Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и характеристика новых сайт-специфических эндонуклеаз и ДНК-метилаз из термофильных штаммов Bacillus species LU11, Bacillus species КТ8 и Bacillus species OV

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика новых сайт-специфических эндонуклеаз и ДНК-метилаз из термофильных штаммов Bacillus species LU11, Bacillus species КТ8 и Bacillus species OV"

pre од

- 8 01« «96

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. Ломоносова

на правах рунописи

ЧЕРНОВ АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

УДН 577.152.312 4 4

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЭНДОНУКЛЕАЗ И ДНК- МЕТИЛАЗ ИЗ ТЕРМОФИЛЬНЫХ ШТАММОВ BACILLUS SPECIES LUU , BACILLUS SPECIES KT8 И BACILLUS SPECIES OV.

03. 00. 03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наун

Москва - 1396

Работа выпопнена.в Институте бепка РЛН

Научный руководитель:

локтор биологических наун, профессор Н. И. МАТВИЕННО

Официальные оппоненты:

Локтор биологических наук М. Д. КИРНОС

Локтор биологических наук, профессор Я. И. БУРЬЯНОВ

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Защита диссертации состоится «. 28» 1996 г.

в час ЗО мин на заседании диссертационного совета Л 053. 05. 70 при Московском государственном университете им М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Киологичесного фанультета МРУ им М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_ ¿-Ь »

.1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наун

Н. Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. С,, й г-специфические знычнунлеазы и ДНИ- метилаяы пронариот позволяют клетне отличать собственную ДИН от чужеродной. Вся ДНК клетки после реплинации метилируется ДНК- метилазами в сторого определенных участках. Соответствующие сайт специфические эндонунлеазы отличают ее по наличию лотипированных основании в этих участках от чужеродной неметилиропянной ДНК и не подвергают гидролизу. Эндонунлеазы и ДНИ- мстила:«!, узнающие одну и ту же последовательность образуют систему модификации-рестрикции.

Выделяют три основных класса систем модификации- рестрикции. Наибольший интерес для генетической инженерии представляют Ферменты н-го класса. Несмотря на то, что уже известно более 200 прототипов по узнаваемой последовательности, поисн их изомеров остается весьма актуальным. Некоторые изомеры обладают целым рядом свойств, делающими их более полезными для работ в генетичесной инженерии: повышенной стабильностью при хранении и/или при расщеплении ДНК, меньшей штриховой активностью, большей активностью в экстремальных условиях инкубации. Особый интерес вызывает поиск изомеров в термофильных штаммах бантерий, так как многие белки выделенные из таних бантерий обладают повышенной стабильностью.

Ферменты модификации-рестрикции являются привлекательной моделью для изучения ДНК- белкового взаимодействия, благодаря широкому разнообразию узнаваемой последовательности ДНИ, высокой специфичности и тому обстоятельству, что для многих ферментоп уже известна аминокислотная последовательность.

Интенсивный поиск саИт-специфических эндонуклеаз привел н обнаружению ферментов, не укладывающихся в первоначальную классификацию, состоящую из трех классов. При этом у ферментов модификации- рестрикции обнаруживаются свойства, позволяющие существенно расширить представление об их значении для нлетни.

Научная новизна работы.

1. В термофильном штамме Bacillus species LÜH была обнаружена новая сайт-специфическая эндонунлезза R.ßspLUl 1111, распознающая последовательность 5'-GGGAC-3'. Определны точни ращепления ДНК и некоторые особенности взаимодействия фермента с ДНК. Показано, что данная эндонуклеаза обладает также дополнительной ДНК-метилаэной активностью, что позволяет относить данный фермент н новому, четвертому классу систем модификации-рестринции.

2. Обнаружена и охарактеризована отдельная сайт-специфическая

5С-метилцитозиновая ДНН-метилаза М.BspLUl1111, защищающая

последовательность 5'-GGGaC-3' от расщепления r. BspLUX 11 ; i.

3. Обнаружена и охарактеризована новая сайт-специфическая 6N-метилздениновая ДНК-метилаза M.ßspLUllII, защищающая последовательность 5'-TCTAGA-3' от расщепления R.ßspLUllII.

4. Выделена и очищена сайт- специфическая эндонуклеаза из термофильного штамма Bacillus species КТ8, ноторая узнает и разрезает ДНИ по схеме: 5»-aIagCTT-З'

3'-TTCGA|А-5'

Изучены некоторые физико- хиничесние свойства фермента и свойства, важные с точки зрения практического применения этого термостабильного изошизомера Hin dl II.

5. Из термофильного штамма Bacillus species OV выделены две

сайт-специфические эндонунлеазы ispOVI и BspOVII- BspOVI очищена

до состояния близного н гомогенному. Она узнает

последовательность ДНК и разрезает ее как показано стрелками:

5 '-gacnmnJnngtc-3 ' 3'-ctgnn[nnncag-5',

следовательно является изошизомером £а/п11051. BspOVII очищена до

функционально чистого состояния. Она узнает и разрезает

последовательность:

з-

следовательно, является изошизомером ClaI. Изучены свойства обоих ферментов.

Практическая ценность работы. Все выделенные ферменты получены в виде гомогенных или функционально чистых препаратов, что позволяет использовать их в работах по генетической инженерии. Изошизомеры, выделенные из термофильных штаммов, как правило более стабильны, чем эндонунлеазы- прототипы. Их также отличает ряд других прантичесни ценных свойств. Штамм Bacillus species KT 8 является природным суперпродуцентом изошизомера Hindlll. Неноторые методы, использованные в работе, применялись впервые для данного класса ферментов (определение специфичности метилирования ДНК; определение длины последовательности фланкирующей сайт узнавания и необходимой для связывания).

Апробация работы. Материалы диссертации донладывались на объединенном семинаре лабораторий Института белка РАН, на ГородсноИ научной конференции молодых ученых (Пущино, 1996), на Ежегодной научной конференции Института белка РАН (Пущино, 1996) и на семинаре Института молекулярной генетики Макса Планка (Берлин, Германия, 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

i'-ATlCGAT-З' -ТА<ЗС]ТА-5

Овьем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

Работа изложена на Л32. страницах машинописного тенета, содержит t) таблиц и 12 рисунков. Библиография внлючает ЛЪЪ ссылон.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Очистка и характеристика белков системы модификации-рестрикции BspLUlllîl из штамма Bacillus species LUI 1.

Очистна эндонуклеазы R.BspLUllIII затруднялась присутствием лпух других эндонунлеаз BspLUllI и BspLUllII в штамме Bacillus species LU11. Чтобы отделиться от сопутствующих антивностей и получить препарат белка бпизний к гомогенному понадобилось пять стадий очистки: фракционирование сульфатом аммония, хроматографии на Sephadex G100, голубой агарозе, НТР-биогеле и гепарин-сефарозе.

Для определения узнаваемой последовательности ДНК проводился гидролиз односаИтово расщепленной плазмиды pJRD184 эдонунпеазой R.BspLUllI11. Анализ длин полученных фрагментов с помощью программы Microgene позволил найти мепалиндромную

последовательность 5'-GGGAC-3', соответствующую точкам

расщепления. Длины фрагментов гидролиза различных ДНК с известными последовательностями соответствуют длинам, расчитанным для сайта 5'-GGGAC-3' (Рис.1). Известны две эндонунлеазы, узнающие указанную последовательность - BsmFI и Fin I.

Место расщепления ДНК определялось методом Брауна и Смита. В качестве матричной ДНК использовали одноцепочечную ДНК реномбинантного фага M13hagb38, у которого вблизи от универсального праймера находится последовательность 5* - GGGAC-3'. Авторадиограмма, приведенная на Рис. 2, показывает, что расщепление происходит в двух точках на расстоянии 10 и 11 нукпеотидов от узнаваемой последовательности по 5'- 3' цепи, а также 14 и 15 нунлеотидов по 3'-5'-цепи. Обнаружилось, что вероятность расщепления в обоих точнах практически не зависит от соотношения фермента и субстратной ДЬН (дорожки 1,2 до достройки ненонсним фрагментом, и 3,4 после достройки), что указывает на то, что расщепление в двух точнах - характерное свойство этой эндонуклеазы.

Для определения минимальной длины последовательности, фланкирующей сайт узнавания 5'-GGGAC-3' и необходимой для

Рис. 1. Расшеппение различных субстратных ДНК эндонуклеазой И. ВярЬШПП (К). 1- рВЯ322 + Я; 2- рАСУС184 + Я; 3- М131в131 + й; 4- Т7 + II; 5- рЛЦ)184 + Я; 6- X + И; Маркеры длин фрагментов: М1- Т7 + В /1*7361 ; М2— X + Яг/кПИ.'

Рис. 2.Определение точек расщепления ДНК в стороне от сайта узнавания эндонуклеазой Е.гзрНЛПП. А, С, в, Т- сенвенирующие дорожки; 1,2-продунт полимеразной реанции, расщепленный И. ВврЬиШПв двух разведениях фермента: х 10 их 1; 3, 4- продукты 2 и 1 соответственно после обработки фрагментом Кленова. Стрелнами уназаны места разрывов.

связывания, использовали два типа одноцепочечной ДНК, содержащих сайт 5'-ОСОАС-3' в разных направлениях (Рис. 3, А и Б). ДНК достраивали до двухцепочечноИ формы с помощью фермента Нленова в присутствии дидезоксинунлеотидов. Продунты этой реанции, аналогичной сенвенированию методом Сэнгера, обрабатывались эндонуклеазой К.ВярИЛ 1111. Расщеплялись только те фрагменты, у которых длина двухцепочечного участка была достаточной для связывания фермента с сайтом. Если эпонгируемая цепь несет 5'-концевую метну, то разрезанные фрагменты будут иметь одинаковую длйну и на денатурирующем геле будут выглядеть в виде одной более интенсивной полосы во всех сенвенирующих дорожках. Фрагменты, не взаимодействующие с К-йярШШП видны в виде сенвенирующих дорожек выше точки разрезания. С результате показано, что для связывания и расщепления ДНК ферменту необходимо 24 н. п. с 5'- нонца и 12 н. п. с 3'- конца (Рис.ЗВ).

В отсутствии ионов fig2* эндонунлеаза И. ВзрЫЛП II образует стабильный номпленс с ДНИ, который имеет меньшую элентрофоретичесную подвижность в геле (эффект ретардации). При связывании с белками конформация моленупы ДНК может изменяться и одной из важных характеристик образовавшегося комплекса является угол изгиба моленупы ДНИ. Для определения угла изгиба ДНК использовался специальный вентор рСУ4, с клонированным сайтом 5'-ОвоАС-ЗПосле расцепления этого вектора эндонунпеапами £соШ , ВвШ! и ВалШ получали три типа фрагментов. Эти фрагменты

А.

Б.

5 ■ - с с С A fÁGCTTCTTC f AG 3 • - G с G т [TCGAAGAAGATC

GGGAC CCCTG

С

Т~1

G CGT G СТА G A G СТА С CGC-3 CGCACGATCT С CAT G GCG-5'-* _±_t

ГI

5' - g а с g ГШпсШШ"с1пгс'^тстШсАбвс 3' -CTGC CTAOGGTTC^Jí/^A^J^AJVGTGCG

t-Л__

GTCCC CAGGG

CTAG-3' GATC-5'-*

в. р-т-г

5' -ССА [АС'СГТСТТСТЛО

3• -GGT i_TCGAAGAAGATC.

GGGAC CCCTG

CCeTdc^O^''G~GTA~c''CGCATGCG^TAT-3 '

£Q?A£9AT£X..£.SAT...R..üQ9IA£!S£TÁ ATA- 5 * -« _

Рис. 3. Опредепение длин последовательностей фланкирующих сайт 5'-GGGAC-3', и необходимых для связывания эндонунлеазы R.BspLUl1III. Выделенным шрифтом обозначен сайт узнавания , курсивом выделена минимальная нукпеотидная последовательность, необходимая для связывания эндонунлеазы.

имели однинаковую длину, но различались тем, что сайт узнавания находился на различном расстоянии от края фрагмента. Если в молекулу ДНК вносится изгиб, то он будет локализован на разном расстоянии от нрая и, следовательно, фрагменты будут иметь различную зпентрофоретическую подвижность в геле. После связывания с R.BspLUl1III все фрагменты с замедленной элентрофоретиеской подвижностью мигрировали одинаково. Таким образом, при связывании с ДНК эндонуклеаза R.BspLUl1111 не изменяет угол изгиба ДНК.

Моленулярная масса фермента R.BspLUllIII определялась после пятой стадии колоночной хроматографии электрофоретичесни в 12*-ном попиакриламидном геле в присутствии DS-Na (Рис.4 а). Окрашивание геля выявило одну белковую полосу, соответствующую 93 нДа. Для определения субъединичноИ структуры фермента применяли гепь-хроматографию на нолоние Superóse 12 в системе FPLC (Рис. 46). Фракции анализировали по эндонуклеазной антивности и с помощью денатурирующего электрофореза. R.BspLUllIII оптируется нал белок с массой около 90 нДа. Молекулярная масса фермента, оцененная по данным денатурирующего электрофореза, равна 93 кДз. Следовательно, в условиях гель-хроматографии (20 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 300 мМ NaCl) эндонуилеаза присутствует в виде мономера с моленулпрной массой около 93 кДа.

Оптимальная температура реанции R.BspLUllIII 49 . Тепловая обработка при 65 в течение 20 мин не инантивировала фермент полностью. Однако, инкубация при 48 в буфере для рестрикции без субстратной ДНК в течение ночи приводила н полной потере

М 15

i

34- ** 60- *» 4¡). «•

32- ft 18-

Рис. 4. а- Электрофорез в денатурирующих • условиях белков фракций градиента в 1236- ном лолиакриламидном геле, м - маркеры мзленулярных весов белков (кДа). 6- Определение моленулярной массы эндонуилеазы R.BspLUllIII по элюирующему объему с нолонки Superóse 12 HR. Маркерные белки: 1- 132 нДа, 2- 80нДа, 3- 66 кДа, 4- 48 нДа, 5- 25 кДа.

активности. Показано, что скорость гидролиза субстратной ДНК зависит от времени инкубации, следовательно, связывание фермента с субстратной ДНК обратимо. Оптимальный буфер рестрикции имеет состав: 20 мМ Трис-ацетат, рН 7,5, 50 мМ ацетата калия, 10 мМ ацетата магния и 40 мкг/мл БСА. Triton Х-100 в концентрации 0,596 приводил к появлению минорных дополнительных полос, атр (100 мнМ) не влиял на активность фермента, что указывает на то, что R.BspLUllIII не принадлежит к типу III сайт-специфических эндонукпеаз. Добавление SAM в буфер рестрикции стимулирует эндонуклеазную активность R.BspLUllIII в концентрации 80 мнМ по крайней мере в 4 раза. Характерной особенностью фермента является ослабленная специфичность узнавания сайта в буфере с NaCl. По- видимому, это происходит не из- за увеличения ионной силы буфера, а в результате повышения концентрации ионов el". При этом ДНК расщеплялась во «вторичных» сайтах, один из ноторых, 5' -GGGAT-3', удалось определить.

В присутствии SAM R.BspLUllIII метилирует ДНК. В пользу этого свидетельствует ряд экспериментальных фактов:

1. ДНК плазмиды pJRD184 инкубировали без Mg2* с R.BspLUllIII и SAM (20, 40, 80, 120 и 160 мнМ). Реакцию метилирования ДНК вели 2 ч, после чего добавляли ацетат магния и дополнительную порцию фермента. Смесь инкубировали 1 ч и подвергали электрофорезу в

155-ном агарозном rene. О полноте защиты ДНК супили по исчезновению продуктов специфического гидролиза ДНК и по количеству нерзсщепленной плазмиды. Оназалось, что при концентрации 120 и 160 мкМ SAM ДНК полностью защищается от последующего гидролиза. В присутствии SAM 20, 40, и 80мкМ видна лишь незначительная степень специфического гидролиза ДНК.

2. Конечный препарат R.SspLUl1111 проявляет и эндонунлеаэную, и метилазную активности, а по данным электрофореза он содержит только один белок с мопенулярной массой 93 кДа. Естественно предположить, что один белой проявляет обе активности.

3. Рель-хроматография нонечного гомогенного препарата на колонне Superóse 12 HR 30/10 в FPLC' системе указывает, что франция с наибольшей метилазной активностью по включению трития в реакции с [метил- 3Н]SAM'точно совпадает с пиковой Францией выхода эндонуклеазноЯ активности.

Таблица 1.

Определение метилирующей антивности ДНН-метилаз по включению [3Н]в ДНИ плазмиды pJRD184 В реакции метилирования с [Me- эн ISAM-

Метилаза Радиоактивность, имп/мин а *, *

до гидролиза HCl поспе гидролиза HCl

K.BspLUl1III 17 846 692 3, 8

М.flspLUl1111 207 137 66,0

M.BspLUl111 2 406 153 6,4

M. EcoRI I 160 760 98 246 61,0

M.Msp I 7 622 5 362 70, 3

M. Taq I 20 384 514 2, 5

M. Eco RI 10 714 466 4, 3

а* - процент метни, оставшейся на фильтре поспе депуринизации

4. Для того, чтобы показать, что метилирование ДНК происходит сайт-специфично, а не является проявлением активности примесью другсГй адениновой ДНК- метилазы ДНК ппазмиды pJRD184 метилировали R.BspLUllIII в присутствии [Не- 3H]SAM и расщепляли эндонуклеазой Яра! I. Полученные фрагменты имеют небольшую длину и хорошо разделяются в 8% попианрипамидном геле. Фрагменты разделяли в двух дорожках, поспе чего одну из них обрабатывали 1М салиципатом натрия и проводили авторадиографию при -70 , а другую окрашивали бромидом этидия (Рис.5). Видно, что тольно фрагменты, содержащие последовательность 5'- GGGAC-3' , с длинами 160 (2 фрагмента), 209 и 23В п. н. оказались [ 3Н J" меченными. Следовательно, метилирование ДНК очищенным препаратом R.flspLUinil происходит сайт-специфично и не является проявлением посторонних ДНК- метилаэ.

MR2 3

S

771

197

394

Рис. 5. Определение специфичности

энзиматического метилирования нонечными препаратами R.BspLUllIII и N. BspLUl 1111- а Карта рестрикции ДНК плазмиды pjRD184. Латинскими буквами обозначены фрагменты расщепления pjRDI84 эндонуклеазоИ Нра II в порядке уменьшения длины. Черными кружками обозначены сайты 5'-GGGAC-3'. б Разделение фрагментов ДНК в в% нолиакриламидном геле. Слот 1 использован для авторадиографии. Слоты 2 и 3 окрашены бромидом этидия. Плазмида pJRD184, предварительно метилированная R.BspLUllIII (дорожка R) или M.BspLUllIlI (дорожка м) в присутствии [метил- Н] SAM, расщеплена эндонуклеазоИ Нра II. 2- Фрагменты плазмиды р J RD184, расщепленной Нра II. Четыре фрагмента рестрикции Нра II с длинами 160, 160, 209 и 238 п. н. содержат сайт 5'-gggac"3'. 3- маркеры длин фрагментов.

Для определения природы метилируемого основания проводили внлючение тритиевой метни в реанции эноиматичесного метилирования ЛНН в присутствии [метил-Зн]SAM. В таблице 1 приведены данные по включению метки в ДНК ллаэмиды pJRD!K4 для R.BspLUllIII, а танже трех других метилаз с известной специфичностью, взятых в качестве контроля. Кислотный гидролиз метилированной ДНК в присутствии О, 5 И НС1 приводил к уменьшению радиоактивности связанной с фильтром. В случае R.BspLUllIII на фильтре остается 3,8% исходной радиоактивности (Таблица 1). То же наблюдается для двух 6N" метиладениновыхДНК- метилаз М. Гад1 и М.ЯсоК! (2,5% и 4,3%, соответственно). ДНК-иетилаза U.MspI метилирует по цигозиновым остаткам, гликозидная связь которых слабо гидролизуется в НС1 (70,3%). Следовательно, R. BspLUl 1III является пурин-специфичной метилазой. Поскольку в ДНК встречаются в качестве метилируемых

основания только цигозины и аденины, следовательно, R.BspLUl1111 метилирует аденин узнаваемой последовательности.

Мы считаем, что представили исчерпывающие доказательства того, что эндонунлеазная и метилазная антивности проявляются одним и тем же полипептидом. Это второй пример подобного рода. Эндонунлеазная и метилазная активности Есо51\ также проявляются одним и тем же полипептидом с молекулярным весом близним весу фермента R. üspLU 111 11. Благодаря этому признану А. Янулайтис отнес ЕсоЪИ н новому классу IV ферментов модифинации- рестринции. Следует напомнить, что дпя первого нласса эндонунлеазная и метилазная антивности могут проявляться одним и тем же ферментом. Однако, d этом случае фермент представляет сложный надмоленулярныЯ комплекс из узнающей, метилирующей и эндонуилеазной субъединиц. У класса III метилазная и узнающая антивности обьединены в одном попипептиде. У ферментов ЕсоЪИ и R . BspI.Ul 11 11 произошло дальнейшее объединение всех трех функций в одном попипептиде. Поскольку, у двух подробно изученных ферментов класса IV наблюдается такое объединение, встает занонный вопрос, не является ли это характерной чертой ферментов класса IV?

R.BspLUllIII метилирует только одну цепь ДНК. Поснольну

метилирование внутриклеточной ДНК после реплинации осуществляется

с некоторым запозданием, то возникает вопрос, нан осуществляется

зашита от эндонуилеазной антивности одной из дочерних нитей ДНК,

ноторая не имеет метилированных адениновых оснований в сайте

узнавания? Подобный вопрос вставал в случае эндонунлеазы Eco57l.

Оназалось, что дпя метилирования второй нити узнаваемого сайта в

2 +

нлетне синтезируется вторая Ca - зависимая метилаза.

Чтобы ответить на этот вопрос мы предприняли целенаправленный поисн ДНК-метилаз в штамме Bacillus species LU11. В результате были обнаружены две ДНК-метилазы, защищающие ДНК от расщепления R.BspLUllIII и R.fispLUllII (изошизомер Xbal). Первый фермент, М. BspLUl 1111, был очищен до функционально чистого состояния в четыре стадии: фракционирование сульфатом аммония, хроматографии на сефадеисе G100, голубой агарозе и гепарин- агарозе.

Дпя определения специфичности метилирования проводился эксперимент по метилированию ДНИ плаэмиды pjRD184 в присутствии [метил-3H]SAM и последующего расщепления эндонунлеазой Hpall.

Таблица 2.

Результаты тонкослойной хроматографии нуклеоэидов после гидролиза ДНК фага X, метилированной в присутствии [метип- НЗБАМ.

ДНИ-метилаза метилируемое основание Rf

M.BspLUllIII С^-метилцитозин 0, 39

R.BspLUllIII N^-метиладенин 0, 30

М. Prüll Ng- метилцитозин 0, 52

М. EcöR 11 С6"метилцитозин 0, 40

К EcoRI N -метиладенин 0, 30

Условия разделения и детектирования продуктов были аналогичны эксперименту с R. BspLVl Uli. В результате, как и в случае с R.BspLUllIII меченными оказались только фрагменты, содержащие сайт 5 ' -GGGAC-3' ( Рис. 56, дорожка М) .

Для ответа на вопрос оприроде метилируемого основания мы проводили энзиматическое включение трития в реакции с [метил- 3H]SAM в ДНК плазмиды pJRD184. Затем ДНК осаждали на фильтр и подвергали гидролизу HCl. Как видно из таблицы 1, после гидролиза на фильтре остается ббх радиоактивности. Такой же процент остающейся метки характерен для цитозиновых ДНК-метилаз, взятых в контроле (M.£coRII и M.tfspl). Таким образом, метильная группа переносится на один из цитозинов в сайте узнавания.

Однано у прокариот встречаются по крайней мере два варианта

„ 5 4

метилирования по цитозину: С - метипцитозин и N - метилцитозин. Для определения природы метилирования цитозина ДНК фага X. метилировали M.BspLUllIII с [метип-3H]SAM. Конторолем служили ДНК- метипазы М. Pvul К N4" МеС) , М.EcoRII(С5-МеС) и М. £coRI (N6-MeA). Затем ДНК гидролизовали до мононунпеозидов последовательной обработкой ДНКазой I, нунлеаэой PI и бактериальной щелочной фосфатазой. Продукты реакции разделяли ионообменной тонкослойной хроматографией с последующей авторадиографией. В таблице 2 приведены данные R, меченных нуклеозидов, отнуда следует, что

5

продунт метилирования - С-метилцитозин. Аналогичный результат был пдлучен при разделении продуктов гидролиза метилированной ДНК в присутствии НСЮ^ на пластинке с челлюло^ои в системе НгО:бутаноп: NH^OH.

Электрофоретическое разделение цепей ДНК, предварительно метилированной с [Зн-метил]- SAM и М. BspLUl 1I11, в нзтивном полиакриламидном геле показывает, что метилируются обе цепи ДНК.

Таким образом, в клетке присутствуют два фермента узнающие последовательность 5'-GGGAC-3': R.BspLUllIII, обладающая эндонунлеазной и метилазной антивностями, и M.BspLUllIII с функцией ДНК-метилаэы. Следовательно, BspLUllIII можно отнести к

классу IV систем модификации-рестрикции, предложенному Янулайтисом для Есо511.

2. Очистка и свойства эндонуклеааи BspKT8 из штамма Bacillus species KT8.

Дпя очистки эндонуклеазы BspKT8 использовали последовательно 5 стадий колоночной хроматографии: гель-хроматография на Sephadex GlOO, хроматографии на голубой агарозе, НТР-биогеле, гепарин— агарозе и Polyanion SI. В результате белок очищен до почти гомогенного состояния. В итоге из 50 г влажной бимассы получили 343000 ед. активности, что позволяет считать штамм Bacillus sp. КТ8 очень перспективным продуцентом BspKTS.

Эндонуклеаза BspKTS расщепляет ДНИ фага X в 7-ми точках, приводя к образованию фрагментов с длинами 23130,9416,6557, 4361, 2322, 2027, 564 и 125 п. и. ДНК плазмид pBR322, pUCIS и Mî3mpl8 расщеплялись эндонукпеазой в одной точке. Такую же схему расщепления ДНИ фага X имеет эндонукпеаза Hindi II. Сравнение схем расщепления ДНК этими эндонукпеазами позволило заключить, что BspKTS и Hin dl II узнают один и тот же сайт 5 '-AAGCTT-3 '.

R A G Т С К

30 32

34

674332-

4

Рис. 6. Определение точек расщепления ДНК внутри сайта узнавйния эндонунлеазоВ В«рК'Г8. А, в, С, Т" секвенирующие дорожки, 1-продукт попимеразной реакции, расщепленный АярКТв, 2- продукт 1 после обработки фрагментом Кпенова. Стрепнами указаны места разрывов. Рис. 7. Денатурирующий электрофорез белнов в активных (с 30 по 34) франциях. М- стандартные бепки.

Место расщепления определялось по методу Брауна и Смита. В качестве матричной использовалась ДНК фага М131е131, у которой недалеко от универсального праймера находится сайт 5'-ААОСТТ-З'. На Рис. 6 приведена авторадиография, из которой следует, что расщепление ДНК происходит внутри узнаваемой последовательности после 1-го нуклеотида по 5'-3'-цепи и после 5-го нунлеотида по 3'-5'-цепи, с образованием 4-х нунлеотидного выступающего 5'-нонца. Таким образом, ВярКТ8 являеется изошизомером ШЫ\11.

Установленная методом денатурирующего электрофореза в полиакрипамидном геле молекулярная масса фермента составляет 34 нДа (Рис.7). После окрашивания CBB-R250 посторонние полосы не наблюдались, что говорит о высоной степени очистки BspKTS.

Для определения молекулярной массы в неденатурирующих условиях применяли гель-хроматографию на колонке с Sephacryl S200HR. BsрКТ8 оптировался в объеме, соответствующем молекулярной массе белка в 30-35 рДа. Учитывая данные денатурирующего электрофореза, можно заключить, что i)spKT8 присутствует в растворе в мономерной форме как белок с молекулярной массой 34 нДа. Отметим, что гель-хроматография проводилась в разных буферах с 300 мМ NaCl, 50 мМ, а также в присутствии Mg2*, без изменения результатов. Следовательно, субъединичное строение эндонуклеаэы не зависит от молярности соли от 50 до 300 мМ и ионов Mg2*.

В диапазоне от 37° до 48° скорость реакции гидролиза ДНК была наибольшей. Инкубация 20 мин при 65° не инантивирует фермент полностью. Фериент не снижал активность при хранении в течение суток при комнатной температуре. Оптимальным для BspKT8 является буфер следующего состава: 10 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 10 мМ MgCl^ 100 мМ NaCl. Нонечный препарат фермента не проявляет штриховой активности в присутствии глицерина до '125!. Штриховая активность танже не обнаруживалась в ходе ночной инкубации с большим избытком BspKT8.

Замена ионов Mg2t в реакционной среде на Мп2+ не приводит н заметному снижению активности BspKT8. В присутствии ионов Zn2*, Ni2+, CaZt и cu2+ гидролиз ДНИ не происходил.

В последние годы в каталогах фирм- производителей эндонунлеаз рестрикции многие эндонунлеазы- прототипы стали заменяться на изошизомеры, узнающие ту же последовательность ДНК,, но обладающие более- совершенными свойствами. Тание изошизомеры характеризуются пониженной штриховой активностью, более стабильны, содержат меньше примесей и выделяются несложными методами с хорошим выходом. BspKТ8 является изошизомером /find III и обладает свойствами выгодно отличающими его от прототипа.

3. Очистка и свойства эндонунлеаз BspOVl и BspOVl I из штамма Bacillus species КТ8.

Очистка ферментов проводилась в пять стадий: фракционирование сульфатом аммония, гепь-хроматография на сефаденсе G100, хроматографии на голубой агарозе и НТР-биогепе и аффинная хроматография на гепарин-сефарозе. В результате BspOVl очищена до состояния, близкого к гомогенному, a Bspow II до

К К G Л Т С К 3'

Рис. 8. а- Определение точек расщепления ЯНН внутри сайта узнавания эняонуклеазами BspOVl (а) и BspOVII (6). A, G, С, Т -секвенирующие дорожки, R - продукт полимеразной реакции, расщепленный эндонунлеазой, к- продукт R после обработки фрагментом Кленова. Стрелнами уназаны места разрывов.

функционально чистого состояния. Из 50 г влажной биомассы получено 117000 ед. BspOV I и 90000 ед. BspOV II . Это позволяет считать термофильный штамм Bacillus species ОV достаточно перспективным продуцентом изошизомеров Earn 11051 и Claï-

Для определения узнаваемой последовательности проводили полный гидролиз эндонуклеазами BspOVl и BspOVII ДНК фага X и плазмид PÜC19, PBR322 и M13tgl30. Фрагменты ДНК разделяли в lSÉ-ном агарозном геле и оценивали их длину. BspOVl расщепляет ДНИ фага X в 9 точках, pBR322, pUC19 и М13шр18 в 1 тонне и образует фрагменты, характерные для эндонуклеазы BamllOSI с сайтом узнавания 5'-GACNNNNNGTC-3'. Фрагменты образовыванные BspOVII совпадали с продуктами гидролиза эндонуклеазы С/а 1 с сайтом-узнавания 5 '-ATCGAT-3 '. BspOVII расщепляет ДНИ X в 15 точках, Ml3mpl8 в двух точках, pBR322 в одной точне, a pUC19 не расщепляет. Метилирование по любым аденинам в сайге узнавай ия блонирует гидролиз ДНК эндонунлеазой BspOVII. Эндонуклеаза Claï также блокируется ы6-метиладенинами в тех же положениях.

Определение точек расщепления проводили методом Брауна -и Смита. В качестве матричной ДНК с сайтом для BspOVl использовали одноцепочечную форму ДНК фага M13tgl30 с клонированным в сайт BaniiI v Фрагментом с длиной 341 п. н. , полученным в результате гидролиза плазмиды pUCl9 эндонунлеазой Sau3AI. Фрагмент был вставлен таним образом, чтобы последовательность

5'-GACNNNNNGTC-3' находилась на расстоянии 58 нунлеотидов от универсального праймера. Сравнение зон в дорожнах R и К на Рис. 8а

и в сенвенирующих дорожках показывает, BspOVl Estí'i

разорванный сайт узнавания и расщепляет ДНК внуп оайта согласно

s * -gacnnн "^hmgtc- 3 '

схеме , образуя однонунлеотидтг 3выступающий

3'-CTGMN.j.liHNCAG-5'

конец. Таким образом, BspOVl относится н una с. у IIP и является изошизомером эндонунлеазы-прототипа Еат\ 1051.

В начестве матричной ДНК для эндонунлеазы BspOVII использовали одноцепочечную форму фагемидьа pBluescript с сайтом 5'-ATCGAT-3', отстоящим от универсал1. ного праймера на 69 нуилеотидов. Определение точек расщепления проводили тем же методом. Как видно на Рис. 86 эняонуклеазаBspOVlI расщепляет ДНК

Б'-АТ^ССАТ-З'

по схеме . Следовательно, BspOVII относится к классу

3 ' - tagc.t.ta-5 '

II и является изошизомером cíaI.

Молекулярную массу BspOVl определяли с помощью гель-хроматографии нативного белка на колонке с Sephacryl S200 и элентрофореза в денатурирующих условиях белков из франций после гель-хроматографии. Положение пика активности BspOVl определяли по способности расщеплять ДНИ фага X. Согласно этим данным молекулярная масса BspOVl в растворе равна 70-80 кДа. Электрофорез денатурированных белнов из активных фракция и последующая окраска геля серебром позволили увидеть е.пинственную полосу в диапазоне молекулярных масс 38-40 кДа, интенсивность которой во фракциях соответствовала антивности фермента. Таким образом, эндонуклеаза BspOVl имеет молекулярную массу около 38 кДа и присутствует в растворе в виде димера.

Наибольшая активность BspOVl наи.-гпалась при температуре 48°, a BspOVII при 42° и 48°. Таким образом, температурные оптимумы ферментов находятся в диапазоне около 48 , что позволяет отнести эти ферменты к группе термостабильных.

Оптимальным для BspOVl является буфер с 50 мМ Тгis-ацетата, рН 8,5, 50 мМ ацетата калия, 10 мМ ацетата магния, 1 мМ DTT. SAM и АТР не влияли на активность BspOVl. В присутствии 0,01% Triton Х100 активность BspOVl снижалась в 3 раза. Фермент не проявлял активность без ионов Mg2*, а также в присутствии двухвалентных ионов Со2*, Ni2* и Мп2* вместо Mg2*. Оптимальный буфер для BspOVII имеет состав: 20 мМ Tris-HCI, рН 8,5, 50 мМ NaCi, 10 мМ MgCt2, 1 MM DTT и 0,01% Triton Х100. DTT, АТР и SAM не влияют на активность.

Повышение стабильности препаратов ферментов является актуальной практической задачей. Для ее решения применяется несколько подходов: хранение белнов в неводных растворителях, лиофилизация с дисахаридами, получение мутантных белков методами

белкопоИ инженерии и ряд других методой. С другой стороны поиск изошизомеров в термофильных штаммах позполлет обнаружить ферменты с повышенной ста' .i п ростые. Изучение стабильности препарата BspOVl поьазывает, ¡то активность фермента не уменьшается при хранении в течение D5 дней при 25 в буфере хранения. Это говорит об исключительно высокой стабильности BspOVl и о хорошей очистке препарата, исключающей присутствие протеазных примесей.

Эндонунлеаза BspQVl образует 3выступающий однонуклеотидный нонец. Кроме того, фрагменты гидролиза лигируются более эффективно по сравнению с прототипом Ля/п11051 и коммерчески доступными изошизомерами Ahdl и £cJHKI. Эта эндонунлеаза может быть использована совместно со специализированными венторами с япумл сайгами для BspOVl, при расщеплении ноторых образуется 3'-выступающий Т нуклеотид, для прямого клонирования продуктов PCR-реакции в Т-векторы ( А/Т-клонирование) .

ВЫВОДЫ

1. Н термофильном штамме Bacillus species LU11 была обнаружена новая сайт-специфическая эндонунлеаза R. BspLUX 1111, распознающая последовательность 5'-GGGAC-3'. Установлено, что эндонунлеаза расцепляет ДНИ по 5'-3'-цепи в двух точках на расстоянии 10 и 11 нуклеотидов, а по 3'-5'-цепи в точках на расстоянии 14 и 15 нунлеотидов: 5,_GGGACNNNNNNNNNN|ц j NNNNN-3'

3'-CCCTGNNNNNNNNNNNNNN|N! Ы-5' В присутсвии S- аденозил- 1г метионина R.BspLl/llIII проявляет

ДНК- метилазную активность. В результате метилируется единственный

аденин в сайте узнавания по 5'-3'-цепи в N6-положении. Фермент

очищен до почти гомогенного состояния. Показано, что белок имеет

молекулярную массу около 93 нДа и присутствует в растворе в виде

мономера. В присутствии ионов Cl~ R.BspLC/llIIJ способна

расщеплять ДНИ во «вторичном» сайте 5'-GGGAT-3'.

2. Обнаружена и очищена сайт- специфическая ДНК- метилаэа, М.BspLUl1III защищающая последовательность 5'-GGGAT-3' от расщепления R. BspLUX 1111. Показано, что продунтом метилирования является цитозин в С5- положении. Предполагается, что М. BspLVi 1111 защищает от расщепления обе цепи ДНК, что позволяет избежать рестрикции эндонуклеазой R.BspLl/llIII после репликации.

3. В термофильном штамме Bacillus species КТ8 обнаружена и очищена почти до гомогенного состояния сайт-специфическая эндонунлеаза, узнающая последовательность 5'-AAGCTT-3'. Фермент имеет молекулярную массу 34 нДа и находится в растворе в виде мономерного белка. Активность BspКТ8 не зависит от АТФ и не стимулируется S- аденозил- L- метионином. Фермент обладает

наибольшей активностью в широком диапазоне температур от 37 до

48°. Расщепление ДНК происходит по схеме:

5'-a[agctt-3' 3'-ttcgai а-5',

следовательно фермент принадлежит но 11-му классу эндонуклеаз рестрикции и является изошизомером Hind III.

4. Из термофильного штамма Bacillus species OV выделены две

сайт-специфические эндонуклеазы BspOVl и BspOVII. BspOVl очищена

до состояния близкого к гомогенному. Она узнает

последовательность ДНК и разрезает ее как показано стрелками:

5'-gacnnnJ nngtc-3'

3'-ctgnn fnnncag-5', следовательно является изошизомером Ea/nllOSI. Фермент >меет

молекулярную массу около 40 кДа и присутствует в растворе в виде

димера с массой около 80 кДа. BspOVlï очищена до функционально

чистого состояния. Она узнает и разрезает последовательность:

5'-at icgat-3' 3' -tagc]ta-5 ' ,

следовательно, является изошизомером Claï. Наибольшая активность у обоих ферментов наблюдается при 48 и не зависит от присутствия Б^аденозил- L-метионина и ATP. flspOVII блокируется метилированием обоих аденинов в сайте узнавания. UspOVI обладает повышенной стабильностью при хранении. BspOVl может быть использована в создании Т-векторов для прямого клонирования продуктов PCR-

Публикации

1. Чернов A.B., Матвиенко H.H., Железная H.A., Матвиенко H.H. Новая сайт-специфическая эндонунлеаза-метилаза из термофильного штамма Bacillus species LU11." Биохимия, 1994, Том.59, N.11, Стр. 1275-1286.

2. Chernov А.V., Matvienko N.N., Zheleznaya L.A., Matvienko N.I. BspLUll III, a Bifunctional Restriction and Modification Enzyme from a Thermophilic Strain Bacillus species LU11. Nucleic Acids Research, 1995, Vol.23, No.7, P.1213-1214.

3. Чернов A.B., Железная Л.А., Матвиенко H.H. Сайт-специфическая эндонуклеаза ßspKT8 из термофильного штамма Bacillus species КТ8. Биохимия, 1995, Том. 60, N. 8, Стр. 1001-1007.

4. Чернов А. В. , Матвиенко Н. Н. , Железная JI. А. , Матвиенко Н. И. Система модификации-рестрикции из термофильного штамма Bacillus species LUI 1. Городсная научная конференция молодых ученых. Тезисы докладов. Пущино, 1936, Стр. 99.

5 . Чернов А. В. , Пепихов К. А. , Железная П. А , Матвиенко Н. И. Две сайт-специфические эндонуклеазы из термофильного штамма Bacillus