Структурно-функциональные основы каталитической активности эндонуклеазы рестрикции Eco29kI

Ибряшкина, Елена Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональные основы каталитической активности эндонуклеазы рестрикции Eco29kI
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные основы каталитической активности эндонуклеазы рестрикции Eco29kI"

003471362

На правах рукописи

ИБРЯШКИНА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ ЕС029К1

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 МАЯ 2039

Пущино - 2009

003471362

Работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Захарова Марина Викторовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Равин Виктор Константинович

кандидат биологических наук Кошелева Ирина Адольфовна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Защита диссертации состоится 18 июня 2009 года в 14:00 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биофизики клетки РАН, г. Пущино.

РАН

Автореферат разослан

2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Значительные достижения последних лет в области молекулярной биологии и генной инженерии во многом связаны с успешным использованием ферментов нуклеотидного обмена. К числу таких ферментов относятся эндонуклеазы рестрикции, способные узнавать специфические последовательности нуклеотидов на ДНК и разрезать ее по определенным положениям.

Среди всех известных к настоящему времени эндонуклеаз рестрикции, наиболее популярными остаются эндонуклеазы типа II. Благодаря высокой специфичности и относительно простой структуре, эндонуклеазы рестрикции типа II служат великолепными моделями для изучения ДНК-белковых взаимодействий и эволюционных взаимосвязей среди разных групп белков.

К настоящему моменту рентгеноструктурным анализом охарактеризовано 28 эндонуклеаз типа II. Вопреки отсутствию гомологии на уровне аминокислотных последовательностей, рентгеноструктурным анализом удалось выявить общий для эндонуклеаз рестрикции типа II структурный мотив PD...(D/E)XnK. Мотив PD...(D/E)XnK содержит аминокислотные остатки существенные для каталитической активности этих белкоз.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей различных по функциональным особенностям белков выявил наличие мотива PD...(D/E)X„K в белках, относящихся к другим классам. Тот факт, что разные ДНК-связывающие белки имеют общий структурный мотив, дает основание предполагать существование общего, хотя и далекого предка.

гомология ряда эндонуклеаз рестрикции типа II с "хоминг" - эндонуклеазами семейств "HNH" и "GIY-YIG". Так, в структуре ряда эндонуклеаз рестрикции типа II со слабо выраженным подобием (таких как, SapI, NspI, Kpnl, MboII) была отмечена консервативность повторяющихся Cys, которые характерны для большинства ферментов семейства "HNH".

А в последовательности эндонуклеазы Eco29kI выявлены каталитически значимые аминокислотные остатки мотива "GIY-YIG" и элементы вторичной структуры, идентифицированные экспериментально в "хоминг" - эндонуклеазе I-TevI из одноименного семейства. Наиболее консервативными аминокислотами в модуле "GIY-YIG" эндонуклеазы Eco29kI являются предположительно следующие аминокислотные остатки - тирозины в положениях 49 и 76, аргинины 86 и 104, глутаминовая кислота 142, аспарагин 154 и гистидип 108. Вполне логично предположить, что в обоих ферментах эти аминокислотные остатки выполняют одинаковые функции. По результатам рентгеноструктурного анализа N-концевого каталитического домена I-TevI была предложена модель пространственной организации каталитического центра эндонуклеазы Eco29kI.

На основании этого представлялось интересным изучить структурные и биохимические характеристики Eco29kI в сравнительном аспекте с эндонуклеазами типа II и "хоминг" - эндонуклеазами семейства "GIY-YIG".

Цели и задачи исследования: Целью настоящей работы являлось изучение структурно-функциональных основ каталитической активности эндонуклеазы рестрикции Eco29kI и сравнительному анализу свойств Eco29kI с эндонуклеазами типа II и классом "хоминг" - эндонуклеаз.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Охарактеризовать ДНК-связывающие свойства эндонуклеазы рестрикции Eco29kI;

2. Изучить механизм гидролиза ДНК эндонуклеазой Eco29kI;

3. Получить мутации в гене <?co29kIR по кодонам, кодирующим аминокислотные остатки, предположительно формирующие каталитический центр фермента;

4. Определить эффективность узнавания ДНК мутантными формами Eco29kI в сравнении с нативным ферментом;

5. Изучить каталитические свойства мутантных форм Eco29kI;

6. Провести сравнительный анализ свойств эндонуклеазы Eco29kI с ферментами типа II и "хоминг" - эндонуклеазами.

Научная новизна. Данная работа носит приоритетный характер. В настоящем исследовании впервые описаны ДНК-связывающие и каталитические свойства эндонуклеазы рестрикции Eco29kI типа II. На основании полученных данных впервые предложен механизм катализа ДНК эндонуклеазой Eco29kI. С учетом ранее установленной в лаборатории Я.М. Буйницкого гомологии аминокислотной последовательности Eco29kI с "хоминг" - эндонуклеазой I-TevI и выявленным в структуре Eco29kI мотива "GIY-YIG", было высказано предположение о роли аминокислот, входящими в мотив "GIY-YIG", в формировании каталитического центра Eco29kI.

В работе с помощью метода сайт-направленного мутагенеза in vitro были получены конструкции для продукции мутантов Eco29kI, содержащих единичные замены ряда аминокислот. Впервые были получены мутантные ферменты, содержащие замены остатков, предположительно участвующих в катализе (Y49, R104, Н108, Е142 и N154). Было изучено связывание и гидролиз ими ДНК. Показано, что остатки Y49, Н108 и Е142 являются критическими для катализа. Обнаружено, что при нарушении каталитических свойств эндонуклеазы Eco29kI мутантные формы белка сохраняют способность специфически связывать ДНК. На основании полученных данных было предположено, что центры связывания и катализа имеют разную структурную основу. Сравнение значений констант диссоциации нативного фермента и его мутантных форм выявило значительное снижение эффективности связывания последних. Возможно частичное перекрывание центров связывания и катализа или влияние пространственно соседствующих аминокислот друг на друга.

Полученные в ходе исследования результаты доказывают наличие структурного подобия каталитических центров эндонуклеазы Eco29kI и "хоминг" - эндонуклеаз семейства "GIY-YIG". К настоящему моменту

эндонуклеаза рестрикции Eco29kI является единственным представителем ферментов типа И, которого можно отнести к ceMeficTBy"GIY-YIG".

Научно-практическая ценность работы. Представленная работа является началом исследования структурно-функциональных взаимосвязей эндонуклеаз рестрикции с известными классами "хоминг" - эндонуклеаз. Полученные в ходе данного исследования результаты имеют несомненное фундаментальное значение. Используемый в данной работе алгоритм исследования позволяет описывать структуру и механизм катализа эндонуклеаз, которые в силу определенных причин (например, агрегация) не могут быть изучены рентгеноструктурным анализом.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в реферируемых научных журналах. Результаты работы были представлены на 7-ой Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, апрель 2003), на международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна (Пущино, 26 ноября -2 декабря 2006), на 5-ом международном конгрессе: 5Л New England Biolabs Meeting on Restriction/Modification, Wills Hall (Bristol UK, сентябрь 2004) и ежегодной сессии Ученого совета ИБФМ РАН (Пущино, 2007), посвященной подведению итогов конкурса научных работ, по результатам которого работа была удостоена щземии имени Г.К. Скрябина.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает источника. Работа содержит с^Зрисунков и Ô таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности ДНК-белкового взаимодействия эндонуклеазы рестрикции Eco29kI

Ранее в нашей лаборатории была охарактеризована эндонуклеаза рестрикции Eco29kI типа IIP. Было установлено, что эндонуклеаза Eco29kI, являясь глобулярным белком с молекулярной массой 24,5 кДа, узнает и гидролизует палиндромную последовательность 5'-CCGCAGG-3\ В растворе этот фермент существует в форме мономера, в то время как большинство представителей типа ИР являются гомодимерами. Возникает закономерный вопрос, каким образом эндонуклеаза Eco29kI типа ИР осуществляет свою биологическую функцию, а именно каталитический гидролиз ДНК? Очевидно, что при ответе на этот вопрос первостепенным становиться изучение способа взаимодействия эндонуклеазы Eco29kI с ДНК.

Для большинства эндонуклеаз рестрикции типа II для связывания с ДНК требуются в качестве кофакторов ионы двухвалентных металлов. В экспериментах по задержке ДНК-белковых комплексов в геле было обнаружено, что эндонуклеаза Есо29И обладает способностью специфически связывать ДНК в отсутствии ионов Mg2+(Рис.1). Ранее, подобная особенность была описана лишь для эндонуклеаз рестрикции IIS типа, таких как FokI, MboII.

Pstl-Pvuil- _

фрагмент ДНК-Есо29к1

комплекс

с сайтом для Eco29kl, 150 п.о.

Рис. 1. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК швдмиды риС128 в присутствии эндонуклеазы Есо29к1: К - контроль, Рй1-РуиП фрагмент плазмиды риС128 с сайтом для Есо29к1, дорожки I и 2 - реакции протекали в присутствии ионов (+), дорожка 3 - в отсутствии ионов (-).

С целью определения механизма связывания ДНК эндонуклеазой Есо29к1 был проведен поляризационный флуоресцентный анализ на олигонуклеотидном дуплексе, меченном по 5'-концу карбоксифлуоресцеином и содержащим сайт узнавания для эндонуклеазы Есо29к1. На рисунке 2 представлено титрование флуоресцентно меченой ДНК эндонуклеазой Есо29к1.

w о

-I

ЕЁ.

Wt Eco29kl, нМ

Рис. 2. Определение констант диссоциации (Kj) Eco29kI методом флуоресцентной полхриметрии.

Обсчет полученных данных проводили в соответствии с двумя моделями связывания - бимолекулярной и кооперативной. Е + Б Е8 (М1), пЕ + БоЕпБСШ).

Таблица 1. ДНК-связывающая активность Есо291с1

Стандартная бимолекулярная модель связывания . Кооперативная модель связывания

Kd, нМ гг R К4, иМ х2

Eco29kI 16±5 1500 0.78 17 ± 7 2.1 ±0.2 360 0.95

Как видно из графика (Рис. 2) и таблицы 1, связывание эндонуклеазы Eco29kl со специфической ДНК описывается сигмоидальной кривой. Константа диссоциации Eco29kI около 17 нМ, коэффициент кооперативности равен 2, что указывает на протекание процесса димеризации двух молекул Eco29kI на ДНК, подобно действию ферментов типа IIS.

Образование комплексов эндонуклеазы Есо29к1 с ДНК изучали методом задержки ДНК-белковых комплексов в геле с использованием радиактивномеченных олигонуклеотидов в двух сериях экспериментов со специфическим субстратом, содержащим сайт связывания для Есо29к1 и не специфическим (Рис. 3).

При низких концентрациях фермента наблюдается формирование единственного специфического комплекса на специфической ДНК (Рис. ЗА).

А Б

Неспецифический •*- комплекс _^ щ

• •■: ь» -«— Специфический .

комплекс

- С8°днкная и

О 1 2 4 10 20 40 100 200 400 ■*- Есо29к!,иМ —»• 0 1 2 4 10 20 40 100 200 400

Рис. 3. Электрофоретическое разделение в 8 % неденатурирующем ПААГ специфического (А) и неспецифического (Б) олигонуклеотидов в присутствии возрастающей концентрации эндонуклеазы рестрикции Есо29к1.

С увеличением концентрации фермента, начиная с 50 нМ, образуется дополнительный высокомолекулярный комплекс, имеющий низкую электрофоретическую подвижность. Для того чтобы установить природу дополнительного комплекса параллельно были поставлены эксперименты на неспецифической ДНК. Как видно из электрофореграммы (Рис. ЗБ), происходит образование неспецифического комплекса в том же диапазоне концентраций. Таким образом, фермент Есо29к1 способен связывать родственную ДНК и формировать на ней лишь один специфический комплекс.

Известно, что некоторые эндонуклеазы рестрикции типа II способны взаимодействовать с несколькими копиями их последовательности узнавания. Анализ специфического комплекса Есо29к1 с ДНК проводили на

специфических дуплексах длиной 16 п.о. и 30 п.о., содержащих по одному сайту узнавания Есо29к1 (Рис. 4).

16 п.о. ДНК - - 1 23456789 10 10 30 п.о. ДНК 10 10 987654321 - -

Рис. 4. Анализ специфического комплекса Eco29kI - ДНК.

Олигонуклеотиды добавляли в реакционную смесь независимо друг от друга либо смешивали друг с другом в определенных соотношениях. Как видно из электрофоре1раммы (Рис. 4), в результате взаимодействия образует только два специфических комплекса. Подвижность этих комплексов совпадает с подвижностью комплексов, образующихся на каждом олигонуклеотиде по отдельности.

Таким образом, эндонуклеаза Eco29kI может взаимодействовать лишь с одной молекулой специфической ДНК, связывая одну копию последовательности узнавания. Это свойство эндонуклеазы рестрикции Eco29kI, характерное для многих эндонуклеаз типа IIP, существенно рознит Eco29kI с ее ближайшими изошизомерами SacII и Cfr42I.

Стехиометрия комплекса Eco29kI с ДНК

Для определения стехиометрического коэффициента реакции связывания ДНК эндонуклеазой Eco29kI использовали метод Ферпосона (Рис. 5).

Был определен молекулярный вес комплекса Eco29kI с ДНК, коэффициент

стехиометрии реакции связывания для Eco29kl равен двум. Таким образом, с

одной молекулой ДНК связываются две мономерные молекулы Eco29kI. На

основании этого можно заключить, что в процессе взаимодействия с ДНК

эндонуклеаза Eco29kl ведет себя как типичный представитель ферментов типа IIS.

16 14

12 10 8

комплекс

Есо29к1-ДНК

ЕС029К1-ДНК

^ 6

0' ■ ■ ■ ' ■ 1............

0 20 40 60 80 100 120 140

MW (кДа)

Рис. S. А - Электрофоретическое разделение комплекса Есо29к1-ДНК в 12 % неденатурирующем ПААГ. Б - График зависимости коэффициента задержки белка в геле (-Кг) от молекулярного веса белков-маркеров (а- а-лактоальбумин - 14.2 кДа; б -карбоксиангидраза - 29.0 кДа; в - яичный альбумин - 45.0 кДа; бычий сывороточный альбумин: г - мономер - 66.0 кДа, д - димер - 132.0 кДа).

Каталитический механизм: кинетика расщепления ДНК эндонуклеазой рестрикции Eco29kI

Начальным этапом в изучении каталитического механизма Есо29й было исследование кинетики расщепления специфического субстрата, которым служила олигонуклеотидная шпилька с биотиновым зондом (Bio-60) в свободной форме и пришитая к твердому носителю. В случае иммобилизации ДНК на матрице фермент может взаимодействовать только с одним сайтом узнавания на ДНК. В другой серии экспериментов к иммобилизованному субстрату в качестве in trans активатора добавляли немеченый олигонуклеотид. В этих условиях фермент может связать две копии последовательности узнавания (Рис. 6А).

Результаты гидролизов для обеих серий экспериментов представлены на рисунке 6Б. Как видно из графика, профили реакций и скорости гидролиза сопоставимы друг с другом. Таким образом, димерная форма эндонуклеазы

Есо29к1 является единственной, активной формой фермента. Кроме того, доказано, что для проявления каталитической активности ферменту Есо29к1 не требуется формирование синаптических комплексов с двумя молекулами родственной ДНК. Эти данные совпадают с результатами экспериментов по изучению специфического комплекса.

Матрица, покрытая

ЯР

^ Фермент

стрептавидином Я?

Иммобилизованная специфическая ДНК

100 г 80 60

ас

ч 40 20 0

' \ Иммобилизованный I '■ч субстрат

! \Ч /

^ОФ------------

| Субстрат в -----------

растворе _____

10 20 30 40 50 60 Время, сек

Рис. 6. А - Схема эксперимента. Олигонуклеотид Вю-60, содержащий сайт связывания для Есо29И, фиксируется на поверхности магнитных шариков, покрытых стрептавидином. Б - Гидролиз иммобилизованного и свободного субстрата эндонуклеазой Есо29к1 во времени.

Процесс каталитического расщепления ДНК эндонуклеазой Есо29к1 и его кинетические параметры изучали на природном и синтетическом субстрате в стационарных условиях и в условиях насыщения субстрата ферментом. Результаты реакции гидролиза плазмидной ДНК эндонуклеазой Есо29к1 в условиях стационарной кинетики ([Ео]<[80]) представлены на рисунке 7.

Как видно из электрофореграммы (Рис. 7А), в ходе реакции гидролиза происходит образование линейной формы ДНК. Линейная форма плазмидной ДНК является конечным продуктом реакции, в результате гидролиза связи по обеим цепям сайта узнавания.

Оценивая изменение субстратной ДНК с течением времени, наблюдали быстрое накопление полностью гидролизованного линейного продукта с незначительным содержанием в реакционной смеси промежуточных форм. Как

видно из графика (Рис. 7Б), количество открытой формы плазмидной ДНК составляет не более 5% от общего количества субстратной ДНК и практически не меняется во времени. Скорость реакции гидролиза субстрата практически равна скорости образования продукта. Зависимость скорости реакции от концентрации фермента носит линейный характер (Рис. 7В).

А Б

Время, мин

[Eco29W], нМ

4 10 17 30 60 120 240 480 с

Л м

Б § =

go*

о li

Рис. 7. Элекгрофоретическое разделение в 1% агарозном геле продуктов гидролиза ДНК pUC128 эндонуклеазой Eco29kI. СФ - суперспирализованная форма ДНК плазмиды, ОФ - открытая форма ДНК и ЛФ - линейная. График Б - процентное изменение субстратной ДНК за первые 60 минут реакции: 1 - субстрат, 2 - переходная форма ДНК, 3 - продукт реакции. График В - зависимость скорости гидролиза субстратной ДНК от концентрации эндонуклеазы Eco29kJ.

Таким образом, за один оборот реакции, т.е. за время жизни фермент-субстратного комплекса, эндонуклеаза Eco29kI расщепляет обе цепи плазмидной ДНК перед диссоциацией, подобно действию ферментов типа IIP EcoRI, EcoRV, ВатШ.

Кривая зависимости гидролиза субстратной ДНК эндонуклеазой Есо29кГ во времени в условиях насыщения субстрата ферментом представлена на рисунке 8А. Как видно из графика, количество исходного субстрата (линия 1) уменьшается по экспоненте в процессе реакции. Скорость гидролиза эндонуклеазы Есо29к1 по своему значению близка значениям скоростей гидролиза ряда эндонуклеаз рестрикции, включая изошизомерную эндонуклеазу СЫН. Скорость гидролиза ДНК также обнаруживает сигмоидальную зависимость от концентрации Есо29к1 (Рис. 8Б). Коэффициент Хилла, полученный из экспериментальных данных, равен Ь = 1,87 ± 0,02. Данные результаты подтверждают протекание в процессе связывания димеризации фермента, которая предшествует гидролизу ДНК.

100 80 Ь/ 1 3 I

* ео .а'*

а ев ч 40 г 2 X -Л--.. I

20 и -л т-г-л

Время, сек

Рнс. 8. Кинетика гидролиза эндонуклеазы Есо29к1 на олигонуклеотидах. А — График зависимости гидролиза ДНК Вю-60 эндонуклеазой Есо29к1 во времени (1 - субстрат, 2 -промежуточный продует, 3 - конечный продукт реакции). Б - График зависимости констант коЬ, от начальной концентрации фермента Ео-

На основании полученных данных по кинетике расщепления субстрата эндонуклеазой рестрикции Есо29к1 была предложена модель механизма гидролиза ДНК исследуемым ферментом (Рис. 9).

Мономеры Есо29к1

ДНК с сайтом Есо29к1 II III I II I I* 3'

5'-

I им

димеризация на ДНК | + 5'-г

> 2E + S -«-♦•EjS

5" I I I I Inn + 1 ' '..1J I I I Г3'

гидролиз ДНК эндонуклеазой Eco29kI

Рис. 9. Модель механизма гидролиза ДНК эндонуклеазой Есо29Ы.

Мутационный анализ каталитического центра эндонуклеазы рестрикции Есо29к1

Следующим этапом в работе стало исследование структуры каталитического

центра эндонуклеазы Есо29к1.

Ранее по результатам биоинформационного анализа в последовательности

исследуемой эндонуклеазы Есо29к1 были выявлены каталитически значимые

аминокислотные остатки мотива "СТУ-УЮ" и элементы вторичной структуры,

идентифицированные экспериментально в "хоминг" - эндонуклеазе 1-Теу1 из

одноименного семейства. Наиболее консервативными аминокислотами в

модуле "ШУ-УЮ" эндонуклеазы Есо29к1 являются предположительно

следующие аминокислотные остатки - тирозины в положениях 49 и 76,

аргинины 86 и 104, глутаминовая кислота 142, аспарагин 154 и гисгидин 108

(Рис. 10А). Вполне логично предположить, что в обоих ферментах эти аминокислотные остатки выполняют одинаковые функции, т.е. участвуют в ферментативном катализе. На рисунке 10Б представлена модель пространственной организации каталитического центра Есо29к1 в сравнительном аспекте со структурой К-концевого каталитического домена "хоминг" - эндонуклеазы 1-Теу1.

Y49

xrayl - TevI ------------------------------------------MKSGIfQIKNTL-----

Eco29kI MHNKKFDRSEHVYRNDSFLELIKDAVRFFSGTPVHSLPPPERF2GA GVfALYYTGHYSLY

Y 76 R104 H108

xrayl - TevI----------NNKVIVGSAK------------------DFEKRWKRHFKDLEKGCHSSI

Eeo29kI DEYSRINRLAYNLPIiVGKAVPAGWRQSRISDHETRASSE LSNRIREHGRKIAKTS----

E 142 N154

xrayI-Tevl KbQRSFNKHGNVFECSILEEIPYEKDLIIERENFHIKELNSKINGi SIADATFG------

Eco29kI ------NLDLCDFSCRFVIFEATGSDMISTV EAALIKIYKP---LWtJTWDGFGNHTPGA

Eco29kI

-*- I-TevI

Рис. 10. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей эндонуклеаз Eco29kI и I-TevI (А). Модель структурной организации каталитического центра Eco29kf (Б). Консервативные аминокислотные остатки помечены цифрами.

Методом сайт-направленного мутагенеза in vitro были получены мутации в гене eco29kIR по кодонам, кодирующим аминокислотные остатки, предположительно формирующие каталитический центр фермента. Так, аминокислоты Y49 и Е142 были заменены на аланин, R104 и Н108 на остаток

фенилаланина, а N154 был заменен на лейцин. Выбор "нейтральной" для катализа аминокислоты определялся сохранением способности белковой молекулы к правильной сборке и организации в пространстве. Полноразмерный белок с заменой по Y76 аминокислоте не был получен, в связи с делениями в заменяемых триплетах. Вероятно, тирозин в 76 положении отвечает за специфичность белка Eco29kI и стабилизацию его структуры, чем за катализ. Мутантные формы Есо29Ы по 108 и 154 аминокислотам с заменами на аланин также не были получены, вероятно, в связи с нестабильностью образующихся белков в клетке.

Конформацию мутантных форм белка Eco29kI изучали КД-спектроскопией (Рис.11).

Рис. 11. Спектры кругового дихроизма эндонуклеазы рестрикции Eco29kI ( — ) и её мутантных форм: Y49A( ),R104A( ),N154L( ).

На рисунке 11 приведены КД спектры Eco29kI и ее мутантных форм по 49, 104 и 154 аминокислотам. Сравнение спектров кругового дихроизма нативного фермента Eco29kI и его мутантных вариантов позволяет делать вывод о том, что мутации не вносят изменений в пространственную укладку белковой молекулы Eco29kI.

Анализ эндоиуклеазной активности мутантных вариантов Eco29kI

Тестирование каталитической активности мутантных форм Eco29kI на ДНК бактериофага ф 80 vir показало полное отсутствие у мутантов по 49, 108, 142

аминокислотам и частичную потерю у мутантов по 104 и 154 аминокислотам эндонуклеазной активности (Рис. 12). Также было установлено отсутствие никазной активности у мутантных форм Есо29Ы.

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7

субстрат,

200 П.О.* • | .«.

продукт, -> *

57 п.о. . ■■ -<

1 2 3 4 В 6 7 8

Рис. 12. Электрофоретическое разделение продуктов гидролиза ДНК: А - фага <р80у1г, Б -200 п.о. фрагмента эндонуклеазой Есо29к[ (2) и ее мутантными формами У49А (3), Я86А (4), Ю 04А (5), Н108Р (6), Е142А (7) и N154Ъ (8).

В то же время, у мутантных форм сохраняется способность специфически связывать ДНК с сайтом Есо29к1 в отсутствии ионов М£2+.

К з х £

3 |

я г? п о

й К о с >

0 5 с ■8

250 200 150 100 50 О

0 100 200 300 " 405 Н108Р, НМ

Рис. 13. График зависимости поляризации флуоресценции от концентрации Есо29к1

В качестве примера приведена кривая связывания для мутантного белка по 108 аминокислоте, она носит кооперативный характер. Данный факт указывает

на то, что мутагенез по консервативным аминокислотам не нарушает центра связывания фермента.

По данным из экспериментов флуоресцентной поляриметрии были получены константы диссоциации для мутантных форм Есо29к1.

Таблица 2. Эндонуклеазная и ДНК-связывающая активности мутантных форм Есо29к1

Есо29к1 Эндонуклеазная активность [% от нативного Есо29Ы] Стандартная бимолекулярная модель связывания : Кооперативная модель связывания

К<1, нМ х2 К,ь нМ щ. ■

У/Т 100 16±5 1500 0.78 17 ±7 2.1 +0.2 360 0.95

У49А 0 49 ±5 105 0.97 /,23 ±:7!; ¡-:" 1.9 ±0.3 31 0.99

Я104 А ~2 43 + 18 442 0.94 43 ±18 1.8 ±0.2 27 0.99

Н108Р 0 114 + 25 1533 0.84 . 119144 2+0.1 582 0.94

Е142А 0 45 ±11 1480 0.87 31 + 14 1.8 ±0.4 547; 0.95

Ш54Ь -10 50 ±15 1267 0.75 55±26 1.96 431 0.91

В сводной таблице 2 приведены значения эндонуклеазных и ДНК-связывающих активностей для Есо29к1 и ее мутантных форм. Сопоставляя данные таблицы, можно сделать вывод о том, что У49, Ш04, Н108, Е142, N154 аминокислотные остатки принимают непосредственное участие в ферментативном катализе, осуществляемом Есо29к1, а У49, Н108 и Е142 аминокислоты являются критическими для катализа Есо29к1. А по высоким значениям констант мутантных белков 104 и 154 можно сделать предположение, что в снижение каталитических свойств этих белков вносит

вклад ослабление специфичности связывания.

выводы

1. Эндонуклеаза Eco29kI обладает Mgi+ - независимым специфическим узнаванием субстратной ДНК. Величина константы диссоциации равна 17 ±7 нМ.

2. Мономеры Eco29kI димеризуются на субстрате, подобно эндонуклеазам типа IIS.

3. Для проявления каталитической активности эндонуклеазы Есо291с1 необходима одна копия последовательности узнавания на ДНК. Константа скорости гидролиза ДНК в условиях насыщения равна kobs=0.99 ± 0.06 s"1.

4. Аминокислотные остатки Y49, R104, Н108, Е142 и N154 участвуют в формировании каталитического центра эндонуклеазы Eco29kI. Аминокислотные остатки У49, HI 08 и Е142 являются критическими для гидролиза ДНК.

5. Биохимический и структурный анализы эндонуклеазы Eco29kI позволяют отнести этот фермент как к эндонуклеазам типа IIP, так и типа IIS. Каталитический центр эндонуклеазы Eco29kI имеет конформацию "хоминг" - эндонуклеаз семейства "GIY-YTG".

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Ibryashkina Е.М., Zakharova M.V., Baskunov V.B., Bogdanova E.S., Nagomykh M.O., Den'mukhamedov M.M., Melnik B.S., Kolinski A., Gront D., Feder M., Solonin A.S., Bujnicki J.M. Type II restriction endonuclease R.Eco29kI is a member of the GIY-YIG nuclease superfamiiy.BMC Struct Biol., 2007,7:48.

2. Ibryashkina E.M., Sasnauskas G., Solonin A.S., Zakharova M.V. and Siksnys V. Oligomeric Structure Diversity within the GIY-YIC Nuclease Family. J. Mol. Biol, 2009,387,10-16.

3. Ибряшкина E.M., Захарова M.B., Деньмухамедов M.M., Солонин А.С. Eco29kI: Альтернативная организация каталитического центра эндонуклеазы рестрикции типа II. // Сборник тезисов 7-ой Путинской конференции молодых ученых: Биология - наука XXI века, Пущино, 14-18 апреля 2003, с 333.

4. Ibryashkina Е.М., Zakharova M.V., Den'mukhamedov М.М., Solonin A.S., Kolinski A., Feder M. and Bujnicki J.M. R.Eco29kI: Alternative organization of the catalytic center of Type II restriction endonucleases. Л Сборник тезисов 5-ого международного конгресса New England Biolabs Meeting on Restriction/Modification, Wills Hall, Bristol, 4-8 сентября 2004, с 202.

5. Ибряшкина E.M., Солонин А.С., Буйницкий Я.М., Захарова М.В. «Филогенетическое сходство эндонуклеазы рестрикции II типа £eo29kI с интронными эндонуклеазами GIY-YIG семейства». // Тезисы международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна, 26 ноября -2 декабря 2006, стр. 23-24.

Подписано в печать:

13.05.2009

Заказ № 2041 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ибряшкина, Елена Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные понятия о системах рестрикции-модификации ДНК

1.2. Классификация и номенклатура ферментов СРМ

1.3. Системы рестрикции-модификации типа И: их структурно-функциональная организация и биоразнообразие

1.4. Структурные особенности эндоиуклеаз рестрикции типа II в эволюционном аспекте

1.5. Механизмы взаимодействия эндонуклеаз типа II с ДНК

1.5.1. Процессы связывания и узнавания ДНК эндонуклеазами типа II

1.5.2. Механизм каталитического расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции типа II

1.6. Система рестрикции-модификации Eco29kI и ее основные характеристики

1.7. Анализ структурной организации эндонуклеазы Eco29kI

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И МАТЕРИАЛЫ

2.1. Штаммы бактерий, бактериофаги и плазмидные вектора

2.2. Выделение и очистка ДНК

2.3. Клонирование гена эндонуклеазы Eco29kI-N6His

2.4. Сайт-специфический мутагенез in vitro

2.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК

2.6. Получение бактериальной массы

2.7. Экспрессия гена эндонуклеазы Eco29kI

2.8. Выделение и очистка эндонуклеазы рестрикции Eco29kI-N6His и её мутантных форм до гомогенного состояния в нативных условиях

2.9. Определение ферментативной активности эндонуклеазы

Eco29kI-N6His и её мутантных форм

2.10. Тестирование никазной (штриховой) активности мутантных форм эндонуклеазы рестрикции Eco29kI

2.11. Ограниченный протеолиз Eco29kI

2.12. Электрофорез

2.12.1. Электрофорез белков в ПААГ

2.12.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.13. КД - спектроскопия

2.14. Анализ специфического узнавания ДНК мутантными формами Eco29kI

2.15. Поляризационный флуоресцентный анализ

2.16. Анализ комплексообразования эндонуклеазы Eco29kI

2.17. Стехиометрический анализ (Метод Ферпосона)

2.18. Реакция гидролиза плазмидной ДНК

2.19. Реакция гидролиза модифицированного субстрата

2.20. Быстрые реакции Eco29kI 50 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Особенности ДНК-белкового взаимодействия эндонуклеазы рестрикции Eco29kI

3.2. Стехиометрия комплекса Eco29kI с ДНК

3.3. Каталитический механизм: кинетика расщепления ДНК эндонуклеазой рестрикции Eco29kI

3.4. Мутационный анализ каталитического центра эндонуклеазы рестрикции Eco29kI

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональные основы каталитической активности эндонуклеазы рестрикции Eco29kI"

Значительные достижения последних лет в области молекулярной биологии и гешюй инженерии во многом связаны с успешным использованием ферментов нуклеотидпого обмена. К числу таких ферментов относятся эндонуклеазы рестрикции, способные узнавать специфические последовательности нуклеотидов на ДНК и разрезать ее по определенным положениям.

Среди всех известных к настоящему времени эндонуклеаз рестрикции, наиболее популярными остаются эндонуклеазы рестрикции типа II. Благодаря высокой специфичности и относительно простой структуре, эндонуклеазы рестрикции типа II служат великолепными моделями для изучения ДНК-белковых взаимодействий и эволюционных взаимосвязей среди разных групп белков.

К настоящему моменту рентгеиоструктурным анализом охарактеризовано 28 эндонуклеаз типа И. Вопреки отсутствию гомологии на уровне аминокислотных последовательностей, рентгеиоструктурным анализом удалось выявить общий для эндонуклеаз рестрикции типа II структурный мотив PD.(D/E)XnK. Мотив PD.(D/E)XnK содержит аминокислотные остатки существенные для каталитической активности этих белков.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей различных по функциональным особенностям белков выявил наличие мотива PD.(D/E)XnK в белках, относящихся к другим классам. Тот факт, что разные ДНК-связывающие белки имеют общий структурный мотив, дает основание предполагать существование общего, хотя и далекого предка.

Интересным оказался тот факт, что среди эндонуклеаз рестрикции типа II существуют ферменты, имеющие в своей структуре консервативные мотивы неродственных фосфодиэстераз других классов и тем самым отличающиеся от типичных систем типа II семейства "PD.(D/E)XnK". Первым ферментом типа II, в структуре которого был обнаружен каталитический мотив нуклеазы Nuc семейства "PLD", была эндонуютеаза ВШ типа IIS. Позднее с использованием современных методов сравнительного анализа амииокислотиых последовательностей и структурного прогнозирования была обнаружена также гомология ряда ЭР типа II с "хоминг" - эндонуклеазами семейств "HNH" и "GIY-YIG". Так, в структуре ряда эндонуклеаз рестрикции типа II со слабо выраженным подобием (таких как, Sapl, Nspl, Kpnl, MboII) была отмечена консервативность повторяющихся Cys, которые характерны для большинства ферментов семейства "HNH".

А в последовательности эндонуклеазы Eco29kI выявлены каталитически значимые аминокислотные остатки мотива "GIY-YIG" и элементы вторичной структуры, идентифицированные экспериментально в "хоминг" - эндонуклеазе I-TevI из одноименного семейства. Наиболее консервативными аминокислотами в модуле "GIY-YIG" эндонуклеазы Eco29kI являются предположительно следующие аминокислотные остатки - тирозины в положениях 49 и 76, аргинины 86 и 104, глутаминовая кислота 142, аспарагин 154 и гистидин 108. Вполне логично предположить, что в обоих ферментах эти аминокислотные остатки выполняют одинаковые функции. По результатам рентгеноструктурного анализа N-концевого каталитического домена I-TevI была предложена модель пространственной организации каталитического центра эндонуклеазы Eco29kI.

Настоящая работа по теме диссертации посвящена изучению структурно-функциональных основ каталитической активности эндонуклеазы рестрикции Eco29kI и сравнительному анализу свойств Eco29kI с эндонуклеазами типа II и классом "хоминг" — эндонуклеаз.

Для достижения поставленной в данной работе цели решались следующие задачи:

1. Охарактеризовать ДНК-связывающие свойства эндонуклеазы рестрикции Eco29kI;

2. Изучить механизм гидролиза ДНК эндонуклеазой Eco29kI;

3. Получить мутации в гене eco29kIR по ко донам, кодирующим аминокислотные остатки, предположительно формирующие каталитический центр фермента;

4. Определить эффективность узнавания ДНК мутантными формами Eco29kI в сравнении с нативным ферментом;

5. Изучить каталитические свойства мутантных форм Eco29kI;

6. Провести сравнительный анализ свойств эндонуклеазы Eco29kI с ферментами типа II и "хоминг" - эндонуклеазами.

В настоящем исследовании впервые описаны ДНК-связывающие и каталитические свойства эндонуклеазы рестрикции Eco29kI типа II. На основании полученных данных впервые предложена модель механизма гидролиза ДНК эндонуклеазой Eco29kI. С учетом ранее установленной в лаборатории Буйницкого Я.М. гомологии аминокислотной последовательности Eco29kI с "хоминг" - эндонуклеазой I-TevI и выявленным в структуре Eco29kI мотива "GIY-YIG", было высказано предположение о роли аминокислот, входящими в мотив "GIY-YIG", в формировании каталитического центра Eco29kI.

В работе с помощью метода сайт-направленного мутагенеза in vitro были получены конструкции для продукции мутантов Eco29kI, содержащих единичные замены ряда аминокислот. Впервые были получены мутантные ферменты, содержащие замены остатков, предположительно участвующих в катализе (Y49, R104, Н108, Е142 и N154). Было изучено связывание и гидролиз ими ДНК. Показано, что остатки Y49, HI08 и Е142 являются критическими для катализа. Обнаружено, что при нарушении каталитических свойств эндонуклеазы Eco29kI мутантные формы белка сохраняют способность специфически связывать ДНК. На основании полученных данных было предположено, что центры связывания и катализа имеют разную структурную основу. Сравнение значений констант диссоциации нативного фермента и его мутантных форм выявило значительное снижение эффективности связывания последних. Возможно частичное перекрывание центров связывания и катализа или влияние пространственно соседствующих аминокислот друг на друга.

Проведен сравнительный анализ Eco29kI с эндонуклеазами типа II и "хоминг" -эндонуклеазой I-Tevl.

Полученные в ходе исследования результаты доказывают наличие структурного подобия каталитических центров эндонуклеазы Eco29kI и "хоминг" — эндонуклеаз семейства "GIY-YIG". К настоящему моменту эндонуклеаза рестрикции Eco29kI является единственным представителем ферментов типа II, которого можно отнести к ceMeftcTBy"GIY-YIG".

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Ибряшкина, Елена Михайловна

выводы

1. Эндонуклеаза Eco29kI обладает Mg2+ - независимым специфическим узнаванием субстратной ДНК. Величина константы диссоциации равна 17 ± 7 нМ.

2. Мономеры Eco29kI димеризуются на субстрате, подобно эндонуклеазам типа IIS.

3. Для проявления каталитической активности эндонуклеазы Eco29kI необходима одна копия последовательности узнавания на ДНК. Константа скорости гидролиза ДНК в условиях насыщения равна kobS=0.99 ± 0.06 s-l.

4. Аминокислотные остатки Y49, R104, Н108, Е142 и N154 участвуют в формировании каталитического центра эндонуклеазы Eco29kI. Аминокислотные остатки Y49, HI 08 и Е142 являются критическими для гидролиза ДНК.

5. Биохимический и структурный анализы эндонуклеазы Eco29kI позволяют отнести этот фермент как к эндонуклеазам типа IIP, так и типа IIS. Каталитический центр эндонуклеазы Eco29kI имеет конформацию "хоминг" — эндонуклеаз семейства "GIY-YIG".

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Спектр исследований эндонуклеазы рестрикции Eco29kI типа II был ограничен высокой степенью агрегации, с которой столкнулись мы в процессе выделения этого белка в препаративных количествах. Таким образом, не представлялось возможным изучение структурно-функциональных основ каталитической активности эндонуклеазы Eco29kI рентгеноструктурным анализом.

Основываясь на биоииформационном анализе, выполненном с помощью компьютерного прогнозирования Я. Буйницким, в последовательности эндонуклеазы Eco29kI были выявлены каталитически значимые аминокислотные остатки мотива "GIY-YIG", идентифицированные экспериментально в "хоминг" — эндонуклеазе I-TevI из одноименного семейства. Теоретическая модель пространственной структуры каталитического центра Eco29kI была предложена по аналогии со структурой N-концевого каталитического домепа I-Tevl, полученной рентгеноструктурным анализом.

Замены предполагаемых каталитически значимых аминокислотных остатков в последовательности Eco29kI привели к сильным нарушениям каталитической активности мутантных белков - от частичной ее потери у мутантов по R104 и N154 аминокислотам, до полного отсутствия гидролиза ДНК у мутантных белков с заменами по Y49, HI08, El42 аминокислотам. Таким образом, аминокислотные остатки Y49, R104, Н108, Е142 и N154 участвуют в формировании каталитического центра эндонуклеазы Eco29kI. А аминокислотные остатки Y49, Н108 и Е142 являются критическими для гидролиза ДНК.

Однако мутантные формы Eco29kI сохраняют способность специфически связывать ДНК, указывая на то, что мутагенез по консервативным аминокислотам не нарушает центра связывания фермента.

Впервые нами были получены экспериментальные доказательства того, что эндонуклеазы рестрикции типа II могут принадлежать к неродственному семейству "GIY-IYG" "хоминг"- эндонуклеаз и, тем самым, существенно отличаться от типичных представителей эндонуклеаз типа II семейства PD.(D/E)XnK.

Известно, что среди эндонуклеаз семейства "GIY-YIG" существует разнообразие олигомерных структур и механизмов гидролиза ДНК. Так, бактериальные нуклеазы семейства UvrC являются мономериыми мультидоменпыми белками, GIY-YIG и EndoV домены которых участвуют в процессе разрезания поврежденных цепей ДНК по обе стороны от повреждения (Рисунок 29А). В структуре мономерной "хоминг" -эндонуклеазы I-Tevl С- концевой домен отвечает за связывания с сайтом узнавания на

ДНК, а N-концевой домен - за гидролиз ДНК. Процесс гидролиза ДНК эндонуклеазой I-TevI

UvrC lllti В

I-Tevl l-Bmol

Eco29kl rz

Рис. 29. Модели механизмов гидролиза эндонуклеаз семейства "GIY-YIG" (Ibryashkina Е.М. ct al, 2009). А - ДНК-репарирующий белок UvrC (выделен светлосерым цветом) и нуклеаза EndoV (выделена темно-серым цветом) используют каталитические домены для разрезания обоих цепей ДНК родственного сайта; Б -"хоминг" - эндонуклеазы I-Tevl и I-Bmol имеют один активный сайт, расположенный в домене "GIY-YIG" (обозначен светло-серым), и последовательно гидролизуют сначала нижнюю, затем верхнюю цепь ДНК; В - эндонуклеаза рестрикции Cfr42I является гомотетрамером, который одновременно связывает и разрезает две молекулы родственной ДНК; Г — эндонуклеаза Eco29kI, являясь в растворе мономером, димеризуется на родственной ДНК. начинается с разрезания нижней цепи сайта узнавая, после чего происходит искажение ДНК в сайте на 40° и последующий гидролиз верхней цепи ДНК (Рисунок 29Б). Эндонуклеаза Cfr42I семейства "GIY-YIG" характеризуется обязательной тетрамеризацией в процессе гидролиза ДНК (Рисунок 29В).

Нами было экспериментально показано, что эндонуклеаза Eco29kI, являясь в растворе мономером, в присутствии ДНК субстрата ассоциирует в димер с последующим гидролизом обоих цепей сайта узнавания 5'-CCGCGG- 3' (Рисунок 29Г). Обнаружено также, что для проявления каталитической активности эндонуклеазы Eco29kI необходима одна копия последовательности узнавания на ДНК. Это свойство эндонуклеазы рестрикции Eco29kI, характерное для многих эндонуклеаз типа II, существенно рознит Eco29kI с ее ближайшим изошизомером Cfr42I, принадлежащим к семейству "GIY-YIG".

Таким образом, структурный и биохимические анализы эндонуклеазы Eco29kI позволяют отнести этот фермент как к эндонуклеазам типа IIP, так и типа IIS. Каталитический центр эндонуклеазы Eco29kI имеет конформацию "хоминг" -эндонуклеаз семейства "GIY-YIG".

Экспериментальные данные, полученные в ходе исследования, могут быть положены в основу доказательства эволюционного родства между разными классами фосфодиэстераз и позволяют предполагать дивергентный путь развития ферментов этого класса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ибряшкина, Елена Михайловна, Пущино

1. Зайцев Е.Н., Зайцева Е.М., Бакланова И.В., Горелов В.Н., Кузьмин Н.П., Крюков В.М., Лапцов В.А. Клонирование и секвенирование гена гесА из штамма Pseudomonas aeruginosa. II Генетика. 1986. Т. 22. С. 2721-2727.

2. Мазин А.В., Кузнеделов К.Д. Методы молекулярной генетики и генной инженерии.-Новосибирск: Наука, сиб. отд-е. 1990. С. 14-25.

3. Ackers G.K., Johnson A.D. and Shea M.A. Quantitative model for gene regulation by lambda phage repressor // Proc Natl Acad Sci U S A. 1982. Vol. 79. P. 1129-1133.

4. Aravind L., Makarova K.S. and Koonin E.V. Survey and summary: Holliday junction resolvases and related nucleases: identification of new families, phyletic distribution and evolutionary trajectories //Nucleic Acids Res. 2000. Vol. 28. P. 3417-3432.

5. Barkley M.D. Salt dependence of the kinetics of the lac repressor-operator interaction: role of nonopcrator deoxyribonucleic acid in the association reaction // Biochemistry. 1981. Vol. 20. P. 3833-3842.

6. Belfort M. and Roberts R.J. Homing endonucleases: keeping the house in order // NAR. 1997. Vol. 25. N. 17. P. 3379-3388.

7. Bcrtani G. and Weigle J.J. Host-controlled variation in bacterial viruses // J.Bacteriol. 1953. Vol. 65. P. 113-121.

8. Bitinaite J., Wah D. A., Aggarwal A. K. and Schildkraut I. Fokl dimerization is required for DNA cleavage // Biochemistry. 1998. Vol. 95. P. 10570-10575.

9. Bujard H., Gentz R., Lanzer M., Stuber D., Miiller M., Ibrahimi I., Hauptle M.T., Dobberstein В. A T5 promotor based transcription-translation system for the analysis of proteins in vivo and in vitro. // Methods in Enzymology. 1987. V. 155. P. 416-433.

10. Bujnicki J.M. Understanding the evolution of restriction-modification systems: Clues from sequence and structure comparisons // Acta Biochim Pol. 2001. Vol. 4. P. 935-967.

11. Bujnicki J.M., Radlinska M. and Rychlewski L. Polyphyletic evolution of type II restriction enzymes revisited: two independent sources of second-hand folds revealed // Trends Biochem Sci. 2001. Vol. 26. P. 9-11.

12. Catto L.E., Bellamy S.R.W., Retter S.E. and Halford S.E. Dynamics and consequences of DNA looping by the Fokl restriction endonucleases // Nucleic Acids Research. 2008. Vol. 36(6). P. 2073-2081.

13. Chan S.H., Bao Y., Ciszak E., Laget S., Xu S.Y. Catalytic domain of restriction endonuclease Bmrl as a cleavage module for engineering endonucleases with novel substrate specificities // Nucleic Acids Res. 2007. Vol. 35. P. 6238-6248.

14. Chevalier B.S. and Stoddard B.L. Homing cndonucleases: structural and functional insight into the catalysts of intron/intein mobility // Nucleic Acids Res. 2001. Vol. 29(18). P. 3757-3774.

15. Christ F., Schoettler S., Wende W., Steuer S., Pingoud A. and Pingoud V. The monomeric homing endonuclease Pl-Scel has two catalytic centres for cleavage of the two strands of its DNA substrate // EMBO J. 1999. Vol. 18(24). P. 6908-6916.

16. Connolly B.A. Assay of restriction endonucleases using oligonucleotides // From: Methods in Molecular Biology. 30: DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. Edited by: G. G. Kneale. 1994. P. 371-383.

17. Ehbrecht H.-J., Pingoud A., Urbanke C., Maass G. and Gualerzi C. Linear diffusion of restriction endonucleases on DNA // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 6160-6166.

18. Fiandt M., Hraedecna Z., Lozeron II.A., Szybalski W. The Bacteriophage Lambda. // Cold Spring Harbor Lab. New York. 1971.

19. Frednoff P., Lurz R., Luder G. and Pingoud A. Sau3Al, a monomeric type II restriction endonuclease that dimerizes on thereby induces DNA loops // J Biol Chem. 2001. Vol. 276(26). P. 23581-23588.

20. Galburt E.A. and Stoddard B.L. Catalytic mechanisms of restriction and homing endonucleases // Biochemistry. 2002. Vol. 47. P. 13851-13860.

21. Gasiunas G., Sasnauskas G., Tamulaitis G., Urbanke C., Razaniene D., Siksnys V. Tetrameric restriction enzymes: expansion to the GIY-YIG nuclease family // Nucleic Acids Res. 2008. Vol. 36(3). P. 938-949.

22. Groger R.K., Morrow D.M., Tykocinski M.L. Directional antisense and sense cDNA cloning using Epstein-Barr virus episomal expression vectors. // Gene. 1989. V. 81. P. 285-294

23. Huai Q., Colandene J.D., Chen Y., Luo F., Zhao Y., Topal M.D. and Ke H. Crystal structure of Nael an evolutionary bridge between DNA endonuclease and topoisomerase//The EMBO Journal. 2000. Vol. 19(12). P. 3110-3118.

24. Ibryashkina E.M., Sasnauskas G., Solonin A.S., Zakharova M.V. and Siksnys V. Oligomeric Structure Diversity within the GIY-YIG Nuclease Family // J. Mol. Biol. 2009. Vol. 387. P. 10-16.

25. Jakubauskas A., Giedriene J., Bujnicki. J.M., Janulaitis A. Identification of a single HNH active site in type IIS restriction endonuclease Eco31I // J. Mol. Biol. 2007. Vol. 370. P. 157-169.

26. Jo K., Topal M.D. DNA topoisomerase and recombinase activities in Nael restriction endonucleases // Science. 1995. Vol. 267. P. 1817-1820.

27. Jurica M.S. and Stoddard B.L. Homing endonucleases: structure, function and evolution // Cell. Mol. Life Sci. 1999. Vol. 55. P. 1304-1326.

28. Kessler C. and Manta V. Specificity of restriction endonucleases and DNA modification methyltransferases a review (edition 3) // Gene. 1990. Vol. 92. P. 1-248.

29. Kim Y., Grable J. C., Love R., Green P.J. and Rosenberg J.M. Refinement of EcoRI endonuclease crystal structure: A revised protein chain tracing // Science. 1990. Vol. 249. P. 1307-1309.

30. Kirsanova O.V., Baskunov V.B., Gromova E.S. Type HE and IIF restriction endonucleases interacting with two recognition sites in DNA // Mol Biol (Mosk). 2004. Vol. 38(5). P. 886-900.

31. Kriukiene E., Lubiene J., Lagunavicius A., Lubys A. Mnll—The member of H-N-H subtype of Type IIS restriction endonucleases // Biochim. Biophys. Acta. 2005. Vol. 1751. P. 194-204.

32. Kruger D.H., Kupper D., Meisel A., Reuter M. and Schroeder C. The significance of distance and orientation of restriction endonuclease recognition sites in viral DNA genomes // FEMS Microbiol. Rev. 1995. Vol. 17. P. 177-184.

33. Modrich P. and Zabel D. EcoRI endonuclease. Physical and catalytic properties of the homogenous enzyme // J Biol Chem. 1976. Vol. 251(19). P. 5866-74.

34. Mucke M., Kruger D. H. and Reuter M. Diversity of Type II restriction endonucleases that require two DNA recognition sites // Nucleic Acids Res. 2003. Vol. 31(21). P. 60796084.

35. Newman M., Lunnen K., Wilson G., Greci J., Schildkraut I. and Phillips S.E. Crystal structure of restriction endonuclease Bgll bound to its interrupted DNA recognition sequence // EMBO J. 1998. Vol. 17. P. 5466-5476.

36. Newman M., Strzelecka Т., Dorner L.F., Schildkraut I. and Aggarwal A.K. Structure of BamHI endonuclease bound to DNA: Partial folding and unfolding on DNA binding // Science. 1995. Vol. 269. P. 656-663.

37. Orlowski J. and Bujnicki J. M. Structural and evolutionary classification of Type II restriction enzymes based on theoretical and experimental analyses // Nucleic Acids Research. 2008. Vol. 36 (11). P. 3552-3569.

38. Pertzev A.V., Kravetz A.N., Mayorov S.G., Zakharova M.V., Solonin A.S. Isolation of a strain overproducing endonuclease Eco29kI: purification and characterization of the homogeneous enzyme // Biochemistry (Mosc). 1997. Vol. 62(7). P. 732-741.

39. Pertzev A.V., Ruban N.M., Zakharova M.V., Beletzkaja I.V., Petrov S.I., Kravetz A.N., Solonin A.S. Eco29kl, a novel plasmid encoded restriction endonuclease from Escherichia coli II Nucl. Acids Res. 1992. V. 20. P. 1991.

40. Pingoud A. and Jeltsch A. Recognition and clcavage of DNA by type II restriction endonucleases // Eur. J. Biochem. 1997. Vol. 246. P. 1-22.

41. Pingoud A. and Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases // Nucleic Acids Res. 2001. Vol. 18. P. 3705-3727.

42. Pommer A.J., Cal S., Keeble A.H., Walker D., Evans S.J., Kuhlmann U.C., Cooper A., Connolly B.A., Hemmings A.M. Mechanism and cleavage specificity of the H-N-H endonuclease colicin E9 // J. Mol. Biol. 2001. Vol. 314. P. 735-749.

43. Roberts R.J. and Halford S.E. Type II restriction endonucleases. In:(Eds.) Nucleases // Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 1992. P. 35-88.

44. Ruther U. A recA lacZ transformation host. // Nucleic Acids Res. 1981. V. 9. P. 40874098.

45. Sambrook J., Frith E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual // Cold Spring Harbor Lab. Press. New York. 1989.

46. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc Natl Acad Sci USA. 1977. Vol. 74(12). P. 5463-5467.

47. Saravanan M., Bujnicki J.M., Cymerman I.A., Rao D.N. and Nagaraja V. Type II restriction endonuclease R.Kpnl is a member of the HNH nuclease superfamily // Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32. P. 6129-6135.

48. Sasnauskas G., Halford S. E. and Siksnys V. How the Bfil restriction enzyme uses one active site to cut two DNA strands // PNAS. 2003. Vol. 11. P. 6410-6415.

49. Sasnauskas G., Jeltsch A., Pingoud A. and Siksnys V. Plasmid DNA cleavage by Muni restriction enzyme: single-turnover and steady-state kinetic analysis // Biochemistry. 1999. Vol. 38. P. 4028-4036.

50. Shen B.W., Landthaler M., Shub D.A., Stoddard B.L. DNA binding and cleavage by the HNH homing endonuclease I-Hmul // J. Mol. Biol. 2004. Vol. 342. P. 43-56.

51. Shibata Т., Ikava S., Kim C., Ando T. Sate specific deoxyribonucleases in Bacillus subtilis and other Bacillus strains // J. Bacteriol. 1976. Vol. 128. P. 473-476.

52. Shimotsu H., Takahashi H., Saito H. Site-specific endonucleases in Streptomyces strains //Agric. Biol. Chem. 1980. Vol. 44. P. 1665-1666.

53. Siksnys V., Skirgaila R., Sasnauskas G., Urbankc C., Cherny D., Grazulis S., Huber R. The CfrlOI restriction enzyme is functional as a tetramer // J Mol Biol. 1999. Vol. 291(5). P. 1105-18.

54. Sistla S. and Rao D.N. S-adenosyl-L-methionine-dependent restriction enzymes // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2004. Vol. 39. P. 1-19.

55. Soundararajan M., Chang Z., Morgan R. D., Heslop P. and Connolly B. A. DNA binding and recognition by the lis restriction endonuclease MboII // J Biol Chem. 2002. Vol. 277(2). P. 887-895.

56. Tamulaitis G., Sasnauskas G., Mucke M., Siksnys V. Simultaneous binding of three recognition sites is necessary for a concerted plasmid DNA cleavage by EcoRII restriction endonucleases // J Mol Biol. 2006. Vol. 358(2). P. 406-419.

57. Tamulaitis G., Solonin A.S., Siksnys V. Alternative arrangements of catalytic residues at the active sites of restriction enzymes // FEBS Letters. 2002. Vol. 518(1-3). P. 17-22.

58. Taylor J.D. and Halford S.E. The activity of the EcoRV restriction endonuclease is influenced by flanking DNA sequences both inside and outside the DNA-protein complex // Biochemistry. 1992. Vol. 31. P. 90-97.

59. Terry B.J., Jack W.E. and Modrich P. Facilitated diffusion during catalysis by EcoRI endonuclease: nonspecific interactions in EcoRI catalysis // J. Biol. Chem., 1985. Vol. 260. P. 13130-13137.

60. Venclovas C., Timinskas A. and Siksnys V. Five-stranded beta-sheet sandwiched with two alpha-helices: a structural link between restriction endonucleases EcoRI and EcoRV // Proteins. 1994. Vol. 20. P. 279-282.

61. Wah D.A., Bitinaite J., Schildkraut I. and Aggarwal A.K. Structure of Fokl has implications for DNA cleavage // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 1056410569.

62. Wende W., Grindl W., Christ F., Pingoud A. and Pingoud V. Binding, bending and cleavage of DNA substrates by the homing endonuclease Pl-Scel // Nucleic Acids Research. 1996. Vol. 24 (21). P. 4123^132.

63. Werner W. E. Ferguson Plot Analysis of High Molecular Weight Glutenin Subunits by Capillary Electrophoresis // Cereal Chem. 1995. Vol. 72(3). P. 248-251.

64. Wilson G.G. and Murray N.E. Restriction and modification systems // Annu. Rev. Genet. 1991. Vol. 25. P. 585-627.

65. Xia Y., Burbank D.E., Van Etten J.L. Restriction endonuclease activity induced by NC-1A virus infection of a Chlorella-like green alga // Nucleic Acids Res. 1986. Vol. 14. P. 6017-6030.

66. Yoshioka K. KyPlot — a user-oriented tool for statistical data analysis and visualization // Comput. Stat. 2002. Vol. 17. P. 425-437.

67. Zakharova M.V., Pertzev A.V., Kravetz A.N., Beletskaya I.V., Shlyapnikov M.G. and Solonin A.S. Complete nucleotide of the Hsd plasmid pEC029 and identification of its functional regions // BBA. 1998. Vol. 1398. P. 106-112.

68. Zaremba M., Sasnauskas G., Urbanke C., Siksnys V. Conversion of the tctrameric restriction endonuclease Bse634I into a dimer: oligomeric structure-stability-function correlations // J Mol Biol. 2005. Vol. 348(2). P. 459-78.

69. Zaremba M., Sasnauskas G., Urbanke C., Siksnys V. Allosteric communication network in the tetrameric restriction endonuclease Bse634I // J Mol Biol. 2006. Vol. 363(4). P. 800-812.1. БЛАГОДАРНОСТИ

70. Выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю к.б.н. Марине Викторовне Захаровой за руководство, моральную поддержку и постоянную помощь при выполнении данной работы.

71. Особо благодарна зав. лабораторией «Молекулярной микробиологии» к.б.н. Александру Сергеевичу Солонину за ценные советы, критические замечания и помощь в написании диссертационной работы.

72. Я глубоко признательна всем сотрудникам нашей лаборатории за поддержку и помощь, оказанную мне в процессе выполнения экспериментов.

73. Выражаю большую благодарность д.м.н. Япушу Буйницкому (Институт молекулярной биологии, г. Варшава, Польша) за сравнительный анализ эндонуклеаз I-Tevl и Eco29kI и предоставленные компьютерные модели этих белков.

74. Я благодарю Еремина Сергея Александровича (МГУ) за предоставленную возможность повысить свою квалификацию на базе лаборатории «Биотехнологии» при МГУ и помощь в освоении новых методик.

75. Я признательна всем сотрудникам лаборатории «ДНК-белковых взаимодействий» института Биотехнологии (Вильнюс, Литва) за оказанную мне помощь в приобретении новых знаний и навыков в области кинетики взаимодействий.

Информация о работе

Ибряшкина, Елена Михайловна
кандидата биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Структурно-функциональные основы каталитической активности эндонуклеазы рестрикции Eco29kI - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы