Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДНК-диагностика гемофилии А методом полимеразной цепной реакции

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ДНК-диагностика гемофилии А методом полимеразной цепной реакции"

* о < 9 <1

И. МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

ЖУКОВА Елена Львовна

УДК 616.155.194.125-07:576.32/36(479.24)

ДНК-ДИАГНОСТИКА ГЕМОФИЛИИ А МЕТОДОМ ПОЛИЧЕРАЗНСИ ЦЕПН011

РЕАКЦИИ

03.00.04 - БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

/ Москва - 1990

7 , / ' ,

Работа выполнена во Всесоюзном ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени гематологическом научном центре Министерства здравоохранения СССР.

Научный руководитель: кандидат биологических наук Г.Я.Соловьев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

г.г.гаузе доктор биологических наук в.н.калинин

Ведущее учреждение: Институт молекулярной биологии им.

во всесоюзном гематологическом научном центре Минздрава СССР (125167, Москва, Новозыковский проезд, д.4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке вгнц мз СССР.

В.А.Энгельгардта АН СССР.

защита диссертации состоится " _ 1990 г.

в _ час. на заседании специализированного совета к 074.08.0

1990 г.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

в.д.Реук

ДДГСГГЕ!;. •

ib'i./1'fEW j

l'Ü Itrio' ' АКТУальН0С'гь проблемы, успехи в области молекулярной ¿Ójlfjjiо"г|ии, молекулярной генетики создали предпосылки для ис-сеИ&3№»опания методов, предлагаемых ними науками, для проведения днк-диагностики наследственных ?аболеваний и, в частности, гемофилии А. Эти методы - более точные и эффективные, чем иммунологические тесты, - позволяют выявлять носителей дефектных генов и прогнозировать появление больных детей в семьях с отягощенной наследственностью.

До последнего времени не существовало методов, позволяющих проводить надежную диагностику гемофилии ф на ранних этапах эмбриогенеза. Возможности пренатальной диагностики ограничивались двумя несовершенными подходами. В первом случае на ранних сроках беременности (8-10 недель ) проводилось определение пола плода, и при этой удалялся любой мужской плод без определения его статуса. Во втором случае проводилось определение антигена и активности фактора VIH в феталь-ной крови в начале последнего триместра беременности. Индивидуальные колебания нормальных значений активности фактора VIII не всегда позволяли однозначно трактовать результат исследования, а поздние сроки проведения анализа делали прерывание беременности травматичным для организма матери.

Появление метода блот-гибрндизации позволило проводить ДНК-диагностику наследственных заболеваний, выявляя носитель-ство заболевания у членов семей гемофиликов и диагносцируя статус Ю-12-недельного плода в случае носительства дефектного гена матерью. Поскольку прямая идентификация гемофиличес-ких мутаций осложнена большими размерами гена фактора VIII, генодиагностика гемофилии а реализуется при помощи семейного ПДРФ-анализа (анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов) , основанного на тестировании наличия или отсутствия в ДНК полиморфных сайтов рестрикции, ассоциированных с данным мутантным геном. Для проведения такого исследования требуется несколько десятков микрограммов ДНК, а детекция результата с использованием радиоактивной метки занимает 10 - 12 дней.

Разработанный в конце 80-х годов метод полимеразной цепной реакции (метод ПЦР, Saiki R., 1988) дает возможность существенно упростить, ускорить и удешевить исследование по-пиморфных сайтов рестрикции, являющихся маркерами наследовали хромосом. Для определения статуса плода методом пцр тре-

буется всего 1 день и всего 0.1 мкг ДНК, что чрезвычайно критично при проведении пренатального обследования, при этом результат анализа определяется визуально по результатам электрофореза без использования радиоактивности. Явные преимущества последнего метода по сравнении с методом блот-гибридизации делают актуальным перевод ДНК-диагностики гемофилии А на использование полимеразной цепной реакции.

Цель работы состояла в разработке оптимальной усовершенствованной стратегии ДНК-диагностики гемофилии А через создание систем детекции полиморфных сайтов рестрикции методом ПЦР и сочетание их с описанными методами ДНК-диагностики.

, Задачи исследование, поставленная цель определила постановку задач:,. • ■ • . • '

1. Создание системы детекции' полиморфного сайта рестрикции BclL в интроне 18 гена фактора- VIII методом'полимераз-

..ной. цепной реакции. (ПЦР).

2. Разработка . альтернативной системы; позволяющей детектировать полиморфизм сайта рестрикции HindlII в интроне 19 .ггна фактора vixx методом пцр.'

3. Сравнение двух альтернативных систем (Bell и HijidlII) и. выбор оптимальной. " '

4. Определение первичной структуры фрагментов интрона 22.. гена фактора VIII*для' создания системы детекции'полиморфизма . сайта рестрикции'.;хЬа1 в- этом интроне Методом ПЦР."

Анализ информативности некоторых* полиморфных сайтов рестрикции в обследуемой популяции.

6. Разработка оптимальной стратегии проведении днк-диагностики в.исследуемой популяции с использованием сочетания предложенных в работе и ранее описанных подходов.

7. Обследование больных гемофилией А и членов их семей методами ДНК-диагностики и проведение пренатальной диагностики заболевания. ^ <

Научная новизна. В настоящей работе разработаны система детекции полиморфного сайта рестрикции Bell и система детекции полиморфного сайта рестрикции HindlII (соответственно, интроны 18 и 19) гена фактора VIII методом ПЦР с внутрен-

ним контролем растепления. Из двух взаимозаменяемых систем выбрана оптимальная (Hindlll), показаны ее преимущества для проведения ДНК-диагностики гемофилии А. Анализ полиморфного сайта Hindlll методом ПЦР, а также введение в систему внутреннего контроля расщепления предложены впервые.

Разработанная система позволила оценить информативность полиморфизма сайта рестрикции Hindlll для проведения днк-диагностики гемофилии А в популяциях Москвы и Вильнюса и провести две пренаталыше диагностики заболевания.

В ходе исследования впервые определена первичная структура фрагментов интрона 22 гена фактора VIII и их внегенных аналогов, что показало полную гомологию изученных участков ДНК и, как следствие, невозможность усовершенствования ныне существующей системы анализа полиморфизма сайта рестрикции Xbal.

В работе определена информативность полиморфизма локуса DXS52 в исследованной популяции, что позволило рассчитать суммарную информативность использованных систем (HindIII/инт-рон 19 гена фактора VIII + Taql/локус DXS52), то есть оценить процент семей, в. которых возможно проведение пренатальной ДНК-диагностики гемофилии А. .

Практическая ценность. Проведенные исследования позволили разработать новые системы ПДРФ-анализа гемофилии А методом полимеразной цепной реакции, которые позволяют экспрес-сно выявлять носительство заболевания и проводить пренаталь-ную ДНК-диагностику в семьях с отягощенной наследственностью.

На основе разработанных систем анализа и оценки информативности наиболее важных полиморфных маркеров в исследованных популяциях определена оптимальная стратегия ДНК-диагностики гемофилии А, обеспечивающая быстрое и надежное обследование гемофиликов и членов их семей.

Результаты работы и разработанные в ходе ее выполнения методики используются для установления статуса носительства и проведения пренатальной ДНК-диагностики в ВГНЦ МЗ СССР, Институте акушерства и гинекологии в Ленинграде, Институте медицинской генетики в Грайфсвальде, ГДР.

Апробация диссертации, материалы диссертационной ра-

боты были доложены на конференциях и семинарах ВГНЦ МЗ СССР в 1989-1990, международном симпозиуме по ДНК-диагностике наследственных заболеваний (ГДР, Дрезден, 1989), 5-ом международном конгрессе по пренатальной диагностике (ЧСФР, Прага, 1990).

В целом работа была апробирована на заседании проблемной комиссии "Экспериментальная гематология, гемацитология и биотехнология" ВГНЦ МЗ СССР 27 сентября 1990 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано б научных статей.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на ill страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы. Указатель литературы включает 123 отечественных и иностранных источника. Диссертация иллюстрирована 20 рисунками и 7 таблицами.

Работа начата в лаборатории генной инженерии (зав. -доктор химических наук, профессор Н.И.Гринева), завершена в лаборатории генных диагностикумов (зав. - кандидат биологических наук Г.Я.Соловьев) НИИ экспериментальной гематологии и биотехнологии ВГНЦ МЗ СССР. Исследование выполнено при консультативной помощи ст.н.с. лаборатории генных диагностикумов ВГНЦ в.л.Сурина.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Исследование проведено на образцах днк, выделенных из крови больных тяжелой формой гемофилии А и членов их семей.

Выделение высокомолекулярной ДНК из цельной крови проводили по модифицированному стандартному методу фенольной экстракции. Аналогичный" подход применяли при выделении ДНК из ворсинок хориона.

Амплификацию ДНК с праймеров С1/С2, СЗ/С4, 7.1/7.10, С9/С10 проводили, модифицируя состав реакционной смеси, температурный и временной режимы реакции для каждой системы

ПЦР-анализа. После амплификации непосредственно к аликвотам реакционной смеси (5-10 мкл) добавляли 2-5 ЕА соответствующей рестриктазы, инкубировали в условиях, рекомендованных изготовителем, и анализировали разделением в .'электрофорезе.

Первичную структуру фрагментов ДНК определяли прямым секвенированием амплифицированной ДНК по методу Максама-Гил-берта и по методу Сэнгера. Для некоторых фрагментов ДНК сек-венирование вели пб стандартному методу Сэнгера. Для секвени-рования по методу Сэнгера со стандартного праймера фрагмент ДНК предварительно клонировали в плазмиде рЧС19.

Блот-гибридизационный анализ образцов ДНК проводили по по методу Саузерна. В качестве зондов использовали плазмиды Stl4 и р482.б, которые нарабатывали, выделяли и чистили в соответствии с опубликованными протоколами.

статистическую обработку результатов пдРФ-анализа в популяциях проводили с использованием критерия Стьюдента, информативность полиморфных маркеров рассчитывали по уравнениям Харди-Вайнберга для дву- и мультиаллельных систем.

Использованные в работе олигонуклеотидные праймеры, синтезированные метокси-фосфоамидитным методом, были любезно предоставлены профессором Н.И.Гриневой (вгнц мз СССР) и д.х.н. ю.А.Берлиным (ИБХ АН СССР).

Подбор пациентов и взятие крови проводили сотрудники гемофилического центра вгнц мз СССР ( рук. - профессор О.п.плющ) и ст.н.с. вмгнц в.л.ижевская.

Разработка системы анализа полиморфизма сайта рестрикции Bell методом полимеразной цепной реакции. Ранее упоминалось, что в последние годы после появления подходов к ДНК-диагностике наследственных заболеваний традиционным стало использование метода блот-гибридизации по Саузерну для анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), позволяющего отличить дефектную хромосому от нормальной. Разработка метода пцр, позволяющего in vitro амплифицировать фрагменты уникальных генов, и его модификации с использованием термостабильной ДНК-полимеразы дала возможность предельно упростить и ускорить такую диагностику.

Для европейских популяций наиболее информативным из внутригенных ПДРФ, тестируемых методом блот-гибридизации яв-

ляется полиморфизм ;сайта рестрикции Bell в интроне 18 гена фактора VIII (Gitschier J. et al., 1985). В работе Kogan с соавт. в 1987 году была предложена система пдРФ-анализа полиморфного сайта Bell методом ПЦР, в которой применены прайме-ры, синтезированные на основе нуклеотидных последовательностей интрона 18, расположенных поблизости от полиморфного сайта Bell, с которых аплифицируется короткий фрагмент интрона 18 длиной 142 п.н.. Недостатком этой системы с нашей точки зрения является отсутствие дополнительного константного сайта Bell, который позволил бы контролировать полноту расщепления ДНК соответствующим ферментом, такой внутренний контроль расщепления в амлифицируемом фрагменте гена, предложенный В.Л.Суриным, представляется нам необходимым условием получения достоверных результатов, поскольку в противном случае нельзя с уверенностью утверждать наличие или отсутствие искомого сайта рестрикции без введения многочисленных внешних контролен, так как неполный гидролиз ДНК ферментом может ошибочно трактоваться, как отсутствие сайта рестрикции.

Исходя из изложенных выше соображений нами совместно с В.Л.Суриным была разработана собственная система пдрф-анализа полиморфного сайта Bell методом ПЦР. Предложенная нами схема амплификации полноразмерного интрона 18 гена фактора VIII приведена на рис.1А. Там же даны последовательности использованных в работе олигонуклеотидных праймеров (рис.1Б, праймеры С1 и С2). В качестве праймеров были выбраны нуклеотидные последовательности экзонов 18 и 19 из ранее опубликованных данных по первичной структуре кДНК гена фактора VIII. Как следует из схемы, при помощи праймеров С1 и С2 амплифицируется полностью интрон 18, размером около 1.95 т.п.н., содержащий два сайта Bell, константный и полиморфный. Гидролиз амплифи-ката рестриктазой Bell приводит к образованию константного фрагмента 1.5 т.п.н. и фрагмента размером 450 п.н. при отсутствии полиморфного сайта или двух фрагментов размером 3 30 и 120 п.н. при наличии такового.

На рис.2 (треки 1-3) представлены результаты анализа полиморфного сайта Bell с применением метода ПЦР у больного гемофилией А и его матери (семья А35). как следует из элект-рофореграммы в амплифицировашшх фрагментах ДНК пробанда имеется полиморфный сайт Bell. У матери больного выявляются

а.

ktl"

-ПО

Ci-»-

bell

_L

"19

(Mi* Hlnd б

I I

—| 20

c3-

450

<20

— 330

t soo

480

<60

¿so

С1: 5'-dCACTGTACAATCTCTATCCA-3' С2": 5 ' -dGGTAACATTTCCACTGTCTC-3 '

C3: 5'-dTTGGCGAGCATCTACATGCT-3' C4: 5'-dCTAATGTGTCCAGAAGCCAT-3'

рис.1. а. Схема пцр-амплификации интронов 18 и 19 гена фактора VIII. в квадратах обозначены номера экзонов, вертикальные стрелки указывают расположение константных и полиморфных (*) сайтов рестрикции, горизонтальными стрелками обозначены олигонуклеотид-ные праймеры и направление синтеза при ПЦР. Размеры фрагментов указаны в т.п.н.

Б. Структура олигонуклеотидных праймеров, использованных для амплификации.

На— im—

Bell

Hindlll

Рис.2, семейный анализ полиморфных сайтов Bell (треки 1-3) и Hindlll (треки 5-7) методом пцр в семье А35. На электрофореграм-ме в треках 1,5 -нативный амплификат интронов 18 и 19, соответственно; треки 2,6 -амплификат ДНК матери и 3,7 - амплификат днк сына, гидролизованные соответствующими рестриктазами. Молекуляр-Г ную массу маркировали по ДНК фага А, гидролизованной рест-риктазой Pstl (трек 4). здесь и далее на родословной (-) и (+) соответствуют отсутствию или присутствию искомого сайта на х-хромосоме; размеры фрагментов указаны в п.н.

Б

фрагменты, обусловленные как присутствием полиморфного сайта (330 и 120 п.н.), так и его отсутствием (450 п.н.)., что свидетельствует о ее гетерозиготности по данному маркеру.

Как уже было сказано выше к достоинствам данной системы амплификации относится присутствие константного сайта Bell, являющегося внутренним контролем полноты рестрикции. Однако у нее есть и недостаток - большая протяженность амплифицируемо-го фрагмента, что естественно требует большей продолжительности каждого из циклов реакции и в целом делает ее менее стабильной. Исходя из этого мы предприняли попытку создать альтернативный вариант ПЦР-анализа этой области гена.

Разработка системы анализа полиморфизма сайта рестрикции Hindin в гене фактора VIII методом полимеразной цепной реакции. В непосредственной близости от полиморфного сайта Bell (интрон 18) известен полиморфный сайт HindlII (интрон 19). Оба сайта полностью сцеплены и, следовательно, обладают равной информативностью (Ahrens Р. et al., 1987). Однако для диагностических исследований методом блот-гибридизации последний не используется из-за близких размеров аллельных фрагментов (2.6 и 2.7 т.п.н.), трудноотличимых при блот-гибриди-зационном анализе.

Появление метода ПЦР позволило нам предложить систему, в которой амплифицируется полноразмерный интрон 19, содержащий два сайта для рестриктазы HindlII - полиморфный и константный. Схема такой амплификации приведена на рис.1А. там же даны последовательности использованных в работе олигонуклео-тидных праймеров (рис.1Б, праймеры СЗ и С4), синтезированных в соответствии с известными нуклеотидными последовательностями кДНК фактора VIH. Как следует из схемы, с праймеров СЗ и С4 амплифицируется полностью интрон 19 (0.75 т.п.н.), содержащий 2 сайта Hind III, один из которых является полиморфным. Гидролиз ампяификата рестриктазой HindlII приводит к образованию константного фрагмента размером около 480 п.н. и фрагмента длиной около 250 п.н. при отсутствии полиморфного сайта или двух фрагментов (160 и 90 п.н.) при наличии такового. Условия проведения реакции аналогичны предложенным для предыдущей системы, за исключением продолжительности каждого из циклов: меньший размер амплифицируемого фрагмента позволяет

уменьшить время отжига и синтеза.

Для тестирования полиморфного сайта HindIII амплификация геномной ДНК использована впервые. предложенная система является высокостабильной, информативность ее эквивалентна информативности широко применяемой системы полиморфизма сайта Bell, перед которой она имеет преимущество наличия внутреннего контроля полноты рестрикции (по сравнению с предложенной Kogan и соавт.) и большей стабильности воспроизведения результатов (по сравнению с предложенной нами).

На рис.2 (треки 5-7) представлены результаты анализа полиморфного сайта HindIII по предложенной схеме у больного гемофилией а и его матери (семья А35). Как следует из элект-рофореграммы в амплифицированном фрагменте ДНК пробанда отсутствует полиморфный сайт HindIII. У матери больного выявляются фрагменты, обусловленные как присутствием полиморфного сайта (160 и 90 п.н.), так и отсутствием такового, что свидетельствует о ее гетерозиготности по данному маркеру.

Сравнение электрофоре грамм на рис.2 (треки 2,3 и 6,7) подтверждает описанную в литературе сцепленность обоих полиморфных маркеров, при которой наличию полиморфного сайта HindIII сопутствует отсутствие полиморфного сайта Bell, и наоборот. из сравнения данных анализа для гемизиготы (пробанда) видно, что (+)аллелю по сайту Bell соответствует (-)аллель по сайту HindIII.

Предложенная схема амплификации интрона 19 била использована для определения статуса носительства и проведения пре-натальной диагностики гемофилии А в семьях больных.

На рис.з приведен пример обследования семьи, обратившейся с просьбой установить носительство дефектного гена двоюродной бабкой пробанда (13) и ее дочерью (112). Болезнь в этой семье ранее не наблюдалась, а впервые диагносцировалась у пробанда, в крови которого не детектируется активность факторов VIII и IX. Анализ полиморфизма сайта HindIII показал, что дефектный ген имеет искомый сайт (III1), а к матери пробанда (III), гетерозиготной по этому маркеру, (+)аллель пришел от ее отца (и, дед пробанда, ДНК которого мы не располагали). Из этого следует, что бабка пробанда (12), двоюродная бабка (13) и ее дочь (112), все гомозиготы с генотипом (-/-), носительницами гемофилии А не являются. Проведенный ДНК-ана-

Рис.3. Определение статуса носительства гемофилии А в семье а< по полиморфизму сайта рестрикции Hindin методом ПЦР.

ТАБЛИЦА 1

ИНФОРМАТИВНОСТЬ ПОЛИМОРФИЗМА САЙТА РЕСТРИКЦИИ Нл.гк1111 ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ДНК-ДИАГНОСТИКИ ГЕМОФИЛИИ А В ПОПУЛЯЦИЯХ МОСКВЫ и ВИЛЬНЮСА

ПОПУЛЯЦИЯ ВСТРЕЧАЕМОСТЬ ЧАСТОТА ВСТРЕЧАЕМОСТИ

АЛЛЕЛЕЙ МОСТИ ГЕТЕРОЗИГОТ (+/~) Р*

ОЖИДА- НАБЛЮ-+ - ЕМАИ ДАЕМАЯ

(FO) (FH)

МОСКВА 0.31 ; 0.69 0.43 0.45 <0.75

ВИЛЬНЮС 0.26 0.74 0.39 0.44 <0.70

Р - уровень значимости расхождений Fh и Fq при оценке по критерию Стьюдента.

лиз в сочетании с. данными по измерению активности фактора VIII у членов семьи показывает, что это мутация de novo, которая, возможно, произошла при гаметогенезе у деда пробанда по материнской линии (активность фактора VIII у деда пробанда соответствует норме, а у матери снижена до 36% от нормальной) .

Предложенный метод позволил нам провести исследование частоты встречаемости полиморфных аллелей и информативности полиморфизма сайта рестрикции HindlII в гене фактора VIII в популяциях Москвы и Вильнюса.

Определение частоты встречаемости аллелей при анализе полиморфизма сайта рестрикции HindlII. Расчет информативности данного полиморфизма в популяции. Определение частоты встречаемости полиморфных маркеров позволяет рассчитать информативность (частоту встречаемости гетерозигот) конкретного ПДРФ в популяции и является важной характеристикой для определения стратегии ДНК-диагностики наследственных заболеваний. Пользуясь разработанной системой анализа полиморфного сайта рестрикции HindlII мы обследовали образцы ДНК от 161 человека из 58 семей, в которых встречаются случаи гемофилии а. исследовались образцы днк представителей трех различных популяций: московской, вильнюсской и восточногерманской. Для первых двух были проведены популяционные расчеты по данным анализа статуса неродственных x-хромосом. данные анализа образцов, полученных из ГДР не обсчитывались, так как выборка обследованных мала и неслучайна: нам были переданы образцы ДНК из семей, где ранее методом блот-гибридизации были выявлены женщины гетерозиготные по полиморфизму сайта Bell и, следовательно, HindlII, что в дальнейшем было подтверждено нашими данными.

Полученные результаты представлены в таблице 1. сравнение наблюдаемой и ожидаемой частот встречаемости гетерозигот (+/-) по полиморфному сайту рестрикции HindlII в популяциях Москвы и Вильнюса, проведенное по критерию Стьюдента, показы-вет, что различие наблюдаемых и ожидаемых частот встречаемости гетерозигот не является статистически значимым.

Эти данные показывают, что предложенный метод позволяет дискриминировать аллели, несущие нормальные или дефектные гены фактора VIII у 43% нуждающихся в диагностике семей Москвы

и 39% семей Вильнюса и иллюстрируют высокую информативность данного полиморфизма для проведения днк-диагностики гемофилии А в этих популяциях.

С использованием данного метода нами было проведено две пренатальные диагностики.

Пренатальная ДНК-диагностика гемофилии А по полимор-. физму сайта рестрикции Hindlll в гене фактора VIII методом ПИР. Предложенный метод позволил нам провести пренатальную диагностику гемофилии А в двух семьях, в первом случае (семья из ГДР, рис.4, треки 1-3) дефектный ген у пробанда (II) не имеет полиморфного сайта Hindlll. сестра пробанда (12) - носительница болезни - гетерозиготна по данному маркеру. ДНК ю-недельного плода (III) анализировали одновременно и для определения пола, и для определения статуса плода. Пол плода определяли кариотипированием цитогенетики в ГДР. Параллельно проведенное нами определение пола амплификацией высокоповто-ряющихся последовательностей, характерных для У-хромосомы, по методу Kogan и соавт., (рис.4, треки 4-6) показало, что это мальчик, подтвердив результаты кариотипирования. Использование предложенной нами системы позволило определить, что плод унаследовал дефектный ген, не имеющий полиморфного сайта Hindlll.

Во втором случае была проведена прецатальная диагностика в семье, проживающей в Вильнюсе (рис.5). Статус носитель-ства у женщины, нуждающейся в пренатальной диагностике (III) и ее матери (II), происходящих из семьи, в истории которой имеются случаи гемофилии А, был определен по сниженной активности фактора VIII. Как следует из электрофореграммы, женщина (III), гетерозиготная по определяемому маркеру, унаследовала дефектный (-)аллель от своей матери (II), оба аллеля которой - нормальный и дефектный - не имеют полиморфного сайта BindXII. Из полученных данных следует, что плод (III1) унаследовал от матери дефектный аллель. Мужской пол плода был одновременно определен методом кариотипирования цитогенетиками в Вильнюсе.

Во втором случае пренатальнах диагностика была проведе на в семье где получение образца ДНК больного гемофилией » было невозможно. Однако сочетание методов иммунохимических

< 21-

1-

1 гх——

/л

Рис.4. Пренатальная диагностика гемофилии А в семье из ГДР. Анализ полиморфизма сайта рестрикции Н1псЛ11 (электрофореграмма, треки 1-3). определение пола плода амплификацией высокоповторяю-щихся последовательностей у-хромосомы (треки 4-6).

Ш

£14 12 Е* II

— т

—- 250 —- М

—— 90

Рис.5. Пренатальная диагностика гемофилии А в семье из Вильнюса. Электрофореграмма анализа полиморфизма сайта рестрикции н1пс1111. Пол плода предварительно определен кариотипированием.

которые надежно установили носительство гемофилии а у женщины, обратившейся за консультацией, с молекулярно-генегическим подходом позволило провести пренатальную диагностику и в этой семье-

В обоих случаях было проведено прерывание беременности.

Исследование возможностей анализа полиморфизма сайта рестрикции Xbal методом пцр. ПДРФ-анализ сайта рестрикции Xbal методом блот-гибркдизации выявил большую информативность этой полиморфной системы, имеющей неравновесие по сцеплению с полиморфизмами сайтов Bell и HindIII (Wion К. et al., 1986). После появления метода полимеразной цепной реакции была сделана попытка разработать соответствующую систему для анализа высокоинформативного внутригенного полиморфизма сайта рестрикции Xbal. Однако предложенная авторами система (Kogan S. et al., 1987, на рис.б праймеры 7.1 и 7.10) имеет существенный недостаток: одновременно с последовательностью гена фактора VIII амплифицируется и внегенная последовательность, предположительно имеющая высокую степень гомологии с искомой и затрудняющая трактовку результатов при рестрикционном анализе. Существование этой последовательности обсуждалось в упомянутой выше работе, где впервые был описан и охарактеризован данный полиморфизм. Размеры фрагментов ДНК, выявляемых при блот-гибридизационном анализе, предполагали существование структурного различия между этими последовательностями в области сайта рестрикции Kpnl, соседнего с полиморфным сайтом Xbal (рис.6). Одновременное расщепление геномной ДНК обеими рестриктазами позволяло отличить аллель фактора VIII от его аналога за счет отсутствия этого сайта в аналоге. Предложенная Kogan и соавт. схема амплификации фрагмеЕП-а интрона 22 исключает возможность такой дискриминации, и поэтому ее использование при определении статуса носительства и пренаталь-ной диагностике оказывается ограниченным случаями, когда ге-терозиготность женщины по данному полиморфизму подтверждается генеалогически.

Из-за эффективности проведения ДНК-диагностики методом ПЦР, а также высокой информативности этого внутригенного мар-

кера, несцепленного с Bcir/HindIII-ПДРФ, мы предприняли попытку создать систему, позволяющую либо амплифицировать только интересующую нас последовательность, либо отличить ампли-фицированную последовательность гена фактора vin от ее аналога. Первая возможность реализуется через использование праймеров, комплементарных последовательностям гена фактора VIII, отсутствующим или вырожденным в аналоге, вторая - через разработку системы, позволяющей дискриминировать аналог, пользуясь растеплением упомянутого ранее сайта Kpnl.

поскольку первичная структура нитронов гена фактора VIII неизвестна, перед нами стояла задача секвенирования участков интрона, перспективных для синтеза праймеров. Для секвенирования интересующих нас фрагментов интрона использовали плазмиду р482.6 (Wion К.), содержащую искомые последовательности гена фактора VIII. Для- секвенирования вне генных последовательностей (аналога) провели скрининг ДНК гемизигот (мужчины, одна x-хромосома) и отобрали образец ДНК, в котором присутствовал полиморфный сайт xbal в гене фактора VIII. гидролиз такой ДНК рестриктазой Xbal позволил дискриминировать последовательность фактора VIII и секвенировать нерасщеплен-ную последовательность аналога. На рис.6 показаны фрагменты ДНК, для которых была определена первичная структура. Секве-нирование проводили по методу Максама-гилберта и по метод\ сэнгера, как в традиционном варианте, так и модифицировав их для использования в качестве матрицы днк, амплифицированной с праймеров 7.1 и/или 7.10. Определение первичной структуры показало полную гомологию фрагмента интрона 22 гена фактора VIII и его внегенного аналога.

Для реализации второй возможности - создания системы, позволяющей отличить интересующий нас ген от его внегенного аналога при помощи сайта Kpnl, - мы секвенировали область retía, лежащую в З'-направлении от этого сайта, в качестве матрицы использовалась сконструированная нами плазмида ркх5, содержащая Крп1/ХЬа1-фрагмент длиной 3.4 т.п.н. (рис.6), который предварительно переклонировали из плазмиды р482.6 в плаз-шду pUCl9, что позволило вести секвенирование по методу сэнгера с использованием универсального праймера. Была определена последовательность 320 нуклеотидов, лежащих в 3'-направлении от сайта Kpnl (рис.б).

2Z[-

х

I

с

X" К

/

/

/

/

/ /х*

/

7.10

Ч

L..J

ч

ч

\

V

ч

ч

сю\

ч

11 _

сз

0,095

УГГ/1////П

■.-,0,6С)швттт

Гf

-0,200

г* 0,320

Рис.6. Фрагмент интрона 22 гена фактора VIII. Буквами X и К обозначены сайты рестрикции Xbal и Kpnl; * - полиморфный сайт цифрами обозначены размеры фрагментов (т.п.н.). е-1?.-- - фрагменты интрона 22, для которых определена первичная структура; У////А - фрагменты аналога интрона 22, для которых определена первичная структура; | | - фрагмент интрона 22 (3.4 т.п.н.) гена фактора VIII, содержащийся в плазмиде рКХ5;

|-1- фрагмент интрона 22 (9.6 т.п.н.) гена фактора VIII,

содержащийся в плазмиде р482.6.

Рис.7. Анализ полиморфных аллелей в локусе ОХЭ52. Пример ради оавтографа с указанием размеров гибридизующихся фрагментов (т.п.н.).

На основании определения последовательности нуклеотидов были синтезированы праймеры С9 и СЮ (рис.б), амплификация с которых должна была иммитировать дискриминацию последовательностей аналогов при блот-гибридизации. Однако, рестрикционный анализ выявил присутствие сайта Kpnl не только в последовательности интрона, но и в последовательности аналога, доказательство присутствия сайта Kpnl в ДНК аналога противоречило представлениям, следовавшим из опубликованной в 1986 году работы Wion К. и соавт., согласно которым присутствие сайта Kpnl по соседству с полиморфным сайтом Xbal в гене фактора VIII определяло различие в размере фрагментов гена и аналога (6.2 и 6.6 т.п.н., соответственно), выявляемое блот-гибриди-зационным анализом при одновременном гидролизе ДНК рестрикта-зами Xbal и Kpnl. Из полученного результата следовало, что разница в размерах двух фрагментов определяется структурными отличиями, лежащими в 5'-направлении от полиморфного сайта Xbal. Наши результаты были подтверждены и дополнены опубликованными в конце 1989 и начале 1990 года работами других авторов (Chan V. et al., 1989, Lillicrap D.P. et al., 1990), выполненными методом блот-гибридизации. В этих же работах было показано присутствие полиморфного сайта xbal в последовательности не одной, а двух копий внегенных аналогов, хотя авторами было доказано расположение этих копий на Х-хромосоме, точная локализация их не ясна, что ставит под сомнение правомерность приоритетного использования данного ПДРФ для ДНК-диагностики гемофилии А даже методом блот-гибридизации. полученные нами результаты, подтвержденные данными других авторов, продемонстрировали невозможность создания удовлетворительной системы амплификации фрагмента интрона 22 гена фактора VIII, позволяющей надежно отличать последовательности гена фактора VIII от внегенных.

Исследование информативности внегенного полиморфизма сайтов рестрикции Taql в локусе DXS52 при проведении диагностики гемофилии А. К настоящему моменту проведение днк-диагностики гемофилии А не ограничивается использованием внут-ригенных полиморфизмов, поскольку их суммарная информативность для разных популяций не превышает 70%. Для того чтобы увеличить число информативных семей почти до 100%, использую-

ся внегенные полиморфные маркеры, расположенные по соседству с геном фактора VIII. Однако, такие маркеры не обеспечивают безошибочной диагностики, так как с увеличением расстояния, разделяющего ген и определенный полиморфный локус, пропорционально увеличивается возможность рекомбинации между ними, что может привести к диагностической ошибке. Из всех известных внегенных маркеров, используемых при диагностике гемофилии л, наиболее общепринятым являе:гся полиморфизм сайтов рестрикции Taql в локусе DXS52 (Oberle I. et al., 1985): эта мультиал-лельная система включает наибольшее число полиморфных аллелей, список которых постоянно пополняется данными из разных популяций, и наименее удалена от гена фактора VIII.

Обследование смешанной московской популяции по данному маркеру позволило определить частоты встречаемости отдельных полиморфных аллелей и сравнить с данными исследования других популяций. На рис.7 приведены фрагменты радиоавтографов с указанием размеров полиморфных аллелей. Исследуемые образцы ДНК расщепляли рестриктазой Taql и проводили блот-гибридиза-цию с зондом Stl4 (Oberle I., 1985). Было обследовано 59 человек из 19 семей, имеющих больных гемофилией А. Однако для расчетов частоты встречаемости отдельных полиморфных аллелей было" отобрано только "47 неродственных х-хромосом, поскольку трактовка гетеро- или гомозиготности при наследовании мульти-аллельной полиморфной системы не всегда возможна.

В таблице 2 приведены частоты встречаемости отдельных полиморфных аллелей в смешанной московской популяции и аналогичные данные для других этнических групп, как следует из приведенных данных, частоты встречаемости отдельных аллелей отличаются от полученных нами результатов во всех трех популяциях, однако в наиболее этнически близкой западноевропейской популяции максимумы частот приходятся на те же аллели, что и в смешанной московской популяции (аллели 4.5 и 4.0 т.п.н.). среди выявленных аллелей не встречаются характерные для алжирской популяции, но встречаются все описанные для популяции западноевропейцев. Сравнение ожидаемой и наблюдаемой частот встречаемости гетерозигот по данной полиморфной системе (таблица з) по критерию Стыодента показало, что различие наблюдаемой и ожидаемой частот встречаемости гетерозигот не является сгатистически значимым. Информативность этого ПДРФ в

ТАБЛИЦА 2

ЧАСТОТЫ ВСТРЕЧАЕМОСТИ ПОЛИМОРФНЫХ АЛЛЕЛЕЙ ЛОКУСА DXS52.

АЛЛЕЛИ ЧАСТОТА ВСТРЕЧАЕМОСТИ (Fo>

No т.п.н. МОСКВА ЗАП.ЕВРОПА АЛЖИР КИТЛП

1DZ 14 .0 0.0 0.0 0 . 3 0.0

1А 7.5 0.0 0.0 0.0 0 . 0

1 6.6 2.0 0.5 2.9 0.0

2 5.3 4.0 4.5 12 .2 0.0

3 4.8 4.0 12.0 24.0 9.0

4 4.5 53 . 0 36.0 8.0 2.0

5 4.1 4.0 . ) 20.5 8.7 4 . 0

6 4.0 21.0 18.0

7 3.9 9.0 10 .5 - 23.0

8 3.6 9.0 0.5 19 .7 -

9 3.4 2.0 15.5 21.6 44 . 0

Данные по западноевропейской, алжирской и китайской популяциям приводятся по Oberle I., 1985, Nafa К., 1990 и Chan V. , 1988, соответственно.

ТАБЛИЦА 3

ЧАСТОТЫ ВСТРЕЧАЕМОСТИ ГЕТЕРОЗИГОТ ПО ПОЛИМОРФИЗМУ ЛОКУСА DXS52 В РАЗНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ

ПОПУЛЯЦИЯ ЧАСТОТА ВСТРЕЧАЕМОСТИ

ОЖИДАЕМАЯ НАБЛЮДАЕМАЯ

МОСКВА 0.83 0.67

АЛЖИР 0.83 0.79

ЗАПАДНАЯ ЕВРОПА 0.78 0.80

См. сноску к таблице 2.

ТАБЛИЦА 4

СТРАТЕГИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ДНК-ДИАГНОСТИКИ ГЕМОФИЛИИ А

результат

ИССЛЕДОВАНИЯ РЕКОМЕНДУЕМАЯ ДАЛЬНЕЙШАЯ СТРАТЕГИЯ

Н1паш ХЬа!

л-р- ЛЮБОЕ ПРОВЕДЕНИЕ ДИАГНОСТИКИ НА ОСНОВАНИИ РЕ-

СОЧЕТАНИЕ ЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ Н1пс1111-ПОЛИМОР-ФИЗМА.

+/+ +/? ИССЛЕДОВАНИЕ ОБРАЗЦОВ ДНК ЧЛЕНОВ СЕМЬИ

-/- +/? ИНОГДА ПОЗВОЛЯЕТ ОПРЕДЕЛИТЬ СТАТУС ВТО-

РОЙ ХРОМОСОМЫ. ПРИ ГЕНОТИПЕ МАТЕРИ (+/+] СЛЕДУЕТ ПЕРЕХОДИТЬ К ИССЛЕДОВАНИЮ ПОЛИМОРФИЗМА В ЛОКУСЕ ОХБ52 МЕТОДОМ.БЛОТ-Г И Б Р ИДИ 3 АЦИИ. ПРИ ГЕНОТИПЕ МАТЕРИ (+/-) СЛЕДУЕТ ВОСПОЛЬЗОВАТЬСЯ ДАННЫМ ПОЛИМОРФИЗМОМ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ДИАГНОСТИКИ. ПРИ НЕВОЗМОЖНОСТИ ОПРЕДЕЛИТЬ ГЕНОТИП ПО ДАННОМУ ПОЛИМОРФИЗМУ ПРОВОДИТСЯ ДИАГНОС ТИКА МЕТОДОМ БЛОТ-ГИБРИДИЗАЦИИ ПО ПОЛИМОРФИЗМУ ЛОКУСА ОХБ52.

+/+ -/- ПРОВЕДЕНИЕ ДИАГНОСТИКИ МЕТОДОМ БЛОТ-ГИБ

-/- -/- РИДИЗАЦИИ ПО ПОЛИМОРФИЗМУ ЛОКУСА ОХБ52

эбследованной популяции так же высока как и в других популяциях и, следовательно, может быть эффективно использована для проведения ДНК-диагностики, в тех случаях, когда ПДРФ HindIII эказывается неинформативным.

Стратегия определения статуса носительства и пренаталь-яой ДНК-диагностики при гемофилии А. В настоящий момент оптимальной стратегией для проведения ДНК-диагностики гемофилии \ нам представляется следующая последовательность процедур: амплификация исследуемых образцов днк с праймеров СЗ/С4 (Hindlll-полиморфизм) и 7.1/7.10 (Xbai-полиморфизм), расщеп-пение соответствующей рестриктазой и анализ фрагментов электрофорезом в полиакриламидном геле, при этом амплификация с зраймеров 7.1/7.10 носит вспомогательный характер из-за проблем описанных выше. В таблице 4 представлен набор возможных вариантов, каждый из которых предполагает определенную последовательность действий для проведения ДНК-диагностики. Суммарная информативность ПДРФ HindIIl/интрон 19 гена фактора /III и Taql/локус DXS52, рассчитанная на основании величин эжидаемых частот встречаемости гетерозигот (FQ) для популяции Москвы составляет 0.965. Это означает, что 96.5% семей :мешанной московской популяции информативны хотя бы по одному Í3 этих двух ПДРФ и при необходимости в этих семьях может зыть проведена пренатальная диагностика.

выводы

1. Предложены две системы детекции полиморфных сайтов рестрикции в гене фактора VIII методом полимеразной цепной эеакции, позволяющее проводить ДНК-диагностику гемофилии А. В тервой - амплифицируется последовательность интрона 18, со-хержащая полиморфный и константный сайты рестрикции Bell, во второй - последовательность интрона 19, содержащая полиморф-шй и константный сайты рестрикции HindIII. Константный сайт юзволяет контролировать полноту расщепления амплифицирован-шй ДНК, чем упрощает проведение диагностики и делает ее бо-íee надежной. Сравнение двух альтернативных систем позволило ¡ыбрать оптимальную (HindIII). Амплификация интрона 19 для фоведения ДНК-диагностики гемофилии а использована впервые.

2. Определена первичная структура фрагментов интрона 22 гена фактора VIII и его внегенных аналогов, показана полная гомология исследованных структур, на основании чего доказана невозможность создания надежной системы детекции полиморфного сайта рестрикции Xbal в этом локусе гена методом полимеразной цепной реакции для проведения ДНК-диагностики гемофилии а.

3. Определена информативность ПДРФ-анализа в интроне 19 гена фактора VIII для популяций Москвы и Вильнюса (0.43 и

0.39. соответственно) и в локусе DXS52 для московской популяции (0.83), что позволило рассчитать процент семей (96.5%), для которых возможно проведение пренатальной ДНК-диагностики.

4. Разработана стратегия ДНК-диагностики гемофилии А, позволяющая устанавливать и исключать статус носительства гемофилии А при семейном обследовании и проводить пренатальнук диагностику заболевания.

5.. Проведена практическая ДНК-диагностика гемофилии А у 161. человека из 58 семей Москвы, Вильнюса и ГДР. В двух семьях проведена пренатальная диагностика заболевания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сурин в.Л., Жукова Е.л., крутов A.A., Соловьев г.я., Лихачева Е.'А., Плющ О.П., Гринева Н.И. Использование метода PCR для тестирования полиморфных сайтов Bell и Hindin при установлении статуса носительства гемофилии А. - Гематология и трансфузиология.- 1990.- п.З.- с.3-6.

2. Сурин В.Л. , Асеев М.В., Жукова Е.Л., Баранов B.C., Соловьев Г.Я., Гринева Н.И., Плющ О.П., Ижевская В.Л., Лихачева е.а. Выявление носителей гемофилии а при помощи тестирования полиморфного сайта HindIIl в гене фактора VIII методом PCR.- Генетика.-1990. - т.26.- п.10.-

С.1840-1846.

3. Kucinskas V., Zhukova E.L., Vilkaite R. , Solovyevas G.Ya., Surinas V., Kriauciunienene A. Paveldemu ligu DNR zandines diagnostikos bukle er jos perspectivos Lietuvoje.