Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно генетический анализ генов факторов VIII и IX в некоторых популяциях и семьях с гемофилией А и В

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно генетический анализ генов факторов VIII и IX в некоторых популяциях и семьях с гемофилией А и В"

На правах рукописи

ОД

i п;:;:!! гъ

ACSB3 МИХАИЛ ВЛАДИМИРОВИЧ

ЫОЛККУЛЯРНО ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ «АКТОРОВ VIII И IX В НЕКОТОРЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ И СЕМЬЯХ С ГЕМОФИЛИЕЙ ЛИВ.

Специальность - 03.00.04 - биохимия

Ai>opi)ipit диссертации на соискание ученой степени кандидата Виологических наук.

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в лаборатории пренатальной диагностики наследственных заболеваний Научно-исследовательского института акушерства и гинекологии РАМН иы.Д.О.Отта.

Научные руководители:

доктор медицинских наук,профессор В.С.Баранов, доктор медицинских наук,профессор Л.П.Папаян.

, Официальные оппоненты:

чл.-корр.РАМН,профессор B.C.Гайцхоки, д.О.н.,профессор М.Н.Блинов.

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский государственный университет.

Защита состоится .Ч'Р/'Л. . . 1996 г. в "¡У* часов на

заседании Диссертационного совета (Д 084.19.01) при Российском НИИ гематологии и трансфузиологии МЗ МП РФ (по адресу: 193024. Санкт-Петербург,2 Советская,16)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Российского НИИ гематологии и трансфузиологии по адресу: 193024, г.Санкт-Петербург, 2-я Советская улица,16.

Автореферат разослан " ...........1996

S 0Щ \uast,

Ученый секретарь Диссертационного совета В.С.Быков.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Гемофилия А и В - тяжелые наследственные заболевания, обусловленные функциональной неполноценностью или отсутствием факторов VIII или IX (FVIII, FIX) свертывания крови. Причиной заболеваний являются рецессивные мутации генов, локализованных в длинном плече Х-хромосомы - Xq28 и Xq27 соответственно. Заболевания встречаются с частотой 1:8 и 1:30 тысяч новорожденных мальчиков и в 85 % случаев протекают в тяжелой или средней формах. Высокая частота, отсутствие радикальных методов лечения, тяжелая инвалидизация уже с раннего возраста делает весьма актуальными поиски эффективных путей диагностики и профилактики этих социально-значимых наследственных заболеваний.

Современные клинико-биохимические и иммунологические методы определения уровня и активности фактора VIII и IX в крови недостаточны для выявления гетерозиготного носительства и совершенно непригодны для пренатальной диагностики гемофилии на ранних сроках беременности. Точная идентификация генов FVIII и IX молекулярно-генетическими методами, их позиционное картирование на генетической карте, клонирование соответствующих кДНК и фрагментов геномных ДНК (Kurachi, Davie, 1982; Jaye et al. 1983; Anson et al.1984; Yoshitake et al. 1983) послужили основой для разработки эффективных молекулярных методов диагностики этих тяжелых наследственных заболеваний.

В настоящее время с этой целыо используют два основных подхода: I) анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ -анализ); 2) прямая идентификация мутаций.

ПДРФ - анализ позволяет на уровне конкретной семьи, точнее конкретного больного определить с каким внутригенным или близлежащим внегенным аллелем полиморфного маркера сцеплен мутантный ген FVIII или FIX, и таким образом осуществить молекулярное маркирование мутантного гена и проследить его передачу в потомстве в данной семье, т.е. уточнить диагностику у больных и выявить скрытых гетерозиготных носителей.

Диагностическая эффективность ПДРФ - анализа определяется шпротом спектра аллельных вариантов (диаллельные, полиалельпые системы) и зависит от частоты встречаемости соответствующих аллелей в популяции. Известно, что частоты различных аллелей даже для одного полиморфного сайта могут обнаруживать существенные межпопуляционные различия. К началу наших исследований по гемофилиям А и В данные о популяционных особенностях вне-и внутригенных полиморфных сайтов генов FVIII и IX у жителей России и стран СНГ отсутствовали. Между тем, только при наличии таких данных и эффективных способов детекции полиморфных аллелей методом ПЦР-анализа можно было разработать эффективную стратегию молекулярной диагностики этих заболеваний. Следует также обратить внимание, что исследования особенностей популяционного полиморфизма молекулярных маркеров (аллелей полиморфных сайтов) имеют не только важное прикладное значение для медицинской генетики, но представляют большой самостоятельный интерес для популяционной генетики человека в плане изучения проблем этногенеза и генетической дивергенции популяций, наций и рас.

Несмотря на то, что за последние 10 лег после идентификации обоих генов и анализа их первичных молекулярных последовательностей были зарегистрированы многие сотни мутаций как в гене FVIII (Antonarakis ct al.,1995),так и в гене FIX (Gianelli et al., 1993), прямой способ молекулярной диагностики этих заболеваний до сих пор не нашел широкого применения. Причины этого- отсутствие мажорных (частых) мутаций и отсутствие выраженных "горячих точек", где происходят типичные поломки, и сравнительно большие размеры гена (FVIII).

Исключением из этого правила оказалась недавно обнаруженная инверсионная мутация интрона 22 гена FVIII, которая была идентифицирована почти у половины всех больных с тяжелой формой гемофилии A (Lakish et al.,1994). Однако, частота этой мутации в отечественной популяции, ее удельный вес у больных с гемофилией А в России оставались совершенно неизученными. В равной мере, ничего не было известно и о спектре точечных и других мутаций генов FVIII и IX в России и в других странах бывшего СССР. Выяснение этого круга проблем и явилось предметом настоящей диссертационной работы, начатой в 1987г. в Лаборатории пренатальной диагностики ИАГ РАМН.

Цели и задачи исследования.

Цель: На основе ПДРФ - анализа генов FVIII и IX в различных популяциях и молекулярно-генетического анализа мутаций этих генов у больных гемофилией А и В разработать оптимальные молекулярные способы выявления гетерозиготного носительства и пренатальной диагностики этих заболеваний.

Задачи исследования :

1)Осуществить подбор и оптимизировать работу систем олигопраймеров для анализа Xba I, Hind III, (СА)„ полиморфизмов в гене FVIII, а так же Tag I и Hinfl полиморфизмов в гене FIX.

2) Изучить особенности аллелыюго полиморфизма внутригенных ДНК-сайтов XbaI,HindIII,BglI и (СА)п и внегенного полиморфного локуса DXS52 (зонд Stl4) гена FVIII в различных популяциях жителей России и некоторых стран СНГ.

3) Проанализировать популяционные особенности аллельных вариантов внутригенных ДНК-сайтов Taql и Hinfl гена FIX .

4) Провести направленный поиск мутаций в гене фактора VIII и IX у больных гемофилией.

5) Изучить частоту и типы инверсионной мутации интрона 22 гена FVIII у больных гемофилией А северо-западного региона России.

6) Отработать оптимальную схему молекулярного обследования семей высокого риска с гемофилией А и В для последующей пренатальной диагностики и выявления гетерозиготного носительства .

Научная новизна и практическая значимость работы.

В настоящем исследовании впервые проведена оценка частот аллельных вариантов ряда внутри- и внегенных полиморфных сайтов генов FVIII и FIX в популяции Северо-Западного региона России, узбекской и казахской популяциях; впервые выявлены межпопуляционные особенности аллелыюго полиморфизма этих генов для жителей России и Средней Азии; впервые обнаружены и охарактеризованы новые аллели для двух полиморфных сайтов (DXS52 гена FVIII и Hinfl гена FIX) и показана принципиальная возможность

использования мсжпопуляционных различив в спектре и типах аллелей изученных полиморфных сайтов в геногеографии и этногенезе. Впервые изучены показатели гетерозиготности тестированных полиморфных сайтов генов FVIII и FIX, дана оценка их информативности в различных популяциях России и некоторых стран СНГ, и предложена оптимальная схема молекулярно-генетического анализа в семьях с гемофнлиями А и В. Используя данный подход впервые в СССР и в России осуществлены молекулярно -генетический анализ гетерозиготного носительства и прснатальная диагностика в семьях высокого риска с гемофилией А и В (всего 240 семей). Впервые в отечественной популяции осуществлено тестирование инверсионной мутации интрона 22 у больных тяжелой формой гемофилии А, установлена высокая частота (45%) этой мутации, т.е. доказана ее большое диагностическое значение для жителей Северо-западного региона России, проведена количественная оценка различных подтипов этой мутации. Впервые у больных гемофилией России предпринят направленный поиск мутаций в гене FVII1, обнаружены две крупные делеции и идентифицированы пять точковых мутаций, две из которых найдены впервые.

Апробация работы.

Представленные в диссертации результаты докладывались на Всесоюзных и Международных симпозиумах и конференциях: па XIX научной сессии, посвященной памяти профессора Д.О.Отто (1990г.), Международной конференции педиатров породненных городов (Одесса 1990г.), Всесоюзных конференциях" Геном человека" (1990 и 1991гг. Персславль-Залесский), II Всесоюзном Съезде медицинских генетиков (1990г. Алма-Ата), па I Российском Съезде медицинских генетиков (1994г. Москва), на XY Конгрессе Международного Общества по тромбозу и гемостазу (1995г. Иерусалим).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано одиннадцать работ.

Структура и объем диссертации.

Работа изложена на 112 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал представлен 7 таблицами и 12 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения собственных исследований, заключения, выводов. Список цитируемой литературы содержит 90 источников.

Работа проводилась в лаборатории пренатальиой диагностики Института акушерства и гинекологии РАМН под руководством доктора медицинских наук профессора В.С.Баранова и доктора медицинских наук Л.П.Папаян.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови, биоптатов хориона и амниоцитов, а также рестрикционный анализ, ник-трансляцию, блот-гибридизацию ДНК, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили согласно общепринятым методам (Маниатис и др. 1983, 1987). Поиск точковых мутаций осуществлялся при помощи SSCP анализа (Orita et al., 1989). Определение нуклеотидной последовательности проводили ферментативным методом с некоторыми модификациями, используя дидезокситерминаторы (Gyllensten et al.1988, Newton et al., 1988). Синтезированные олигопраймеры, использованные для ПЦР, получены из Вильнюса (НПО"Фермент"), Новосибирска (НПО"Вектор") и Москвы (ВГНЦ). Образцы крови больных гемофилией предоставлены Республиканским центром по лечению гемофилии, лабораторией свертывания крови Российского НИИ ГТ (г.С.Петербург ), Ташкентским институтом гематологии и переливания крови, Одесским медицинским институтом, а также от женщин группы высокого риска, поступающих на пренатальную диагностику и их родственников. ДНК зонды р.51.61 и р1.8 любезно предоставлены Р.Лоуном (Сан-Франциско,США), зонд р.482.6 Дж. Гитчиер (США), зонд St 14 Дж.А.Манделем (Страсбург, Франция). Анализ мутаций в гене фактора IX проводился в сотрудничестве с ВГНЦ(Москва).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Сравнительный анализ полиморфных локусов гена FVIII в различных

популяциях.

Проведен ПДРФ анализ трех различных внутригенных полиморфных сайтов гена FVIII в двух различных популяциях : у русских, преимущественно из Северо-Западного региона страны, и у узбеков. Нам представляется важным сопоставить полученные результаты и сравнить их с аналогичными данными для других изученных популяций.

таблица 1. частоты аллелей трех полиморфных локусоб гена еуш в явух популяциях (П11Р анализ).

Полиморфный сайт Размер аллеля п. о. Русские (Северо-Западный регион) Узбеки

Число изученных Х-хромосом Частота аллелей Гетерози-готность Число изученных Х-хромосом Частота аллелей Гетерози-готность

Hind III 250 160+90 56 0. 71 0. 29 0. 41 67 0. 72 0. 28 ' 0. 40 V

ХЬа I 96 68 + 28 70 0. 54 0. 46 0. 50 71 0. 14 0. 14 0. 50

(CA) n lntron 13 (СА)24 (СА) 23 (СА)22 (СА)21 (СА)20 (СА)19 (СА)18 (СА)17 96 0. 00 0. 10 • 0. 11 0. 19 0. 56 0. 03 0. 00 0. 00 0. 63 63 0. 00 0. 03 0. 03 0. 14 0. 80 0. 00 0. 00 0. 00 0. 34

Показано, что частоты аллелей Hind III полиморфизма (интрон 19) фактически совпадают в обеих изученных популяциях. Частота аллеля, соответствующего отсутствию сайта рестрикции, составляет 0.71 в русской и 0.72 в узбекской популяциях. Ожидаемая частота гетерозиготности в обеих популяциях равна 0,41, следовательно, более 40% семей русских и узбеков информативны по Hind III сайту.

Полученные данные положительно коррелируют с соответствующими частотами определенными в европейских и азиатских популяциях (Р>0.05) и достоверно отличаются от частот аллелей, характеризующих чернокожих американцев 0.22 (Р<0.05) (WHO, 1992).

Частота аллеля Xba I полиморфизма (интрон 22), соответствующего отсутствию сайта рестрикции (фрагмент 96 п.о.), составила 0.54 в русской и 0.52 в узбекской популяциях. Ожидаемая частота гетерозиготности в обеих популяциях равна 0.50 (табл.1). Наблюдаемые в наших исследованиях частоты аллелей Xba I недостоверно отличаются между собой (Р>0.05) и от таковых в ранее изученных популяциях европейцев,а так же китайцев и японцев (WHO, 1992). Следует подчеркнуть, что наличие в X - хромосоме анонимного участка ДНК, гомологичного области Xba I полиморфизма 22 интрона гена фактора VIII существенно снижает количество информативных семей и, соответственно, уменьшает диагностическую ценность Xba I полиморфизма.

Частота редкого аллеля Bgl I полиморфизма ( фрагмент 20 т. п.о.) составила 0.09 в русской популяции и фактически не отличалась от европейской и японской популяциях (Р> 0.05 ), но достоверно отличалась от таковой у чернокожих американцев ( Р<0.05 ) (см. Табл.2.). Низкая частота гетерозиготности ( 0.18) делает малоинформативным Bgl I полиморфизм при исследовании в русской популяции. Анализ данного полиморфизма в дальнейшем проводился нами только в семьях, неинформативных по другим полиморфным сайтам.

Таким образом, при анализе трех полиморфных сайтов в гене FVIII в русской и в узбекской популяциях обнаружено сходство частот аллелей с ранее изученными европейскими и некоторыми азиатскими популяциями. Наряду с этим, доказано достоверное отличие обследованных нами популяций в

Таблица 2. Частоты аллелей двух полиморфных локусов гена ГУШ в русской популяции Северо-Западного региона ( метод гибридизации по Саузерну).

/

Полиморфный Аллель Число изучен- Частота Гетерози-

сайт/зонд т. п. о. ных Х-хромосом аллелей готность

20 0. 09

Bgl I 56 0. 19

5 0. 91

б. б 0

5. 2 0. 006

4. 8 - 0. 107

4. 5 0. 397

4. 35 * 0. 017

St 14/TaeI 4. 2 * 123 0. 006 0. 77

4. 1 0. 174

4. 0 0. 041

3. 9 0. 157

3. Ч 0. 091

« новые аллели

отношении проанализированных полиморфизмов от популяции чернокожих американцев.

При анализе (СА)„ полиморфизма в интроне 13 в русской популяции нами идентифицированы 5, а в узбекской- только 4 аллеля, в отличие от английской популяции, где число динуклеотидных аллелей равно 8 (Lalloz et al.1991). Аллель (СА)го оказался наиболее частым во всех изученных популяциях (Табл. 1). Его частота составила 56% в русской, 80% в узбекской и 45 % в английской популяциях (Lalloz et al.1991). При этом наблюдаемые межпопуляционные различия оказались высокодостовреными как между русскими и узбеками (Х= 12.57; Р<0.001) так и между английской и русской (Х=4.00; Р<0.05) популяциями. Вероятностные межпопуляционные различия русских и англичан определены по аллелю (CA)2t (Х=2.9 ;Р<0.1); русских и узбеков по аллелю (СА)22 (Х=3.47; Р<0.1) и по аллелю (СА)2з (Х=2.86; Р<0.1). Ожидаемая частота гетерозигот в русской популяции составляет 0.63, в узбекской - 0,34 (Табл. 1).

Таким образом, выявлено существенное отличие русской, узбекской и описанной ранее английской популяций, которое заключалось в уменьшении числа аллелей и снижении частоты встречаемости редких аллелей за счет увеличения частоты встречаемости частого аллеля (СА)„. Известно, что тандемные повторы обычно меняются в сторону увеличения числа коровых единиц, главным образом, за счет нарушения процесса репликации (соскальзопание реплнкативной петли) (Cooper,Krawchak,1987). Полученные нами данные позволяют предполагать, что процесс образования новых аллелей в микросателлитной ДНК идет с разной скоростью в разных популяциях.

Высокая частота гетерозиготности (СА)„ полиморфизма в интроне 13 гена OVIII в русской популяции свидетельствует о перспективности его анализа при изучении информативности семей высокого риска с гемофилией А.

■ При анализе частот аллелей в локусе DXS52 с использованием зонда Stl4 в наших исследованиях из 8 ранее описанных аллелей (Mandell et al. 1987) 7 были идентифицированы в русской популяции. Отсутствующий редкий аллель был в последующем обнаружен при семейном анализе больных с гемофилией А. Достоверные отличия в частотах аллелей между изученной нами выборкой из русской популяции и описанной Mande! et al.( 1989 ) французской популяцией определены для аллеля 5.3 т.п.о. (X = 4.54; Р<0.05) . Аллель 4.5 т.п.о.

преобладал в обоих популяциях. !.ю частота у русских составляет 39.7% (Табл.2).

Необходимо отметить, что частоты встречаимости всех аллелей данного локуса в изученных нами популяций отличаются от соответствующих частот аллелей китайской популяции (Р<0.05), в которой преобладающим был аллель 3.4 т.п.о. (44%) (WHO,1992).

В наших исследованиях в локусе DXS52 были обнаружены два дополнительных, ранее неописанных аллеля 4.35 и 4.2 т.п.о, частота которых составила, однако, только 1.7% и 0.8%. При семейном анализе гемофилии А в узбекских семьях был обнаружен дополнительный аллель 3.85 т.п.о. Таким образам, при популяционном исследовании была показана возможность идентификации новых аллелей в области 50 п.и. повтора локуса DXS52.

Показатель гетерозиготиости для данного полиморфизма найденный экспериментально, оказался очень высоким (0.73) и статистически не отличался от теоретически ожидаемого(0.77).

Сравнительный анализ полиморфных локусов гена FIX в различных

популяциях.

Популяционные различия частот и паттернов аллелей в гене FIX были значительно более выражены, чем в гене FVIII. Так, в популяции европейской части России аллель - 594 п.о. Taq I полиморфизма определяется с частотой 0,71, аллель- 463 +131 с частотой 0,29 ( табл. 3 ) . Частота гетерозигот 41 %. Эти результаты хорошо согласуются с обобщенными данными по европейским популяциям (0,75 и 0,25 соответственно) (WHO,1992), но существенно отличаются от таковых в популяциях Африки и Юго - Восточной Азии ( Lubahn et al. 1987.)

В то же время в азиатских популяциях СНГ нами идентифицирован еще один, дополнительный аллель (395 п.о.), являющийся по всей вероятности, результатом инсерционного полиморфизма. Эта находка стимулировала изучение частоты всех трех аллелей в различных популяциях СНГ. При этом в популяции европейской части России этого дополнительного аллеля не выявлено и так же как в популяциях Западной Европы идентифицировано только два аллеля: 350 п.о.(частота- 0,29) и ЗООп.о. (частота - 0,71 (Табл. 3). Эти

Таблица 3. Частоты аллелей двух полиморфных локусов гена FIX в трех популяциях.

полимор рфный сайт Размер аллеля п. 0. Русские(С. Западный регион) Узбеки казахи

Число изученных Ххромосом Частота аллеля Гетерози готность Число изученных Ххромосом Частота аллеля Гетерози готность Число изученных ххромосом Частота аллеля Гетерози готность

Tag I 594 463 77 0. 71 0. 29 0. 41 72 0. 85 0. 15 0. 26 30 0. 83 0. 17 0. 28

395 0. 14 0. 17

Dde I 350 300 80 0. 29 0. 71 0. 41 67 0. 14 0. 72 0. 44 30 0. 83 0. 28

частоты несколько отличаются от таковых среди жителей Западной Европы и негров ( 0,18 и 0,19 для большего по размерам аллеля соответственно). Изученная узбекская популяция имеет другую аллельную структуру. Частота аллсля 395 п.о. - 0,1 , аллеля 350 п.о. -0,21 и аллеля 300 п.о. - 0,69. Ожидаемая частота гетерозигот благодаря наличию дополнительного аллеля составила 0,47 и оказалась несколько выше, чем в европейских популяциях (0,41).

В дальнейшем исследование данного полиморфизма было продолжено в туркменской и азербайджанской популяциях. В туркменской популяции было обследовано 30 человек и дополнительный аллель не был обнаружен, частота аллеля 300 составила 0.75, что достоверно не отличалось от русской популяции. В азербайджанской популяции обследовано 20 человек и дополнительный аллель встретился в одном случае. Частота аллеля 300 составила 0.72 и также достоверно не отличалась от частоты этого аллеля в русской популяции.

Таким образом, область распространения дополнительного аллеля преимущественно ограничена казахской, узбекской и, возможно, территориально близко расположенными популяциями. Тестирование данного полиморфизма перспективно для изучения процессов миграции данной группы тюркского происхождения и для выяснения национального принадлежности конкретного человека.

Идентификация мутаций у больных гемофилией.

К настоящему времени в гене FIX идентифицировано более 300 различных мутаций, подавляющее большинство из которых представляют собой точечные замены, нередко затрагивающие области CpG динуклеотидов этого гена . При анализе мутаций у больных гемофилией В в a, b+c, d, е, g, h экзонах гена FIX в наших исследованиях было обнаружено наличие делеции экзонов g и h в одном случае. Еще у одного больного гемофилией В обнаружена протяженная делеция, захватывающая экзоны b+c, d, е, f, g.

Подавляющее большинство точечных мутаций гена FIX (74%) сосредоточена в экзонах b+с и h, т.е. эта область гена наиболее уязвима для мутационных повреждений. В наших исследованиях ни у одного из 14 пациентов с гемофилией В, не было найдено мутаций в этих экзонах. Таким образом, в силу пока неизвестных популяционных особенностей горячие точки

мутаций у больных гемофилией В отечественных популяций, по - видимому, находятся в других районах гена FIX.

Действительно, при SSCP -анализе у 15 больных гемофилией В в двух случаях точечные мутации были обнаружена в экзоне е, по одной в экзонах d , f и g. В трех случаях из пяти мутации влияли на электрофоретическую подвижность амплифицированных фрагментов в 6% ПААГ, 10% глицерине не только одноцепочечной, но и двуцепочечной ДНК. Прямой сиквенс амплифицированных фрагментов экзонов е и d позволил идентифицировать три миссенс мутации, две из которых обнаружены впервые. Все три мутации были связаны с тяжелой формой гемофилии В. В трех семьях из пяти данные по анализу мутаций совпадали с данными, полученными с помощью ПДРФ анализа. Одна из семей была неинформативной по результатам ПДРФ анализа и идентификация мутации позволила провести пренатальную диагностику. Еще в одном случае при помощи SSCP-анализа удалось уточнить и подтвердить диагноз, ранее поставленный биохимическими методами.

Таким образом, в изученной нами выборке больных с гемофилией В частота делеций гена FIX сравнительно не велика и вполне сопоставима с литературными данными. Основная часть мутационных изменений, приводящих к заболеванию, представлена точечными мутациями. В изученной нами выборке больных гемофилией В эти мутации не были выявлены в известных "горячих точках" гена, но были обнаружены в других, сравнительно редко мутирующих экзонах. Дальнейший, направленный поиск мутаций в гене FIX необходим для того, чтобы судить о наличии или отсутствии популяционных особенностей в паттерне точечных мутаций этого гена.

Мутации в гене FVIII представлены как крупными структурными перестройками (делеции, дупликации, инсерций) так и многочисленными точечными заменами, затрагивающими преимущественно области, богатые CpG динуклеотидами.

Крупные делеции в гене FVIII зарегистрированы нами у 2-х из 20 больных гемофилией А, т.е. их частота существенно не отличается от литературных данных (Antonarakis et al., 1995).

Особый интерес представляют на наш взгляд данные о частоте недавно обнаруженной у больных с гемофилией А инверсионной мутации,

Таблица 4. Точковые мутации у больных гемофилией В.

Экзон Метод определения Локализация Изменение в белке

d SSCP.секвенирование 10468 G - А Тгр 142 - Stop

е SSCP.секвенирование SSCP 17755 G - А 17700 С - А Gly 114 - Arg Сус 95 - stop

е SSCP

f SSCP

Таблица 5. Результат ДНК -диагностики в семьях с гемофилией А и В. ■

Изученный полиморфизм Количество семей Диагностика носительства Пренатальная диагностика

Всего ИнФорма тивные Установлено Отвергнуто Всего Больных плодов

ГЕМОФИЛИЯ А Hlnd III Xba I, St 14 210 160 42 52 28 18

ГЕМОФИЛИЯ В Taß I Dde I 24 12 б 10 3 2

затрагивающей интрон 22 ( Lakish et al.,1994). Известно, что данная мутация встречается почти у половины больных с тяжелой формой гемофилии А. Удельный вес данной мутации в этимологию тяжелых форм гемофилии А у отечественных пациентов оставался невыясненным. Нами предпринята попытка оценить вклад этой мутации в данную патологию. С этой целью изучена частота встречаемости инверсионной мутации в образцах ДНК 54 больных гемофилией А. 20 больных имели тяжелую форму и 34 недифференцированную форму гемофилии А.

Наши данные показали, что из трех рекомендуемых рестриктаз ( Neo I, Dra I, Bel I) наиболее воспроизводимые и четкие результаты блот-гибридизацин по Саузерну могут быть получены с рестриктазой Dra I. Из 54 больных гемофилией А, изученных нами, инверсионная мутация была обнаружена у 24 ,т.е. у 45%. всех больных, что хорошо коррелирует с мировыми данными (Rossister et al.1994; Antonarakis et al.,1995). Детальный анализ показал, что из 3-х возможных типов мутаций инверсионного типа, затрагивающих различные фрагменты нитрона 20 в исследованной выборке 18, больных гемофилией А тип1 имели 12 человек (75%), тип II 6 человек (25%),а редкий тип III не обнаружен ни в одном случае. Эти результаты соответствуют ранее полученным данным для больных гемофилией А других популяций. Полученные результаты свидетельствует о том, что частота и тип возникновения инверсионной мутации определяются первичной структурой данного фрагмента гена FVIII.

Серьезным препятствием для детальных молекулярных исследований гемофилии А и В в России является недостаточно полное биохимическое и иммунологическое обследование таких больных. Отсутствие подобной информации создает серьезные трудности при сопоставлении отечественных и аналогичных зарубежных данных. В частности, это не позволяет изучить причинную связь между мутацией и ее проявлением, т.е. делает невозможным анализ взаимоотношений генотипа и фенотипа при данной патологии.

В заключении необходимо отметить, что исследованные нами полиморфизм гена FVIII оказались достаточно информативными для проведения пренаталыюй диагностики и диагностики носительства гемофилии А в 180 из 230 обследованных нами семей (табл. 4). В 50 неинформативных семьях вопрос о пренаталыюй диагностике или о диагностике носительства

стоял только в двенадцати семьях, в которых было рекомендовано или проводилась биохимическая пренатальная диагностика во втором триместре беременности.

Совместное использование описанных полиморфизмов позволило установить в информативных семьях носительство гемофилии А в 42 и отвергнуть в 52 случаях. Пренатальная диагностика проводилась в 28 семьях и в 18 случаях определены мальчики, больные гемофилии А.

Из 24 семей с гемофилией В (Табл. 4) информативными оказались двенадцать, причем семь - при тестировании Taq I полиморфизма и семь - при Hinf I / Dde I инсерционного полиморфизма. В этих семьях совместное исследование позволило установить носительство у шести женщин и отвергнуть его у десяти. Пренатальная диагностика проводилась у трех женщин. В двух случаях определены девочки неносительницы гемофилии В, в одном мальчик больной гемофилией В.

ВЫВОДЫ.

1. Осуществлен подбор и оптимизированы система олигопраймеров для анализа Xba I, Hind III, (СА)„ полиморфизмов в гене FVIII, а так же Tag I и Hinf I полиморфизмов в гене FIX.

2. Проведен популяционный анализ частот встречаемости аллелей впутригенных полиморфизмов Bgll, Hind III, Xba 1,(СА)„-интрон 13 и внегенного полиморфизма локуса DXS52 (St 14) в русской популяции; в локусс DXS52 обнаружены аллели, не описанные раннее-4.35 и 4.2 т.п.о.

3. Наиболее информативные внутрнгенные полиморфные сайты Xbal, Hind III, (СА)п-интрон 13 проанализированы в русской и узбекской популяциях, частоты встречаемости аллелей полиморфного сайта (СА)„ достоверно отличаются в исследованных популяциях. На основе полученных данных разработана и апробирована оптимальная схема ДНК-анализа семей с гемофилией А.

4. Проанализированы частоты аллелей Taql и Hinfl полиморфизмов в русской, узбекской, казахской, туркменской и азербайджанской популяциях. В казахской, узбекской и туркменской популяциях обнаружен дополнительный

аллель Hinfl инсерционного полиморфизма. Частота данного аллеля была меньше в более западных популяциях.

5. В 7 случаях из 20 у больных гемофилией В обнаружены мутации гена FVIII: 2 крупных делеции и 5 точковых мутаций. 2 точковые мутации описаны впервые: 1048G-A (Trp72-Stop) и 17755G-A (Glyl 14-Arg).

6. Проанализированы частота встречаемости и патерн инверсионной мутации в выборке из 54 неродственных больных с гемофилией А. Прямая молекулярная диагностика инверсионной мутации гена FVIII особенно эффективна при использовании рестриктазы Dra I.

7. ДНК-диагностика проводилась в 210 семьях с гемофилией А. 160 семей оказались информативными, носительство мутации гена FVIII установлено у 42 и отвергнуто у 52 женщин высокого риска . Пренатальная диагностика проводилась в 28 случаях и в 19 случаях у плодов мужского пола определено наличие мутантного гена и беременность была прервана.

8. ДНК-диагностика гемофилии В проводилась в 20 семьях. 12 были признаны информативными; в 3 случаях проводилась пренатальная диагностика, в 2-х случаях было рекомендовано прерывание беременности.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.М.В.Асеев, Т.Э.Иващепко, Т.А.Андреева, П.В.Хролова, Л.П.Папаян, В.С.Баранов. Изучение аллелыюго полиморфизма информативности специфических ДНК-зондов в семьях с гемофилией А.// Биохимия-медицине, Ленинград, Тезисы докладов научной конференции, 1988,29-30.

2. М.В.Асеев, Т.Э.Иващенко, В.Н.Горбунова, Т.А.Андреева, П. В.Хролова, Л.П.Папаян, Е.Л.Кузьменко, В.С.Баранов. Выявление гетерозиготного носительства и пренатальная диагностика гемофилии А при помощи ДНК-зондов. // Гематология и трансфузиология,1989,Ы11,10-13.

3.М.В.Асеев, В.С.Баранов. ДНК-зондовая пренатальная диагностика и выявление носительства гемофилии А.// Тезисы докладов XIX научной сессии, посвященной памяти профессора Д.О.Отта, 1990, 10-12.

4. М.В.Асеев, Т.Э.Иващенко, В Н.Горбунова, В.С.Баранов. ПДРФ-аналнз и диагностика гемофилии А при помощи ДНК-зондов. // Биополимеры и клетка, 1990, т.6, N 2, С.45-52.

5. М.В.Асеев, В.С.Баранов. Исследование гена фактора VIII свертывания крови в диагностике гемофилии А.//Тезисы доклада на первой всесоюзной конференции, Москва, 1990, С. 147-148.

6.В.С.Баранов, М.В.Асеев, Н.Г.Горностаева, К.Т.Бабоев, Л.П.Папаян, Т.А.Андреева. Выявление гетерозиготного носительстпа и пренатальная диагностика гемофилии А и В молекулярными методами.//Материалы всесоюзного совещания, Барнаул, 1991.

7. М.В.Асеев, Н.Г.Горностаева, В.С.Баранов. Некоторые проблемы диагностики гемофилии А и возможные пути их решения. // Биополимеры и клетка, 1991, т.7, N 5, С.29-34.

8.Baranov V.S.,Gorbunova V.N.,Ivaschcnko T.I.,Shwed N.Y., Malysheva O.V.,Aseev M.V., Kascheeva Т.К., Lebedev V.M., Micliailov A.V.,Vakharlovsky V.G., Kuznetzova T.V. Five years expericncemin prenatal diagnosis of inherited deseascs in the north-european part of the USSR.//European Society of Human Genetics, Annual meeting, Leuvean, Belgium. Abstr., 1991, P.162.

9.M.Aseev, V.S.Baranov. Allele polimorphisms studies and molecular diagnosis in haemophilia A and Bpanitnts from Russia and from some Asian republics of the former USSR.// 1 st Balkan meeting on Human Genetics, Thessaloniki, Greece. Abstr.,1994. P. 116.

10. M.V.Aseev, V.L.Surin, K.Baboev, N.Gornostaeva, T.Kuznetzova, T. Kascheeva, T.Ivaschenko, G.Solovyev, V.Vacharlovsky and V.S.Baranov. Allele frequencies and molecular diagnosis in haemophilia A and В patients from Russia and from some asian republics of the former U.S.S.R./ /Prenat.Diagn, 1994, v. 14, P.513 -522.

11. M.Aseev, V.Surin, L.Papaian, V.S.Baranov. Allele frequencies and molecular studits of haemophilia A and В in Russia,Uzbekistan and in Kazachstan republics. //Thromb. Haemostas.,1995, v.73, пб, P. 1220.