Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые сайт-специфические эндонуклеазы и метилазы из штаммов Bacillus cereus 83, Bacillus licheniformis 736 и Bacillus species LU11

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Новые сайт-специфические эндонуклеазы и метилазы из штаммов Bacillus cereus 83, Bacillus licheniformis 736 и Bacillus species LU11"

РГ6 од

г п срл

всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения

на правах рукописи

матвиенко надежда ниг.01жаевна

УДК 577. 132. 211. 314.

НОВЫЕ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ЭНДОНУХЛЕЛЗЫ И МЕТИЛАЗЫ ИЗ ШТАЯМОВ ВАС1ЬШ5 СЕПЕЧЗ 83, ВАСИШЗ 11СНЕИ1РОт1В 736 и ВЛСХиЛВ ЭРЕСТЕ? Ш11

из.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на сойсканиэ учаной степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена во Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лаченвя.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н. К. Янкоаский иандвдат биологических наук С. Я. ¡Саяьнов

Ввдуцая организация - Институт биоорганической ;:ккки вн. М. м. Шемякина к ¡0. А. Овчинникова РАИ

во Всероссийском научном центре молекулярной

диагностики в лечения по адресу: Н3149, Москва, Свифаропольсиий бульвар, д. 8.

С диссертацией ножно ознакомиться в бкблкотвке Всероссийского научного и ;нтра молекулярной диагностика и лечонвв

Научные руководители:

доктор биологических наук В. и. Киселев, кандидат биологических иаук В. М. Крамаров

в ' часов на з

часов на заседании Специализированного Совета

Автореферат разослан

года

Ученый секретарь Специализированного Совета

к. б. н. В. В. Отраднова

ОбШМ. ХАРАКТЕРИСТИКА РАбОТЫ

Актуальность темы. Несмотря на ужэ »моющиеся болив чем 2000 продуцентов сайт-специфических зндонуклааз (рсстряктаз), помск новых прадуцеитоз проводится so все больших масштабах. Это обусловлено той обстоятельством, что обнзружэниэ экдонухлеаз с новыми специфичности*« расширяет возможности конструирования рекомбянантных ДНК, секвенирооанкя ДНК я RFLP-вкалнза ■зукариотный геномов. Обнаружение фврмэнта с " новой специфичностью иногда приводит х совершенно новым технологиям в -е>.но8 якиекеряи. Часто оказывается, что новый штвих- продуцент эндонуклз&зы с: уже известно® специфичность» синтезирует фермент в большей количестве или болев стабялыный, тогда при производства фермента новому штамму отдают предпочтение.

Сайт-специфические эндо'ну.кяейзы я метклазы вг.ж:алй обьэкт дяе решения проблемы белок-нуклеинового узлавания. Прв этом аспекте испольаования этик ферментов ваяно име.ь ятаммы-продуцэнты, которые позволяют получать количества рэстрвктаз и иетклвз достаточные для фязнко-химгческих экспериментов.

До последнего времени основное внимание исследователей сосредотачивалось на одном компоненте системы рестрикции-мояхфжка-Ц8и, на сайт-специфических эндонуклэчзан, поскольку они являются основным инструментом генной янжонерни. Однако, а последнее время стало ясно, что на основе сайт-специфических иетилаз яогут быть разработаны перспективные методы для решения задач гонкой иняэнернк. В качестве примера можно привести кетоды увеличения специфичности рвсщеплелия ДНК рестриктазамк после её продваритель-ного метилироваккя, технику «пяты Ахиллеса» я другке метода.

Таким образом, задача пояска новых продуцентов рэстриктаз и метилаз остаётся актуальной и в настоящее время. особенно перспективен поиск штаммов продуцентов зтиз: фе^кентоэ среди термофилькых микроорганизмов, поскольку бэлки кз термофильных макроорганизмов более стабильны при хранении я болеа устойчивы к различным денатурирующим бегок воздействиям, чем ях аналоги яз кезофилышх организмов. Кроме того после клонирования гемов термофильных микроорганизмов в Е. coli существенно упрощаемся процедура зыделеняя соотвегствугаихя бел.чои, поскольку в большинстве таких случаев значительная очистка достигается простым прогревом экстракта рекомбинанта.

Цепь и задачи исследования. Задачей исследования былс выдэявяке ферментов скстен рестрикции-кодификация из штаммов bacilles ' cersas 83 и Bacillus licheniformis 736, опродзлеадв субстратно! специфичности выделанных рестрмктаз н точен эеска>плзнз:я ДНК. этямн ферментам*. Шапыо работы был также покер яовьпе продуцентов ¿айт-специфкческих эндонуклеаз из природных гзссятсг термофильных бактерий а надежде найти продуценты рестржетаз с новой специфичностью .

Наущая новизна. В клетках В. cereus 83 к В.licheniformis 736 зиарзы® обнаружены caïT-специфические эндонукеаэы Х соогватствушцсе км нетилазы. Создана коллекция из 100 втанчоЕ гвр::о:)>;:г>-га:к бактерий. Проведён скрининг коллекции на наличие рестрхжте.з. Найден штамн-продуцент {Bacillus species (J1U) рестряктазы с кого fi специфичностью. Разработаны схемы очкеткх дс фунадïокаяько чистого состояния рестриктаз из штаммов В. cereus 83 3. licheniformis 736, В. species Ш11 и сайт-специфических метхлаа яз В.versus S3 к В.licheniformls 736. Определены субстратная специфичность к течки расщепления ДНК для рестриктаз Все831, BÜ73SI, BspUJl 11 _ к BspLUllII. Рестриктаза Все831 обладает ново® спвцмфкчностью. Она узнает на ДНК нзпалиндрокную последова-

5cttgagljn^-3'

тэльнссть яз S нуклеотндов и расщепляет

3'-G&ACTC14IV-5'

ДНК еЙлмзи сайта, как указано стрелками. Она относктся И IV ткну сайт-слецнфичэскик экдонугоззаз, поскольку стимулируется а-Ерэиозкл-ь-нетконнном я не стимулируется ÀTÔ. Рестрык7Ь.1! BspijUl II узкеэт новую палиндронную последовательность A^CATGT S рас^эпляэ? эб, как указано стрелкой.' ßcplUX 1X1 являете) изошизомером XbaX, a B1ÎÏ3SI - изошизомер Ес< 311.

Практическая ценность работы, рестриктазы Все831 я BspLUlU являются новыми аналитическими реагентами -при изучении структура ДИК и новыми инструментами для конструирования рекомбинантных ДНК. BspVJ ill дает липкие кончики, идентичные липкин кончикан, произвольным рестриктазамк Ncol к BcpHI. Следовательно, napi BspUJ' II С F col К BcpHI c wcol могут быть использованы дл1 ферментативной селекции реком^нкантких ДНК. в состав узнаваехо) последовательность ScpIMllI входит триплет AUG (кодон нетионина) i поэтому эта рестриктаза можег быть использована дл/ конструирования супарпрпдуцентов с хннкчйск* синтезированным] генами. Сайт-спецкфичаские эндон;клеазы 8117361 к BspLUlli:

пая*!ются язошяэоиер&гт ут »звосттх рестрихтаз ксози я sbai. 0ЫЯОД BUÎ36Î sa штаика Я, llchetilformis делает этот штейн ¡¡арспвктязиой альтернативой штакиу E,coll 31 а качестэ® продуцента реетриктазы огвй специфичное«, Шияапвнхв сайт-специфических метйлаэ M BlilSQt », H ВсеаЗ! вткрызаат возноккссть асаной характеристик* систем илдифккацйЯ'рестрякцяи а Иоаннах B.ltchefíltormls B.ctreue 33.

Апробация работ, Матврмаш диссэртсник докладызалксь на ежегодной научной «онферситн* Института бзгка РАМ {1ззз г. ! * Гериакс-йос-гочкааЕроявйекон совещании по коорд?«нац«8 s биотехнология 1-4 ЙЙНЯ 1903 Г,

Публикаций. По НйТврк&яак аиссерт&ци* опубликовано 4 рабогн, 1 работа находится в печати,

объем и структура диссертации, Диссертаций состоят кз введения, обзора литературы, опхсаимя катеркалой я методов йсслвдоаания, результатов я ах обсужден»4, еьшэйов s списка цитируемой латературы.

Работа изложена на страницах нааинвпнемаго текста,

содержит 1 таблицу к рисунков. Библиография вкяючаат ссылок.

ОБЬЕХТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. МАТ£Р!ШЫ И МЕТОДЫ Мэзофилъшэ штампы В.iiebeniforraís ?ЗЬ к B.csreus 83 из коллекции S. К.Кранарова. Остальные штаммы выделены из различных экологических ииш посевом образцов на твердую питательную среду LBA м инкубацией чашек Потри при 35°С.

Анализ содержания рестриктаз. После очнеткя втакков двух-трехкраткых лересевом штрихом засеоалк se» гоээрхкость агара. Поело суточной инкубации nps 85°С клетки собирали с поверхности игара жесткой петлей а отеклянну» пробирку и ресуспвчдкровалы ях в 130 мкя лязяруицзго буфера ! SQ кК тряс-«ci рн е. з, ю г<и esta, 9 яМ ДТТ, 2 мЯ фвняямвтяясуяьфокияфторида) к добавляли so ккп гввяепрйГотовявмного раетрора яизоаж.ча на лкзяруяяэк буфере с концентрацией 8 йг/ня. Зослв 10 мин инкубация apk xohhrthoS температура добавляли 20 «tos 2% раствора тритона S loo к препарат озвучивал» 1С пни ¡т УЗ дез интеграторе иа льду с яитерваламк ¿о сак йкпульс. 30 сек пауза. Посла оэвучявакия проиарат центрифугировали яа цвнтрхфугв TUCO 1 чье SO т. oG/хям при 5°с. к суперна такту flo6aaniir<.<¡ НО нчл 90% глицерине.. Часть Образца сразу

с

использовали для проварки на ростриктазную активность. Остаток з&моражияалк tips -70°С для возможных повторных экспериментов.

Для очксткх' форментдв проводил» хроматографию клеточных экстрактов я® S-3C г. клеток на колонках с голубой-агарозой, гепарин-сэфзроз ой, HA-ultragel. В качестве субстратных ДНК использовали шга.зкядь. püC18, pUCX9, pBR322, реплинативную форму фагов М13пр18 к K13tgI30, ДНК фагов А. и Т7. Супрерспералькью ДНК бьшк счищены цэнтрЕфугированиек в градкэнте CsCl. Фаги X н Т7 пере;-, выделением ДИК также очищались в градиенте CsCl. Для определения точек расщепления JDHK рестриктазой Все831 специально былк сконструированы два рехокбинантных фага И13 с фрагментами ДНК. А, содержащие сайты расщепления для этой рестриктазы. Для рестркктвзы BspUJllI шспользован фаг И13Кад, сконструированный ранее ВелезноЁ Л.Д. Для определения точек расщепления ДНК рестриктазой 31173BI использован фаг М13шр8Е2. любезно предоставленный Ксензенко В.Н. Определение точек расщепления проводили по потоку «злонгированного праймера» с использованием одноцепочечных ДНК соответствующих фагов М13. Поело удлинения цепи Я^ченого яройиерв фрагментом Кленова ДНК-полинеразы X получонная двунктввая ДНК расщеплялась рестриктазой. Половину прапрата «сгсояьзовали для определения точки расщепления в меченой цепи ДНК, б втору» половину после последующей обработки ДНК фрагментом Кяэнойа - в комплементарной цепи. Размер фрагментов определяли, сопоставляя полученные . полосы в секвбнирующем геле с соогзэтствуюакми полосами s соквенирующих дорожках.

Анализ активности немилаз. Поскольку для активности.' экдонуклеазы необходимы ионы Мд2*, а для кетклазы они обычно на трэбуются, то ДНК Т7 сначала обрабатывали агиквотами из фракций градяэнта в присутствий Э~ТА и S-аденозил-Ь-метионина, после чего к инкуба конной смеси добавляли избыток МдС12 и рестриктазу к прояошали инкубацию. Если во фракции содержится сайт-специфическая метилаза, то она при первой инкубации пронетилируег ДНК и таким образом защитит ей от последующего действия рестриктазы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Скрининг Ko/inei iuu термофильных бактерий. После высева образцов из различных энологических лиы на среду 2УТ и инкубации чашек прк 55°С в течение 16-24 часов было излировано 100 бактериальных штаннов и 2 • штамма низших грибов. При скрининге

оказалось, что в 32 штампах обнаруживается ростриктазцая активность. Специфичность рестряктазы обычно определяли используя непосредственно грубый экстракт. Если же экстракт содержал значительное колпоство нвспецифкческкх эндоиуклэаз, либо веля не удавалось определять специфичность рэстриктазы вследствие наличия в одном штамме сразу нескольких активностей, то проводилось фракционирование экстракта на .маленькой колонке с гепарин-еофарозой с обьекон носителя 1,5 мЛ. В качестве субстратов пря упроделонип специфичности яспользогаля ДНК Т?, Л, риС18, рВГ(322, pJF.DJ.84, M13tgl31 в этя »е ДНК, расщепленные в одном сайте яля в 2-х близких саЗтах различными ростркктазамк. В результате гроввденного анализа оказалось, что во всэх эткх атвмках :одорясатск-кзокврм ужа извастныж рэстряктаз (Таблица 1). Крона гото в одной стайно, 1Д311, после фракционирования на ■епарян-софарозе бь:ла обнаружена растриктзза, для которой

расовппэник субстратов с известной послазоватслькостьп не ;овпадала со схемами расторгший для нзвэстих рэстряктаз.

'аблица 1. Специфичность рестриктаз в анализированных итамнах

словноо Число Специфич- Условное •Iv.cno Сяэцяфкч-

«звание рострнк- ность назв&нкз рэстрик- HÜCTi.

1та.ниа таз ятакиа тгй

УЗ 3, ffpall МАИ 1 ЕсоЗИ

:i3 1 Clal . КЛ14 1 Snal

:i4 1 CcoP.ll rai 1 S.-3U96I

17 1 ffpal ST 5 1 SirJII

III 2 Xial+ffftal 1JA9 1 PS'llX

PI 1 Xbal LU4 1 Ava I

07 1 ClaX Ш7 1 Hhsl

010 tu 2 1 XbaTHlbal ClaX Ш11 2 XbaI+ггоаая

Поскольку цояью ясслеяозаняи был поиск нопых рестриктаз, то айьнейиак работа проводилась с этих штаняом. При рвкроскопячгскок селвдования культуры в стааионариоЖ фаз® а фазэЕОМ контраста 10"лядалпсь палочкн с г'.ерйферкчэскн расяопожзнкния срамя. гсэ,',оватольно. птакн LÜH относятся к роду Bacillus. йапьюТлчы: авктифвкааия атамкя не проводилась.

с.

Выделение и характеристика сайт-специфических эндонуклеаз ВврШИТ к Ддр1Д11П.

|В. вреде* ШН1

УЗ-о^роботко, ПЭИ-преципитоцип Сулырст аммония (70% насыщения! . 025 обёссопивание ' . Г ? 64

Рис. 1 . Общая схема выделения сайт-специфических эндонуклеаз Верили и Вершин. Прямоугольниками без штрихов а масштаба условно показаны градиенты элюирующих буферов. Над мини в нижнем ряду цифрами указаны исходные и конечные полярности элюирующих растворов. Во втором ряду указано число фракций градиента. Ь -соответствует этапу нанесения и промывки, И - промывка колонки после градиента. Заштрихованные прямоугольники показывают

фракции, содержащие феркент. Кружками отмечены конечные препараты фирнантов.

Обаая схема зыделеккя растряктаз BspUJllI я BsplüLlII лредстазлона на ряс. 1. Общий выход Ферментов Bsp LUlll - 8000 ад., ВзрШИИ - 30000 ед. из 10 г. Зконассы.

Сптималыык буфером для обаях рестриктаз является буфер KRB (10 к.Ч тркс-IICl pH 7, 4, 50 ни NaCl, 10 мм МдС1г), максимальная активность при температуре «ккубацн* 48°С.

Рестрвктаза BspLUllI расяапляэт ДНК шгазмида pBR3Z2 только в однов точке. Для локализация узнаваемого сайта были получены лнкеЯкыэ мономеры отой. плазмядо за счет р&са-еялеки'я рвстрккгазаик, янегадкмя на pBR322 только один сайт узкаваиия. Эти мономера Ёатэм была обработан« рвстряигазой PspVJlll (рис. 2). При аналазз

I 2 3 4 5 6 7 8 9J0 II 12

Ряс. 2. Расщепление плазииды pBR322 и эо мономеров эпдокуклеазой BspLUllI.

Плаз кила была предварительно. гидролкзоаана рестрзштазамк, ргсщеплясяикя ае в одной точка, затек обработана BspLS'llI* 1) BstBSI; 2) mills 3) BspLU4I (язоаизоиер Луг!), 4) Nrul, 5) Barr.HI; S) Hindi 11: 7) PvuJ.-, 8) Pst I; 9) BIi736I (кэопшзомер ЕсоЗИ); 10) pBR322. расиеплекная только BspLUllI (контроль);' 11) ?BR322, расшеплеккая только £coRV (контроль); 12) маркеры длин фрагментов - T4d с, расяяплэнная "coRI (размеры даны а т. rl. н, ).

продуктов расщепления электрофорезом в агарознои геле удалоо локализовать сайт в окрестности 2470 нунлеотида { 50 нуклеотидов). ДКК фага Н13Ъд130 расщепляется на два видимых фрагмента. При совместном гидролизе этой ДНЮ рестрнктазой ВзрЫПИ и рэстрнкте.зами Есот и Бд111 удалось локализовать один из сайтов достаточно точно в окрестности 200 нуклеотида ( 50 нуклеотидов). Поиск гомология пс программе Шсгодепе в пределах указанных областей «а рВ&322 и М5^д130 обнаруживает общую для этих участков последовательность 5'-АСАТСГ-З'.

Вторая ресгряктаза ВзрХШIII дает схему расщепления ДНК рестрнктазой ХЬаI. В точности совпадают число н размеры фрагментов. Кроме того эта растряктаза, как к рестриктаза ХЬа1, расцепляет ДНК фага М13Ьд130 в окг.т сайте и не расщепляет ДМ Эти данные пЬкезывают, что ВзрШПП является изомером

IАСв Т П

рВКЗ?. ХЬа 1.

I А С 6 Т П

83

А

и

«а та »а

&

О

О)

<яяя

Ю

РИС. 3.

РИС. 4.

Рис. 3. Определение точек расщепления сайта узнавания экдонуклзазой ззрШНХ. I - продукт полимеризации, расщепленный эндонуклеазой; А, С, в, Т - "секвениругацие дорожки"; II - продукт полимеризации, расщепленный эндонуклеазой и з~.тем обработана!4 фрагментом Кленова в присутствии трифосфатов. Темной стрелкой обозначен разрыв в секвенирующей цепи, светлой - в кон.плэкентарной.

Рис. 4. Определение точек расщеплечия сайта узнавания эндонуклеазой ВярШИИ. Обозначения, как на рис.3.

Для

локализации разрыйов в

узнаваемой последовательности 8

была

спользована методика «элонгированного» праймера. В случав D&pLUlil атричной ДНК слуаила одноцепочечная ДНК рекомбинантного фага 13Над, полученного в лаборатории. В. интегрированном фрагменте того фага вблизи универсального праймера имеется палиндрокная оследовательность A^CATGT, этот сайт расщепляется как указано трелкой с образованной четырэхнуклеотидных 5'концов (рис.3).

Для определения точек расщепления сайта рестрактазой spLUllII в качестве матрицы была использована ДНК фага К13яр13, з олилинкере которой имеется сайт Xbal. Данные, представление sis ис. 4 показывают, что при оасщепленки ДНК этой растрнкте.зой бразуются четырехнуклеотидные S'-кончики. Таким образок естриктаза BspLUllI является не ' только изомером, но а зсиизомером Xbal.

иделеяие сайт-специфических эндонукпеазы и метилаэы из Bàcillus icheniformis 736.

В штамме B.licheniformis 736 при первичном скрхкинго на сличив сайт-специфических эндонуклеаз была обнаружена рестряктазо IÎ736I, которая расщепляет ДНК плазмиды pBR322 в одном касте. Для окализации сайта узнавания плазмида сначала была обработана естриктазамн с известной специфичность», расщепляющими эб в одном айте, а затем уже BM736I (рис.5 ). Результаты это. о эксперименте

1 2 3456 7 8 9 10 II

SL1'

Рис. 5. Расщепление линеаризованной различными рестрнктазакя плазмнды pBR322 рестриктазой 3I173BI. Плазкида была ликеариэоЕана с PstI (I), FVuI (2), Hlndlïï (3), BamHI (4), WruI (5), Aval (6), PvuII (7), BstBSI (в):

кольцевая плазмида, расщепленная В117Г><51 (контроль) 19); каркеры молекулярных масс: Т4д1'и,~ расщепленная гсоШ (10); молекуляные массы в т. п. о. (11).

показкля, что сайт узнавания для Bii736I находится недалеко о сайта PstI £ облает», гда имеется уникальный сайт для расщелйэн»

| 811 736 )

I УЗ-ОБРАБОТКА | НЭК-ПРЕЦИПИТАЦИЯ

| (riK2)Jso< (70% ндецагахв)

| С25-ОВЕССОЛИВА1ШЕ

X -<7

0,3 И H»Cl 2,5 . 2,5 3 3,5

Рис. 6. Обща к схема выделения ферионтов К ВИТЗвI я К ВИ7351.

Прямоугольниками без штрихов в масштабе условно показап градиенты элюхрумщях буферов. Над нини в шшнен ряд; цк^паик указаны исходные и конечные нолярностх злючруювдп агэигг. Во втором ряд^ указано число фракций градиента. Ь соответствует этапу нанесения на колонку к промывки; И - промывка колоикк после скончания градиента. Заттоахованкыэ прямоугольнккк показывают объединение фракции, • содераашие фермент. Кружками отмечены конечны* препараты ферментов. И - рестрмктаза, Н - метилаза.

ндонуклеазой Есо31. Характер расщеплен»« ДНК Т? и X подтвэрдял, то сайг узнаванхя для новой сайт-специфическое эндонуклааэы акоЭ жэ. как и для £со31: . Для того, чтобы научать

З'-С—МЖ;^'

войства этого фермента и определять место расщепления ДНК 5ыла роведена его очистка до функционально чистого состояния. Общая хема очистке рестриктазы х соотвествующай ей мвтяяазы приведена а ряс. 6.

Для' определения точки расщепления ДНК применялась етодхка «злонгированного праймера» с использованием дноцепочечной ДНК фага гиЗшр8Е2, в йитагржрозанном фрагкенгв оторого икается сайт для расцепления рестряктазой Ш173В1. з рисунка 7 видно, что полоса, образованная- а т'одэ продуктом а сцепления дик ВЛ73Б1, соответствует полоса А, расиолояодагой .ча

нуклеотндов нижа сайта узнавания 5'-САОАСС-З'. Посла ополнхтельной обработки .фрагментом КленоЕа полоса поднимается на нуклеотнда выше. Таким образом, рестркктаза 3117381

5 '-йСГГСТС-З е

;ействительно узнает на молекуле ДНК сайт в

3'-ССАСАС-5°

асщепляет верхнюю цопь ма расстоянии одного я нижшда цепь на

Рхс. 7. Определение точек расщепления ДНК вблязя узнаваемого сайта рэетрзк-тазой BÜ736I: I, С, Т, Q -"секэеннрующие" дороикв. I " продукт полямаразкой роакцм, расщепленный BJi73SX; II -тот из продукт поел® обработай фрагментом Клэкова лосле расиепленяя растрккгаэой; III - продукт II вкэстэ с "секванируощей лестнаиаЯ" Т. Черной стрелкг>8 показам разрыв э "секз«етруамой" г|вик, светлой - в комплементарной цепи.

>асстояния пяти нуклоотидов от сайга. Следовательно, рветряктаза >117361 является нзошкзокером рестриктаз ЕсоЗИ, Ppal. BseI.

Оптимальный реакционный буфер для растриктазы BÜ736I: 10 иН трИС-ИС1 рИ 8,3, аонм HgCl2, 1 ММ ЛТТ, О, 5Я тритон Х-100. °

Рзстриктазв. может быть с успехом использована для создания селехтруемых кассет для сайт-специфического мутагенеза или создания векторов для направленного одностороннего укорачивания интегрированных фрагментов, для конструирования «возвращающих» векторов.

Выделение сайт-специфических эндонукпеаэы и кетипазы из Bacillus cereus 83.

Обеги схема выделения П БсеВЗХ и К Все831 представлена на рис. 8. В порсон эксперименте по выделении К ВсеВЗ! пи столкнулись .с ргзкнк уменьшением общей активности фермента при его хроматогра-фической очистке. О-но из предположений состояло в ток, что фермент зависит от какого-то кофактора. Е качестве таких кофакторов были ксследоааи»! АТФ я Б-аденоаил-Ь-кетионин. АТФ на влияет на активность феризнта, SAH значительно его стимулирует. Поэтому во всех дальнейших экспериментах SAH добавляли в реакхшокнуи скось до кокцаятрадяк ВО ккК, активность фермента пргг этом возрастала примерно в Б раз. Поскольку R Все8Э1 стимулируется SAH к на зависит от АТФ она относится ■ к IV типу ферментов рестрикции-модификации,

Ups раецэпланпи различных субстратных анк с извэстиой иуклеотядноВ последовательностью (pUCIS, pBR322, H13tgl30, 17 и М рвстриктазоЁ Все831 схема расцепления этих ДНК не совпадала ни с одной схемой расаешзенйя этих ЛПК известным ростриктазакп. Расдеппениэ pUC19 дает 4 наблюяаеиых фрагмента, pBR322 - 6, к- 14, в 17 - боява 40 фрагментов.. Поскольку pUC19 дает кеньпее число фрагментов, было проведено картирование точек расщепления на этой ДНК. Мы дэлаэн четкое разграннчэняе кетду сайтом узнавания в точкой грасвеклеяяк. Положание сайта узнавания определяется по первой нукивотядкей паро узнаваемого сайта - при общепринятой нумерация иуклеоткякой последовательности. Точка расоеплекия определяется пеложекквк бяв&айаэга к сайту' узнавания разрыва ДНК. В данном случае такое различие вэська существенно, поскольку как оказалось, точка: раснепле»;яя Д1;К (заходятся на некотором удалении ст сайта узнаваний. Без учета §тсго обстоятольства бьше бы сделано неверное 'зекяачэкйэ о фязмчесяой карте, плазмида pucis. Фрагмент С расцеплена« p?oS плаэкяды рестриктвзой Все831 оказался Си неньпа фрагменте D fptfe. 8). .

В. 5рес1'ез 83

I УЗ-обработко

ЬЭИ-прациг.итоция 70% сульфат аммония С25-обзссот1всние

I У 37

0.012КН2Р04М 0,5

I- НА-упьтрагель V/

диализ

I 31

О МаС1М 1

I 4,4 '37

0,01 КН,Р04 !

I |НА-ультра гель W

\qW2Z

диализ

34

О МаС1М I

, гепарин ш сефороза "

23 '28

диализ

:с. 8 Общая схема выделения ферментов К Все831 к М Все831. Прямоугольниками без штрихов в масштабе условно показаны градиенты элюирующих буферов. Над ними в первом ряду цифрами укатаны исходные м конечные молярноегн злаярующего агента. Во втором ряду указано число фракций градиента Ь - соответствует э.апу нанесения н промывки, Ы - промывки колонки конечным раствором после окончания градиент». Заштрихованное прякоугольники показывают обьедхшшкые фракции, содержащие феркент. Кружочками отмочены конечные препараты ферментов. И - рестриктаза, М - метвла:га.

Для картирования точек расотпления использовали как иатол

нескольких рестриктаз, так л котоЛ неполного гидролиза. Плазмиду PUCHS расщепляле несколькими рестриктаз&ы), икешиня на ней Сдин сайт узнавания (Kiricflll, ВЛ7301 - изошизомэр ЁсоЗИ) нлк 2 сайта (PvuZZ, Вга=1421 - изошизомер Avall) * после этого долопитольно проводили расщепление. рестрикгазой ВсеЗЗХ в условиях полного М неполного гидролиза. Построенная физическая карта пЛазмида предст&влзгса на рис. 9.

2319,2305 (2302) .

I!

2059

ВН 736 1766

Pvu И 306

Hindill 447

Pvu II ™ 628

SI 912,89! (880)

S3 1451,1437 «1445)

S2 1174,1196 (1200)

Рис. 9. «язяческая карта рис19 для ВсейЗ!. Цкфраив указаны . координаты сайтов узнавания. Для Все831 первое чясло -координаты сайта узнавания, второ® число - координаты точек расщепления, числа в скобках координаты точек растепления. Стрелка указывает направление от сайта узнавания в котором находится точка растепления ЛИК. Обозначения фрагментов: большими буквами А, В, С, В с означены продукты полного гидролиза рестряктазой Все831, калыма буквами обозначены продукты совместного гидролиза двух рестриктаз, г. в, Н- продукты полного гидролиза другамк рестриктазаии.

После-аватвлыга® сравнение нуклеотидных последоватеяьчостей Б окресткос7як гочей расцеплении с окном в 100 нукяеотидов по программе "НоноХоду" из пакета программ иН1сгодепе" показало, что в окрестности зсех этих точек имеется одинаковая последовательность Ь'-СТТСка-З' илк комплементарная ей. Схемы расцепления

пругих субстратных ДНК с известной пос-педояательностью

иуклвотидов (рВЮ22, М131д130, Л, 77) совпадают с расчетньмя в

тредположенин. что Все831 узнает последовательность СТТСАС.

Для определения точек расщепления ДНК рестринтзой ВсевЗХ

5ыл сконструирован рекомбинантный фаг M13tgl 30-\ШпсгХ1Х, который

;одержит фрагмент ДНК ф-\га Л (37459-37384) длиной 125 нуклоотядов

' сайтом для Все831. Продукт расщепления в свквонирутщвм

геле (рис.Ю) образует преикушественнуга полосу, ' комигрярумдут с

3 на расстоянии 14 нуклеотидов от сайта узнавания. После обработки

ИНК полимеразой полоса опускается на два нуклвоткди яки®.

)ти результаты показывают, что И Все831 узнает сайт 5'~СТТСАС16М-3,+

а расщепляет его как показано стрелками с

5'-СААСТС14И-5'1,

эбразованкем фрагментов ДНК с выступающим 3'-динуклеотидон.

I А6СТП

а

»л» &

т

IW

<=з

5' 3'

Рис. 10. Определение точек расщепления ДНК растриктазой Все831. А, в, С, т - «свкве-нируюшяе» дорожкн. X - продукт синтеза, инициированного меченный лраймером, расщепленный ВсевЗХ. II - тот же продукт, обработанный ДНК-полиме,разо(. Прямоугольником откачен сайт узнавания, темная стрелка - разрыв » меченой цепа, сватлая стрелка - разрыв в полинеразноЯ цепи.

выводы

В составленной коллекци.. термофильных бактерий мз ЮО штанное найдено 32 продуцента сайт-специфических эидонуклвпз. В П проанализированных продуцентах содержались изомеры известных рестриктаз : Иран, cla I, EcoRll, Hhal, XJbal, SnaX, Sau96l, Eco311, SfaNI, Pvul, Aval. Один итак» солежит. наряду с уяв известной рестриктазой Xbal, фернент с новой специфичностью

1 5

BspUUUI.

О

2. фермент JBspLUllI из штамма Bacillus species LU11 получен в функционально чисток состоянии. Oh узнает на молекуле ДНК ПЕЛнидрокну» последовательность A^CATGT я расщепляет её как показано стрелкам». Показано, что второй фермент из этого же штамме, BspLUllIX, является язопизокером Xbat.

3. Яз иового продуцента Bacillus lichen iformis 736 выделены к

очацэкы до функционально чистого состояния са&т-специфические

рвсхряктаза к иетклаза R P1J736I к К В1х7ЭВ1. Показано,

что R 3Ü73SI узнает на ДНК последовательность 5'-GGTCTCM1-3

н раааэпляэг её на расстоянии одного к пятя

3"-CCAGAGH5-5'

нуюзэотидаэ от сабта узнавания, как указано стрелками. Она является изошкзокером ЕсоЗИ.

4. Из втакка Bacillus cereus 83 очищены до функционального

чистого состояния сайт-специфические ре^триктаза к котклаъз

Ж ВсгЗЗХ is Н BceS3I. R Все83Х обладает новой специфичностью,

узнаат непелиндронную последовательность и расщепляет ДНК как 5'-dTTGAG16H—3

показм;о стрелками на расстоянии 16 н 14

3'-GAACTC14i!-5%

нуилэоткаое от сайта узнавания. R Все83Х сильно стимулируется З-адвкозюл-Хг-метяоилнок и на сткнулируется AT®, следовательно ' она относится к типз? IV ферментов рестрикции-модификации.

Основной иатеряал диссертация опубликован в следующих работах:

2. Nadezhda H. Matvienko, Vladimir M. Kramarov» Leonid Yr Ivanov and Niqholac X. Matv-snlco. Bce83I, a restriction endonuclea from Bacillus sereus 83 which recognizes novel nonpalindromic eequenca 5"-CTTGAG-3' and is stimulated by S-adenosyl-L-mathionine. ~ Nucl. Acids Res. iây2, v.20, N.7, p.1803.

2, N iezda H. HatvienKo, Ludnila A. Zheleznaja, Nicholas I Matvienko. BspLCJllI, a novel site specific endonuclease which cleaves 5'-ACATGT-3'. - Kucl. Acidt Res, 1993, v.21, N.6, p.1495.

3. H. H Матвиенко, В.М.Крамаров, Jl. A. Железна«. II. И. Матвиенко. Новые сайт-специфические эндонуклеэзп и кетилаза из bacillus

licheniCormis 736. Биохимия. 1993, т. 58, U 8. с. 1137-U31.

4. JI. А. Железная. Н. И. Натвианко. К. Ü. Матвиенко. Два сайт-спецнфнческмэ эндонуклеазы из тэркофильного птгкма Bacillus specslus Ulli. окохимня, 1S33. т. 58, Н 9.

5. Н. Н. Матвиенко В. И. Крамаров, Л. А. Хвивг чая, К. И. Квтвквкко. Выделение сайтг-спецнфжчэсках эляонунявазы н иэгклазы из Bacilius cereus 83. Бяозснмяя ( а печвтв ).