Характеристики гемостаза при гемодилюции. Коррекция гемодилюционной гиперкоагуляции ингибиторами тромбина

Синауридзе, Елена Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристики гемостаза при гемодилюции. Коррекция гемодилюционной гиперкоагуляции ингибиторами тромбина
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристики гемостаза при гемодилюции. Коррекция гемодилюционной гиперкоагуляции ингибиторами тромбина"

На правах рукописи

Синауридзе Елена Ивановна

ХАРАКТЕРИСТИКИ ГЕМОСТАЗА ПРИ ГЕМОДИЛЮЦИИ. КОРРЕКЦИЯ ГЕМОДИЛЮЦИОННОЙ ГИПЕРКОАГУЛЯЦИИ ИНГИБИТОРАМИ ТРОМБИНА

03.01.04- биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 7 ЯНВ 2013

Москва 2013

005048317

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения России

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Атауллаханов Фазоил Иноятович,

Официальные оппоненты: Азизова Офелия Ахатовна,

доктор биологических наук, профессор, ФГБУ науки «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства России, руководитель лаборатории биофизических основ патологии

Дрозд Наталия Николаевна, доктор биологических наук, ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России, ведущий научный сотрудник лаборатории патологии и фармакологии гемостаза

Лозинский Владимир Иосифович, доктор химических наук, профессор, ФГБУ науки «Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова» РАН, заведующий лабораторией криохимии (био)полимеров

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки «Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля» РАН

Защита состоится 20 февраля 2013 г. в 13 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д208.135.02 по защите докторских диссертаций при ФГБУ «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения России по адресу: г. Москва, Новый Зыковский проезд, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения России.

Автореферат разослан декабря 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Зыбунова Елена Евгеньевна

Актуальность темы. Трансфузионная терапия один из важнейших нструментов современной медицины. Переливание различных искусственных лазмозамещающих растворов (ПЗР) необходимо при терапии многих атологических состояний, в первую очередь, при травмах с массивной кровопотерей, ирургии, лечении пациентов в критических состояниях и т.д. Сегодня существует ольшое количество таких растворов, обладающих разными физико-химическими войствами, поэтому эффективность лечения в каждом конкретном случае зависит от равильности их выбора. ПЗР не содержат компонентов гемостаза, поэтому ереливание этих растворов приводит к гемодилюции, т.е. разбавлению крови и нижению концентраций всех ее компонентов. Это изменяет состояние гемостаза ациента. Для правильной терапии необходимо знание всех процессов, которые [роисходят при гемодилюции, однако на сегодняшний день полного понимания этих [роцессов не существует. Это связано с тем, что система гемостаза очень сложна и [аже при разбавлении плазмы одним и тем же раствором, но в разных условиях, юлучаемые результаты могут быть различны. Кроме непосредственного влияния, второе могут оказывать отдельные компоненты растворов на различных участников :истемы свертывания, на гемостаз влияет сам процесс разбавления, т.к. в такой шогокомпонентной системе как кровь/плазма он приводит к нарушению существующих равновесий между различными реакциями гемостаза. Распространено мнение, что гемодилюция вызывает коагулопатию, связанную со снижением концентраций предшественников факторов свертывания. Такая коагулопатия, действительно, наблюдается при переливании большого объема ПЗР. Однако в целом ряде работ на сегодняшний день показано, что умеренное разбавление плазмы, в первую очередь, кристаллоидными растворами может вызывать состояние гиперкоагуляции, которое регистрируется не только in vitro, но и in vivo, увеличивая, например, частоту возникновения тромбозов глубоких вен. Изучение причин такого нарушения и его влияния на функционирование системы свертывания является важной и актуальной задачей, которая может помочь в правильности выбора инфузионной стратегии. Кроме того, понимания механизмов, приводящих при гемодилюции к нарушению равновесия в системе свертывания, может помочь в правильной модификации существующих ПЗР с целью создания нового поколения таких растворов, переливание которых, даже в относительно больших объемах, будет вызывать меньшие нарушения гемостаза.

Цель работы. Исследовать изменения гемостаза, вызываемые гемодилюцией, и разработать пути модификации стандартных плазмозамещающих растворов для возможной коррекции этих изменений.

Задачи исследования: 1. Экспериментально изучить изменения коагуляции, вызываемые процессом гемодилюции, с помощью стандартных коагулогических тестов, а также с помощью новых интегральных методов оценки состояния гемостаза.

2. Разработать принципы коррекции стандартных плазмозамещающих растворов с целью создания ПЗР, не вызывающих нарушений гемостаза при объемных переливаниях.

3. Разработать новые низкомолекулярные ингибиторы тромбина, которые могут быть использованы в составе ПЗР нового поколения.

Научная новизна. В работе предпринято систематическое изучение влияния гемодилюции на состояние системы свертывания при разбавлении плазмы in vitro и in vivo ПЗР разных типов. Показано, что современные интегральные тесты оценки состояния гемостаза - тест генерации тромбина и оригинальный тест измерения скорости роста сгустка в пространстве, которые способны чувствовать как гипо-, так и гиперкоагуляционные сдвиги в системе, регистрируют усиление свертывания при умеренном (до 50-60%) разбавлении плазмы in vitro различными ПЗР, в то время как традиционные коагулогические тесты являются нечувствительными к возникающим гиперкоагуляционным сдвигам, связанным с нарушением баланса про- и антикоагулянтных реакций.

Впервые показано, что коллоидные ПЗР увеличивают скорость полимеризации фибрина в растворах фибриногена, что позволило опровергнуть существующую гипотезу о том, что данные коллоидные растворы ингибируют скорость полимеризации фибрина, ухудшая взаимодействие тромбина с фибриногеном и/или взаимодействие полимера фибрина с фактором ХШа. Это позволяет предполагать, что причиной образования некомпетентных сгустков в присутствии различных коллоидных растворов является не снижение скорости полимеризации, а образование сгустков сниженного качества.

Существование гиперкоагуляционного состояния при гемодилюции было подтверждено также in vivo в разработанной модели гемодилюции на крысах, а также у здоровых добровольцев без кровопотери и доноров костного мозга с высокой кровопотерей, которым переливали различные объемы ПЗР разных типов.

Таким образом, было показано, что умеренная гемодилюция является риск-фактором возникновения гиперкоагуляционного состояния. Показано, что причиной этого состояния является снижение при разбавлении плазмы концентраций ингибиторов свертывания и что гемодилюционная гиперкоагуляция может быть снижена или полностью отменена при введении в систему дополнительных ингибиторов свертывания, в частности, ингибиторов тромбина. Впервые предложено использовать ингибиторы тромбина в составе кристаллоидных плазмозамещающих растворов.

Использование методов молекулярного лекарственного дизайна и последующего многоступенчатого экспериментального скрининга позволило разработать ряд новых оригинальных низкомолекулярных ингибиторов тромбина, обладающих высокой эффективностью, низкой токсичностью и высокой стабильностью в водных растворах.

Научно-практическое значение. Изучение влияния гемодилюции на систему вертывания крови важно как для фундаментальной, так й для практической едицины. Гемостаз является сложной многокомпонентной биологической системой, [онимание принципов регуляции его функционирования помогает раскрыть общие акономерности в работе таких систем, а, следовательно, правильно определять пути орьбы с нарушениями, которые могут возникать при их работе. С точки зрения рактической медицины важно осознание того факта, что умеренная гемодилюция южет являться риск-фактором возникновения гиперкоагуляционного состояния. Это омогает правильно выбирать стратегию инфузионной терапии, учитывая свойства онкретных плазмозамещающих растворов. Кроме того, это указывает пути юдификации существующих стандартных ПЗР для создания таких растворов, оторые будут лишь минимально влиять на состояние системы свертывания при |нфузиях. В работе впервые показано, что эти задачи при гемодилюции могут быть 1ешены путем введения в стандартные ПЗР ингибиторов тромбина.

Вторая часть работы посвящена разработке новых низкомолекулярных ингибиторов тромбина, что важно для улучшения возможностей антикоагулянтной ерапии. Проведен направленный поиск таких ингибиторов. Научное значение (анной работы состоит в разработке последовательной стратегии отбора и направленного конструирования ингибиторов системы свертывания. Принципы этой стратегии могут быть применены не только при создании ингибиторов тромбина, но и для разработки ингибиторов других протеаз системы свертывания крови. Все это открывает путь к созданию новых антитромботических средств, которые призваны улучшить эффективность и безопасность антикоагулянтной терапии. Практическое значение этой части работы в том, что создан ряд принципиально новых, высокоэффективных и безопасных ингибиторов тромбина, которые могут быть использованы как в составе ПЗР, так и как самостоятельные антитромботические препараты.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Умеренное (до 50-60%) разбавление плазмы любым плазмозамещающим раствором in vitro приводит к сдвигу в сторону усиления свертывания.

2. Умеренная гемодилюция (примерно на 25%) физиологическим раствором в модели на крысах in vivo приводит к усилению свертывания.

3. Гемодилюция при переливании ПЗР здоровым добровольцам без кровопотери, а также восполнение кровопотери в ходе эксфузии костного мозга у здоровых доноров вызывают гиперкоагуляционные изменения гемостаза.

4. Добавление в физиологический раствор ингибитора тромбина (как антитромбина III, так и синтетических низкомолекулярных прямых ингибиторов) способно частично или полностью компенсировать гемодилюционную гиперкоагуляцию.

5. Методы лекарственного дизайна (использование программы докинга низкомолекулярных лигандов в активный центр тромбина) и разработанная

многоступенчатая стратегия экспериментальной проверки отобранных соединений позволяют провести направленное конструирование новых ингибиторов тромбина и сократить период разработки новых высокоэффективных соединений.

Апробация работы. Работа прошла апробацию на заседании проблемной комиссии №6 «Биохимия, биофизика и реология крови» ГУ Гематологический научный центр РАМН 22 июля 2009 г.

Материалы диссертации представлены автором на следующих конференциях и конгрессах: III Всероссийский съезд гематологов и трансфузиологов, 26-28 ноября 1996 г., Санкт-Петербург; XVIIth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (ISTH), August 14-21, 1999, Washington, DC, USA; II Съезд биофизиков России, 23-27 августа 1999 г., Москва; II Российский конгресс по патофизиологии (с международным участием), 9-12 октября, 2000 г., Москва; XIXth Congress of ISTH, 12-18 July 2003, Birmingham, UK; IX Съезд Федерации анестезиологов и реаниматологов, 27-29 сентября 2004 г., Иркутск; III Съезд биофизиков России, 24-29 июня 2004 г., Воронеж; 48th Annual Meeting of the Biophysical Society, February 14-18, 2004, Baltimore, MD, USA; II Всероссийская научная конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии", 2-4 февраля 2005 г., Москва; XXth ISTH Congress, 6-12 August 2005, Sydney, Australia; семинар "Новые медицинские технологии в акушерстве, гинекологии и неонатологии (методы гемафереза, квантовая гемотерапия, медицинский озон), Москва, 2005 г.; Conference "Mathematical models and methods in biology and medicine", May 29-June 3, 2005, Bedlewo, Poland; VII сессия Московского научного общества анестезиологов и реаниматологов, 24 марта 2006 г., Москва; XIII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", 3-7 апреля 2006 г., Москва; III Всероссийская научная конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии" (с международным участием), 1-3 февраля 2007 г., Москва; IV Международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития", 12-16 марта, 2007 г., Москва; конференция "Фундаментальные науки - медицине", по программе фундаментальных исследований Президиума РАН, 3-4 декабря 2007 г., Москва; BIT's 5th Anniversary Congress of International Drug Discovery Science and Technology, Serial II: Advances and Challenges Toward Major Diseases, November 7-13, 2007, Xi'an and Beijing, China; XXIth ISTH Congress, July 6-12, 2007, Geneva, Switzerland; workshop "Modeling of Blood Diseases", November 5-8, 2007, Lyon, France; XI Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных "Биология - наука XXI века", 29 октября - 2 ноября 2007 г., Пущино; Международный форум по нанотехнологиям (Rusnanotech), 3-5 декабря 2008 г., Москва; конференция «Органическая химия для медицины», 7-11 сентября 2008 г., г.Черноголовка, Московская обл.; 53rd Annual Meeting of Society of Thrombosis and Haemostasis Research, 4-7 February 2009, Vienna, Austria; XXII

Congress of ISTH, July 11-16, 2009, Boston, MA, USA; конференция по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине", декабрь 2009 г., Москва; V Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 16-20 марта, 2009 г., Москва; II Международный форум по нанотехнологиям (Rusnanotech), 6-8 октября, 2009 г., Москва; Is' Joint Meeting GTH and NVTH (54rd Annual Meeting of Society of Thrombosis and Haemostasis Research and Symposium of the Netherlands Society of Thrombosis and Haemostasis), February 24-27, 2010, Nürnberg, Germany; XXXIII World Congress of the International Society of Hematology, October 10-13, 2010, Jerusalem, Israel; конференция «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины», 6-7 октября 2010 г., Киров; I Международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», 17-19 ноября 2010 г., Москва; конференция по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине", декабрь 2010 г., Москва; V Всероссийская конференция по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечнососудистой хирургии (с международным участием), 3-5 февраля 2011г., Москва; XXIII Congress of ISTH, July 23-28, 2011, Kyoto, Japan; 36th FEBS Congress: Biochemistry for Tomorrow's Medicine, 25-30 June 2011, Turin, Italy; конференция no научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине", декабрь 2011 г., Москва; 58th Meeting of the scientific and standardization committee of the ISTH, 27-30 June 2012, Liverpool, UK.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 83 работы, в том числе 1 книга, 1 глава в книге, 25 статей в реферируемых научных изданиях, 7 патентов и 49 работ в материалах съездов, конгрессов и конференций.

Личное участие автора в получении результатов. Автором была проведена ббльшая часть всех экспериментов по исследованию влияния разбавления плазмы in vitro на генерацию тромбина, а также ключевые эксперименты по влиянию гемодилюции на скорость роста сгустка в пространстве (in vitro) и полностью все тромбодинамические эксперименты при работе со здоровыми добровольцами и донорами костного мозга in vivo. Кроме того, автором были проведены ключевые эксперименты по коррекции гемодилюционной гиперкоагуляции добавляемыми в ПЗР ингибиторами тромбина. Автор руководил работой группы сотрудников при разработке модели гемодилюции на крысах и исследовании влияния ПЗР на полимеризацию фибрина. Теоретическая часть работы по разработке новых низкомолекулярных ингибиторов тромбина была выполнена совместно с Научно-Исследовательским Вычислительным Центром МГУ. При этом автор лично участвовал в разработке структур новых ингибиторов. Экспериментальный скрининг отобранных в базах и вновь синтезированных (в Институте органической химии РАН) соединений был полностью выполнен группой под руководством автора. При этом

автор лично провел все измерения по влиянию различных ингибиторов на генерацию тромбина.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 280 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, 10 таблиц, 61 рисунка, выводов и списка цитированной литературы, включающего 537 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обсуждается актуальность исследуемой темы для понимания регуляции гемостаза и выбора правильной инфузионной стратегии, обозначены основные проблемы в данной области, сформулированы цель и задачи и дана общая характеристика работы.

Глава 1 содержит обзор литературы. Она состоит из двух частей. Первая посвящена описанию процессов, происходящих при гиповолемии, сведениям о различных плазмозамещающих растворах, используемых для борьбы с гиповолемией, и об их влиянии на гемостаз, а также описанию влияния на систему свертывания крови самого процесса гемодилюции. Во второй части описаны различные типы антикоагулянтов, используемых в настоящее время в клинике, в том числе новые лекарственные препараты на основе низкомолекулярных синтетических ингибиторов тромбина и фактора Ха.

В главе 2 описаны материалы и методы, использованные в работе. Для разбавления плазмы применяли ПЗР разных классов, в том числе два кристаллоидных раствора (физиологический раствор (ФР) и раствор Рингера (РР)), а также четыре коллоидных раствора: 6% раствор декстрана с молекулярной массой 30-40 килодальтон (кДа) (Реополиглюкин, РПГ), 6% раствор гидроксиэтилкрахмала с молекулярной массой 130 кДа и степенью замещения гидроксиэтильными группами 0.4 (Волювен, ГЭК 130/0.4), 4% раствор сукцинилированного желатина с молекулярной массой 30 кДа (Гелофузин, ГФ) и 10% раствор альбумина человека (АЛБ). В разделе методов описан метод приготовления разбавленных образцов плазмы, позволяющий поддерживать во всех образцах после запуска свертывания (путем рекальцификации исходного цитратного образца) постоянный физиологический рН и концентрацию ионов Са+2. Описаны стандартные коагулогические тесты по определению активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового времени (ПВ), тромбинового времени свертывания (ТВ) и времени рекальцификации (BP). Далее подробно излагаются использованные методики современных интегральных методов оценки состояния гемостаза - стандартный метод тромбоэластографии, тест генерации тромбина (в стандартной и оригинальной модификациях, последняя из которых позволяет избежать дополнительного разбавления образца плазмы в ходе измерения, что очень существенно при исследовании гемодилюции), а также оригинальный метод исследования тромбодинамики (метод, использующий светорассеяние, для

измерения скорости роста сгустка от поверхности зафиксированного в пространстве активатора свертывания в образце плазмы без перемешивания). Скорость полимеризации фибрина в растворах фибриногена и в плазме в присутствии различных ПЗР была измерена по изменению оптической плотности образца в ходе свертывания на длине волны 405 нм. Подробно описана разработанная модель гемодилюции на крысах. При этом у животного быстро (~ за 1 мин) забирали 4.5 мл крови и сразу же восполняли (также за ~ 1 мин) кровопотерю равным объемом физиологического раствора (или того же раствора, но содержащего дополнительно низкомолекулярный ингибитор тромбина HC-019s-10C). Средняя степень гемодилюции при этом составляла 23±0.5%. За изменением состояния гемостаза животных следили на протяжении 1 часа с помощью тестов генерации тромбина и тромбодинамики. Влияние гемодилюции на свертывание in vivo было исследовано также на здоровых добровольцах, которые не имели кровопотери, но получали инфузию одного из двух ПЗР: гидроксиэтилкрахмала (ГЭК 130/0.4, Волювен) или раствора модифицированного желатина (Гелофузин) в дозе 12 мл/кг веса, а также на донорах костного мозга, которые имели в ходе эксфузии костного мозга серьезную (1-2 л) кровопотерю, восполняемую по протоколу путем переливания 1-2 л кристаллоидного раствора (ФР или РР), а затем 1-1.5 л одного из двух приведенных выше коллоидных растворов. Средние степени гемодилюции составляли 1.17±0.01 раза (14.53±0.01%) и 1.78±0.4 раза (43.82±0.22%) для здоровых добровольцев и доноров костного мозга, соответственно. За состоянием гемостаза следили по скорости роста сгустка в пространстве на протяжении 2 дней после инфузии.

Во второй половине главы «Материалы и методы» описан метод компьютерного скрининга для поиска новых ингибиторов тромбина на основе модели докинга (SOL) низкомолекулярных лигандов в активный центр тромбина, разработанной в НИВЦ МГУ. Здесь же кратко описаны методы синтеза новых разработанных соединений и анализ их ингибирующей активности по отношению к тромбину и фактору Ха (с помощью соответствующих хромогенных субстратов). Тот же метод оценки ингибирующей активности был использован при исследовании сохранности новых ингибиторов тромбина в ходе их длительного хранения в водных растворах. Антикоагулянтная активность новых ингибиторов была исследована в плазме in vitro с помощью тестов генерации тромбина и тромбодинамики. Острая токсичность новых соединений была исследована на мышах линии C57BL/6 (самки, 26-28г), которые получали внугрибрюшинно инъекции растворов данных соединений в различных дозах. Величина острой токсичности была оценена как доза соединения, вызывающая гибель половины животных за время менее 2 часов (LD5024aca)-

Глава 3 содержит описание полученных результатов и их обсуждение.

Часть I данной главы посвящена исследованию влияния разбавления плазмы различными ПЗР на состояние системы свертывания.

Первые опубликованные исследования нарушений в системе свертывания при переливании ПЗР с помощью классических тестов ПВ и АЧТВ привели к заключению, что ПЗР вызывают коагулопатию разбавления, т.е. скорость свертывания снижается из-за снижения при разбавлении концентраций предшественников прокоагулянтных факторов. Аналогичные результаты были получены и в данной работе. Тем не менее, этот факт не может служить прямым доказательством данной гипотезы, т.к. хорошо известно, что стандартные клоттинговые тесты малочувствительны к гиперкоагуляционным состояниям плазмы (Неткег НС, Béguin S. 2000). Т.к. данные тесты проводятся в условиях максимальной активации системы свертывания и при избытке фосфолипидной поверхности, они измеряют только максимальную возможную активность свертывания в конкретной плазме, которая зависит, в первую очередь, от концентраций в ней предшественников прокоагулянтных факторов. При разбавлении плазмы эти концентрации снижаются, что и приводит к удлинению соответствующих стандартных времен. Снижение концентраций природных ингибиторов при разбавлении плазмы не успевает внести заметного вклада в изменение ПВ и АЧТВ, из-за относительно медленной скорости их работы в сравнении с величинами данных времен. В ходе свертывания in vivo, в системе при гемодилюции могут возникать и гиперкоагуляционные нарушения. Они могут быть связаны, в первую очередь, с замедлением реакций ингибирования из-за разбавления ингибиторов свертывания. Эти кинетические гиперкоагуляционные изменения невозможно зарегистрировать, измеряя только максимально возможный уровень свертывания (ПВ и АЧТВ).

Известно, что факторы свертывания присутствуют в плазме в большом избытке. Чтобы заметно изменить ПВ и АЧТВ, их концентрации надо снизить на 50-80% (Ciavarella D et al. 1987). Это не так для ингибиторов коагуляции, в первую очередь, антитромбина III (ATIII). Реакции этих ингибиторов с активными факторами-мишенями подчиняются уравнению второго порядка, т.е. скорость реакции ингибирования снижается прямо пропорционально снижению концентрации ингибитора (Jesty J. ¡985). Расчеты показывают, что при уменьшении концентрации большинства факторов свертывания в 2 раза скорости прокоагулянтных реакций почти не изменятся, однако, одновременно, свертывание усилится из-за снижения концентрации ATIIÍ. Таким образом, первичным нарушением гемостаза при умеренной гемодилюции должно быть ускорение свертывания из-за снижения концентрации ингибиторов.

Можно надеяться, что почувствовать гиперкоагуляцию при умеренных степенях разбавления плазмы смогут такие клоттинговые тесты, как тромбиновое время (ТВ) и время рекальцификации (BP), которые должны быть чувствительны к разбавлению ингибиторов. Проведенные нами измерения показали, что, в отличие от ПВ и АЧТВ, величины BP и ТВ при разбавлении плазмы до 2-3 раз (на 50-66.7%) для всех

исследованных растворов действительно снижаются. Таким образом, ясного ответа на вопрос о влиянии гемодилюции на гемостаз измерение времен свертывания не дает.

Чтобы достоверно определять как гипо-, так и гиперкоагуляционное состояние плазмы, надо использовать другие методы оценки состояния гемостаза. Именно поэтому в подавляющем большинстве работ по исследованию изменений свертывания при гемодилюции был использован метод тромбоэластографии (ТЭГ)-Однако данные, полученные с помощью ТЭГ при разбавлении крови или плазмы, также могут быть неоднозначными, т.к. разбавление может влиять на различные параметры ТЭГ в противоположных направлениях (одновременно снижать времена реакции и коагуляции, что говорит об ускорении свертывания, и максимальную амплитуду тромбоэластограммы, что принято считать ослаблением свертывания).

В данной работе были использованы два других современных метода интегральной оценки коагуляционного статуса: тест генерации тромбина, и измерение скорости роста сгустка в пространстве. Оба эти метода используют более низкую активацию свертывания, чем стандартные клотгинговые тесты, близкую по уровню к той, что имеет место в организме. Оба они высокочувствительны как к гипо-, так и к гиперкоагуляционным изменениям свертывания.

Измерение генерации тромбина в плазмах, разбавленных ПЗР in vitro, показало, что эта генерация увеличивается для любого исследованного ПЗР с ростом степени разбавления плазмы (до 2-2.5 раз, т.е. до 50-60%). При больших степенях разбавления генерация тромбина начинает постепенно снижаться, что уже связано, по-видимому, с сильным уменьшением концентраций прокоагулянтных факторов свертывания. На рис. 1 в качестве примера приведены кривые генерации тромбина при различных степенях разбавления плазмы ФР (рис. 1А), а также величины эндогенного тромбинового потенциала (площади под кривой генерации тромбина, ЭТП) при различных степенях разбавления плазмы разными растворами (рис. 1Б), полученные в одном из характерных экспериментов.

Одновременно с величиной ЭТП, разбавление влияет и на другие параметры теста генерации тромбина: максимальную концентрацию тромбина, достигаемую в пробе (Атах), время достижения этой концентрации (tmax) и лаг-период до начала быстрой фазы наработки тромбина (W). На рис. 2 представлены усредненные для всех экспериментов величины данных параметров в неразбавленной плазме, а также в плазме, разбавленной в 2 раза различными ПЗР.

Величины ЭТП и Атах были достоверно увеличены при разбавлении плазмы любым из исследованных растворов, за исключением раствора альбумина, для которого тенденция сохранялась, но наблюдаемое увеличение не было достоверно значимым (рис. 2А и Б). Продолжительности tMr в случае разбавления плазмы растворами ГЭК 130/0.4, РПГ и ГФ были достоверно снижены. Для ФР и АЛБ тенденция изменения была аналогична, однако различия не были достоверными

Рис. 1. Генерация тромбина при разбавлении плазмы ГОР. А - Кривые генерации тромбина в плазме, разбавленной ФР. Степени разбавления (Е>=Ураз6авл ш,/УИСХ0ДН ш) составляли: (1) - 1.025 (практически неразбавленная плазма); (2) - 1.5; (3) - 2; (4) - 3; (5) - 4. Б - Характерные зависимости величины эндогенного тромбинового потенциала (ЭТП) от степени разбавления плазмы, полученные в одном из экспериментов. За 100% принята величина ЭТП в неразбавленной плазме. Для разбавления использовали: (1) - ФР; (2) - РПГ' (3) - ГЭК 130/0.4; (4) -ГФ; (5) - АЛБ.

ПЛ ФР РПГ ГЭК ГФ АЛ6

ПЛ ФР РПГ ГЭК

ПЛ ФР РПГ ГЭК ГФ АЛЕ

ПЛ ФР РПГ ГЭК ГФ АЛБ

Рис. 2. Параметры генерации тромбина в неразбавленной плазме, а также в плазме, разбавленной в 2 раза различными ГОР. А - эвдогенный тромбиновый потенциал (ЭТП); Б - максимальная концентрация тромбина в пробе (Агаах); В - время достижения максимальной концентрации тромбина ашах) и Г - лаг-период генерации тромбина (иг). В качестве нормы приняты параметры, измеренные в неразбавленной плазме (ПЛ). Для разбавления плазмы были использованы: ФР; РПГ; ГЭК 130/0.4; ГФ и АЛБ. Все коллоиды растворены в ФР. Приведены средние значения величин и ошибки среднего (п=8). * Значения достоверно отличаются от соответствующих значений для неразбавленной плазмы (Р<0.05, парный 1-тест Стьюдента).

(рис. 2Г). Для всех ПЗР величины tmax при разбавлении плазмы имели тенденцию к укорочению, которое, однако, не было достоверно значимым (рис. 2В). Таким образом, все представленные данные говорят о том, что при умеренных степенях разбавления плазмы любым ПЗР происходит ускорение и увеличение генерации тромбина по сравнению с неразбавленной плазмой.

Эффекты разбавления в разных плазмах достаточно сильно варьируют, но качественно они одинаковы для всех исследованных растворов. Это может говорить о том, что увеличение генерации тромбина при гемодилюции связано не со свойствами того или иного ПЗР, а с самим процессом разбавления плазмы. По-видимому, при умеренных степенях разбавления система, действительно, оказывается более чувствительной к разбавлению присутствующих в плазме ингибиторов свертывания. Полученные данные хорошо согласуются с результатами ряда опубликованных работ ('Tocantins LM at al. 1951; Monkhouse FC. 1959; De Smedt E at al. 2009), но противоречат выводам работы (Brummel-Ziedins К at al. 2006), авторы которой говорят об уменьшении генерации тромбина при разбавлении плазмы, определяя количество генерированного тромбина на основании измерения концентрации образовавшегося тромбин-антитромбинового (TAT) комплекса. Однако, т.к. концентрация образовавшегося TAT зависит не только от концентрации тромбина, но и от концентрации АТШ в плазме, для сравнения плазм с различной степенью разбавления данный метод является некорректным.

Развитие гиперкоагуляционного состояния при умеренных степенях разбавления плазмы ПЗР in vitro наблюдалось и при исследовании в разбавленной плазме скорости роста сгустка в пространстве (VCIyCTKa). Метод позволяет измерять начальные и стационарные VcryCTKa, которые характеризуют различные стадии процесса свертывания: исходную инициацию вблизи поверхности активатора и стадию роста сгустка в объеме образца вдали от этой поверхности, соответственно. Кроме того, еще одним параметром, характеризующим пространственную динамику коагуляции, является образование в ходе свертывания спонтанных сгустков, возникающих в объеме образца вдали от активатора и прямо с ним не связанных.

Начальная и стационарная Vcryc7xa в образцах плазмы были измерены после ее разбавления различными ПЗР. Активацию свертывания проводили как по внутреннему, так и по внешнему пути (стеклом, или фибробластами, несущими на поверхности тканевый фактор, соответственно). В отличие от ЭТП, VcrycTKa по-разному изменялись в присутствии различных ПЗР. На рис. ЗА представлены соответствующие зависимости, полученные для начальных VcrycTKa при контактной активации свертывания. При увеличении разбавлении плазмы до 2-3 раз любым ПЗР кроме РПГ наблюдали увеличение начальной VcrycTKa. Величина этого эффекта постепенно убывала в ряду: ФР > АЛБ > ГФ > ГЭК 130/04, а для раствора РПГ Усгустка падала с увеличением степени разбавления. В случае контактной активации не удавалось измерить стационарные величины VcrycTKa, т.к. в разбавленных образцах

резко ускорялось спонтанное свертывание. В результате все поле образца заполнялось спонтанными сгустками быстрее, чем Ус1устка успевала выйти на стационарное значение. Причина появления спонтанных сгустков в настоящий момент до конца не выяснена. Возможно, что к появлению спонтанного свертывания могут приводить присутствующие в плазме из-за гемолиза клеток крови и эндотелия фрагменты клеточных мембран, или везикулы, возникающие в ходе целого ряда патологических процессов.

Степень разбавления

1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

Степень разбавления (V . /V )

1 рдзбавл ИСХОДИ'

Рис. 3. Начальные скорости роста сгустка (в % относительно неразбавленной плазмы) при различных степенях разбавления и разных типах активации свертывания. А -

активированный по внутреннему пути (стеклом) рост сгустка в плазмах, разбавленных (1) -ФР; (2) - РПГ; (3) - ГЭК 130/0.4; (4) - ГФ и (5) - АЛБ. Б - Рост сгустка при активации свертывания стеклом (кривые 1 и 3) или фибробластами (кривые 2 и 4) в плазмах, разбавленных ФР (кривые 1 и 2) или раствором ГЭК 130/0.4 (кривые 3 и 4). Приведены средние величины и стандартные отклонения.

Качественно аналогичная картина влияния ПЗР на Уиустка наблюдалась и при активации свертывания по внешнему пути, однако, величина наблюдаемого увеличения Усгустк8 в данном случае всегда была ниже, чем при контактной активации. На рис. ЗБ в качестве примера представлены зависимости начальной У0Г7С„а от степени разбавления плазмы ФР или раствором ГЭК 130/0.4 при различных путях активации свертывания. Измерение \''сгустка при активации по внешнему пути проводили в присутствии ингибитора контактной активации (ингибитор трипсина из кукурузы, КТИ). Это снижало скорость спонтанного свертывания, что позволяло измерить в экспериментах не только начальную, но и стационарную Усп,стка. Суммарные данные по влиянию степени разбавления плазмы различными ПЗР на начальные и стационарные Усгусгка при активации свертывания тканевым фактором показаны на рис. 4 Представлены усредненные скорости в неразбавленной плазме, а также в плазме, разбавленной разными ПЗР в 2 раза. Стационарная Ус,устка в разбавленных образцах была достоверно выше, чем в исходной плазме для всех исследованных ПЗР кроме РПГ (рис. 4Б). В то же время начальная Ус(тстка при

разбавлении была достоверно увеличена только для плазм, разбавленных ФР, но оставалась в пределах нормальных значений для всех остальных растворов. Увеличение Усгустка (начальной и стационарной) было достоверно ниже, при разбавлении плазмы коллоидными растворами, чем кристаллоидным ФР. В случае начальной Усгустка исключение составляла скорость роста сгустка при разбавлении плазмы РПГ. Эта скорость не только не увеличивалась, но даже имела тенденцию к уменьшению, хотя оно и не было достоверно значимым.

* * *

# # # * * *

ПЛ ФР РПГ ГЭК ГФ АЛБ

Рис. 4. Начальные (А) и стационарные (Б) скорости пространственного роста сгустка в неразбавленной плазме и плазме, разбавленной в 2 раза различными ГОР, при активации свертывания по внешнему пути. За 100% приняты значения соответствующих величин в неразбавленной плазме (ПЛ). Для разбавления были использованы следующие ПЗР: ФР (п=20); РПГ (п=12); ГЭК 130/0.4 (п=18); ГФ (п=12); АЛБ (п=12). Представлены средние величины ± ошибки среднего. # Различия между неразбавленной и разбавленной плазмой достоверны (Р<0.05, ANOVA); * Различия между плазмой, разбавленной данным ПЗР, и плазмой, разбавленной ФР, достоверны (Р<0.05, ANOVA).

Таким образом, величина наблюдаемого при разбавлении эффекта зависела не только от типа ПЗР, но и от типа активации свертывания. При этом увеличение Vcryc„a было более сильным при активации свертывания по внутреннему (контактному) пути. Аналогичные тенденции наблюдались и в ряде работ при тромбоэластографическом исследовании разбавленных плазм {Niemi ТТ et al. 2006; Innerhofer Р et al. 2002). Причина этого в настоящий момент не ясна. Недавно появилась работа (Van der Meijden РЕ et al. 2012), результаты которой говорят о том, что тромбоцитарные и эритроцитарные везикулы осуществляют свое влияние на гемостаз именно через контактный путь свертывания. Авторы показали, что эти микровезикулы способны запускать генерацию тромбина в плазме только по внутреннему пути, т.к. эта способность полностью пропадает в дефицитной по фактору XII плазме. В тоже время, влияние этих везикул на генерацию тромбина в плазме не зависит от дефицита

или ингибирования фактора VII, т.е. от внешнего пути свертывания. В отличие от тромбоцитарных и эритроцитарных, микровезикулы из моноцитов могут запускать генерацию тромбина и в плазме, дефицитной по фактору XII, т.к. несут на поверхности небольшое количество тканевого фактора и могут запускать генерацию тромбина по внешнему пути.

Если усиление свертывания при умеренных разведениях плазмы связано, в первую очередь, со снижением концентрации ингибиторов коагуляции, то для суммарного изменения коагуляционного статуса при гемодилюции могут быть важны концентрации не только ATIII, но и других ингибиторов. Можно предполагать, что более сильный гиперкоагуляционный эффект при контактной активации свертывания связан со снижением при разбавлении концентрации ингибиторов этой активации.

При контактной активации свертывания, в отличие от активации по внешнему пути, даже начальные VcryCTKa оказались чувствительны к типу использованного ПЗР. При этом самый высокий гиперкоагуляционный эффект наблюдался при разбавлении плазмы кристаллоидным ФР (рис. ЗА).

Полученные результаты дают основание полагать, что коллоидные растворы оказывают на свертывание двоякое действие. С одной стороны, разбавление плазмы любым коллоидным раствором, также как и кристаллоидным ФР, вызывает усиление генерации тромбина за счет нарушения баланса про- и антикоагулянтных свойств системы, а с другой, присутствие некоторых коллоидов в плазме может оказывать собственное специфическое действие на процесс образования фибринового сгустка, и, таким образом, тормозить наблюдаемый рост сгустка в пространстве. Ингибирующий эффект различных коллоидных растворов может сильно различаться. При этом такие коллоиды, как желатин, декстран или ГЭК могут изменять качество образующихся сгустков СMardel SN et al. 1996; Carr ME, Gabriel DA. 1980; Carr ME. 1986), a из-за ускоренного растворения таких сгустков в ходе реакций фибринолиза (Carr ME, A hing ВМ. 1995), суммарный процесс образования сгустка может замедляться.

Еще одним аспектом влияния коллоидных ПЗР на скорость образования сгустка является их влияние на скорость полимеризации фибрина. В современной литературе широкое распространение получила гипотеза, которая объясняет замедление образования сгустков в присутствии коллоидных растворов тем, что данные коллоиды снижают скорость полимеризации фибрина, ухудшая тромбин-фибриногеновые взаимодействия и/или взаимодействия фактора ХШа с фибрин-полимером (Nielsen VG. 2005). Гипотеза основана на том, что при измерении тромбоэластографических показателей в плазмах, разбавленных различными коллоидными растворами, в некоторых работах наблюдали снижение максимальной амплитуды и угла а ТЭГ. Такое изменение параметров в ТЭГ принято считать ухудшением свертывания. Однако это не позволяет считать предложенную гипотезу полностью доказанной, т.к. тромбоэластография измеряет не скорость полимеризации, а только вязко-эластичные свойства образующегося сгустка. Прямых исследований

влияния различных ПЗР на скорость полимеризации фибрина до сих пор не было. Это

стало задачей нашей работы.

Влияние ПЗР на скорость полимеризации фибрина было исследовано сначала в чистых растворах фибриногена, разбавленных различными ПЗР. Полимеризацию запускали постоянной концентрацией тромбина. В предварительных экспериментах было показано, что: активность тромбина не меняется в присутствии различных ПЗР, что за время эксперимента (40 мин) она снижается не более чем на 10% и что весь присутствующий в образцах фибриноген полностью превращается в фибрин за 30 мин инкубации.

На рис. 5А представлены усредненные кривые полимеризации, полученные в исходном растворе фибриногена, а также после его разбавления в 2 раза различными ПЗР. Таблица 1 и рис. 5 (Б, В и Г) представляют усредненные величины отдельных параметров полимеризации: максимальной оптической плотности образца после полной полимеризации фибрина (Огаах), лаг-периода полимеризации (т.е. времени достижения 3% от Этю, 1лаг) и максимальной скорости полимеризации фибрина в образцах (Утах).

При разбавлении фибриногена любым ПЗР кривые полимеризации изменялись (рис. 5А). Величина От2Х достоверно снижалась. Это снижение было меньше в растворах ГЭК и ГФ, для которых величины Отах были достоверно выше, чем в образцах, разбавленных ФР. Для сгустков, сформированных в кристаллоидных растворах, РПГ и АЛБ величины Отм достоверно не различались (рис. 5Б). Наблюдаемые различия в От„ говорят о том, что, несмотря на одинаковое во всех полученных сгустках количество фибрина, качество сгустков (плотность, толщина образующихся волокон фибрина, количество связанной со сгустком воды и т.п.) в присутствии разных ПЗР было различным.

Присутствие любого из исследованных ПЗР достоверно сокращало время до начала полимеризации (1лаг) (рис. 5В). При этом влияние кристаллоидных растворов (ФР и РР), а также ГФ не различалось, в то время как все другие коллоидные растворы сокращали лаг-период полимеризации достоверно сильнее, чем ФР.

Максимальная скорость полимеризации также зависела от типа использованного ПЗР. Она не отличалась достоверно в исходном растворе фибриногена и после его разбавления в 2 раза кристаллоидными растворами (ФР и РР), но была существенно увеличена, даже по отношению к исходному неразбавленному раствору фибриногена, в присутствии любого из исследованных коллоидных растворов (рис. 5Г).

Поскольку при регистрации процесса свертывания на величину измеряемой оптической плотности может влиять и скорость поперечного сшивания фибрина под действием фибринстабилизирующего фактора ХШа, вторую серию опытов мы провели в присутствии в системе физиологической концентрации фактора XIII. Единственным отличием этих экспериментов от описанных выше было то, что

исходный раствор фибриногена в физиологическом растворе (4 мг/мл) содержал дополнительно физиологическую концентрацию фактора XIII (10 мкг/мл).

Присутствие фактора XIII в плазме не меняет принципиально результатов, полученных в чистых растворах фибриногена, за исключением того, что снижение скорости полимеризации при разбавлении исходного раствора фибриногена кристаллоидными ПЗР стало достоверным (таблица 1).

. 0,8 5

О 0,4 | 0,2

10 1S 20 Время, мин

§ о,<

1 1

Пп т п

ФНГ ФР РР РПГ ГЭК ГФ АЛБ

V?/

УА

ФНГ ФР РР РПГ ГЭК ГФ АЛБ

# * я #

ГЭК ГФ АЛБ

Рис. 5. Полимеризация фибрина в присутствии различных ПЗР. Исходный раствор фибриногена в физиологическом растворе (4 мг/мл) (1, ФНГ) был разбавлен в два раза следующими ПЗР: 2 - ФР, 3 - РР, 4 - РПГ, 5 - ГЭК 130.0.4, 6 - ГФ или 7 - АЛБ. А -усредненные кривые полимеризации фибрина, измеренные по увеличению оптической плотности раствора на длине волны 405 нм. Б - Максимальные оптические плотности образцов после окончания полимеризации (Dmax). В - Лаг-периоды полимеризации (tmr). Г -Максимальные скорости полимеризации (Vmax) в исходном растворе фибриногена (ФНГ) и после его разбавления в 2 раза различными ПЗР. Представлены средние величины ± ошибки среднего (п=10-11). # - Различия между исходным неразбавленным раствором фибриногена (4 мг/мл) и разбавленной пробой достоверны (Р < 0.05, ANO VA). * - Различия между пробой, разбавленной в 2 раза данным ПЗР, и пробой, разбавленной физиологическим раствором ' достоверны CP < 0.05, ANO VA).

Таким образом, анализ представленных данных показал, что кристаллоидные растворы влияют на скорость полимеризации фибрина очень слабо, в то время как

скорость полимеризации не только не уменьшается, но, наоборот, увеличивается в присутствии исследованных коллоидных растворов. Кроме того, при разбавлении раствора фибриногена любым ПЗР сильно сокращается лаг-период свертывания, что говорит о том, что наработка фибрин-мономеров в разбавленных образцах происходит существенно быстрее, чем в исходном растворе. При этом практически все коллоидные растворы (за исключением раствора ГФ в серии экспериментов без фактора XIII) сокращали лаг-период достоверно сильнее, чем ФР (рис. 5В). Все эти результаты противоречат утверждению о том, что коллоиды ухудшают тромбин-фибриногеновые и фактор XIIIa-фибрин-полимерные взаимодействия, высказанному в литературе (Nielsen VG. 2005). Однако одновременно коллоиды могут ухудшать качество образующихся сгустков (формирующиеся фибриллы могут быть более толстыми, но короткими, т.е. иметь увеличенное отношение масса/длина, сгустки могут быть более пористыми, содержащими больше связанной воды, менее устойчивыми к фибринолизу). Это и приводит к описанному в литературе ухудшению показателей ТЭГ (снижению силы сгустка и угла а).

Таблица 1. Параметры полимеризации фибрина в присутствии различных ПЗР '

ПЗР Фибриноген (п=10-11) Фибриноген + фактор XIII (п=5)

Dm ах t-лаг Vmax Dm ах t-лаг Vmax

Исходный фибриноген (4 мг/мл) 100.0±3.3 100.0±15.0 100.0±7.9 Ю0.0±4.2 100.0±15.0 100.0±2.6

Физиологический растовр 43.1±2.9 43.8±12.5 79.8±6.2 41.0±2.9 29.5±3.1 76.9±2.1

Раствор Рингера 47.4±3.1 49.1±13.4 84.8±5.4 43.4±2.2 36.8±9.4 80.4±3.8

Декстран 40 (Реополиглюкин) 45.4±3.5 16.6±1.4 139.1±6.4 50.6±1.9 11.6±1.0 137.3±5.4

ГЭК 130/0.4 (Волювен) 66.0±5.3 12.9±1.2 179.4±14.8 67.6±3.1 9.3±1.9 181.3±15.8

Желатин полисукцинат (Гелофузин) 73.1±4.4 30.7±6.3 139.2±6.0 75.0±3.4 13.2±1.4 131.9±1.9

Альбумин человека (10%) 53.2±5.1 14.4±11.6 145.2±6.6 55.2±2.9 11.4±0.9 130.7±5.3

*' Исходные образцы фибриногена разбавлены ПЗР в 2 раза. Все данные (среднее ± ошибка среднего) представлены в % от аналогичных величин дня неразбавленных растворов фибриногена

В экспериментах с растворами фибриногена из рассмотрения исключены многие реакции, происходящие при свертывании в плазме, поэтому нами была проведена

серия опытов, где полимеризация происходила в цитратной плазме, разбавленной в 2 раза разными ПЗР. Свертывание активировали одинаковой концентрацией тромбопластина. Концентрация СаС12 во всех пробах также была строго одинакова.

Аналогично результатам, полученным в растворах фибриногена, максимальная оптическая плотность в полностью свернувшихся разбавленных образцах всегда была достоверно ниже, чем в исходной плазме, а время лаг-периода при разбавлении любым ПЗР всегда укорачивалось. При этом коллоидные ПЗР снижали Хлаг достоверно сильнее, чем кристаллоидные ФР или PP. Несмотря на то, что начало свертывания при разбавлении плазмы в 2 раза любым ПЗР всегда ускорялось, в отличие от опытов с растворами фибриногена, максимальная скорость полимеризации плазмы в этих условиях достоверно снижалась. При этом кристаллоидные растворы (ФР и РР) и ГФ влияли на Vmax одинаково, тогда как разбавление всеми остальными исследованными коллоидными растворами (РПГ, ГЭК и АЛБ) снижало скорость полимеризации достоверно сильнее, чем разбавление ФР.

То, что один и тот же коллоидный раствор с одной стороны укорачивает 1лаг, а с другой - замедляет максимальную скорость полимеризации в плазме, может означать, что ПЗР по-разному влияет на различные реакции, участвующие в формировании сгустка. Как было показано выше, увеличение генерации тромбина при гемодилюции должно приводить к ускоренному образованию фибрин-мономеров и, соответственно, к укорочению лаг-периода до начала свертывания. Это, действительно, происходит во всех разбавленных образцах плазмы. Однако пока не понятно, какие реакции в плазме отвечают за суммарное снижение скорости полимеризации. Возможно, причина в том, что при данной постановке опытов свертывание происходит не при постоянной концентрации тромбина, а под действием того тромбина, который образуется в ходе запуска коагуляционного каскада в каждом отдельном образце разбавленной плазмы, а кинетика изменения концентрации тромбина в плазме, разбавленной разными растворами, оказывается различной. Эти вопросы требуют дальнейшего изучения.

Итак, проведенные ш vitro эксперименты показали, что при разбавлении плазмы до 2-3 раз искусственными ПЗР происходит усиление свертывания. Генерация тромбина, Vcryc„a, а также Vmax полимеризации при разбавлении увеличивались. Мы предполагали, что причиной такого усиления свертывания может быть сдвиг баланса между про- и антикоагулянтными реакциями, происходящий из-за того, что при умеренной гемодилюции система оказывается более чувствительной к разбавлению природных ингибиторов свертывания. Чтобы проверить эту гипотезу, были проведены опыты по коррекции вызванных гемодилюцией гиперкоагуляционных нарушений путем введения в систему дополнительного ингибитора тромбина (ATIII или низкомолекулярного ингибитора из новой серии прямых ингибиторов тромбина, разработанных в этой работе (см. далее)). При этом в экспериментах с ATIII ингибитор добавляли в разбавленные образцы плазмы из такого расчета, чтобы во всех пробах одной серии финальная концентрация ингибитора в образцах была

постоянной. В опытах с синтетическим ингибитором тромбина (HC-025s-IOC) различные концентрации ингибитора добавляли в стандартный ФР, которым разбавляли плазму. Эта постановка эксперимента отличается от условий в опытах с ATIII тем, что ингибитор введен прямо в раствор, которым разбавляют плазму. Таким образом, чем выше степень разбавления, тем более высока финальная концентрация добавленного ингибитора в пробе. Такая постановка прямо имитирует процесс in vivo при введении различных объемов ПЗР, содержащего ингибитор.

За изменениями коагуляции при введении ингибиторов тромбина следили по изменениям параметров генерации тромбина (ЭТП) и тромбодинамики (VcryCTKa). Полученные результаты представлены на рис. 6. Оба ингибитора дозо-зависимо снижали увеличенный при разбавлении плазмы ЭТП (рис. 6А, Б и В). Добавление ингибиторов корректировало также Vcryc„a при активации коагуляции, как по внутреннему, так и по внешнему пути (рис. 6Г). Оптимальной концентрацией ATII1 можно считать концентрацию близкую к 1ед./мл, т.к. при этом показатели ЭТП и VcryCTKa оказываются наиболее близкими к нормальным значениям. Однако ATIII является дорогим природным антикоагулянтом, для которого нельзя до конца исключить возможность переноса опасных вирусных инфекций. Поэтому его трудно считать оптимальным для добавления в ПЗР с целью создания ПЗР нового типа С точки зрения безопасности и цены более приемлемыми для этой цели могут стать синтетические низкомолекулярные ингибиторы тромбина. Если полагать, что при коррекции коагуляции приемлемо ±50% изменение в ЭТП, то видно, что концентрация ингибитора HC-025s-IOC в растворе, соответствующая 0.5 мкМ, обеспечивает наиболее широкую область разбавлений, в которой данный раствор может быть использован для коррекции ЭТП при гемодилюции. Концентрации других синтетических ингибиторов, которые можно использовать в ПЗР, будут зависеть от равновесных констант связывания этих соединений с тромбином, и должны подбираться отдельно для каждого такого ингибитора.

Таким образом, полученные нами оригинальные данные подтвердили существование усиления свертывания при умеренном разбавлении плазмы in vitro различными ПЗР и возможность их компенсации добавляемыми в ПЗР ингибиторами тромбина. Несмотря на это, необходимо было убедиться, что подобные изменения существуют и в организме in vivo. В рамках данной работы это было продемонстрировано в модели умеренной гемодилюции на животных (крысы) и при измерении показателей гемостаза здоровых добровольцев при переливании им ПЗР, а также здоровых доноров костного мозга, которые получали объемные инфузии ПЗР для компенсации кровопотери при операции эксфузии костного мозга.

У животных забирали по 4.5 мл крови, после чего быстро восполняли кровопотерю эквивалентным объемом одного из исследуемых ПЗР (ФР или ФР, содержащего дополнительно 2 мкМ разработанного нами низкомолекулярного

Разбавление ФР (V /VI Разбавление ГЭК 200/0.5 (V . N )

раз&авл исхоян' * раэбэвл исход» '

Рис. 6. Коррекции гемодилюционной гиперкоагуляции ингибиторами тромбина.

Добавление ATIII в плазму снижает повышение ЭТП, вызванное разбавлением плазмы ФР (А) или ГЭК 200/0.5 (Б). Концентрации добавленного ATIII в плазме для всех точек каждой кривой были постоянны и составляли: (1) - 0; (2) - 0.145 ед./мл; (3) - 0.29 ед./мл; (4) - 0.58 ед./мл; (5) - 0.87 ед./мл или (6) - 1.45 ед./мл; (п=5-9). Свертывание активировано по внешнему пути (концентрация тканевого фактора (ТФ) 4 пМ). (В) - Характерный эксперимент, представляющий изменение ЭТП при разбавлении плазмы ФР, содержащим различные концентрации низкомолекулярного ингибитора тромбина HC-025s-IOC. Концентрация ингибитора в ПЗР составляла: (1) - 0, (2) - 0.25 мкМ, (3) - 0.5 мкМ и (4) - 1 мкМ. Пунктирными линиями указан ±50%-ный интервал изменений ЭТП по отношению к исходной величине. Свертывание активировано по внешнему пути (концентрация ТФ 4 пМ). (Г) - Начальные VCI>WK8 при разбавлении плазмы in vitro ФР в присутствии различных ингибиторов тромбина: (1) - разбавление плазмы ФР, активация свертывания по внутреннему пути (стеклом, п=3); (2) - разбавление той же плазмы ФР, при условии поддержания во всех пробах постоянной финальной концентрации добавленного ATIII (0.87 ед/мл), активация то внутреннему пути (п=3); (3) - разбавление плазмы ФР при активации свертывания по внешнему пути (ТФ, п=3), или (4) - разбавление плазмы ФР, содержащим дополнительно 8 мкМ синтетического ингибитора НС-025з-ЮС (активация ТФ, п=3). Приведены средние величины ± среднеквадратичные отклонения.

ингибитора тромбина HC-019s-IOC). Весь процесс занимал в сумме 1-2 минуты. Состояние системы свертывания в пробах плазмы до и после переливания ПЗР оценивали, измеряя ЭТП и пространственную динамику свертывания. Степень кровопотери была рассчитана, исходя из полного объема крови животного, а также снижения концентрации эритроцитов и гемоглобина в крови. Величина концентрации ингибитора, добавляемого в ФР, была выбрана на основании опытов in vitro, учитывая, что его концентрация в крови in vivo будет дополнительно снижена при переливании раствора животному (в 4-8 раз при восполнении, соответственно, 2512.5% кровопотери равным объемом ПЗР), а также то, что ингибитор в ходе свертывания будет расходоваться. Параметры коагуляции (АЧТВ, ПВ, ЭТП и VcrycTKa) были исследованы в крови каждого животного до переливания ПЗР, а также через определенное время после такого переливания.

АЧТВ и ПВ в плазмах крыс до и после переливания ПЗР достоверно не изменялись, что не является неожиданным, учитывая умеренную степень гемодилюции (Ciavarella D et al. 1987; Hemker НС, Béguin S. 2000). В опытной группе, получавшей ПЗР с ингибитором тромбина HC-019s-IOC, наблюдалась тенденция к удлинению АЧТВ и ПВ, но эти различия не были достоверными.

Было обнаружено, что при быстром восполнении фиксированной кровопотери (4.5 мл) равным объемом стандартного ФР у животных постепенно развивается гиперкоагуляционное состояние, которое можно зафиксировать по монотонному увеличению ЭТП при увеличении времени после переливания раствора (рис. 7, слева). При восполнении кровопотери ФР, содержащим 2 мкМ ингибитора HC-019s-IOC, гиперкоагуляция не наблюдалась ни для одного из исследованных времен (рис. 7,

Рис. 7. Добавление ингибитора тромбина в ФР предупреиедает гиперкоагуляцию, вызываемую гемодилюцией у крыс in vivo. Кровопотерю (4.5 мл) быстро восполняли переливанием равного объема ФР (контрольная группа), либо того же раствора, содержащего 2 мкМ ингибитора тромбина HC-019s-IOC (опытная группа). Представлены изменения ЭТП (средние величины ± ошибки среднего (п=6-10)) через различные промежутки времени после переливания ПЗР. * - Достоверные различия с аналогичными группами контроля [Р<0.05, ANOVA).

0.9% NaCI 2 мкМ HC-019S-IOC

При изучении скоростей роста сгустка у животных в контрольной и опытной группах мы столкнулись с тем, что при переливании ФР резко усиливалось

образование в плазме спонтанных сгустков. Это не позволило точно измерить величины Усгустка, поэтому чтобы охарактеризовать изменение пространственной динамики свертывания были рассчитаны максимальные скорости спонтанного свертывания в образцах контрольных и опытных животных. Максимальная скорость спонтанного свертывания при переливании ФР через 1 час после гемодилюции превышала базовую скорость (до переливания ПЗР) в среднем примерно в 2 раза, тогда как в опытной группе это увеличение в среднем было менее 10%.

Далее в работе были исследованы изменения коагуляции при переливании стандартных ПЗР добровольцам. Все они дали информированное согласие на участие в экспериментах. Первую группу составляли здоровые добровольцы, не имеющие кровопотери (контрольная группа I). Они получали единовременную инфузию одного из коллоидных ПЗР (ГЭК 130/0.4 или ГФ) в дозе 12 мл/кг веса тела. Вторая группа состояла из здоровых доноров костного мозга, эксфузия которого сопровождается обычно массивной кровопотерей и переливанием больших объемов стандартных ПЗР (опытная группа II). Образцы крови для анализа Усгустка и ЭТП забирали до, а также через 2, 24 и 48 часов после переливания ПЗР. Параллельно клинико-диагностическая лаборатория ГНЦ измеряла для каждого пациента показатели стандартной коагулограммы. Эти показатели, включая уровень АТШ, не различались достоверно ни на одном из исследованных временных интервалов. Кроме этого, в группе II были проведены измерения показателей тромбоэластографии.

В обеих группах Усгустка сразу после гемодилюции увеличивается (рис. 8). Кроме

■ ГЭК 130/0.4 (п=5)

- Гелофузин (п=2)

10 20 30 40 50 Время, ч

—ГЭК 130/0.4 (п=6)

- • - Гелофузин (п=5)

10 20 ЭО 40 50 Время, ч

Рис. 8. Начальные У„

в различные сроки после инфузии ГЭК 130/0.4 или ГФ в

группах пациентов 1 и П. А - группа I - здоровые добровольцы без кровопотери (п=7), которым было перелито по 12 мл/кг ГЭК 130/0.4 (п=5) или ГФ (п=2). Средняя степень гемодилюции 1.17+0.01 раза. Б - группа II - здоровые доноры костного мозга (п=11), получившие сначала один из растворов кристаллоидов (1-2 л), а затем инфузию ГЭК 130/0.4 (п=6) или ГФ (п=5) объемом 1-1.5 л. Средняя степень гемодилюции 1.78+0.40 раза. Представлены средние величины ± среднеквадратичные отклонения. За 100% приняты исходные скорости пространственного роста сгустков до инфузии ПЗР. Сплошные линии соответствуют раствору ГЭК 130/0.4, пунктир - раствору ГФ.

того, в плазме резко ускоряется спонтанное свертывание. На рис. 9 в качестве примера представлены серии фотографий растущих сгустков в образцах плазмы одного и того же донора костного мозга, взятых в. различное время после инфузии раствора ГФ.

Увеличение Усгустаа у доноров костного мозга, которое сохранялось на протяжении 1-2 суток после переливания не связано исключительно с травматичностью операции эксфузии костного мозга. Это подтверждает тот факт, что аналогичное ускорение Ус1устка было обнаружено и у здоровых добровольцев (без кровопотери или травмирующих операций), которым переливали ПЗР.

Генерация тромбина была измерена только в отдельных экспериментах для пациентов группы II. Полученные результаты показали увеличение ЭТП через 2 часа после начала операции. Это увеличение постепенно снижалось через сутки, а через 48 часов у большинства пациентов ЭТП полностью возвращался к исходной величине, хотя иногда генерация тромбина оставалась увеличенной даже через 2 суток. Эффект был качественно одинаковым при инфузии различных ПЗР, а также при активации свертывания как по внешнему, так и по внутреннему пути.

5 мин 10 мин 15 мин 25 мин

0 н Я Щ\

2ч н 91 1 : 1

24 ч н Ш < Ж -¿¿мм

48 ч Н Н 1 И. 1 1 !

Рис. 9. Серии фотографий растущих сгустков в образцах плазмы одного из доноров костного мозга, взятых в различные моменты времени после операции, сопровождавшейся инфузией раствора ГФ (степень гемодилюции 1.68 раза, т.е. 40.5%).

Образцы плазмы были получены до, а также через 2, 24 и 48 часов после операции. Каждый горизонтальный ряд представляет последовательные фотографии одной пробы, снятые через 5, 10, 15 и 25 минут после активации свертывания. Активатор (стекло) на фотографиях расположен справа.

Параллельно с измерениями Усгустка и ЭТП в группе доноров костного мозга были проведены измерения ТЭГ. Они были выполнены в отделении анестезиологии и реанимации ГНЦ О.В. Щербаковой и А.Ю. Булановым. Стандартные параметры тромбоэластограммы были измерены до, а также через 2 часа после начала операции. Полученные результаты представлены в таблице 2. Сравнивая данные ТЭГ, полученные для ГЭК 130/0.4 и ГФ, можно видеть, что в то время как для ГФ изменение параметров ТЭГ в ходе операции эксфузии костного мозга однозначно говорит об усилении свертывания, для ГЭК 130/0.4 большинство этих параметров достоверно не изменяется.

Таблица 2. Параметры ТЭГ в образцах крови доноров костного мозга до и через 2 часа после инфузии различных плазмозамещающих растворов

^\Лараметр ПЗР Время (часы) К (мин) К (мин) Угол а (градусы) МА (мм)

ГЭК 130/0.4 (Волювен) (п=8) 0 10.62±3.29 5.91±2.36 41.12±8.01 47.65±4.25

2 10.04±2.33 6.50±3.65 42.81±7.26 40.40±7.39

Р'> 0.498 0.354 0.159 0.003

Гелофузин (п=12) 0 11.11±2.06 6.36±3.52 49.24±6.65 46.56±8.46

2 7.82±1.85 3.35±1.10 60.64±5.40 51.06±6.47

Р'> 0.004 0.015 0.010 0.134

Представлены средние величины ± среднеквадратичные отклонения.

* Статистическая достоверность различий в параметрах ТЭГ до и через 2 часа после инфузии ПЗР была оценена с помощью стандартного Ьтеста Стьюдента. Различия рассматривались как статистически достоверные при величинах Р<0.05.

Взятые вместе, полученные результаты показывают, что гемодилюция может являться реальным риск-фактором развития гиперкоагуляционного состояния в организме, наиболее сильно выраженным в случае быстрого переливания кристаллоидных растворов.

Часть II главы 3 посвящена разработке новых низкомолекулярных ингибиторов тромбина для внутривенного введения, которые могут быть использованы не только в составе ПЗР для коррекции гемодилюционной гиперкоагуляции, но и как самостоятельные антикоагулянтные препараты.

В настоящее время в мире для клинического применения одобрен только один низкомолекулярный ингибитор тромбина для внутривенного введения - аргатробан. Однако он мало стабилен в плазме и водных растворах, что делает его непригодным для введения в ПЗР. Для того чтобы ингибиторы можно было использовать как добавку в ПЗР, они должны быть не только высоко эффективными и безопасными, но также обладать стабильностью в водных растворах. Разработка таких ингибиторов была одной из целей данной работы.

Поиск новых химических структур ингибиторов является ключевой фазой долгого, трудоемкого и дорогостоящего процесса создания нового лекарства. Современный лекарственный дизайн достаточно широко использует компьютерный скрининг структур новых лигандов с помощью программ докинга. Эти программы позволяют теоретически позиционировать молекулу низкомолекулярного соединения в активный центр фермента, рассчитать энергию связывания соединения с ферментом и, таким образом, предсказать прочность этого связывания, а, следовательно, сделать предположение о возможной ингибиторной эффективности лиганда.

Работа по компьютерному дизайну новых ингибиторов тромбина была проведена совместно с сотрудниками Научно-исследовательского вычислительного центра МГУ д.ф.-м.н. профессором В.Б. Сулимовым, к.ф.-м.н. А.Н. Романовым и к.ф.-м.н. O.A. Кондаковой. Первичный компьютерный скрининг и отбор наиболее перспективных соединений проводили с помощью оригинальной программы докинга SOL, разработанной в НИВЦ МГУ. Наиболее перспективные соединения были затем синтезированы сотрудниками Института органической химии РАН Ю.В. Кузнецовым и A.A. Боголюбовым, а их антитромбиновая и антикоагулянтная активность были исследованы экспериментально.

Активный центр тромбина имеет несколько карманов (Sn), где происходит связывание и реакции расщепления субстрата. Молекулы прямых ингибиторов тромбина часто занимают те же карманы, препятствуя связыванию субстрата и, таким образом, ингибируя действие фермента. Как правило, фрагменты молекулы ингибитора, располагающиеся в определенном кармане активного центра, носят номер соответствующего кармана (Рп). Схема расположения фрагментов ингибитора тромбина в карманах активного центра фермента (на примере известного орцинового ингибитора, близкого по структуре к разработанным в данном исследовании), представлена на рис. 10А. Эта схема опирается на данные рентгено-структурного анализа комплекса, зарегистрированного в Банке Данных Белков (PDB, код 1T4U) (Lu Т. 2004). Большинство эффективных ингибиторов тромбина имеет положительно заряженный или нейтральный, но легко поляризуемый PI фрагмент молекулы. При образовании комплекса тромбина с ингибиторной молекулой, PI фрагмент ингибитора располагается в активном центре тромбина внутри узкой и глубокой щели (карман S1), на дне которой находится отрицательно заряженная группа остатка аспарагиновой кислоты (Asp 189) (рис. 10А). Два других кармана (S2 и S3) имеют

гидрофобную поверхность. Строгие пространственные ограничения диктуют небольшой размер и гидрофобную природу Р2 фрагмента ингибитора. Ограничения, накладываемые на фрагмент РЗ, не настолько строги, т.к. соответствующий центр связывания в молекуле тромбина достаточно широк и открыт в сторону окружающего растворителя.

Карман

Карман S3

jcc

Карман SI

чссх^—

■ f-.........- <1

1 4-Аминопиридиниевый (4-АП)

2 Изотиурониевый (ИТ)

+ .NH.

-3=С '

NH,

3. 2-Аминстиазолиниевый (2-АТ)

+ ГЛ

Рис. 10. Структура новых ингибиторов тромбина. (А) Расположение одного из известных типичных ингибиторов в активном центре тромбина. Указаны карманы активного центра (Sn) и соответствующие им фрагменты молекулы ингибитора (Рп). (Б) Общая формула предложенных в работе новых ингибиторов тромбина. Снизу указаны обозначения различных фрагментов молекулы ингибитора. Справа приведены структуры новых групп PI.

Основным фрагментом, отвечающим за эффективность связывания лиганда с активным центром тромбина, является PI фрагмент. Чтобы лучше настроить программу докинга для описания этого связывания, на первом этапе работы был проведен компьютерный скрининг более 2000 существующих положительно заряженных лигандов из открытых баз данных химических соединений Института органической химии РАН (ИОХ РАН) и Национального института рака США (NCI, USA). Для этих соединений существовала возможность экспериментальной проверки реальных тромбин-ингибирующих свойств. В результате было отобрано 114 наиболее перспективных соединений. При отборе кандидатов были использованы следующие критерии: 1) достаточно отрицательная величина скоринг-функции (рассчитанная энергия связывания < -5.5 ккал/моль); 2) разумное расположение лиганда в активном центре тромбина, которое проверяли визуально.

По специальному запросу эти соединения были любезно предоставлены нам ИОХ РАН и NCI для последующей экспериментальной проверки. Среди 114 исследованных экспериментально соединений 15 оказались реальными ингибиторами тромбина. Они эффективно снижали скорость гидролиза тромбин-специфичного хромогенного субстрата. Пять из этих соединений имели достаточно высокую антитромбиновую активность, чтобы быть интересными для последующей разработки новых ингибиторов. Четыре отобранных соединения имели в качестве Р1 фрагмента изотиурониевую группу (рис. 10), которая ранее не была описана в качестве Р1 фрагмента известных ингибиторов тромбина.

Второй этап работы включал теоретическое конструирование новых химических структур с предполагаемым антитромбиновым действием. Принимая во внимание данные литературы, а также результаты, полученные при компьютерном скрининге и экспериментальной проверке отобранных в ИОХ РАН и NCI соединений, мы попытались сконструировать виртуальные библиотеки новых химических структур, которые, согласно теоретическим предсказаниям, должны были бы быть эффективными ингибиторами тромбина. Библиотеки виртуальных лигандов также были сначала протестированы с помощью программы докинга SOL. На этом этапе был проведен скрининг около 6000 структур. В результате было решено принять за основу новых ингибиторов ранее известные ингибиторы тромбина, содержащие в качестве Р2 фрагмента остаток орцина. В качестве фрагмента РЗ также был выбран известный ранее в ингибиторах тромбина остаток бензосульфоновой кислоты. Общая формула новых ингибиторов представлена на рис. 10.

Ингибиторы, содержащие такие Р2 и РЗ группы, уже были ранее известны. Они были выбраны для последующей модификации, т.к. просты, обладают относительно высокой эффективностью (имеют К, в области порядка десятка нМ) и высокоселективны (lllig С et al. 1998; Lu Т et al. 1998; Soil RM. 2000; Tomczuk В et al. 2003). Для повышения эффективности новых ингибиторов мы варьировали основной Р1 фрагмент молекулы, а также попытались выбрать оптимальную длину линкера, связывающего Р1 и Р2 фрагменты ингибитора.

Расчеты показали, что наибольшего увеличения тромбин-ингибирующей активности можно ожидать при введении в позицию Р1 молекулы остатков 4-аминопиридиния (4-АП), изотиурония (ИТ) или его «обращенного» и более напряженного структурного аналога - 2-аминотиазолиния (2-АТ) (рис. 10). Для всех соединений, содержащих эти фрагменты, были получены достаточно большие отрицательные величины энергии связывания (AGCB(nb,B). Теоретические расчеты показали также, что увеличение длины линкера между Р1 и Р2 фрагментами в молекулах ИТ и 4-АП производных приводит к менее отрицательным скоринг-функциям (таблица 3). Таким образом, величина ингибирующей способности соединения должна увеличиваться при уменьшении длины этого линкера. И, наконец, введение различных R1 и R2 заместителей в ароматическое кольцо РЗ фрагмента (рис.

10) изменяло скоринг-функцию, иногда даже значительно, однако мы не смогли выявить никакой регулярности этих изменений.

Реальные тромбин-ингибирующая и антикоагулянтная активности всех вновь синтезированных соединений были проверены экспериментально. Все вновь синтезированные соединения (более 45) оказались хорошими ингибиторами тромбина. Структуры наиболее эффективных из них приведены в таблице 4. Мониторинг проходил в несколько стадий.

Таблица 3 Величины скоринг-функций для серии 4-аминопиридиниевых производных (4-АП) с постоянными Р1, Р2 и РЗ фрагментами, но различной длиной линкера (п) между Р1 и Р2 частями молекулы

о, „о

/(СН2)П + U N

Длина линкера (п) 1 2 3 4 5

Скоринг-функция, ккал/моль -7.50 -6.57 -6.48 -6.27 -5.45

Сначала все новые соединения были протестированы на их прямую антитромбиновую активность в чистом буферном растворе in vitro. Активность тромбина измеряли по скорости гидролиза специфичного хромогенного субстрата (рис. IIA). Об эффективности ингибирования судили по степени замедления этой скорости в присутствии различных концентраций испытуемого лиганда. Все новые соединения эффективно и дозо-зависимо ингибировали тромбин. В результате экспериментов были определены концентрации каждого из соединений, снижающие активность фермента на 50% (1С50). Чтобы рассчитать из этих данных константы ингибирования (К^ необходимо знать механизм ингибирования. Для его установления были измерены серии скоростей гидролиза под действием постоянной концентрации тромбина, но при различных концентрациях субстрата и в присутствии различных концентраций ингибитора. Полученные результаты были построены в координатах Лайнуивера-Берка. т.е. в виде зависимостей обратной скорости гидролиза (1 /V) от обратной концентрации субстрата (1/S) для каждой концентрации ингибитора. В случае конкурентного механизма ингибирования эти зависимости должны представлять собой пучок прямых, пересекающихся на оси ординат (Березин И.В., Клесов A.A. 1976). Полученные результаты подтвердили конкурентный механизм ингибирования новых соединений (см. пример на рис. 12). Это позволило рассчитать константы ингибирования тромбина (Kj) для каждого из вновь

синтезированных соединений, используя формулу: К[= ГСзо/О+Б/Км), где: К] -константа ингибирования, Б - концентрация субстрата в ячейке (100 мкМ), а Км -константа Михаэлиса данного субстрата по отношению к тромбину (9.44 мкМ).

Концентрация НС-МОа-ЮС:

1 - В

2-^— НМКМ

3 I мкМ

4- .ШкМ

5 13.8 мкМ в-34.5 МКМ

10 " 20 30 40 50

Время, мин.

-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Время, мин.

Рис. 11. Свойства новых ингибиторов тромбина. Примеры антитромбиновой и антикоагулянтиой активности новых ингибиторов, а также сохранения их ингибиторной активности при длительном хранении в водных растворах. (А) Ингибитор НС-0468-ЮС дозо-зависимо снижает скорость гидролиза специфичного хромогенного субстрата тромбином. Концентрации ингибитора составляют: (1) - 0, (2) - 1.25 нМ, (3) - 2.5 нМ, (4) - 5 нМ, (5) -12.5 нМ и (6) - 25 нМ. Снижение эндогенного тромбинового потенциала (Б) и скорости роста сгустка в пространстве (В) при различных концентрациях ингибиторов НС-020з-ЮС и НС-оГЭв-ЮС в плазме, соответственно. Для сравнения на панели (В) приведены также соответствующие данные для клинически применяемого ингибитора аргатробана (красная кривая). (Г) Сохранение ингибирующей способности НС-19з-ЮС после автоклавирования (120°С, 15 мин) и длительного хранения ингибитора в физиологическом растворе в концентрации 1 мкМ при температуре +20°С (черная кривая) или +4°С (красная кривая).

Экспериментальное исследование синтезированных соединений показало, что все они, действительно, являются эффективными ингибиторами тромбина в чистой системе. Самые эффективные из новых ингибиторов имели К, < 1 нМ (таблица 4), что гораздо лучше, чем у применяемого в клинике для внутривенного введения аргатробана, у которого Кг по отношению к тромбину человека составляет 39 нМ, а

также лучше, чем у известных ингибиторов-прототипов, для которых величины К! составляют не менее десятка нМ.

Рис. 12. Определение типа ингибирования для соединения HC-019s-IOC. Измерены скорости реакции гидролиза при различных концентрациях хромогенного субстрата (Хромозим ТН) под действием 0.2 нМ тромбина в присутствии различных концентраций соединения HC-019S-IOC. Результаты представлены в виде прямых Лайнуивера-Берка (1/V -1/S). Концентрации ингибитора дня разных прямых составляли: (1) - 0; (2) - 5 нМ; (3) - 10 нМ и (4)- 15 нМ.

Эксперименты доказали также теоретическое предположение об усилении ингибирующей активности новых соединений при уменьшении длины линкера, связывающего Р1 и Р2 фрагменты молекулы.

Высокая прямая антитромбиновая активность новых соединений еще не достаточна для того, чтобы сделать эти соединения эффективными антикоагулянтами в плазме крови. Это связано с тем, что антикоагулянтная активность любого ингибитора тромбина в плазме зависит не только от его Кь но также от возможных взаимодействий с другими компонентами системы свертывания и/или от связывания с белками плазмы, в первую очередь, альбумином. Поэтому на следующей ступени экспериментального тестирования было проверено, как новые соединения, которые прекрасно ингибировали тромбин в буферной системе, влияют на эффективность работы системы свертывания в плазме in vitro. Для этого в работе были использованы тест генерации тромбина и тест тромбодинамики (измерение скорости роста сгустка в пространстве), проводимые in vitro.

Все вновь синтезированные соединения достоверно, снижали эндогенный тромбиновый потенциал и VcrycTKa. Величина эффекта возрастала с увеличением концентрации ингибитора, и при определенных концентрациях генерация тромбина и рост сгустка полностью подавлялись. Соответствующие примеры экспериментальных данных, полученных для некоторых из новых ингибиторов тромбина (соединений HC-020s-IC>C и HC-019s-IC>C), представлены на рис. 11Б и В.

При увеличении концентрации ингибитора в плазме уменьшается не только площадь под кривой генерации тромбина, но и максимальная концентрация тромбина, достигаемая в пробе, а время достижения этой концентрации сильно увеличивается (рис. 11Б). Для высоких концентраций ингибиторов вообще не удавалось наблюдать выраженного пика тромбина в пробе за все время эксперимента. На основании экспериментальных данных были определены концентрации ингибиторов, снижающие ЭТП на 50%, (1С50 для снижения ЭТП). Лучшие из разработанных новых ингибиторов имели величины 1С50 для снижения ЭТП 0.1-0.25 мкМ, что ниже, чем соответствующая величина для аргатробана, которая по данным литературы составляет 0.6-0.97 мкМ (Lau A et al. 2007; Nagashima Н. 2002).

Для лучших из новых ингибиторов тромбина (тех, которые снижают ЭТП в плазме при концентрациях. ниже 1 мкМ) величины концентраций, снижающих стационарную VcrycTla на 50% (1С50 сгустка) варьировали от 9.0 мкМ (для HC-037s-IOC) до 102 мкМ (для HC-020s-IOC) (см. таблицу 4).

На основании анализа антитромбиновой и антикоагулянтной активности всех новых соединений для дальнейшего более подробного анализа было отобрано несколько наиболее эффективных ингибиторов, которые имели 1С5оотп) менее 1.25 мкМ. Все они представлены в таблице 4. Для сравнения в той же таблице приведены данные для применяемого в клинике ингибитора аргатробана.

Для нескольких наиболее эффективных новых ингибиторов были также определены константы ингибирования по отношению к фактору Ха (таблица 4). Было показано, что новые вещества гораздо эффективнее ингибирукгг тромбин, т.е. обладают хорошей селективностью по отношению к тромбину по сравнению с родственной ему сериновой протеазой - фактором Ха.

Одним из важнейших показателей любого лекарства является его безопасность. Поэтому до начала работ in vivo в модели на животных, было проведено предварительное исследование острой токсичности лучших из вновь синтезированных ингибиторов на мышах. Полученные результаты также представлены в таблице 4. Как видно из таблицы острая токсичность при внутрибрюшинном введении мышам (LDS0 2 часа) для ряда новых ингибиторов оказалась ниже, чем соответствующая токсичность аргатробана (Mano Т, Shiomura J. 1992). Для ряда соединений испытанные дозы ингибитора не превышали 1000-кратных по отношению к той, что была необходима, чтобы снизить ЭТП in vitro на 50%. Это было связано с невозможностью введения более высоких доз препарата из-за недостаточной растворимости данных соединений в водных растворах.

Необходимо упомянуть, что в настоящий момент для одного из разработанных ингибиторов тромбина (HC-019s-IOC) уже проведено полное доклиническое токсикологическое изучение специально сертифицированной Лабораторией лекарственной токсикологии НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального

агентства по высокотехнологической медицинской помощи» (руководитель лаборатории Е.В. Арзамасцев). Это исследование не являлось предметом настоящей работы, поэтому не будет описано здесь подробно. Приведем только его основной вывод, который очень важен для характеристики новых ингибиторов.

Исследования показали, что препарат не повреждает основные органы и ткани, в том числе печень, почки, легкие и т.д.), не изменяет биохимические и гематологические показатели крови, не обладает эмбрио- и тератотоксическими свойствами. При этом было установлено, что новый ингибитор не обладает мутагенными свойствами в тестах «доминантные летали» и «хромосомные аберрации», однако в высоких концентрациях (в 10000-100000 раз превышающих рекомендуемые терапевтические) вызывает сдвиг рамки считывания в тесте Эймса. Препарат не влияет на репродуктивную функцию и не обладает иммунотоксическими свойствами. В результате проведенного исследования препарат ингибитора HC-019s-ЮС был признан безопасным и рекомендован для последующих клинических испытаний.

Так как мы предполагаем возможность использования новых ингибиторов тромбина в качестве добавки к плазмозамещающим растворам, одним из важнейших свойств новых ингибиторов должна быть достаточная стабильность в водных растворах. Для проведения экспериментов по изучению этой стабильности были отобраны 6 соединений: HC-019s-IOC, HC-025s-IOC, HC-036s-IC)C, HC-037s-IOC, HC-039s-IC>C и HC-046s-IOC. Растворы этих ингибиторов в физиологическом растворе (конечные концентрации 1 мкМ) были разделены на аликвоты и подвергнуты сначала стерилизации с помощью автоклавирования. Все ингибиторы в ходе этой процедуры оставались стабильны. При последующем хранении ингибиторных растворов при комнатной температуре или при температуре холодильника (4°С) ингибирующая активность продолжала сохраняться для всех ингибиторов в течение, по крайней мере, 2.5 лет. На рис. 11Г представлен характерный пример сохранения ингибирующей активности в ходе длительного хранения одного из ингибиторов.

Таким образом, анализ результатов, полученных в данной работе, показал, что умеренное (до 2-3 раз, т.е. на 50-66.7%) разбавление плазмы in vitro различными плазмозамещающими растворами приводит к гиперкоагуляционным изменениям в системе свертывания крови. Они не могут быть четко зафиксированы с помощью измерения стандартных времен свертывания, однако обнаруживаются при анализе коагуляции с помощью современных интегральных методов оценки гемостаза: теста генерации тромбина, теста тромбодинамики, а также при исследовании свертывания с помощью тромбоэластографии. Все эти тесты высокочувствительны как к гипо, так и к гиперкоагуляционным изменениям гемостаза.

Впервые проведенное в данной работе прямое измерение влияния различных ПЗР на скорость полимеризации фибрина показало, что вопреки распространенному в

мире мнению, коллоидные ПЗР не только не замедляют, но, наоборот, ускоряют индуцированную тромбином полимеризацию в чистых растворах фибриногена. Ситуация оказывается более сложной, когда полимеризация осуществляется в плазме при активации коагуляции тканевым фактором. Однако и здесь явно видно ускорение начала полимеризации при разбавлении плазмы различными ПЗР, в первую очередь, коллоидными. Таким образом, все проведенные эксперименты указывают на то, что разбавление плазмы до 2-3 раз растворами разного типа усиливает прокоагулянтный ответ системы.

Существование реальных гиперкоагуляционных сдвигов в условиях гемодилюции было подтверждено также in vivo. Они были продемонстрированы как в специально разработанной модели гемодилюции на животных (крысы), так и при исследовании гемостаза у здоровых добровольцев (с кровопотерей или без), которым переливали различные ПЗР.

Итак, гемодилюция влияет на гемостаз многими путями. В плазме снижаются концентрации предшественников прокоагулянтных факторов (это приводит к пролонгации ПВ и АЧТВ), а также ингибиторов свертывания (что при умеренных степенях гемодилюции приводит к усилению генерации тромбина). Уменьшается также концентрация фибриногена (что может снижать скорость полимеризации фибрина). Кроме того, некоторые коллоиды могут прямо влиять на качество образующегося сгустка. Суммарный эффект, который наблюдает исследователь, зависит от многих параметров: степени разбавления; типа ПЗР; метода, которым оценивают статус свертывания; времени после гемодилюции, когда измеряют состояние гемостаза и т.д. Иногда при постановке экспериментов in vitro не поддерживается постоянный уровень рН или ионов Са+2, что приводит, в конечном счете, к различным условиям, при которых идет свертывание после рекальцификации при различных степенях разбавления плазмы. Именно это и объясняет те противоречия, которые существуют в современной научной литературе в вопросе о влиянии гемодилюции на гемостаз.

Необходимо понять, какие факторы оказываются решающими в ходе образования сгустков, а также то, как различные коллоиды изменяют их качество, что в конечном итоге может оказаться наиболее важным при клиническом применении данных ПЗР. Все эти вопросы, безусловно, требуют дальнейшего изучения.

Мы полагаем, что ответственным за пшеркоагуляционные сдвиги при умеренных степенях разбавления плазмы может быть снижение концентраций природных ингибиторов свертывания. Подтверждением этому может служить то, что добавление в ПЗР ингибиторов тромбина (ATIII или низкомолекулярных

синтетических ингибиторов) снижает вызываемую гемодилюцией гиперкоагуляцию. Величина эффекта увеличивается при повышении концентрации ингибитора. Основываясь на полученных результатах, было предложено создать плазмозамещающие растворы нового типа, которые содержали бы дополнительно ингибитор тромбина. Такие растворы не должны вызывать сильного изменения коагуляции даже в условиях массивного переливания.

В работе был разработан ряд новых низкомолекулярных ингибиторов тромбина для внутривенного введения. Проведенное исследование показало, что компьютерный дизайн ингибиторов тромбина на основе правильно настроенной программы докинга, усиленный последующим многоступенчатым экспериментальным скринингом, является мощным инструментом для поиска нового ингибиторного мотива (базовой ингибиторной структуры) с целью создания соединений с повышенной эффективностью ингибирования.

В результате было разработано более 40 новых эффективных, стабильных и безопасных ингибиторов тромбина. Эти соединения не только снижали активность тромбина в буферной системе, но и проявляли антикоагулянтную активность в плазме в различных тестах in vitro. Типичный представитель новых соединений -ингибитор HC-019s-IOC, добавленный в плазмозамещающий кристаллоидный раствор, предупреждал также возникновение гиперкоагуляционного состояния в модели гемодилюционной гиперкоагуляции на крысах in vivo. Многие из новых ингибиторов оказались более эффективными ингибиторами тромбина, чем применяемый в настоящее время в клинике для внутривенного введения ингибитор аргатробан. Кроме того, новые ингибиторы прекрасно сохраняют активность при длительном хранении в водных растворах, что делает их пригодными для использования в составе плазмозамещающих растворов. Все новые ингибиторы тромбина являются перспективными с точки зрения разработки новых антитромботических средств, однако для подтверждения возможности их клинического применения необходимы дальнейшие детальные исследования.

Таблица 4. Константы ингибирования тромбина и фактора Ха, ингибиторная активность по отношению к генерации тромбина и скорости роста сгустка в плазме, а также острая токсичность лучших новых ингибиторов тромбина и аргатробана.

Структура (внутренний К] для ингибирования активности(в буферной системе), нМ 1С50 для снижения в плазме, мкМ 2 часа (мыши), интрапери-тонеальное введение, мг/кг

идентификационный код) Для Иаи) Для Ха3'4» ЭТП V * сгустка (стационарная)

(НС-037в-ЮС) 0.3 37500 0.1 9.0 523.1 ±92.3

О. „о Л (НСЧШв-ЮС) 0.78 44400 0.15 43.1 372.7 ±84.6

Л V. (НС-0465-ЮС) 0.33 30000 0.16 52.8 793.5 ± 118.5

(НС-ОЗбв-ЮС) 0.75 14250 0.16 21.4 166.7 ±20.0

(НС-0195-ЮС) 0.78 92500 0.25 10.4 418.9 ±33.0

(НС-025$-ЮС) 0.21 - 0.26 18.9 679.0 ± 152.7

П ^Аа н'^сн, (НС-ОЗЗэ-ЮС) 5.7 - 0.53 - > 287.05'

-я 1М ^Чо2сн, н'% (НС-0408-ЮС) 1.5 - 0.80 14.6 > 45 8.05'

[¡1 V. (нс-огов-юс) 0.95 - 0.90 102.0 >1111.1

о ° Л) (НС-0315-ЮС) 2.03 - 1.24 - > 653.15>

Т Т ^мн —М\-СН—[Сн2), Т \ » н.о й -ч сн, Аргатробан6' 39 210000 0.65 8.1 475

Измерено с помощью хромогенного субстрата То5у1-01у-Рго-А^-пара-нитроанилид. 2) Величины ^ рассчитаны, учитывая конкурентный механизм ингибирования. Величина Км данного субстрата по отношению к тромбину была принята равной 9.44 мкМ.

Измерено с помощью хромогенного субстрата 527б5-4) Величины К1 рассчитаны в предположении о конкурентном механизме ингибирования. Величина Км для субстрата 32765 по отношению к фактору Ха составляет, согласно данным производителя, 300 мкМ. 5> Вещество являлось нетоксичным в дозе 1000-кратно превышающей дозу, необходимую для достижения ГС50 для снижения ЭТП (при пересчете на целую мышь весом 26-28 г).

6> Все приведенные для аргатробана константы (кроме 1С50 для снижения Уср,ст„) взяты из литературы, однако хорошо соответствуют аналогичным константам, измеренным нами для аргатробана в экспериментах.

Выводы

1. Разбавление плазмы до 50-60% любым плазмозамещающим раствором in vitro вызывает сдвиг в системе свертывания крови в сторону гиперкоагуляции, который может быть зафиксирован такими интегральными методами анализа гемостаза, как тест генерации тромбина и измерение скорости роста сгустка в пространстве. Причиной такого сдвига является преимущественная чувствительность системы при данных степенях разбавления к снижению концентрации ингибиторов свертывания.

2. Кристаллоидные плазмозамещающие растворы не влияют на скорость полимеризации фибрина в растворах фибриногена, а коллоидные растворы ускоряют эту полимеризацию. Гемостатическая некомпетентность сгустков, образующихся в присутствии коллоидов, может быть связана со снижением их качества (например, с увеличением пористости сгустков из-за увеличения отношения масса/длина образующихся фибриновых волокон, с увеличением количества связанной со сгустком воды, ускоренным фибринолишческим разрушением таких сгустков и т.п.).

3. Умеренная гемодшпоция различными плазмозамещшощими растворами in vivo является риск-фактором возникновения гиперкоагуляционного состояния. Это подтверждается следующими результатами:

При ~ 25% гемодилюции в модели гемодилюции у крыс наблюдается увеличение тромбинового потенциала и ускоренное образование спонтанных сгустков в тесте тромбодинамики;

Переливание плазмозамещающих растворов здоровым добровольцам без кровопотсри (по 12 мл/кг), а также объемное восполнение кровопотери различными плазмозамещаюшими растворами у доноров в ходе эксфузии костного мозга, приводят к ускорению роста сгустка в пространстве, увеличению эндогенного тромбинового потенциала и гиперкоагуляционному сдвигу в параметрах тромбоэластографии.

4. Введение ингибиторов тромбина (антитромбина III или низкомолекулярных прямых синтетических ингибиторов) способно полностью или частично компенсировать вызываемые гемодилюцией гиперкоагуляционные изменения свертывания.

5. Метод теоретического докинга низкомолскулярных лигандов в активный центр фермента и разработанная многоступенчатая система экспериментального скрининга антшеоагулянтных свойств отобранных соединений позволяют сократить время поиска новых высокоэффективных ингибиторов ферментов

системы свертывания. В результате применения такого подхода были разработаны три новых класса низкомолекулярных синтетических прямых ингибиторов тромбина для внутривенного введения, обладающих низкой токсичностью, высокой эффективностью ингибирования и хорошо сохраняющих активность при длительном хранении в водных растворах как при +4°С, так и при комнатной температуре. Лучшие представители этих ингибиторов превосходят по эффективности аргатробан - клинически применяемый низкомолекулярный синтетический ингибитор тромбина для внутривенного введения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Книги

1. М.А. Пантелеев, С.А. Васильев, Е.И. Синауридзе, А.И. Воробьев, Ф.И. Атауллаханов. «Практическая коагулология». Москва, Изд-во «Практическая медицина», 2011, 192 стр.

2. Ya.N. Kotova, Е.А. Kostanova, М.А. Rozenfel'd, ЕЛ. Sinauridze, М.А. Panteleev, F.I. Ataullakhanov. Influence of Protein Proteinase Inhibitors to Platelet and Plasma Components of Blood Coagulation. In: "Human Placenta: Structure and Development, Circulation and Functions". Nova Science Publishers, Inc. NY, 2011, Chapter 6, p. 111.

Статьи в реферируемых научных изданиях

1. Ф.И. Атауллаханов, Р.И. Волкова, А.В. Похилко, Е.И. Синауридзе. Пороговое поведение системы свертывания крови при изменении концентрации кальция. Биофизика, 1994; 39(4): 713-720.

2. F.I. Ataullakhanov, A.V. Pohilko, E.I. Sinauridze, R.I. Volkova. Calcium threshold in human plasma clotting kinetics. Thromb. Res., 1994; 75(4): 383-394.

3. E.I. Sinauridze, R.I. Volkova, Y.V. Krasotkina, V.I. Sarbash, F.I. Ataullakhanov. Dynamics of clot growth induced by thrombin diffusing into nonstirred citrate human plasma. Biochim. Biophys. Acta, 1998; 1425(3): 606-616.

4. Y.V. Krasotkina, E.I. Sinauridze, F.I. Ataullakhanov. Spatiotemporal dynamics of fibrin formation and spreading of active thrombin entering non-recalcified plasma by diffusion. Biochim. Biophys. Acta, 2000; 1474(3): 337-345.

5. F.I. Ataullakhanov, Y.V. Krasotkina, V.I. Sarbash, R.I. Volkova, E.I. Sinauridze, A.Yu. Kondratovich. Spatio-temporal dynamics of blood coagulation and pattern formation. An experimental study. International J. of Bifurcation and Chaos, 2002; 12 (9): 19691983.

6. Е.И.. Синауридзе, Р.И. Волкова, Ю.В. Красоткина, .М.В. Ованесов, , Ф.И. Атауллаханов. Системы без перемешивания: новая модель для изучения пространственной динамики роста1 фибринового сгустка. Тромбоз, гемостаз и реология, 2003; 2: 12-18.

7. Ф.И. Атауллаханов, А.И. Воробьев, А.А. Бутылин, Е.И. Синауридзе, М.В. Ованесов. Почему дефициты факторов внутреннего пути свертывания приводят к гемофилии. Проблемы гематологии и переливания крови, 2003; 1: 7-13.

8. Ф.И. Атауллаханов, А.И. Воробьев, А.А. Бутылин, Е.И. Синаурвдзе, М.В. Ованесов. Парадокс гемофилии н рост сгустка в пространстве. Новое в трансфузиологии. 2003; вып.35: 5-14.

9. А.Ю. Буланов, Е.И. Синаурвдзе, С.А. Васильев. Гемостазиологические аспекты предоперационной гемодилюции. Вестник Российского университета Дружбы народов, серия медицина, 2005; №3(31): 98-101.

10. М.А. Panteleev, M.V. Ovanesov, D.A. Kireev, A.M. Shibeko, E.I. Sinauridze, N.M. Ananyeva, A.A. Butylin, E.L. Saenko, F.I. Ataullakhanov. Spatial propagation and localization of blood coagulation are regulated by intrinsic and protein С pathways, respectively. Biophys. J., 2006; 90(5): 1489-1500.

11. Е.И. Синауридзе, E.M. Шулутко, O.B. Щербакова, Д.А. Киреев, С.А. Васатьев. Методы анализа состояния гемостаза при введении пациентам препарата рекомбинантного фактора Vila "НовоСэвен". Новое в трансфузиологии, 2006; вып.42: 17-34.

12. А.Ю. Буланов, Е.М. Шулутко, Е.И. Синауридзе, С.А. Васильев, А.С. Горбатенко. ГемодилюциЯ и гемодилюционная коагулоиатия. Тер. архив (вопросы гематологии), 2006; 78(7): 90-94.

13. E.I. Sinauridze, D.A. Kireev, N.Y. Popenko, A.V. Pichugin, M.A. Panteleev, O.V. Krymskaya, F,I. Ataullakhanov. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fol'd higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb. Haemost., 2007; 97(3): 425-434.

14. Е.И. Синауридзе, А.С. Горбатенко, И.В. Грибкова, В.Б. Сулимов, А.Н. Романов, О.А. Кондакова, М.А. Ажигирова, Т.Н. Дереза, Ю.В. Кузнецов, А.А. Боголюбов, Ф.И. Атауллаханов. Гиперкоагуляция, вызываемая разбавлением плазмы искусственными плазмозамещакнцими растворами. Технологии живых систем, 2008; 5(1): 3-14.

15. M.V. Ovanesov, М.А. Panteleev, E.I. Sinauridze, D.A. Kireev, O.P. Plyushch, K.G. Kopylov, E.G. Lopatina, E.L. Saenko, F.I. Ataullakhanov. Mechanisms of action of recombinant activated factor VII in the context of tissue factor concentration and distribution. BloodCoagul. Fibrinolysis, 2008; 19(8): 743-755.

16. М.А. Пантелеев, Е.И. Синауридзе, Ф.И. Атауллаханов. Свертывание крови: современные проблемы (часть 3), Клиническая онкогематология, 2008; 1(3): 259265.

17. Ф.И. Атауллаханов, А.А. Бутылин. В.М. Витвицкий, И.Л. Лисовская, М.В. Мартынов, Б.Е. Мовшев, М.И. Молодцов, М.А. Пантелеев, В.И. Сарбаш, Е.И. Синауридзе, Е.С. Шурхина. Физическая биохимия крови: от описания к пониманию. Гематология и трансфузиология, 2008; № 5: 42-49.

18. Е.И. Синауридзе, А.Ю. Буланов, О.В. Щербакова, А.С. Горбатенко, Ф.И. Атауллаханов. Усиление коагуляции, вызываемое переливанием искусственных плазмозамещающих растворов. Тер. архив, 2009; 81(1): 52-56.

19. Е.И. Синауридзе, С.С. Суров, И.В. Грибкова, А.С. Горбатенко, М.Ю. Монаков, Ф.И. Атауллаханов. Функциональные испытания нового синтетического ингибитора тромбина HC-G19S-IOC in vitro В in vivo в составе плазмозамещающего раствора на модели гемодилюции у крыс. Технологии живых систем, 2009; 6(8): 67-77.

20. A.V. Nikolaev, E.I. Sinauridze, V.N. Buravtsev. Experimental research on fibrin clot permeability with albumin present. Moscow University Physics Bulletin, 2009; 64(3): 324-328.

21. Ya.N. Kotova, E.A. Kostanova, M.A. Rosenfel'd, E.I. Sinauridze, M.A. Panteleev, F.I. Ataullakhanov. Influence of cisteine proteinase inhibitors on platelet and plasma components of blood coagulation system. Biochemistry (Moscow), Suppl. Series A: Membrane and Cell Biology, 2009; 4(3):498-503.

22. E.I. Sinauridze, A.N. Romanov, I.V. Gribkova, О.Л. Kondakova. S.S. Surov. A.S. Gorbatenko, A.A. Butylin, M.Yu. Monakov, A.A. Bogolyubov, Yu.V. Kuznetsov, V.B. Sulimov, F.I. Ataullakhanov. New synthetic thrombin inhibitors: molecular design and experimental verification. PLoS ONE. 2011; 6(5): el9969

(doi: 10.137 l/journal.pone.OO 19969).

23. Е.И. Синауридзе, A.H. Романов, O.A. Кондакова, И.В. Грибкова, C.C. Суров, A.C. Горбатенко, Ю.В. Кузнецов, A.A. Боголюбов, В.Б. Сулимов, Ф.И. Атауллаханов. Новые прямые низкомолекулярные синтетические ингибиторы тромбина. Технологии живых систем, 2011; 8(3): 34-47.

24. E.I. Sinauridze, M.A. Panteleev, F.I. Ataullakhanov. Anticoagulant therapy: basic principles, classic approaches and recent developments. Blood Coagul. Fibrinolysis, 2012; 23(6): 482-493.

25. Е.И. Синауридзе, M.A. Пантелеев, A.A. Бутылин, K.C. Мельник, А.Г. Румянцев, Ф.И. Атауллаханов. Новые подходы к антикоагулянтной терапии. Современные медицинские технологии, 2012; №9: 16-19.

Патенты

1. Е.И. Синауридзе, А.С. Горбатенко, М.А. Ажигирова, Т.Л. Дереза, Ф.И. Атауллаханов. Способ коррекции первичных нарушений гемостаза плазмозамещающими растворами нового состава. Патент РФ № 2300385 (заявка №2005140841 от27.12.2005). Дата публикации: 10.06.2007.

2. Е.И. Синауридзе, Ф.И. Атауллаханов, А.А. Бутылин, В.Б. Сулимов, А.Н. Романов, А.А. Боголюбов, Ю.В. Кузнецов, И.В. Грибкова, А.С. Горбатенко, О.А. Кондакова. Новые соединения, обладающие функцией ингибиторов тромбина, и фармацевтические композиции на их основе. Патент РФ № 2354647, (заявка № 2007124201 от 28.06.2007), патентообладатель ООО «Бионика», Москва, Россия. Дата публикации: 10.05.2009.

3. Е.И. Синауридзе, Ф.И. Атауллаханов, А.А. Бутылин, В.Б. Сулимов, А.Н. Романов, А.А. Боголюбов, Ю.В. Кузнецов, И.В. Грибкова, А.С. Горбатенко, О.А. Кондакова. Новые соединения, обладающие функцией антикоагулянтов, фармацевтические композиции на их основе для лечения тромботических состояний и плазмозамещающий раствор для коррекции гиперкоагуляционных нарушений при гемодилюции. Патент РФ № 2353619, (заявка № 2007124202 от 28.06.2007), патентообладатель ООО «Бионика», Москва, Россия. Дата публикации: 27.04.2009.

4. E.I. Sinauridze, F.I. Ataullakhanov, А.А. Butylin, V.B. Sulimov, A.N. Romanov, A.A. Bogolyubov, Yu.V. Kuznetsov, I.V. Gribkova, A.S. Gorbatenko, O.A. Kondakova. New antithrombin function compounds and pharmaceutical compositions based oh them. International Patent Application PCT/RU2008/000400 (priority of June 28, 2007). Data of publication: 31.12.2008. Applicant: Bionika, Moscow, Russia.

5. E.I. Sinauridze, F.I. Ataullakhanov, A.A. Butylin, V.B. Sulimov, A.N. Romanov, A.A. Bogolyubov, Yu.V. Kuznetsov, I.V. Gribkova, A.S. Gorbatenko, O.A. Kondakova. New anticoagulant compounds, pharmaceutical compositions on their basis to tread thrombotic conditions, and plasma-substituting solution to correct hypercoagulation

defects of hemodilution. International Patent Application PCT/RU2008/000401 (priority of June 28, 2007). Data of publication: 31.12.2008. Applicant: Bionika, Moscow, Russia.

6. Е.И. Синауридзе, Ф.И. Атауллаханов, A.A. Бутылин, В.Б. Сулимов, А.Н. Романов, А .А. Боголюбов, Ю.В. Кузнецов, И.В. Грибкова, А.С. Горбатенко, О.А. Кондакова. Сполуки з функщею шпбування тромбшу та фармацевтичш композицп на ix ocHoei [Вещества с функцией ингибиторов тромбина и фармацевтические композиции на их основе]. Патент Украины № 98970 (заявка № а 2010 00792/М (PCT/RU2008/000400 от 27.06.2008)). Патентообладатель ООО «Бионика», Москва, Россия. Дата публикации 10.03.2010.

7. Е.И. Синауридзе, Ф.И. Атауллаханов, А.А. Бутылин, В.Б. Сулимов, А.Н. Романов, А.А. Боголюбов, Ю.В. Кузнецов, И.В. Грибкова, А.С. Горбатенко, О.А. Кондакова. Антикоагулянтш сполуки, фармацевтична композищя на ix 0CH0Bi для лжування тромботичних стан i в i п л аз м оз ам i щу юч и й розчин для корекци пперкоагулящйних порушень при гемодилюци [Антикоагулянтные соединения, фармацевтические композиции на их основе для лечения тромботических состояний и плазмозамещающий раствор для коррекции гиперкоагуляционных нарушений при гемодилюции]. Патент Украины № 98969 (заявка № а 2010 00790/М (PCT/RU2008/000401 от 27.06.2008)). Патентообладатель ООО «Бионика», Москва, Россия. Дата публикации 10.03.2010.

Публикации в трудах конференций и съездов

1. Е.И. Синауридзе, Р.И. Волкова, В.И. Сарбаш, Ю.В. Красоткина, С.А. Пестова, Ф.И. Атауллаханов. Исследование механизмов остановки роста тромба. Сб. «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» Тезисы докладов III Всероссийского Съезда гематологов и трансфузиологов, Санкт-Петербург, 26-28 ноября 1996, стр.55.

2. E.I. Sinauridze, Y.V. Krasotkina, V.V. Savkin, R.I. Volkova, F.I. Ataullakhanov. Thrombin diffusion into nonstirred blood plasma lacking calcium iones: a new experimental model to study the spatial dynamics of clot formation. Thromb. Haemost., Supplement, August 1999, abstract 284, pp.93-94. Abstracts, XVIIth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Washington, DC, USA, August 14-21,1999.

3. Е.И. Синауридзе, Р.И. Волкова. Тромбин-индуцированный рост фибриновых сгустков в системах без перемешивания. Тезисы докладов II съезда биофизиков России, Москва, 23-27 августа 1999г., т.2, стр. 450-451.

4. Е.И. Синауридзе, Ю.В. Красоткина, В.В. Савкин, Р.И. Волкова, Ф.И. Атауллаханов. Рост тромба при диффузии тромбина в неперемешиваемую цитратную плазму. Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы (экспериментальные и клинические аспекты). Тезисы докладов II Российского конгресса по патофизиологии (с международным участием), Москва, 9-12 октября, 2000г., стр. 99.

5. M.V. Ovanesov, E.I. Sinauridze, М.А. Panteleev, О.Р. Plushch, K.G. Kopylov, E.G. Lopatina, F.I. Ataullakhanov. Comparative study of the effect of recombinant factor Vila on clot growth and thrombin generation in normal and hemophilia A plasma in vitro. J. Thromb. Haemost., 2003, 1 (Suppl. 1), abstract PI 109. Abstracts of XIX International Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Birmingham, UK, 12-18 July 2003.

6. А.Ю. Буланов, Е.М. Шулутко, Е.И. Синауридзе. Инфузионная терапия и гемостаз: современные аспекты проблемы. Тезисы докладов IX съезда Федерации анестезиологов и реаниматологов, 27-29 сентября 2004г., Иркутск, стр.48.

7. Е.И. Синауридзе. Влияние разбавления плазмы на скорость пространственного роста сгустка. Тезисы докладов III съезда биофизиков России, 24-29 июня 2004г., Воронеж, том I, стр.377-378.

8. М.А. Panteleev, M.V. Ovanesov, E.I. Sinauridze E.L. Saenko, F.I. Ataullakhanov. Spatio-temporal dynamics of blood coagulation. Computational simulation studies. The 48th Annual Meeting of the Biophysical Society, Baltimore, MD, USA, February 14-18, 2004 (the abstract: Biophys. J. 2004, 86(1 Pt 2): 1561-Pos).

9. А.Ю. Буланов, Е.М. Шулутко, C.A. Васильев, Е.И. Синауридзе, Е.Б. Орел. Современные представления о механизмах гемодилюционной коагулопатии. Тезисы докладов И-ой Всероссийской научной конференции "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии", 2-4 февраля 2005 г., Москва, стр. 45.

10. E.I. Sinauridze, A.S. Gorbatenko, A.Yu. Bulanov. Effects of plasma dilution with crystalloid or colloid solutions on blood coagulation. J. Thromb. Haemost., 2005, 3 (Suppl.l), abstract P0080. Abstracts from XXth ISTH Congress, 6-12 August 2005, Sydney, Australia.

11. D.A. Kireev, N.Y. Popenko, E.I. Sinauridze, A.V. Pichugin, F.I. Ataullakhanov. Comparison of activated platelets with platelet-derived microparticles in procoagulant activity. J.Thromb. Haemost., 2005, 3 (Suppl. 1), abstract P0976. Abstracts from XX* ISTH Congress, 6-12 August 2005, Sydney, Australia.

12. Е.М. Шулутко, O.B. Щербакова, Е.И. Синауридзе, C.A. Васильев. Возможности применения рекомбинантного фактора Vila для остановки кровотечений. Материалы семинара «Новые медицинские технологии в акушерстве, гинекологии и неонатологии (методы гемафереза, квантовая гемотерапия, медицинский озон)», клинические лекции, тезисы докладов (ред. проф. Т.А. Федорова), Москва, 2005, стр. 23-25.

13. М.А. Panteleev, M.V. Ovanesov, A.M. Shibeko, A.A. Tokarev, E.I. Sinauridze, F.I. Ataullakhanov. Computer simulation study of blood coagulation control. Proceedings of the Conference "Mathematical models and methods in biology and medicine", Bedlewo, Poland, May 29 - June 3, 2005, p. 12.

14. Е.М. Шулутко, O.B. Щербакова, Е.И. Синауридзе, Д.А. Киреев, C.A. Васильев. Эффективность рекомбинантного фактора Vila при кровотечениях различной этиологии. Тезисы VII сессии Московского научного общества анестезиологов и реаниматологов, Москва, 24 марта 2006 г. (Новости анестезиологии и реаниматологии, №1, 2006, стр.107).

15. В.Б. Сулимов, Ф.И. Атауллаханов, Е.И. Синауридзе, А.Н. Романов, С.В. Лущекина, А.А. Боголюбов, В.В. Семенов. Результаты компьютерного поиска новых ингибиторов тромбина и экспериментальное определение их активности. Тезисы докладов XIII Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 3-7 апреля 2006, стр. 8.

16. Н.В. Цветаева, С.А. Васильев, П.В. Авдонин, О.В. Стахина, И.И. Калинина, Г.А. Суханова, Е.И. Синауридзе, Е.Б. Орел, Е.С. Шурхина, С.В. Колодей, И.Ф. Суханова, М.Д. Фомин, В.В. Рыжко, В.И. Петрова, B.C. Журавлев, Н.Д. Хорошко. Случаи успешной терапии тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТЛ). Материалы третьей Всероссийской научной конференции "Клиническая

гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии" (с международным участием), Москва, 1-3 февраля 2007 г., стр.249-250.

17. Н.В. Цветаева, Г.А. Суханова, О.Ф. Никулина, А.В. Гржимоловский, Е.И. Синауридзе, Е.Б. Орел, Е.С. Шурхина, С.В. Колодей, В.И. Петрова, О.В. Стахина, А.А. Шевелев, О.В. Пырикова, B.C. Журавлев, С.А. Васильев, Н.Д. Хорошко. "Аспленические тромбоцитозы" при аутоиммунных гемолитических анемиях (АИГА). Материалы третьей Всероссийской научной конференции "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии" (с международным участием), Москва, 1-3 февраля 2007 г., стр.251-252.

18. Е.И. Синауридзе, А.С. Горбатенко. Изменение коагуляции при разбавлении плазмы стандартными плазмозамещающими растворами. Материалы третьей Всероссийской научной конференции "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии" (с международным участием), Москва, 1-3 февраля 2007 г., стр.221-222.

19. Е.И. Синауридзе, В.Б. Сулимов, В.В. Семенов, И.В. Грибкова, А.С. Горбатенко, А.А. Боголюбов, А.Н. Романов, О.А. Кондакова, Ф.И. Атауллаханов. Новый ряд ингибиторов тромбина (A new family of thrombin inhibitors). Материалы четвертого международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", Москва, 12-16 марта, 2007 г., стр. 103.

20. Ф.И. Атауллаханов, Е.И. Синауридзе, А.С. Горбатенко, М.А. Пантелеев, И.В. Грибкова. Гиперкоагуляция, вызываемая разбавлением плазмы стандартными плазмозамещающими растворами. Тезисы докладов конференции "Фундаментальные науки - медицине", по программе фундаментальных исследований Президиума РАН, Москва, 3-4 декабря 2007 г., стр. 124-125.

21. V.B. Sulimov, A.N. Romanov, О.А. Kondakova, E.I. Sinauridze, A.A. Butylin, A.S. Gorbatenko, A.A. Bogoliubov, l.Yu. Titov, E.V. Polunin, Yu.V. Kuznetsov, l.V. Taidakov, V.V. Voevodin, S.I. Sobolev, F.I. Ataullakhanov. New Thrombin Inhibitors: Molecular Design and Experimental Discovery. BIT'S 5th Anniversary Congress of International Drug Discovery Science & Technology, Serial II: Advances and Challenges Toward Major Diseases. Theme: Extension on New Hope, November 7-13, 2007, Xi'an & Beijing, China, p. 145.

22. E.I. Sinauridze, A.Y. Bulanov. Hemodilution causes hypercoagulability. J. Thromb. Haemost., 2007, 5 (Suppl.2), abstract PW 463. Abstracts from XXI th ISTH Congress, July 6-12, 2007, Geneva, Switzerland.

23. E.I. Sinauridze, A.S. Gorbatenko, A.Yu. Bulanov, O.V. Shcherbakova, F.I. Ataullakhanov. Plasma dilution by standard plasma expanders produces hypercoagulation. Proceedings of the workshop "Modeling of Blood Diseases", November 5-8, 2007, Lyon, France, p. 20.

24. И.В. Грибкова, Е.И. Синауридзе, В.Б. Сулимов, А.С. Горбатенко, Ю.В. Кузнецов, М.Ю. Монаков, А.А. Боголюбов, А.Н. Романов, О.А. Кондакова, Ф.И. Атауллаханов. Поиск новых ингибиторов тромбина. Сборник тезисов 11-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых учёных "Биология -наука XXI века", Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007, стр. 240-241.

25. С.С. Карамзин, О.А. Фадеева, Е.И. Синауридзе, Ф.И. Атауллаханов. Разработка нового метода диагностики нарушений свертывания крови. Международный форум по нанотехнологиям (Rusnanotech), 3-5 декабря 2008 г. Сборник тезисов докладов научно-технологических секций, т. 2, стр.366-368.

26. И.В. Грибкова, Е.И. Синауридзе, В.Б. Сулимов, A.C. Горбатенко, A.B. Юдина, Ю.В. Кузнецов, М.Ю. Монаков, A.A. Боголюбов, А.Н. Романов, O.A. Кондакова, Ф.И. Атауллаханов. Новые низкомолекулярные синтетические ингибиторы тромбина. Тезисы докладов конференции «Органическая химия для медицины», г. Черноголовка, Московская обл., 7-11 сентября 2008 г., стр.59-60.

27. I. Gribkova, Е. Sinauridze, V. Sulimov, F. Gorbatenko, Y. Kuznetsov, M. Monakov, A. Butylin, F. Ataullakhanov. New low-molecular synthetic Thrombin inhibitors. 53rd Annual Meeting of Society of Thrombosis and Haemostasis Research, Vienna, Austria, 4-7 February 2009, Hemostasiology, 1, 2009, p.A31.

28. E.I. Sinauridze, A.N. Romanov, I.V. Gribkova, O.A. Kondakova, A.S. Gorbatenko, Yu.V. Kuznetsov, A.A. Bogoliubov, M.Yu. Monakov, V.B. Sulimov, F.I. Ataullakhanov. New Thrombin Inhibitors: Strategy of Molecular Design and Experimental Testing. XXII Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. Boston, USA, MA, July 11-16, 2009. J. Thromb. Haemost., 2009, 7 (Suppl. 2), PP-MO-182.

29. G.M. Galstyan, A.V. Krechetova, M.G. Alexanyan, E.I. Sinauridze, V.M. Gorodetsky, S.A. Vasiliev. Thrombin generation in patients (pts) with severe sepsis and septic shock during the treatment with high doses of antithrombin III (AT). XXII Congress of The International Society on Thrombosis and Haemostasis. Boston, USA, MA, July 11-16, 2009. J. Thromb. Haemost., 2009, 7 (Suppl. 2), PP-WE-170.

30. Ф.И. Атауллаханов, Е.И. Синауридзе, C.C. Суров, И.В. Грибкова, A.C. Горбатенко. Функциональные испытания нового синтетического ингибитора тромбина НС-019s-IOC in vitro и in vivo в составе плазмозамещающего раствора на модели гемодилюции у крыс. Тезисы докладов на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине", Москва, «Слово», декабрь 2009 г., стр. 107-108.

31. O.A. Фадеева, С.С. Карамзин, Е.И. Синауридзе, И.В. Смирнов, Ф.И. Атауллаханов. Разработка нового метода диагностики нарушений свертывания крови. Сборник тезисов 5-го Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 16-20 марта, 2009, Москва, стр.130-131.

32. O.A. Фадеева, С.С. Карамзин, Е.И. Синауридзе, И.В. Смирнов, Ф.И. Атауллаханов. Иммобилизация тромбопластина для изучения пространственной динамики тромбообразования. Сборник тезисов 2-го Международного Форума по Нанотехнологиям (Rusnanotech), Москва, 6-8 октября, 2009, стр. 821-823.

33. I.V. Gribkova, S.S. Surov, E.I. Sinauridze, A.A. Butylin, F.I. Ataullakhanov. Supplementing normal saline with synthetic low-molecular-weight thrombin inhibitors for use as a plasma volume expander. 1 Joint Meeting GTH & NVTH (54rd Annual Meeting of Society of Thrombosis and Haemostasis Research and Symposium of the Netherlands Society of Thrombosis and Haemostasis), Nürnberg, Germany, February 24 - 27, 2010, Hämostaseologie, 1, 2010, p.A99.

34. I.V. Gribkova, E.I. Sinauridze, S.S. Surov, A.S. Gorbatenko, F.I. Ataullakhanov. Examination of a new plasma substituting solution (PSS) with thrombin inhibitor in rat models of hemodilution. XXXIII World Congress of the International Society of Hematology, Jerusalem, Israel, October 10-13, 2010, poster 57.

35. S.S. Surov, T.A. Vuimo, I.V. Gribkova, A.S. Gorbatenko, E.I. Sinauridze, F.I. Ataullakhanov. Experimental study of the new synthetic Iow-molecular-weight

thrombin inhibitor HC-019S-IOC. XXXIII World Congress of the International Society of Hematology, Jerusalem, Israel, October 10-13, 2010, poster 96.

36. E.I. Sinauridze, I.V. Gribkova. Effect of artificial plasma substituting solutions on fibrin polymerization in vitro. XXXIII World Congress of the International Society of Hematology, Jerusalem, Israel, October 10-13, 2010, poster 186.

37. И.В. Грибкова, Е.И. Синауридзе, C.B. Варламова, М.М. Петров, Н.Н. Калинин, Е.А. Ватагина, Е.М. Худякова, М.И. Лазаренко, Ф.И. Атауллаханов. Исследование тромбинового потенциала у доноров аппаратного тромбоцитафереза. Тезисы докладов конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины», г. Киров, 6-7 октября 2010 г., стр.7071.

38. Ф.И. Атауллаханов, Е.И. Синауридзе, В.Б. Сулимов. Новые ингибиторы тромбина или как компьютерный драг-дизайн позволяет ускорить первые стадии скрининга в сотни раз. Тезисы первой международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Секция 5: Постгеномные технологии в создании и валидации лекарственных соединений, 17-19 ноября 2010 г. Москва, стр. 99.

39. Ф.И. Атауллаханов, Е.И. Синауридзе, В.Б. Сулимов, А.Н. Романов, И.В. Грибкова, С.С. Суров, О.А. Кондакова, А.С. Горбатенко,, Ю.В. Кузнецов, А.А. Боголюбов. Поиск новых высокоэффективных низкомолекулярных синтетических прямых ингибиторов тромбина. Тезисы докладов на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Фундаментальные науки -медицине", Москва, «Слово», декабрь 2010 г., стр. 125-126.

40. А.С. Горбатенко, Т.Л. Дереза, Е.И. Синауридзе. Влияние разбавления плазмы in vitro различными плазмозамещающими растворами на систему свертывания крови. Тезисы V Всероссийской конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (с международным участием), Москва, 3-5 февраля 2011г., стр. 142-143.

41. E.I. Sinairidze, I.V. Gribkova. Artificial plasma substituting solutions (PSSs) don't worsen thrombin-fibrinogen and factor XIH-fibrin polymer interactions. XXIII Congress of The International Society on Thrombosis and Haemostasis. Kyoto, Japan, July 23-28, 2011 .J. Thromb. Haemost., 2011, 9 (Suppl. 2), O-WE-Ol 1.

42. E.I. Sinauridze, A.S. Gorbatenko. Moderate plasma dilution by artificial plasma substituting solutions intensifies coagulation in vitro. XXIII Congress of The International Society on Thrombosis and Haemostasis. Kyoto, Japan, July 23-28, 2011. J. Thromb. Haemost., 2011, 9 (Suppl. 2), P-TU-138.

43. I.D. Tarandovskiy, M.A. Panteleev, E.I.Sinauridze, N. N. Topalov, E. O. Artemenko, N. A Podoplelova, F.I. Ataullakhanov. Formation of the second peak in platelet-rich plasma thrombin generation curve is linked with phosphatidylserine expression during platelet activation. XXIII Congress of The International Society on Thrombosis and Haemostasis. Kyoto, Japan, July 23-28, 2011 .J. Thromb. Haemost., 2011, 9 (Suppl. 2), P-WE-221.

44. I.V. Gribkova, G.Galstyan E. Sinauridze. Kaolin, used to trigger the coagulation in thrombin generation test, increases sensitivity of the method in hemophilia patients. XXIII Congress of The International Society on Thrombosis and Haemostasis. Kyoto, Japan, July 23-28, 2011. J. Thromb. Haemost., 2011, 9 (Suppl. 2), P-WE-566.

45. E.S. Urnova, L.P. Mendeleeva, O.S. Pokrovskaya, E.I. Sinauridze, A.N. Balandina, E.N. Lipets, I.V. Gribkova, S.A. Vasiliev, V.G. Savchenko. Hemostasis in the primary multiple myeloma patients. XXIII Congress of The International Society on Thrombosis and Haemostasis. Kyoto, Japan, July 23-28, 2011. J. Thromb. Haemost., 2011, 9 (Suppl. 2), P-MO-420.

46. I.D. Tarandovskiy, M.A. Panteleev, E.I. Sinauridze, N.N. Topalov, E.O. Artemenko, N.A Podoplelova, F.I. Ataullakhanov. Appearance of the second thrombin peak on thrombin generation curve in platelet-rich plasma depends on phosphatidylserine expression during platelet activation. Abstracts of the 36lh FEBS Congress: "Biochemistry for Tomorrow's Medicine", Turin, Italy, 25-30 June 2011; FEBS J., 2011; 278 (Suppl. 1):292.

47. Ф.И. Атауллаханов, Е.И. Синауридзе, И.В. Грибкова, А.С. Горбатенко. Поиск новых высокоэффективных низкомолекулярных синтетических прямых ингибиторов тромбина. Тезисы докладов на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине", Москва, «Слово», декабрь 2011 г., стр. 149-151.

48. Gribkova I., Spiridonova V., Gorbatenko A., Sinauridze Е. Thrombin inhibition activity and in vitro stability in human plasma of two aptamers. 58th Meeting of the scientific and standardization committee of the ISTH, Liverpool, 27-30 June 2012, abstract SSC12-1172.

49. M. Gracheva, E.S. Urnova, L.P. Mendeleeva, E.I. Sinauridze, A.N. Balandina, E.N. Lipets, I.V. Gribkova, S.A. Vasiliev, E.N. Parovichnikova, V.G. Savchenko, F.I. Ataullakhanov. Assesment of haemostasis in the primary multiple myeloma patients using different laboratory methods. 58th Meeting of the scientific and standardization committee of the ISTH, Liverpool, 27-30 June 2012, abstract LSPE31.

Список использованных сокращений

АЛБ - альбумин ТЭГ - тромбоэластография

д - максимальная концентрация ФР - физиологический раствор

тромбина в пробе ЭТП - эндогенный тромбиновый

4-АП - 4-аминопиридиниевый остаток потенциал

2-АТ - 2-аминотиазолиниевый остаток DMax - максимальная оптическая

ATIII - антитромбин III плотность сгустка

АЧТВ - активированное частичное ic50 - концентрация эффектора,

тромбопластиновое время снижающая ЭТП или Ус1устка в 2

BP - время рекальцификации раза

ГФ - Гелофузин ld50 - доза соединения, вызывающая

ГЭК - гидроксиэтилкрахмал гибель половины животных за 2

кДа - килодальтон часа

ИТ - изотиурониевый остаток ^лаг - лаг-период

ПВ - протромбиновое время ^мах - время достижения максимума

ПЗР - плазмозамещающий раствор V * мах - максимальная скорость

РПГ - Реополиглюкин полимеризации

РР - раствор Рингера V v сгустка - скорость роста сгустка в

ТВ - тромбиновое время пространстве

Объем: 1,5усл.п.л. Подписано в печать: 20.12.2012 Тираж: 75 экз. Заказ № 9375 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, ул. Ленинский проспект, д. 2 (495)978-66-63; www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Синауридзе, Елена Ивановна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

05201350528

Синауридзе Елена Ивановна

ХАРАКТЕРИСТИКИ ГЕМОСТАЗА ПРИ ГЕМОДИЛЮЦИИ. КОРРЕКЦИЯ ГЕМОДИЛЮЦИОННОЙ ГИПЕРКОАГУЛЯЦИИ ИНГИБИТОРАМИ

ТРОМБИНА

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант доктор биологических наук, профессор Ф.И. Атауллаханов

Москва 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ................................................................................................................................................................2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..............................................................................................................................6

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................................................9

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................................15

Часть I. Искусственные плазмозамещающие растворы................................................15

1.1. Гиповолемия........................................................................................................................................................15

1.2. Основные патофизиологические процессы, связанные с гиповолемией, и регуляция состава и объема различных

водных секторов организма..................................................................................................................16

1.3. Коррекция гиповолемии............................................................................................................................17

1.4. Современные плазмозамещающие растворы..............................................................................19

1.4.1. Кристаллоидные растворы............................................................................................................21

Изотонические солевые растворы................................................................................................21

Осмотичностъ кристаллоидныхрастворов................................................................................22

Метаболический ацидоз, возникающий при переливании

больших объемов несбалансированных по ионному

составу плазмозамещающих растворов................................................................................................23

Дефицит оснований и «носителирезервной щелочности»........................................24

Гипертонические кристаллоидные растворы................................................................................27

Влшние кристаллоидных растворов не систему гемостаза........................................28

1.4.2. Коллоидные плазмозамещающие растворы......................................................................................28

Альбумин..................................................................................................................................................................................................................29

Применение растворов альбумина....................................................................................................................31

Побочные эффекты переливания альбумина..................................................................................34

Растворы на основе желатина................................................................................................................................................36

Побочные эффекты желатиновых плазмозамещающих растворов.. 40

Влияние желатиновых растворов на гемостаз........................................................................40

Декстрановые растворы....................................................................................................................................................................44

Побочные эффекты переливания декстрановыхрастворов..............................46

Влияние декстрановых плазмозамещающих растворов

на гемостаз................................................................................................................................................................................................48

Растворы на основе гидроксиэтилкрахмалов..............................................................................................51

Химическая структура гидроксиэтилкрахмалов....................................................................51

Физико-химические свойства, характеризующие

разн ые препарат ы ГЭК.....................................................................................................................................................52

Концентрация препарата................................................................................................................................................53

Средний молекулярный вес ГЭК...........................................................................................................................53

Степень замещения и степень молярного замещения ГЭК.................................55

С/С^ отношение гидроксиэтилирования..............................................................................................57

Источники сырья для производства ГЭК...........................................................................................58

Использование сбалансированных солевых растворов для растворения ГЭК и как основы других коллоидных

плазмозамещающих растворов..............................................................................................................................60

Фармакокинетические параметры различных препаратов ГЭК...............62

Побочные эффекты ГЭК.................................................................................................................................................64

Влияние ГЭК на гемостаз................................................................................................................................................67

1.5. Влияние гемодилюции на систему свертывания крови..............................................................70

1.5.1. Влияние гемодилюции на различные времена свертывания................................73

1.5.2. Исследование влияния гемодилюции на гемостаз

с помощью метода тромбоэластографии................................................................................................79

Исследование ТЭГ в опытах in vitro..............................................................................................................80

Исследование ТЭГ в опытах in vivo................................................................................................................82

1.5.3. Исследование влияния гемодилюции на гемостаз путем

измерения генерации тромбина..............................................................................................................................86

1.5.4. Механизмы, ответственные за возникновение гиперкоагуляции

при гемодилюции............................................................................................................................................................................89

Часть II. Современные принципы антикоагулянтной терапии....................................94

1.6. Стандартные антикоагулянты..................................................................................................................................................97

1.6.1. Антитромбоцитарная терапия..................................................................................................................................97

1.6.2. Нефракционированный гепарин, гепарины низкого молекулярного веса и гепариноиды..............................................................................................................98

1.6.3. Антагонисты витамина К..................................................................................................................................................103

1.7. Селективные ингибиторы тромбина и фактора Ха..........................................................................105

1.7.1. Гирудин и его аналоги..........................................................................................................................................................107

1.7.2. Низкомолекулярные синтетические ингибиторы

тромбина и фактора Ха........................................................................................................................................................108

Ингибиторы тромбина..........................................................................................................................................................109

Аргатробан..................................................................................................................................................................................109

Дабигатран этексилат..........................................................................................................................................111

Селективные ингибиторы фактора Ха......................................................................................................112

1.8. Новые направления в разработке антикоагулянтов........................................................................114

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................................................................................................................118

2.1. Материалы..............................................................................................................................................................................................................118

2.2. Методы..........................................................................................................................................................................................................................121

2.2.1. Приготовление плазмы для анализа......................................................................................................121

2.2.2. Инкубация плазмы с молочной кислотой....................................................................................121

2.2.3. Разбавление плазмы плазмозамещающими растворами....................................122

2.2.4. Измерение стандартных времен свертывания....................................................................123

Измерение активированного частичного

тромбопластинового временм (АЧТВ)......................................................................................................124

Измерение протромбинового времени свертывания (ПВ)....................................124

Измерение тромбинового времени свертывания (ТВ)..................................................124

Измерение времени рекальцификации (BP)......................................................................................125

2.2.5. Измерение генерации тромбина..................................................................................................................125

Стандартная постановка............................................................................................................................................126

Измерение генерации тромбина без дополнительного

разбавления плазмы в ходе анализа..............................................................................................................128

2.2.6. Тест тромбодинамики (измерение скорости роста

сгустка в пространстве)..................................................................................................................129

2.2.7. Приготовление активаторов с тканевым фактором для

изучения скорости роста сгустка в пространстве..................................................133

2.2.8. Измерение параметров полимеризации фибрина............................................134

Измерение скорости полимеризации фибрина в растворах

фибриногена в присутствии различных плазмозаменителей..............................134

Измерение параметров полимеризации в плазме,

разбавленной ПЗР........................................................................ 136

2.2.9. Тромбоэластография......................................................... 137

2.2.10. Модель умеренной гемодилюции на крысах.......................... 138

2.2.11. Измерение концентрации гемоглобина................................. 138

2.2.12. Счет клеток................................................................... 139

2.2.13. Исследование изменений коагуляции после переливания плазмозамещающих растворов пациентам in vivo........................ 139

2.2.14. Компьютерный скрининг для поиска новых ингибиторов тромбина........................................................................... 140

2.2.15. Синтез новых соединений - ингибиторов тромбина................. 141

2.2.16. Измерение активности тромбина и фактора Ха....................... 143

2.2.17. Измерение острой токсичности вновь синтезированных ингибиторов....................................................................... 145

2.2.18. Стабильность лучших новых ингибиторов тромбина

в водных растворах............................................................. 146

2.2.19. Статистическая обработка результатов................................. 146

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ................................................... 147

Часть I. Влияние на свертывание крови разбавления плазмы

искусственными плазмозамещающими растворами............... 147

3.1. Измерение стандартных времен свертывания при разбавлении

плазмы плазмозамещающими растворами in vitro............................. 148

3.2. Генерация тромбина при разбавлении плазмы in vitro различными плазмозамещающими растворами................................................. 152

3.3. Скорость пространственного роста сгустка в плазмах, разбавленных различными плазмозамещающими

растворами in vitro.................................................................... 155

3.4. Влияние различных плазмозамещающих растворов на скорость полимеризации фибрина в растворах фибриногена........................... 160

3.4.1. Полимеризация фибрина в присутствии различных ПЗР............. 161

3.4.2. Полимеризация фибрина в присутствии различных ПЗР

и фибринстабилизирующего фактора XIII................................. 162

3.5. Образование сгустков в плазме, разбавленной различными плазмозамещающими растворами................................................. 166

3.6. Коррекция гиперкоагуляции, вызванной гемодилюцией, с помощью

ПЗР, содержащих ингибиторы тромбина................................................169

3.6.1. Влияние гемодилюции на эндогенный тромбиновый потенциал в присутствии различных концентраций

антитромбина III в системе.................................................... 169

3.6.2. Разбавление плазмы изотоническим солевым раствором, содержащим низкомолекулярный синтетический ингибитор тромбина (HC-025S-IOC)....................................................... 170

3.6.3. Коррекция гемодилюционных нарушений скорости роста

сгустка в пространстве ингибиторами тромбина......................... 172

3.7. Изучение влияния гемодилюции на состояние коагуляции in vivo......... 174

3.7.1. Модель умеренной гемодилюции на животных........................ 174

3.7.1.1. Экспериментальное определение степени кровопотери....... 175

3.7.1.2. Выбор концентрации ингибитора тромбина HC-019s-IOC

для введения в физиологический раствор.............................. 175

3.7.1.3. Изменения коагуляции in vivo у крыс после

гемодилюции различными плазмозамещающими растворами .... 178

Стандартные времена свертывания.............................................. 178

Измененш генерации тромбина при гемодилюции in vivo стандартным физиологическим раствором и раствором,

содержащим ингибитор тромбина HC-019s-IOC..................... 179

Исследование пространственной динамики свертывания

при гемодилюции различными ПЗР у крыс in vivo.................... 180

3.7.2. Изменение параметров системы свертывания крови при переливании пациентам in vivo искусственных

плазмозамещающих растворов................................................ 182

3.7.2.1. Влияние гемодилюции in vivo на скорость роста

сгустка в пространстве.................................................... 182

3.7.2.2. Изменение генерации тромбина в ходе гемодилюции

у пациентов in vivo................................................................. 183

3.7.2.3. Динамика изменения тромбоэластографических показателей у доноров костного мозга, получавших

инфузии различных ПЗР................................................... 184

Заключение.................................................................................. 188

Часть И. Разработка новых синтетических низкомолекулярных

ингибиторов тромбина...................................................... 192

3.8. Компьютерный дизайн новых ингибиторов тромбина........................ 197

3.9. Экспериментальное исследование прямой антитромбиновой активности новых соединений ..................................................... 203

ЗЛО. Определение механизма и констант ингибирования тромбина

для вновь синтезированных соединений........................................ 205

3.11. Антикоагулянтная активность новых ингибиторов в плазме in vitro...... 214

3.11.1. Влияние новых соединений на тест генерации тромбина........... 214

3.11.2. Измерение скорости роста сгустка в пространстве в присутствии новых ингибиторов тромбина................................ 217

3.12. Определение способности новых ингибиторов тромбина ингибировать активность фактора Ха............................................. 217

3.13. Изучение безопасности новых ингибиторов тромбина..................... 218

3.13.1. Острая токсичность новых соединений................................. 219

3.13.2. Доклинические токсикологические исследования препарата ингибитора тромбина HC-019s-IOC.......................................... 222

3.14. Стабильность новых ингибиторов в водных растворах..................... 223

3.15. Антикоагулянтное действие нового ингибитора in vivo..................... 224

Заключение.................................................................................. 226

ВЫВОДЫ....................................................................................... 228

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..................................... 230

БЛАГОДАРНОСТИ........................................................................ 280

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДГ

АДФ

АИК

АЛБ

АМах

4-АП

2-АТ

АТІІІ

АЧТВ

в/в ВР ГФ ГИТ

гэк две

дмсо

ИТ

кДа

КТИ

МА

МЕ

мно оцк пв

ПЗР РПГ РР

сзп

ТАТ

ТВ

ТФ

тэг

угол а

ФР ЭТИ

АМС АРС АМЭБ ВЕ

антидиуретический гормон (вазопрессин) аденозиндифосфат

аппарат искусственного кровообращения альбумин человека

максимальная концентрация тромбина в пробе 4-аминопиридиниевый остаток 2-аминотиазолиниевый остаток антитромбин III

активированное частичное тромбопластиновое

время свертывания

внутривенное введение

время рекальцификации

Гелофузин

гепарининдуцированная тромбоцитопения

гидроксиэтилкрахмал

диссеминированное внутрисосудистое

свертывание

диметилсульфоксид

изотиурониевый остаток

килодальтон

ингибитор трипсина из кукурузы максимальная амплитуда тромбоэластограммы международная единица ферментативной активности

Международное Нормализованное Отношение

объем циркулирующей крови

протромбиновое время свертывания

искусственный плазмозамещающий раствор

Реополиглюкин

раствор Рингера

свежезамороженная плазма

комплекс тромбин-АТШ

тромбиновое время свертывания

тканевый фактор

тромбоэластография

угол наклона касательной к растущему участку тромбоэластограммы физиологический раствор эндогенный тромбиновый потенциал

7-амино-4-метил кумарин активированный протеин С острый респираторный дистресс синдром избыток оснований

BEp0t (potential bases excess)

c2/c6

CAT

CFT (clot formation time)

CT (clotting time) CYP29 и CYP3A4/5 D

3D структуры

Омах

DVT (deep vein thrombosis) FITC

Gas6 (growth arrest sequence 6)

^^связыв.

GPIb

GPIb-IX-V

GPIIb/IIIa

HEPES

IC50

ICT (impedance clotting time)

LD50 LMWH

MCF (maximal clot firmness)

MGP

MS Mw

NCI

потенциальный избыток оснований отношение гидроксиэтилирования (отношение количества гидроксиэтильных групп, введенных в С2 и С6 позиции молекулы ГЭК) автоматизированная калиброванная тромбограмма

время образования сгустка в ЯОТЕС (аналог К в ТЭГ)

время свертывания в ЯОТЕО (аналог Я в ТЭГ)

белки семейства цитохромов Р450

степень разбавления плазмы

трехмерные структуры

максимальная оптическая плотность сгустка

степень замещения гидроксиэтилкрахмала

тромбоз глубоких вен

флюоресцеинизотиоцианат

белок, предотвращающий неконтролируемое

деление клеток

энергия связывания лиганда в активном центре

тромбина

гликопротеин 1Ь

комплекс рецепторных гликопротеинов 1Ь и факторов свертывания IX и V на поверхности активированных тромбоцитов гликопротеиновые рецепторы тромбоцитов ПЬ/Ша

4-(2-гидроксиэтил)-1 -пиперазин-2-этаносульфоновая кислота

концентрация эффектора, снижающая какой-либо

измеряемый параметр в 2 раза

импедансное время свертывания

время коагул

Информация о работе

Синауридзе, Елена Ивановна
доктора биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.04

Диссертация

Характеристики гемостаза при гемодилюции. Коррекция гемодилюционной гиперкоагуляции ингибиторами тромбина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы