Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика новых сайт-специфических эндонуклеаз и метилаз из штаммов BACILLUS SPECIES IS4, BACILLUS SPECIES ST5 и ACINETOBACTER SPECIES M

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика новых сайт-специфических эндонуклеаз и метилаз из штаммов BACILLUS SPECIES IS4, BACILLUS SPECIES ST5 и ACINETOBACTER SPECIES M"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Р Г Б ОД ИМ М.В.Ломоносова

1 8 MAP

на правах рукописи

ЗЕЛИНСКАЯ НАТАЛИЯ ВЯЧЕСЛАВОВНА

УДК 577.152.312'14

ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЭНДОНУКЛЕАЗ И ИЕТИЛАЗ ИЗ ШТАММОВ BACILLUS SPECIES IS4, BACILLUS SPECIES ST5 И ACINETOBACTER SPECIES M

03.00.03. - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2995

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Н.И.Матвиенко

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Е.С.Громова, доктор биологических наук М.Д. Кирнос

Ведущая организация - Институт биохимии и физиологии

на заседании Специализированного совета Д 053.03.07. при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, Биологический факультет ИГУ, корпус "А".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета НГУ

микроорганизмов РАН

Защита состоится

1996 года в

часов

Автореферат разослан

года.

Ученый секретарь Специализированного совета

/

канд. хим. наук В. Н. Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Открытие в конце 60-х годов сайт-специфических эндонуклеаз (рестриктаз) оказало значительное влияние на исследование нуклеиновых кислот. Сайт-специфические эндонуклеазы типа II (КФ 3.1.21.4) благодаря своей способности узнавать строго определенные последовательности нуклеотидов находят широкое применение в работах по генной инженерии. Несмотря на то, что имеется уже большой набор сайт-специфических эндонуклеаз, поиск их продолжается с целью найти ферменты с новыми специфичностяии, а также обнаружить аналоги уже известных рестриктаз, отличающиеся более высоким выходом фермента либо большей стабильностью при хранении.

Системы модификации-рестрикции состоят из двух компонентов: сайт-специфических эндонуклеаз и соответствующих им метилаз. Однако только для небольшого числа эндонуклеаз, выделенных к настоящему времени, доказана их принадлежность к системам модификации-рестрикции, поскольку метилазы, соответствующие сайт-специфическим эндонуклеазам, в большинстве подобных работ на выделялись. Это объясняется тем обстоятельством, что именно сайт-специфические эндонуклеазы являются основными инструментами при конструировании рекомбинантных ДНК, практическое же использование сайт-специфических метилаз весьма ограничено. Однако в последнее время наблюдается растущий интерес к сайт-специфическим метилазам, обусловленный главным образом успехами в изучении механизма метилирования ДНК.

Таким образом, задача поиска новых продуцентов рестриктаз и метилаз остается актуальной и в настоящее время. Особый интерес представляют эндонуклеазы типа IIS, поскольку они расщепляют ДНК на некотором расстоянии от сайта узнавания и образующиеся фрагменты обладают большим набором различных концов. Эти обстоятельства позволяют разработать целый ряд новых методов в технике рекомбинантных ДНК. Однако набор эндонуклеаз типа IIS значительно меньше, чем ферментов, узнающих палиндромные последовательности.

Задача исследования. Задачей исследования было выделение ферментов модификации-рестрикции из штаммов Bacillus species IS4, Bacillus species ST5 и Acinetobacter species M, определение субстратной специфичности выделенных эндонуклеаз и точек расщепления ДНК этими ферментами.

Научная новизна. Разработаны методы очистки до функционально чистого состояния рестриктаз из штаммов В.species IS4, В.species ST5, A. species М и сайт-специфических метилаз из штаммов В.species IS4 и В. species ST5. Определены субстратная специфичность и точки расщепления ДНК для эндонуклеаз BspIS4I, 0spST5I и AspKL. Эндонуклеаза BspSTSI узнает на ДНК последовательность 5'-GCATC-3' и расщепляет ДНК в стороне от сайта узнавания на расстоянии s и 9 или 5 и 10 нуклеотидов в зависимости от нуклеотидного окружения сайга на ДНК. Рестриктаза BspSTSI является изомером эндонуклеазы Sfa N1, но отличается от нее по характеру расщепления ДНК. Выделенная из штамма В.species ST5 адениновая кетклаза защищает ДНК от последующего расщепления эндонуклеазой BspST5I. Из штакма В.species IS4 выделены оба компонента системы модификации-рестрикции BspIS4I. Метилаза M-BspIS4I относится к аденин-специфичным метилазам. Эндонуклеаза Aspfil является изошизомером эндонуклеазы Stul. Расщепление сайта узнавания 5'-AGGCCT—з' ингибируется dcm-метилированием. ЛэрМ1 находится в растворе в виде мономера с молекулярной массой - 30 кДа.

Практическая ценность работы. Все полученные эндонуклеазы очищены до функционально чистого состояния и могут с успехом быть использованы для физического картирования, клонирования и секвенирования ДНК. Эндонуклеазы BspIS4I и BspSTSI, относящиеся к типу IIS, могут быть с успехом применены дпя создания селектируемых кассет для сайт-специфического мутагенеза, для фракционирования сложной смеси фрагментов ДНК с помощью метода SAGT, для конструирования <возвращающих» векторов, векторов для направленного одностороннего укорачивания интегрированных фрагментов. Выделение сайт-специфических метилаз M-BspIS4I и M-BspST5I открывает возможность полной характеристики систем модификации-рестрикции в штаммах В. species IS4 и В. species ST5. Сайт-специфическая эндонуклеаза ЛгрИ1 является изошизомером рестриктазы Stul. Однако высокий выход эндонуклеазы .AspMI из штамма A.species М (75000 ед. /г биомассы) делает перспективным использование этого штамма в качестве продуцента рестриктазы этой специфичности.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Германо-восточноевропейском совещании по координации в биотехнологии (Пущино, 1-4 июня 1993 г.). Апробация диссертационной работы проведена на объединенном семинаре лабораторий Института белка РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано две работы. Две статьи находятся в печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

Работа изложена на страницах машинописного текста,

содержит 1 таблицу и рисунков. Библиография включает

ссылок.

ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе использовали природные иезофильные и термофильные штаммы, выделенные из различных экологических ниш посевом образцов на твердую питательную среду LB. В качестве субстратных ДНК использовали плазмиды pUC18, pUC19, pBR322, pBRII-8dcm , pBRII-8dcm~, репликативную форму фагов M13tgl31 и M13tgl31-BbvII, ДНК фагов X и Т7. Суперспиральные ДНК были очищены в градиенте CsCl. Фаги Л и Т7 перед выделением ДНК также очищались в градиенте CsCl.

Выделение сайт-специфических эндонуклеаэ и определение их специфичности. Для очистки ферментов проводили хроматографию клеточных экстрактов из 15-SS г клеток на колонках с голубой агарозой, оксиапатитом, гепарин-сефарозой и Mono Q (FPLC) или ДЭАЭ-трисакрилом. Все операции по выделению и очистке ферментов проводили при 4°.

Определение точек расщепления проводили по методу «элонгированного праймера» с использованием одноцепочечных ДНК фагов на основе М13. Для определения точек расщепления ДНК эндонуклеазами BsplSil и BspSTSI использовали сконструированные ранее рекомбинантные фаги М13Над14 и M13D9. Для определения точек расщепления ДНК эндонуклеазой ЛярМ1 был специально сконструирован рекомбинантный фаг на основе M13tgl31 со -троенным полилинкером плазмиды pJRD184 по сайтам XbaX и PstX, торый содержит сайт узнавания для R-^spMI.

Анализ активности сайт-специфических ДНК-хетилаз. Активность сайт-специфической метилазы определяли по защите субстратной ДНК от действия парной сайт-специфической эндонуклеазы.

Для определения метилируемого основания использовали метод Бурьянова, основанный на различной стабильности гликозидной связи

между дезоксирибозой и пуриновыми и пиримидиновыми основаниями в кислой среде. В этих условиях из метилированной и осажденной на стекловолокнистых фильтрах ДНК почти полностью вьпцепляется 6-кетипадекик, тогда как нетилцитозин сохраняется в значительных количествах. В качестве контроля параллельно метилировали pUC19 M-Taql и M-EcoRI (аденин-специфичные метилазы) и ДНК фага А M-iTcoRII и М-РуцЦ (цитоэин-специфичные метилазы).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение сайт-специфических эндонуклеазы и МНК-хетилазы из термофильного штамма Bacillus species IS4I.

Общая схема очистки рестряктазы R-BspIS4I и соответствующей ей метилазы представлена на рис. 1.

Для установления субстратной специфичности R-BspIS4I проводили расщепление ДНК с известной нуклеотидной последовательностью (ДНК фагов Л, M13tgl31 и ДНК плазмид pUCIS и PBR322). Анализ продуктов расщепления показал, что R-£spIS4I дает схему расщепления ДНК фага X и плазмиды pBR322, идентичную той, которая получается при гидролизе этих ДНК рестриктазой BbvII. Кроме того, эта рестриктаза, как и рестриктаза BbvII, не расщепляет ДНК плазмиды pUC18 и фага M13tgl31, в то же время расщепляет ДНК рекомбинантного фага на основе M13tgl31, которая содержит единичный сайт для Bi>vTI. Эти данные показывают, что R-BspIS4I является изомером рестриктазы BbrII.

Для определения точек расщепления R-BspIS4I в качестве матрицы использовали ДНК рекомбинантного фага M13hagl4, которая содержит сайт для узнавания рестриктазы R-BspIS4I вблизи универсального прайнера. На рис. 2 видно, что продукт расщепления ДНК рестриктазой расположен на 6 нуклеотидов ниже сайта узнавания (дорожка 1). После обработки продукта расщепления фрагментом Кленова (дорожка 2) полоса поднимается на 4 нуклеотида выше, следовательно, немеченая нить расщепляется на расстоянии 2 нуклеотидов от сайта узнавания. Таким образом, R-BspIS4I узнает на ДНК последовательность 5'-GAAGAC-3' и расщепляет ее с образованием 5'-выступающих тетрануклеотидных концов. Это показывает, что эндонуклеаза R-BspIS4I является не только изомером, но и изошизомером рестриктазы BbvII.

Оптимальным реакционным буфером для R-BspIS4I является буфер MRB (10 мМ трис-HCl, pH 7,4, 100 мкг/мл альбумин, 10 мМ МдС12, 50

УЗ-Обработка 0,2 [NaCl],M 2,5

Голубая агароза

0,01 [КН РО 1,М

2 4

L Оксиапатит W

6 I 15

50 [NaCl],мМ 1000

L Гепарин-сефароза W

20 [NaCl],мМ 600

DEAE-трисакрил

37 \

0 Ol X [KH PO ],M 1

L Оксиапатит W

1 1 2 1

10 [NaCl],MM 600

L Mono Q W

M-BspIS4I

0,01 [NaCl],И 1

Mono Q

R-BspIS4I

10 [NaCl],mM 500

Mono Q

R-BspIS4I

1

Рис. 1. Общая схема выделения сайт-специфических эндонуклеазы Р-Вэр1341 и метилазы М-В5р1341. Прямоугольниками в масштабе условно показаны градиенты элюирующих буферов. Над ними цифрами указаны исходные и конечные молярности элюирующих растворов. I, -этап нанесения и промывания, VI - промывание колонки после градиента высокосолевым буфером. Нижними прямоугольниками обозначены фракции, содержащие фермент.

мМ N301), Фермент проявляет максимальную активность при температуре инкубации 48°.

Эндонуклеаза Вэр1341 может быть использована для направленного одностороннего укорачивания интегрированного фрагмента ДНК. Для этой цели был сконструирован вектор на основе

1 С Т A G г

,*- 2

Ряс. 2. Определение точек расщепления ДНК эндонуклеазой R-BspIS4I. С, Т, А, G -«секвенирующие» дорожки; 1 продукт полинеразной реакции, расщепленный R-BspIS4I; 2 - тот же продукт после обработки фрагментом Кленова днк-полимеразы I E.coli. Ранкой выделен сайт узнавания рестриктазы R-BspIS4I.

ДНК фага M13tgl31 с уникальным сайтом эндонуклеазы BspIS4I области полилинкера (рис. 3).

BspIS4I

EcoRV

Sstl

С С С G G G Т С Т Т С G А А Т Т

G G G С С С А G А А G С Т Т А А

Smal

EcoRl

-5'

mm

Рис. 3. Нуклеотидная последовательность участка полилинкера вектора на основе ДНК фага M13tgl31 с уникальным сайтом для BspIS4I. Сплошной линией выделен субклонированный фрагмент плазмиды pBBV21, содержащий сайт BspIS4I. Пунктирным прямоугольником отмечен сайт, узнаваемый BspIS4I.

Выделенная из штамма В.species IS4 метилаза M-BspIS4I защищает ДНК от последующего расщепления эндонуклеазой R-BspIS4I. С помощью метода Бурьянова было показано, что M-BsplS4I относится к аденин-специфичным метилазам. В таблице 1 приведены данные по включению трития в ДНК при обработке M-BspIS4I и 4 контрольными метилазами с известной специфичностью. Для метилазы M-BspIS4I процент оставшейся после гидролиза ДНК метки составляет 6,8Х исходной радиоактивности, что соответствует аденин-специфичным

Таблица 1. Определение метилирующей активности M-BspIS4I и

з

M-BspST5I по включению Н в ДНК в реакции

з

энзиматического метилирования с [метил- HJSAM

Метилаза Радиоактивность, имп/мин * у. Метилируемое

до гидролиза HCl после гидролиза HCl основание

M-BspIS4I 2990 205 б ,8 А

M-BspST5I 9054 567 6 ,2 А

М•TaqI 4998 366 7 ,3 А

M-EcoRI 1218 179 14 ,0 А

M-EcoRII 14524 9432 65 ,0 С

M-Prüll 1946 1603 82 4 С

Рис. 4. Определение сайт-специфичности энзиматического метилирования конечным препаратом M-BspIS4I. а - Карта рестрикции рекомбинантного фага на основе ДНК M13tgl31 с единичным сайтом R-BspIS4I. Латинскими буквами обозначены фрагменты расщепления ДНК рекомбинантного фага зндонуклеазоС Prüll в порядке уменьшения длины. Точкой обозначено положение сайта метилирования M-BspIS4I. б - Разделение фрагментов ДНК в 52-ном полиакриламидном геле (дорожка 1 окрашена бромидом этидия; дорожки 2 и 3 использованы для радиоавгографии). 1, 2 ДНК рекомбинантного фага,

предварительно метилированная M-BspIS4I в присутствии [метил- Н]SAM, расщеплена рестриктазой Prüll. Фрагмент В длиной 322 п. о. содержит сайт для BspIS4I. 3 - маркеры длин фрагментов (ДНК фага А, расщепленная Arall; размеры некоторых фрагментов в п. н. приведены справа).

метилазам. Поскольку аденины встречаются в сайте узнавания только в одной нити ДНК, одна из дочерних цепей ДНК некоторый промежуток времени после репликации ножет оставаться ненетилированной по сайту узнавания BspIS4I. По-видимону, защита немодифицированной молекулы ДНК осуществляется с помощью дополнительной метилазы.

Для того чтобы доказать, что метилирование проходит сайт-специфично, метилированную M-BspIS4I в присутствии [метил-3Н]5-аденозилметионина ([метил-3Н]ЗАМ) ДНК рекомбинантного фага на основе M13tgl31 с единичным сайтом BsplSil расщепляли рестриктазой IVuII. При этом образуются три фрагмента с длинами 6835, 322 и 93 нуклеотидов (фрагмент С из-за его малой величины не виден на электрофореграмме) (рис. 4, дорожка 1). При проведении радиоавтографии только фрагмент длиной 322 п.о., несущий сайт узнавания для M-BspIS4I, оказался меченным по тритию (дорожка 2). Следовательно, метилирование проходит сайт-специфично и не является проявлением активности неспецифических метилаз.

Выделение сайт-специфических эндонуклеазы и метилаэы иэ термофильного штамма Bacillus species ST5.

Обшая схема выделения R-BspST5I и M-BspST5I приведена на рис.

5.

Эндонуклеаза BspSTSI дает схему расщепления субстратных ДНК, идентичную той, которая получается при гидролизе этих ДНК рестриктазой SfaNI. В точности совпадают число и размеры фрагментов. Эти данные показывают, что R-BspST5I является изомером эндонуклеазы SiaNX.

При определении точек расщепления эндонуклеазой BspSTSI в качестве матрицы использовали ДНК рекомбинантных фагов М13Над14 и M13D9, которые имеют сайты узнавания BspST5I вблизи универсального праймера. Из рис. 6 видно, что продукт расщепления ДНК фага М13Над14 эндонуклеазой R-BspST5I расположен на 9 нуклеотидов ниже сайта узнавания (дорожка I). После обработки продукта расщепления фрагментом Кленова (дорожка 4) полоса поднимается на 4 нуклеотида выше, следовательно немеченая нить расщепляется на расстоянии 5 нуклеотидов от сайта узнавания. Таким образом, при расщеплении образуются 5'-выступающие тетрануклеотидные концы. Такие же результаты показаны и для эндонуклеазы SfaNX (НПО «Вектор>, Новосибирск) (дорожки 2 и 3). Однако в другом случае, когда в качестве матрицы использовали ДНК фага M13D9, оба фермента расщепляли ДНК в положениях 5 и 10 (рис. 7). Продукты расщепления

2 0 2 3 3 5 40

0,2 [NaCl],M

L Голубая агароза И

1 1 S 1 17

10 [КНгР04],мМ 1000

L НА-Ультрагель W

1 1 17 21 1

50 [NaCl],мМ 800

L Гепарин-сефароза W

1 1 22 26 1

10 [NaCl],ММ 500

L Mono Q W

0,25 [NaCl],M

2,5

Голубая агароза

НА-Ультрагель

50 [NaCl],нН

20 [NaCl],ММ

DEAE-Трисакрил

10 [КН РО 1,мМ 750

800

Гепарин-сефароза

500

R-BspST5I

M-BspST5I

Рис. 5. Общая схема выделения сайт-специфических эндонуклеазы К'ВзрБТБ! и метилазы М-ВгрвТб!. обозначения как на рис. 1.

ДНК фага эндонуклеазами R-BspST5I и SfaNI (дорожки 1 и 2) расположены на 5 нуклеотидов выше последовательности GCATC, после обработки продуктов фрагментом Кленова полосы поднимаются на 5 нуклеотидов выше (дорожки 3 и 4). Таким образом, рестриктазы R-BspST51 и SfaNI узнают на ДНК последовательность 5'-GCATC-3' и расщепляют ДНК в стороне от сайта узнавания на расстоянии 5 и 9 или 5 и 10 нуклеотидов в зависимости от нуклеотидного окружения сайта на ДНК. Прототип эндонуклеазы BspXS4I, S/aNI, выделенный и охарактеризованный фирмой <New England Biolabs» (США), расщепляет

2

L

W

1 2 О А С Т О 3 4

Рис. 6. Определение точек расщепления ДНК

эндонуклеазами R-BspST5I и SfaNI на матрице ДНК рекомбинантного фага

М13Над14. А, С, G, Т -«секвенирующие» дорожки; 1 -продукт полимеразной реакции, расщепленный R-BspST5I; 4 -тот же продукт после обработки фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I E.coli; 2 -продукт полимеразной реакции, расщепленный SfaNI; 3 - тот же продукт после обработки фрагментом Кленова. Рамкой выделен сайг узнавания рестриктаз R-BspST5I и SfaNI.

ДНК по разным цепям на расстояниях 5 и 9 нуклеотидов от узнаваемого сайта. Таким образом, эндонуклеаза К-ВБр5151 является изомером эндонуклеазы SfaNI.

1 2 С Т G А 3 4

\\W\III

ю

с о

Т А

----— А Т

•——-- С G

■— G С

Рис. 7. Определение точек расщепления ДНК эндонуклеазами И-ВэрБТ51 и SfaNI на матрице рекомбинантного фага М1309. обозначения, как на рис. 7.

I 2 3

.562454352272-

Pi

4-A

-b -c

Уы-t

«¡-E

%* -F

W -G

5 и c. 8. Определение сайт-специфичности энзинатического 1етилирования конечным препаратом M-BspSTSI: а - карта рестрикции IHK плазмиды pUC19. Буквами обозначены фрагменты расщепления ДНК тлазмиды эндонуклеазой JíaelII в порядке уменьшения длины. Кругами збозначены точки сайт-специфического метилирования M-BspST5I, б -разделение фрагментов ДНК в 5%-нок ПААГ (в колонках 1 и 2 гель зкрашен бромидом этидия; в колонке 3 приведен радиоавтограф геля): ! - маркеры длин фрагментов (ДНК фага Т7, расщепленная BÜ736I, эазмеры некоторых фрагментов в п. н. приведены слева) ; 2, 3 - ДНК 1лазмиды pUC19, предварительно метилированная M-BspST5I в 1рисутствии [метил-3Н] SAM, расщеплена рестриктазой HaelII. >рагменты А, С, D и Е содержат сайты для BspSTSI

Оптимальный реакционный буфер - HRB (10 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 100 мМ Nací, 100 мкг/мл альбумина). Оптимальная температура инкубации 37-48°.

ДНК-метилаза M-BspST5I, парная R-BspST5I, метилирует адекикы, после кислотного гидролиза ДНК оставшаяся метка составляла 6, 2У. исходной радиоактивности (табл. 1), что соответствует аденин-специфичным кетилазам (TaqX и EcoRI). Полученный препарат метилазы не содержит принесей неспецифических метилаз, что подтверждено следующим экспериментом. Энзиматически метилированную в присутствии [метил-3Н]ЗАМ ДНК плазмиды pUC19 расщепляли рестриктазой НаеШ. Из полученных фрагментов только фрагменты с длинами 267, 298, 434 и 587 п. о. оказались меченными по тритию (рис. 8). Все эти фрагменты содержат сайты узнавания для BspST51.

Выделение сайт-специфической эндонуклеазы из штамма Acinetobacter species М.

Эндонуклеаза R-JspMI, несодержащая примеси неспецифических нукяеаз, была получена после пяти последовательных стадий очистки (рис. 9).

Для установления субстратной специфичности выделенной эндонуклеазы проводили расщепление различных ДНК с известной нуклеотидной последовательностью (ДНК фагов А, Т7 и M13tgl31 и ДНК плазмиды pUC19). Анализ продуктов расщепления показал, что эндонуклеаза .AspMI не расщепляет ДНК плазмиды pUC19 и ДНК фага M13tgl31, а ДНК фага Т7 гидролизует в одной точке, образуя равные по величине фрагменты. После обработки ДНК фага A AspMI образуются семь фрагментов, размеры которых точно совпадают с размерами фрагментов, образующихся при гидролиза ДНК фага А эндонуклеазой Stul. Таким образом, эндонуклеаза .AspMI является изомером эндонуклеазы Stul.

При определении точек расщепления эндонуклеазой AspMl в качестве матрицы использовали ДНК рекомбинантного фага на основе M13tgl31, который имеет сайт узнавания для ЛгрМ1 вблизи универсального праймера. Эндонуклеаза -4spMI узнает на ДНК последовательность 5'-AGGCCT-3' и расщепляет ее как показано стрелкой (рис. 10). обработка продукта расщепления фрагментом Кленова не приводит к изменению положения полосы. Следовательно после расщепления ДНК эндонуклеазой AspMI образуются фрагменты с ступыми» концами. Таким образом. AspMI является изошизокером эндонуклеазы stul.

Оптимальным для эндонуклеазы AspMI является буфер LRB (i0 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl ). Максимальная активность фермента

0,25 [ИаС1], Н 3,5

Голубая агароза

10 [КН2Р04], нН

900

НТР-Биогель

50 [N801], иМ

ТОО

Гепарин- сефароза

100

[ИаС!], мМ 800

Гепарин-сефароза

"Г

Я-АярМ!

ис. 9. общая схема выделения сайт-специфической эндонуклеазы БрМ1. Обозначения как на рис. 1.

роявляется при температуре 48°.

Эндонуклеаза ЛгрМ1 также как и ее изошизомеры, ЯСШ и ЛаС1 увтствительна к сЗст-метилированию. При расщеплении рекомбинантной лазмиды рВКИ-8 эндонуклеазой ВЦ 7361, изошизомером ЕсоЗИ, бразуются четыре фрагмента с длинаки 3093, 2438, 826 и 8 пар снований (не виден) (рис. 11, дорожка 2 и 5). При совместном идролизе эндонуклеазами В.П7361 и ЛгрМ1 фрагмент длиной 826 пар снований расщепляется на два фрагмента размерами 623 и 143 пар

1 Л G С Т 2

ш

Рис. 10. Определение точек

расщепления ДНК эндонуклеазой AspMI на матрице ДНК рекомбинантного фага на основе M13tgl31. А, С, G, Т -«секвенирующие> дорожки; I - продукт полимеразной реакции, расщепленный AspMI; 2 - тот же продукт после обработки фрагментом Кленова

ДНК-полинеразы I E.coli. Рамкой выделен сайг узнавания рестрктазы Лг;рМ1.

оснований (не виден) (дорожка 6). При использовании в качестве субстрата ДНК плазмиды рВ1Ш:-8<1ст+ расщепление сайта ¿эрГЛ ингибируется сЗст-метилированием (дорожка 3).

м

2 3 4 5 6 7

894

U 462

Рис. 11. Чувствительность /грМХ к йсш-метилированию: 1 - исходная ДНК рВИИ-всЗст ; 2 - рВМ1-8с!сЕ1, обработанная Е-Б.1.173б1; 3 рВЕ1Х-8йст , обработанная

Н'ВИ7361+Л5рМХ; 4 - исходная ДНК рВЕ11-8<Зст~; 5 - рвки-8с1спГ, обработанная К-ВИ 7361; 6 рВЕ11-8йст , обработанная

Н-В11736Х+ЛзрМ1; 7 - маркеры длин фрагментов (ДНК фага Л, расщепленная эндонуклеазой

1?-Взр1341; размеры некоторых фрагментов приведены в п. н. справа)

Молекулярную массу эндонуклеазы ЛзрМ1 определяли после пятой стадии колоночной хроматографии по подвижности в 12Х-ном ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия, испопьзуя в качестве маркеров стандартные белки В1А-РШТ (Диа-М, Москва) с молекулярными массами 95, 67, 43, 30, 20 и 14,5 кДа. При проведении гель-фильтрации на колонке с Сефакрил Э200 фермент элюируатся как белок с

б

о eo|-t-i f-ою -

о о о о

2 40-

к

0

1 CL К

п;

Ч 20-

с о

0,3 0,5 0,2 0,6 1,0

Rf

не. 12. Определение молекулярной массы эндонуклеазы ЛярМ1. а -элекулярная масса, определенная по элюирующену объему с колонки с эфакрил Б200. Маркерные белки: 1 ~ 67, 2 - 43, 3 - 25 кДа. б -элекулярная масса, определенная по миграции в денатурирующем V/.- ном ПААГ. Маркерные белки: 1 - 95, 2 - 67, 3 - 43, 4 - 30, 5 -3, 6 - 14,5 кДа.

элекулярной массой -30 кДа (рис. 12). Колонку предварительно шибровали белками: ЕСА (67 кДа), овальбунин (43 кДа), »мотрипсиноген А (25 кДа) и Dextran Blue (свободный объем) и tfP-ala (полный объем).

ВЫВОДЫ

Из штамма Acinetobacter species М выделена и очищена до функционально чистого состояния сайт-специфическая эндонуклеаза R-^spMI. Показано, что фермент узнает на ДНК симметричную последовательность 5'-AGG^CCT-S' и расщепляет ее в середине с

0,1

образованием ступых» концов. Она является изошизомером эндонуклеазы StuI. Расщепление ДНК эндонуклеазой R-AspMI ингибируется dcm-метилированием. R'AspMI находится в растворе в виде мономера с молекулярной массой - 30 кДа.

2. Из термофильного штамма Bacillus species IS4I очищены до

функционально чистого состояния сайт-специфические эндонуклеаза

R*BspIS4I и метилаза M-BspIS4I. R-BspIS4I узнает на ДНК 5'—GAAGAC2N^—3'

последовательность 3<_сттстс6л _5< и расщепляет ее в стороне от сайта узнавания в положениях 2 и 6 с образованием однонитевых тетрануклеотидных 5'-выступающих концов. Она является изошизомером эндонуклеазы Вbrll. M-BspIS4I относится к аденин-специфичным кетклазак.

3. Сконструирован вектор на основе ДНК фага M13tgl31 со вставкой последовательности ДНК, содержащий сайт узнавания для эндонуклеазы рестрикции типа IIS, BspIS4I, для ступенчатого направленного укорачивания интегрированных фрагментов ДНК.

4. Из термофильного штамма Bacillus species ST5 выделены и очищены до функционально чистого состояния сайт-специфические эндонуклеаза R-BspST5I и метилаза M-BspST5I. R-BspST5I узнает на ДНК последовательность 5'-GCATC-3' и расщепляет ее на расстоянии 5 нуклеотидов с З'-конца сайта узнавания и на расстояниях 9 или 10 нуклеотидов по комплементарной нити в зависимости от нуклеотидного окружения сайта на ДНК. Она является изомером эндонуклеазы SfaNI. M-BspST5I относится к аденин-специфичным метилазам.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Зелинская Н. В. , Ковалевская Н. П. , Матвиенко H.H., Железная Л. А. , Матвиенко Н.И. Новые сайт-специфические эндонуклеаза и метилаза из термофильного штамма Bacillus species IS4. - Биохимия, 1995, т. 60, вып. 9, 1435-1449.

2. Зелинская Н. В. , Матвиенко Н. Н. , Железная JI. А. , Матвиенко Н. И. Новая сайт-специфическая эндонуклеаза из Bacillus species ST5I. -Биохимия, 1995, Т. 60, ВЫП. 12, 1706-1717.

3. Зелинская Н. В. , Матвиенко H.H., Железная Л. А. , Матвиенко Н.И. Новая сайт-специфическая адениновая ДНК-метилтрансфераза из штамма Bacillus species ST5I. - Биохимия (в печати).

4. Зелинская Н.В. , Ковалевская Н. П. , Матвиенко H.H., Железная Л. А., Матвиенко Н.И. Новая сайт-специфическая эндонуклеаза из штамма Acinetobacter species М. - Биохимия (в печати).