::тп9' нобилизовали неконыогативную плазмиду pbr322.

ТрансФорнадия клеток плазниднои ДНК. Компетентные клетки получали по известному методу (Ledeberg, Cohen, 1974). Трансформацию проводили как описано Кослой и Оиши (Cosloy, Oishl, 1973).

Выделение и рестриктазный анализ плазнидной ДНК. Плазмид-ну» ДНК выделяли по методу Бирнбойна и Доли (Birnboim, Doly, 1979), а их растепление рестрикционными зндонуклеазами и электроФоретическое разделение Фрагментов ДНК проводили как описано наниатнсом с соавт. (йаниатис с соавт., 1984).

Извлечение Фрагмента ДНК из згарозного геля проводили методом электроэлюоии Шаниатис с соавт., 1984).

лигирование Фрагментов ДНК проводили в буфере: 66 мМ трис-НС1, pH 7,6; 6,6 мН HgC12, 10 мН дитиотрейтол, 6, бмНАТРв присутствии ДНК-лигазы Фага т4 при 12° С в течение 3-6 ч,

Синтез олиговуклеотидов 5'-6ATCTTGCA-3' и 5'-AGATCTGCA-3* проводился в лаб. В. П. Вейко с применением твердофазного ФосФо-анидатного метода (HcBride, Caruthers, 1983). '

ФосФорнлирование одигояуклеотидов проводили раздельно с помошью полинуклеотидкиназы Фага Т4 в буфере: 50 мН трис-НС1, pH 7,6; 0,1 НК ЭДТА, Г мН АТР.

Отхиг олигонуклеотидов проводили непосредственно после их фосфорилирования. Для этого реакционные смеси объединяли и полученный раствор нагревали до Ю0°С, затем плавно снижали температуру до 37сС (в течение 3 ч).

Инсердионный мутагенез элементов' IS1 в составе транспозона

Тп9\ Для получения производных плазмиды PüC19::Tn9' со вставками олигонуклеотидных дуплексов в сайты Pstl транспозона Тп9' составляли лигазную смесь, состоящую из: 1) векторной плазмиды pUC19::IS1 (рис.4), частично расщепленной рестрикта-зой Pstl, 2) Pstl-Фрагмента транспозона Тп9', содержащего ген cat, выделенного с применением метода электроэлюдии из плазмиды PUC19: :Тп9'(рис, 4) и 3) олигонуклеотидиого дудлекса. Компоненты брали соответственно в молярном соотношении 1:1:50. Ли-газной смесью трансформировали клетки штамма TG1. Отбор транс-Форнантов проводили на полноценной питательной среде, содержащей клорамФеникол. Из клеток полученных трансФормантов выделяли плазмидные ДНК, Плазмиды, подвижность которых при электрофорезе соответствовала подвижности PUC19::Тп9\ анализировали далее с помошъю рестриктазы Bglll. Окончательную структуру рекомбинантных плазмид» содержащих два сайта Dg III (образующих Bglll-фрагмент размером 2,1 т. я. п. ), устанавливали с помошы» рестриктаз Pstl, EcoRI, BamHI, SPhI и некоторых их сочетаний.

Определение нукдеотидной последовательности ДНК проводили по методу Наксаиа и Гилберта (Haxam, Gilbert, 1980) в модификации Чувпило и Кравченко (Чувпило, Кравченко, 1983), а также Сенгера (Sanger, Coulson, 1977).

Результаты и обсуждение,

I. Анализ нукдеотидной последовательности сегмента ДНК из внутренней части транспозона TtiQ', прилегашего к правой копии элемента IS1.

а

Тп9

5 • -цсдотат(;Ассот|;т(зсттстсАДАтесст8сст(}Д(К}сс*стттег;ттАедстстсс-з ■ -сСтТсаса стадс д с а са д а о а еттт а сое а со<з а стсса&тс а а а сс}а а тсса д о д«; -

" ' &шЗА '

ссстасас<?таатааттоас(;атат0атс"»тттаттстс;сстсссачассс5атааааасе-азс д сстсс дтт дтта дотает атастдс;та дат а 4аасг,одаг,с;тстсчостаттттт5с-

слтд^сасосесзеттед АТттттсд^геттссоастАдсизсто-додсдттсстаттсдасс;-С д АТСССЙСССССААСТТАА А А АОТСОСАДОССС&АТТСССАСТССйТААОСАСАА&ТСОС-

с а айссодсстат а а а йсоад' i i а[ сксттт а сссвтассстт д гттсв д тсос д стад« а -о-ттсочсссе а т а тттсесаоАтддса а а дтдедс а ситед д тщд^сщдбс^те а стст -

Ж М , Р** ш',

ААСДТДС'АвСГСТТТААТАТО^АдСТа'АССвСТЧТАТСОеЧвСвАйачдааТААТ^АСТСС-ТТ5ТАТетса*(5АААТТАТАСвТСвДСТадС13АСДТА5ССССдСТСССТССАТТАСТ&А1;е-

25V

ААСТТАТТСАТА&ТОТТТ-З• ТТаААТААСТАТСАСААА-5'

300

5 ■ - д й сас а л ассооаст д т д а а еседд тт а тсксттт д сссс твссстт дггттсв а/гсос --тсцскттсаессс&Атдтттсасагд дтА1жеАААтеадсАС£(МААТ1АААс;ст|Адда-

Ш

2 00

Рм1

. ЛиГ

а стала А ААСАТАСА^СТСТТТА АТАтесАОСте"асс<;стйтатсад<?с;сеа<}(5(5АТА А АЙ-ТСАСТСТТтеТАТЧТСЧАвАААТТАТАСЧТСйДСТйаСЧАСАТАвССССасТСССТАТТТС-

•-гь'Тг' про!

-35" РЗ

250

ж.

-а'Рг

"ю-рь

а дтдгтвСАа сатвсабессайтар ЩтТЯт гдстесдесзсбстст^агсасса вдатАСс-

тт а тталс&тткта С9ТСС®»тс а трдса ат1а1ас(^с&тс(^6ссасаст1а6тс<у11ссс а тед-

33)

евАААЙССбЧТТСвеТААТйАСТССААСТТАТТСАТАбТСТТТТАТеТТСАЧАТААТаССС-

ОСТТТС5(}ССААСССАТТАСТеАееТТвДАТААСТАТСАСАДААТДСАА(?ТСТАТТАС60<т-,

САТ0АСТТТ5ТСАТ(}СА0СТССАСС0АТТТТС;Д6ААССАСАССС-3 ' СТАСТЦА А АСАаТАС5ТСвАГ,г;ТОЦСТА А ААСТСТТОСТаТСОС- 5 '

45»

Рис. з. нуклеотидные последовательности центральной части *

транспозонов Тп9 и Тп9\ граничащей с правой копией элемента 151: а) секвенированная область Тп9 . б) секвенированная область Тп9'. 44-ый нуклеотид секвенированной последовательности соответствует 1102-ому нуклеотиду внутренней части тп9.

Для выявления потенциальных сигналов транскрипции, влиявших на транспозиционную активность правой копии TS1 траяспозона Тп9' нани была определена нуклеотидная последовательность (НИ)

сегмента ДНК длиной -200 н. в. из центральной части транспозона Тп9\ прилежашего к правой копии элеиента IS1 Срис. 3). Одновременно была определена НП ("300 н. п. ) соответствующего сегмента ДНК из центральной части транспозона Тю9 , который по данный рестриктазного анализа длиннее транспозона Тп9. но короче Тп9' (рис.?.). Как оказалось, НП всех трех транспозо-нов перекрываются, что свидетельствует об общности их происхождения (рис.3).

При компьютерном анализе определенной нани НП на предмет наличия терминаторов транскрипции таких последовательностей обнаружено не было. Для поиска потенциальных промоторов были использованы два различных иатематических подхода (Harley, Reynolds, 1987; Alexaridrov, Hironov, 1990). В области длиной 60 н, п,, прилехашей к иравой копии IS1 было обнаружено две таких последовательности: Р2 и РЗ. Р2 определяет транскрипцию в сторону гена cat, РЗ - в сторону элеиента IS1.- Кроне того, на расстояний 130 н. п. от правой копии IS1 был обнаружен пронотор Р1, определяющий транскрипцию в сторону гена cat. Наибольшую кореллячию с консенсусной промогорной последовательностью ("-35" - TTGACA, "-10" - ТАТМТ) обнаружил пронотор Р1, нень-шую - пронотор РЗ, нинимальную - промотор Р2 (рис. 3).

Расположение обнаруженных промоторов в структуре транспозона Гп9' обьясняет транспозиционные свойства транспозонов Тп9'илТп9'. Согласно данным Бредта проявление зленентон IS1 резолвазной активности зависит от эффективной транскрипции элемента с Енешшх промоторов (Braedt. 1988). Наличие в транс-

позоне Тп9' промотора РЗ способствует транскрипции генов правой кошм эленента IS1. в частности, определяет экспрессию гена insC, кодирующего резолвазо-подобную Функцию (рис. 3 ). Это должно способствовать большей нестабильности коинтегратов, опосредуемых Тп9' по сравнению с делеционнын вариантом Тп9\ в структуре которого промотор РЗ отсутствует, а сквозная транскрипция правой копии IS1 с cat-промотора, видино, ингибируется встречной транскрипцией с промотора PI.

2. Инсерционный мутагенез гена insA в составе элемента isi.

Для выяснения роли гена insA как в образовании, так и в разрешении коинтегратов, опосредуемых элементом ISi(Tn9*), мы провели инсерционный мутагенез гена insA в составе обеих копий элемента IS1 транспозона Тп9' коротки® олигонуклеотидныии дуплексами длиной 9 н. п. (рис.5). Эти вставки не сдвигают рамку считывания и, таким образом, не могут оказать полярного эффекта на транскрипцию гена insB, расположенного дистальнее и существенного для образования коинтегратов. 9-звенные дуплексы получали отжигом двух 9-звенных олигонуклеотидов. В своей структуре дуплексы содержат сайт узнавания для рестриктазы Bglll (рис. 5), Кроме того, они содержат липкие концы 3*-ACGT, образуемые при растеплении ДНК рестриктазой Pstl. и поэтому иогут быть лигированы с Pstl-фрагнентами плазниды PUC19::Tn9J(рис.4). При лигировании структура сайта Pstl у одного из концов дуплекса не восстанавливается из-за несоответствия его НП структуре сайта Pstl (рис. 5а). Для внедрения дуплексов одновременно в оба сайта Pstl транспозона Тп9' в лигазной снеси использовалось 50-кратное превышение молярной

почнлинсар (Н

Рис. РестРиктазные карты пяазиид PUC19::Тп9' и PUC19::ist, использованных для инсерщкжного мутагенеза гена insA в структуре элементов IS5 и Тп9'

. ** _

л ш

¿а^сШШЗЩЬ'д'

$ BsSE

5ЫосаШШШ

з'4дШСПШса-5г . Pstl

* М® ^

з^дШШСфз'

з'^СЩкксййя-з' ш т

Рис. 5, Альтернативные структуры, образующиеся в ходе операции по укорочению полимерных вставок 9-звенного олигонуклеотидного дуплекса, встроенных в сайты Pstl обеих копий ist в составе плазмиды PUC19::Тп9'/Х: а,б) альтернативные ориентации исходного 9-звенного дуплекса, в) 10-звешшй дуплекс (сайт Pstl отсутствует), г) 8-звенныа дуплекс, содержаний два сайта Pstl.

конпектрэции дуплекса над векторной ДНК и ДНК транспорта Тп9'. При такой концентрации эффективно идет полимеризация дуплексов. Лигирутаей смесью трансформировали клетки штамма TG1. Отбор рекомбиначтнчх плазмид вели с помощью рестриктазно-го анализа плазнидной ДНК, выделенной из большого числа транс -Формантов с Фенотипом Стй. Таким образом была отобрана ллазми-да с олигонуклеотиднши вставками неизвестной длины в обеих копиях элемента TS1, Эту пяэзмиду обозначили PUC19::Тп9'/Х. С целью получения мономерных вставок эта плазмида была обработана избыточным количеством рестриктазы Bglll и подвергнута повторному лигированио.. При этом нами была получена плазмида PUCJ9:: Тп9'/10, утратившая в правой копии IS1 трансцозона сайт Pstl. Утрата сайта Pstl могла произойти только в результате образования гибридного 10-звенного дуплекса, структура которого приведена на рис.5в. Этот дуплекс состоит из двух одинаковых BglII-половинок исходного 9 -звенного дуплекса у которых нарушена структура сайта Pstl. В левой копии IS1 плазмиды PUC19::Тп9'/10 сохранились оба сайта - Pstl и Bglll. По этой причине однозначно установить структуру вставки на основе данных рестриктазного анализа не удалось. В дальнейшем нами была изолирована плазмида PUC19::IS1/10, содержащая в своей структуре правую копию элемента IS1/10 транспозона Тп9'/10, а также плазмида PUC19::IS1/9, содержащая в своей структуре мономерную вставку исходного 9-звенного дуплекса. Плазмиду PÜC19::IS1/9 получили путем самолигнрования большего из двух Bglll-Фрагментов плазмиды рис19::Тп9'/Х, Структуру олигонуклеотидной вставки в PUC19::IS1/9 определили на основании данных рестриктазного анализа.

3. Изучение транспозиционных характеристик инсерционных производных Тп9' и IS1 в биндазмидных системах Е, со 1 i (pRP3.1) (PUC19: :Tn9') и (PRF3, i) (PÜC19: :ISi).

Для выяснения роли гена insA в транспозиции элемента ISi и транспозона Тп9' была изучена способность нутантных вариантов элемента ISl(Tii9') вызывать образование коинтегратов между плазмидами типа PüC19::T3 и конъюгативной плазмидой pRP3.1, а также простых инсерции типа pRP3. 1::Тп9'.

Для этого были проведены опыты по мобилизации производных pUCi 9 со вставками мутантных элементов с помощью коньюгативной плазмкды pRP3.1. В контрольных экспериментах с помощь» PRP3.1 мобилизовали PUC19::ISi и pUC19::Тп9' Поскольку puc19 являет ся неконьюгативной mob- плазмидой, мобилизация ее производных осуществляется исключительно за счет коинтегратов, опосредуемых соответствующим элементом IS1 или транспозонои (Данилевич, 1985). Эксперимента по мобилизации позволяют также количественно оценить частоту образования простых инсерций Тп9' при транспозиции из PUC19 в PRP3.1.

Клетки сконструированных нами биплазнидных штамнов Е. col i (гесА или гес+), несущих pRP3. 1 и одну из инсерционных производных PUC19, скрещивали на агаризованной среде с соответствующим бесплазмиднш реципиентом Е. coll (гес+ штаммон СбОО или ABl 157). Селекцию трансконьюгантов проводили параллельно 1) по маркеру Арг плазниды PUC19 Н) по маркеру Cmr транспозона Тп9' и по маркеру плазниды pRP3.1. Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Частота мобилизации плазмид типа pUC 19: :тп9' (Ар1" сиГ) и PUC19::IS1(Арг), содержащих различные варианты транспозона Тп9* и эяенента IS1, с помощью коныогативной плазмиды р8РЗ. 1 на перенос из донорного штамма в рецишентный

Донорияй штамм !Реципиент-!ннй штамм ! Мобилизуемая ! плазнида Частоты мобилизации » ! плазмид по маркерам !

Арг сшг !

!PUC19;:Тп9' ! г, гчо"7 з,я»ю"7 !

НВ101 (гесА ) • С-бОО ! (гес+) !pUC19::Tn9V10! 1, 6»!0"7 г, 9*ю~? :

!pUC19::Тп9'/Х : г,г*ю"? з,г«ю~7 :

!ptiC19::ISl ! г,о»ю"? !

!PUC19:: IS1/9 ! 1.3*10"7 !

'.PUC19:: IS1/10 0,6*10"? !

СбОО (гес+) ! АВ1157 ! (гес+) '.pUC19::Tn9' ! 0,7*10~7 1.2И0"7 !

¡PUC19::Tn9'/10! 1,2И0"7 1.7»Ю"7 !

'•PUC19".: Tll9'/X ! г,9*ю"7 4,б*10"7 !

»

представленные значения частот являются усредненными по данным нескольких (от трех до шести) независимых скрещиваний. Среднеквадратичная ошибка во всех случаях не превышала 3М.

1 I

Как видно из табл. 1, частота транспозиции нутантных элементов тп9' и 151 и соответствующих элементов дикого типа практически не отличаются в штамне НВ101гесА. Исключением яв-

ляется элемент ISl/iO, где частота транспозиции в три раза ни-хе по сравнению с элементом IS1 дикого типа. Вставка 10-звен-ного олигонукпеотидного дуплекса в сайт Pstl элемента IS1 приводит к сдвигу ранки считывания insA и образованию стоп-ко-дона трансляции в районе. 226-228 н. п.. Таким образом, данная мутация затрагивает более половины гена InsA и наиболее вероятно долхна привести к его инактивации. Незначительное снижение частота транспозиции элемента IS1, наблюдаемое в случае данной мутации, видимо, обусловлено ее полярным эффектом на экспрессию гена insB, расположенного дистальнее и сушественно-го для транспозиции. Полученные нами данные свидетельствуют о несущественности гена insA в транспозиции элемента IS1, Их от личие от данных, полученных другими авторами; наблюдавшими при инактивации гена msA значительное снихение частоты транспозиции эленента IS1 (~в 100 раз), возможно, явилось следствием уникальности использованной в нашен эксперименте биплазмидной системы (рЕРЗ, 1)(PUC19::ТЭ). Для выяснения этого вопроса было решено изучить транспозиционные свойства мутантных вариантов транспозона Тп9' в биплазмидных системах иного типа - (рЕРЗ. 1: :ТЭ) (PBR322) и (рЕРЗ. 1: :ТЭ) (РУС19) (см. ниже).

Ны исследовали такхе влияние гес -генотипа на частоту

транспозиции мутантных транспозонов. Как видно из табл. 1 в

гес+ штамие С&ОО внесто охидаеиого уменьшения частоты нобилиза-г

ции маркеров Ар и Сш при инактивации гена msA наблюдается ее увеличение в 1,5-2 раза в случае транспозона Тп9'/ю и в 4 раза в случае транспозона Тп9'/Х. Наблюдаемый рост частоты транспозиции при увеличении длины олигонуклеотидных вставок (копии IS1 эленента Тп9'/10 содержат мономерные олигонукпео-тидные вставки, а копии IS1 эленента Тп9'/Х - полинернне

вставки 9-звенного дуплекса), видимо, объясняется участием белка RecA в гомологичном спаривании олигонукпеотидных вставок, что облегчает сближение концевых ИП нутантных транспозо-нов, необходимое на первой стадии транспозиции.

4. Изучение транспозиционных характеристик различных вариантов транспозона Тп9' в биплазмидных системах Е. coli типа (pRP3. 1: :Tn9') (PBF322) и (pRP3. 1: :Tn9') (PÜC19).

Для более полного изучения свойств различных вариантов транспозона Тп9' мы исследовали их способность к образованию коинтегратов в биплазмидных системах типа (PRP3. i: :Tn9')(PBR322) и (PRP3,1::Tn9')(PUC19), где транспозон находится на коньюга-тивной плазмиде pRP3. 1. в эксперименте были использованы плазмиды PRF311, PRP3101 и PRP31X1» содержащие простые инсерции транспозонов Тп9', Тп9'/10 и Тп9'/Х в пределах гена Kan, а также плазмиды PRP312, PRP3102 и PRP31X2 с инсерциями этих же транспозонов вне гена Кап, соответственно. Все шесть плазмид были получены в независимых скрещиваниях штамна НВЮ1 , содержащего коньюгативную плазииду pRP3.1 и одну из неконызгативных плазмид: PUC19::Tn9', PUC19: :Tn9V10 или PÜC19::Тп9'/Х с реципиентом С600 rif*;. Структуру этих плазмид детально не исследовали.

С помощью указанных инсерционных производных плазниды

pRP3.1 проводили мобилизацию плазмид PBR322 или PÜC19 из клев

ток донорного штамма С600 rif в клетки реципиентного штамма ABl157. Селекцию транскокъюгантов проводили на агаре Хоттинге-ра, содержащем антибиотики 1) ампициллин + стрептомицин, а также 2) хлорамФеникол + стрептомицин. Частоту мобилизации

плазмиды PBR322 или PÜC19 определяли как отношение числа

в

транскоьюгантов с Фенотипои Ар к числу транскоьюгантов, имею-

о

щих Фенотип Cm . Полученные данные представлены в табл. 2.

Таблица 2.

Частоты мобилизации плазмид pBR322(Apf") и pUC19(Apr') с помощью производных конъюгативной плазниды pRP3. 1, содержащих инсерции транспозонов Тп9'. Тп9'/10 и Тп9'/Х, из донорного

и

штамма С600 rif в рецдашентный штамм ABl 157.

Неконьюгатив!

ная (нобили-! Коныэгативная зуемая) :(мобилизующая) плазмида : плазмида

Структура конъюгативной плазниды

Частота мобилизации плазмид PUC19 и PBR322

PBR322

PRF311 PRP3. 1 :Tn9' (Kms) • -е 1.4»10

PRP312 PRF3. 1 :Тп9' (йГ) !

PRP3101 PRF3. 1 :Tn9'/10(Kms) 1,3*10~?

PRP3102 PRP3. 1 :Tn9'/10(Kmr>

PRP31X1 PRP3. 1 :Tn9'/X(Bns) 1,5*10"?

PRF31X2 PRP3. 1 :Тп9'/Х (Kmr)!

PRF311 PRP3. 1 :Тп9' (йве) 3,2*10"7

PRP312 PRP3, 1 :Тп9" (Ввг) '

PRF31X1 PRP3, 1 :Tn9'/X(Ims)! -S О, 6*10

PRF31X2 PRP3. 1 :Tn9VX(Imr)!

puc19

Значения частот, представленные в таблице, являются усредненными по данный нескольких (3-4) независимых скрещиваний. Среднеквадратичная ошибка во всех случаях не превышала 40*.

Как видно из табл. 2 в. биплазмидных системах типа (рЯРЗ. 1::Тп9')(РБК322) и (рйРЗ, 1::Тп9')(р"С19) олигонуклеотид-нне вставки неизвестной длшш приводят к снижению частоты транспозиции в 10 и 50 раз, соответственно, независимо от нес-та локализации транспозона на плазниде рРРЗ. 1. Эти данные говорят о тон, что полученные нами мутации инактивируют белок 1п.чА, а также о том, что в биплазмидных системах данного типа

он принимает участие в образовании коинтегратов, опосредуемых

/

Тп9', и простых инсерций этого' элемента. Вместе с тем, как было установлено ранее (сн. табл. 1), нутации в гене ¡пэА не снижают частоту транспозиции элементов Тп9' и 131 в биплазнидной системе типа (р!?РЗ. 1) (риС19: :ТЭ). Различное поведение нутант-ных ТЭ в биплазнидных системах (р!?РЗ. 1: :ТЭ) (риС19) и (рйРЗ. 1) (рТС19::ТЭ! наблюдалось в одном и том же штамме СбОО гНе. Это означает, что влияние нутаций в гене тзА на частоту транспозиции элемента 1Б1(Тп9*) не зависит от штанна и определяется особенностями самой биплазмидной систены.

Как видно из табл. 1 и 2 частота транспозиции элемента Тп9* дикого типа не зависит от типа донорного репликона а также от копийности Тп9' в клетке - в биплазмидных системах (рКРЗ. 1: :Тп9'! (риС19) и (рКРЗ. 1) (РТС19: :Тп9'> она оказалась одинаковой. Последний результат кажется парадоксальным: при увеличении числа копий элемента Тп9' в составе донорного репликона пропорционально этому увеличению должна была возрасти и частота его транспозиции. Этого, однако, не происходит. Единственное возможное объяснение этого Факта, как нам. кажется, состоит в том, что линиткруюозей стадией в транспозиции элемента 151(Тп9'> является взаимодействие ИЛ ТЭ с ДНК-нишенью. Эффективность этого взаимодействия, в свою очередь, зависит-'от

-ео-

вероятности "столкновения" молекулы донорной плазмиды с молекулой редипиентной плазмиды. Так как в биплазмидных системах (PRP3.1::Тп9')(PÜC19) и (pRP3.1)(PUC19::Тп9') вероятность их столкновения приблизительно одинакова (она определяется размерами и копийностью пяазмид), частота транспозиции Тп9' в обеих системах также должна быть одинаковой, что мы и наблюдали.

5. Структурная нестабильность коинтегратов, опосредуемы): мутантныни транспозонами Тп9'/Х и Тп9'/Ю

Для ответа на еоирос, сохраняется ли рекомбиназная (резол-вазная) активность у элемента IS1 при инактивации гена insA, нами была изучена способность коинтегратов плазмид pRPj. i и PUC19. опосредуемых Тп9'/Х и Тп9'/10, диссоциировать с образованием простых инсерций типа pRP3. 1::Тп9' либо вышеплять из своего состава маркер СпГв клетках гесА штамма Н8101. Частоту диссоциации коинтегратов плазмид pRP3.1 и PüC19::Tn9'. опосредуемых мутантными транспозонами, определяли в скрещиваниях биплазмидного донорного штамна НВ101, содержащего указан-

D

ные плазмиды, с реципиентным бесплазмидным штаммон CGOOrif , Ее 5

определяли по доле Ар -Форм среди трансконьюгантов.с Фенотипом

р • -г

Cm О частоте вышепления Cm -маркера из коинтегратов судили

о р

по доле Cm -Форм среди Ар -трансконьюгантов. Аналогичный анализ частоты вышепления соответствующих плазмидных маркеров из состава коинтегратов был проведен в штамме Сб00(гес+) при его скрещивании со штаммом ABl 157. Полученные данные приведены в таблице 3

-?л-

Таблица 3 .

Частота вытеп-пения неселектируемых маркеров Ар^и Сп1*из

„ & . &

трансконьюгзнтов с Фенотипом Ст ' и Ар- соответственно.

Тип скрещивания 'Доля форм ар5 среди ^ трансконьюгантов с ¡Фенотипом сшя Доля Форм ст среди: трансконыогантов с ! Фенотипом Ара !

HB?01!р£РЗ. 1)(PHC19: :ТП9'! X СбОО 1 ! . 29/ 14/. '.

HB10HPRP3. 3) {PUC19: :ТП9'/10) X СбОО ! ! 50*/ 1 50/. !

ipRPJ- 11!. "'И!: :Tn9'/X) X СбОО 1 ! 70/ 70/ !

C600(PRP3.1) (PUC19: Tn9') X ABl 157 } ! 33/. 1 57/. !

C600(PRP3. 1 > {PTJCI9: :Tn9'/X) X ABl 157 ♦ ! 35/. ; 61/ !

3

Как видно из табл.з доля Ар -Форм среди трансконьюгантов Ст от скреиивания НВ101 X СбОО возрастает в случае мутантных транспозонов Тп9'/10 (50*) и Тп9'/Х (7О/) по сравнению с транс-

лозоном Тп9' дикого типа (29'О. Аналогичным образом возрастает

с о

доля Сш -Форм среди трансконьюгантов с Фенотипом Ар - в случае транспозона Тп9' она составляет да, в случае Тп9'/10 -50/, а в случае Тп9'/X - 70'/.. Такин образом, олигонуклеотид-ные вставки в гене 1пзА не только не подавляли резолвазную Функцию элемента IБ1 в штанме гесА, но, наоборот, вызывали некоторое возрастание частоты диссоциации коитегратов с увеличением длины олигонукдеотидных вставок.

Дополнительная информация о нестабильном характере коин-тегратов, опосредуемых транспозономами Тп9'/Х и Тп9'/10, была

получена с помощью гель-электрофореза плазмидной ДНК, выделен-

й- я к

ной из трансконьюгантов ар Сш от скрещивания штамма СбООгН ,

содерхашего коинтеграты плазнид prp3.1 и. puc19: :тп9'/х (puc19::тп9*/10>.' с штампом НВ101. Полученные данные свидетельствуют о том, что разрешение коинтегратов, опосредуеик иутантными транспозонани, происходит в основной "правильно", т.е. с образованием низконолс-кулярных продуктов типа pUC19::IS1 и PUC19::Тп9\ При изучении диссоциации коинтегратов в гее штамме ABl157 оказалось, что среди продуктов диссоциации помимо указанных плазнид присутствуют плазмшш с более высокой молекулярной нассой. Строго определенный размер указанных плазнид свидетельствует об их происхождении в результате "правильной" диссоциации коинтегратов содержащих нультииеры плазмиды pUC19::T3. Нультимеризация плазииды puc19 в составе коинтеграта в гес+ штамме может происходить за счет гомологичной рекомбинации иежду коинтегратной и свободной копиями плазииды puc19: :тэ.

Таким образом, при инактивации гена insA резолвазная Функция сохраняется, хотя разрешение коинтегратов происходит в основной "правильно",

6. Нодель функционирования белка InsA при транспозиции элемента IS!.

Из полученных в работе данных следует, что ген insA является несущественный для транспозиции эленента IS1. Следовательно белок InsA не может выполнять таких существенных функций при транспозиции элемента ISl(Tn9'), как внесение однони-тевых разрывов в ДНК на концах ТЭ и двунитевого разрыва в ДНК-мишени, а также дотирование однонитевых З'-ОН концов ТЭ с выступающими У-РОЧ концами ДНК-мишени, согласно модели Еапиро,

Рис, б, а) схена предтранспозидионного сближения инвертированных повторов ISI (insi, и insR) с сайтом инсерции (модель Шапиро), б) грррхгтфз,пьяая Форма плззнирной молекул«, альтернативные направления миграции ДНК показали стрелками

единственная стадия в транспозиции, которая ножет осуществляться без участия каких -либо белков - это сближение ИП IS1 перед внедрением этого элемента в сайт инсерции (рис.ба), Так как ín vivo плазмиды находятся в сверхспиральной Форме, такое сближение может произойти в результате миграции ЭДК вдоль сверхспирзлыюго жгута в тот момент, когда центр ТЗ оказывается в вершине жгута (рис.66). В случае плазмиды малого размера вероятность сближения ИП в результате миграции ДНК, таким образом, больше, чем в плазниде большого размера. Если Функция белка InsA состоит в сближении ИП IS1, в плазниде pUCí9::IS1 IL-з,5 т.н. п.) она может быть компенсирована за счет миграции ДНК, а в плазниде pRP3.1::Тп9' (L=51,3 т.н.п.) эта компенсация может оказаться недостаточной. То, что белок InsA может обладать упомянутой Функцией, подтверждается данными Зербиба, согласно которым белок InsA способен связываться с ИП элемента ISi (Zerblb, 1987). Обладая двумя вышеописанными Функциями, белок InsA может способствовать гомологичной рекомбинации между ИП IS1 и участками ДНК, гомологичными ИП и находящимися за пределами элемента IS1.

Выводы.

1. Определена нуклеотидная последовательность сегмента ДНК центральной части транспозона Тп9', прилежашего к правой копии элемента IS1. Найдено перекрывание определенной НП с НИ других транспозонов семейства Тп9 . Во внутренней части вблизи правой копии эленента IS1 транспозон Гп9' содержит дополнительный Фрагмент ДНК длиной 326 н. п. по сравнению с транспозоном Тп9.

2. Компьютерный анализ секвенированного Фрагнента ДНК выя-

вйл в ней три потенциальных промотора: Р1. Р2 и РЗ. Активностью промотора РЗ, расположенного на расстоянии ~50 н. п. от правой копии элемента можно объяснить нестабильный характер коинтегратов, опосредуемых транспозоном Тп9' и более стабильный характер коинтегратов в случае дТп9'. так как с этого промотора может транскрибироваться ген ШбС. кодирующий резол вазу.

3. Показано, что частота транспозиции элемента Тп9' дикого типа не зависит от таза доеорного репликона и от копийности ТЭ в клетке: в биплазмидных системах (рКРЗ.1)(риС19::Тп9') и (рЕРЗ. 1: :тп9') (риС19) она одинакова.

4. Показано, что белок ШбА принимает участие в транспозиции элемента 131, однако его функция в этом процессе не является существенной. Предложена модель, объясняющая функцию белка Шзл в транспозиции 151.

5. Показано, что мутации в гене гпгА не подавляют резолваз-ную Функцию элемента 151, однако влияют на характер диссоциации коинтегратов: разрешение последних происходит в основном "правильно", т. е. путем гомологичной рекомбинации между коин-тегрзтндаи копиями элемента 151.

Список работ, опубликованных по тене диссертации

Данилевич В. Н., Дужий Д. Е., Вейко В. П., Ратманова К. И., Шех-трр И. и,, Суходолен в. в. "Изучение роли рамки считывания тзА в структуре ичсерционяого элемента 131 в процессах транспозиции и разрешения опосредованных 181 коинтегратов". Нолекупяр. биология. 1990. т, 24. с. 1549-1561.

2 Данилевич В. Н., Духии Д. Е.. Хачеровская Н. А., Миркин С. И.

"Первичная структура двух природных 1б1-Фланкированных транс-*

позонов Тп9 и Тп9'. кодирующих устойчивость к хлорамФенико-лу". Нолекуляр. биология. 1991. т. 25. с. 205-211.

3 Духий Д. Е. > Данилевич В. Н., Суходолец В. В. "Изучение Функции гена ША элемента Ш в составе транспозона Тп9': влияние олигонукпеотидных вставок в ШбА на образование простых ин-сердий и плазмидннх коинтегратов". Генетика. 1991. т. 27.

Я 8. с. 1301-1315.