Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование ферментов систем рестрикции-модификации Ysp1 и Tru91

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование ферментов систем рестрикции-модификации Ysp1 и Tru91"

РГб од

í f) í'vl

I МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ КОНСТРУКТОРСКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИИ ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКИ-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

На правах рукописи

Приходько Елена Александровна

ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ СИСТЕМ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ Vsp1 И Tru91

03.00.03 — молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ насоискание ученой степени кандидата биологических наук

I

(мрдск — 1993 г.

Работа выполнена в Научно-исследовательском

конструкторско-технологическом институте биологически-активных веществ, НПО "Вектор".

Научный руководитель:

доктор биологических наук С.Х.Дегтярев

Официальные оппоненты:

Ведущая организация: Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, Москва

на заседании Специализированного совета в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии ШО "Вектор" по адресу: 633159, Новосибирская обл. Новосибирский район, п.Кольцово

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института молекулярной биологии ШО "Вектор"

Диссертация разослана " /V " 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета:

доктор биологически* наук, проф.

Э.Г.Малыгин

доктор химических наук

В.Буткус

Защита состоится 20 мая 1993 г. в 9 часов

кандидат химических наук

Актуальность проблемы. Ферменты систем рестрикции-модификации широко применяются в качестве одного из основных инструментов в молекулярно-биологических и генно-инкенерных исследованиях, и как удобная модель для изучения проблемы белок-нуклеинового взаимодействия, что обусловлено их относительно простой структурно-функциональной организацией, высокой специфичностью действия.

В настоящее время изучение эндонуклеаз рестрикции и ДНК-метилаз проводится в нескольких направлениях,среди которых мошо выделить: I. детализирование механизмов функционирования этих ферментов с использованием синтетических субстратов, содержащих все более разнообразные модификации; 2.выявление общих закономерностей действия эндонуклеаз рестрикции и ДНК-метилаз при помощи анализа первичной структуры и установления эволюционных связей данных ферментов,что делает особенно актуальным клонирование, определение первичной последовательности и установление генетической организации белков й/м-систем различных специфачностей.

Цель работы. Целью работы являлось : I. исследование взаимодействия ферментов систем рестрикцйи-модаЗякации УзрХ- и Тги91 с нативными и модифицированными сайтами узнавания, выяснение общих закономерностей и индивидуальных особенностей механизма сайт-специфического действия этих ферментов; 2. изучение генетической организации н/и-систеш Увр1,установление гомологий с ферментами я/м-систем других специфкчяостей, изученными ранее.

Научная новизна и практическая ценность работы. Выявлена новая зндонуклеэза рестрикции Тги91. Предложены схемы получения гомогенных препаратов рестриктаз Увр1 и Тгиэх. Впервые в качестве модельных субстратов для изучения взаимодействия Узр1 и Тги91 с субстратными ДНК использовались олигонуклеотидные дуплексы , в которых, в определенных позициях сайта узнавания отсутствовали азотистые основания при сохранении целостности сахаро-фосфатного остова, что позволило выявить роль кавдого нуклеотида узнаваемой последовательности в фермент-субстратном взаимодействия. Определен субъединичный состав КЛзр1 и и.Тги91.Предложена модель генетической организации и/м-системы Узр1.

Объем работы. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения,обзора литературы,обсуждения результатов, экспериментальной части, выеодов, списка литературы.

-2-

I. Получение препаратов эндонукдеаз рестрикции Vspl и Tru9l.

При изучении природных микроорганизмов, продуцирующих ферменты рестрикции-модификации, в нашей лаборатории были выявлены бактериальные штаммы Vibrip species 343 и Thermus ruber 9, продуцирующие эндонуклеазы рестрикции Vspl и Тги91, соответственно.

Рестриктаза Vspl узнает последовательность АТТААТ и гидроли-зует фэсфодиэфирную связь между остатками тимидина.

I.I. Определение субстратной специфичности эндонуклеазы рестрикции Tru9I.

При определении последовательности нуклеотидов, узнаваемой рвстриктазой Гги91, проводили сравнение экспериментально полученных длин фрагментов ..при гидролизе ДНК фага К й pBR322 с расчетными длинами фрагментов для различных нуклеотидных последовательностей. Проведенный анализ показал, что существует единственная последовательность, для которой расчетные длины фрагментов, совпадают с экспериментально полученными для Tru9I, а именно, последовательность ттаа.

Эта последовательность узнается и гидролизуется рвстриктазой Msei (Morgan,1988) и содержится внутри сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции Vspl. Поэтому для подтверждения последовательности узнавания и определения места расщепления да рвстриктазой Tru9l был использован следующий олигонуклеотидный дуплекс :

5'-a a g с т т а ттаа т g g а т с с -3'

З'-Т Т С G А А Т А А Т Т А С С Т A G О -5\ содержащий сайт-узнавания Vspl-Tru9I.

Олигонуклеотидный дуплекс метили по 5'-концу верхней цепи

оо • .

7- Р-АТР и проводили совместный и параллельный гидролиз эндонук-леазами рестрикции Vspl и Тги91. На радиоавтографе (рис.1) подвижность продукта гидролиза рвстриктазой Tru9I совпадает с подвижностью фрагмента, образующегося при расщеплении субстрата ферментом vspl. Это позволяет сделать вывод, о том, что точка разрыва ДНК для рестриктазы Tru9l расположена мевду остатками тимидина в последовательности ТТАА.

Таким образом, рестриктаза Tru9l является истинным изошизо-

-3-

мером рестриктазы Мзе1, т.е.узнает внутреннюю часть 7зр1-последо-вательности.что делает интересным сравнение механизмов взаимодействия этих ферментов с субстратными ДНК.

РисЛ Радиоавтограф разделения в 20 %

4 3.2 1 денатурирующем геле продуктов гидролиза ^^ олигонуклеотидного дуплекса

^^ рестриктазами Vspl и Tru9I.

5 Дор.I - продукты гидролиза

д" ^R олигонуклеотидного дуплекса R.Yspi;

д дор.2 -смесь продуктов гидролиза

— , дуплекса R.Yspi и R.Tru9I;

_ ~ продукты гидролиза дуплекса

А рестриктазой Tru9I;

__ дор.4 продукты химического расщепления

А олигонуклеотидной цепи по методу

Максама-Гилберта.

Наш были определены оптимальные условия реакции гидролиза субстратных ДНК рестриктазой Tru9l. Реакцию гидролиза ДНК эндонуклеазой рестрикции Tru9l целесообразно проводить в буфере следующего состава: 0,02М трис-HCl, рН 7,5; O.OIM MgCl2, 0.05М NaCl, о,01 mif (3-меркаптозтанол. В ходе экспериментов были выявлены отличия в значениях оптимальных температур реакции расщепления Tru9i олигонуклеотидных дуплексов и высокомолекулярных субстратов. Наибольшая глубина гидролиза ДНК фага к наблюдается при 65°С, а олигонуклеотидного субстрата при 45°С. Это, вероятно, связано с увеличением нестабильности синтетического дуплекса при повышении температуры проведения реакции. В связи с этим все дальнейшие эксперименты по изучению процесса расщепления олигонуклеотидных субстратов рестриктазой Tru9l проводили при 45°С.

1.2. Выделение и очистка эндонуклеаз рестрикции Vspl и Тги91.

Известно множество вариантов очистки эндонуклеаз рестрикцйи. Большинство из них имеет общую схему , мало отличающуюся от способа очистки зндонуклеазы Hindll (Smith,Н.О et al,1970) первой выделенной рестриктазы и-типа. Очистка фермента Tru9i осуществлялась гель-фильтрацией на биогеле- А 0,5М с последующим

-4-

фракционированием на deae- и фосфоцеллюлозе. Цри этом был получен препарат фермента концентрации 50000 е.а./мл, свободный от примесных фосфатазных и экзонуклеазных активностей.

Применяя данную схему выделения для рестриктазы Vspi не удается получить препарат фермента, нэ содержащий примесных активностей типа экзо III. В связи с этим нами был разработан способ доочистки препарата фермента. После гель-фильтрации осветленного клеточного лизата Vibrio speoies 343 на Сио-геле А 0,5М и фракционирования на eso- и фосфоцеллюлозе мы проводили хроматографию на гепарин-сефарозе и гель-фильтрацию на сефакриле S-200 с использованием калий-фосфатного буфера, содержащего 0,8Ы Nací и 0,1$ тритон Х-100. Зависимость качества препарата рестриктазы Vspl от последовательности стадий доочистки. приведена в таблице I . Из данных таблицы видно,что для получения препарата рестриктазы Vspl, свободного от примесных активностей, ваша последовательность стадий использования сорбентов.

Гель-фильтрация на сефакриле 5-200 не позволяет избавиться от примесей. И только фракционированием на гепарин-сефарозе достигается очистка препарата рестриктазы Vepi от фосфатазной и нукпеазшй активностей. Однако, существенно уменьшается относительная активность фермента.которая составляет лишь 30% от исходной. При обратной последовательности стадий доочистки можно не только повысить качество препарата фермента Vspl, исключив приписные активности, но и увеличить активность фермента в два раза по сравнению с исюдвой. При этом удельная активность ферментативного препарате составляла 20000 ед.а./мл.

Увеличение удельной активности препарата фермента, вероятно, связано с использованием для гель-фильтрации буфера, содержащего 0,1* тритон Х-100. Возможно, данный неионный детергент препятствует высокой степени агрегации белковых субъединиц, тем самым способствуя сохранению-«аталитически активной формы H.vepi. Выбор оптимально! концентрации тритона Х-100 равной 0,1*, обусловлен тем, что при данной концентрации наблюдается максимальное увеличение активности рестриктазы Vspl в расчете на единицу массы расходуемого реагента.

Табл. I . Зависимость качества препарата Увр1 от последовательности стаций доочистки.

Стадия очистки Наличие примесных активностей Относительная активность

Опыт I.

I.Исходный препарат Увр1 (после градиентной хроматографии на фосфоцеллшозе) + 100%

2.Гель-фильтрация на сефакриле Б-200. + 130%

3.Градиентная хроматография на гепарин-сефарозе. 30%

Опыт 2 Г. Исходный препарат 7зр1 (после градиентной хроматографии на фосфоцаллюлозе) + 100%

2.Градиентная хроматография на гепарин-сефарозв. - 60«

3.Гель-фильтрация на сефакриле Б-200. - 120%

1.3. Определение значений молекулярных весов эндонуклеаз рестрикции Увр1 и Тги91.

Используя предложенные методики, были получены функционально чистые препараты рестрихтаз Узр1 и Тги91. Гомогенность препаратов подтверждается данными электрофореза в зш-яолизкрил-амвдном геле. Сравнивая электрофоретическуй подвижность полипептидной цепи эндонуклеаз рестршсции Узр1 и Тги91 с подвижность» маркерных белков известного молекулярного веса (в качестве маркеров использовались бычий сывороточный альбумин 67 кса, овальбу-мин 45 кБа, хлмотрипсиноген 25 кВа), были определены значения молекулярного В8са рестриктаз Узр1 и Тги91 в денатурирующих условиях. ОнЯ составляют 23 - 1.5 кЛа и 38 - 2 кОа,соответственно.

Гель-фильтрацией на сефадексе 0-100 нами были определены

-6-

значения молекулярного веса данных рестриктаз в нативных условиях (маркерные белки:-бычий сывороточный альбумин 67 кБа, овальбумин 45 кВа, лизоцим II М)а). Кажущийся молекулярный вес эндонуклеазы рестрикции Увр1 42 -5 кВа, а Тги91 - 38 ±5 ква, т.е. равен значении, полученному при анализе данных Бкз-электрофореза. Это свидетельствует о том, что и в нативных условиях рестриктаза Тги91 находится в мономерной форме.

Димеризация Тги91 происходит в присутствии субстратной ДНК. В качестве субстратной ДНК йспользовался 18-членный олигонуклеотид-ннй дуплекс, содержащий сайт узнавания Увр1-Тги91.Оказалось, что молекулярный вес комплекса "ГгиЭХ-субстрат" составляет 71-5 кЬа, в то время как существенного увеличения значения молекулярного веса комплекса "Узр1-ДНК" не наблюдается.

Возможно, что димерная форма является каталитически активной для всех эн д ону к леаз рестрикции, узнающих палиндромные последовательности.

2. Взаимодействие эндонуклеаз рестрикции Уар1 и Тги91 с олигонуклеотидными субстратами.

В последнее время для изучения взаимодействия ферментов п/и-систем с субстратными ДНК аффективно используются синтетические олигонукпеотиды, содержащие как нативный, так и модифицированные участки узнавания.

Наиболее часто в качестве модельных субстратов применяются олигонуклеотиды, содержащие аналоги природных нуклвотидов. Другая группа субстратов представлена олигонуклеотидами, имеющими разрыв сахаро-фосфатной цепи, в которой отсутствует межнуклеотидная фосфатная группа или нуклеотидный остаток. Однако, разрыв сахаро-фосфатного остова может приводить к нарушению конформации ДНК и изменению роли нуклеотидов сайта узнавания при взаимодействии рестриктазн с субстратом.

Для изучения реакции гидролиза эндонуклеаз рестрикции Узр1 и ТгиЭГ ,бшш синтезированы «шгонуклвотидше субстраты, в которых была произведена замена соответствующего нуклеозида на 1,2-дидез-окси-1)-рибофуранозу, т.е. в определенных позициях сайта узнавания отсутствовало азотистое основание. При этом целостность сахаро-фосфатного остова не нарушалась. Синтез олигонуклеотидов был проведен Горбуновым Ю.А. (ВНИИ МБ , НПО "Вектор").

-7-

Нативные олигонуклеотида А и В комплементраны и образуют устойчивый дуплекс, содержащий центрально расположенный сайт узнавания Узр1-Гги91. В олигонуклеотидах В1-В6, производных от олигонуклеотида В, по • определенным позициям сайта узнавания отсутствуют азотистые основания (см. табл.2).

Табл.2 Структура синтетических олигонуклеотидов.

Обозначение Структура

А 5'-A-A-G-C-T-T-A-T-T-A-A-T-G-G-A-T-C-C-3 *

в 5'-G-G-A-T-C-C-A-T-T-A-A-T-A-A-G-C-T-T-3'

В1 5' -G-G-A-T-C.-*-A-T-T-A-A-T-A-A-G-C-T-T-3'

В2 5 *-G-G-A-T-C-C-*-T-T-A-A-T-A-A-G-C-T-T-3'

ВЗ 5'-G-G-A-T-C-C-A-*-T-A-A-T-A-A-G-C-T-T-3'

В4 5'-G-G-A-T-C-C-A-T-*-A-A-T-A-A-G-C-T-T-3'

. В5 5'-G-G-A-T-C-C-A-T-T-*-A-T-A-A-G-C-T-T-3'

Вб 5'-G-G-A-T-C-C-A-T-T-A-*-T-A-A-G-C-T-T-3'

Данные модификации затрагивают не только сайт узнавания , но и позиции, соседние с ним (олигонуклеотида BI и В2 - для Тги91 и В1 для Vspl). Введение модификаций то этил позициям обусловлено тем, что в ряде работ было показано влияние нуклеотидов, окружающих сайт узнавания , на процесс гидролиза (Речкунова H.H.и др.. ,1988).

Олигонуклеотида В1-Б6 в сочетании с олигонуклеотидом А образуют модифицированные субстратные дуплексы.

Наш были определены кинетические параметры реакции гидролиза обеих цепей нативного и модифицированного субстратов эндонуклеа-ззми рестрикции Vspl и Trugi. Результаты представлены в таблице 3 и таблице 4, соответственно.

Из полученных данных можно сделать вывод,что в случае рестриктазы Vspl отсутствие азотистого основания в какой-либо позиции сайта узнавания приводит к существенному уменьшению скорости реакции гидролиза верхней цепи (субстраты АВ2.АВЗ). Дуплексы АВ4-АВ6 не расщепляются. Отсутствие азотистого основания в 5'-соседаем положении к сайту узнавания (субстрат АВ1) также влияет

-8-

Таблица. 3. Кинетические параметры реакции гидролиза олигонуклеотидных дуплексов рестриктазой Увр!

Структура сайта узнавания «т <*)

натив. цепь модиф. цепь

АВ 5* 3' -А-Т-Т-А-А-Т-31 -Т-А-А-Т-Т-А-51 2-10"7 14 11 ,г

АВ1 5' 3' -А-Т-Т-А-А-Т---3' -Т-А-А-Т-Т-А-П-5' г,5-1о-7 1,54 7,28

АВ2 5 3' -А-Т-Т-А-А-Т-3' -Т-А-А-Т-Т-^-5' г,5'ю~7 0,56 0,73

АВЗ 5 3 -А-Т-Т-А-А-Т-3' -Т-А-А-Т-^-А-5' 1,5'10-^ 0,22 N

АВ4 5 3 -А-Т-Т-А-А-Т-3* -Т-А-А-^Т-А-З' - N N

АВ5 5 . 3 -А-Т-Т-А-А-Т-3' -Т-А-Л-Т-Т-А-5' - N N

АВ6 5 3 -а-т-т-а-а-т-3'' -Т-П-А-Т-Т-А-5'" - N N

N - нет видимого расщепления к . - для ДНК фага Я. 0.85 1/мин

Таблица.4

Кинетические параметры реакции гвдрлиза . олигонуклеотидных дуплексов рестриктазой ТгиЭ1.

Структура к оа1; гт1п~1]

сайта узнавания

натив. цепь ' МОДИф. цепь

5'-А-Т-Т-А-А-Т-3'

ав 3' -т-т-А-т-т-а-5' 1,04* ю-7 0,25 0,25

ав1 5'-а-т-т-а-а-т---3' 3'-т-а-а-т-т-а-п-5' 2,2'10~7 0,14 0,03

АВ2 5'-а-т-т-а-а-т-3' 3'-5-А-А-Т-А-Л-5' 4,1'10~7 0,03 0,02

авз 5'-а-т-т-а-а-т-3' 3'-т-а-а-т-п-а-5' - N N

аб4 5'-а-т-т-а-а-т-э; 3'-т-а-а-п-т-а-5' - N N

ав5 5'-а-Т-Т-а-а-Т-3; 3'-Т-А-П-Т-Т-А-5' - N N

ав6 5'-а-Т-Т-а-А-Т-3' 3'-Т-П-А-Т-А-А-5' - N N

N - 'нет еидимого расщепления к - для ДНК фага X 0.07 1/мин

на скорость реакции, сникая значения в- десять раз по сравнению с нативнш субстратом. Такта образом, цепь А расщепляется только в тех субстратах, которые не содержат «эдафжаций в центрально расположенной паре нуклеотидов и в паре, нуклеотидов, образующих расщепляемую фосфодиэфирную связь..

Введение модификации в любое положение сайта узнавания низней цепи приводит к полному ингибированию гидролитического -расщепления рестриктазой Vspi. Исключение составляет '-субстрат АВ2, в~ котором модификация расположена в 5'-концевом полопэнии сайта узнавания,хотя и в этом случае наблюдается резкое уменьпенЕэ скорости реакции. Для дуплекса АВ1 скорость расщепления такгэ нпгз чем в нативном субстрате.

Расщепление дуплексов рестриктазой Тги91 такгэ зависит от положения модифицированного нуклеотвда.!Гги91 расщепляет только те субстраты, в которых отсутствуют основания, на входящие в состав узнаваемой последовательности. Расщйпгазнэ тдцфщированных субстратов не зависит от стабильности дшп-ых дуплексов.Например, АВ1 с температурой плавления 44.S°C гядролкзуется рэстрпктазсй Тги91, в то Бремя,как субстрат АВЗ с более высоким вначенсем г (50,2°С) не расщепляется ни по одной из цепей.

Анализ кинетических парметров показывает, что прп гидролизе оли-гонуклеотидных субстратов эндонуклвазаня рестрикции Yspl п Tru9l значения к^ практически одинаковы и составляют около 2*10~7М. Значения kQat и для Vßpl и для Тпь91 варьируют от субстрата к субстрату. Значения kQat для реакции расщепления ДНК фага А. нилэ, чем для олигонуклеотидных дуплексов и в случае Vspi, и для Tru9i. Возмоаио, что более низкие значения . koat для высокомолекулярных ДНК обусловлены большей протягенностью субстратных ДНК, и следовательно,, увеличением влияния фланкирующих последовательностей на / скорость высвобождения продукта из фермент-субстратного комплекс^.

Сравнение относительных скоростей расщепления модельных субстратов рестриктазой Tru9l показывает, что гидролиз нативкых цепей идет почти с одинаковой скоростью. Аналогичные результаты были получены для рестриктазы Taql (Jiricny и Hartln, 1S86). Вероятно,что равные скорости гидролиза обеих цепей в случае ферментов, выделенных из терлофальных штаммов, связаны с уменьшением

-Ю-

неспецифических. взаимодействий фермента с ДНК при высоких температурах, что приводит к снижению влияния нуклеотидов, окружающих сайт узнавания, на процесс гидролиза. В случае рестриктазы vspi неспецифические взаимодействия с ДНК сохраняются е большей степени, так как реакция гидролиза осуществляется при 37°С, поэтому и значения koat для различных цепей дуплекса различны. Анализируя полученные данные можно сделать следующий еывод: для расщепления субстратных ДНК рестриктазами Vspi и Тги91 необходимо наличие в сайте узнавания нуклеотидов, образующих расщепляемую фосфодиэфирную связь и комплементарной к ним пары оснований. Для К.ТгиЭХ эти нуклеотида составляют нативный сайт узнавания.

2.1.Взаимодействие ДНК-модифицирущей метлтрансферазы M.Vspl с синтетическими субстратами.

Для ыетилазы H.VßpI был проведен качественный анаЛга характера взаимодействия с синтетическими олигонуклеотидными дуплексами, AB , АВ1 , АВ2 , АВЗ , АВ4 , АВ5 , АВб , ЧТО ПОЗВОЛИЛО СраЕНИТЬ некоторые особенности функционирования ферментов R/H системы Vspi.

Данные по включению тритиевой метки в олигонуклеотидные субстраты приведены в табл. 5. Результаты получены при концентрации олигонуклеотидных субстратов гчсГ^Ы и соответствуют максимальному значению скорости метилирования.

Сравнивая полученные данные с результатами для рестриктазы vspi, (йбл.З) можно сделать вывод, что для ферментов р/м-системы Vspi наблюдается обратная зависимость глубины реакции от положения модификации в сайте узнавания.что указывает,возможно, на различный механизм узнавания и связывания втих^рментов с Увр1-сайтом.

Аналогичные результаты были получены и для других R/M-систем. Например, используя аналоги природных нуклеотидов в сайте узнавания, было показано, что ферменты EcoRI-систеш имеют различные контактные точки внутри сайта узнавания (Bodnar, J.W. et al,1983).

Как обсуждаюсь выше, для гидролитического расщепления субстратных ДНК рестриктазе Vspi. необходимо наличие в сайте узнавания нуклеотидов, образующих расщепляемую фосфодиэфирную связь и комплементарных к ним оснований;

5'- А

3'- Т

ттт-а-а а а-тат

Т- 3* А- 5'

Таблица 5 . Наличие %-радиоактивности в олигонуклеотидных дуплексах после метилирования метилазой и Vspi.

Субстрат --гг - • Н-радиоактивность,. CFM.

АВ 19447

АБ1 8615

АВ2 13283

АВЗ 14373

АВ4 785

АВ5 616

АВб 405

фон 437

Для реакции метилирования также необходимы центральные пары

основзний и остаток аденина, занимающий соседнее к ним положение:

5'- A-TIT-A-AIT- 3' V- ТГХ-А-ТПР-А- 5*.

Исходя из этого утверждения, а также учитывая интенсивность метилирования различных субстратов,можно предположить,что M'Yspl осуществляет перенос метальной группы на один из внутренних остаткоз аденина.

2.2. Влияние метилирования субстрата на гидролитическое расщепление рестриктазой Vspi.

В настоящее время выяснено, что эндонуклеазы рестрикции имеют различные требования к метилировании субстратных ДНК. Многие рестриктазы чувствительны не только к метилированию ДНК по каноническому основанию. Защита ДНК от действия рёстриктаз может осуществляться и метилазами других специфичностей, узнаваемые последовательности которых полностью или частично перекрываются с сайтом узнавания исследуемой рестриктазы (McClelland & Nelson,1992).

Нами была исследована чувствительность рёстриктаз Vspi и Tru9l к метилированию субстратных ДНК. Для этого были синтезиро-

-12-

ваш 14-членные самокомплементарные олигонуклеотида, содержащие е определенных позициях Узр1-сайта тб-аденин.Структура олигонуклео-тидов приведена в табл.6.

Таблица. 6. Структура олигонуклеотидов.

Обозначение Первичная последовательность

I. 5'-G G С С тбА STAATGGCC

И. 5'-G 0 С С А Т Т тбА А Т G G С С

III. 5'-G G С С А Т Т А тбА Т G G .С С

Результаты эксперимента представлены на рис.2. Как видно из рисунка рестриктэза Узр1 не расщепляет субстраты, в которых метилирован какой-либо аденин. Рестриктаза Тги91 гидролизует только олигонуклеотид I, где метилирован остаток аденина, не входящий в сайт узнавания Тги91.

и 0 □ О 0 м*

Рис.2 Радиоавтограф разделения в 20% денатурирующем геле продуктов гидролитического расщепления дуплексов l,H,III (структура приведена |§ в табл.6)

ДорЛ-гидролиз олигонуклеотидного дуплекса hi R.Yspi,(iii+Yspi), дор.2 - Ill+Tru9I; дор.3 - II+YspI; дор.4 - 11+ Tru9I; дор.5 -I+Vspl; дор.б - I+Ti*u9I.

Результаты, полученные нами,свидетельствуют о том,что рестриктазы Yspl и 3?ru9I, видимо, сильно ингибируются введением модификации в любой остаток аденина узнаваемой последовательности. Необходимо отметить, что рестриктаза Asel - истинный изошизомер рестриктазы Vspl - способна гидролизовать узнаваемую последовательность, в которой метилирован Еторой остаток аденина (MoClelland & Nelson, 1992). Это свидетельствует, возможно__с различном механизме действия ферментов R/M-систем Vspl и Asel.

-13-

3. Анализ генетической организации R/H системы Vibrio species 343.

3-1. Клонирование генов R/M системы Vibrio species 343.

На первом этапе работы была создана библиотека генома vibrio species 343. Фрагменты генома V.species 343, полученные частичным гидролизом по БаиЗА-сайту лигировались с векторной плазмидой рНТЪ22 с предварительной частичной достройкой 5'-выступающих концов фрагментом Кленова в присутствии dGTP+dATP и dTTP+ dCTP,соответственно. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli RRI, не имеющие собственной метилазной активности. Далее была выделена суммарная плазмидная ДНК полученного банка и, после гидролиза рестриктазой Vspi, ретрансформирована в компетентные клетки RRI. Было получено пять клонов, содержащих рекомбинантные плазмиды, устойчивые к Vspi-гидролизу. Две из них-pMVS8 и pMVSlö, имеющие наименее протяженные последовательности ДНК v.species, были использованы для дальнейшего анализа. Рестрикционный анализ pMVS8 и pMVSlö приведен на рис.3.

При обработке ДНК фага X грубыми лизатами клеток E.coli RRI,

трансформированных ДНК pMVS8 или pMVSi6, наблюдается перенос ме-

3

ченой метальной группы от [ H]-SAM на ДНК. В контрольном штамме E.coli RRI метилазной активности не наблюдается.

Для подтверждения синтеза метилазы Vspl-специфичности в клетках E.coli RRI, трансформированных рекомбинантными плазмидами pMVS8 и pmvs16, был проведен тест на защиту субстратных ДНК от гидролиза рестриктазой Vspl. Для этого ДНК плазмиды рио19, содержащая два Vspl-сайта, обрабатывалась грубым лизатом клеток E.coli RRI,несущих pMVS8 или pMVSi6.Полученный таким образом препарат плазмидной ДНК гидролизовали рестриктазой Vspl. Результаты представлны на рис.4. Как еидно из рисунка, ДНК pUCl9 после обработки грубым лизатом клеток E.coli RRI, трансформированных рекомбинантными плазмидами,приобретала устойчивость к Vspl-гидролизу.

Клетки E.coli RRI, трансформированные ДНК плазмид pMV58 и pMVSlö проверяли на наличие рестриктазной активности Vspl методом скрининга, описанного ранее (Белавин H.A. и др.,1988.). В

• Рис.3 Рестрикционный анализ плазмидных ДНК рМУБВ и рМУйЧб дороиси 2,4.6, и 3,5,7, соответственно.

;1 "2 3 Ч 5 б ¡7 Д0?-1 -плазмидный Еектр рМТЬ22, ' гидролизованный вашм (рмтьгг + ВашН1); дор.2 - рМ781б+ PstI +

__ВаиНГ; дор.3 - рГ/Бв + Рз« +

^ ВагаНГ; дор.4 - рМУБ16 + Рв11;

2205 п.о. Ы ' дор.5 рМУБв + РвИ; дор.6 -

I' , рВ1УЭ16 + N001; дор.7 рМУБ8 +

^ ^ N001.

• л ^ до Электрофорез продуктов гидро-■ . лиза проводили в 0,7% агароз-

. . ' ' ном геле. ' • ••

И'.

Рис.4 Устойчивость ДНК puci9 после обработки грубым лизатом клеток E.coli REI,трансформированных плазмидами pMVsS и pMVSi6, к Vspl-гидролизу.

Дор.1 - Днк рис19; дор.2,5 - ДНК PUC19, гид-ролизованная R.vspl; дорчЗ,4- ДНК PUC19,последовательно обработанная грубым лизатом клеток E.coli RRI, трансформиро-ЕЭННЫХ pMVS8, и R.VspI. Для pJTVSlô - дор. 6,7 , соответственно.

качестве субстратной ДНК. использовали ДНК фага к. Как видно из рис. 5, в клетках E.coli RRI, трансформированных pMVSi6, имеется рестриктазная активность Узр1-специфичность.

Рис.5 Тестирование клеток E.coli RRI, трансформированных ДНК pMVSS или pMVSiб, на наличие рестриктазной активности Yspi ( гидролиз ДНК фага \ 1,3 и 5 мкл грубого лизата клеток) Дор.1,2,3 - ДНК фага обработанная грубым лизатом клеток E.coli RRI, несущих pMVS8 ( RRI/pMBVS8), дор.4,5.6 - \ + RRI/pMVS16, дор.7,8,9 - X +грубый лизат клеток V.species 3433.2. Картирование гена метилазы Vspl.

На следущем этапе было проведено картирование гена метил-траксферазы. Для этого последовательность Y.species субклониро-Еали , а созданные рекомбинантные плазмидные ДНК тестировали на устойчивость к действию рестриктазн Vspl.Ha рис.6 приведена схема сконструированных плазмидных ДНК семейства pMVS.Плазмиды pMVS/P3, pMVS/R6 и pMYS/B2 были получены в результате делегирования Pstl-psti-.EcoRi-EooRi и Bgili-Bgiu-фрагментов ДНК плазмиды pMVSi6 .

Плазмидную ДНК pilVS/P7 сконструировали перекпонированием Psti-Psti-фрагмента. плазмиды pMYSl6 в вектор рЫТЬ22 по соответствующему сайту рестрикции и использовали для делетирования EcoRI-EcoRI- И NcoI-NooI-фрагментов ДНК ( pMVS/PR4 И pMVS/PN3). Рестрикционный анализ сконструированных плазмидных ДНК показал, что только.две плазмиды pMVS/P7 и pMVS/FR4 не гидролизуются R.Vspi. Следовательно, ген метилазы- Vspi располагается мевду EcoRi и Pstl сайтами рестрикции ( рис.6).

3.3. Определение первичной структуры гена метилазы Vspl.

Нами была определена первичная структура фрагмента генома V. species 343,расположенного между сайтами рестрикции NcoI.Pstl. Нуклеотидную последовательность секвинировали методом Максама-Гилберта по двум цепям ДНК с использованием ппазмид pitvs/P7, pMVS/PR4, pMYS/PN3. В результате была расшифрована последовательность ДНК протяженностью 2230 п.о. Ее анализ выявил три открытые рамки трансляцйи (ОРТ), начинающиеся от нуклеотидов 503, 557, 812

-16-

А.

О 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 тыс.П.о.

|_I-1—,_I_I_I_I_I__1_I_I

N R N S Р R В ^^^^¿¡¡¿¡¡^Н PMVS16

Б. ■ => pMVS/РЗ

' I PMVS/R6

' ' pMVS/B2

DMVS/P7

^^^^^^^^ PMVS/PR4

PÜVS/PN3

Г.

M.VepI R.VspK?)

Рис.6 А. - картирование плазмидных ДНК pMVS8 и pMVSi6 n,r,s,p,b - сайты узнавания рестриктаз Ncoi.EooRl.Sphl, Psti и Bglii,соответственно.

В. - схема субклонирования*'последовательности ДНК у.species, клонированной в плазмидном векторе pMTL22 (плазмида pMVSiб). Обозначения сконструированных плазмвд указаны справа, ■ш - плазмида устойчива к гидролизу Vspl; ■ | - плазмида гидролизуется рестриктазой Vspl. Г. - модель генетической организации R/M-системы Vspl.

и заканчивающиеся в , IY89 н., которые кодируют полипептиды с расчетной молекулярной массой 47.5, 45.5 и 36.1 kDa, соответственно. SD-последовательность присутствует в двух последних ОРТ. Для того, чтобы найти истинную рамку трансляции, был. определен молекулярный вес метилазы Ii.Vspl, значение которого в кативных условиях составляет 42.6- 5 kDa. Полученное значение молекулярного веса соответствует ОРТ, кодирующей полипептид с расчетной молекулярной массой 45.5 kDa.

Данные рестрикционного анализа рекомбинантных плазмид pMVsa и pMVSi6, наличие и метилазной.и рестриктазной активности в клетках E.coli rri, трансформированных p«tvsi6, и отсутствие рестриктазной активности в Е.coli rri, несущей рекомбинантную пдазмиду pMVSB, позволяет сделать еывод о том, что ген M.Vspi расположен

-17-

перед геном рестриктазы R.VspI.

Анализ последовательности NcoI-Pstl-<JpaniBHTa генома Vibrio speoies 343 показал, что в прямом направлении нет ни одной достоверной рамки считывания для гена рестриктазы Vspi. Возможо, что ген R.Vspi расположен в обратном направлении к гену lf.vspl. причем между ними есть вставка из 355 нуклеотидов. Предполагаемая генетическая организация R/м-системы Vspi с учетом молекулярных сов R.Vspi и M.Vspi представлена на рис'.б.

3.4.Сравнение первичной последовательности м.Узр1

с ранее изученными метилтрансферазаыи. Используя подход, предложенный ранее КИтазаизказ с со зет. (К11тазаизказ е1; а1.,1989), было проведено сравнение первичной последовательности гена МЛзр1 с известными последовательностями

Табл.9 Сравнение аминокислотных последовательностей консервативных мотивов ябА-метилтрансфераз:

ША-МТаве

_Doaain_J_

Domain II

аминокислотные последовательности

-olass

Ы'Есот Ecodam M'DpnII T4dam M Dpnl I-HÍn/I * Ее аГ Jf FokI

K-Hhall 190

I Barl 207

M-EcoP15 450

Ж-ТаеКТ 22

t'CvlBIII 53

М-Есо57Г 38

i-Taql 43

I-RñZ 51

Jf EcoBI 10В

I'EcoX 171

I Ecoñí?4/3 ¿11

35 WV EPFMGTG WÁ?

31 LV EPPVGAG SVPb

39 yp eppvggg Su?

28 FV DlPCGCL ßVSL

221 IL DPPYGSG TTGV

196 VL DPFPGTG TTGA

342 VI DPFCGSG STIfl

27 FM DLFSGTG IYGB

IL DPASGGT STPE QY QGXAGSG DLIS IL D7FAGSG TTAH LL EPSPGCG ПРХЬ IL SPSCGTG ET IS П. EPSCGDG VPIQ VL KPACAHG PFIR LF BSYVGBä ЕШ SV SSPCGDG DPRS VQ BPAAGTA GPU IT EPAAGSG SELL

186 RDD 174 DAS

187 TGD 164 DGD

41 SMD

29 SID 92 КАК

211 YGD

541 QNB

30 AVK 58 SVQ

118 KVH

113 QPD

113 KFD

109 I?D

98 APD

145 KYH

132 KSD

.260 KAH

285 F?D

WT CBPP TVY CDPP FVY iDPP FVT VDPP М1У ADPP LI? AffiT LIT IDPP ILT IDPP LVY CDPP IA? ?DPQ XII CDPP MTY IDPP FW GHPP FIV GHPP GAL 1ЯРР LIL GHPP KAI bSPP IW THPP IVA THPP AIV SKFP

YIGRHV YAPISA YIPLSE YLITVA YPLSNG TFSHTB IATGMG THGROY TbITTG YHGTLD THIMLA TNTGKO YVEPEL YVTKPS PIEYGP YGIVGS YLKIAA PSLPRS IGSAAG 1SYKWI

m£Aa тбАа габАа тбАа тбАб тбА 5 тбА 3 n£xß

шбАВ тбАЙ тбАр тбА7 Ш6А7 Я6А7 ш6А7 Ш6А7

тбА7 я£А7

f'VapI ' ' 161 PC DPCCGTG KPLI 228 KYD VIP THPP ■GKKLP m6A7

генов метилаз других специфичностей, которое позволило локализовать мотивы консервативных аминокислот (табл.Э).

В соответствии с классификацией Wilson (Wilson,G.G.,1991) ДНК-метилаза M.Vspi относится к ибАу-классу метилтрансфераз. При этом только в одном положении существует несоответствие со вторым мотивом. У метилазы v.species 343 мотив N-P-P-Y представлен последовательностью N-P-P-w. Однако, замена Y * v (тирозин » триптофан), одной ароматической аминокислоты на другую не является, возможно, принципиальной.

вывода

1. Выявлена новая эндонуклеаза рестрикции Trugi.

2. Разработаны способы очистки эндонуклеаз рестрикции vspl и Tru9l, позволяющие-получать препараты ферментов, свободные от примесных экзонуклеазных и фосфатазиых активностей.

3. Определены значения молекулярных весов и субъединичная структура эндонуклеаз рестрикции Vspl и Tru9i. Показано, что рестриктаза Vspl в нативных условиях является димером, а димеризация Тги91 происходит только в присутствии субстртатных ДНК.

4. Исследовано взаимодействие эндонуклеаз рестрикции Тги91 и Vspl с олигонуклеотидными. дуплексами,в которых произведена замена одного из нуклеозидов сайта узнавания на 1,2-дидез-окси-о-рибофуранозу:

а) определены кинетические параметры реакции гидролиза олигонукдеотидных субстратов, рестриктазами Vspl и Tru9l;

б) показана абсолютная необходимость всех оснований сайта узнавания для гидролиза олигонуклеотидных субстратов эндо-нуклеазой рестрикции Tru9i;

в) установлено, что для гидролиза субстратов рестриктазой Vspl необходимы все основания в центральном МАА тетра-нуклеотиде сайта узнавания;

г) сделан выеод о функциональной значимости нуклеотидов, образующих расщепляемую фосфодизфирную связь, и . комплементарной к ним пары оснований для гидролиза ДНК

эндонуклеазами рестрикции Vspl и Tru9I.

5. Показано, что эндонуклеазы рестрикции Vspl и Tru9l чувствительны к метилированию любого остатка аденина в узнаваемой последовательности.

6. Клонирована система рестрикции-модификации Vspl.

а) Определена первичная поледовательность гена, кодирующего метилтрансферазу M.Vspl.

б) Сравнение первичной структуры данной метилазы с известными последовательностями ДКК-металаз показало, что ¡1.Vspl принадлежит к Ы5А7-классу ДНК-метилаз.

РЕЗУЛЬТАТЫ ДОСЕРТАЭДИ ОПУБЛИКОВАНЫ В ШЕДШИХ РАБОТАХ:

1. Авторское свидетельство СССР.» I6876I4-,

Штамм бактерий Тегтшз ruber 9 - продуцент эндонуклеазы рестрикции Tru9l.

Саблина И.А., Богданова Т.И., Каравайко Г.И., Речкунова Н.И., Дегтярев С.Х., Приходько Е.А.

2. Е.А. Приходько, Н.И. Речкунова, С.Х. Дегтярев Установление субстратной специфичности эндонуклеазы рестрикции Tru^I., Сиб.Виол.Журнал,19911, вып.I,стр.57-58.

3. S.Kh. Degtyrev, Е.А. РгШю'ко, N.I. Rechkunova, Yu.A. Gorvunov, Interaction of Vspl and Tru9I with synthetic oligonucleotides, 1993, Bioch. et Bioph. Acta.,1172,89-94

Тезисы докладов:

4.Приходько Е.А., Речкунова Н.И., Горбунов Ю.А., Дегтярев С.Х. Эндонуклеаза рестрикции Vspl : взаимодействие с олигонуклео-тидными субстратами./ В кн. Ферменты рестрикциц-модифмкации: от генов до белков.Тезисы докладов всесоюзного симпозиума. Тракай. 17-20 октября 1989г.с 25.