Исследование пространственной динамики генерации тромбина в процессе свертывания крови

Дашкевич, Наталья Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование пространственной динамики генерации тромбина в процессе свертывания крови
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование пространственной динамики генерации тромбина в процессе свертывания крови"

На правах рукописи

ДАШКЕВИЧ Наталья Михайловна

Исследование пространственной динамики генерации тромбина в процессе свертывания крови

03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2013

005544858

Работа выполнена в Федеральном государственном буджетном учреждении науки «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Фазоил Иноятовнч Атауллаханов

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор, заведующий кафедрой биофизики физического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Всеволод

Александрович

Твердислов

доктор биологических наук, профессор,

Марк Александрович

заведующий лабораторией термодинамики биосистем Розенфельд Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

на заседании диссертационного совета Д.002.252.01 при ФГБУН «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАН по адресу: г. Москва, ул. Саморы Машела д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАН

2013 г. в // час.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Николаева Ирина Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Система свертывания крови обеспечивает остановку кровотечения при повреждении кровеносного сосуда. Образование гемостатического сгустка происходит в несколько этапов: сужение просвета сосуда, образование тромоцитарного агрегата на месте повреждения и укрепление сгустка, состоящего из клеток крови, полимерной сетью фибрина. Нарушения в работе каждого из этих звеньев могут привести к тромбозу или кровотечению. Активация системы свертывания происходит на поверхности поврежденного сосуда, однако при дальнейшем росте сгустка процесс идет уже без непосредственного контакта с активирующей поверхностью.

Формирование полимерной сети фибрина, удерживающей клетки крови, происходит в результате работы каскада ферментативных реакций - системы плазменного свертывания. Это запутанная система сериновых протеаз, кофакторов и ингибиторов, в которой существует, по крайней мере, шесть положительных и отрицательных обратных связей. На финальном этапе происходит образование и полимеризация мономеров фибрина, полученных из нерастворимого белка фибриногена путем частичного протеолиза тромбином.

Тромбин является ключевым элементом системы свертывания, который выполняет как прямую функцию гемостаза - образование фибриновой сети и активацию тромбоцитов, так и регуляторную - активацию факторов, обеспечивающих положительные и отрицательные обратные связи в системе. Кроме того, тромбин играет важную роль в процессе восстановления тканей.

Нарушения системы свертывания, вызванные дефицитом белков свертывающей системы - факторов VIII, IX и XI - приводят к неконтролируемым кровотечениям. Они связаны с недостаточным образованием фибрина во внутренней области сгустка не контактирующей с активирующей поврежденной поверхностью кровеносного сосуда. Таким образом, для исследования процессов,

происходящих при образовании фибринового сгустка необходимо учитывать пространственную неоднородность процесса.

Важность положительных и отрицательных обратных связей в процессе распространения свертывания в пространстве была подтверждена теоретически и экспериментально. Теоретически было предсказано существование автоволны концентрации тромбина в крови, которая в рамках данного представления является активной средой. Однако до сих пор эта гипотетическая автоволны тромбина не наблюдалась экспериментально. Образование фибрина легко исследовать в эксперименте, так как образование полимерной сети можно наблюдать по светорассеянию. Но до настоящего момента было невозможно восстановить пространственно-временное распределение тромбина внутри растущего сгустка и определить форму возможной автоволны.

Существует метод исследования динамики активации тромбина в гомогенной системе, однако в такой постановке превращение всего доступного фибриногена в фибри и образование сустка происходит при достижении концентрацией тромбина уровня менее 5% от максимального. Таким образом, остается неясным, зачем производится такое количество «лишнего» тромбина. Ответ на этот вопрос может быть найден в рамках рассмотрения процесса роста сгустка в пространственно неоднородной системе.

Методика, позволяющая исследовать пространственную динамику тромбина в процессе формирования сгустка, даст возможность исследовать процессы регуляции системы свертывания на совершенно новом уровне.

Цель работы

Исследовать пространственную динамику генерации тромбина в процессе роста фибринового сгустка в плазме крови

Задачи исследования

1. Создание экспериментальной методики, позволяющей регистрировать пространственно-временное распределение тромбина

2. Исследование характера пространственной динамики тромбина в плазме крови

3. Выявление ключевых факторов, определяющих динамику тромбина в плазме

4. Исследование влияния тромбоцитов на динамику тромбина

Научная новизна

В результате работы создана уникальная экспериментальная методика, позволяющая регистрировать пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента. Было впервые непосредственно показано, что движущей силой роста фибринового сгустка в пространстве является автоволна концентрации активного тромбина, которая может распространяться в крови. Были найдены ключевые факторы, обеспечивающие существование этого феномена и изучена его регуляция.

Научно-практнческое значение

Созданная методика может быть использована для исследования пространственно-временного распределения ферментативной активности различных протеаз. Кроме того, разработанный метод может являться чувствительным методом диагностики нарушений плазменного и тромбоцитарного звеньев гемостаза. Также он может быть использован для исследования механизмов действия и эффективности препаратов, применяющихся для терапии врожденных и приобретенных нарушений системы свертывания.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработана экспериментальная методика для исследования пространственно-временного распределения активности тромбина в процессе роста фибринового сгустка в плазме крови

2. Экспериментально показано, что распространение активности тромбина в пространстве обладает свойствами автоволны в активной среде

3. Показано, что формирование автоволны определяется составом плазмы, т.е. присутствием белков, обеспечивающих положительные обратные связи в системе и

фосфолипидной поверхности, необходимой для протекания реакций каскада плазменного свертывания

4. Показано, что ограничение распространения автоволны в пространстве обеспечиавется работой пути протеина С в присутствии кофактора тромбина — тромбомодулина

Апробация работы

состоялась 01 ноября 2013 г. на заседании межлабораторного семинара в федеральном бюджетном учреждении науки центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.

Результаты работы представлены на научных конференциях: 5-я Всероссийская конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии" (Москва, 3-5 февраля 2011), XXIII Congress of the International Society of Thrombosis and Haemostasis (Киото, Япония, 23-28 июля 2011), IV Съезд биофизиков России (Нижний Новгород , 20-26 августа 2012 г), American Society of Hematology Annual Meeting (Атланта, США 8-11 декабря, 2012), 6-я Всероссийская конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии" (Москва, 31 января - 02 февраля 2012), XXIV Congress of the International Society of Thrombosis and Haemostasis (Амстердам, Нидерланды, 29 июня - 04 июля 2013).

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 9 научных работ. Статей в рецензируемых журналах - 2, в трудах конференция и съездов - 7

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 — обзора литературы, главы 2 — описания материалов и методов, главы 3 — описания результатов, и главы 4 — обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 132 источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы

Были использованы следующие реагенты: 10% раствор молочной кислоты (Лабхим, Россия), 7-амино-4-метилкумарин (сокр. AMC, Sigma Aldrich, США), флуорогенный субстрат Z-Gly-Gly-Arg-AMC (Bachem, США), кроличий тромбопластин, фактор VIII-тест (Ренам, Россия), полиэтиленимин (ICN Biomedicals, США), глутаровый альдегид 25% (TED Pella, США), фосфатидилсерин из мозга свиньи и фосфатидилхолин из куриных яиц (Avanti Polar Lipids, США), низкотемпературная агароза (Fluka Chemie AG, Швейцария), ингибитор трипсина из кукурузы (Гамма, Россия), фактор VIII (Baxter, Россия), фактор XI и тромбоиодулин из легких кролика (Haematologic Technologies, США), Actichrome TF test (American Diagnostica, США), плазма, дефицитная по фактору VIII (George King Biomedical, США), плазма, дефицитная по фактору XI (HRF, США), анцистрон (Технология-Стандарт, Россия), антагонист гликопротеина Ilb-IIIa Монафрам был любезно предоставлен проф. A.B. Мазуровым (Российский кардиологический центр), Остальные реагенты, используемые в работе, были производства фирмы Sigma-Aldrich (США).

Описание экспериментальной установки

Эксперименты проводились на специально разработанной установке для видеомикроскопии (рис.1 А), которая позволяет одновременное наблюдение за пространственной динамикой роста фибринового сгустка и генерации тромбина. Образец плазмы помещается в экспериментальную кювету, и свертывание активируется, когда плазма приводится в контакт с поверхностью, к которой ковалентно присоединен тканевый фактор (ТФ) - физиологический активатор свертывания. Экспериментальная кювета в течение эксперимента находится в водяном термостате, в котором поддерживается температура 37С. Кювета освещается поочередно красными (625нм) и ультрафиолетовыми (365нм) диодами (Optotech, Hsinchu, Тайвань). Рост сгустка регистрируется по рассеянию красного света. Флуоресценция AMC (7-амино-4-метилкумарина) возбуждалась ультрафиолетовыми диодами. Рассеянный красный свет и флуоресценция AMC

после прохождения через макро-объектив (Canon, Япония) регистрировались цифровой камерой (Apogee Imaging Systems, США). Изображения в красном и ультрафиолетовом свете записывались раз в минуту.

Приготовление плазмы

Кровь здоровых добровольцев путем венипунктуры забиралась в пластиковые пробирки, содержащие 3.8% цитратный буфер (рН 5.5) в объемном соотношении кровь:буфер 9:1. Кровь центрифугировалась 15 мин при 1600g, для получения плазмы, которая центрифугировалась повторно 5 мин при 10 000g, для удаления тромбоцитов. Свободная от тромобцитов плазма замораживалась и хранилась на -80С. Перед каждым экспериментом плазма размораживалась на водяной бане при 37С. Для стабилизации рН на уровне 7.2-7.4 плазма инкубировалась с 10% раствором молочной кислоты в течение 1 часа при температуре 37С. Плазма, дефицитная по факторам VIII и XI, после разморозки обрабатывалась таким же образом.

Рост сгустка в свободной от тромбоцитов плазме

Перед проведением эксперимента в плазму добавлись ингибитор трипсина из кукурузы до конечной концентрации 0.2 мг/мл, флуорогенный субстрат Z-Gly-Gly-Arg-AMC до концентрации 800 мкМ и фосфолипидные везикулы до концентрации 10 мкМ (фосфатедилсерин/фосфатидилхолин в молярном отношении 20:80). Образцы инкубировались 10 мин при температуре 37С и затем рекальцифицировались добавлением СаС12 до конечной концентрации 20мМ. Сразу после рекальцификации образец помещался в кювету. Свертывание активировалось при вставлении в кювету пластины, покрытой тканевым фактором.

Рост сгустка в присутствии тромбоцитов

Кровь забиралась в пробирку, содержащую как цитратный буфер, так и ингибитор трипсина из кукурузы (конечная концентрация 0.2 мг/мл) для минимизации контактной активации. Плазма, обогащенная тромбоцитами, получалась путем центрифугирования крови при 100g в течение 8 минут. Количество тромбоцитов доводилось до 250 000 мкл и уровень рН

стабилизировался на уровне 7.4 добавлением 20мМ Hepes. Чтобы предотвратить ретракцию сгустка добавлялся антагонист гликопротеина Ilb-IIIa Монафрам (25 мкг/мл), и эксперименты проводились в 0.5% низкотемпературной агарозе. Подготовка образцов перед экспериментом проводилась, как описано выше, кроме добавления фосфолипидных везикул. После рекальцификации плазма нагревалась до 42С в течение 2 минут, смешивалась с агарозой, и смесь инкубировалась в экспериментальной кювете в течение 3 минут для образования геля. Активация проводилась так же, как для плазмы, сводобной от тромбоцитов.

Рост сгустка в дефибринированной плазме

Плазма, свободная от тромбоцитов, приготовленная, как описано выше, была дефибринирована инкубированием с 0.02 NIH единиц анцистрона при 37С в течение часа. Получившийся фибриновый сгусток удалялся. Эксперименты проводились в агарозном геле, как описано выше.

Результаты

Описание методики

Для исследования пространственной динамики свертывания крови и пространственно-временного распределения активности тромбина была разработана методика, основанная на использовании флуорогенного субстрата и видеомикроскопии (рис.1 А). Свертывание активировалось слоем иммобилизованного тканевого фактора (ТФ) — трансмембранного гликопротеина, который активирует свертывание на поврежденной стенке кровеносного сосуда. Процесс свертывания распространяется от активирующей поверхности в объем плазмы. Флуорогенный субстрат Z-Gly-Gly-Arg-AMC, специфичный к тромбину, был добавлен в плазму. Расщепление тромбином субстрата приводит к появлению в растворе флуоресцентной молекулы AMC (рис. 1 Б). Растущий фибриновый сгусток поочередно освещается красным и ультрафиолетовым светом для регистрации сзеторассеяния от фибринового сгустка или пространственно-временного распределения флуоресценции AMC соответственно (рис. 1 В). Профили концентрации фибрина были получены из распределения интенсивности

светорассеяния (рис. 1 Д). Т.к. эксперимент проходит в тонком слое плазмы, можно перейти к одномерному распределению интенсивности путем усреднения значений вдоль активатора. Для уменьшения шумов усреднение проводилось по полосе шириной 100-300 пикселей (0,4-1,2мм). Для расчета распределения тромбина использовалось распределение флуоресценции AMC (рис. 1 Г). Основная идея подхода заключается в использовании стандартного уравнения баланса массы для AMC, которое подразумевает, что если законы для скорости наработки флуорофора и его диффузии известны, то экспериментальное распределение концентрации AMC может быть использовано для восстановления распределения функции источника в данном уравнении, т.е. активности тромбина как функции пространства и времени. Базовое уравнение реакции-диффузии

д[АМС] _ дг[лмс] | кс„ [5] [//а]

dt ~ Аис' Эх2 + А^+ОД (1)

где [IIa] - концентрация активного тромбина, [AMC] - концентрация AMC, [S] -концентрация флуорогенного субстрата, Км, kcat - константы Михаэлиса для реакции расщепления тромбином субстрата, было трансформировано:

Таким образом, пространственно-временное распределение тромбина было численно восстановлено путем решения обратной задачи для данного уравнения, модифицированного применительно к конкретной экспериментальной методике для учета искажения сигнала флуоресценции фибриновым сгустком и связывания AMC в плазме.

На рис. 1 Е показано распределение тромбина, получаемое таким образом. Активность тромбина распространяется в пространстве в виде движущегося пика концентрации.

(2)

380 HM 440 HM

Время, рассеяние мин

0 15 30 45 60

Свето- Флуоресценция AMC

1. Коррекция искажений, вносимых фибриновым сгустком

2. Калибровка

Расстояние, мм

3. Коррекция шумов

гоо х 4, Восстановление

пГ пространственно-временного юо »о распределения тромбина

Расстояние, мм ^

Расстояние, мм <гЯ

Рис.1 Пространственно-временное распределение тромбина и фибрина в плазме здоровых добровольцев. (А) Общая схема эксперимента. Иммобилизованный тканевый фактор (1) активирует рост фибринового сгустка (2) в неперемешиваемой плазме (3). Образец освещается поочередно красными (4) и ультрафиолетовыми (5) диодами через фильтр, пропускающий возбуждающий свет для флуоресценции AMC. Свет, рассеянный фибриновым сгустком (7) и флуоресценция AMC, образованного в результате работы тромбина, (8) проходят через многополосный фильтр (9) и макро объектив (10). Полученный свет фокуссируется на ПЗС матрице (11); (Б) Флуорогенный субстрат Z-Gly-Gly-Arg-AMC расщепляется тромбином, высвобождая в раствор флуорофор AMC; (В) Экспериментальные кадры, светорассеяние от фибринового сгустка (красный) и флуоресценция AMC (синий); (Г) Распределение концентрации AMC полученное из распределения интенсивности флуоресценции; (Д) Распределение концентрации фибрина, полученное из распределеия светорассеяния; (Е) Одномерное распределение тромбина как функция времени, полученное из пространственно-временного распределения AMC путем решения обратной задачи уравнения реакции-диффузии.

Распространение активности тромбина обладает свойствами автоволны в активной среде

Важным свойством автоволн в активных средах является формирование идентичных волн в широком диапазоне интенсивности активирующих сигналов, т.е. автоволна регулируется свойствами самой активной среды. Чтобы исследовать эффект' силы инициирующего сигнала на свойства распространяющейся тромбиновой волны, были использованы активаторы с различной способностью к активации путем использования различной поверхностной плотности тканевого фактора. Волны, полученные при активации 90 пмоль/м2 (рис.2 А) и 4 пмоль/м2 (рис. 2 Б) тканевого фактора, становились одинаковыми в течение 30 мин после начала эксперимента (рис. 2 В, Г). Следует заметить, что наименьшая плотность тканевого фактора соответствует всего нескольким молекулам тканевого фактора на квадратный микрометр. Это, тем не менее, всего на порядок ниже плотности тканевого фактора на фибробластах и сравнимо с плотностью тканевого фактора на макрофагах и эндотелиальных клетках. Таким образом, волна активности тромбина непрерывно распространяется в пространстве с постоянной скоростью, имеет постоянную форму и амплитуду и является независимой от исходных условий активации, если преодолен активационный порог. Т.е. она проявляет свойства автоволн в активной среде. В отличие от активационного сигнала, волна была чувствительна к свойствам самой среды. Она не формировалась в свободной от тромбоцитов плазме без добавления фосфолипидных везикул (рис. 2 Д) или тромбоцитов (рис. 2 Е), которые необходимы для ускорения реакций каскада свертывания, происходящих на фосфолипидной мембране, и обеспечивающих положительные обратные связи в системе. Амплитуда пика тромбина была особенно чувствительна к концентрации фосфолипидов в отличие от скорости его распространения.

Распространение тромбина определяет формирование фибринового сгустка При инициации свертывания поверхностью, покрытой тканевым фактором, фибриновый сгусток распространяется в нормальной плазме с постоянной

20 40 60

Время, мин Без липидов

Расстояние, мм

[ТФ]=4 пмоль/м2

1 2 3

Расстояние, мм

300

ГО 200 х с со

о о 2 СО

100

[ТФ]=90 пмоль/м2 [ТФ]=4 пмоль/м2

20 40 60 80

Время, мин [ТФ]=4 пмоль/м2

100-

1 2 3 4 1

Расстояние, мм -^Г

Рис.2 Распространяющийся пик тромбина обладает свойствами автоволны в активной среде. (А) и (Б) Пространственно-временное распределение тромбина после активации свертывания в нормальной плазме в присутствии 10 мкМ фосфолипидов разной плотностью тканевого фактора; (В) и (Г) Скорость распространения пика тромбина (В) и его амплитуда (Г) для этих случаев. Ддя п=8 экспериментов амплитуда пика тромбина и скорость его распространения достоверно не различались (р<0.05) при использовании этих уровней активации; (Д) типичные профили тромбина а плазме, свободной от тромбоцитов, без добавления фосфолипидов; (Е) типичные профили тромбина (из п=3) в плазме в присутствии тромбоцитов. Активация 4 пмоль/м2 тканевого фактора.

скоростью -20-50 мкм/мин (Рис. 2 В). Чтобы исследовать, регулирует ли образование сгустка генерацию тромбина, например, через обратимоеингибирование тромбина фибрином, или защиту тромбина от ингибирования антитромбином III, или ускорение активации фактора XI, была использована плазма, дефибринированная анцистроном - протеазой из змеиного яда, расщепляющей фибриноген. В дефибринированной плазме распространение тромбина в пространстве проходило аналогичным образом (рис. 3), что означает, что распространение волны тромбина - независимый от образования фибринового сгустка феномен. Данные эксперименты были выполнены совместно с Н.П. Сошитовой (Гематологический научный центр, Москва).

VO 2 о Q.

Расстояние, мм Расстояние, мм

Рис.3 Образование волны активности тромбина в дефибринированной плазме. (А) и (Б) распределение активности тромбина и концентрации фибрина в нормальной плазме; (В) и (Г) - в дефибринированной плазме.

Расстояние, мм

Положительные обратные связи необходимы для распространения волны Формирование автоволны требует существования положительных обратных связей в системе, которые обеспечивают самоподдерживающееся распространение независимо от активатора. Кровь обладает, по крайней мере, одной такой связью: активация фактора XI тромбином, как показано на рис. 4 А. Другие положительные обратные связи, такие как активация факторов V, VII и VIII, не ведут к активации независимых ферментов, и таким образом не могут обеспечивать бесконечное распространение в пространстве. Врожденный дефицит фактора XI (гемофилия С) -редкое нарушение свертывания. Описание его механизмов до сих пор противоречиво в виду кажущейся вторичной роли фактора XI в каскаде свертывания. Остается неясным, почему человеку нужно небольшое количество фактора 1Ха, производимого активированным тромбином фактором Х1а, если есть избыток фактора 1Ха, произведенного комплексом тканевый фактор - фактор Vila. Одним из возможных объяснений с точки зрения данного исследования является то, что активация фактора XI тромбином образует автоволну, которая распространяет процесс свертывания вдаль от места активации, что может быть необходимым для заживления больших ран.

Чтобы проверить эту гипотезу, были поведены эксперименты в плазме, дефицитной по фактору XI (Рис. 4 Б). Эксперименты выполнены совместно с М.В. Ованесовым (Food and Drug Administration, Bethesda, USA). Автоволна не возникала в такой плазме, но формировалась при восполнении фактором XI. При дефиците фактора VIII, известном как гемофилия А, также не происходило формирования автоволны.

Путь протеина С определяет ограничение волны тромбина в пространстве Предыдущие исследования показали, что различные части каскада свертывания выполняют различные функции. Это формирование активационного порога,

Положительные обратные Отрицательные обратные связи связи

0.2 МЕ/мл 3.2 нМ

1 МЕ/мл 16 нМ

Расстояние, мм Активность фХ1: 0 МЕ/мЛ Концентрация фХ1: 0 нМ

^т^мнштжи200

■ ■ • •° ^

Рассюяниа. мм 5 МЕ/мл 80 нМ

Рис.4 Возможность существования автоволны тромбина обеспечивается положительными обратными связями в системе плазменного свертывания. (А) В системе свертывания существуют положительные обратные связи (показано темно-серым), которые обеспечивают самомоддерживающееся распространена импульса тромбина Фактор XI, расположенный на вершине каскада, может быть активирован тромбином, образуя типичную для активной среды обратную связь. (Б) Фибриновый сгусток (верхний ряд) и распределение тромбина (нижний ряд) в плазме, дефицитной по фактору XI и восполненной различными концентрациями фактора XI. В плазму добавлено 5 мкМ фосфолипидов.

пространственное распространения и остановка, т.е. образование сгустка конечного размера. В частности было показано, что активация пути протеина С, ведущего к ингибированию процесса свертывания, регулирует размер сгустка. Активация пути протеина С в норме происходит путем аллостерического изменения активности тромбина его кофактором - тромбомодулином.

Время, мин

Рис. 5 Распространение автоволны тромбина может быть остановлено тромбомодулином.

(A) пространственно-временное распределение тромбина в нормальнйо плазме при добавлении различных концентраций тромбомодулина. В плазму добавлено 10 мкМ фосфолипидов, активация проводилась 4 пмоль/м2 тканевого фактора. Показан типичный эксперимент из п=4. (Б) Зависимость размера сгустка (основной график), скорости распространения (левая вставка) и амплитуды пика (правая вставка) от времени для различных концентраций тромбомодулина.

(B) Гипотетическое описание функции автоволны тромбина в организме. В больших ранах необходимо образовать сгусток значительного размера, т.е. быстро распространить процесс свертывания на большое расстояние. Это становится возможным, т.к. распространение тромбина может быть самоподдерживающимся, благодаря активации фактора XI тромбином. Это может объяснить кровотечения у пациентов с гемофилией С при серьезных травмах и хирургических операциях. Присутствие большого количества тромбомодулина на стенках здоровых сосудов предотвращает распространение автоволны свертывания вне зоны повреждения.

Тромбомодулин: О

0.3 НМ

Расстояние, мм 1 нМ

Расстояние, мм & 3 нМ

Чтобы исследовать потенциальный эффект этого пути ингибирования тромбина, были проведены эксперименты с добавлением разных концентраций тромбомодулина. Активация пути протеина С вела к формирование нестационарных структур волны, с последующим замедлением и исчезновением (рис. 5, А, Б). Распространение свертывания инициировалось нормально, однако далее

прекращалось на разных расстояниях от активатора в зависимости от используемой концентрации тромбомодулина. При низких концентрациях вначале скорость была постоянной, однако затем следовало замедление и уменьшение амплитуды пика. При увеличении концентрации пик тромбина распространялся на некоторое расстояние, затем замедлялся и останавливался. Существование различных режимов распространения волны является еще одним известным свойством активных сред.

В пространственно-распределенной системе активация тромбина просходит только на границе растущего стустка для дальнейшего распространения свертывания. Активации тромбина после образования сгустка, в отличие от гомогенной системы, не происходит.

Образование автоволны происходит на расстоянии 1-1.5 мм от активатора при ширине фронта 0.2-0.3 мм. Такая волна может играть основную роль в формировании фибринового сгустка в больших ранах (рис. 5 В), где с ее помощью образование фибрина может распространяться максимально эффективно.

Основное клиническое проявление гемофилии С - это кровотечения при серьезных травмах и хирургических операциях. Возможно, при гемофилии С, отсутствии автоволны тромбина, которая способна быстро образовать сгусток достаточного размера, может привести к серьезным кровотечениям. Таким образом, пациенты не испытывают проблем с неболыпыми ранами, для которых не требуется быстрое распространение тромбина на большое расстояние. Тромбомодулин, в избытке присутствующий на поверхности здорового эндотелия, может предотвратить распространение тромбина вне зоны повреждения. Таким образом, рассмотрение крови как активной среды не только предоставляет новый пример биологических нелинейных динамических систем, но и оказывается полезным для понимания работы системы свертывания.

выводы

1. Разработана экспериментальная методика, позволяющая исследовать пространственно-временное распределение активности тромбина в процессе роста фибринового сгустка

2. Экспериментально показано, что распространение активности тромбина в пространстве происходит в виде движущегося пика

3. Амплитуда и скорость пика тромбина не меняются со временем и не зависят от силы активационного сигнала, что позволяет утверждать об автоволновых свойствах этого процесса

4. Формирование автоволны происходит только в присутствии факторов VIII и XI, необходимых для работы положительных обратных связей в системе, а так же при наличии фосфолипидной поверхности, предоставляемой in-vivo тромбоцитами и микровезикулами

5. Остановка автоволны возможна при активации отрицательной обратной связи через добавление в систему кофактора тромбина - тромбомодулина

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Dashkevich NM, Ovanesov MV, Balandina AN, Karamzin SS, Shestakov PI, Soshitova NP, Tokarev AA, Panteleev MA, Ataullakhanov FI. Thrombin activity propagates in space during blood coagulation as an excitation wave Biophys J. 2012; 103(10):2233-2240.

2. Ataullakhanov FI, Dashkevich NM, Negrier C, Panteleev MA. Factor XI and traveling waves: the key to understanding coagulation in hemophilia? Expert Rev Hematol. 2013 Apr;6(2):lll-113

3. Дашкевич H.M., Ованесов M.B., Пантелеев M.A., Шестаков П.И., Сошитова Н.П., Баландина А.Н., Карамзин С.С., Атауллаханов Ф.И. Новый метод изучения

системы свертывания: исследование пространственной динамики тромбина. Материалы 5-й Всероссийской конференции "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии", 3-5 февраля 2011, Москва, с. 162163.

4. Сошитова Н.П., Карамзин С.С., Баландина А.Н., Фадеева О.А., Дашкевич Н.М., Кречетова А.В., Галстян Г.М., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Метод пространственного роста сгустка детектирует развитие гиперкоагуляционного состояния при сепсисе на несколько дней раньше теста на Д-димеры. Материалы 5-й Всероссийской конференции "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии", 3-5 февраля 2011, Москва, с. 481-482

5. N.M. Dashkevich, M.V. Ovanesov, М.А. Panteleev, F.I. Ataullakhanov Measuring thrombin generation in a heterogeneous system as a function of space and time: a novel approach for basic and applied coagulation research. XXIII Congress of International Society of Thrombosis and Hemostasis, Kyoto, Japan

July 22-27, 2011, Journal ofThrombosis and Haemostasis, 2011, 9 (Suppl. 2), p279

6. Дашкевич H.M., Ованесов M.B, Шестаков П.И., Сошитова Н.П., Баландина А.Н.,Карамзин С.С., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Распространение тромбина в процессе свертывания крови обладает свойствами авто-волны. IV Съезд биофизиков России, 20-26 августа 2012 г., Нижний Новгород, Материалы конференции, том II стр 41.

7. Dashkevich NM, Vuimo TV, Balandina AN, Ovsepyan RA, Soshitova NP, Seregina EA, Surov SS, Lipets EN, Panteleev MA, Ataullakhanov FI, Negrier C, Effect of Pre-Analytical Conditions on the Results of Thrombodynamics Assay, American Society of Hematology Annual Meeting, December 8-11, 2012 Atlanta, USA, Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2012, 120: Abstract 4393

8. Dashkevich N., Vuimo Т., Ovsepyan R., Soshitova N., Surov S., Panteleev M, Ataullakhanov F., Negrier C. Impact of sample preparation procedure in the spatial clot growth assay. XXIV Congress of the International Society on Thrombosis and Hemostasis (ISTH). June 29 - July 4 2013. Amsterdam, Netherlands, PB 2.51-6

9. Дашкевич H.M., Вуймо Т.А., Овсепян P.A., Суров С.С., Сошитова Н.П., Атауллахаиов Ф.И., Пантелеев М.А. Влияние условий подготовки образца плазмы крови на результаты теста Тромбодинамика. Материалы 6-й всероссийской конференции Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии (с международным участием), Москва, 31 января - 02 февраля 2013, с. 8586

Подписано в печать: 08.11.2013

Заказ № 9056 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дашкевич, Наталья Михайловна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАН

На правах рукописи

0420-Н50273

ДАШКЕВИЧ Наталья Михайловна

Исследование пространственной динамики генерации тромбина в процессе свертывания крови

03.01.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ф.И. Атауллаханов

Москва 2013

Содержание

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................11

1.1 СИСТЕМА ГЕМОСТАЗА ЧЕЛОВЕКА..........................................................................11

1.2 СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ПЛАЗМЕННОМ ЗВЕНЕ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА...........................................................................................................................12

1.2.1 Общие сведения о системе свертывания.................................................................13

1.2.2 Активация системы свертывания............................................................................16

1.2.3 Формирование ферментных комплексов..................................................................18

1.2.3 Петли положительной обратной связи..................................................................19

1.2.4 Формирование фибринового сгустка........................................................................21

1.2.5 Ингибиторы свертывания и отрицательные обратные связи..............................23

1.3 ТРОМБИН В СИСТЕМЕ ГЕМОСТАЗА..........................................................................26

1.3.1 Структура тромбина.................................................................................................26

1.3.2 Функции тромбина в системе плазменного свертывания......................................27

1.3.4 Активация тромбоцитов тромбином......................................................................28

1.4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ................................28

1.4.2 Пространственно-однородные модели процесса свертывания............................29

1.4.3 Пространственно-распределенные модели процесса свертывания......................32

1.4.4 Пространственно-однородные модели исследования динамики факторов свертывания.........................................................................................................................35

1.4.5 Пространственно-распределенные модели исследования динамики факторов свертывания.........................................................................................................................37

1.5 АВТОВОЛНОВАЯ ГИПОТЕЗА РАСПРОСТРАНЕНИЯ СВЕРТЫВАНИЯ В ПРОСТРАНСТВЕ....................................................................................................................38

1.5.1 Представление об активных средах.........................................................................38

1.5.3 Автоволновая гипотеза распространения процесса свертывания.......................39

1.6 ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.................................................................................................40

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...........................................................................43

2.1 МАТЕРИАЛЫ....................................................................................................................43

2.3 ПОДГОТОВКА ПЛАЗМЫ КРОВИ..................................................................................44

2.3.1 Получение плазмы крови, свободной от тромбоцитов..........................................44

2.3.2 Получение плазмы крови, обогащенной тромбоцитами.........................................44

2.3.3 Работа с замороженной плазмой.............................................................................44

2.3.4 Стабилизация pH плазмы...........................................................................................45

2.3.5 Восполнение плазмы факторами свертывания.......................................................45

2.3.6 Дефибринирование плазмы.........................................................................................46

2.4 ИММОБИЛИЗАЦИЯ ТРОМБОПЛАСТИНА НА ПОЛИСТИРОЛОВУЮ ПОВЕРХНОСТЬ......................................................................................................................46

2.6 ПРИГОТОВЛЕНИЕ ФОСФОЛИПИДНЫХ ВЕЗИКУЛ.................................................47

2.7 СТАНДАРТНЫЕ ТЕСТЫ: АЧТВ И ИЗМЕРЕНИЕ УРОВНЯ ФАКТОРА VIII............47

2.8. И ССЛЕДОВАНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ AMC С БЕЖАМИ ПЛАЗМЫ.......................48

2.9 ИЗМЕРЕНИЕ КОЭФФИЦИЕНТА ДИФФУЗИИ AMC..................................................48

2.10 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СИСТЕМА.........................................................................49

2.10.1 Гомогенный тест генерации тромбина.................................................................49

2.10.2 Установка для иследования пространственной динамики генерации тромбина ................................................................................................................................................51

2.10.2.1 Конструкция кюветы..........................................................................................51

2.10.2.2 Схема и принцип работы установки.................................................................51

2.10.2.3 Эксперименты в свободной от тромбоцитов плазме......................................53

2.10.2.4 Эксперименты в плазме в присутствии тромбоцитов.....................................53

2.10.2.5 Эксперименты в дефибринированной плазме.................................................54

2.11. ПРОГРАМНЫЙ КОМПЛЕКС ПОЛУЧЕНИЯ И ОБРАБОТКИ ИЗОБРАЖЕНИЙ... 54

2.11.1 Получение изображений............................................................................................54

2.11.2 Обработка экспериментальных кадров.................................................................55

2.11.3 Восстановление распределения активности тромбина.......................................58

2.11.4 Определение параметров пространственной динамики тромбина...................61

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.................................................................................................63

3.1 РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕТОДИКИ..............................................63

3.1.1 Измерение коэффициента диффузии AMC..............................................................63

3.1.2 Измерение связывания AMC с белками плазмы........................................................64

3.1.3 Измерение влияния искажений, вносимых фибриновым сгустком........................66

3.1.4 Сравнение с гомогенным тестом генерации тромбина.........................................67

3.2 ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ ГЕНЕРАЦИИ ТРОМБИНА В НОРМАЛЬНОЙ ПЛАЗМЕ...................................................................................................................................69

3.3 ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАВИСИМОСТИ ДИНАМИКИ ГЕНЕРАЦИИ ТРОМБИНА ОТ СИЛЫ АКТВИРУЮЩЕГО СИГНАЛА И ЛИПИДНОГО СОСТАВА ПЛАЗМЫ.............72

3.3.1 Пространственная динамика генерации тромбина при использовании активаторов с низкой плотностью тканевого фактора...............................................73

3.3.2 Влияние фосфолипидных везикул на пространственную динамику генерации тромбина..............................................................................................................................75

3.3.3 Пространственная динамика генерации тромбина в присутствии тромбоцитов ................................................................................................................................................77

3.4 ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИИ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ ОБРАТНЫХ СВЯЗЕЙ В РАСПРОСТРАНЕНИИ АКТИВНОСТИ ТРОМБИНА В ПРОСТРАНСТВЕ.....................80

3.4.1 Пространственная динамика генерации тромбина в плазме, дефицитной по фактору XI и при добавлении фактора XI........................................................................80

3.4.2 Пространственная динамика генерации тромбина в плазме, дефицитной по фактору VIII и при добавлении фактора VIII...................................................................81

3.5 ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИИ ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ ОБРАТНЫХ СВЯЗЕЙ В РАСПРОСТРАНЕНИИ АКТИВНОСТИ ТРОМБИНА В ПРОСТРАНСТВЕ.....................84

3.5.1 Влияние тромбомодулина на пространственную динамику генерации тромбина ................................................................................................................................................84

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ...............................................................................................89

4.1 АВТОВОЛНОВЫЕ СВОЙСТВА РАСПРОСТРАНЕНИЯ АКТИВНОСТИ ТРОМБИНА В ПРОСТРАНСТВЕ..........................................................................................89

4.2 ВОЗМОЖНЫЙ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ СМЫСЛ АВТОВОЛНОВОГО РАСПРОСТРАНЕНИЯ ТРОМБИНА.....................................................................................90

ВЫВОДЫ...........................................................................................................................97

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................................98

Список сокращений

АПС - активированный протеин С

AT III - антитромбин III

АЧТВ - Активированное частичное

тромбопластиновое время

AMC - 7-амино-4-метилкумарин

BS А - бычий сывороточный альбумин

ВМК - кининоген с высокой молекулярной массой

ГК-П - гепарин кофактор II

CTI - Corn trypsin inhibitor (ингибитор трипсина из кукурузы)

ME - международная единица активности

ПЗС - прибор с зарядовой связью

ПЭТ - полиэтилентерефталат

ПС - протеин С

nS - протеин S

тПА - тканевой активатор плазминогена

PAR - рецептор, активируемый протеазами

ТФ - тканевой фактор

ТАФИ ингибитор фибринолиза, активируемый тромбином

ТФПИ - ингибитор пути тканевого фактора

Fn - фибрин

ф11 - фактор II, протромбин

фПа - активный фактор II, тромбин

фУ - фактор V

фУП - фактор VII

фУШ - фактор VIII

ф1Х - фактор IX

ф1Ха - активированный фактор IX

фХ - фактор X

фХа - фактор X

фХ1 - активированный фактор XI

фХ1а - активированный фактор XI

фХП - фактор XII

фХШ - фактор XIII

ВВЕДЕНИЕ

Тромбин является ключевым элементом системы свертывания, который выполняет как прямую функцию гемостаза — образование фибриновой сети и активацию тромбоцитов, так и регуляторную - активацию факторов, обеспечивающих положительные и отрицательные обратные связи в системе. Кроме того, тромбин играет важную роль в процессе восстановления тканей.

активирующей поврежденной поверхностью кровеносного сосуда. Таким образом, для исследования процессов, происходящих при образовании фибринового сгустка необходимо учитывать пространственную неоднородность процесса.

Цель работы

Задачи исследования

2. Исследование характера пространственной динамики тромбина в плазме крови

3. Выявление ключевых факторов, определяющих динамику тромбина в плазме

4. Исследование влияния тромбоцитов на динамику тромбина

Научная новизна

Научно-практическое значение

исследования механизмов действия и эффективности препаратов, применяющихся для терапии врожденных и приобретенных нарушений системы свертывания.

Положения, выносимые на защиту

3. Показано, что формирование автоволны определяется составом плазмы, т.е. присутствием белков, обеспечивающих положительные обратные связи в системе и фосфолипидной поверхности, необходимой для протекания реакций каскада плазменного свертывания

4. Показано, что ограничение распространения автоволны в пространстве обеспечиавется работой пути протеина С в присутствии кофактора тромбина - тромбомодулина

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 СИСТЕМА ГЕМОСТАЗА ЧЕЛОВЕКА

Основная функция системы гемостаза - это поддержание целостности кровеносного русла, нарушение которого может привести к гибели организма. Механизм гемостаза включает взаимодействие между стенкой сосуда, тромбоцитами и белками крови[1]. В этой системе очень важно равновесие между образованием плотного сгустка, механически закрывающим повреждение в сосуде, и сохранением функций крови, которые она может выполнять только в жидком состоянии. Нарушения системы гемостаза - как излишнее тромбообразование так и кровоточивость - могут привести к серьезным патологиям.

Самой быстрой реакцией на повреждение является сужение сосуда -вазоконстрикция - и образование агрегата тромбоцитов, закупоривающего место повреждения. Это так называемый первичный гемостаз. Описанные процессы происходят в течение 1-3 мин, за это время происходит остановка кровотечения из мелких сосудов у здорового человека [2]. Для предотвращения вымывания тромбоцитарного сгустка потоком крови он в дальнейшем скрепляется нерастворимым белком фибрином, который, полимеризуясь, образует «сетку», закрепляющую тромбоциты и другие клетки крови [3-5]. Процессы, приводящие к образованию фибринового сгустка, называют вторичным гемостазом [2] или свертыванием крови. Характерное время образования фибриновой сети составляет около 10 минут

ИТаки образом в системе гемостаза выделяется три звена: сосудистое, тромбоцитарное и плазменное. Эти звенья работают не независимо, а активно взаимодействуют на всех уровнях. Активированные тромбоциты

предоставляют липидную поверхность для сборки ферментных комплексов плазменного звена [3,6] и активируют свертывание по так называемому внутреннему пути [7], в свою очередь основной фермент плазменного звена -тромбин - является сильным активатором тромбоцитов [3,6]. Стенки сосуда экспрессируют вещества, влияющие не тромбообразование такие как тромбомодулин, фактор фон Виллебранда, тканевый фактор, ингибитор пути тканевого фактора и многие другие [3,8]. Кроме того, правильная работа плазменного и тромбоцитарного звена необходима для процесса заживления ран [9,10]. Так тромбоциты секретируют медиаторы воспаления, факторы роста и цитокины, тромбин обладает цитокинетической активностью и активностью, схожей с факторами роста [9,11], фибриновая сеть является основой, на которой происходит восстановление ткани, а продукты ее деградации вызывают приток нейтрофилов и макрофагов [9,11].

Данная работа посвящена исследованию плазменного звена гемостаза, поэтому далее его работа будет рассмотрена более подробно.

1.2 СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ПЛАЗМЕННОМ ЗВЕНЕ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА

Система плазменного свертывания является сложным каскадом протеолитических реакций [4,12,13]. Результатом его работы является формирование полимерной сети из фибрина, полученного из растворимого белка фибриногена путем частичного протеолиза тромбином [4,12]. Устройство системы свертывания х�

Информация о работе

Дашкевич, Наталья Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.02

Диссертация

Исследование пространственной динамики генерации тромбина в процессе свертывания крови - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы