Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Малая субъединица гетеродимерной эндонуклеазы рестрикции нового типа BspD61

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Малая субъединица гетеродимерной эндонуклеазы рестрикции нового типа BspD61"

На правах рукописи

ЮНУСОВА Альфия Кяшафовна

МАЛАЯ СУБЪЕДИНИЦА ГЕТЕРОДИМЕРНОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ НОВОГО ТИПА ВзрБб!

Специальность 03.00.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003452685

Пущино, 2008

003452685

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук Железная Людмила Алексеевна

кандидат физико-математических наук Качалова Галина Сергеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Камзолова Светлана Григорьевна

кандидат биологических наук Ушакова Татьяна Евгеньевна

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии РАН им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Защита диссертации состоится «11» декабря 2008 г. В 14 час 00 мин на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН, г. Пущино

Автореферат разослан «07» ноября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Эндонуклеазы рестрикции узнают в ДНК короткую (4-8 н.п.) специфическую последовательность и расщепляют ДНК по двум цепям в фиксированном положении относительно узнаваемой последовательности. Эндонуклеазы рестрикции - одно из наиболее многочисленных семейств, насчитывающее около 3900 биохимически охарактеризованных представителей и приблизительно такое же количество, существование которых предсказано на основе биоинформационного анализа последовательностей ДНК, представленных в вепВапк. Это чрезвычайно быстро эволюционирующее семейство, что проявляется в необычном разнообразии стратегий, используемых эндонуклеазами рестрикции для расщепления ДНК по двум цепям. Так, эндонуклеазы рестрикции, узнающие симметричную (палиндромную) последовательность, взаимодействуют с этой последовательностью в виде гомодимера. Эндонуклеазы рестрикции, узнающие несимметричную последовательность, часто взаимодействуют с ней в виде мономера, однако расщепление ДНК происходит только после димеризации мономеров, связанных с двумя разными копиями сайтов.

В последние годы были выявлены два новых типа эндонуклеаз рестрикции — двухсайтовые и гетеродимерные. Двухсайтовые эндонуклеазы рестрикции взаимодействуют с ДНК в виде мономера, который содержит два каталитических центра. Один каталитический центр расщепляет верхнюю цепь ДНК, другой - нижнюю. Гетеродимерные эндонуклеазы рестрикции состоят из двух различных субъединиц, каждая из которых содержит по одному каталитическому центру и каждая из которых расщепляет «свою» цепь ДНК.

Двухсайтовые и гетеродимерные эндонуклеазы рестрикции явились основой для конструирования нового типа1 ферментов - никующих эндонуклеаз. Эти эндонуклеазы, подобно эндонуклеазам рестрикции, узнают в ДНК короткую специфическую последовательность и, подобно же эндонуклеазам рестрикции, расщепляют ДНК в строго фиксированном положении относительно узнаваемой последовательности. Но в отличие от

эндонукулеаз рестрикции никующие эндонуклеазы расщепляют только одну из цепей ДНК. Никующие эндонуклеазы стали важным инструментом молекулярной биологии. На их основе уже создан ряд новых биотехнологических методов. Предполагается, что некоторые проблемы нанотехнологий на основе ДНК могут быть решены с применением этих ферментов.

Никующие эндонуклеазы были открыты вначале как самостоятельные ферменты. Предполагалось, что они являются природно мутировавшими эндонуклеазами рестрикции, которые утратили способность к димеризации и, как следствие, способность расщеплять ДНК по двум цепям. В представленной работе впервые показано, что никующие эндонуклеазы являются одной из субъединиц (большой) гетеродимерных эндонуклеаз рестрикции. Настоящая работа посвящена изучению свойств и определению пространственной структуры малой субъединицы гетеродимерной эндонуклеазы рестрикции BspD6I. !

Цель работы: Выяснение функции белка, кодируемого открытой рамкой считывания, прилегающей к гену никующей эндонуклеазы в геномной ДНК Bacillus species D6.

Задачи работы:

1. Клонирование открытой рамки считывания, прилегающей к гену никующей эндонуклеазы в хромосомной ДНК Bacillus species D6.

2. Получение штамма-суперпродуцента белка, кодируемого открытой рамкой считывания (малой субъединицы).

3. Выявление специфичности и функциональных особенностей малой субъединицы.

4. Определение пространственной структуры малой субъединицы. Выявление структуры ее каталитического центра.

Научная новизна. Определена функция белка, кодируемого открытой рамкой считывания. Показано, что он является малой субъединицей гетеродимерной эндонуклеазы рестрикции BspD6I. Впервые показано, что никующая эндонуклеаза BspD6I - это не природно мутировавшая эндонуклеаза рестрикции, а одна из субъединиц гетеродимерной эндонуклеазы рестрикции BspD6I.

Получены кристаллы и определена с разрешением 1.5 А пространственная структура малой субъединицы, в которой выявлены

аминокислотные остатки, формирующие ее каталитический центр.

I

Практическая значимость работы. Эндонуклеазы рестрикции в свое время легли в основу техники рекомбинантной ДНК и продолжают оставаться ее незаменимым инструментом. Обнаружение новой эндонуклеазы рестрикции BspD6I расширяет возможности генно-инженерных методик. Охарактеризованная в работе эндонуклеаза рестрикции BspD6I позволит использовать ее не только как эндонуклеазу рестрикции, но и как никующую эндонуклеазу.

Апробация работы н публикации: материалы диссертации были доложены на 11-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2007) и на международной конференции "24 European Crystallographic Meeting", (Марракеш, Марокко, 2007).

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в реферируемых журналах.

Структура и объем диссертации: Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 22 рисунка. Список литературы содержит 120 ссылок.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее в нашей лаборатории в штамме Bacillus species D6 была обнаружена никующая эндонуклеаза BspD6I, которая узнает на ДНК последовательность 5'-GAGTC-375'-GACTC-3' и вносит разрыв (nick) только в цепь ДНК, содержащую последовательность 5'-GAGTC на расстоянии четырех нуклеотидов от узнаваемой последовательности. Нами была определена пространственная структура никующей эндонуклеазы BspD6I [Kachalova et al., 2008], которая состоит из узнающего и каталитического доменов, связанных между собой линкерным доменом (рис. 1).

каталитическим домен

линкерныи домен

Рис. 1. Структура никующей эндонуклеазы BspD6I. Голубым и фиолетовым цветом представлены субдомены узнающего домена никующей эндонуклеазы, красным -каталитический домен, зеленым - линкерный домен.

В геномной ДНК Bacillus species D6 к гену никующей эндонуклеазы прилегает открытая рамка считывания (ОРС), которая кодирует белок длиной 186 аминокислотных остатков с ранее неизвестной функцией (рис. 2А). Аминокислотная последовательность, кодируемая открытой рамкой считывания, имеет гомологию с каталитическим доменом никующей эндонуклеазы - 29% идентичных остатков и 20% гомологичных. Важно

отметить, что в выровненной последовательности совпадают положения всех аминокислотных остатков, которые входят в каталитический центр никующей эндонуклеазы (рис. 2Б). Поэтому можно было ожидать, что продукт открытой рамки считывания будет обладать эндонуклеазной активностью.

^^^ О Р С к _Ь 5РР61Н

1 ЬЛе-.-ЯяЯыс "вгбкхкпвг I Ла.-г.

2 Ихкх-Шкмубк Г --------Вррму

fI;■н7азvк 435 ккЯз^кы:.*/ з э

|ЕЕгМКУ1 (л в н 1с г»

5 2 9 1 2 5

ко—яенгырккь

Рис. 2. (А) Организация генного комплекса системы рестрикции-модификации ВэрОб. Размер каждого гена в н.п. указан под стрелками. (Б) Сравнение аминокислотных последовательностей никующей эндонуклеазы (1) и открытой рамки считывания (2). Точками указаны аминокислотные остатки, входящие в активный центр никующей эндонуклеазы.

Получение штамма-суперпродуцента белка, кодируемого открытой рамкой считывания

Открытую рамку считывания нарабатывали при помощи ПЦР. ПЦР-продукт клонировали в вектор рЕТ28с под промотор Т7 РНК-полимеразы. Соединение ПЦР-фрагмента и вектора планировали таким образом, чтобы в результате экспрессии образовался белок с шестью остатками гистидина на С-конце, включение которых в дальнейшем позволило нам использовать аффинную хроматографию на №-ЫТА-агарозе. В качестве штамма-реципиента

использовали BL21(DE3), который содержит ген РНК-полимеразы фага Т7 в составе дефектного профага DE3. Индукцию экспрессии в этом штамме проводили изопропил^-Б-тиогалактозидом (ИПТГ).

При клонировании эндонуклеаз рестрикции в штамм необходимо предварительно ввести плазмиду, содержащую ген ДНК-метилтрансферазы, для защиты геномной ДНК от автогидролиза. Для этой цели мы использовали плазмиду pRARE/M.Ssc. Помимо того, что эта плазмида содержит ген метилазы M.SscLII, узнающей ту же последовательность, что и никующая эндонуклеаза, она содержит гены, кодирующие тРНК для редко используемых в Е. coli кодонов, что важно, т.к. белок открытой рамки считывания содержит 12% редких для E.coli кодонов.

Рис. 3. Схема получения штамма-суперпродуцента белка, кодируемого открытой рамкой считывания.

Полученный штамм ВЬ21(БЕЗ)/р11АКЕ/М.85с трансформировали рекомбинантной плазмидой рЕТ28с/ОРС.

иптг

ген метыпазы

Были проведены эксперименты по определению условий индукции, обеспечивающих наибольший выход белка. При этом варьировали время индукции, температуру и концентрацию ИПТГ в ростовой среде.

--150

—100

—75

ИВ—50

~3 5 Рис. 4. Электрофорез в 13% SDS-ПААГ. 1 -

_2 5 лизат клеток штамма Е.соЧ,

продуцирующего белок, кодируемый открытой рамкой считывания, до индукции ИПТГ; 2 - лизат тех же клеток после индукции; 3 - препарат, элюированный 100 мМ имидозолом. М - маркер молекулярных масс белков, числа справа - молекулярные массы (кДа).

После очистки лизата клеток на №-ЫТА-агарозе нами был получен белок с молекулярной массой около 20 кДа, близкой к значению, рассчитанному исходя из аминокислотного состава. Благодаря высокому выходу белка использование только одной колонки позволило нам получить белок с чистотой более 95% (рис. 4).

Характеристика малой субъединицы

Для анализа активности белка, кодируемого открытой рамкой считывания, использовали плазмиду рНС624 (рис. 5). Плазмида содержит два сайта узнавания (вАвТС) никующей эндонуклеазой, которые расположены на расстоянии 500 н.п. Из рис. 5 видно, что при добавлении только белка, кодируемого открытой рамкой считывания, никаких изменений плазмидной ДНК не происходит (дорожка 2). При добавлении только никующей эндонуклеазы, суперскрученные формы плазмиды переходят в открытые

кольца (дорожка 3), что свидетельствует о внесении никуюшей эндонуклеазой одноцепочечных разрывов. Однако при совместном добавлении никующей эндонуклеазы и белка открытой рамки считывания образуются два фрагмента -500 н.п. и 1500 н.п. (дорожка 4), что свидетельствует о расщеплении ДНК по

двум цепям, а, значит, смесь никующей эндонуклеазы и продукта открытой

„

рамки считывания действует как эндонуклеаза рестрикции.

OI+S2.

.51111 .4114

Рис. 5. Электрофорез в 1%-ном агарозном геле. Плазмида рНС624 инкубирована: 1 - без добавления белков; 2-е продуктом ОРС; 3-е никующей эндонуклеазой; 4-е продуктом ОРС и никующей эндонуклеазой; 5-е Я.НтЯ; М - маркер длин фрагментов ДНК (числа справа - длины фрагментов в н.п.). Слева указаны изоформы плазмиды (81 -мономерная суперспираль; 82 - димерная суперспираль; 01 - открытое мономерное кольцо; 02 - открытое димерное кольцо).

В качестве контроля плазмиду рНС624 расщепляли эндонуклеазой рестрикции НтЯ, которая узнает в ДНК последовательность ОАТ^ТС и расщепляет в тех же положениях, что и никующая эндонуклеаза, только по двум цепям. Длины полученных фрагментов при совместном добавлении никующей эндонуклеазы и белка открытой рамки считывания полностью совпали с теми, которые были получены после расщепления Я-НтА.

Таким образом, продукт открытой рамки считывания, прилегающей к гену никующей эндонуклеазы в геномной ДНК Bacillus species D6, и никующая эндонуклеаза являются субъединицами гетеродимерной эндонуклеазы рестрикции. В дальнейшем изложении большую субъединицу (70,8 кДа) мы будем по-прежнему называть никующей эндонуклеазой, а продукт открытой

рамки считывания (21,6 кДа) - малой субъединицей. Согласно принятой номенклатуре эта эндонуклеаза рестрикции получила название BspD6I.

Эндонуклеаза рестрикции BspD6I расщепляет цепь, содержащую последовательность GAGTC, также как никующая эндонуклеаза - на расстоянии четырех нуклеотидов от сайта узнавания, а комплементарную цепь ДНК - на расстоянии шести нуклеотидов от сайта с некоторым люфтом: примерно 10% молекул расщепляется на расстоянии пяти нуклеотидов (рис. 6).

Рис. 6. Локализация фосфодиэфирных связей, гидролизуемых смесью никующей

эндонуклеазы и малой субъединицы. С, A, G, Т - продукты реакции секвенирования ДНК фага M13mpl9. 1 - меченая ДНК М13тр19, инкубированная со смесью никующей эндонуклеазы и малой субъединицы; 2 -меченая ДНК М13тр19, инкубированная со смесью никующей эндонуклеазы и малой субъединицы, к которой после инактивации ферментов (80°С - 20 мин) добавили фрагмент Кленова и смесь dNTP. Электрофорез в 6%-ном ПААГ в присутствие 7 М мочевины при 50°С.

Наблюдаемый люфт положения, в котором малая субъединица расщепляет нижнюю цепь ДНК, обусловлен, по-видимому, очень слабым контактом малой субъединицы с никазой и/или с ДНК.

К моменту обнаружения нами эндонуклеазы рестрикции BspD6I (2006 г.) она была уникальной гетеродимерной эндонуклеазой рестрикции (таблица).

Отличительные свойства эндонуклеазы рестрикции BspD6I позволили отнести ее к новому типу гетеродимерных эндонуклеаз рестрикции, который ранее не был описан в литературе. Эндонуклеаза рестрикции BspD6I не долго оставалась уникальным ферментом. Позднее были обнаружены две

x с a. g т 2

3'

х g

g .

5'

гетеродимерные эндонуклеазы рестрикции с такими же свойствами (Вбг061 и В1з!) [Хи е1 а1., 2007].

Таблица. Сравнение свойств гетеродимерных эндонуклеаз рестрикции

Свойства гетеродимерной эндонуклеазы Свойства гетеродимерных эндонуклеаз

рестрикции ВхрП61 рестрикции известных к 2006 г.

Молекулярные массы субъединиц сильно Субъединицы с близкими

различаются (70,8 и 21,6 кДа) молекулярными массами (-30 кДа)

Одна из субъединиц (70,8 кДа) Ни одна из субъединиц самостоятельно

связывается с ДНК и вносит разрыв в не связывается и не расщепляет ДНК

одну цепь ДНК

Расщепление ДНК в стороне от Расщепление ДНК внутри узнаваемой

узнаваемой последовательности последовательности

Изучение образования комплекса малой субъединицы с никующей эндонуклеазой без ДНК и в присутствии ДНК проводили методом торможения в геле (рис. 7). Из рис. 7 видно, что в отсутствие ДНК малая субъединица и никующая эндонуклеаза не образуют комплекса независимо от наличия или отсутствия ионов двухвалентных металлов. Об этом свидетельствует наличие полос, соответствующих малой субъединице, интенсивность которых совпадает с интенсивностью свободной субъединицы. Однако комплекса малой субъединицы с никующей эндонуклеазой не образуется и в присутствии ДНК. Об этом свидетельствует наличие на одной дорожке полосы, соответствующей свободной малой субъединице, и полосы, соответствующей дуплексу, связанному с никующей эндонуклеазой.

малая субъединица малая малая с\<уксди ни ца

»ющхкюш с>Гп«„шша .тютощмттяптаяи шклтта-тжтк^а ..cam дуплекс 24 H t. Л»™»« 24 ...11. дуп-ки: 24 п ..

ник\ кчная

■)ПДО-

нмаеаза

Mg Mi. C'a 0 Ma Mn C'a 0 Mg Ми C'a 0 Ma Ми C'a О USA

-14(1 KJU> 2

1

68 к Да

мачая

субье- * Л » М1Ф 9 *'■ Ш 9

линица

Рис. 7. Анализ взаимодействия малой субъединицы с никующей эндонуклеазой и с ДНК. В реакции использовали 80 пмоль дуплекса (24 н.п.), 40 пмоль никующей эндонуклеазы и 40 пмоль малой субъединицы. Дорожки 0 - реакция в отсутствие ионов металла; дорожки Mg, Mn, Са, - реакция в присутствии 10 мМ MgCl2, МпСЬ, СаСЬ соответственно. В качестве маркера использовали BSA, справа даны молекулярные массы мономера, димера и тримера BSA. 1 — положение полосы, соответствующей дуплексу, связанному с никующей эндонуклеазой; 2 - комплекс гидролизованного дуплекса с никующей эндонуклеазой. Нативный 8% ПААГ, окрашивание Кумасси G-250.

Кристаллизация малой субъединицы

Высокий выход высокоочищенной малой субъединицы позволил нам поставить задачу ее кристаллизации с целью определения пространственной структуры малой субъединицы.

Эксперименты по поиску условий кристаллизации проводили при 21°С и 5°С методом диффузии паров в сидячей или висячей капле с использованием как коммерческих наборов для кристаллизации (Crystal Screen, Crystal Screen Cryo, Wizard I и Wizard II), так и самостоятельно приготовленных растворов. В экспериментах по кристаллизации использовали белок с концентрацией 60-80 мг/мл.

Первые кристаллы, выросшие в виде игольчатых друз примерно через месяц, представляли собой поликристаллы, непригодные для определения пространственной структуры. При дальнейшей вариации условий кристаллизации удалось получить кристаллы, которые дали дифракционную картину с рефлексами до 2.6 А. И, наконец, путем дополнительного подбора осадителей были получены кристаллы размером 0.15 х 0.15 х 0.03 мм, давшие дифракционную картину с набором рефлексов до 1.5 А (рис. 8 и 9).

а б в

Рис. 8. Кристаллы малой субъединицы, полученные при использовании следующих резерву арных растворов: (а) 0.1 М Hepes, рН 7.0, 0.2 М СаС12, 25% PEG 4000; (б) 10 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 0.2 М Li2S04, 30% PEG 4000; (в) 2 М (NH4)2S04, 0.1 М CAPS, рН 10.5, 0.2 М Li2SQ4

Рис. 9. Дифракционная картина кристалла малой субъединицы, полученного при использовании резервуарного раствора (2 М (NH4)2S04, 0.1 М CAPS, рН 10.5, 0.2 М Li2S04).

Эти кристаллы были использованы в дальнейшей работе для сбора дифракционных данных. Съемку кристаллов проводили на станции ВХУб/ООЮБ на синхротроне ОЕБУ (Гамбург, Германия). Кристаллы принадлежат к пространственной группе Р2, с параметрами ячейки а = 38.43 А, Ь = 38.36 А, с = 62.00 А, р = 101.47°. Асимметричная часть ячейки содержит одну молекулу белка; 42% объема ячейки приходится на растворитель.

Структура малой субъединицы была определена методом молекулярного замещения с использованием в качестве поисковой модели структуры каталитического домена никующей эндонуклеазы.

Структура малой субъединицы

Структура малой субъединицы (код в банке белковых структур РЭВ -2Р14), представленная на рис. 10, обнаруживает высокое сходство со структурой каталитического домена никующей эндонуклеазы. Структура малой субъединицы представлена р-листом, состоящим из 5 тяжей, окруженного а-спиралями. Такая структура типична для большинства эндонуклеаз рестрикции.

а/р-коровый мотив

Малая субъединица

Тсположя укладки

Рис. 10. Сравнение пространственных структур и топологии укладки структурных элементов малой субъединицы и каталитического домена никующей эндонуклеазы. Желтым цветом обозначены (Ь-тяжи, красным - а-спирали, которые, предположительно, участвуют во взаимодействии с ДНК. Ь - петля в малой субъединице.

Примечательно, что в структуре малой субъединицы есть протяженная петля (16 аминокислотных остатков). Петли такой протяженности в каталитическом домене никующей эндонуклеазы отсутствуют. Протяженные петли в структурах гомодимерных эндонуклеаз, как правило, участвуют во взаимодействии между мономерами. Возможно, что эта петля также участвует в формировании контактов с каталитическим доменом никующей эндонуклеазы.

Организация активного центра малой субъединицы представлена на рис. 11. Характерным мотивом каталитического центра эндонуклеаз рестрикции является последовательность РБ....(0/Е)ХК. Особенностью активного центра малой субъединицы является наличие в нем трех отрицательно заряженных аминокислотных остатков (Б60, Е73 и Е86), тогда как в известных эндонуклеазах рестрикции всегда присутствуют два отрицательно заряженных остатка и один положительно заряженный остаток (как правило, лизин). Основанием для отнесения этих остатков к каталитическому центру является с одной стороны их аналогичное положение соответствующим остаткам в активном центре никующей эндонуклеазы А5р60/Азр456, С1и73Л31и469, 01и86/Ии482 (рис. 10Б) и с другой стороны - участие в катализе указанных аминокислотных остатков никующей эндонуклеазы подтверждено мутагенезом [Ш^пв & а!., 2001].

Несмотря на значительное сходство по аминокислотным остаткам, формирующим активные центры малой субъединицы и никующей эндонуклеазы, следует отметить некоторые отличия в их организации. Активный центр малой субъединицы включает две молекулы воды (022 и 017), а никующей эндонуклеазы - одну молекулу воды (02227). Наличие двух молекул воды в активном центре малой субъединицы косвенно указывает на участие в катализе двух ионов М§2+.

■

4 У470

А450 >

Ц,

W2227 и

Э456

Е482

Е469

< 0452

Н489~

Б

Рис. 11. Структура каталитического центра и его окружения (А) никующей эндонуклеазы и (Б) малой субъединицы. Пунктиром обозначены водородные связи.

Сайт-направленный мутагенез никующей эндонуклеазы

Для дальнейшего выяснения характера взаимодействия между малой субъединицей и никующей эндонуклеазой нами была поставлена задача, определить, будет ли малая субъединица расщеплять нижнюю цепь ДНК, если в большой субъединице будет инактивирован каталитический центр. Для ингибирования каталитического центра никующей эндонуклеазы были выбраны два аминокислотных остатка глутаминовая кислота 418 (Е418А) в одной мутантной форме и аспарагиновая кислота 456 (Б456А) - в другой.

Замены аминокислотных остатков на аланин были введены в ген никующей эндонуклеазы при помощи ПЦР, полученные ПЦР-продукты клонировали в вектор рЕТ28с. Рекомбинантными плазмидами рЕТ28/№скти1Е и рЕТ28/№скт1ЛБ трансформировали клетки Е.соН

КоуаВ1ие(БЕЗ)/р]1А11Е/М85с. Рекомбинантные плазмиды были выделены и секвенированием подтверждено наличие заданной замены нуклеотидов в каждой из них и отсутствие ошибок. Выделение белка в обоих случаях проводили на гепарин-сефарозе с последующей очисткой на №-ЭТА-агарозе, так же как нативную никующую эндонуклеазу.

На рис. 12 показано, что замены Б456А в одной мутантной никующей эндонуклеазе и Е418А - в другой действительно привели к потере никующей активности (дорожки 4 и 6) при сохранении способности к связыванию с ДНК. Однако ожидаемого расщепления ДНК по нижней цепи малой субъединицей в присутствии мутантных форм никующей эндонуклеазы не наблюдалось (дорожки 5 и 7). Эти данные свидетельствуют о том, что в результате каждой из замен в структуре никующей эндонуклеазы происходят такие изменения, которые приводят к нарушению контактов малой субъединицы с никующей эндонуклеазой.

M 1 2 3 4 5 6 7 (н. п. я^и^^дидиидящвиияиияр^ищии

21001900.

1300 1200

Рис. 12. Электрофорез в 0,8%-ном агарозном геле. 1 - ДНК фага Т7 без обработки ферментами; 2 - ДНК фага Т7 + никующая эндонуклеаза; 3 -ДНК фага Т7 + никующая эндонуклеаза + малая субъединица; 4 - ДНК фага Т7 + никующая эндонуклеаза D456A; 5 -ДНК фага Т7 + никующая эндонуклеаза D456A + малая субъединица; 6 - ДНК фага Т7 + никующая эндонуклеаза Е418А; 7 - ДНК фага Т7 + никующая эндонуклеаза Е418А + малая субъединица. M - маркер длин фрагментов ДНК (числа справа - длины фрагментов в н.п. ).

Тот факт, что единичная мутация приводит к нарушению взаимодействия малой субъединицы с никующей эндонуклеазой, оказался неожиданным, но чрезвычайно важным, т.к. он открыл возможность попытаться выяснить, каковы те изменения в структуре мутантных никаз, которые приводят к потере контактов малой субъединицы с никазой. С этой целью нами была поставлена задача - определить пространственную структуру мутантной никующей эндонуклеазы D456A. Предполагалось, что условия кристаллизации мутантного фермента не будут отличаться от тех условий, при которых были получены кристаллы нативной никующей эндонуклеазы.

Действительно, кристаллы D456A мутантной никующей эндонуклеазы были получены в тех же условиях, что и кристаллы нативной никующей эндонуклеазы. В силу чрезвычайно малых размеров полученных кристаллов (~Юмкм), набор дифракционных данных был отснят с использованием микрофокусного пучка станции ID14-2 (ESRF, Grenoble). Вначале сьемки кристаллы дифрагировали до 2.5 Â, однако, из-за радиационного повреждения в процессе сьемки полный набор данных был получен с разрешением 3.2 Â. Кристаллы принадлежат пространственной группе P212i2i с параметрами

ячейки а = 58.90 А, Ь = 87.80 А, с= 118.96 А. Структура была решена методом молекулярного замещения с использованием в качестве исходной модели структуры нативной никующей эндонуклеазы.

Несмотря на относительно невысокое разрешение, на картах разностной плотности вдоль петли от Б456 до Н449 присутствовал набор статистически достоверных разностных пиков, самый сильный из которых при Н449 свидетельствовал о его новой альтернативной конформации. Из-за низкого разрешения нельзя интерпретировать конформационные изменения, произошедшие в этой петле, однако есть все основания предполагать, что аминокислотные остатки этой петли участвуют в формировании контактов малой субъединицы с никующей эндонуклеазой.

ВЫВОДЫ:

1. Показано, что открытая рамка считывания, прилегающая в геномной ДНК Bacillus species D6 к гену никующей эндонуклеазы N.BspD6I, кодирует белок, который вместе с никующей эндонуклеазой образует гетеродимерную эндонуклеазу рестрикции нового типа BspDöI. В отличие от известных гетеродимерных эндонуклеаз рестрикции одна из субъединиц эндонуклеазы рестрикции BspD6I вне комплекса со второй (малой) действует как никующая эндонуклеаза.

2. Сконструирован штамм-суперпродуцент малой субъединицы, который позволил нарабатывать в препаративных количествах малую субъединицу с чистотой более 95%.

3. Малая субъединица вне комплекса с большой субъединицей не связывается с ДНК и не проявляет эндонуклеазной активности.

4. Получены кристаллы малой субъединицы и определена ее пространственная структура с разрешением 1,5 Ä. Установлена пространственная организация активного центра малой субъединицы.

5. Определена пространственная структура мутантной никующей эндонуклеазы D456A и выявлен предположительный участок взаимодействия малой субъединицы с никующей эндонуклеазой.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Юнусова. А.К., Рогулин, Е.А., Артюх, Р.И.,. Железная, JI.A, Матвиенко, Н.И. (2006). Белок, кодируемый открытой рамкой считывания, расположенной рядом с геном никазы BspD6I, в комплексе с никазой образует эндонуклеазу рестрикции. Биохимия. 71(7). С. 1002-1005.

2. Kachalova G.S., Yunusova А.К.. Artyukh R.I., Rogulin E.A., Perevyazova T.A., Zheleznaya L.A., Matvienko N.I., and Bartunik H.D. (2007). Crystallization and preliminary X-ray difraction analysis of the small subunit of the heterodimeric restriction endonuclease R.BspD6I. Acta Crystallographica. F63. P. 795-797.

3. Kachalova G.S., Rogulin E.A., Yunusova A.K., Artyukh R.I., Perevyazova T.A., Matvienko N.I., Zheleznaya L.A., and Bartunik H.D. (2008). Structural analysis of the heterodimeric Type IIS restriction endonuclease R.BspD6I acting as a complex between a monomeric site-specific nickase and a catalytic subunit. J. Mol. Biol. 348. P. 489-502.

4. Kachalova G.S., Rogulin E.A., Yunusova A.K., Artyukh R.I., Perevyazova T.A., Zheleznaya L.A., Matvienko N.I., Bartunik H.D. (2007). Structures of large and small subunits of new type of heterodimeric restriction endonuclease, R.BspD6I. ECM24 (24 European Crystallographic Meeting, Marrakesh, 22-27 August).

5. Юнусова A.K.. Артюх Р.И., Перевязова T.A., Железная Л.А. (2007). Особенность взаимодействия субъединиц гетеродимерной эндонуклеазы рестрикции R.BspD6I. 11-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. С. 125.

6. Перевязова Т.А., Качалова Г.С., Юнусова А.К.. Артюх Р.И., Рогулин Е.А., Железная Л.А., Матвиенко Н.И., Бартуник Х.Д. (2007). Кристаллизация и структурные параметры кристаллов малой субъединицы гетеродимерной эндонуклеазы рестрикции R.BspD6I. 11-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. С. 106.

Подписано в печать 05.11.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ №1098 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Юнусова, Альфия Кяшафовна

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общее представление о системах рестрикции-модификации.

1.2. Системы рестрикции-модификации типа I

1.3. Системы рестрикции-модификации типа III.

1.4. Системы модификации-рестрикции типа IV

1.5. Системы рестрикции-модификации типа II.

1.5.1. Общее представление о системах рестрикции-модификации типа II.

1.5.2. Эндонуклеазы рестрикции типа II.

1.5.3. Стратегии взаимодействия эндонуклеаз рестрикции типа II с ДНК.

1.5.4. ДНК-метилтрансферазы систем рестрикциимодификации типа II.

1.5.5. Никующие эндонуклеазы.

1.5.6. Гетеродимерные эндонуклеазы рестрикции тип ИТ).-.

1.5.7. Пространственная структура никующей эндонуклеазы N.BspD6l

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

II.1. Материалы.

II. 2. Методы.

Рестрикция.

Лигирование.

Включение метки в 5'-концы ДНК

Электрофорез в агарозном геле

Электрофорез белков в ПААГ

Торможение в геле

ПЦР-амплификация.

Очистка фрагментов ДНК

Получение компетентных клеток E.coli и трансформация клеток.

Выделение плазмидной ДНК для последующего автоматического секвенирования.

Индукция экспрессии генов в клетках Е. coli.

Определение титра фага.

Проверка способности фага АСЕ6 активировать транскрипцию с промотора фага Т7.

Получение штамма-продуцента малой субъединицы

Выделение малой субъединицы

Выделение никующей эндонуклеазы N.BspD6I.

Определение активности никазы

Секвенирование ДНК.

Точки расщепления на ДНК эндонуклеазой рестрикции R.BspD6l.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

III. 1. Клонирование открытой рамки считывания, прилегающей к гену никазы.

111.2. Выделение продукта открытой рамки считывания.

111.3. Анализ активности продукта открытой рамки считывания.

III. 4. Характеристика малой субъединицы.

II 1.5. Кристаллизация малой субъединицы.

111.6. Структура малой субъединицы

111.7. Сайт-направленный мутагенез никазы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Малая субъединица гетеродимерной эндонуклеазы рестрикции нового типа BspD61"

Эндонуклеазы рестрикции узнают в ДНК короткую (4-8 н.п.) специфическую последовательность и расщепляют ДНК по двум цепям в фиксированном положении относительно узнаваемой последовательности. Эндонуклеазы рестрикции - одно из наиболее многочисленных семейств, насчитывающее около 3900 биохимически охарактеризованных представителей и приблизительно такое же количество, существование которых предсказано на основе биоинформационного анализа последовательностей ДНК, представленных в GenBank. Это чрезвычайно быстро эволюционирующее семейство, что проявляется в необычном разнообразии стратегий, используемых эндонуклеазами рестрикции для расщепления ДНК по двум цепям. Так, эндонуклеазы рестрикции, узнающие симметричную (палиндромную) последовательность, взаимодействуют с этой последовательностью в виде гомодимера. Эндонуклеазы рестрикции, узнающие несимметричную последовательность, часто взаимодействуют с ней в виде мономера, однако расщепление ДНК происходит только после димеризации мономеров, связанных с двумя разными копиями сайтов.

В последние годы были выявлены два новых типа эндонуклеаз рестрикции - двухсайтовые и гетеродимерные. Двухсайтовые эндонуклеазы рестрикции взаимодействуют с ДНК в виде мономера, который содержит два каталитических центра. Один каталитический центр расщепляет верхнюю цепь ДНК, другой - нижнюю. Гетеродимерные эндонуклеазы рестрикции состоят из двух различных субъединиц, каждая из которых содержит по одному каталитическому центру и каждая из которых расщепляет «свою» цепь ДНК.

Двухсайтовые и гетеродимерные эндонуклеазы рестрикции явились основой для конструирования нового типа ферментов -никующих эндонуклеаз. Эти эндонуклеазы, подобно эндонуклеазам рестрикции, узнают в ДНК короткую специфическую последовательность и, подобно же эндонуклеазам рестрикции, расщепляют ДНК в строго фиксированном положении относительно узнаваемой последовательности. Но в отличие от эндонукулеаз рестрикции никующие эндонуклеазы расщепляют только одну из цепей ДНК. Никующие эндонуклеазы стали важным инструментом молекулярной биологии. На их основе уже создан ряд новых биотехнологических методов. Предполагается, что некоторые проблемы нанотехнологий на основе ДНК могут быть решены с применением этих ферментов.

Никующие эндонуклеазы были открыты вначале как самостоятельные ферменты. Предполагалось, что они являются природно мутировавшими эндонуклеазами рестрикции, которые утратили способность к димеризации и, как следствие, способность расщеплять ДНК по двум цепям. В представленной работе впервые показано, что никующие эндонуклеазы являются одной из субъединиц (большой) гетеродимерных эндонуклеаз рестрикции. Настоящая работа посвящена изучению свойств и определению пространственной структуры малой субъединицы гетеродимерной эндонуклеазы рестрикции BspD6I.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I.1. Общее представление о системах рестрикциимодификации

Явление рестрикции-модификации ДНК впервые было обнаружено в начале 50-х годов прошлого века при изучении размножения бактериофагов в клетках различных штаммов бактерий [Luria et al., 1952; Bertani et al. , 1953]. При исследовании закономерности размножения фага К в клетках Е.coli было замечено, что выход фагового потомства резко снижается при замене одного штамма E.coli на другой. При повторном размножении, фаговых частиц в новом хозяине выход фага достигает нормального уровня. Длительное время этот факт рассматривался как пример адаптивной изменчивости, и только в 1962 году было доказано, что в бактериях действуют специфические ферменты, способные отличать «свою» (бактериальную) ДНК от «чужой» (фаговой) [Arber et al., 1962]. За ограничение (англ., restriction) размножения фагов в бактериальной клетке отвечает эндонуклеаза рестрикции, узнающая специфическую последовательность в ДНК и гидролизующая ДНК по обеим цепям. Защиту хозяйской ДНК от автогидролиза обеспечивает ДНК-метилтрансфераза, которая узнает ту же последовательность, что эндонуклеаза рестрикции, и метилирует по одному основанию (аденин или цитозин) в каждой цепи узнаваемой последовательности. Эндонуклеаза рестрикции, как правило, расщепляет двунитевую ДНК только в тех случаях, если ни в одной из цепей соответствующие основания узнаваемой последовательности не модифицированы.

Совокупность двух активностей - эндонуклеазной и ДНК-метилтрансферазной - получила название «система рестрикции-модификации». Таким образом, системы рестрикции-модификации являются последним барьером на пути проникновения чужеродной ДНК в клетку и рассматриваются как примитивная иммунная система бактериальной клетки.

Системы рестрикции-модификации очень распространены у бактерий. Среди более 4 00 геномов бактерий и архей, секвенированных на сегодняшний день, 80% содержат системы рестрикции-модификации, а около 75% из них имеют более одной системы. Больше всего систем рестрикции-модификации обнаружено у Helicobacter pylori J99, этот штамм содержит 23 системы [Tomb et al., 1997; Kong et al., 2000].

Впервые ферменты рестрикции-модификации были выделены и охарактеризованы из Haemophilus influenzae и E.coli в 1968 г. [Linn et al., 1968, Meselson et al., 1968]. Эти ферменты расщепляли ДНК без образования гомогенных фрагментов. В 1970 г. Смит с соавторами из Haemophilus influenzae выделили эндонуклеазу рестрикции, которая расщепляла ДНК с образованием гомогенных фрагментов [Smith et al., 1970]. Эндонуклеазы рестрикции с такими свойствами стали основой методов генной инженерии, что привело к революции в молекулярной биологии.

Последовавший после 1970 г. стремительный рост количества различных систем рестрикции-модификации и их разнообразие заставило ввести специальную номенклатуру [Smith et al., 1973].

В название системы входят первая буква рода бактерии, две первых буквы вида, серотипа или экстрахромосомного элемента, кодирующего систему, и номер системы в порядке ее обнаружения в штамме, например EcoRV.

В зависимости от локализации эндонуклеазной и метилазной активностей (на сложном белковом комплексе, на одной полипептидной цепи или на разных белках), от специфичности (узнаваемая последовательность), от характера расщепления ДНК, а также кофакторов, необходимых для проявления активностей, системы рестрикции-модификации разделяют на четыре типа. Особое внимание в обзоре будет уделено системам типа II, а системы рестрикции-модификации типа I, III и IV будут описаны кратко.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Юнусова, Альфия Кяшафовна

ВЫВОДЫ:

1. Показано, что открытая рамка считывания, прилегающая в геномной ДНК Bacillus species D6 к гену никующей эндонуклеазы N.BspD6I, кодирует белок, который вместе с никующей эндонуклеазой образует гетеродимерную эндонуклеазу рестрикции нового типа BspD6l. В отличие от известных гетеродимерных эндонуклеаз рестрикции одна из субъединиц эндонуклеазы рестрикции BspD6I вне комплекса со второй (малой) действует как никующая эндонуклеаза.

2. Сконструирован штамм-суперпродуцент малой субъединицы, который позволил нарабатывать в препаративных количествах малую субъединицу с чистотой более 95%.

3. Малая субъединица вне комплекса с большой субъединицей не связывается с ДНК и не проявляет эндонуклеазной активности.

4. Получены кристаллы малой субъединицы и определена ее пространственная структура с разрешением 1,5 А. Установлена пространственная организация активного центра малой субъединицы.

5. Определена пространственная структура мутантной никующей эндонуклеазы D4 56A и выявлен предположительный участок взаимодействия малой субъединицы с никующей эндонуклеазой.

IV.ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, нами установлено, что белок (21.6 кДа), кодируемый открытой рамкой считывания, прилегающей в геномной ДНК Bacillus species D6 к гену никующей эндонуклеазы, не связывается с ДНК и не проявляет нуклеазной активности. Однако смесь этого белка с никующей эндонуклеазой действует как гетеродимерная эндонуклеаза рестрикции - одна субъединица (большая, 70.8 кДа) расщепляет верхнюю цепь ДНК, другая (малая субъединица, 21.6 кДа) расщепляет нижнюю цепь ДНК. Эта эндонуклеаза рестрикции согласно принятой номенклатуре получила название BspD6I. Она не только пополнила довольно ограниченный список гетеродимерных эндонуклеаз рестрикции, но и расширила спектр свойств гетеродимерных эндонуклеаз. Эндонуклеаза BspD6I оказалась первой гетеродимерной эндонуклеазой, одна из субъединиц которой (большая) в отсутствие второй субъединицы способна узнавать специфическую последовательность в ДНК и вносить разрыв в одну цепь ДНК.

Обнаружение этого нового типа гетеродимерной эндонуклеазы пролило свет и на происхождение никующих эндонуклеаз, которые ранее рассматривались как природно мутировавшие эндонуклеазы рестрикции, утратившие способность к димеризации и, как следствие, способность к расщеплению ДНК по двум цепям. Обнаружение гетеродимерных эндонуклеаз BtsI и BsrDI [Xu et al., 2007] со свойствами, сходными со свойствами BspD6I, свидетельствует о том, что гетеродимерные эндонуклеазы, одна из субъединиц которых в отсутствие второй субъединицы действует как никующая эндонуклеаза, по-видимому, распространены в природе. Однако зарегистрировать наличие гетеродимерных эндонуклеаз в лизатах бактериальных клеток достаточно трудно

Традиционно наличие эндонуклеаз регистрируют по образованию фрагментов ДНК после инкубации субстратных ДНК с лизатом бактериальных клеток. Незначительное количество найденных гетеродимерных эндонуклеаз рестрикции (6), возможно, связано с особенностями их поведения при выделении. Гетеродимерные эндонуклеазы можно зарегистрировать лишь на стадии инкубации субстратной ДНК с лизатом клеток. Однако при последующей очистке они «теряются». Поэтому исследователи дальнейшую работу с таким эндонуклеазами прекращали [Железная и др., 2001; Janulaitis et al., 1998; Heiter et al., 2005]. В настоящее время, когда установлено, что в отсутствие ДНК субъединицы не взаимодействуют друг с другом, стала понятна причина, по которой эти эндонуклеазы «теряются» при выделении. Субъединицы при хроматографии выходят в разных пиках и, соответственно, ни в одном из пиков не удается зарегистрировать эндонуклеазной активности (расщепления субстратной ДНК).

Рассмотрим организацию генов систем рестрикции-модификации, содержащих гетеродимерные эндонуклеазы рестрикции (Рис. 22).

Ври 10!

Зпо М2

92по

Ru +4л.О.

884п.о.

866ло

BbvCI о RV ^7n.O. RB 827ti о * BSOno

BspD6l 13п о

1614(1,0.

560по

BsrDI

Nb(Rt)

1466п о

-1п о r2 -42п о.

U1

-3 чг

653п.о 4

BslI

46л.о

RA -Ш-Oj RB

677л .о.

Э05(1.о

BtSl

353rio. . RB

986fi.o.

Рис . 22. Организация систем рестрикции-модификации, содержащих гены, кодирующие гетеродимерные эндонуклеазы рестрикции. Красные стрелки -гены, кодирующие отдельные субъединицы, зеленые - гены, кодирующие гены ДНК-метилтрансфераз- Цифры над стрелками - со знаком «+» - число н. п между генами субъединиц, с знаком «-» - число н.п., на которое гены субъединицы перекрываются.

В большинстве систем организация сходна. Во-первых, все они, за исключением системы BslI, содержат по два гена ДНК-метилтрансферазы. Наличие двух генов метилаз характерно для систем, которые узнают несимметричную последовательность. Это объясняется тем, что в этом случае последовательности верхней и нижней цепей различаются, поэтому каждую из цепей узнает и метилирует «своя» метилаза. В систему BslI входит одна метилаза, так как система узнает симметричную последовательность. Однако в системах, содержащих две метилазы, гены метилаз по-разному располагаются относительно генов субъединиц, что предполагает разные механизмы регулирования экспрессии генов в разных системах.

Сходство системы обнаруживают и в расположении генов, кодирующих отдельные субъединицы: эти гены ориентированы однонаправлено и почти вплотную прилегают друг к другу. Так, гены субъединиц эндонуклеазы BpulOI отделены друг от друга всего тремя парами нуклеотидов, в системе BspD6l - одним, а в остальных системах они даже перекрываются. В системах BslI и BsrDI последний аденин стоп-кодона ТАА одной из субъединиц входит в инициирующий кодон второй субъединицы. В системе BbvCI все гены, включая метилазные, перекрываются примерно на 6 нуклеотидов. Такая картина расположения генов субъединиц наводит на мысль, что перед нами стадия эволюции, после которой последует полное слияние генов, кодирующих отдельные субъединицы гетеродимерных эндонуклеаз, и возникнут эндонуклеазы рестрикции с двумя каталитическими центрами.

Возможно, однако, что вектор эволюции совсем другой. Так в системе BtsI гены никующей эндонуклеазы и малой субъединицы не просто далеко отстоят друг от друга, но разделены геном метилазы. Тогда картину расположения генов субъединиц во всех остальных системах можно интерпретировать обратным образом, а именно: перед нами картина стадии эволюции, не предшествующая слиянию генов субъединиц, а напротив, стадия, предшествующая полному отделению субъединиц друг от друга.

Последний вариант эволюции систем рестрикции-модификации нам представляется более предпочтительным по следующей причине.

Внесение разрыва в одну цепь ДНК вовлечено в такие важные

95 клеточные процессы, как репликация, рекомбинация и репарация. Поэтому можно предположить, что в бактериальных клетках на основе систем рестрикции-модификации формируются системы, содержащие только никующую эндонуклеазу.

Гетеродимерные эндонуклеазы, как и другие эндонуклеазы рестрикции, используются при конструировании рекомбинантных ДНК. Однако особый интерес они представляют в связи с тем, что на их основе можно создавать (и созданы) никующие эндонуклеазы. Интерес к никующим эндонклеазам связан с их практическим применением. Они позволяют усовершенствовать или упростить некоторые уже существующие методы, такие как сайт-направленный мутагенез [Shortle et al., 1982;, Sayers et al., 1988;, Wang and Hays, 2001], мечение ДНК [Pfannschmidt and Langowski, 1998; Li et al., 2002], изотермическую амплификацию ДНК с замещением цепи [Walker et al., 1992]. На основе никования ДНК уже создан ряд новых биотехнологических методов, таких как изотермическая реакция для амплификации олигонуклеотидов [Van Ness et al., 2003] , амплификация геномной ДНК, построение простейшего линейного мотора [Bath et al., 2005], усиление флуоресцентного сигнала при гибридизации ДНК [Zheleznaya et.al., 2006]. Предполагается, что никующие эндонуклеазы могут быть применены для решения некоторых проблем ДНК-нанотехнологий и ДНК-компьютеров [Zhang et al., 2002., Wang et al., 2001].

Таким образом, никующие эндонуклеазы стали ещё одним инструментом молекулярной биологии. Расширение списка гетеродимерных эндонуклеаз рестрикции с новыми специфичностями, и особенно за счет эндонуклеаз, одна из субъединиц которых является «готовой» никующей эндонуклеазой, будет способствовать прогрессу в этой области науки. В работе выявлена характерная особенность организации систем рестрикции-модификации, содержащих гетеродимерные эндонуклеазы с никующей субъединицей. А именно, наличие двух субъединиц с сильно различающимися молекулярными массами. Это позволит при анализе бактериальных геномов находить гетеродимерные эндонуклеазы, содержащие никующую субъединицу.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Юнусова, Альфия Кяшафовна, Пущино

1. Ahmad, 1., Krishnamurthy, V. and Rao, D.N. DNA recognition by the EcoPl5l and EcoPI modification methyltransferases. Gene, 1995. 157, 143-147

2. Akhtar M.K., Kaderbhai N., Kaderbhai M.A. Growth of Escherihia coli on medium containing glycine increases transformation efficiency. Annal. Biochem. 2000. 277. 273-276.

3. Altschul, S.F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucl. Acids Res. 1997. 25(17). 3389-4020.

4. Arber, W. and Dussoix, D. Host Specificity of DNA Producted by Escherichia Coli: I. Host controlled modification of bacteriophage lambda. J. Mol. Biol. 1962. 5. 18.

5. Bachmair A., Finley D., Varshavsky A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science. 1986. 234(4773). 179-186.

6. Bath, J., Green, S.J. and Turberfield, A.J. A free-running DNA motor powered by a niching enzyme. Angew. Chem. Int. Ed. 20 05. 44. 4358-4361.

7. Beletskaya, I.V., Zakharova, M.V., Shlyapnikov, M.G., Semenova, L.M., Solonin, A.S. DNA methylation at the CfrBI site is involved in expression control in the CfrBI restriction-modification system. Nucleic Acids Res. 2000. 28. 3817-3822.

8. Bellamy, S.R.W., Milsom, S.E., Scott, D.J., Daniels, L.E., Wilson, G.G., Halford, S.E. Cleavage of individual DNA strands by the different subunits of the heterodimeric restriction endonuclease BbvCI. J. Mol. Biol. 2005. 348. 641-653.

9. Bertani, G. and Weigle, J.J. Host controlled variation in bacterial viruses. J. Bacterid. 1953. 65. 113.

10. Bilcock, D.T., Daniels, L.E., Bath, A.J. and Halford, S.E. Reactions of type II restriction endonucleases with 8-base pair recognition sites. J. Biol. Chem. 1999. 274. 36379-36386

11. Bourniquel, A.A. and Bickle, T. A. Complex restriction enzymes: NTP-driven molecular motors. Biochimie. 2002. 84. 1047-1059.

12. Brown, N.L. and Smith, M. A general method for defining restriction enzyme cleavage and recognition sites. Methods Enzymol. 1980. 65. 391-404.

13. Bujnicki, J.M., Radlinska, M. Molecular evolution of DNA-(cytosine-N4) methyltransferases: evidence for their polyphyletic origin. Nucleic Acids Res. 1999. 27. 4501-4509.

14. Bujnicki, J.M., Radlinska, M. Molecular phylogenetics of DNA 5mC-methyltransferases. Acta Microbiol. Pol. 1999. 48. 19-30.

15. Chandrasegaran, S., Smith, J. Chimeric restriction enzymes: What is next? Biol. Chem. 1999. 380. 841-848.

16. Daniels, L.E., Wood, K.M., Scott D.J. and Halford, S.E. Subunit Assembly for DNA Cleavage by Restriction Endonuclease SgrAI. J. Mol. Biol. 2003. 327. 579-591.

17. Davies, G.P., Martin, I., Sturrock, S.S., Cronshaw, A., Murray, N.E., Dryden, D.T.F. On the structure and operation of type I DNA restriction enzymes J. Mol. Biol. 1999. 290. 565579.

18. Deibert, M., Grazulis, S., Sasnauskas, G., Siksnys, V., Huber, R. Structure of the tetrameric restriction endonuclease NgoMIV in complex with cleaved DNA. Nat. Struct. Biol. 2000. 7. 792-799.

19. Dower, W.J., Miller, J.F. and Ragsdale, C.W. High efficiency transformation of E.coli by high voltage electroporation. Nucl. Acids Res. 1988. 16. 6127-6145.

20. Dreier J., MacWilliams M.P., Bickle T.A. DNA cleavage by the type 1С restriction-modification enzyme EcoR124II. J. Mol. Biol. 1996. 264. 722-733.

21. Dryden D.T., Murray N.E., Rao D.N. Nucleoside triphosphate-dependent restriction enzymes. Nucleic Acids Res. 2001. 29. 3728-3741.

22. Dryden D.T.F., Cooper L.P., Thorpe P.H., Byron 0. The in vitro assembly of the EcoKI typel DNA restriction/modification enzyme and its in vivo implication. Biochemestry. 1997. 36. 1065-1076.

23. Ellis D., Dryden D.T.F., Berge Т., Edwardson J.M. and HendersoT R.M. Direct observation of DNA translocation ana cleavage by atomic force microscopy. Nuture Struct.' Biol. 1-999. 6. 15-17.

24. Friedrich Т., Fatemi M., "Gowhar H., Leismann 0. and Jeltsch A. Specificity of DNA binding and methylation by the M.Fo£"I DNA methyltransferase. Biochim. Biophys. Acta. 2000. 1480. 145-159.

25. Fuller-Pace F.V., Bullas L.R., Delius H., Murray N.E. Genetic recombination can generate altered restriction specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1984. 81. 60956099.

26. Fuller-Pace F.V., Murray N.E. Two DNA recognition domains of the specificity polypeptides of a family of type I restriction enzymes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1986. 83. 9368-9372.

27. Hadi S.M., Bachi В., Shepherd J.C.W., Yuan R. , Ineichen K. and Bickle T.A. DNA Recognition and Cleavage by the EcoP15 restriction endonuclease. J. Mol. Biol. 1979. 134 655-666.

28. Heiter D.F., Lunnen K.D. and Wilson G.G. Site-specific DNA-nicking mutant of the heterodimeric restriction endonucclease R. BbvCI. J. Mol. Biol. 2005. 348. 631-640.

29. Higgins L.S., Besnier C., and Kong H. The nicking endonuclease N.BstNBl is close related to type IIS restriction endonucleases Mlyl and PIel. Nucleic Acids' Res. 2001. 29 24 922501.

30. Hsieh, P.-C., Xiao, J.-P., O'Loane, D. , Xu, S.-Y. Cloning, expression, and purification of a thermostable nonhomodimeric restriction enzyme, BslI. Journal of Bacteriology. 2000. 182(4). 945-955.

31. Huai Q., Colandene J.D., Chen Y., Luo F. , Zhao Y., Topal M.D. and Ke H. Crystal structure of Nael-an evolutionary bridge between DNA endonuclease and topoisomerase. EMBO J. 2000. 19. 3110-3118.

32. Humbelin M., Suri В., Rao D.N., Hornby D.P., Eberle H., Pripfl Т., Kenel S. and Bickle T.A. Type III DNA restriction and modification systems EcoFl and £coP15. Mol. Biol. 1988. 200. 23-29.

33. Inoue H., Nojima H. and Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 1990. 96(1) 23-28.

34. Janulailis A., Petrusyte M., Maneliene Z., Klimasauskas S. and Burkus V. Purification and properties of the Ecobll restriction endonuclease and methylase prototypes of a new class (typelV). Nucl. Acids Res. 1992. 20. 6043-6049.

35. Karreman C. and De W.A. Agmenellum quadruplicatum M.AquI, a novel modification methylase. J. Bacteriol. 1990. 172. 266272.

36. Kong H., Lin L-F. , Porter N., Stikel., Byrd D., Posfai J., Roberts R. Functional analysis of putative restriction-modification system genes in the Helicobacter pylori J99 genome. Nucl. Acids Res. 2000. 17. 3216-3223.

37. Kruger D.H., Kupper D. , Meisel A., Reuter M, and Schroeder C. The signficance of distance and orientation of restriction endonuclease recognition sites in viral DNA genome. FEMS Microbiol. Rev. 1995. 17. 177-184.

38. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970. 227. 680-685.

39. Lauster R. , Trautner T. A. and Noyer-Weidner M. Cytosine-specific type II DNA methyltransferases a conserved enzyme core with variable target recognizing domains. J. Mol. Biol. 1989. 206. 305-312.

40. Lee K-F. , Kam K-M. and Shaw P-C. A bacterial methyltransferase М.ЕсоНКЗИ requires two proteins for in vitro methylation. Nucl. Acids Res. 1995. 223. 103-108.

41. Lepikhov K.A., Zheleznaya L.A., Matvienko N.I., Walter J.and Trautner T.A. Characterization of the type IV restrictionmodification system BspLUllIII from Bacillus sp. LU11. Nucleic

42. Acids Res. 2001. 29. 4691-4698.

43. Li Y., Hatfield S., Li J., McMills M. , Zhao Y. and Chen X. Seryl-histidine as an alternative DNA nicking agent in nick translation yields superior DNA probes and hybridizations. Bioorg. Med. Chem. 2002. 10. 667-673.

44. Linn S. and Arber W. A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. I. Purification and general properties. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1968. 59. 1300-1306.

45. Luria S.E. and Human M.L. () A nonhereditary, host-induced variation of bacteria viruses. J. Bacteriol. 1952. 64. 557.

46. Malone Т., Blumenthal R.M. and Cheng X. Structure-guided analysis reveals nine sequence motifs conserved among DNA amino-methyltransferases and suggests a catalytic mechanism for these enzymes. J. Mol. Biol. 1995. 253. 618-632.

47. Meisel A., Bickle T.A., Kruger D.H., Schroeder C. Type III restriction endonucleases translocate DNA in a reaction driven by recognition site-specific ATP hydrolysis. EMBO J. 1995. 14. 2958-2966.

48. Meselson M. and Yuan R. DNA restriction enzyme from E. coli. Nature 1968. 217(134). 1110-1114.

49. Morgan R.D., Calvet С., Demeter M., Agra R. and Kong H. Characterization of the specific DNA nicking activity of restriction endonuclease N.BstNBI. Biol. Chem. 2000. 381 11231125.

50. Murray, N.E. Type I restriction systems: sophisticated molecular machines. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2000. 64, 412434

51. Pfannschmidt C. and Langowski J. Superhelix organization by DNA curvature as measured through site-specificlabeling. J. Mol. Biol. 1998. 275. 601-611.

52. Pingoud A. and Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucl. Acids Res. 2001. 29(18). 3705-3727.

53. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., Wende, W. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. Cell. Mol. Life Sci. 2005. 62. 685-707.

54. Pingoud, A., Jeltsch, A., Maxwell, A., Sherratt, D. Enzymes that keeps DNA under control. EMBO reports. 2001. 21, 271-276

55. Powell L.M., Murray N.E. S-adenosyl methionine alters the DNA contacts of the EcoKI methyltransferase. Nucl. Acids Res. 1995. 23(6). 967-974.

56. Rao D.N., Saha S., Krishnamurthy V. ATP-dependent restriction enzymes. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2000. 64. 1-63.

57. Reich, S., Gossl, D., Reuter, M., Rabe, J.P., Kruger, D.H. Scanning force microscopy of DNA translocation by the type III restriction enzyme EcoPl5l. J. Mol. Biol. 2004. 341. 337-343.

58. Reich, S., Mucke, M., Moncke-Buchner, E., Reuter, M., Kruger. DNA cleavage by the restriction endonuclease EcoP15I. Biochem. Soc. Trans. 2000. 28. A331.

59. Roberts R.J., Belfort M., Bestor Т., et al. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, hominfg endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res. 2003. 31. 1805-1812.

60. Roberts R.J., Vincze Т., Posfai J. and Macelis D. REBASE -restriction enzymes and DNA methyltransferases. Nucl. Acids Res. 2005. 33. 230-232.

61. Roberts R.J., Vincze Т., Posfai J., Macelis D. REBASE -enzymes and genes for DNA restriction and modification. Nucleic Acids Res. 2007. 35. D269-D270.

62. Rosamond J., Edlich B. and Linn S. Elecrton microscopy studies of the mechanism of action of the restriction endonuclease of Escherichia coli B. J. Mol. Biol. 1979. 1239. 619-635.

63. Saha S. and Rao D.N. ATP hydrolysis is required for DNA cleavage by EcoPI restriction enzyme. J. Mol. Biol. 1995. 247. 559-567.

64. Samuelson J.С., Zhu Z. and Xu S. The isolation of strand-specific nicking endonucleases from a randomized Sapl expression library. Nucl. Acids Res. 2004. 32(12). 3661-3671.

65. Sanger, F. , Nicklen, S. and Coulson, A.R. DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. 74.5463-5467.

66. Sasnauskas G., Halford S.E., Siksnys V. How the Bfll restriction e nzyme uses one active site to cut two DNA strands. Proc. Natl. Acad. Soc. USA. 2003. 100. 6410-6415.

67. Sayers J.R., Schmidt W. and Eckstein F. 5'—3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucl. Acids Res. 1988. 16(3). 791-802.

68. Shortle D., Grisafi P., Benkovic S.J. and Botstein D. Gap misrepair mutagenesis: efficient site-directed induction of transition, transversion, and frameshift mutations in vitro. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 1982. 79. 1588-1592.

69. Sistla, S., Rao, D.N. S-adenosyl-L-methionine-dependent restriction enzyme. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2004. 39. 1-19.

70. Smith H.O. and Wilcox K.W. A restriction enzyme fromг

71. Hemophilus influenzae. I. Purification and general properties. J. Mol. Biol. 1970. 51. 379-391.

72. Smith H.O., Nathans D. A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes. J. Mol. Biol. 1973. 81. 419-423.

73. Som S., Friedman S. Regulation of EcoRII methyltransferase: effect of mutations on gene expression and in vivo binding to the promoter region. Nucleic Acids Res. 1994. 22. 5347-5353.

74. Stankevicius K. , Lubis A., Timinskas A., Vaitkevicius D. and Janulaitis A. Cloning and analysis of the four genes coding for Ври 101 restriction-modification enzymes. Nucl. Acids Res. 1998. 26. 1084-1091.

75. Stankevicius, K. , Lubys, A., Timinskas, A. and Janulaitis, A. BpulOl restriction endonuclease is composed of two nonidentical subunits. Biologija. 1996. 2. 51-53.

76. Studier F.W. and Bandyopadhyay P.K. Model for how type I restriction enzymes select cleavage sites in DNA. Proc. Natl. Acad. Sci.US. 1988. 87. 8070-8074.

77. Szczelkun, M.D., Dillingham, M.S., Janscak, P., Firman, K., Halford, S.E. Repercussions of DNA tracking by the type 1С restriction endonuclease EcoR124I on linear, circular and catenated substrates. EMBO J. 1996. 15. 6335-6347.

78. Szczelkun, M.D., Janscak, P., Firman, K., Halford, S.E. Selection of non-specific DNA cleavage sites by the type 1С restriction endonuclease EcoR124I. J. Mol. Biol. 1997. 271. 112-123.

79. Tao Т., Bourne J.C., Blumental R.M. A family of regulatory genes accosiated with Type II restriction-modificationsystems. J. Bacteriol. 1991. 173. 1367-1375.

80. Tomb, J.F., White, Q., Kerlavage, A.R. The complete genome sequence of the gastric payhogene. Helicobacter pylor. Nature,1997. 388, 539-547

81. Topal M.D., Thresher R.J., Conrad M. and Griffith J. JVael endonuclease binding to pBR322 DNA induces looping. Biochemistry. 1991. 30. 2006-2010.

82. Van Ness J., Van Ness L.K., Galas D.J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. PNAS. 2003. 100(8). 4504-4509.

83. Vanamee, E.S., Berriman, J., Aggarwal, A.K. An EM view of the Fokl senaptic compltx by single partical analysis. J. Mol. Biol. 2007. 370. 207-212.

84. Vanamee, E.S., Santagata, S. and Aggarwal, A.K. Fokl requires two specific DNA sites for cleavage. J. Mol. Biol. 2001. 309. 69-78.

85. Vanamee, E.S., Viadiu, H., Kucera, R. , Dorner, L., Picone, S., Schildkraut, I., Aggarwal, A.K. A view of consecutive binding events from structures of tetrameric endonuclease Sfil bound to DNA. Embo J. 2005. 24. 4198-4208.

86. Verdine G.L. The flip side of DNA methylation. Cell. 1994. 76. 197-200

87. Viadiu, H., Aggarwal, A.K. The role of metals in catalysis by the restriction endonuclease BamHI. Nat. Struct. Biol.1998. 5. 910-916.

88. Vijesurier, R.M., Carlock, L., Blumental, R.M., Dunbar, J.C. Role and mechanism of C.PvuII, a regulatory protein conserved among restriction-modification systems. J. Bacteriol. 2000. 182. 477-487

89. Walker, G.T., Little, M.C., Nadeau, J.G. and Shank, D.D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. Proc. Natl. Acad. Scl. U.S.A. 1992. 89. 392-396.

90. Wang, H. and Hays, J.B. Simple and rapid preparation of gapped plasmid DNA for incorporation of oligomers containing specific DNA lesions. Mol. Biotechnol. 2001. 19. 133-140.

91. Xu, Y., Lunnen, K.D. and Kong, H. Engineering a nicking endonuclease N.AlwI by domain swapping. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001. 98. 12990-12995.

92. Yuan, R., Hamilton, D.L., and Burckhardt, J. DNA translocation by restriction enzyme from E.coli K. Cell. 1980. 20. 237-244.

93. Zhang, X., Yan, H., Shen, Z. and Seeman, N.C. Paranemic Cohesion of Topologically-Closed DNA Molecules. J. Am. Chem. Soc. 2002. 124. 12940-12941.

94. Zhou, X.E., Wang, Y., Reuter, M. , Mucke, M. , Kruger, D.H., Meehan, E.J., Chen, L. Crystal structure of Type HE restriction endonuclease EcoRII reveals an autoinhibition mechanism by a novel effector-binding fold. J. Mol. Biol. 2004. 335. 307-319.

95. Zhu, Z., Samuelson, J.C., Zhou, J., Dore, A. and Xu, S-Y. Engineering strand-specific DNA nicking enzymes from the type IIS restriction endonucleases Bsal, BsmBI, and BsmAI. J. Mol. Biol. 2004. 237. 573-583.

96. Абдурашитов M.A., Беличенко O.A., Шевченко А.В., Дегтярев C.X. N.BstSE сайт-специфическая нуклеаза из Bacillus stearothermophilus SE-589. Мол. Биол. 1996. 30. 1261-1267.

97. Васильева Л.Ю., Железная Л.А., Матвиенко Н.И. Клонирование и экспрессия новой сайт-специфической метилтрансферазы M.SscLlI из Staphylococcus sp. L1. Биохимия. 2000. 65. 665-671.

98. Гололобова Н.С., Охапкина С.С., Абдурашитов М.А., Дегтярев С. X. Первичная структура оперона NM.BstSEI из Bacillus stearothermophilus SE-589, продуцента сайт-специфической никазы N.BstSEI. Мол. биол. 2005. 39. 960-964.

99. Дедков B.C., Абдурашитов М.А., Янковский Н.К., Килева Е.В., Мякишева Т.В., Попиченко Д.В., Дегтярев С.Х. Новая сайт-специфическая ДНК-никаза N.Bst9I Bacillus stearothermophilus 9. Биотехнология. 2001. 4. 3-8.

100. Железная Л.А., Перевязова Т.А., Альжанова Д.В., Матвиенко Н.И. Сайт-специфическая никаза из штамма Bacillus species D6. Биохимия. 2001. 66. 1215-1220.

101. Железная Л.А., Перевязова Т.А., Железнякова Е.Н., Матвиенко Н.И, Некоторые свойства сайт-специфической никазы BspD6l и возможность ее применения для гибридизационного анализа ДНК. Биохимия. 2002. 67. 1215-1220.

102. Ковалевская Н.П., Железная J1.A., Зелинская Н.В., Матвиенко Н.И. Новый термофильный штамм Bacillus coagulans продуцент сайт-специфической эндонуклеазы BcoKI. Микробиология. 1994. 63. 235-238.

103. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

104. Перевязова Т.А., Рогулин Е.А., Железная JI.A., Матвиенко Н.И. Клонирование и секвенирование сайт-специфической никазы N.BspD6I. Биохимия. 2003. 68. 1203-1207.

105. Рогулин Е.А. Никующая эндонуклеаза N.BspD6l: определениепространственной структуры и применение для гибридизационногоанализа. Дисс. . к.б.н. Пущино, 2006. С. 130.

106. Рогулин Е.А., Перевязова Т.А., Железная Л.А., Матвиенко Н.И. Плазмида pRARE в качестве вектора для клонирования при получении суперпродуцента сайт-специфической никазы N.BspD6I. Биохимия. 2004. 69. 1381-1387.

107. Свадьбина И.В., Матвиенко Н.Н., Железная JI.A., Матвиенко Н.И. Определение оснований, метилируемых метилазами BcoKIA и BcoKIB в сайте 5/-CTCTTC-3//5/-GAAGAG-3/. Биохимия. 2005. 70. 1363-1366.

108. Юнусова A.JI., Рогулин Е.А., Артюх Р. И., Железная JI.A, Матвиенко Н.И. Белок, кодируемый открытой рамкой считывания, расположенной рядом с геном никазы BspD6I, в комплексе с никазой образует эндонуклеазу рестрикции. Биохимия. 2 006. 71. 1002-1005.9