Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ключевые звенья метаболизма пуринов тромбоцитов при гемофилии А и гетерозиготных носителей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ключевые звенья метаболизма пуринов тромбоцитов при гемофилии А и гетерозиготных носителей"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГЕ/АТОДОГИЧЕСКИЯ НАУЧНЫЯ ЦЕНТР

На правах рукописи

МАРЕЕВА Татьяна Борисовна

КЛГЧЕВЫЕ ЗВЕНЬЯ МЕТАБОЛИЗМА ПУРИНОВ ТРОМБОЦИТОВ ПРИ гаомлии А И ГЕТЕРОЗИГОТНЫХ НОСИТЕЛЕЙ

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Мссхва, 1Э91

ХЕШИ

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор В.А.Макаров доктор биологических наук, профессор В.А.Исаченков

Ведущая организация: Институт питания АМН СССР

Защита диссертации состоится " 1991 г.

в 14 часов на заседании Специализированного совета Д 074.08.02 во Всесоюзном гематологическом научном центре КЗ СССР / 125167 Москва, Новозыковский проезд, 4-а /.

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного гематологического научного центра МЗ СССР.

Автореферат разослан * i " уч-оЛчЯ. 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

старший научный сотрудник В.Д.Реук ■■'*■

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА' РАБОТЫ

Ак^^ьность jipog^evij. Гемо*ялия А, наиболее рпспростра-ненное и тяжелое наследственное заболевание системм гемостаза, привлекает большое внимание' различий исследователей. В последнее время, благодаря разрити»: методов молекулярной биологии, достигнуть; значительные успехи в изучении 'этиологии У патогенеза геэд^'лии А: выделен и клонирован ген фактора УШ { I.I.Toole et al , I9?4; J.Gitscher, W.J.Wood , I9P6; O.A.Ve-har et al , 1965),.охарактеризована его структура ( A.Whit«, 1959), изучена'экспрессия in vitro .( 1.1.Toole, D.D.Fittman, 1985), природа некоторгэс , «утаи'й ( J.Gitscher et «i , 1985; •J.OitscfcVr , I9?3; F.L.Kovard , 19"?).

.Однако, в связи с возрастании распространением заболеваниям учазением случаев спонтанной гек*у*илии ( a.rc.Lovn et al 1985; З.С.Баркаган, I95c; J.Gitscher , 1988), недостаточной точностью и надежнзстья еузествуазюс. методов детекции кондукторов гемофилии, обусловленной вариабельностью экспрессии гена фактора УШ у гетерозигот и нормальные гокозигот • • ( J.B.Grahaa , 1977; .Ю.Н.Токарев, О.П.Шпщ, 1978; г.Chen , 1962; И.Б.Снегирева-Дгшыденко с соавт.,1986), зависимостью-от возраста и группы крови обследуеьок ( D.S.HcLellian , I9S8), остается постоянно актуальной проблема генопрофилакти-ки гемо^ллии А, цель» которой является выявлений женщин-гете-розиготных носителей дефектного гена фактора УШ (0. П. Плющ с соавт. , 1986; З.С.Баркаган, 1988). Использование эндонуклеаэ рестрикции в качестве зондов для детекции мутаций в геномной ДНК представляется наиболее перспективным направлением диагностики гетерозиготного носительстса патологического гена

( i..ü .X'uddenham , 1987; m.L.¿anco , I9F7; A. Vojiesour.f ion , I9Í3B), но вопрос о иироком применении данных методов в целях генетического консультирования вызывает серьезное сомнения, связанное прежде всего со сложностью их воспроизведения В условиях клинической лаборатории ( K.tt.Lown , G.A.Vehar , I9Cö).

•Поэтому, до настоящего времени сохраняет свою актуальность поиск биохимических маркеров гемофилии А. Биохимические аспекты патогенеза гемофилии практически не изучены. В этом отноаении осаСий интерес представляет исследование,ферментов, гени которых локализованы в непосредственной близости от гена {актора УШ (З.С.Боркаган, 19Я5). Известно, что гены гл^козо-б-^ос^атдегидрзгёназы (Г-с-ФД), о( -галактззида-зы, .}оз^оглицераткиназм, ^ос^орибсзилгаро^ос^атсинтетазы и гипохсантан-гуанин?.ос$<>рибоэилтранс}ераэи локализованы в дас-т&льной части длинного плеча Х-хромосомы'как и ген фактора УШ ( V.A.KcKusick , 1977), Б ряде случаев в семьях с гемофилией А обнаруживали сопряженное нарушение ф.ункгии гена Г-б-ФД (дефицит активности в эритроштах), а также проявление .дальтонизма и цветовой слепога (Ю.Н.Токарев с соавт., 1977, с.S.Ed-gell . , 1970; Э.Бойтлер, I9&I). Биохимическое исследование • продуктов ¡экспрессии других генов не проводилось.

У§£ь_и_задаод_исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение важнейшего фермента обмена пуринов -гипоксантин-гуаяинфосфорибозилтрансферазы (ГФРТ) и уровня адениннуклеотидов тромбоцитов (как биохимического критерия функциональной полноценности тромбоцитов) при гемофилии А и гетерозиготных носителей, определение патогенетической значимости выявленных нарушений и возможности использования полученных данные в комплекса диагностических тестов детекции

гетерозиготного носительства гена гемофилии А. Для решения поставленной гели использовались следугкие подхопн:

- Разработка микрометода и определение активности ПРТ тромбогитов доноров и больны* гемо?илие? А.

- Ирелелов-янке- *ияико-химиоеских и кинетических параметров ПРТ тромбсгитов в норме и при гемофилии А.

- Исследование корреляпионноЯ зависимости между активностью ПРТ и содержанием адениннуклеотидов в различных бондах тромбогитов в норме и при гемофилии А.

- Определение активности ПРТ и урогкя адениннуклеотидов "пула гранения" тромбоцитов облнгатнътх гетероэигот по гену гемофилии А, а также огенка разработанинх критериев в комплексе различных диагностических тестов для иденти^икагии кондукторов гемофилии Л.

• Проведено исследование ключевых звеньев метаболизма пуринов в тромбоцитах крови (определение активности ПРТ и уровня' аяенинкуклеотидов в различных компартаен-тах), изучен ряд *изико-химических и кинетических характеристик ПРТ тромбоцитов в норме и у больных гемофилией А. •

Выявлен биохимический дефект в содержании адениннуклеотидов гранул хранения тромбоцитов при гемофилии А, указывавший на *унктаональную неполноценность тромбоцитов при данном заболевании и являтацийся следствием энэимопатии на уровне Фермента пути реутилиэаиии пуринов - ПРТ. На основании про-есдс:;!дл: исследования представлена новая информация о роля изучаемого Фермента в патогенезе гемофилии А.

Проведено комплексное обследование нескольких семей больных гемофилией Л с использованием разработанных биохимических ме-

методов и показана значительная кежсемейная вариабельность исследуемых параметров при данной наследственной патологии.

П£актическая_знащшость. Разработанный радиохимический микрометзд определения Г5РТ тромбоцитов может быть использован для обследования больньж и гетерозиготных носителей как- при гемофилии А, так и при подагре и синдроме Леша-Ниха-на..Метод определения адениннуклеотидов в'плотных гранулах тромбоцитов может быть рекомендован для практического здравоохранения в качестве диагностического теста для выявления функциональной неполноценности тромбоцитов и направленной терапии щм гемофилии, а также при различных фордах тромбо-цитопатнй.

Предложено использование биохимических методов-(определение активности ГФРГ и содержания адениннуклеотидов "пула хранения" тромбоцитов) в комплексе различных методов детек-. ции гетереэиготних носителей гемофилии А.

Ап^бщия^зботы состоялась 29 сентября 1939 года на. I межлабораторяой конференции НИИ биологической и медицинской химии АМН СССР.

Основные положения диссертации, докладывались на Всесо- ■ юзь.л.( съезде врачей-лаборантов (Таллинн, 1985), У Всесоюзном биох!1мическом съезде (Киев, 1986), Всесоюзном симпозиуме "Актуальные вопросы профилактики наследственных болезней" (Вильнюс, 1986), У Всесоюзном симпозиуме по проблеме "Медицинская энэимология" (Махачкала, 1986), ХУ научной конференции молодых .ученых ЩМИГПК ИЗ СССР "Актуальные вопросы гематологии и тргшефузиологии" (Москва, 1986), ХУ1 Республиканской научной конференции молодых ученых и специалистов ГССР

(Вакуриани, 1987), Всесоюзной конференции "Актуальнее вопросы диагностики заболеваний системы крови" (Сухуми, 1980).

« Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

QdíÉM-ü-ílEHSYES-ES^Üí" Диссертация состоит из введения, обзора, литературу, методической части, результатов собственных исследований, обсуждения и выводов. Количество страниц 130, рисунков 19, таблиц 23. Список цитируемой литературы включает 202 источника.

Результаты клинико-генеалогического енализа родословных, коагулогического и иммунохимического методов обследования сэ-мзй больных гемофилией А были предоставлены сотрудником Центра гемофилии ВГНЦ И.Б.Снегкревой-Дзвкденко.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы я методы исследования

Работа выполнена на тромбоцитах, выделенных из крови доноров, больных гемофилией А и гетерозиготных носителей.

Активность ШРТ определяли в экстрактах тромбоцитов. Фракшв тромбоцитов получаля методом центрифугирования на 'Знкаяло-Пяя. В котэство антппоагулянта использовали 3,8 % раствор нитрата натрия. Вццелеяша тромбоциты разрушали о звучи-ранием , центрифугировали при 25000 к в течение 20 мин и надо-сацодаую жидкость использовали в.дальнейшей работе. Активность ПРТ определяли радиохимическим методом. Речктюття смесь, обтемом 300 мкл содержала: (в-^О-гипоясянткн ( удельная psnnoPRTMPHocTb 14,5 мкКи/мл ) - 40 нмоль, ФосФорибояилпчро-. (f.or-TisT - 100 нмоль, тркс - Í1CI, р!1 7,4 - 10 милоль, Hij'óO^ _ ,

55 »«.моль, при содержании белка в пробе 10-120 мнг. Пробы им-

кубировали 15 мин при 37°С, реакцию останавливали 95 % этанолом (200 мкл). Радиоактивность (°-14С) - инозинмонофосфата (ИМФ) измеряли на автоматическом линейном анализаторе "Bert-holdI024" после разделения компонентов реакционной смеси на пластинах "Stlufoi " в системе растворителей: IM ацетат аммония рН 7,4 : 96 % этанол, в соотношении 3:7. Удельную активность- ГФРТ выражали в ныолях в час на I мг белка.

Белок определяли по методу Ло.ури ( O.H.i.ovry et al , 1951).

На схеме I представлены методы экстракции и определения аденинн.уклеотидов в различных отделах тромбоцитов.

Общее содержание аденинн.уклеотидов и "пул хранения" определяли биолюминесцентннм методом с использованием АТФ-ре-агента ("LKB") на люминометро "1250 LKB-Wailac ". Количество АД5 измеряли после предварительного фосфорнлнровакия пиру-ваткиназой (ПК) в присутствии фос^оенолпирувата ис-

пользуя препараты фирмы " Boehringer". Концентрацию ATS и . Ада выражали в нмолях на Ю тромбоцитов ( H.Holmeen , H.J.Ve-isE , 1979; J.L.Daniel et al , 19P.0) .

Содержание адениннуклеотидоз метаболического дула и I'-акти;-.-АД$ оценивали радиохимическим методом по интенсивности ' включения радиоактивного предшественника в АТФ и АД$ после инкубации интактных тромбоцитов с -аденином (удель-

ная радиоактивность 0,2 мкКи/мл) в течение 2-х часов при 37°С. Радиоактивность аденинн.уклеотидов регистрировали на . счетчике "1210 uitrobeta " ("LKB"), после разделения смеси АТФ и А® методом нисходящей хроматографии на бумаге "Whatr man I" в системе растворителей: н-бутамол: ацетон¡ледяная уксусная кислота:а.и.\!иак (25 %) : вода, в соотношении 45:15:19: 2:2;_\ Общпо радиоактивность аденинн.уклеотидов вырахали в им-

I I

?ac. 1. Схеиа экстракция я определения содерзаняя аденаннуклеотндов з различных пузах тромбоютов.

пульсах в мин на 10^ тромбоцитов. Удельную радиоактивность ATS и АД5 выражали в импульсах в мин на I нмоль соответствующего нуклеотида ( H.Holmsen, Н.-J.Weiss , 1972).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследование активности, физико-химических свойств и кинетических параметров Г5РТ тромбоцитов доноров и больных гемофилией А

В соответствии с задачами работы, активность Г$РТ определена в тромбоцитах крови 19 доноров и 21 больного гемофилией А (табл. I).

Таблица.!

Активность Г$РТ тромбоцитов доноров и больных гемофилией А

Заболевание Гемофилия А п =21 ГФРТ ____^fiSibL'äS-äKÜEÜociba-tliiSSbZMCöSS. 78,1+6,3

Доноры. п=19 22,0+4,8 • '

Результаты, полученные при исследовании ГФР? тромбоцитов .доноров,'соответствуют данным, представленным в литературе ( et , 1.972), При гемофилии А ¡зыяБлен-замет-

ный дефицит активности ГФРТ, составляющий в среднем 35 % от нормы. - .

Биохимический механизм, ответственный за обнаруженный де-

фект в активности Г5РТ тромбоцитов больных гемофилией А неясен. Известно, что недостаточность Г2РГ - в&таейяего фермента обмена пуринов conpoBO*maCT тчкие тяжелые наследственные заболевания как синдром Лепа-Нихана и подагра ( J.к.Wilson et el , 1953). Оба заболевания, как и гемофилия А ■наследуется по рецессивно^, Х-сцепленному типу.

Широкая вариабельность !<утаний в структурном гене Г8РТ проявляется в разнообразии вариантных Форм этого фермента и определяет генетическую гетерогенность заболеваний, связанных с недостаточностью Г5РТ. В настоящее время изолированы и охарактеризованы многие структурные варианты ГЗРТ, различающиеся между собой по уровни активности фермента, Физико-химическим свойствам, кинетическим характеристикам, уровню нммунореяк-тивного белка и аминокислотной последовательное™ ( j.m.wh-son et al ,1955),

С цельп получения дополнительной информации о причинах выявленного нами дефицита активности ГЗРТ при гемофилии А было проведено сравнительное изучение физико-химических и каталитических свойств ГФРТ тромбоцитов доноров и больных, гемофи- . лиел А. Следует отметить, что как з отечественной, так и в зарубежной литературе данные о свойствах Г5РТ тромбоцитов в. норме и при патологии отсутствуют.

Било исследовало влияние различных метаболитов обмена пуринов: И®, ГМЗ, инозина и гипоксантина в концентрации 100 мкМ и 500 мкМ (в 4 раза превышающей концентрации субстрата). Результаты исследования суммированы в табл. 2.

Ряд метаболитов, таких как ИМ? и ГМ2 подавляют активность Г$РТ как у доноров, так и у больных гемофилией А. Тяк, И® в концентрации 100 мкМ имеет более выраженное ингиблру-пщее действие на ГЗРГ доноров по сравнении с ферментом бол?>-

Влияние метаболитов обмена пуринов ка активность ГФРГ тромбоцитов доноров и больных гемофилией А

I Боль-I ные | гемо-I Фили-|_ей_А_

{ I- К.

• 2. М.

| 3. П.

I 4. Р.

т

! 1 (мкМ) 7" ГЙ5 <мк.\!)

! юо ! боо . .4_______ \ 100 ! 500

! 19,6 ! 99,4 ! 53,0 ! 79,6

\ 39,4 { 46,9 ¡' 33.1 { 55,4

! 30,3 ! 51.1 ! 39,5 | 67,5

1 33,3 \ 71,5 ! 45,9 \ йО.8

Г 52,6+ 1 65,5+ ! 2,6 "{1.9 ! 27,2*1 72,6 + | 2,0 "1 0,5 "

Инозин | Гипоксантин _(мкМ)|____[мкМ}_____

500 { 500

I ' 0,0

0,0 0,0 0,0 0,0

0,0 0,0 0,0

Доноры п =4

27,3* I

3/7 | 0.0

ньк гемофилией, тогда как Г.\№ в той же концентрации ингибирует Р1РТ больных гемофилией в большей степени, чем фермент тромбоцитов доноров.

При концентрами нуклеотидов 500 мкМ различия в степени ингибирования Г$РТ в норме и при гемофилии А незначительны. Исследование влияния инозина на активность ГФРТ показало, что ::нозин не вызывает снижеГшя активности фермента тромбоцитов больных гемофилией А, в то время как активность ГФРТ доноров -снижается в среднем на 27 % от исходной. Гипоксантин в избыточной концентрации не оказывал эффекта ингибирования на ГФРТ тромбоцитов как в норме, так и при патологии, хотя в литературе имеется данные о значительном субстратном ингиби-ровашш Г'ЗРТ эритроцитов больных подагрой ( /..т.^ох е<:. ьХ,198*1).

Исследование термола'бильнисти ГЯТ тромбоцитов в норме и при ггасфцлни А показало, ■ что фермент больше гемофилией оказался болго устойчив к длительному температурному воздай-

стену) (в 2,3 разя) по сравнение с *<?рментом доноров (табл. 3).

Таблица 3

Термолабильность Г5РТ тгомТоцитов доноров и больнкх гемс?1?лией А

Заболевание

Гемофилия А п = 4

Активно.

исходная

Ъ 1 2Г; у—

Выход по актив-

24,7+3,3

14,9Л,2 ! С 1,9+5,6

Донорк

135,1+","

п = 4

На рис. I представлена крааш зависимости скорости катализируемой Г5РТ *ерм?нттг:;г,'1оГ! гсигж ( v ) от концентрации субстратов: гипоксянтинч ( в j) и фос-ГорибоэилгшрофосФата (s ;>) как в норме, так и при гемофилии А. Кривые имеют выраженный гиперболический характер, указывавй на подчинение кинетики реакции классическое уравнетп Михаолиса-Ментен. Рассчитанные графическим методом Лайнуивера и Еерка кинетические _параметрьт ГЗРТ тромбоцитов доноров и больных гемофилией А представлены я табл. 4.

Сравнительный анализ данных (табл. 4) свидетельствует об отсутствии значительных отклонений от нормальных значений Км и у мах Г£РТ тромбочитов больных гемофилией А, хотя небольшие вариант в значении исследуемых параметров все же следует отметить. У больного Р. показатель v мах ГФРТ для гипо-ксантака.бш в 3,8 раза, а для фосфорибозилпирофосфата в 3,0 раза ниже по сравнения с нормой, фермент больного К. характеризовался значением Км более высоким (20,0 мпМ) по сравнению с

икМ

-0,3 -0,2 -0,1 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 1/Й, мкМ ~Г

Вт - гипоксантин

- фоефорибозилшрофосфат ( ФРШ )

Рис Л. Зависимость скорости реакции ГФРТ тромбоцитов от концентрации гипоксантина и ФРПФ.

Кинетические характеристики ГФРГ тромбоцитов доноров и больных гемофилией А

I_____Гипоксантин_______

Заболевание | Км (ыкМ) рмах (икЧ/тн)

Гемофилия А | |

1. К.

2. П.

3. П.

4. Р.

I

33,3 22,2 16,1 10,0

Доноры п = 4

I

Л

25,0+2,0

1,6? 0,91 0,77 0,33

I,25+0,1

______ ФРПФ_________

Км (мкМ) |Умах(мкМ/мин) ____________________

20,0 2,6 7,1 7.7

0,52 0,30 0,41 0,14

4,5+0,2^ 0,42+0,01

неркой (4,5+0,2 мхМ).

Таким образом, исследование <Тизико-химических свойств и кинетических параметровГФРТ тромбоцитов доноров и больных гемофилией А выявило существенные различия в некоторых свойствах фермента, таких как термолабильность, степень ингибиро-вания фермента метаболитами обмена пуринов, тогда как кинетика ГФРТ тромбоцитов больных гемофилией практически не отличалась от нормы..

Дефицит ГФРТ у человека, наблюдаемый прд подагре и синдроме Леша-Нихана, как правило, является следствием различных мутаций: частичной или полной делении, точковой 1</тации, дупликации ( ¿.и.ипвог еь о1 ,1983). Обнаруженные нами изменения в физико-химических свойствах ГФРТ больных гемофилией А, сопровождающие дефицит активности этого фермента в тромбоцитах, косвенна указывает на возможный деЛект в структуре ГФРТ при данной патологии, идентификация которого требу-

- 14 -

от дополнительных исследований на уровне геномной ДНК.

Биохимическая характеристика функциональной полноценности тгембоюттов при гемофилии А

Использовать тромбоцитов в качестве объекта исследования ГФРТ при гемофилии А позволило солостазит,- обнаруженные изменения в активности фермента больше гемофилией с Функда-. ональной полноценность»; тромбоцитов, одним из вааснейпих критериев которой является уровень гдентануклеотг.дев. Тромбоциты уникальны в том отношении, что для них характерно высокое содержание адениннуклезтндэв, ассоциированных в трех функционально и морфологически различных фондах: "пул хранения", метаболический пул И ?-акТИН-АД5 ( Н.Heinsen , H.J.ùey , 1971; J.L.Daniel et al , 193':).

Сравнительное исследование профиля различных кэмлзртмен-тов адениннуклеотидов тромбоцитов доноров и больных гемэйига-ей А проводилось с цельв выявления возможного'дефекта и его точной локализации в клетке при данной патологии.

Показатели, характеризующие общее содержание адениннук-леотидов, концентрации ATS и АД5 "пула хранения", метаболического пула и Р-актин-АД5 тромбоцитов доноров, приведенные в табл. 5, находятся в полном соответствии с данными литература ( K.ltgurbil et al , 1978; J.L. Daniel , I960).

Результаты определения содержания общего цула адениннук-леотидов тромбоцитов больных гемофилией А указали на аномальные значения концентрации АТФ и Ада, являющиеся отражением дефицита адениннуклеотидов "пула хранения" тромбоцитов, локализованного в плотных гран,удах, тогда как содержание метаболического пула и Г-актин-АДО практически не изменялось по

Та5лица_5

Содержание адениннуклеотидов в тромбоцитах крови б о льни гемофилией А

Адсниннулле о та да _____________________.__{____

Обшчй пул, нмэль/Ю"' клеток

АТ5?

Пул хранения, нмзль/Ю^ клеток

Метаболический пул:

интенсивность™ включении (8-; С)-алэнина, импАкн/ т-9

1ч. кгвлзк

Р-ак-.тн-АД-,

имп/мин/1о9 клеток

сдельная рвдиоак-

тивдость, и!лп/шн/

нмоль

51,4+2,3 (п =14)

11,4+0,5 (п =14)

5325,7+198,5 (п -14)

106,2+6,1 ( (п =14)

Гемофилия А

40,9+2,9 (п"=12) 8,7+0,5

(п~=12)

5215,5+236,5 (и =12)

131,4+6,5 (п =12)

_____еанорц_

29,0+1,4 (п =14)

16,4+1,2 (п =14)

849,7+47,6 (п =14)

447,2+14,2 (п =14) } 30,4+2,1 ! (п =14)

16,9+1,0 {

(п~=12) |

5,9+3,7 ! (п"=12)

866,7+26,9

(п"=12)

440,2+3,7

(:Г=12)

53,0+2,6

(п~=12)

____

___

1,8+0,1 (п~=14)

0,7+0,0 (п"=14)

6,3+0,2 (п"=14)

_Гемо^илия_А I

2,4+0,1 (п =12)

1,6+0,2 (п =12)

6,0+0,1 (п"=12)

Примечание: в скобках - число больных

С1 I

- If, -

сравнению с нормой (табл. 5). Следует отметить более выраженный дефицит АДЕ пп отношению к АТФ "пула хранения" тромбоцитов больных гемофилией А, определяли!* резкое увеличение показателя АТО/А(в 2,3 раза), строго постоянного для тромбоцитов доноров (0,7+0,0).

Известно, что образование "пула хранения" адениннуклеоти-дов и формирование плотных грянул тромбоцитов происходит на уровне мегакариопитов и требует усиленного синтеза АТ9 и AJ5. Было показано, что для накопления избыточного количества адениннуклеотидов в мегакариоцитах используется не биосинтез пуринов "de novo а менее энергоемкий путь, известный как ги-поксантин- "salvage way " метаболизма пуринов, осуществляемый ГФРТ (R.F.ievine , H.K.Webster., I??I; B.H.Schick , P.K.Schick 1986). Следовательно, выявленная недостаточность, адениннуклео-тидоа гранул хранения тромбоцитов, больных гемофилией А отражает дезорганизацию функциональных систем мегакг.риспитов при даяний патологии и обусловлена обнаруженной нами энзимопатией на уровне фермента реутилизации пуринов-ГОРТ.

Дефицит адениннуклеотидов "пула хранения" тромбоцитов однозначно свидетельствует о дефекте резервации этих веществ в плотных гранулах и является диагностическим признаком гетерогенной группы заболеваний, определенных по классификации, предложенной З.С.Баркагеном (1988) как наследственные тромбо-цятопатии по типу недостаточности "пула хранения" (или болезни нарушетного накопления). Известно, что недостаточность "дула хранения" тромбоцитов" обычно проявляется нарушением (функции тромбоцитов в процессе гемостаза, но отмечено существование латентных, бессимптомных форм тромбоцитопатий с умеренным дефицитом адениннуклеотидов как и.в случае гемофилии а ( а.Ко-neti-Rao,H.Holm8en, 1986)Г

- 17 -

Следует отметить, что ранее дефект тромбоцитов при гемофилии не был показан, и в настоящее время ото заболевание классифицируется как наследственная коагулопатия, хотя у некоторых больных гемофилией А отмечались отклонения п функциональной активности тромбоцитов и дефектный уровень £ -тром-боглоб.улина в (¿-гранулах, коррелиругаций со степенью тяжести заболевания (н.А1-КопаЫгу , 1987).

Оценка активности ГФРТ и уровня адсииннуклео-тидов тромбоцитов в комплексе диагностических тестов на гетерозиготное носительство гена гемофилии А

Данные, полученные при исследовании активности ГФРТ тромбоцитов больных гемофилией А послужили основанием для изучения возможности их использования в комплексе с другими известными методами детекции, кондукторов патологического гена гемофилии А.

В табл. 6 представлены результаты определения активности ГФРТ в тромбоцитах крови облигатных гетерозигот, демонстрирующие дефицит активности фермента (е среднем 59'% от нормы) у всех обследованных женщин.

. Исследование содержания аденинн.уклеотидов "пула хранения" тромбоцитов облигатних гетерозигот выявило умеренный дефицит в содержании этих веществ, несколько менее зыраженкый, чем у больных гемофилией А, что явилось дополнителен!ил свидетельством корреляционной зависимости меиду уровнем активности ГФРТ и концентрацией адениннуклеотидов "пула хранения" тромбоцитов (табл. б). Как и у больных гемофилией, в плотных гранулах тром-боцитоо гетерозигот был отмечен преобладающий дефицит АДЕ по отношении к АВД,' определяющий увеличение показателя ЛТФ/АДЕ,

Активность Г$РТ и уровень аденинчуклеотидов "пула хранения" 'тромбоцитов облигатнък носителей гемобилии А

ГОРТ

Адениннуклоотидн

Облигатнне носители (п ='")

Доноры (и =14)

Активность ГФРТ, (няоль/ет~х~час117,3+14,2 | гнгХДТв

АТФ ! 9,1+0,7 ! 11,4+0,5

АД 5 | 1 ™1б~4л1г~

АТФ/АД? [ 1^0 Д | "о/7+о"о"

в среднем в 1,7 раза по сравнению с нормой.

Проведена оценка информативности'показателей активности ГФРТ и концентрации адениннуклеотидов "пула хранения" тромбоцитов в комплексе с данными клинико-генеалогического анализа родословных, коагулогического и иммунохимического методов де- . текши носителей патологического гена гемофилии А. Нами были обследованы больные гемофилией и их родственницы (облигатные и возможные гетероэиготы) 4-х семей (табл. 7). Значительная межсемейная вариабельность,наблюдаемая в уровне исследуемых параметров, по-видимому, является следствием генетической детерминированности дефекта ключевого эвена обмена дуринов при гемофилии А.

Сочетанноо использование различных критериев позволяет в некоторых случаях повысить точность выявления гетероэиготности по гену классической гемофилии. Так, когда по результатам дис-криминпнтного анализа данных определения УШ:С и УШК:Ае вероятность гетерозиготное™ окалывалась недостаточно высокой (Р «= 42 %), были отмочены значительные-отклонения в активности ГФРГ

Таблица 7

Идеитийикация носитеяей патологического гена гемофилии А

иб-сле-до-ван-ньге

А.

Т.

А.

т 1.

Р.

р^

к.

к.

'м.

Генотип

Облигатная

гетерозиго-

та

Больной

Больной

Облигатная гетерозигота

Больной-

Вероятная гетерозигота

Больной

Вероятная гетерозигота

Больной

УШ:С а

/о

50

50 2 2

30

2 44 2

33

?

50200

ивув

а>

104

112

82 98

НО

85 140 101

47

68

50200

Вероятность но-_сителъствал__%___

по I . УК: С ито-родо| упщ.д^ ! го-слов* ""'•"в I иад _но£Ц______

I

100 100

100 50 50

100 100

100 99 42

100 100

100 99 42

Г5РТ нмоль/

МГ бСЛ-1

ка/час

Общее содержание

~т"7~~ атф" А»

2,0

2,1

2,2

2.4

2,0 2,7 3,1

2.5 2,0 2,1

Пул 'хранения

АТС>~[ АД5

I

6,3 | 4,8

I

6,0 I

А 4 !

7,9 |

8,0 I

12,2 |

6,6 |

6.7 |

10,5 '

5,9

2.5 2,9

8.6 9,9

5.0

6.1 9,5

12,0 ! 10,9 г_ .

Д-

1,8+ о!г

(14) | (14) ! (14) |

11.4+ , ^ , " \ 1,2 " |

АТ5 ~АДГ

1,3

1,2

2,5 2,8

0,9

1,2

1,3

1,1

1,1

С,7+~ 0^0"

(14)

0

1

(50 % от нормы) и п содержании адениннуклеотидов "пула хранения" тромбоцитов (табл. 7).

Таким образом, использование данных определения активности Р5РТ и уровня АТФ и АДФ плотных гранул тромбоцитов-в комплексе с другими тестами может служить источником дополнительной информации для идентификации генотипа возможных ге-терозигот по гену гемофилии А, а также позволяет провести оценку функциональной полноценности тромбоцитов при гемофилии в плене проведения обоснованной терапевтической коррекции их возможной дисфункции.

ВЫВОДЫ:

1, Установлена возможность использования ключевого фермента метаболизма пуринов тромбоцитов - гипоксантин-гуанин-фоофорибоэилтрансфораэн в качестве биохимического маркера гемофилии А,

2. Сравнительная оценка активности, физико-химических и кинетических параметров гипоксантин-гуанинфосфорибозилтранс- • феразы тромбоцитов в норме и.при гемофилии А.указывает на возможную мутацию в структурном гене фермента при данной патологии.

3, Выявлен биохимический дефект в уровне адениннуклеоги-дов (AT®, A^) плотных гранул, отражавший первоначальный дефект в развитии могакариоиитов я отсутствие изменений метаболического фонда птих веществ в тромбоцитах при гемофилии А.

4. Дефицит адониннуклеотидоп явлпется следствием энзима-патам на уровне "nol-vng* way " метаболизма пуринов, а' выяв-лепчед Ф(унгатонпльная неполноценность тромбоцитов большее гэ-

мофллисй А и гетерозиготных носителей свидетельствует о делите запасных фондов по типу болезней пула накопления.

5. Отмечен различный уровень активности гипоксантим-гуанинфэсфорибозилтрансферазн и адениннуклеотидов тромбоцитов больных гемофилией А и гетерозиготных носителей, указывающий на'значительную межсемейнуп вариабельность.

6. Однонаправленные изменения активности гипоксантин-гуанинФосфошбозилтрансферазы и содержания адениннуклеотидов плотных гранул тромбоцитов больных гемофилией А и облигатних гетерозигот свидетельствует о генетической детерминированности нарушений ключевого звена обмена пуринов пум данной патологии и отражают генотипические изменения в стволов!« клетках или мегакариоцитах. .

7. Определение активности гипоксянтин-гуанинфосфорибозил-грансферазы и уровня адениннуклеотидов тромбоцитов целесообразно использовать для медико-генетического консультирования

: целью повышения точности детекции гетерозиготных носителей ■емофилии-А в комплексе клинико-генеалогических, коагулогиче-¡ких и икмунохимических методов исследования, а также для вы-[вления дисфункции тромбоцитов при гецофилии и других формах аследственных и приобретенных тромбоциуопатий,

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЯ

1. АденинсБосфорибозилтрансфераза и гипоксантин-г.уанинфос-.эрнбозилтраысфзраза. тромбоцитов крови при наследственны: эзгулопатиях / Соковнина Я.М., Мареева Т.Б., Плющ О.П., )трин И.И.. - Вопр. мед. химии. - 1985. № 5. - С. 114-117.

2, Маоеева Т.Б., Соковнипв Я.М., Вотрин И.И. Значение

исследования адониннуклоотидпп о 'унктги опальной активности тромбоцитов при гемофилии А // Вопр. мед. химии. - 1987. -№ 2. - С. 100-104.

3. Мпреепа Т.Б., Соковнима Я.М., Вотрин И.И. Физико-хи-мичоские и каталитические свойства гипокспнтин^ос^орибяэйл-трансферазы тромбоцитов доноров и большее гемофилией А // Вопр мед. химии.- - 19'-9. - 5. - С. 99-103.

4. Мдрсепа Т.Б., Сокошппш Я.М., Морозова Н.Г. 'А (формам тивность биплчминссцентного метода определения пдениннуклеэ-тидов в тромбоцитах в плаче диагностики ■точения гематологических заболеваний // Симпозиум "Гематологические и цитологические исследования в клинической и лабораторной диагностике": Тезис» докладов. - Ивантеевка. 1990. - С. 2".

5. Особенности метаболизма пуриновья нугслеотидов тромбоцитов крови при гемофилии А и В / Соковнина Я.М., Пл'оц О.П., Мароева Т.Е., Поотина Т.Н. и др. - Всесоюзный симпозиум "Актуальные вопросы профилактики наследственную болезней": Тезисы Докладов. - Вильнюс, 1986. - С. II4-II5.

Р, Опенка активности гипокеантинфос^орибозилтрянсферазы . тромбоцитов и функционального состояния в комплексе диагностических тестов на гетерозиготное носительство гемофилии А , Соковн)!на Я.М,, Мдреева Т.Б., Плюя О.П., Снегирева-Давнденко И,Б, - У Всесоюзный симпозиум по проблеме "Медицинская энзи-мология": Тезисы докладов. - Махачкала. 1986. - С. 222-223.

7, Оценка функциональной полноценности тромбоцитов Соль-' ньк гемофилией А и гетерозиготных носителей / Мареева Т.Е., Соковнина Я.М., Снегирсва-Дапцденко И.Б., Вотрин И.И. - Гема-тол, и трансфуэиод, - I9SS. - № 2. - С. 46-49.

8, Снегирева-Давыденко К.Б., Мареепа Т.Б. Оценка активности гипоксоитинфосфорибозилтряксфсразы тромбоцитов п кош-

лексе диагностических тестов на гетерозиготное носительство гемофилии А // Научная конференция молодых учет« Ц1ИИГПК Ш СССР "Актуальные вопроси гематологии и транс ?узиологии": Тезисы докладов. - М., - С. 45-4G.

9. Соковнина Я.!.!., Мареева Т.Е. Биохимические маркеры дисфункции трсм5о*л«тзв при наследственных тромбоцитопатиях // Республиканская научная кон Je peinai я молодых учеши и специалистов Ï.Î3 ГССР: Тезисы докладов. - Бак/риани, 198?. - С. 3435.

10. Соковнина Я.М., Мареева Т.Б., Плющ О.П. Аденинфосфо-рибозилтранс*ераза и гипоксантин-гуанинфос(к>рибозилтрансфера-за тромбо!31тоэ крови при наследственных заболеваниях // Всесоюзный съезд врачей-лаборантов: Тезисы докладов. - Таллинн, 19Г-.Г,. - С. 142-143.

11. Соковнина Я.М., Мареева Т.Б., Снегирева-Давыденко И.Б. К вопросу о функциональной активности тромбоцитов при наследственных тромбопитопатиях // II Украинский съезд гематологов и трансфузиологов: Тезисы докладов. - Киев, 1986. -С. 179.

12. Ферменты обмена пуринов тромбоцитов при наследственных и приобретенных.тромбоцитопатиях /Соковнина Я.М., Мареева Т.Е., Богданова H.H., Пестина Т.И. и др. - У Всесоюзный биохимический съезд: Тезисы докладов. - Киев, 1985. - С. ЗС7-308.

. Подписано в печать 26.ûi.£)Tr. Заказ 501

Формат 6UX90/I6 . Тираж Г00

Москва. Типография ВАСЛШ