Исследование механизма образования двух пиков на кривой генерации тромбина и возможность применения этого эффекта для предсказания геморрагических осложнений

Тарандовский, Иван Дмитриевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование механизма образования двух пиков на кривой генерации тромбина и возможность применения этого эффекта для предсказания геморрагических осложнений
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизма образования двух пиков на кривой генерации тромбина и возможность применения этого эффекта для предсказания геморрагических осложнений"

На правах рукописи

Тарандовский Иван Дмитриевич

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ОБРАЗОВАНИЯ ДВУХ ПИКОВ НА КРИВОЙ ГЕНЕРАЦИИ ТРОМБИНА И ВОЗМОЖНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ЭТОГО ЭФФЕКТА ДЛЯ ПРЕДСКАЗАНИЯ ГЕМОРРАГИЧЕСКИХ ОСЛОЖНЕНИЙ

03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2013

2 8 НОЯ 2013

005541418

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки

«Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» Российской

академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Атауллаханов Фазоил Иноятович

Официальные оппоненты: Кондрашова Мария Николаевна, доктор

биологических наук, ФГБУ «Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН», главный научный сотрудник лаборатории Энергетики биологических систем

Дрозд Наталья Николаевна, доктор билологических наук, ФГБУ «Гематологический научный центр МЗ» Минздрава России, ведущий научный сотрудник лаборатории Патологии и фармакологии гемостаза

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-

химической биологии имени А. Н. Белозерского Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится « » 2013 года в_часов на

заседании Диссертационного совета Д.002.252.01 при ФГБУН «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАН по адресу: г.Москва, ул.Саморы Машела, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАН.

Автореферат разослан « » 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Николаева Ирина Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Система гемостаза является одной из важнейших систем организма, служащей для предотвращения кровопотери при нарушении целостности сосуда. Результатом работы этой системы является тромб, локализованный в месте повреждения сосуда и препятствующий выходу крови из него. Изучение этой системы является важной задачей для понимания принципов ее работы и предупреждения тромбозов и кровотечений в клинике. В настоящее время существует множество методов исследования свертывания. Тромбоцитарную часть системы гемостаза изучают, в основном, с помощью агрегометрии, микроскопии и проточной цитометрии. Для диагностики плазменного звена помимо исследования активности отдельных плазменных белков существуют так называемые интегральные тесты. Они призваны оценивать работу системы свертывания в целом. Самыми простыми из таких тестов являются времена свертывания, однако, на сегодняшний момент стало ясно, что они не дают достаточной информации о функционировании системы. В связи с этим развиваются новые интегральные тесты, более чувствительные к патологиям плазменного звена. Кроме того, активно исследуются возможности проводить эти тесты с участием тромбоцитов.

К современным интегральным тестам можно отнести тромбоэластографию, тест тромбодинамики и тест генерации тромбина (ТГТ), которому, в основном, и посвящена данная работа. Идея метода заключается в измерении кинетики производства и расходования тромбина в сворачивающейся крови или плазме крови с помощью предварительно добавленного в образец флюорогенного субстрата, специфичного к тромбину [11е§паи11, V., с! а1. 2004]. Как правило, в результате получают кривую зависимости концентрации тромбина от времени с одним максимумом. В данной работе впервые было показано, что при свертывании богатой тромбоцитами плазмы ингибиторы активации тромбоцитов способствуют образованию двух максимумов на кривой генерации тромбина. Был определен механизм этого явления и предложена новая модификация теста генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме, содержащей небольшую концентрацию ингибитора активации тромбоцитов.

Цель работы. Исследовать механизм образования двух максимумов на кривой генерации тромбина и оценить возможность применения этого эффекта для предсказания кровотечений у пациентов с тяжелой формой гемофилии А.

Задачи исследования.

1. Исследовать влияние малых концентраций ингибиторов активации тромбоцитов на генерацию тромбина в богатой тромбоцитами плазме, показав возможность образования двух максимумов на кривой генерации тромбина.

2. Исследовать влияние этих ингибиторов на секрецию а-гранул и экспрессию фосфатидилсерина тромбоцитами с помощью проточного цитометра.

3. Разработать метод оценки параметров кривой генерации тромбина с двумя пиками.

4. Исследовать статус системы свертывания у пациентов с легким и тяжелым течениями тяжелой формы гемофилии А с помощью теста генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме и в присутствии небольшой концентрации ингибитора тромбоцитов, позволяющей получить два пика на кривой. Сравнить полученные результаты с данными других современных интегральных тестов.

Научная новизна. Впервые показано, что при добавлении в богатую тромбоцитами плазму веществ, ингибирующих активацию тромбоцитов, на кривой генерации тромбина образуются два пика. Определен механизм образования двух максимумов на этой кривой. При добавлении ингибиторов активации тромбоцитов скорость экспрессии фосфатидилсерина на них снижается. Вследствие этого фосфолипидная поверхность, предоставляемая активированными тромбоцитами, появляется в плазме позже, и пик производства тромбина разделяется на два. Первый пик формируется, главным образом, за счет реакций свертывания на фосфолипидах плазмы и секреции а-гранулярных белков, на которые исследованные ингибиторы в выбранных концентрациях влияния не оказывали. Второй пик на кривой генерации тромбина формируется только за счет замедленного экспонирования фосфатидилсерина тромбоцитами. Далее был разработан метод анализа параметров двух пиков, базирующийся на аппроксимации кривой экстремальным распределением первого типа (распределением Гумбеля). Предложена возможность создания новой модификации теста генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме, в основу которой положено явление образования двух пиков на кривой генерации тромбина при добавлении диметилсульфоксида. Было показано, что амплитуда второго пика и эндогенный тромбиновый потенциал в тесте генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме являются единственными параметрами, достоверно отличающимися между группами пациентов с разной тенденцией к кровоточивости.

Научно-практическое значение. В данной работе ингибиторы тромбоцитов использовали в концентрациях, близких к применяемым в лабораторно-диагностической и клинической практике. Появление двух пиков на кривой генерации тромбина может свидетельствовать о том, что тромбоциты донора демонстрируют замедленную скорость экспонирования фосфатидилсерина. Эта информация может быть полезной при выборе доз антиагрегантов и антикоагулянтов. Также в данной работе предложен новый метод, позволяющий отражать клиническое состояние больных тяжелой формой гемофилии А. Полученные результаты позволяют предполагать, что коррекция свертывания при легком течении тяжелой формы гемофилии связана, главным образом, с тромбоцитами, экспрессирующими фосфатидилсерин в процессе их активации.

Положения, выносимые на защиту:

1. Показано, что ингибиторы активации тромбоцитов вызывают формирование двух пиков на кривой генерации тромбина путем снижения скорости экспонирования фосфатидилсерина на мембранах тромбоцитов.

2. Разработан метод оценки параметров кривой генерации тромбина с двумя максимумами.

3. Предложена возможность создания новой модификации теста генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме, содержащей ингибитор активации тромбоцитов в малой концентрации.

4. Показано, что амплитуда второго пика на кривой генерации тромбина и эндогенный тромбиновый потенциал в богатой тромобцитами плазме являются единственными параметрами коагуляционных тестов, различающимися у людей с легким и тяжелым фенотипами гемофилии А.

Апробация работы состоялась 26 марта 2012 года на заседании межлабораторного семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.

Результаты диссертационной работы были представлены на 5-й Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии», Москва, 3-5 февраля, 2011; 36th FEBS Congress, Torino, Italy, 25-30 июня 2011, XXIII Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Kyoto, Japan, 23-28 июля 2011, 58th Annual Meeting of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Liverpool, UK, 27-30 июня, 2012, XXIV Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Amsterdam, the Netherlands, 29 июня - 4 июля, 2013.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ. Статей в рецензируемых журналах - 2; публикаций в трудах конференций и съездов - 10.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 93 страницах машинописного текста, состоит из введения, списка сокращений, четырех глав (главы 1 - обзора литературы, главы 2 - описания материалов и методов, главы 3 -описания экспериментальных результатов, главы 4 - обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 253 источника. Работа выполнена на базе Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН в лаборатории молекулярных механизмов гемостаза (зав. лабораторией проф. д. ф.-м. н. Пантелеев М. А.) и Гематологического научного центра Министерства здравоохранения РФ в лаборатории физической биохимии (зав. лабораторией проф. д. б. н. Атауллаханов Ф. И.).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении показана актуальность исследуемой темы, сформулированы цели и задачи исследования, дана общая характеристика работы.

Глава 1 посвящена обзору литературы. Приведены основные сведения о плазменном и тромбоцитарном звеньях системы свертывания крови. Описаны ключевые прокоагулянтные функции тромбоцитов. Далее приведены данные о ключевых реакциях плазменной части системы гемостаза, о путях ее активации, ингибиторах свертывания и петлях положительной и отрицательной обратной связи. Описаны современные интегральные тесты для анализа системы гемостаза -тром'боэластография, тест тромбодинамики и тест генерации тромбина. Рассмотрена проблема качественного различия формы кривой генерации тромбина, получаемой в присутствии и в отсутствии тромбоцитов. Выдвинута гипотеза о существовании двух режимов генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме. Кроме того, описана

проблема гетерогенности клинических фенотипов тяжелой формы гемофилии А. Продемонстрировано, что природа формирования легкого клинического течения этого заболевания не выяснена и что на данный момент не существует интегрального коагулологического теста, позволяющего однозначно определять фенотип гемофилии.

В главе 2 описаны материалы и методы, используемые в работе. Помимо специфических методов, кратко изложенных ниже, приведены все реактивы, использовавшиеся при проведении экспериментов, методика выделения плазмы и тромбоцитов из крови доноров с помощью центрифугирования и гель-фильтрации. Приведены критерии выбора пациентов, страдающих тяжелой формой гемофилии А, для участия в исследовании. Описаны принципы проточной цитометрии для работы с тромбоцитами, методики проведения тестов генерации тромбина и тромбодинамики. Кроме того, приведены все способы обработки результатов экспериментов.

Основные растворы

Буфер А (150 мМ NaCl, 2.7 мМ КС1, 1 мМ MgCl2, 0.4 мМ NaH2P04, 2мМ HEPES, 5 мМ глюкозы, 0,5% альбумина бычьей сыворотки, рН 7,4) использовался для хранения свежевыделенных тромбоцитов перед экспериментом. Для контроля рН плазмы перед экспериментом в нее добавляли буфер Б, содержащий 145 мМ NaCl, 750 мМ HEPES, рН 7.4. Буфер В для проведения теста генерации тромбина содержал 20 мМ HEPES, 145 мМ NaCl, рН 7.5. Буфер Г представлял собой буфер В, содержащий дополнительно 100 мМ СаС12. Все упомянутые реагенты, а также, СаСЬ были производства фирмы Sigma-Aldrich (США). Свертывание в ТГТ запускали раствором ТФ в буфере Г. Для ТГТ в РРР использовали тромбопластин (смесь ТФ и фосфолипидов, выделенную из мозга кролика) фирмы Ренам (Россия). Для ТГТ в PRP использовали рекомбинантный человеческий ТФ (Инновин) фирмы Dade Behring (Германия). Для определения активности ТФ использовали систему Actichrome TF chromogenic activity assay (American Diagnostica, США). Флюорогенный субстрат Z-Gly-Gly-Arg-AMC фирмы Bachem (Швейцария) был растворен в ДМСО в концентрации 100 мМ и 25 мМ и хранился при температуре -20°С. Перед экспериментом субстрат разбавляли до концентрации 2,5 мМ буфером В.

Пациенты и здоровые доноры крови

Для исследований генерации тромбина в PRP использовали кровь здоровых доноров возрастом от 20 до 35 лет обоего пола, не принимавших никаких лекарств в течение двух недель перед днем забора крови и не имевших запротоколированных случаев спонтанных кровотечений или тромбозов. Все доноры дали письменное информированное согласие на участие в исследованиях.

Для исследования фенотипов гемофилии были выбраны 11 пациентов с клинически «легким» течением тяжелой формы гемофилии А и 10 пациентов с «тяжелым» течением гемофилии. Ни у одного из пациентов не было обнаружено антител к фУШ, способных образовываться в организме пациента из-за частых инфузий концентратов фУШ [Penner, J. А. 2001, Rizza, С. R., et al. 1983]. Опыты по выявлению этих антител проводили сотрудники Центра Гемофилии ГНЦ МЗ,

используя систему Nijmegen modification of the Bethesda assay for factor VIII:C inhibitors [Verbruggen, В., et al. 1995].

Клиническую тяжесть заболевания оценивали по следующим критериям:

- частота спонтанных кровоизлияний;

количество потребляемого фУШ, необходимого для купирования кровоизлияний;

- общее функциональное состояние опорно-двигательной системы.

С каждым пациентом была проведена беседа и получено согласие на участие в исследованиях. Период без лечения составлял не менее 4-х суток. Если больному срочно требовалась заместительная терапия в этот период, он получал ее и выводился из исследования. Учитывая, что полноценное лечение факторами свертывания крови стало проводиться только с 2007-2008 гг., многие больные с легким клиническим фенотипом имели деструктивные изменения суставов.

Выделение плазмы крови и приготовление суспензии тромбоцитов

Для выделения РРР кровь центрифугировали 15 мин при 1600 g. PRP выделяли с помощью центрифугирования крови 5 мин при 100g. После центрифугирования забирали 2/3 надосадка. Концентрацию тромбоцитов в полученной PRP измеряли с помошью гематологического анализатора Micros ОТ (Horiba Ltd, Япония). Для достижения требуемой концентрации тромбоцитов в PRP добавляли РРР, выделенную из крови того же донора. PFP получали путем дополнительного центрифугирования РРР 5 мин при 10000g.

Для выделения тромбоцитов из крови, немедленно после забора в кровь добавляли простагландин Е1 (ПГЕ1, конечная концентрация 1 мкМ, MP Biomedicals, США) и апиразу (конечная концентрация 0.1 ед./мл, Sigma-Aldrich, США) для предотвращения преждевременной активации тромбоцитов. После этого из крови выделяли PRP и добавляли дополнительный объем цитратного буфера (рН 5.5, соотношение цитрат:плазма 1:3) для предотвращения агрегации тромбоцитов в процессе центрифугирования. PRP центрифугировали в течение 5 минут при 400 g, надосадок удаляли, тромбоциты ресуспензировали в 300 мкл буфера А. После этого тромбоциты подвергали гель-фильтрации на колонке с гелем Сефароза CL-2B (Sigma-Aldrich, США), уравновешенной буфером А. Для определения концентрации тромбоцитов полученную суспензию анализировали на гематологическом анализаторе аналогично PRP.

Приготовление суспензии фосфолипидных везикул

Коммерческий метод регистрации генерации тромбина, использующийся большинством исследователей, предполагает добавление в РРР суспензии фосфолипидных везикул для увеличения сигнала флюоресценции и меньшей вариабельности теста [Hemker, Н. С., et al. 2002]. Поэтому в данной работе использовали ТГТ в РРР с добавленными в нее фосфолипидами. Кроме того, была проверена возможность исследования гемофилии методом ТД в PFP в присутствии или отсутствии этой суспензии. Для исследования ТД в PFP и ТГТ в РРР использовали суспензию, содержащую 80% фосфатидилхолина (ФХ) и 20% ФС.

Общая концентрация фосфолипидов в исходной суспензии была равной 1 мМ. Изначально растворы ФХ и ФС (Avanti Chemicals, Австралия) в хлороформе хранили при температуре -20°С (концентрация ФС была 31 мМ, ФХ - 33 мМ). Для приготовления смеси фосфолипидов для экспериментов в круглодонной колбе смешивали 24 мкл ФХ и 6.5 мкл ФС. После этого смесь высушивали 30 мин под струей азота, чтобы не допустить окисления. Затем фосфолипиды разбавляли 1 мл буфера В и инкубировали 30 минут на шейкере при температуре 57°С. Полученную эмульсию замораживали при -20°С и снова размораживали, после чего смесь пропускали 10 раз через специальный экструдер (фирмы Avanti Polar Lipids Inc., США) с диаметром пор 100 мкм. Полученную суспензию фосфолипидных везикул разливали на порции малого объема, замораживали при -20°С и хранили вплоть до использования в экспериментах.

Проведение теста генерации тромбина

ТГТ проводили по методике, близкой к описанной в работе [Sinauridze, Е. I., et al. 2007]. В РРР или PRP добавляли флюорогенный субстрат, как описано в п. 2.6. Далее в смесь добавляли буфер Б для поддержания нормального pH в пропорции 40 мкл буфера Б на 1000 мкл плазмы, содержащейся в смеси. После этого смесь разливали по лункам плоскодонного 96-луночного планшета для микротитрования по 100 мкл на лунку. Далее в лунку добавляли активатор свертывания (20 мкл буфера Г, содержащего ТФ. В случае РРР, выделенной из крови пациента, в активатор добавляли суспензию фосфолипидных везикул в пропорции 2 мкл суспензии (1 мМ) на 90 мкл активатора. В случае PRP в части экспериментов в плазму добавляли ПГЕ1, дополнительное количество ДМСО или МЕТ-АМФ фирмы Biolog, США. Флюоресценцию AMC непрерывно измеряли на спектрофлюориметре Appliskan (Thermo Scientific, Финляндия, ^0збуждения=355 нм, ^спуска„ия=460 нм). Для каждого образца плазмы ставили 2 параллельные пробы. Полученные результаты были усреднены. Чтобы перевести условные единицы флюоресценции, в абсолютные концентрации AMC, для каждого образца проводили калибровку сигнала Для этого в отдельных лунках планшета для каждого образца исследованной плазмы ставили по 2 фоновые и 2 калибровочные пробы. Фоновые пробы содержали 100 мкл смеси плазма+субстрат и 20 мкл буфера В. Калибровочные пробы отличались от фоновых тем, что вместо 20 мкл буфера В содержали 2 мкл раствора AMC в ДМСО (исходная концентрация 480 мкМ) и 18 мкл буфера В. Величина калибровочного сигнала, была рассчитана путем вычитания фоновых сигналов из сигналов флюоресценции в калибровочных пробах и деления получившихся разностей на известную концентрацию AMC, присутствующего в калибровочных пробах. При обработке экспериментов все величины флюоресценции AMC в условных единицах были переведены в абсолютные концентрации AMC. При этом учитывали нелинейную зависимость сигнала флюоресценции от концентрации AMC (эффект внутреннего фильтра [Hemker, Н. С., et al. 2002]). Обработку экспериментов проводили в программе Origin версии 6.0 или 8.0 (OriginLab Corporation, США). В результате были построены зависимости концентрации AMC в каждой пробе от времени. Затем они были продифференцированы. Из полученных скоростей производства AMC можно было рассчитать концентрации тромбина в каждый момент времени с учетом расхода флюорогенного субстрата (в предположении, что реакция гидролиза субстрата тромбином подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен). Для вычисления концентрации тромбина были

использованы предварительно измеренные константы реакции расщепления субстрата тромбином: кса, = 48 мин"1, Кт = 156 мкМ. Полученные графики представляли собой зависимости от времени для суммарных концентраций тромбина и комплекса тромбин-а2М, т. к. а2М не соединяется с активным центром тромбина, и комплекс тромбин-а2М тоже может расщеплять флюорогенный субстрат [Неткег, Н. С., е1 а1. 2003, Неткег, Н. С., й а1. 2002, Неткег, Н. С., й а1. 2000]. Для получения зависимости концентрации свободного тромбина от времени необходимо было вычесть из полученных кривых вклады, связанные с активностью комплекса тромбина с а2макроглобулином. Это вычитание осуществляли с помощью специально созданного алгоритма, реализованного в программе Origin 6.0. Этот алгоритм использовался в работе [БтаипсЬе, Е. I., е1 а1. 2007]. Принцип его работы основывался на следующих предположениях. Если суммарная концентрация тромбина, наблюдаемая в эксперименте, состоит из свободного тромбина и тромбина, связанного с а2-М, то можно записать выражение:

(1) [Па + Паа2М] = [Паг] + [Паа2М], где [На+11аа2М] - суммарная концентрация тромбина, связанного с субстратом, наблюдаемая в эксперименте, [Па¥] - искомая концентрация тромбина, связанного с субстратом, но не связанного с а2-макроглобулином, [Паа2М] - концентрация комплекса тромбин-а2-макроглобулин, связанного с субстратом. Если принять во внимание, что

(2) ^[Паа2М^ _ ^_[//я'1'].[¿^д,/]; Где к - константа скорости образования

комплекса Паа2М, а [а2Щ - концентрация а2-макроглобулина, то при дифференцировании (1) можно получить:

(¡[Па + Наа2М 1 с1[Иа1'] , ... . ... ,г

(3) —^--—1 = —--- + к-[На }-[а2М\. Учитывая, что производная

Л Л

функции Г в точке г+Д( при малых А/ приблизительно равна ^ + —можно

Д/

записать для любого момента времени г.

(4) [На + ПаагМ](1 + М) - [Па + 11аа2М]{1) [Паг}(1 + Ы) - [11а"т ) К [Ддг](0 >

Д/ Д/

где К — к • [а2М] в предположении, что изменением концентрации а2М можно пренебречь. Из (4) можно легко получить рекуррентную формулу для вычисления [Паг](1+ А1):

(5)

[11ае}(1 + АС) = [Паг)(1) + [Па + Паа2М](1 + А/)- [Па + Паа2М](1)-М-К-[Па"](1)

Эта формула легла в основу метода вычитания сигнала комплекса тромбин-а2-макроглобулин из общего сигнала. Концентрация свободного тромбина в момент начала эксперимента полагалась равной нулю. Константу К подбирали исходя из того, чтобы на получившейся КГТ концентрация тромбина на стационарной области кривой (области, где скорость накопления АМС перестает изменяться) лежала в области нуля. На рис. 1 приведена схематичная иллюстрация этапов получения КГТ.

=j 2,5x10* | 2,0ж*Л

I 1,5*K)*

3" 1,0x10*

§ 5,0x10*

& 0,0. 0

1 »•

- 30 X

20 о 10

I—

o. о

Рис. 1. Обработка эксперимента по генерации тромбина. Сначала сигнал флюоресценции пересчитывается в концентрацию АМС. Затем производится удаление шумов с помощью усреднения по 7 точкам и кривая производства АМС численно дифференцируется. После этого с помощью специальной программы из полученной кривой вычитается вклад концентрация тромбина, связанного с а2М.

Для запуска свертывания по внутреннему пути в качестве активатора использовали взвесь каолина (Ренам, Россия) для теста АЧТВ, разбавленную в 30 раз в буфере Г, содержащем 20 мкМ фосфолипидов. Конечная концентрация фосфолипидов была 4 мкМ.

Проточная цитометрия для исследования активации суспензии тромбоцитов

Для исследования активации тромбоцитов использовали проточный цитометр FacsCalibur (BD Biosciences, США). Перед проведением опыта в 100 мкл суспензии тромбоцитов (100000 тромбоцитов на 1 мкл суспензии) добавляли 1 мкл раствора, содержащего антитела к Р-селектину, меченые красителем флуоресцеинизотиоцианатом (антиСВ62Р-ФИТЦ, BD Biosciences, США), 1 мкл раствора, содержащего аннексин-V, меченный фикоэритрином (аннексии-V-ФЭ, Invitrogen, США) и 5 мкл буфера Г для присутствия в суспензии ионов Са2+, необходимых для активации тромбоцитов. После этого суспензию разбавляли вдвое раствором человеческого а-тромбина в буфере А (конечная концентрация 35 нМ, Haematologic Technologies, США). В отдельных экспериментах в суспензию предварительно добавляли ДМСО, ПГЕ1 или антагонист рецептора P2Y12 2-метилтиоаденозин-5'-0-монофосфат (МЕТ-АМФ, [Brammer, J. P., et al. 1984], Biolog Inc., США). Для измерения экспрессии Р-селектина и ФС в разные моменты времени из суспензии отбирали пробы объемом 30 мкл и помещали в 300 мкл буфера А, содержащего 2,5 мМ СаС12. После этого производили измерение на цитометре. При обработке получившихся результатов использовали программу Flowing Software (Финляндия). Сначала на точечной диаграмме светорассеяния выделяли регион тромбоцитов (рис., А).

Пересчет в АМС

Удаление шумов и дифференцирование

Время, мин

После этого в этом регионе определяли регион Р-селектин-положительных тромбоцитов, в канале РЬ-1 (канал красителя ФИТЦ) (рис. 2, Б). В конечном итоге получали зависимость процентного содержания Р-селектин-экспрессирующих тромбоцитов в суспензии от времени. Эксперессию ФС оценивали по средней интенсивности флуоресценции фикоэритрина (канал Цитометрические

измерения проводили до и через 5; 10; 15 и 25 минут после активации.

Тромбоэластография в цельной крови

340 мкл цельной цитратной крови, не содержащей КТИ, помещали к кювету тромбоэластографа ТЕО®. Далее в кровь добавляли 20 мкл раствора, содержащего 76 пМ ТФ (Ренам) и 200 мМ СаС12 и запускали эксперимент. Измеряли параметры К, К, а и МА.

Рис. 2. Обработка цитометрического измерения суспензии активированных тромбоцитов. А - определение региона тромбоцитов на точечной диаграмме светорассеяния (в координатах интенсивности прямого (ось X) и бокового (ось У) светорасеяения). Б - точечные диаграммы интенсивности флюоресценции выбранного региона тромбцитов в каналах цитометра РЬ-1 (ФИТЦ) и ГЬ-2 (ФЭ). В - гистограммы интенсивности флюоресценции в каналах цитометра, по которым определяли среднюю флуоресценцию ФЭ и процентное содержание Р-селектин-положительных тромбоцитов. В диаграммах Б и В по оси X отложена интенсивность флюоресценции соответствующего флюорофора, по оси У -интенсивность бокового светорассеяния.

Проведение теста тромбодинамики

Принципиальная схема экспериментальной установки изображена на рис. 3. Свет от осветителей, отраженный сгустком, растущим в кювете, проходит через светофильтр и попадает в объектив цифровой камеры, которая преобразует сигнал и передает его для дальнейшего анализа на компьютер. Камера производит снимки каждые 15 секунд. В результате эксперимента получаются профили светорассеяния от растущего сгустка для каждого момента времени и по ним вычисляется размер сгустка в каждый момент времени [Оуапеэоу, М. V., е1 а1. 2002].

IKS

CCD

Цифровая : Свегпо-

Ксмпьютер ■ Объехтиз .

* намерз фильтр

. Г

И Вставчя I Aïvue^rtvp Ш Ппззма

Рис. 3. Принципиальная схема установки для проведения теста ТД. Воспроизведено из [Сошитова, Н. П. 2012].

Тесты ТД проводили в свободной от тромбоцитов плазме (PFP). Для проведения теста ТД в отсутствии фосфолипидов в 300 мкл PFP добавляли 12 мкл буфера Б и инкубировали при 37°С 10 мин. После этого в плазму добавляли 6 мкл СаС12(1 М), помещали в экспериментальную кювету и приводили в контакт с активатором. Активатор представлял собой пластиковую пластину, на торцевую поверхность которой нанесен ТФ путем обработки пластины тромбопластином (Ренам, Россия). Также тест ТД проводили в присутствии фосфолипидов (3 мкл размороженной суспензии фосфолипидов на 300 мкл плазмы) и тромбомодулина (ТМ), выделенного из легких кролика (6 мкл ТМ на 300 мкл плазмы, Haematologic Technologies, США). Финальная концентрация ТМ составляла 3 нМ. Эксперименты с ТМ проводили только в присутствии фосфолипидов по причине того, что без них добавление ТМ в исследуемых концентрациях не оказывало влияния на рост сгустка.

Глава 3 содержит результаты работы.

Исследование влияния ингибиторов активации тромбоцитов на генерацию тромбина в PRP

Добавление 83 нМ ПГЕЬ 80 мкМ МЕТ-АМФ и увеличение концентрации ДМСО до 1,6% способствовало появлению двух пиков концентрации на кривой генерации тромбина (Рис.4). Если механизм влияния ПГЕ1 и МЕТ-АМР на тромбоциты известен, то про ДМСО такого сказать нельзя. Однако, существуют данные, что ДМСО может ингибировать секрецию а-гранул, адгезию и агрегацию тромбоцитов [Asrais, L., et al. 2010, Holtz, G. С., et al. 1972].

Рис. 4. Влияние ингибиторов активации тромбоцитов на генерацию тромбина. В Р14Р здорового донора с концентрацией тромбоцитов 100*103 мкл"1 добавляли раствор ТФ (Инновин) в буфере Г. Конечная концентрация ТФ составляла 2 пМ. Представлен типичный результат из серии экспериментов (п=3)

д---Контроль (0,4% ДМСО)

Л — 8-ЗцМППЕ,

Время, мин

— 0,4% ДМСО

— 0,8% ДМСО

— 1,6% ДМСО

Влияние ПГЕ1 на образование второго пика на кривой генерации тромбина в РЯР

В опытах, описанных в этом разделе, было исследовано влияние ПГЕ1 на образование второго пика в РЯР, содержащей повышенное количество ДМСО (1,6%), добавленного для образования двух пиков на КГТ. Полученные результаты представлены на рис. 5. Показано, что ПГЕ1 дозозависимо снижает амплитуду второго пика, и в больших концентрациях полностью ингибирует его образование. Также, ПГЕ1 снижал амплитуду первого пика, но до конца никогда ее не ингибировал. Это может говорить о том, что второй пик образуется только за счет активации тромбоцитов.

Контроль

Рис. 5. Влияние ПГЕ1 на образование второго пика на КГТ в РЯР. Различные концентрации ПГЕ1 добавляли в РЕР (100*103 тромбоцитов на 1 мкл Р1*Р), содержащую 1,6% ДМСО. Затем генерация тромбина была запущена добавлением ТФ (конечная концентрация 2 пМ). Представлен типичный результат из серии экспериментов (п=3).

Исследование активации суспензии тромбоцитов

Результаты исследования активации суспензии тромбоцитов тромбином в присутствии ДМСО, ПГЕ1 и МЕТ-АМФ показывают, что эти вещества действительно снижают скорость экспрессии тромбоцитами ФС (рис. 6 А, В, Д). В то же время, экспрессия Р-селектина не снижается под действием этих ингибиторов (рис. 6 Б, Г, Е). Это говорит о том, что второй пик на КГТ образован за счет активированных тромбоцитов, экспрессирующих ФС.

— Контроль

— во шМ МЕТ-АМО -1в0 м«М МЕТ-АМФ

Рис. 6. Влияние ПГЕ1 (А, Б), ДМСО (В, Г) и МЕТ-АМФ (Д, Е) на активацию суспензии тромбоцитов тромбином. Представлены зависимости средней флуоресценции аннексина-У-ФИТЦ (А, В, Д) и процентного содержания Р-селектин-положительных тромбоцитов (Б, Г, Е) от времени, прошедшего после добавления в суспензию тромбина. Представлен типичный результат из серии экспериментов (п=3).

Влияние количества тромбоцитов на формирование двух пиков на кривой генерации тромбина в PRP

В предыдущих разделах было показано, что ингибирование активации тромбоцитов приводит к появлению второго пика на КГТ. В литературе часто встречаются работы, где используется тест генерации тромбина в PRP, но при этом концентрация тромбоцитов не является фиксированной. Эти работы ссылаются на данные, согласно которым количество тромбоцитов не влияет на ЭТП. Однако, показано, что концентрация тромбоцитов может сильно влиять на формы КГТ [Vanschoonbeek, К., et al. 2004]. В связи с этими данными, необходимо было проверить, как влияет количество тромбоцитов на появление второго пика. На рис. 7 показано, что при увеличении концентрации тромбоцитов уменьшается время достижения второго пика, и при высоких концентрациях тромбоцитов два пика могут слиться в один, т.е. тромбоциты активируются быстрее. Это может объясняться несколькими причинами. Во-первых, известно, что активация тромбоцитов проходит тем быстрее, чем выше их концентрация. Также при увеличении концентрации тромбоцитов количество ингибитора, приходящееся на один тромбоцит, уменьшается, и эффект от этого вещества может снижаться. Количество пиков в переходных ситуациях, где концентрация тромбоцитов высокая, определялось по алгоритму, изложенному в следующем разделе.

Концентрация тромбоцитов К103 миг1

ю £ О

Рис. 7. Влияние количества тромбоцитов на образование двух пиков. РРР и РИР с разной концентрацией тромбоцитов, активировали раствором ТФ (Инновин, конечная концентрация 2 пМ). Все плазмы содержали 1,6% ДМСО. Представлен типичный результат из серии экспериментов (п=4)

Было показано, что концентрация тромбоцитов очень слабо влияет на ЭТП (рис. 8). Заметная разница наблюдалась только между РРР и РЯР. Таким образом, в данном исследовании подтверждается, что концентрация тромбоцитов не влияет на ЭТП, но качественно влияет на форму КГТ.

ВО 120 100 0 40 80 120 100

Концентрация тромбоцит«. чо' м*п" Концентрации тромбоцнтои. '10 ии

Рис. 8. Зависимость ЭТП от концентрации тромбоцитов. РРР и РИР четырех здоровых доноров (ИТ, ВП, АП, НП). Активацию свертывания проводили ТФ (2 пМ) в присутствии 1.6% ДМСО в плазме.

Метод оценки параметров двухпиковых кривых генерации тромбина

По мере увеличения количества данных встала необходимость разработки метода анализа параметров двухпиковых КГТ. Кроме того, на части получаемых кривых визуально определить, количество пиков на кривой было невозможно. Пример такой кривой изображен на рис. 9, В. Сначала была подобрана функция, которая хорошо аппроксимирует обыкновенную однопиковую кривую. Это функция экстремального распределения первого типа (функция Гумбеля [вишЬе!, Е. .1. 1954]):

Время, мин

О (РРР) Один пик 33 Два пика 66 Два пика

100 Два пика

133 Один пик

166 Один пик

(6) О, (I, Л1,10,м) = А- ехр(1 - ехр(- -——) - -——) , где С — время, А - амплитуда

№ у/

пика, ¡о - время достижения пика, *с - полуширина пика. Аппроксимацию проводили до момента времени, пока концентрации тромбина не становились сравнимы с погрешностями его измерения. Как показано в табл. 1, коэффициент корреляции при аппроксимации функцией О; заведомо однопиковых КГТ, лежал в диапазоне от 0,912 до 0,994. После этого для аппроксимации двухпиковых кривых была выбрана суперпозиция двух функций С/:

(7) в2(I,А,,1,, 1С,,Аг,11,\1>1) = в,(/,/!,,/,,IV,) + С,(1,Л2,г2,и<2),

где / - время, А, - амплитуда г-го пика, - время достижения г-го пика, -полуширина /-го пика. В табл. 1 показано, что коэффициенты корреляции аппроксимации Я2 были также высоки. Однако проблема определения того, сколько пиков на кривой, подобно изображенной на рис. 9, В, оставалась. Дело в том, что двухпиковая функция всегда описывает эксперимент с большим коэффициентом корреляции, чем однопиковая, за счет большего количества параметров, как это видно из табл. 1.

Чтобы решить проблему определения количества пиков на КГТ, было решено выбрать две группы заведомо однопиковых и двухпиковых кривых, на которых можно было визуально определить количество пиков. Для всех кривых были посчитаны отношения коэффициентов корреляции этих кривых двухпиковой и однопиковой аппроксимаций К2Л11. Для однопиковых кривых эта величина лежала в области от 1,001 до 1,056. Для двухпиковых - от 1,072 до 1,680 (табл. 1) Опираясь на полученные результаты, было решено считать, что если К2/Я1<1,06, то на кривой один пик, а если К2/К[>1,07, то два. Если 1,06<Я2/К1<1,07, то считали, что количество пиков на кривой неопределяемо.

Рис. 9. Аппроксимация КГТ с помощью функции экстремального распределения С; и функцией являющейся суперпозицией двух функций С/. А - КГТ получена на РЯР с добавлением ПГЕ1. Б, В - кривые получены на РЯР. Концентрация ДМСО во всех плазмах 1,6%, активация свертывания осуществлялась 2 пМ ТФ (Инновнн).

Таблица 1. Диапазоны значений Rb R2 и R2/Ri для однопиковых и двухпиковых КГТ.

Число пиков Число экспериментальных кривых Диапазон R2 Диапазон R, Диапазон R^R,

1 19 0,915-0,998 0,912 ■ 0,994 1,001 -1,056

2 30 0,909 - 0,996 0,574 - 0,927 1,072-1,680

Статистика параметров первого и второго пиков. Возможность создания новой модификации теста генерации тромбина

На рис. 10 приведены параметры первого пика для КГТ, полученных на РИР (100*103 тромбоцитов на 1 мкл, 18 кривых, 17 доноров), на PRP в присутствии 830 нМ ПГЕ1 (8 кривых, 7 доноров) а также на РРР (6 кривых, 6 доноров). Концентрация ДМСО везде составляла 1,6%. Приведены только параметры первого пика, потому что все кривые, полученные в присутствии ПГЕ1 и в РРР, содержали только один пик. Как видно из диаграмм, амплитуда и интеграл первого пика в Р1У достоверно больше, чем в РРР и в PRP с ПГЕ1. Также полуширина и время достижения первого пика достоверно различаются в РКР и в РЯР с ГТГЕ1. КГТ, полученные на РРР и РКР+ПГЕ1 достоверно не различаются. Большие отличия первого пика между PRP и остальными кривыми можно объяснить несколькими причинами. При выделении и приготовлении PRP небольшая часть тромбоцитов могла активироваться и внести вклад в первый пик. Кроме того, секреция а-гранул, происходящая сильно раньше экспонирования ФС, также может увеличивать амплитуду и интеграл первого пика.

pr р prp+пгы ррр

prp prp+ппе! ррр

Рис. 10. Средние значения параметров первого пика в PRP (100*10 тромбоцитов*мкл"', 18 кривых, 17 доноров), PRP с 830 нМ ПГЕ1 (8 кривых, 7 доноров) и РРР (6 кривых, 6 доноров) и стандартные ошибки среднего для этих значений (SE) при активации 2 пМ ТФ, концентрация ДМСО 1,6%. Для определения достоверности различий использовался односторонний дисперсионный анализ (one-way ANOVA с уровнями значимости Р, равными 0,01 и 0,05).

На рис. 11 представлены диаграммы усредненных значений параметров пиков, экспериментальных КГТ, полученных на РЯР (100*103 тромбоцитов*мкл"') здоровых доноров при активации 2 пМ ТФ (инновин). Концентрация ДМСО была 1,6%. Параметры определяли с помощью метода, описанного выше. Под интегралом 1-го пика подразумевается площадь под кривой 01(С,А1,1^1). Из 20 проведенных экспериментов на крови 18 здоровых доноров, одна КГТ имела один пик, одна -неопределяемое количество пиков. Остальные кривые (18 кривых, 17 доноров) имели 2 пика. Из диаграмм на рис. 11 видно, что в среднем первый и второй пик не отличаются друг от друга. Достоверно различаются только времена достижения первого и второго пика. Но это связано с тем, что под первым пиком всегда подразумевается пик, который достигается раньше. Результаты, аналогичные приведенным на рис. 10 и 11 были получены также при использовании для активации свертывания 0,5 рМ и 4 рМ ТФ (Инновин). Исходя из полученной статистики можно утверждать, что при концентрации ДМСО 1,6% наблюдается стабильный эффект образования двух пиков, и параметры КГТ не отличаются большей вариабельностью, чем описано в литературе. Т.к. 1,6% ДМСО не оказывает сильного влияния на ЭТП, можно предположить, что увеличение концентрации этого вещества не ухудшит диагностический потенциал ТГТ в РЯР. Однако, появляется новый параметр, отражающий вклад ФС-положительных тромбоцитов в генерацию тромбина, что может быть полезно в клинической практике. В следующих разделах исследования было решено проверить диагностический потенциал новой модификации ТГТ в РЯР (в присутствии 1,6% ДМСО) для предсказания тенденции к кровоточивости у больных гемофилией А.

Первый пик Второй пик В PO.Q1

Первый пик Второй пик

I 40 1 30

С 5 20

Первый пик Второй г

Первый пик Второй пик

Рис. 11. Средние значения параметров пиков в PRP (100*10 тромбоцитов на 1 мкл PRP) при активации 2 пМ ТФ, концентрация ДМСО 1,6%. На диаграммах приведены усредненные данные 18 экспериментов на крови 17 здоровых доноров и стандартные ошибки среднего (SE). Для определения достоверности различий использовали односторонний дисперсионный анализ (one-way ANOVA с уровнями значимости Р, равными 0,01 и 0,05),

Исследование статуса свертывания у больных гемофилией

Уровень фУШ и А ЧТВ

Всего в исследовании участвовал 21 пациент с тяжелой формой гемофилии А, из которых 11 пациентов имели легкий, а 10 - тяжелый фенотип течения болезни.

Активность фУШ (фУШ:С) у пациентов с легким и тяжелым фенотипами гемофилии А в большинстве случаев оказывалась недетектируемой. У трех пациентов из «легкой» группы и у трех из тяжелой она превышала 1% от нормы. Также, у двух пациентов с легким фенотипом и у двух с тяжелым, уровень фУШ составлял более 2% от нормы. Величина АЧТВ достоверно не различалась между двумя группами.

Тромбоэластография

Параметры тромбоэластографии в цельной крови больный гемофилией А при активации свертывания 4 пМ ТФ (Ренам) достоверно не отличались между группами с легким и тяжелым фенотипами течения болезни (рис. 12).

А Б В

нд

i I

нд

I f

-к-

2 40

Тяжелый фенотип

фенотип

Тяжелый фенотип

фенотип

Легкий фенотип

Рис. 12. Параметры ТЭГ у пациентов с легким и тяжелым фенотипами тяжелой формы гемофилии. А Б, В - диаграммы со значениями параметров ТЭГ (R, угол а и МА) для каждого пациента, средними значениями этих параметров в разных группах и стандартными ошибками среднего. НД означает недостоверное различие. Для исследования достоверности использовали односторонний дисперсионный анализ (one-way ANOVA с уровнями значимости Р, равными 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 и 0,05).

Тромбодинамика

Параметры всех вариаций теста тромбодинамики достоверно не различались между группами пациентов с легким и тяжелым фенотипами течения тяжелой формы гемофилии А. Добавление фосфолипидов в PFP перед активацией не оказывало сильного влияния на рост сгустка. Добавление в плазму 3 нМ ТМ (конечная концентрация) приводило к существенному снижению стационарной скорости без сильного влияния на начальную скорость (рис. 13), что согласуется с предыдущими данными [Panteleev, М. A., et al. 2006]. Фактически, сгусток переставал расти после начальной фазы. Поэтому, вторым основным параметром этой вариации теста была выбрана не стационарная скорость, а размер сгустка через 40 мин. после начала эксперимента.

-PFP

- PFP * фосфопипиды

- PFP * фосфолипиды + 3 нМ TM

Время, мин

Рис. 13. Примеры кривых зависимости размера сгустка от времени в разных вариантах теста ТД у больного тяжелой формой гемофилии А.

Результаты всех проведенных экспериментов суммированы на рис. 14.

! I

U 16

800

Si 600

Си 2 400

2 о 200

о та

I-

о о о.

о а о

и К CU X

л с

га

ТД без фосфолипидов

ТДс

фосфолипидами

ТДс

тромбомодулином

Тяжелый Легкий фенотип фенотип

Рис. 14. Параметры ТД у пациентов с легким и тяжелым фенотипами течения тяжелой формы гемофилии А. Показаны диаграммы со значениями параметров ТД для каждого пациента, средними значениями и стандартными ошибками среднего в каждой группе. НД означает недостоверное различие. Для исследования достоверности использовали односторонний дисперсионный анализ (one-way ANOVA с уровнями значимости Р, равными 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 и 0,05).

Генераиия тромбина

При проведении теста генерации тромбина стандартным способом в РРР или в PRP в новой модификации (в присутствии 1.6% ДМСО) наблюдались различные формы КГТ (рис. 15).

Во всех вариациях теста генерации тромбина, проводящихся в РРР достоверной разницы между легким и тяжелым течением гемофилии не выявлено. При активации каолином в большинстве образцов генерация тромбина либо не наблюдалась, либо

она была слабой. То же самое происходило при пониженной концентрации ТФ, при этом в большинстве случаев удавалось получить кривую генерации тромбина.

В тесте генерации тромбина в PRP в новой модификации, амплитуда второго пика и ЭТП различались между группами с тяжелым и легким течением тяжелой формы гемофилии А достоверно (Р<0.02) (рис. 17). Только у трех пациентов с тяжелым фенотипом амплитуда второго пика была выше 30 нМ - нижней границы этого параметра для группы пациентов с легким фенотипом. Это дает возможность предположить, что активация тромбоцитов играет ключевую роль в формировании легкого фенотипа течения тяжелой формы гемофилии А.

Время, мин

Рис. 15. Характерные примеры КГТ у пациентов с разным фенотипом течения гемофилии А. А- КГТ в РРР у одного пациента с легким фенотипом течения тяжелой формы гемофилии А (пациент 3). Б - КГТ в PRP в присутствии 1.6% ДМСО у двух пациентов с разным фенотипом течения гемофилии А.

2000 1600 1200

Активация 4 пМ ТФ

СО 200« 1600 1200

го

-у 80

s »

ю ..

5 н

О „ О.

Н во

ьй »

S „

С ,

i' ' |

Активация 4 пМ ТФ с ТМ

Активация 1 пМ ТФ

Тяжелый Легкий фенотип фенотип

Рис. 16. Параметры генерации тромбина в РРР у пациентов с легким и тяжелым фенотипами тяжелой формы гемофилии А. Показаны диаграммы со значениями параметров ТГТ для каждого пациента, средними значениями и стандартными ошибками среднего в каждой из групп. НД означает недостоверное различие. Для исследования достоверности использовали односторонний дисперсионный анализ (one-way ANOVA с уровнями значимости Р, равными 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 и 0,05).

1 A

rf fi =j 60

о r

2 40'

0 A

«20 ij* 1 Ä *

С Он-1-1-1 5 ич-|-1-1 U4-1 I-'

с Тяжелый Легкий £ Тяжелый Легкий Тяжелый Легкий

1 фенотип фенотип 5 фенотип фенотип фенотип фенотип 4 <

Рис. 17. Параметры генерации тромбина в PRP в присутствии 1,6% ДМСО у пациентов с легким и тяжелым фенотипами тяжелой формы гемофилии А. Показаны диаграммы со значениями параметров ТГТ для каждого пациента, средними значениями и стандартными ошибками среднего в каждой из групп. НД означает недостоверное различие. Для исследования достоверности использовали односторонний дисперсионный анализ (one-way ANOVA с уровнями значимости Р, равными 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 и 0,05).

Глава 4 посвящена обсуждению.

В данной работе показано, что в условиях слабого ингибирования активации тромбоцитов может образовываться второй пик на КГТ в PRP, и разработан метод анализа его параметров. Опыты по изучению активации суспензии тромбоцитов показали, что образование второго пика обеспечивается экспонированием тромбоцитами ФС на своих мембранах. Слабое ингибирование активации тромбоцитов приводит к задержке их активации, как показано в работе [Butenas, S., et al. 2001] для ПГЕ1. Впервые четко показано, что процесс генерации тромбина в PRP разделен на две стадии. Первая стадия обеспечивается частично тромбоцитами и реакциями, проходящими без участия тромбоцитов на фосфолипидах плазмы. Вклад тромбоцитов в первый пик генерации тромбина может быть осуществлен выбросом а-гранул и наличием малого количества активированных тромбоцитов в PRP до активации тканевым фактором. На рис. 18 схематично показано, какие процессы могут играть ключевую роль в образовании каждого пика на КГТ. В предыдущих работах также получали кривые генерации тромбина в PRP, указывающие на факт существования двух фаз в процессе генерации тромбина в PRP. Авторы получали на КГТ точку перегиба в области «взрывной» генерации тромбина, которая разделяла эту фазу на две. Однако они не обращали на это внимания и не ставили вопрос о том, чем это обусловлено, [van der Meijden, P. E., et al. 2005, Vanschoonbeek, K., et al. 2004]. Между тем, тромбоциты могут влиять на генерацию тромбина как минимум двумя основными путями - экспрессией а-гранул, содержащих прокоагулянтные ферменты каскада свертывания, и предоставлением фосфолипидной поверхности для образования комплексов протромбиназы и внутренней теназы [Monroe, D. М., et al. 2002]. Характерные времена различных ответов тромбоцитов на активацию различаются.

I 60' с

! 201

3000,

Р<0,02 4 а X 2400

* * 1

1 л к 1800

I I с 1200

т 600

i' f

О 10 20 30 40 50

Время, мин

Рис. 18. Схематичная интерпретация вклада фосфолипидов плазмы, прсдактивироваппмх тромбоцитов, секреции а-гранул и экспрессии ФС в первый и второй пик КГТ.

В настоящей работе показано, что при активации тромбоцитов 35 нМ тромбина а-гранулы секретируются значительно раньше, чем ФС на мембранах. Опираясь на все вышесказанное, можно предположить, что на разных этапах генерации тромбина ключевую роль в его производстве могут играть абсолютно различные процессы, происходящие с тромбоцитами. Из-за этого скорость генерации тромбина во время его активной наработки может меняться. Результаты, полученные в данной работе, подтверждают эти предположения. Показано, что «поздняя» стадия активной генерации тромбина обеспечивается экспонированием ФС на мембранах тромбоцитов.

Образование двух пиков может свидетельствовать об ингибировании активации тромбоцитов в исследуемом образце плазмы. В основном, при использовании ТГТ в PRP в клинической практике принимают во внимание только один параметр — ЭТП. Однако небольшие дозы ингибиторов не влияют на этот параметр, как показано в данной работе. Т. е. если учитывать только ЭТП, можно не отследить то, что активация тромбоцитов у пациента снижена. Это можно заметить, только исследуя форму КГТ. Если на ней 2 пика, то это может указывать на задержанную активацию тромбоцитов в плазме пациента.

ДМСО, ПГЕ1 и МЕТ-АМФ формируют второй пик на кривой генерации тромбина в PRP. Эти вещества тем или иным образом имеют непосредственное отношение к клинической практике. ДМСО используют как противовоспалительное и обезболивающие средство [Jacob, S. W., et al. 2009]. Кроме того, это вещество является криопротектором для стволовых клеток, и его используют при их трансплантации [Chen-Plotkin, A. S., et al. 2007, Martin-Henao, G. A., et al. 2010, Mueller, L. P., et al. 2007]. Концентрация ДМСО в крови пациента может составлять 0,2-0,4% [Chen-Plotkin, A. S., et al. 2007, Mueller, L. P., et al. 2007], однако может достигать 0,56% [Martin-Henao, G. A., et al. 2010], и даже 1,2 % [Chen-Plotkin, A. S., et al. 2007, Hoang, В. X., et al. 2011]. Другой исследованный ингибитор, ПГЕ1, в клинической практике используют для предотвращения тромбозов [Ozaki, M., et al. 2005]. В данной работе ПГЕ1 добавляли в концентрациях, близких к дозам, применяемым в клинической практике [Cawello, W., et al. 1995, Kozek-Langenecker,

S. A., et al. 1998]. В этих концентрациях ПГЕ1 способен ингибировать агрегацию тромбоцитов [Kreutz, R. Р., et al. 2013, Roberts, W., et al. 2010]. МЕТ-АМФ используют только в тестах in vitro [Andre, P., et al. 2003, Neubauer, H., et al. 2008], однако другой антагонист P2Y12, клопидогрель (плавике) имеет широкое применение в клинике [Neubauer, Н., et al. 2008]. Таким образом, в настоящей работе впервые изучено влияние на процесс генерации тромбина ДМСО, МЕТ-АМФ и ПГЕ1 в концентрациях, соответствующих применяемым в клинической практике.

В работе использовали оригинальную постановку ТГТ в PRP, при которой КГТ содержала два пика. В данном варианте ТГТ для появления второго пика использовался искусственный ингибитор активации тромбоцитов, ДМСО, механизмы действия которого точно неизвестны. Однако в данном исследовании показано, что это вещество в тесте генерации тромбина оказывает такое же воздействие на генерацию тромбина, как и другие, более изученные ингибиторы. Очевидная нефизиологичность данной постановки может компенсироваться дополнительными параметрами, которыми в ней обладает КГТ при том, что на ЭТП ДМСО в выбранной концентрации оказывает незначительное влияние. Вместе с тем, физиологичность остальных постановок и тестов, даже современных, также можно подвергнуть сомнению. Например, использование ингибитора контактной активации КТИ в тестах генерации тромбина и тромбодинамики. Этот белок в норме не присутствует в организме человека. Кроме того, недавние работы демонстрируют результаты указывающие на критическую важность контактного пути в развитии тромбозов [Caen, J., et al. 2010, Kleinschnitz, С., et al. 2006, Muller, F., et al. 2011, Renne, Т., et al. 2006]. Вторым примером нефизиологичности современных тестов является использование флюорогенного субстрата в тесте генерации тромбина, который, кстати сказать, изначально растворен в ДМСО. Субстрат - это синтетическое вещество, с которым в ТГТ связана большая часть существующего в системе свободного тромбина, что может экранировать тромбин от взаимодействий с другими ферментами свертывания [Butenas, S., et al. 2007].

При исследовании различными методами статуса системы свертывания у больных с тяжелой формой гемофилии А, ТГТ, проводимый в PRP в присутствии добавленного ДМСО, был единственным тестом, способным различить среди этих больных группы с различным фенотипом течения болезни. В результате проведения настоящей работы было показано, что амплитуда второго пика КГТ в PRP достоверно больше у пациентов с легким фенотипом течения болезни. В предыдущих разделах было показано, что амплитуда второго пика может отражать вклад экспрессии тромбоцитами ФС в генерацию тромбина. У всех пациентов с легким фенотипом амплитуда второго пика была выше или равной 30 нМ. В то же время большинство пациентов с тяжелым фенотипом имело значения этого параметра ниже 30 нМ. Т. е., можно утверждать, что у большинства пациентов с легким течением гемофилии повышена прокоагулянтная активность тромбоцитов. Это может быть тем компенсаторным механизмом, который позволяет пациентам с тяжелой формой гемофилии А (при содержании фУШ <1%) иметь меньшее количество кровотечений, чем у других пациентов с таким же содержанием фУШ, прокоагулянтная активность тромбоцитов которых не повышена (группа с тяжелым фенотипом течения гемофилии).

Выводы

1. Слабое ингибирование активации тромбоцитов приводит к формированию двух пиков на кривой генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме.

2. Второй пик на кривой генерации тромбина формируется за счет реакций плазменного свертывания, происходящих на мембранах тромбоцитов, экспонирующих фосфатидилсерин.

3. Разработан метод анализа формы кривых генерации тромбина, позволяющий определять количество пиков на кривой и параметры каждого пика с помощью аппроксимации кривой суперпозицией двух функций экстремального распределения первого типа (функций Гумбеля).

4. Предложена новая модификация теста генерации тромбина в PRP, состоящая в проведении исследования в присутствии добавленного ДМСО (1.6%). На примере пациентов с тяжелой формой гемофилии А показано, что данный тест имеет повышенную чувствительность к прокоагулянтной активности тромбоцитов.

5. Результаты применения новой модификации теста генерации тромбина у пациентов с тяжелой формой гемофилии А позволяют предположить, что формирование легкого фенотипа течения болезни у части этих пациентов связано с повышенной прокоагулянтной активностью тромбоцитов, экспрессирующих на своей мембране фосфатидилсерин.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Атауллаханов Ф.И., Баландина А.Н., Пантелеев М.А., Емельяненко В.М., Галстян Г.М., Копылов К.Г., Кумскова М.А., Карамзин С.С., Фадеева O.A., Сошитова Н.П., Липец E.H., Тарандовскин И.Д., Щербина И.А., Пространственный рост фибринового сгустка как новый метод диагностики кровоточивости и тромбозов. Материалы 5-й Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии», 3-5 февраля 2011, Москва, с. 43-44.

2. Баланлина А.Н., Урнова Е.С., Марголин О.В., Сошитова Н.П., Липец E.H., Тарандовскии И.Д., Щербина И.А., Карамзин С.С., Фадеева O.A., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Оценка системы гемостаза у пациентов с онкогематологическими заболеваниями на основа нового диагностического метода регистрации пространственного роста сгустка. Материалы 5-й Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии», 3-5 февраля 2011, Москва, с. 49-50.

3. Щербина И.А., Баландина А.Н., Емельяненко В.М., Соловьева A.A., Леонтьева Т.Н., Карамзин С.С., Фадеева O.A., Сошитова Н.П., Липец E.H., Тарандовскии И.Д., Полохов Д.М., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Исследование пространственного роста фибринового сгустка как новый метод мониторинга состояния пациентов с ишемической болезнью сердца. Материалы 5-й Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии», 3-5 февраля 2011, Москва, с. 577-578.

4. Tarandovskiy I. D., Panteleev М. A., Sinauridze Е. I., Topalov N. N., Artemenko Е. О., Podoplelova N. А., Ataullakhanov F. I. Appearance of the second thrombin peak on

thrombin generation curve in platelet rich plasma depends on phoshpatidylserine expression during platelet activation. Poster presentations, FEBS J, 2011, 278 (Suppl 1): 292 p.

5. Panteleev M. A., Balandina A. N., Emelianenko V. M., Fadeeva O. A., Galstian G. M., Karamzin S. S., Lipets E. N., Soshitova N. P., Tarandovskii I. D., Ataullakhanov F. I. Imaging spatial dynamics of fibrin clot formation: possibilities for detection of prothrombotic and bleeding tendencies. J Thromb Haemost, 2011; 9 (Suppl 2): 495 p.

6. Tarandovskiy I. D., Panteleev M. A., Sinauridze E. I., Topalov N. N., Artemenko E. O., Podoplelova N. A., Ataullakhanov F. I. Formation of the second peak in platelet-rich plasma thrombin generation curve is linked with phoshpatidylserine expression during platelet activation. J. Thromb. Haemost, 2011; 9 (Suppl 2): 589 p.

7. Tarandovskiy I. D., Balandina A. N., Kumskova M. A., Kopylov K. G., Panteleev M. A., Ataullakhanov F.I. Thrombin generation, thrombodynamics and thromboelastography in the patients with different bleeding phenotype of severe hemophilia A. 58th Annual Meeting of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Liverpool, UK, June 27-30, 2012, abstract HDC15.

8. Balandina A. N., Lipets E. N., Soshitova N. P., Tarandovskiy I. D., Shcherbina I. A., Polokhov D. M., Poletaev A. V., Panteleev M. A., Ataullakhanov F.I. The effect of preanalytical and analytical variables on spatial fibrin clot formation (the thrombodynamics assay) in healthy subjects. 58th Annual Meeting of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Liverpool, UK, June 27-30, 2012, abstract LSPE30.

9. Tarandovskiy I. D., Artemenko E. O., Panteleev M. A., Sinauridze E. I., Ataullakhanov F.I. Antiplatelet agents can promote two-peaked thrombin generation in platelet rich plasma: mechanism and possible applications. PLoS ONE, 2013;8:e55688.

10. Tarandovskiy I. D., Balandina A. N., Kopylov K. G., Konyashina N. I., Kumskova M. A., Panteleev M. A., Ataullakhanov F. I. Investigation of the phenotype heterogeneity in severe hemophilia A using thromboelastography, thrombin generation, and thrombodynamics, Thromb Res, 2013,131(6):e274-280.

11. Tarandovskiy I. D., Artemenko E. O., Kopylov K. G., Kumskova M. A., Panteleev M. A., Sinauridze E. I., Ataullakhanov F. I. The appearance of the second peak in platelet rich plasma thrombin generation curve can be provided by antiplatelet compounds: Mechanism and possible applications. J Thromb Haemost, 2013; 11 (Suppl 2): 316 p.

12. Gracheva M. A., Urnova E. S., Mendeleeva L. P., Sinauridze E. I., Balandina A. N., Tarandovskiy I. D., Vasiliev S. A., Parovichnikova E. N., Savchenko V. G., Ataullakhanov F. I. Conventional and new global haemostasis laboratorytest reveal hypercoagulation in primary multiple myeloma patients. J Thromb Haemost, 2013; 11 (Suppl 2): 706 p.

Подписано в печать:

11.11.2013

Заказ № 9047 Тираж - 50 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тарандовский, Иван Дмитриевич, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ «ЦЕНТР ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИИ»

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201450136

Тарандовский Иван Дмитриевич

03.01.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ф.И. Атауллаханов

Москва 2013

Оглавление

Список сокращений....................................................................................................................4

Введение........................................................................................................................................8

Глава 1. Обзор литературы.....................................................................................................11

1.1. Система свертывания крови................................................................................................11

1.1.1. Структура системы гемостаза......................................................................................11

1.1.2. Тромбоцитарный гемостаз............................................................................................11

1.1.2. Плазменный гемостаз....................................................................................................16

1.2. Интегральные тесты оценки статуса системы свертывания............................................19

1.2.1. Стандартные времена свертывания.............................................................................19

1.2.2. Тромбоэластография.....................................................................................................20

1.2.3. Тромбодинамика............................................................................................................22

1.2.3. Тест генерации тромбина: основы метода..................................................................24

1.2.4. Тест генерации тромбина: использование богатой тромбоцитами плазмы............26

1.3. Разнообразие клинических фенотипов тяжелой формы гемофилии..............................30

1.4. Постановка задачи................................................................................................................37

Глава 2. Пациенты, материалы и методы............................................................................39

2.1. Основные растворы..............................................................................................................39

2.2. Пациенты и здоровые доноры крови..................................................................................39

2.3. Процедура забора крови......................................................................................................41

2.4. Выделение плазмы крови и приготовление суспензии тромбоцитов.............................41

2.5. Приготовление суспензии фосфолипидных везикул........................................................42

2.6. Проведение теста генерации тромбина..............................................................................42

2.7. Определение погрешности измерения концентрации тромбина в ТГТ..........................45

2.8. Проточная цитометрия для исследования активации суспензии тромбоцитов.............46

2.9. Тромбоэластография в цельной крови...............................................................................47

2.10. Проведение теста тромбодинамики..................................................................................48

Глава 3. Результаты..................................................................................................................49

3.1. Исследование влияния ингибиторов активации тромбоцитов на генерацию тромбина в РКР............................................................................................................................49

3.2. Влияние ПГЕ1 на образование второго пика на кривой генерации тромбина в Р11Р ...50

3.3. Исследование активации суспензии тромбоцитов............................................................50

3.4. Влияние количества тромбоцитов на формирование двух пиков на кривой генерации тромбина в РКР............................................................................................................................51

3.5. Метод оценки параметров двухпиковых кривых генерации тромбина..........................53

3.6. Статистика параметров первого и второго пиков. Возможность создания новой модификации теста генерации тромбина..................................................................................54

3.7 Исследование статуса свертывания у больных гемофилией............................................56

3.7.1 Уровень фУШ и АЧТВ...................................................................................................56

3.7.2 Тромбоэластография......................................................................................................57

3.7.3 Тромбодинамика.............................................................................................................57

3.7.4 Генерация тромбина.......................................................................................................58

Глава 4. Обсуждение результатов..........................................................................................61

4.1. Эффекты ингибиторов активации тромбоцитов в тесте генерации тромбина...............61

4.2. Клиническая значимость появления двух пиков на кривой генерациТГтромбина ....Г.Г/62 4.3 Исследование статуса свертывания у больных гемофилией А........................................64

Выводы........................................................................................................................................67

Благодарности............................................................................................................................68

Список литературы...................................................................................................................69

Приложение................................................................................................................................89

Список сокращений

АДФ, аденозиндифосфорная кислота АТФ, аденозинтрифосфорная кислота АПС, активированный протеин С АТШ, антитромбин III

АЧТВ, активированное частичное тромбопластиновое время

АТФ, аденозинтрифосфорная кислота

БСА, бычий сывороточный альбумин

ВМК, высокомолекулярный кининоген

ГКП, гепариновый кофактор II

ГПУ1, гликопротеин VI

ППЬЛХ/У, гликопротеин 1Ь/1Х/У

ГПНЫНа, гликопротеин ПЫНа

ДМСО, диметилсульфоксид

ИФА, иммуноферментный анализ

КГТ, кривая генерации тромбина

КТИ, корнтрипсин ингибитор, ингибитор трипсина из зерен кукурузы (ингибитор фактора ХПа)

МЕТ-АМФ, 2-метилтиоаденозин-5'-0-монофосфат МТФР, метилентетрагидрофолатредуктаза ПАИ-1, ингибитор активатора плазминогена 1

ПАИ-2, ингибитор активатора плазминогена 2

ПВ, протромбиновое время

ПГЕ1, простагландин Е1

Протромбин G20120A, протромботическая мутация в гене протромбина

ПС, протеин С

ТВ, тромбиновое время

ТГТ, тест генерации тромбоина

ТД, тромбодинамика

ТАФИ, активируемый тромбином ингибитор фибринолиза

ТМ, тромбомодулин

тПА, тканевой активатор плазминогена

ТФПИ, ингибитор пути тканевого фактора

ТФ, тканевый фактор

ТЭГ, тромбоэластография

ФДЭ, фосфатидилэтаноламин

ФС, фосфатидилсерин

ФХ, фосфатидилхолин

ФИТЦ, флуоресцеинизотиоцианат

ФЭ, фикоэритрин

фП - протромбин

ф1Х(а), фактор IX свертывания крови (активированный)

фУ(а), фактор V свертывания крови (активированный)

фУ Лейден, мутация гена фактора V, при которой фУ не ингибируется АПС

фУП(а), фактор VII свертывания крови (активированный)

фУШ(а), фактор VIII свертывания крови (активированный)

фХ1(а), фактор XI свертывания крови (активированный)

фХП(а), фактор XII свертывания крови (активированный)

фХШ(а), фактор XIII свертывания крови (активированный)

фУШ:С, прокоагулянтная активность фУШ

ф1Х:С, прокоагулянтная активность ф1Х

ЭТП, эндогенный тромбиновый потенциал

Ü2M, аг-макроглобулин

AMC - 4-метил-7-аминокумарин

Cl И, Cl-ингибитор

CRP, коллаген-ассоциированный пептид FSC, прямое светорассеяние

HEPES, 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтаносульфоновая кислота

PARI, тромбоцитарный рецептор для тромбина (Protease-Activated Receptor 1)

PAR4, тромбоцитарный рецептор для тромбина (Protease-Activated Receptor 4)

PFP, свободная от тромбоцитов плазма

PRP, богатая тромбоцитами плазма

РРР, бедная тромбоцитами плазма

PS, протеин S

SFLLRN, агонист рецептора PARI

SNARE, протеиноваый комплекс, участвующий в секреции гранул (Soluble NSF Attachement Protein Receptor)

SSC, боковое светорассеяние

TBXA2R, рецептор для тромбоксана А2

tSNARE, комплексы SNARE, расположенные на внутренней стороне мембран тромбоцитов

TMEM16F, белок, предположительно являющийся тромбоцитарной скрамблазой (Transmembrane protein 16F)

vSNARE, комплексы SNARE, расположенные на мембранах а-гранул

Введение

К современным интегральным тестам можно отнести тромбоэластографию, тест тромбодинамики и тест генерации тромбина, которому, в основном, и посвящена данная работа. Идея метода заключается в измерении кинетики производства и расходования тромбина в сворачивающейся крови или плазме крови с помощью предварительно добавленного в образец флюорогенного субстрата, специфичного к тромбину. Как правило, в результате получают кривую с одним максимумом. В данной работе впервые было показано, что ингибиторы активации тромбоцитов способствуют образованию двух максимумов на кривой генерации тромбина при свертывании богатой тромбоцитами плазмы. Был определен механизм этого явления и предложена новая модификация теста генерации тромбина. Показано, что эта модификация способна отражать тенденцию к кровоточивости у пациентов, страдающих тяжелой формой гемофилии А, в то время как другие современные интегральные тесты этого не продемонстрировали. На основании полученных результатов был сделан вывод о главной роли тромбоцитарного звена гемостаза в формировании клинического фенотипа гемофилии А среди прочих возможных механизмов.

Задачи исследования.

3. Разработать метод оценки параметров кривой генерации тромбина с двумя пиками.

Научная новизна. Впервые показано, что при добавлении в богатую тромбоцитами плазму веществ, ингибирующих активацию тромбоцитов на кривой генерации тромбина образуются два пика. Определен механизм образования двух максимумов на этой кривой. При добавлении ингибиторов активации тромбоцитов скорость экспрессии фосфатидилсерина на них снижается. Вследствие этого фосфолипидная поверхность, предоставляемая активированными тромбоцитами, появляется в плазме позже, и пик производства тромбина разделяется на два. Следует заметить, что ингибиторы в выбранных концентрациях не оказывают влияние на секрецию тромбоцитами а-гранул. Таким образом, второй пик на кривой генерации тромбина формируется только за счет замедленного экспонирования фосфатидилсерина тромбоцитами. Первый пик формируется, главным образом, за счет реакций свертывания на фосфолипидах плазмы и секреции а-гранулярных белков. Далее был разработан метод анализа параметров двух пиков, базирующийся на аппроксимации кривой экстремальным распределением первого типа (распределением Гумбеля). Предложена возможность создания новой модификации теста генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме, в основу которой положено явление образования двух пиков на кривой генерации тромбина при добавлении диметилсульфоксида. Впервые были исследованы статусы системы гемостаза у больных тяжелой формой гемофилии А с помощью различных современных интегральных тестов. Было показано, что амплитуда второго пика и эндогенный тромбиновый потенциал в тесте генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме являются единственными параметрами, достоверно отличающимися между группами пациентов с разной тенденцией к кровоточивости.

Научно-практическое значение. Информация о механизме образования двух пиков на кривой генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме может быть полезной для изучения влияния активации тромбоцитов на плазменное звено свертывания. Помимо использования в фундаментальных исследованиях системы гемостаза, образование второго пика на кривой генерации тромбина может быть использовано и непосредственно в клинике. В данной работе ингибиторы тромбоцитов использовали в концентрациях, близких к применяемым в лабораторно-диагностической и клинической практике. До сих пор влияние таких доз на генерацию тромбина не было исследовано. Появление двух пиков на кривой генерации тромбина может свидетельствовать о том, что тромбоциты донора демонстрируют замедленную скорость экспонирования фосфатидилсерина. Эта информация может быть полезной при выборе доз антиагрегантов и антикоагулянтов. Также в данной работе предложен новый метод, позволяющий отражать клиническое состояние больных тяжелой формой гемофилии А. Кроме того, показано, что использование других вариантов современных интегральных тестов гемостаза не может помочь в определении тенденции к кровоточивости. Полученные результаты позволяют предполагать, что коррекция фенотипа гемофилии связана, главным образом, с тромбоцитами, экспрессирующими фосфатидилсерин в процессе их активации. Более детальное исследование активации тромбоцитов у людей, страдающих гемофилией, поможет более установить детально установить механизм коррекции фенотипа гемофилии. Выяснение причин появления легкого клинического фенотипа гемофилии может позволить создать новые препараты и стратегии лечения для пациентов, которым на данный момент не помогает заместительная терапия.

Положения, выносимые на защиту:

2. Разработан метод оценки параметров кривой генерации тромбина с двумя максимумами

3. Предложена возможность создания новой модификации теста генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме

4. Показано, что амплитуда второго пика на кривой генерации тромбина и эндогенный тромби новый потенциал в богатой тромобцитами плазме являются единственными параметрами коагуляционных тестов, различающимися у людей с легким и тяжелым фенотипами гемофилии А.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Система свертывания крови

1.1.1. Структура системы гемостаза

Систему гемостаза обычно разделяют на сосудистый, тромбоцитарный и плазменный гемостаз. Это разделение весьма условно, так как эти части свертывания сильно взаимосвязаны друг с другом [1, 2]. К сосудистому гемостазу относят механизмы вазоконстрикции и участие сосудистой стенки в регуляции тромбоцитарного и плазменного звеньев гемостаза [3, 4]. Считается, что первыми на повреждение сосуда реагируют тромбоциты. Они меняют свою форму с дисковидной на шарообразную, адгезируют к месту повреждения и формируют первичный тромб [5]. После этого начинает работать каскад ферментативных реакций сериновых протеаз плазменного звена гемостаза, что приводит к образованию тромбина [6]. Тромбин, в свою очередь, расщепляет растворимый белок фибриноген, превращая его в нерастворимый фибрин. Фибриновые нити стабилизируют тромбоцитарный тромб, тем самым препятствуя выходу плазмы крови из кровотока. Тромбоцитарное и плазменное звенья гемостаза взаимодействуют между собой, способствуя нормальной регуляции гемостаза. Так, на мембранах активированных тромбоцитов экспонирован фосфатидилсерин (ФС) и белки-факторы плазменного звена [7, 8]. Это ускоряет реакции плазменного свертывания на несколько порядков [9], что приводит к взрывообразному образованию тромбина, который, в свою очередь, является одним из главных активаторов тромбоцитов [10]. Механизмы, по которым идет взаимодействие тромбоцитарного и плазменного звеньев свертывания, сейчас активно изучаются во всем мире. Ниже рассмотрены подробнее тромбоцитарная и плазменная части гемостаза.

1.1.2. Тромбоцитарный гемостаз

Тромбо�

Информация о работе

Тарандовский, Иван Дмитриевич
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.02

Диссертация

Исследование механизма образования двух пиков на кривой генерации тромбина и возможность применения этого эффекта для предсказания геморрагических осложнений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы