Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые САЙТ-специфические эндонуклеазы из штаммов BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS M6, BACILLUS SPECIES KT5 и BACILLUS SPECIES KT6

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Новые САЙТ-специфические эндонуклеазы из штаммов BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS M6, BACILLUS SPECIES KT5 и BACILLUS SPECIES KT6"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. К. В. Ломоносова

А

<q на правах рукописи

ШАПОВАЛОВА НИНА ИВАНОВНА

УДК 577. 152. 314 ' 1

НОВЫЕ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ИЗ ШТАММОВ BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS Мб,BACILLUS SPECIES KT5 И BACILLUS SPECIES КТб.

03.00.03-Молекулярная биология

Автореферат

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-1935

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель :

доктор биологических наук, профессор Н.И.Матвиенко.

Официальные оппоненты: д. х. н. проффесор Е. С. Гронова, д. б. н. проффесор я. И. Бурьянов

Ведушая организация-Институт биологии и физиологии микроорганизмов РЛН

Я>. об'З Об^-^й ,

Защита состоится " ^ ~~ 1995 г. в часов на

заседании Специализированного Совета в Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Нсква, Воробьевские горы, Биологический факультет МГУ, молекулярный корпус "А".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ, им. М. В. Ломоносова

Автореферат разослан 11 " гола

Ученый секретарь Специализированного Совета

канд. хим. наук В. Н. Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сайт-специфические эндонуклеазы типа II,

явлляются важным инструментом для молекулярной биологии. Идет постоянный поиск новых ферментов, так как обнаружение ферментов с новой специфичностью расширяет возможности исследователей по конструированию рекомбинантных ДНК, секвенированию и исследованию полиморфных участков генома эукарио т ных организмов. Иногда обнаружение новых ферментов с необычными свойствами влечет за собой возникновение новых генно-инжерных технологий или новых направлений исследования генома.

Но обнаружение ферментов с новой специфичностью представляет в настоящее время довольно трудную задачу. Так в 1993 году из примерно 250 объявленных . сайт-специфических эндонуклеаз только 8 обладали новой специфичностью. Что касается ферментов узнающих палиндромные последовательности, то были обнаружены представители изомеров, узнающие 13 из возможных 16 тетрануклеотидов и 55 из возможных 64 гексануклеотидов. Однако, если учитывать характер расщепления палиндромного сайта, то оказывается, что для тетрануклеотидных сайтов из 80 возможных случаев известны ферменты только для 17 изошизомерных подгрупп, а для гексануклеотидов из 320 случаев - только 63.Число ферментов, узнающих вырожденные по центральной паре пентануклеотидные последовательности мало, известноы ферменты узнающие только 11 пентануклеотидов из 288 возможных. Что же касается несимметричных последовательностей и прерванных палиндромов, то несмотря на огромное ч и сл о таких последовательностей, известны ферменты, узнающие только 79 из них. Обнаружено всего 8 ферментов, узнающих октанукл е от идные палиндромы. Интерес к таким ферментам огромный в связи с развертыванием работ по анализу геномов эукариотных организмов, в частности с проектом "геном человека". Можно предполагать что такое малое количество ферментов, редко расщепляющих ДНК, обусловлено не их редкой встречаемостью в природе, а трудностью их детектирования в исходном экстракте исследуемого штамма при скрининге из-за присутствия в экстракте неспецифических эндонуклеаз, поскольку даже небольшая примесь таких нуклеаз способна разрушить высокомолекулярные фрагменты, образованные расщеплением субстратной ДНК высокоспецифичной, редко расщепляющей эндонуклеазой.

Поэтому в настоящее время с осбой актуальностью встает задача разработки новых методов скрининга коллекций микроорганизмов на присутствие редко-расщепляющих

сайт-специфических эндонуклеаз. Что касается второго компонента систем модификации-рестрикции - сайт-специфических метилаз, то до последнего времени им уделялось незаслуженно мало внимания. Сейчас число охарактиризованных метилаз в десятки раз меньше чем число охарактеризованных сайт-специфи ч еских эндонуклеаз. В самое последнее время резко возрос интерес к биологической роли метилирования. Наряду с сайт-специфическими эндонуклеазами метилазы могут стать важным инструментом генной инженерии. В к а честве примера можно привести технику расщепления ДНК по местам связывания специфических ДНК-связывающих белков,или методы редкого расщепления ДНК обычными сайт-специфическими метилазами после ее предварительного метилирования.

Все вышеприведенные факты показывают актуальность дальнейшего поиска продуцентов сайт-специфических эндонуклеаз и метилаз и всестороннего изучения этих ферментов.В качестве продуцентов таких ферментов с практической точки зрения особый интерес представляют термофильные микроорганизмы, поскольку, как правило, выделенные из них ферменты более стабильны и работа с новыми термофильными штаммами до их идентификации более безопасна. Задача исследования.

Задачей исследования были поиск новых продуцентов сайт-специфических эндонуклеаз и метилаз среди природных изолятов термофильных бактерий и изучение выделенных ферментов.

Научная новизна.

Проведен скрининг 67 штаммов из созданной коллекции штаммов термофильных микроорганизмов на наличие сайт-специфических эндонуклказ и метилаз.

В результате были найдены штаммы Bacillus

stearothermophilus Мб , Bacillus species КТ5 и Bacillus species KT6, которые являются прдуцентами новых сайт-специфических эндонуклеаз BstM6I, BspKT5I и BspKT6I, соответственно. Кроме того из штамма В.Species KT б выделена ' сайт-спе ц и фическая метилаза, парная эндонуклеазе Bsp KT6I. '

Разработаны схемы очистки вышеназванных -ферментов до функционально чистого состояния. Установлены точки расщепления узнаваемого сайта. Рестриктаза BstM6I узнает и расщепляет~ нукпеотлдяую последовательность СС-1, (A/T)GG и, следовательно,

является изошизомером Bst NI.

BspKT5I узнает на двунитевой ДНК 5'-CTGAAGlôN^

последовательность и расщепляет ее в стороне от

3GACTTC14N^

сайта, как показано стрелками, с образованием динуклеотидного 3'-выступающего конца. Эндонуклеаза Bsp KT5I является изошизомером EC057I, но в отличие от Eco 5 71, она не стимулируется S-аденозилнетионином (SAM) и потому принадлежит к классу IIS, а не к классу IV, как Есо571 Это первый случай когда изошизомерные ферменты относятся к различным классам. Кроме того, в отличие от Eco 571, эндонуклеаза Bsp KT5I не обладает метилазной активностью.

Эндонуклеаза BspKT6I является изомером, но не изошизомером, эндонуклеаз Say3AI и Mbo I . О на узнает на молекуле ДНК последовательость GATC, но фермент отличается от всех известных изомеров SaуЗА1 по характеру расщепления узнаваемой последовательности . В результате расщепления образуются 3'-выступающие динуклеотидные концы, идентичные концам фрагментов, образующихся при расщеплении ДНК эндонуклеазой Pvui. новый фермент отличен от Say 3AI по чувствительности к метилированию ДНК. Dam-метилирование ингибирует расщепление ДНК эндонуклеазой Bsp KT6I.

Выделенная из штамма В.Species КТ6 метилаза защищает ДНК от последующего расщепления эндонуклеазой Bsp KT6I. Метилируемым основанием являются аденины.

Практическая ценность работы. Все полученные эндонуклезы очищены до функционально чистого состояния и могут с успехом быть использованы для физического картирования молекул ДНК, клонирования и секвенирования фрагментов.

Поскольку рестриктаза Bsp KT6I является первым изомером Say 3AI, дающим динуклеотидные 3'-концы идентичные концам фрагментов ДНК при расщеплении эндонуклеазой Pvui, она может быть с успехом применена для составления банков генов путем интегрирования фрагментов неполного гидролиза клонируемой ДНК эндонуклеазой BspKT6I в уникальный сайт Pvui плазмиды pBR322 или ее производных.

Апробация работы. '■•-'... Результаты работы были доложены на Советско-германском симпозиуме по биотехнологии в мае 1993 года В г. Пущино.

Публикации. - -По материалам.диссертации опубликовано 4 работы.

Объем и структура диссертации.

Диссертация включает в себя-введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты работы, выводы и список цитируемой литературы. Работа изложена на страницах

машинописного текста, содержит 2 таблицы и рисунков.

Библиография включает 97 ссылок.

ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В работе использовались штаммы термофильных бацилл, выделенных из различных экологических ниш, путем неоднократных пересевов на твердые среды 2YT или LB до появления одиночных колоний.

Определение наличия..эндонуклеаз и характера их специфичности. С одиночной колонии штамма, взятого для исследования, культуру засевали микробиологической петлей по всей поверхности чашки Петри с твердой средой 2YT и растили в течение ночи при 55°С. Выросшую биомассу собирали в стеклянную пробирку и добавляли к ней 500 мкл. лизирующего буфера(20мМ трис-НС1,рН 8,0,20мМ ЕДТА,1мМ фенилметилсульфонилфторид). Суспенз ию тщательно гомогенизировали и добавляли 50 мкл свежеприготовленного раствора лизоцима с концентрацией 3 мг/мл и инкубировали при 0° в течение 20 мин., затем добавляли 20 мкл. 2У. раствора тритон Х-100, перемешивали и озвучивали в ледяной бане на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при максимальной мощности в течение 7мин. , ЗО-секундными импульсами с интервалом 30 с. Полнот у разрушения клеток контролировали по снижению мутности суспензии на нефелометре К.ФК-2-УХЛ при 590нм. разрушенные клетки центрифугировали на центрифуге типа "Eppendorf" 5413 10 мин. , 12000об/мин. , при 5°С. К супернатанту добавляли 1/5 объема 50% глицерина. Часть обра з ца сразу же проверяли на наличие рестриктазной активности, а остаток разделяли на аликвоты,замораживали в жидком азоте и хранили при (-)20°С для последующих опытов. Ф у нкцион а льно чисты е препараты

сайт-специфичеких эндонуклеаз рестрикции получали последовательной хромотографией бесклеточного экстракта на голубой

агарозе, оксиапатите и гепарин-сефарозе или гепарин-сефарозе и оксиапатите, как в случае с ферментом R.Bsp KT6I. Для удаления из лизата нуклеиновых кислот перед вышеназванными хроматографкями обычно проводили их преципитацию полиимином Р , с последующим удалением полиимина. В качестве субстратных ДНК использовались фаги AC1857S7, Т7, М13Над, М13шр18 и плазмиды pBR322, pUC18, рис 19 и pjRD 184 - из коллекции группы молекулярной генетики Института

белка РАН. Для определения точек расщепления нитей ДНК была использована методика "элонгированного пра ймера". В случаях эндонуклеаз Bst M6I и Bsp KT6I использовали одноцепочечный фаг М 13 тр 18. Наряду с обычными реакциями секвенировани я с добавлением терминаторов проводили еще дополнительную реакцию полимеризации без терминаторов. Синтезированную в этой реакции ДНК расщепляли рестриктазой Bst M6I и одну аликвоту наносили на гель без последующих обработок, а вторую - после инкубации с фрагментом Кленова в присутствии всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов. В случае эндонуклеазы Bsp KT5I в качестве матрицы была использована однонитевая ДНК рекомбинантного фага М 13 с фрагментом гена hag, природного изолята Е. coli, у которого вблизи участка универсального праймера имеется сайт расщепления для Bsp KT5I.Для прверки метилазной активности Bsp KT5I вели инкубацию смеси объемом 90 мкл. , содержащей 2,2 мкг ДНК pBR322,50MM трис-НС1, pH 8,0, ЮмМ ЕДТА, 50мМ NaCl, 5мМ ДТТ, 100мкг/мл альбумина, з

1 мк Кц [Н] SAM и 2 мкл фермента (метилаза M.Bli 7361, M.EcoRI или эндонуклеаза BspKT5I), 2 часа при 37°.После этого к прбе добавляли SDS-до 0, 5У. и инактивировали фементы прогревом при 65° в течение 1 ч.Затем к смеси добавляли 25 мкг молок лосося и 5 мл ТХУ (5%) и выдерживали во льду 10 мин.Осадок собирали фильтрованием на стеклянные фильтры,на которых после промывания 5Х ТХУ и этанолом и подсушивания измеряли радиоактивность в сцинтилляционной жидкости ЖС 1.

Анализ активности метилаз и определение их специфичности. Активность сайт-специфической метилазы во фракциях градиентов проверяли по эффекту защиты плазмиды pBR322 от расщепления парной эндонуклеазой после предварительной инкубации плазмиды с аликвотами из фракций в присутствии 2 мМ ЕДТА, который связывает ионы Мд++, необходимые для действия эндонуклеазы, но не метилазы. Для определения специфичности метилазы использовали метод, предложенный Бурьяновым и соавторами, основанный на различной чуствительности пуриновых и перимидиновых оснований к кислотному гидролизу ДНК. В качестве контроля использовали метилазу Есо RI, которая, как известно, метилирует аденины узнаваемого сайта.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Сайт-специфическая эндонуклеаза Bst M6I из Bacillus stearother-mophilus Мб.

При скрининге природных изолятов темофильных бацилл, в препарате мелассы был обнаружен штамм Bacillus stearothermophilus Мб, проду-

цирующий сайт-специфическую эндонуклеазу Bst M6I.

Препарат феркента был получен путем последовательной хроматографии на голубой сефарозе, оксиапатите и гепарин-сефарозе. Следует отметить, что фермент очень прочно связывается с голубой сефарозой и начинает элюироваться только при 2, 1М NaCl. После второй хроматографии - на гидроксиапатите - фермент все' еще содержал неспецифические экзонуклеазы, что не позволяло определить точку расщепления сайта. Наконец, после третьй хроматографии - на колонке с гепарин-сефарозой был получен удовлетворительно чистый препарат, при длительной инкубации с которым не было обнаружено неспецифического гидролиза ДНК. При электрофоретическом разделении в агароз-ном геле продуктов расщеленния ДНК фагов X, Т7, М13шр18 и плазмид —PBR322 и pUC18(рис.1)было обнаружено, что число и длины фрагментов соответствуют числу и длинам фрагментов, получаемых при расщеплении этих субстратов рестриктазой Eco RII.

2 3 4 5 6 7

iSSt' Де*

fr Yj^T-

йциидм

сщ »+ W,'

ь^ш. 'rvüJZ bJUKR

f/TrJfrrr ?

Рис. 1. Расщепление различных ДНК рестриктазой Bst M6I: 1 - pUC18, 2 - pBR322, 5 - M13mpl8, 6 - Т7, 7 - Л; 4 - маркеры молекулярных масс, ДНК фага SP6, расщепленная Hind III; 3 - SP6:Hind III и M13mpl8:Bst M6I.

При определении точек расщепления нитей ДНК рестриктазой Вй1 М61 методом элонгированного меченого праймера, использовали одноцепочечный фаг М13гар18(рис. 2). Координата ближайшего к универсальному праймеру сайта - 6136.

Полоса на дорожке I непосредственно указывает пожение одного из разрывов в сайте узнавания, а полоса на дорожке 11-расположение разрыва в комплементарной цепи. Поскольку инкубация с фрагментом Кленова приводит к удлинению фрагмента на один нуклеотид(Т на рис.

б

2), следовательно, в процессе расщепления образуются фрагменты, на 5'-конце которых выступает один нуклеотид. Таким

образом, рестркктаза Bst М61 является изошизомером Bst N1.

Рис.2.Определение точек расщепления в сайте Bst M6I. Автограф секвенирующего геля. A,G,С,Т-дорожки с соответствующей термииацией синтезированных фрагментов. 1-наименыпий фрагмент после расщепления продукта полимеризации рестриктазой Bst М61.11-тот же фрагмент, но после достройки 5'-однонитевого конца фрагментом Кленова ДНК-поли-меразы в присутствии трифосфатов. Стрелки показывают концевые нуклеотиды меченых фрагментов ДНК после обработки рестриктазой(слева) и после дополнительной обработки фрагментом Кленова ДНК - полимеразы I (справа).

Выход фермента составляет приблизительно 20000ед.активности на 1г биомассы.Чистый препарат хранится более года при (-)20°С без заметной потери активности. Пятикратное замораживание в жидком азоте и оттаивание препарата не снижают его активности. Оптимальная температура при расщеплении ДНК составляет 65°С, оптимальный буфер - 50мМ трмс-HCl, pH 8,4, ЮмИ МдС1г, ЮОмМ NaCl»

Новая сайт-специфическая зндонуклеаза Bsp KT5I.

рестриктаза Bsp KT5I, которая расщепляет плазмиду pBR322 в двух местах, была обнаружена в штамме В.Species КТ5 при первичном скрининге на наличие сайт-специфических эндонуклеаз. Получение функционально чистого фермента происходило по схеме: преципитация нуклеиновых кислот полиимииом, осаждение белков сульфатом амкония(70% насыщения), обессолевание растворенного

осадка гельфильтрацией на колонке с сефадексон й 25, хроматография на голубой агарозе, хроматография на оксиапатите, хроматография на гепарин-сефарозе.

При расщеплении плазкиды рис 19 рестриктазой Вер КТ51 образуются два фрагмента с длинами примерно 1700 и 10ООН. п. для картирования мест расщепления на этой плазмиде использовали метод нескольких рестрикционных эндонуклеаз( рис. 3).

а Ь

Рис. 3. Продукты гидролиза . лазмиды pUC19 эндонуклеазой Bsp KT5I, предварительно расщепленной Bmel421(3), B1Î736I (4), PvuII(5), BspLUllI(б), Kpnl(7), 1-исходная плазмида pUC19(контроль); 2-pUC19, расщепленная Bsp KT5I(контроль); 8-маркеры длин фрагментов( Т7, расщепленная BÜ736I) . Размеры фрагментов даны в нуклеотидных парах; а - фото электрофоретического разделения, б-схема с обозначением фрагментов.

Исходная плазмида представляет собой димерную

молекулу. Расщепление ее эндонуклеазой Bsp KT5I неполное. Кроме двух фрагментов конечного гидролиза А и Б имеются две более слабые полосы в высокомолекулярной области, одна из которых соответствует линейной мономерной молекуле. Эндонуклеаза Вте 14211изошизомер Ava 11) расщепляет меньший фрагмент с образованием двух видимых фрагментов!а и в) с длинами примерно 490 и 310н. п. ,третий фрагмент между двумя сайтами Ava II длиной 222н. п. не виден. Эндонуклеаза Bli 7361 (изошизомер Eco 311)расщепляет фрагмент В на два (end) с длинами около 600 и 530н.п. соответственно . Эти данные позволяют установить локализацию сайтов расщепления Bsp KT5I в районах около 1330 и 2380 нуклеотидов. Данные совместного расщепления pUC 19

эндонуклеазой Bsp KT5I и эндонуклеазами PvuII, Kpnl и Bsp LU 111, подтверждают этот вывод. На рис.4 представлена физическая карта плазмиды pUC 19 с указанием фрагментов, видимых на рис.3. С использованием программы поиска гомологичных последовательностей Microgene в окрестностях 1330и 2380 нуклеотидов с окном в 100 нуклеотидных пар, была найдена единственная одинаковая последовательность из шести нуклеотидных пар, нигде больше не встречающаяся на плазмиде:CTGAAG. Эта последовательность является сайтом узнавания эндонуклеазы Eco 571.Следовател ь но, Bsp KT5I является изомером Eco 571.

2381 BspKT5I,

2059 Ava

PvuII 306 Kpnl 408

1837 Ava П

BM736I \\.\a d 1766

PvuII 628

f' 4 ! hl SspLU 111 810

Bsp KT5I 1333

Рис.4. Физическая карта плазмиды pUC19 с указанием сайтов расщепления и локализацией фрагментов, видимых на рис. 3. Стрелка у сайтов, узнаваемых Bsp KT5I, указывает направление от сайта, в котором происходит расщепление.

Для определения точек' расщепления ДНК эндонуклеазой Bsp KT5I использовалась ДНК рекомбинантного фага М13Над, которая имеет сайт узнавания Bsp KT5I вблизи универсального праймера.

Из рис.5 видно, что меченая нить расщепляется на расстоянии

RACGT P

2 i i

G А

1 8 С ' Т

** ш»- Л т С. '

m

■I4N

m

6 м p

Рис.5. Определение точек расщепления ДНК эндонуклеазой |Bsp KT5I. А, С, Gf Т - "секве-'нирующие" дорожки. R - продукт синтеза, инициированного меченым праймером, расщепленный Bsp KT5I; Р - тот же продукт после расщепления Bsp KT5I и последующей обработки ДНК - по-лимеразой. Прямоугольником отмечен узнаваемый сайт. Темная стрелка - разрыв в меченой цепи, светлая стрелка - в комплементарной цепи.

.....s* з'

14 нуклеотидов от сайта узнавания! дорожка R) . После обработки продукта расщепления фрагментом Кленова(дорожка Р) зона опускается на два нуклеотида ниже, следовательно, немеченая нить расщепляется на расстоянии 16 нуклеотидов от сайта узнавания.Таким образом, при расщеплении образуется 3 '-выс т упающий динук л еотид. Это показывает, что Bsp KT5I является не только изомером, но и изошизомером Eco 571.

Следует отметить, что наблюдается некоторый "люфт" ближней к сайту точки расщепления, радиактивности в дорожке R сосредоточено I нуклеотид ниже основной.

Особый интерес представляло изучение активность фермента, поскольку прототип Bsp KT5I зндонуклеаза Есо571, сильно стимулируется SAM. Из рис.6 видно, что SAM на активность фермента не влияет.

Визуально 5-10'/. полосе на один

влияния SAM на

I 3 5 78 10 12 14

Рис.6. Зависимость активности фермента от SAM. Субстратная ДНК - плазмида pBR322: 1-7 -инкубация без SAM; 8-14 - инкубация в присутствии 80 мкМ SAM; 1, 8-1 нкл фермента без разведения; 2-7 и 9-14 - 1 мкл фермента из последовательных разведений в 1,5 раза.

Зндонуклеаза Есо57 сама обладает метилазной активностью, поэтому было решено проверить, обладает ли также и зндонуклеаза Bsp KT5I метилазной активностью.

В табл. 1 приведены данные по включению трития в ДНК pBR322 при обработке эндонуклеазой Bsp KT5I и метилазами M.Eco RI и M.Bli 73 в присутствии неченого SAM. Метилазы M.Eco RI и M.Bli 736 взяты в качестве контроля.

Из таблицы видно, что зндонуклеаза Bsp KT5I метилазной активностью не обладает. Таким образом, выделенный нами фермент Bsp KT5I является изошизомером Eco 571, но в отличив от последнего он не стимулируется SAM и поэтому должен быть отнесен к классу II, подклассу IIS, а не к IV классу как Eco 571. Выделенный фемент не

Таблица 1. Включение радиоактивной метки 3Н из [3H]SAM в дик плазмиды pBR322 при обработке ее эндонуклеазой R.PspKTSI и нетилазаии M.EcoRI и M.B11736I. А - с добавлением фермента, В - без фермента.

R.BspKT5I M.EcoRI M.BÜ736I

опы.т 1 опыт 2 опыт 1 опыт 2 опыт 1 опыт 2

А_ В А В А В А В А В А В

Радиоактивность иип/кин 368 336 329 363 12642 248 13865 195 6830 214 9071 249

X включения метки 0 0 7.0 7,7 3.8 5.0

обладает метилазной активностью, что еще раз указывает на глубокие различия Bsp KT5I и Eco 571.и еще одно обстоятельство отличает Bsp KT5I от Eco 571. С помощью Eco 571 никогда нельзя добиться исчерпывающего гидролиза ДНК.Однако это не представляет трудностей при использовании Bsp KT5I.

Активность фермента слабо зависит от рН в диапазоне 7,4-9,0. Наибольшая активность наблюдается при рН 8, 4. Оптимальным является высокосолевой буфер с рН 8,4(10мМ трис-НС1,рН 8,4,10мМ МдС1г, ЮОмМ NaCl). Неожиданной оказалась температурная зависимость активности фермента. Хотя активность слабо зависит от температуры инкубации в диапазоне 28-55 градусов, наибольшая активность наблюдается при 28

градусах, несмотря на то что фермент выделен из термофильного микроорганизма.

Новые сайт-специфические эндонуклеаза и метилаза из термофильного штамма Bacillus species КТб.

Из термофильного штамма В.Species KT 6 гельфильтрацией на сефадексе G 100 и последующими хроматографиями на гепарин-сефарозе и оксиапатите очищены до функционально чистого состояния сайт-специфические эндонуклеаза R.Bsp KT6I и парная ей сайт-специфическая метилаза M.Bsp KT6I рис.7.

Конечный выход сайт-специфической эндонуклеазы Bsp KT6I из 40г биомассы составляет 4000ед. За еденицу активности Bsp KT6I принято количество фермента, полностью расщепляющего 1мкг ДНК фага ACI857 S7 dam за 1ч при 48° в оптимальном буфере LRB(cm. ниже) в 40 мкл. инкубационной смеси. Первоначально эндонуклеаза Bsp KT6I была обнаружена при скрининге термофильных бактерий на присутствие

Рис.7. Общая схема выделения ферментов R.Bsp KT6I и M.Bsp KT6I. Верхними прямоугольниками в масштабе условно показаны градиенты элюирующих буферов. Над ними в нижнем ряду цифрами указаны начальные и конечные молярности элюирующего агента. Во втором ряду указано число фракций градиента. Нижние незаштрихованные прямоугольники указывают область градиента с эндонуклеазной активностью, заштрихованные - с метилазной активностью. R - эндонукле-за, М - метилаза.

сайт-специфических эндонуклеаз при использовании ДНК фага Т7 в качестве субстра т а. Электроф о рет и ческая схема образующихся фрагментов совпадала со схемой фрагментов при расщеплении этой ДНК

В. species КТ6

УЗ-обработка

1NCH.IJ, М I у,"' ipiigwM,—

IГFПД РИН-СЕ0ЭДР03 АI 10КСИДПАТИТ НТР|

44 1

эндонуклеазой Sau 3AI. Расщепление других субстратных

ДНК(pBR322 dam , А dam )потвердило, что выделенная эндонуклеаза является изомером Sau 3AI и Mbol. Точки расщепления ДНК были определены "по методу элонгированного праймера рис.8. При расщеплении ДНК этой нуклеазой образуется

продукт, комигрирующий в денатурирующем геле при электрофорезе с полосой Т, секвенирующей дорожки Т, а при обработке продукта расщепления фрагментом Кленова ДНК - полимеразы I полоса опускается на два нуклеотида ниже. Эти результаты показывают, что фермент действительно узнает на молекулах ДНК последовательность GAT^C и расщепляет ее как показано стрелкой. Таким образом, BspKT6I является первым изомером Sau 3AI, дающим динуклеотидные 3'-концы. Они идентичны концам фрагментов ДНК при расщеплении эндонуклеазой Pvul, поэтому мелкощепящая эндонуклеаза Bsp KT6I может быть с успехом применена для составления банков генов путем интегрирования фрагментов неполного гидролиза клонируемой ДНК эндонуклеазой Bsp KT6I в уникальный сайт Pvul плазмиды pBR322 или ее производных.

PGACTR

<т

Рис.8. Определение точки расщепления сайта узнавания Bsp KT6I. G, А, т, С, - секве-нирующие дорожки. R - продукт полимеразной реакции, расщепленный Bsp KR6I; Р - тот же продукт после обработки фрагментом Кленова.стрелка с R-разрыв в секвенируемой цепи, стрелка с Р - в комплементарной.

Путем варьирования рН реакционного буфера и концентрации КаС1 было показано, что оптимальным является буфер Ы?В(10мМ трис-НС1,рН 7,5, ЮмМ МдС1г). Максимальная активность фермента Бэр КТ61 проявляется

при48-55 градусах. Подобно ее изомеру Mbol, эндонуклеаза Bsp KT6I ингибируется dam метилированием (рис.9).

ч,-7126 -Г3472 ¡-2310 -1664 г 131 3

Н006

h 689 562

Рис._9. Чувствительность Bsp KT6I ь dam метилированию ДНК. 1. Исходная ДНК pBR322_dam*. 2. Исходная ДНК PBR322 dam". 3. PBR322 dam*, обработанная Bsp KT6I. 5. pBR322 dam , обработанная Bsp KT6I. 4. Маркеры длин фрагментов ДНК Т7, обработанной Bli 7361.Длина некоторых фрагментов в н. п. указана :права.

Выделенная из штамма В.Species КТб метилаза защищает ДНК от последующего расщепления эндонуклеазой Bsp KT6I .Активность сайт-специфической метилазы во фракциях градиентов проверяли по эффекту защиты плазмиды pBR322 от расщепления эндонуклеазой Bsp KT6I после предварительной инкубации плазмиды с аликвотами из фракций в присутствии 2мИ ЕДТА, который связывае т и оны

Mg", необходимые для действия эндонуклеазы, но не метилазы. Для определения специфичности метилазы использовали метод, предложенный Бурьяновым и соавторами, основанный на различной чувствительности пуриновых и пиримидиновых оснований к кислотному гидролизу ДНК. В качестве контроля использовали метилазу Eco RI, которая как известно нетилирует аденины узнаваемого сайта. Из табл.2 видно, что при депуринизации ДНК большая часть метки и в

Таблица 2, Определение основания, метилируемого метилазой BspKT6I. Метилаза £coRl использована в качестве контроля.

Н. BspKT61 М. EcoRI

опыт 1 опыт 2 опыт 1 опыт 2

А ( имп/мин) В (%) С (У.)

11564 14650 6964 5120

23 29 14 10

2, 4 2, 7 3,1 2, 8

А - общий счет радиоактивности на фильтре (имп/мин) ; В - процент включения метки из инкубационной пробы на фильтр;

С - процент метки (X от В), оставшейся на фильтре после депуринизации.

случае М . Eco RI, и в случае M.Bsp KT6I удаляется из ДНК. Следовательно, в узнаваемой последовательности GATC метилаза Bsp KT6I метилирует аденины, как и следовало ожидать, исходя из чувствительности парной этой метилазе эндонуклеазы Bsp KT6I к dam" метилированию ДНК. Таким образом, метилаза Bsp KT6I пополняет список dam метилаз.

ВЫВОДЫ.

1.Функционально чистый препарат сайт-специфической эндонуклеазы Bst M6I из штамма Bacillus stearothtrmjphilus Мб узнает и расщепляет на молекуле ДНК нуклеотидную последовательность СО1*"(А/Т)GG и, следовательно, является изошизомером Bst N1.

2.Из термофильной почвенной бактерии Bacillus species KT5 выделена новая сайт-специфическая эндонуклеаза Bsp KT5I, свободная

от интерферирующих примесей. Bsp KT5I узнает на двунигевой ДНК 5'- CTGAAG 16N-1-

последовательность и расщепляет ее в стороне

3'- GACTTC 14N<n

от сайта, как показано стрелками, с образованием динуклеотидного 3'- выступающего конца. Выделенная эндонуклеа-за является изомером Eco 571.Однако, в отличие от Eco 571, она не стимулируется S - аденозилметионином (SAM) и потому принадлежит к классу IIS, а не к классу IV, как Eco 571.В отличие от Eco 571, эндонуклеза Bsp KT5I не обладает метилазной активностью и дает исчерпывающий гидролиз при обработке субстратной ДНК.

3. Эндонуклеаза Bsp KT6I из термофильного штамма Bacillus species KT6 является изомером, но не изошизомером эндонуклеаз

Sau 3AI и Mbol. Она узнает на молекуле ДНК последовательность GAT-'-C и расщепляет ее, как показано стрелкой. Таким образом, Bsp KT6I является первым изомером Sau 3AI, дающим динуклеотид-ные 3'- концы. Расщепление ДНК эндонуклеазой Bsp KT6I ингиби-руется dam метилированием.

4. Выделенная из штамма В.Species КТ6 метилаза, защищает ДНК от последующего расщепления эндонуклеазой Bsp KT6I.B узнаваемой последовательности GATC M.Bsp KT6I метилирует аденины. Таким образом, метилаза Bsp KT6I является изогепектомером метилазы dam.

Основной материал диссертации опубликован в следующих работах:

1. Nina I. Shapovalova, Ludmila A. Zheleznaja and Nicolas I. Matvienko.Bsp KT6I, a new site-specific endonuclease which cleaves the GATC site producing two nucleotide 3'- protruding ends. - Nucl. Acids Res. 1993, v. 21, N. 24, p.5794.

2. Н. И. Шаповалова, Л.Ю.Иванов, Н.И.Матвиенко. Сайт-специфическая эндонуклеаза Bst M6I из Bacillus stearothermophilus Мб. Биоорганическая химия, 1992, т. 18, N9, с. 1186-1189.

3. Н. И. Шаповалова, Л. А. Железная, Н.Н.Матвиенко, Н.И.Матвиенко. Новая сайт-специфическая эндонуклеаза Bsp KT5I. Биохимия, 1994, Т, 59, вып. 4, с. 485-493.

4. Н.И.Шаповалова, Л. А. Железная, Н.И.Матвиенко. Новые сайт-специфические эндонуклеаза и метилаза из термофильного штамма Bacillus species КТб. Биохимия, 1994, т. 59, вып. 11, с. 1730-1738.

28.12.94 г. Зак.б445Р. Тир.100 экз. Уч.-изд.л. 1.0 Отпечатано на ротапринте в ОНГЛ ПНЦ РАН