Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика нового семейства сайт-специфических эндонуклеаз, кодируемых Т5-подобными бактериофагами

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика нового семейства сайт-специфических эндонуклеаз, кодируемых Т5-подобными бактериофагами"

на правах рукописи

АКУЛЕНКО НАТАЛЬЯ ВИКТОРОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОГО СЕМЕЙСТВА САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЭНДОНУКЛЕАЗ, КОДИРУЕМЫХ Т5-ПОДОБНЫМИ БАКТЕРИОФАГАМИ

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО - 2006

Работа выполнена в лаборатории структурно-функционального анализа генетических систем микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН

кандидат биологических наук В.Н. Ксензенко

доктор биологических наук, профессор ЯМ. Бурьянов

доктор биологических наук Л. А. Железная

Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится " 5 " октября 2006 г. в _15_ час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН

Автореферат разослан " 5 " сентября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ъе^

^молихина Т.И.

Актуальность проблемы. В составе интронов типов I и II часто присутствуют открытые рамки считывания (ОРС), кодирующие сайт-специфические эндонуклеазы, инициирующие перенос интрона с фланкирующими его участками ДНК в лишенный данного интрона аллель гена. Этот процесс получил название "хоуминг", а инициирующие его нуклеазы — "хоуминг-эндонуклеазами". На основании наличия в аминокислотных последовательностях указанных нуклеаз специфических мотивов их подразделяют на 4 семейства: "LAGLIDADG", "GIY-YIG", "His-Cys box" и "Н-N-H". Последнее из них отличается особым разнообразием. Помимо хоуминг-нуклеаз, кодируемых интронами, нуклеазный H-N-H-домен присутствует в последовательностях эндонуклеаз рестрикции, обратных транскриптаз, резолваз, белков, участвующих в упаковке ДНК, а также бактериоцинов (колицинов, пиоцинов, клебсиелинов). Каталитический домен H-N-H-нуклеаз, по-видимому, отличается структурной обособленностью, что и привело к возникновению в ходе эволюции различных комбинаций этого домена с другими функциональными доменами. Необычная его комбинация была недавно выявлена в структуре эндонуклеазы \-Hmul - единственной сайт-специфической H-N-H-нуклеазы с известной пространственной структурой. Этот фермент, как и, по-видимому, ряд других ферментов этого типа, отличается от большинства ранее изученных сайт-специфических нуклеаз удивительно вытянутой структурой с четко отделенными друг от друга доменами, причем узнающие домены с обеих сторон фланкируют каталитический домен. Очевидно, что изучение подобных эндонуклеаз позволяет значительно расширить наше представление о механизмах белок-нуклеиновых взаимодействий.

Представляет также интерес изучение генетической роли эндонуклеазы I-Hrnul и ряда гомологичных ей H-N-H-нуклеаз (l-Hmull, l-Basl и I-7woI), вносящих одноцепочечные разрывы в ДНК. Известно, что эндонуклеазы \-Нти\ и \-Hmu\l инициируют процесс хоуминга. Механизм инициации этого процесса на молекулярном уровне еще предстоит раскрыть, поскольку до сих пор полагали, что перенос интронов инициируется внесением только

двуцепочечных разрывов в ДНК, репарация которых и лежит в основе хоуминга. Интересно, что эндонуклеазы \-Нти\ и 1-НтиП, помимо чужеродной ДНК, разрезают и ДНК "своего" организма, что позволяет предположить участие этих ферментов в других рекомбинационных событиях.

Цели работы. Основной целью данной работы являлось разностороннее изучение четырех гомологичных Н-Ы-Н-нуклеаз, кодируемых Т5-подобными фагами.

Научная новизна. В результате данной работы были впервые охарактеризованы четыре гомологичные сайт-специфические Н-Ы-Н-эндонуклеазы, гены которых расположены вне интронов. Впервые проведено картирование сайта узнавания подобных эндонуклеаз на примере эндонуклеазы Р-7уШ, что позволило предложить возможный механизм узнавания ДНК этими ферментами. В результате анализа аминокислотных последовательностей исследумых эндонуклеаз, а также их предполагаемых сайтов узнавания, было выдвинуто предположение о причинах разной субстратной специфичности этих ферментов. Кроме того, эти результаты также послужили основанием для выдвижения гипотезы о возможном эволюционном происхождении подобных эндонуклеаз.

Практическая значимость работы. Полученные в данной работе результаты имеют в основном фундаментальное значение, однако некоторые из них могут найти и практическое применение. Изученные в данном исследовании ферменты могут быть использованы для создания нуклеаз с заданной специфичностью. Эндонуклеазы, вносящие одноцепочечные разрывы в ДНК, также могут быть использованы в ходе проведения олигонуклеотид-направленного мутагенеза на этапе удаления нити "дикого" типа. Кроме того, для эффективного клонирования ПЦР-фрагментов, получаемых с помощью ДНК-полимераз, у которых отсутствует корректирующая активность, могут быть сконструированы специализированные вектора, содержащие инвертированные сайты эндонуклеазы Г-Т/11У.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертации изложены в 6 публикациях. Результаты работы представлены на конференциях "Биология —

4

наука XXI века" (г. Пущино, 2001 г.); "Phage Around the World" (г. Олимпия, США, 2001 г.); "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (г. Москва, 2002 г.); на ежегодных научных конференциях Института белка РАН (г. Пущино, 2001 г. и 2004 г.) и Института микробиологии и физиологии микроорганизмов (г. Пущино, 2001 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения результатов и их обсуждение, выводов и списка цитируемой

литературы. Диссертация изложена на_страницах машинописного текста,

содержит_рисунков. Список литературы включает_источника.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. В области генов тРНК бактериофагов Т5 и BF23 Escherichia coli, я также фага 5 Salmonella enterica sv. Heidelberg обнаружены ОРС, кодирующие предполагаемые H-N-H-эндонуклеазы.

Ранее в лаборатории генной инженерии Института белка РАН были определены нуклеотидные последовательности областей генов тРНК трех близкородственных бактериофагов: фагов Т5 и BF23 Е. coli, а также фага 5 (<р5) S. enterica sv. Heidelberg (номера в базах данных EMBL/GenBank/DDBJ соответственно AJ85756, AJ604530 и AJ604531). Аминокислотные последовательности трех ОРС из указанного участка генома фага Т5 оказались гомологичными известным хоуминг-эндонуклеазам из семейства H-N-H (I-HmuJ, l-HmuII, l-Basl и I-7woI). Две ОРС (обозначены как гены hegC и hegD) отсутствуют в соответствующих участках геномов фагов BF23 и <р5, тогда как третья ОРС (hegА), помимо фага Т5, присутствует также у фага BF23. В то же время, у фага ср5 была обнаружена еще одна ОРС (hegB), также кодирующая предполагаемую H-N-H-эндонуклеазу. Аминокислотные последовательности всех четырех ОРС являются гомологичными, причем гомология между HegB, HegC и HegD выявляется по всей длине последовательности, тогда как в случае HegA - только в центральной части и в С-концевом участке (рис. 1а). Анализ

5

(.а)

НедА (Е- ■Tfl.1V) 1 1

НедС (Р- ■Т«1) 1

НедС (Е- -ТГЛ1) г

НедВ (Е- •Т/ЛИ) 1

НедА (Р- ■тепч) 61

НедС (Г- ■ТП1) 35

НедО (Е- •МП) 38

НедВ (Г- ■ГГЛ11) 36

НедА (Е- ■ГШУ) 121

НедС (Е- ггл) 88

НедО (Г- ■тшц 91

НедВ (Е" МЛН) 90

НедА (Г- ГГЛУ) 1"

И!!Т01ЬБККЕЕ1А0И1А0СК5РСАЕ1АКМЬ$СЗЗ№ .....................МОЩурВКИ

1РТНН0УОШ<УКЗ ГТИУ1зну1У КзНгЯтннъо

|1ЕИУИКРТ1М

НедС НедО НедВ

(Е-ТГЛ)

(Г-ГГЛ!)

|Г-ГИШ]

ЕОЬКРНКСЕЗСвЬЕЗИЬОКР!

.....ЬЕОр|

Р......SI.ES

|р......зьоэ

изовя......УР|Р:

. ик1Р .т!'

§се|л|иат:-:|: зьмьснзотж

КСЛЯ.'ЗЗК!!'

н-м-н

1кг|тПа1.. иы |ти|вртекык ЕЛКИ____г. г

.ТКБ

^Щмк____

'ЬТЕОРКБК. ^Икузоуо к.. . .

(б)

1-ЯтиИ 1-Ягаи1

НедС 1Т-ТПI) НедБ (Е-ГГЛ!) НедВ (Г-Г«III)

ЙПИЯОИКЗЬКвКЙУЬКТМЮ!: |ЗЫТ|Е|У51К30КТЬКН01РКП

ЕЗТЕТНКУЬгЮТУ 'ЗРУЩЕЙУЗТКЗККЬЬТННЬС

зтхгжуъкрпшк _I I

ккнПг ко Нн: о

баВР: ек Иг

ШМ004А

|1¥1НЬТК03 КККА1Т1ИЬУА1,

ииет-пям ¡«;КТЕО\РН1Л/А1 раукьохыс КОТЗУЫИПКО

РГУТГУЕОЙ КОТ31УьНьНАК |унгаукептккукльоьИ^1 И!! ] I-1

ыимоо4в

ШМ004С

НедА (Е-г/ЛУ) НедС (F-rr.Il) НедО (F-rr.Ul) НедВ |р-г/ЛП|

Т1А11НСЕ133НАТН1К31ТРКС

ПртжзшьокзутвтАСРКР руюкотзвзктЬЛкркз

^УМКЕИНЗСПЕУШлЯзРУК

[к-Щотяютзаутщзкщмп«

(Г)

ЕАУьагал! РТИОУОЫКЩКЗАТЕП, ' •г.оукёизоАчл/Еи.юкзЕЬ

РГВУКЗКАНЬТАЬА1КККИ аакЗ^ЕААУИУНОЕЫЕ |СУЕвр1АЬЬЫ|ьЗЗУЗМТ !1№р1кТС!УАс1АААТеИ ;АА|КТЬААА|аауьсИ

Рис. 1. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей Не§А, HegB, Не§С и Не§0 (я), этих белков с эндонуклеазами \-Hmul и \-Hmu\l (б), с \-Tevl (в), а также Не§А с транскрипционными регуляторами семейств ЬихЯ и Р1хД/ЦЬрА (г). В а и г выделены аминокислотные остатки, совпадающие более чем в 50% случаях; в 6- остатки, консервативные для домена НиМСЮ4; в в - консервативные остатки цистеинов в структуре "цинкового пальца".

аминокислотных последовательностей указанных белков с целью поиска известных белковых мотивов или доменов выявил наличие в них Н-Ы-Н-мотива (1РЫ003615 в базе данных 1шегРго), аминокислотные остатки которого принимают участие в формировании каталитического центра Н-И-Н-эндонуклеаз (рис. 1а). Помимо этого, в Ы-концевых участках Не§В, Не§С и HegD обнаружен составной ДНК-связывающий домен >ШМ(Ю4 (1РЯ010902), найденный ранее в составе эндонуклеаз \-Нти\ и \-Hmull (рис. 16). И-концевой участок Не§А гомологичен узнающему НТН-домену транскрипционных регуляторов, относящихся к семействам ЬихЫ и Р1х1/ШрА (1РЯ000792 и 1Р11009059; рис. 1г).

2. Гены hegA, hegB, и кодируют сайт-специфические

эндонуклеазы.

Для доказательства функциональной активности предполагаемых эндонуклеаз были синтезированы транскрипты, содержащие соответствующие ОРС, и транслированы в бесклеточной системе синтеза белка из зародышей пшеницы (реакция трансляции была проведена Л.А. Шалойко, ФИБХ РАН). В результате были получены в основном полноразмерные продукты, молекулярная масса которых соответствовала расчетному значению: HegA (25,8 кДа), НеёВ (22,1 кДа), НеёС (22,2 кДа) и ^О (22,2 кДа) (рис. 2).

кДа ^У^е^^ 97 _>|

66_» Рис. 2. Анализ продуктов экспрессии

39 генов hegA, hegB, Ъе^О, и Не^О в

^ бесклеточной системе трансляции.

26 "" Продукты трансляции анализировали

21 15% ЗОЯ гель-электрофорезом с

и-» последующей радиоавтографией гелей.

Тестирование активности предполагаемых эндонуклеаз проводили с использованием ПЦР-фрагментов, синтезированных с ДНК близкородственных фагов, у которых исследуемая ОРС отсутствует. Субстраты включали последовательности ДНК, фланкирующие место расположения

7

соответствующей ОРС у фага Т5 или фага ф5. Структуры субстратов, использованных для тестирования HegA и HegB, представлены на рисунке 3. 32Р-меченые по обеим цепям субстраты инкубировали с аликвотами реакционных смесей, полученных в результате трансляции in vitro соответствующих мРНК. Анализ продуктов гель-электрофорезом в неденатурирующих условиях показал, что только в случае HegA наблюдается гидролиз ДНК-субстрата (рис За). Продукты гидролиза ДНК-субстратов белками HegB, HegC и HegD были выявлены электрофорезом в денатурирующих условиях (рис. 36, показано на примере белка HegB). Таким образом, на основании результатов, полученных в этих экспериментах, был сделан вывод о том, что продукты генов hegA, hegB, hegC и hegD действительно являются сайт-специфическими эндонуклеазами, которые были обозначены соответственно как V-TJRV, F-7/ЛП, F-777I и Y-TJRl (Т five - like bacteriophages) согласно принятой номенклатуре (Belfort and Roberts, 1997). Кроме того, из этих результатов следует, что эндонуклеаза F-T/RW вносит двуцепочечный разрыв в ДНК, тогда как эндонуклеазы F-7)7I, F-TJT11 и F-777III -

(0)

(ш 2.3 тРНК1еи2 fm 2.2'

зс

_ (б)

TPHKfWet трнкРго

НедА

субстрат

субстрат НедВ

Рис 3. Характеристика эндонуклеазной активности продуктов генов hegA (а) и hegB (б). 32Р-меченые по одной или по обеим цепям (указано звездочкой) субстраты инкубировали с HegA (а) или HegB (б), синтезированными в бесклеточной системе трансляции. Продукты гидролиза анализировали гель-электрофорезом в 6% ПААГ (а) или 6% ПААГ, содержащем 8 М мочевину (б), с последующей радиоавтографией. Схема синтеза субстратов с ДНК фага q>5 (а) или фага BF23 (б) с использованием праймеров (обозначены стрелками) приведена над каждым из радиоавтографов.

одноцепочечные разрывы. Использование в качестве субстратов 32Р-меченых по одной из цепей фрагментов ДНК позволило установить, в какую из цепей соответствующие эндонуклеазы вносят разрывы. Так, например, было показано, что эядонуклеаза ¥-Т/1Ш расщепляет верхнюю цепь ДНК (рис. 36). С целью точной локализации мест разрывов полученные в этих экспериментах продукты гидролиза разделяли в денатурирующем полиакриламидном геле параллельно с продуктами секвенирующих реакций соответствующих ДНК-субстратов (рис. 4; показано на примере эндонуклеаз Р-7)71У и ¥-Т/Ж1). В результате было показано, что эндонуклеаза Т-Т/ПУ вносит двуцепочечный разрыв в ген тРНК1си2 фага ф5 (рис. 5г). При гидролизе образуются 3'-выступающие концы из 1 и.о., что не характерно для хоуминг-нуклеаз, которые, как правило, образуют выступающие концы из 2-4 н.о. Картирование положения разрывов, вносимых в ДНК эндонуклеазами Б-7/71, Р-Т/П.1 и ¥-Т/1Щ, показало, что эндонуклеаза Т-Т/й разрезает кодирующую цепь гена тРНК8сг2 фага ВР23 (рис. 5а), тогда как эндонуклеазы ¥-Т/1\\ и Б-777111 разрезают

(о)

АвСТХ

ТСС АХ

(б)

АОСТХ

»¡Р*

К

Г

верхняя цепь ДНК нижняя цепь ДНК

5' -ТАЕСТАСТСОАСТТМААТТСАвВТТТТВТ-З' 5' -АССТССОАССССААТСАТССААСОСТСССА-З'

3' -АТССАТСАССТСАА^ГТТТАА<ЗТССААААСА-5' 3' -ТССАС0СТ00ССТТСЗТА50ТТССеА6ССТ-5'

Рис. 4. Локализация разрывов, вносимых в ДНК эндонуклеазами ¥-Т/П.\ (а) и Б-7111 (б). Продукты гидролиза (X) и секвенирующих реакций (А, в, С, Т) ДНК-субстратов анализировали в 6% ПААГ, содержащем 8 М мочевину, с последующей радиоавтографией гелей. Последовательность сайта узнавания приведена под каждым из радиоавтографов. Места внесения разрывов указаны стрелками.

матричные цепи соответственно генов тРНКс|П1 и тРНКРго фага BF23 (рис. 56 и в). Позднее были локализованы дополнительные разрывы, вносимые в ДНК эндонуклеазами F-Tfll, F-Tflll и F-77?III (рис. 5). Обращает на себя внимание тот факт, что все эти разрывы локализованы в пределах генов тРНК. Кроме того, эндонуклеазы F-Tfll и F-Tflll разрезают как ДНК близкородственного, так и "своего" фага, что было показано также в случае эндонуклеаз l-Hmul и 1-НтиО. (Goodrich-Blair and Shub, 1996).

3. Эндонуклеазы F-7//II и ¥-TfH\\ — первые неоизошизомеры среди хоуминг-нуклеаз.

Высокая гомология аминокислотных последовательностей эндонуклеаз F-7/71, F-Tflll и F-T/RH позволяет выдвинуть предположение о том, что эти нуклеазы способны узнавать сайты друг друга. Действительно, нами было показано, что эндонуклеаза F-Tflll способна узнавать оба сайта эндонуклеазы F-7)7111 (рис. 5в). Однако характер расщепления этих сайтов различается. В отличие от эндонуклеазы F-Tfllll, эндонуклеаза F-Tflll вносит разрывы в сайт, локализованный в гене тРНКРг0 фага BF23, в двух соседних положениях, при этом одно из этих положений совпадает в случае обеих нуклеаз, а другое смещено на 1 н.о. (сравните рис. 56, сайт 6 и рис. 5в, сайт 1). При гидролизе эндонуклеазой F-Tflll сайта, расположенном в гене тРНКРго фага Т5, преимущественная точка разрыва также смещена на 1 н.о. (сравните рис. 56, сайт 7 и рис. 5в, сайт 2). Таким образом, эндонуклеазы F-JJTII и F-7)71II, по-видимому, ведут себя, как неоизошизомеры эндонуклеаз рестрикции. По нашим сведениям, наличие неоизошизомеров среди хоуминг-нуклеаз до настоящего времени показано не было.

В то же время, эндонуклеаза F-Tfllll не способна узнавать по крайней мере большинство сайтов, обнаруженных ранее для эндонуклеазы F-Tflll (рис. 56; проанализированы сайты 1, 3-5). Ранее также было показано, что эндонуклеазы F-Tfll и F-Tflll не узнают сайты друг друга (данные получены Н.М. Шестаковой, ИБ РАН).

(а)

| участок 1

1) 5 ' -ДА ГССААТТ ЗЕССАСвААААССНСТ ГСеАААОТ 3- 3 '

2) 5' -ДЖТАеАС'ЮеСбЛеТДДАСССЕД'ПГССААЛТСК- 3'

(б). участок 2

1) 5'-село! ~

. 2) 5'-ТвСАТ|

3) 5'-Е5СА|гС6ААСС

4) 5'-ССАС ГТСААСС

5) 5' -ССА1ТГССААСС

* **

Р-ТЯП | участок 1

'ассаттаассзаЕтЕаааШгс-з '

ЛЕАТСТСбАС

ГТСАААСЙ

\GGAACCTTCGGA ЗТСАСАС<±:С-3

:тсвттттстссс гссАААсске-з

'ТСААААССССАСТГТСТААСддАС - 3

6) 5 ' -ОгАдтССААСОГОСеАСССЕААСС \TCCAAGC -3 ' 7} 5'-БАсассААесптсАДссссАссЕскссАААсдзт-з' консенсус: ТСЕААСС ТСАААОй

(е) ™

участок 2 | участок 1

1) 5' -ООАЖСйААСаГОСОАСССЕААССЙТССААЙбСТ-З'

2) 5' -5САОГССААССГГТСААССССАесСсЬесАААСа;-31

БЬ-23; ген тРНКЭвГг Т5; ген тРНКЗег2

ВГ23г ген тРикО!.^

Т5; ген тРНКб!.!^

ВГ23; ген тРНКС1п2

ВГ23; ген тРНКА1а

ВГ23; ген тРНКЬеи!

ВГ23; ген тРНК?го Т5; ген тРНКРго

ВГ23; ген тРНКРг° Т5; ген тРНКРго

(г)

участок 2

5'-ААДСЗААТИСССАТАеОТАСТЕСАСТТ: 3'-ТТАССТТААСССТАТССА'

0)

уч«сток2

;ТТТТ5Т666ТТС3ДАТ.3,

ТТТААдТССААААСАСЮСААССЯГ А- 5'

|-Нти1

фаг 5; ген тРНКЬе1)2

5 • -АССТТАфтеССААТ^СТОйЬсС! ГАСЕСТС АТ-3 '

1 1ЕЯК1 I аз 1 внн (гомс®4

ЭР01; ген ДНК-полимеразы

Рис. 5. Нуклеотидные последовательности, фланкирующие место внесения разрыва эндонуклеазами ¥-Т/П (а), Р-7/7П (б), р-7)7111 (в), Р-ЩУ (г) и \-Hmul (д). Приведена цепь ДНК, в которую соответствующая нуклеаза вносит разрыв (одна цепь - в случае эндонуклеаз Т-Т/11, Б-77711, Р-7/7Ш, 1-Нти\ и обе цепи -для эндонуклеазы Б-7^71 V). Последовательности выравнены относительно мест внесения разрывов (обозначены стрелками). Дополнительные разрывы в сайтах эндонуклеазы Б-7/711 указаны треугольником. Нуклеотидные остатки, совпадающие во всех последовательностях, узнаваемых эндонуклеазами Т-Т/И и Р-7/7Ш, указаны звездочками. Консенсусные последовательности в сайтах узнавания эндонуклеаз Б-7/71, Р-Т/1П, Т-Т/ПП и Б-7/71V обведены сплошной линией. Симметричные нуклеотиды в сайте ¥-Т/Г1У расположены на черном фоне. Нуклеотидные последовательности, контактирующие с мотивами Ж1МСЮ4 и Н-Ы-Н в сайте узнавания эндонуклеазы 1-Нти1, обведены сплошной линией, а с мотивом 1Е>Ж1 и спиралью НЗ — пунктирной линией. .

4. Разработана схема выделения и очистки эндонуклеаз F-Tßl и F-Tßll.

В дальнейших экспериментах более подробно были охарактеризованы эндонуклеазы F-Tßl и F-7J7II. С этой целью A.B. Калиманом (ИБ РАН) гены hegC и hegD, кодирующие эти эндонуклеазы, были клонированы соответственно в экспрессионные вектора трансляции pBADexl и pBADex2. Условия экспрессии клонированных генов были оптимизированы нами таким образом, чтобы понизить уровень базового синтеза изучаемых нуклеаз в отсутствии индуктора (арабинозы) и увеличить выход синтезируемых продуктов при его добавлении (рис. 6а; показано на примере гена hegC).

Схема очистки была первоначально разработана для эндонуклеазы F-Tfll, а затем использована и в случае выделения эндонуклеазы F-Tflll. Она включала следующие этапы: удаление нуклеиновых кислот, дробное высаливание белков сульфатом аммония, хроматографию на гепарин-сефарозе, очистку на

(«) (б)

Рис. 6. Экспрессия и очистка эндонуклеазы F-777I. (а) Экспрессия гена hegC, кодирующего эндонуклеазу F-Tfll. Белки, синтезированные в клетках Е. coli, содержащих плазмиду pBADexl или pBADexl -F-7y/I, до (-) или после (+) индукции анализировали 15% SDS-гель-электрофорезом. (б) Очистка эндонуклеазы F-Tfll. Стадии очистки указаны над электрофореграммой.

последовательно соединенных колонках с ионообменными носителями Mono Q и Mono S. В результате были получены препараты ферментов со степенью очистки более 90% (рис. 66; показано на примере эндонуклеазы F-TJJ1).

5. Эндонуклеазы Г-7/71 и Р-7)711 наиболее активны при экстремальных значениях рН и температуры.

При определении оптимальных условий гидролиза ДНК эндонуклеазами Т-Т/П. и ¥-Т/П1 было исследовано влияние рН, температуры и ионов одновалентных металлов на активность этих ферментов (рис. 7). Оба фермента наиболее активны при необычайно высоких для ферментов, функционирующих в клетках мезофильных бактерий (Е. соИ), значениях рН и температуры. Максимальная эффективность гидролиза ДНК эндонуклеазой Р-7)71 наблюдается в интервале значений рН 9 - 11 и температуры 50°С - 60°С. Эндонуклеаза Р-7/711, по-видимому, менее устойчива к воздействию этих факторов, так как ее активность резко уменьшается при увеличении рН выше 10, а температурный оптимум этой нуклеазы смещен в область значений 45°С -55°С. В отличие от большинства хоуминг-нуклеаз, активность Г-7)71 и Р-7)711 существенно не изменяется при увеличении концентрации ионов Ыа+ до 300 мМ. В то же время активность эндонуклеаз Р-7Щ1 и Р-27Л. значительно уменьшается при увеличении концентрации ионов К+ соответственно выше 100 мМ и 200 мМ.

Рис. 7. Зависимость активности эндонуклеаз Тг-Т/П (сплошная линия) и ¥-Т/К\ (пунктир) от рН (а), температуры (б) и ионов одновалентных металлов Ыа+ (А) и К» (в).

6. Активность эндонуклеаз ¥-Т/И и Г-77711 стимулируется широким спектром ионов двухвалентных металлов.

Изучение влияния ионов двухвалентных металлов Мп2+, гп2+, №2+,

Со2+, Си2+ и Са2+) на активность эндонуклеазы Б-7)711 показало, что все они, за исключением Са2+, стимулируют активность этой нуклеазы (рис. 8). В зависимости от минимальной концентрации, при которой наблюдается стимуляция гидролиза, эти металлы могут быть расположены в следующий ряд Мп2+> Си2+> Хпг+> №г+, Сог+> Следует также отметить, что в присутствии всех этих металлов, за исключением 2п2+ и Си2+, уровень гидролиза остается практически неизменным в широком диапазоне концентраций (1 мкМ - 10 мМ). Эндонуклеаза Б-7)71, в отличие от Б-7)711, расщепляет ДНК-субстрат в присутствии ионов Са2+, но ее активность не стимулируют ионы Си2+ (данные не представлены). Следует отметить, что стимуляция гидролиза таким широким спектром металлов показана только для некоторых представителей хоуминг-нуклеаз, например, таких как \-Ppol и \-Dmol.

О .ОИ^Л!

субстрат —к. , _ л , . , » ч *»> * **

продук^-Ц' ; #*> **

..',!■"__^_1£___ .' ','г.ь'-',__......

Мз'

субстрат -продукт—

«Вк!

1, *м*

Рис. 8. Влияние ионов двухвалентных металлов на активность эндонуклеазы Б-Т/П1.

7. Ион '¿п2+, по-видимому, связывается с "цинковым пальцем" изучаемых эндонуклеаз и в результате стабилизирует их структуру.

При разработке схемы очистки эндонуклеазы Б-7)71 было замечено, что присутствие в буферных растворах хелатирующих веществ, таких как ЭДТА,

приводит к быстрой потере активности фермента. На основании этого наблюдения нами было сделано предположение о том, что в состав эндонуклеаз Y-Tfll и F-Tflll входит ион(ы) переходных металлов. В связи с этим из буферных растворов исключили хелатирующие вещества и очистку ферментов проводили в присутствии ионов Zn2+. При изучении влияния ионов двухвалентных металлов на ферментативную активность эндонуклеаз были использованы препараты ферментов, предварительно тщательно диализованные против буферных растворов, не содержащих ионов двухвалентных металлов. Как видно из рисунка 8, эндонуклеаза F-2/111 не обладает ферментативной активностью в отсутствии последних. Аналогичные свойства характерны также для эндонуклеазы F-2JII (данные не представлены). Между тем, анализ полученных препаратов обеих эндонуклеаз с помощью атомно-адсорбционной спектроскопии выявил наличие в их составе одного иона Zn2+ из расчета на одну молекулу белка (анализ был проведен Е.В. Кашпаровой, ИБФМ РАН). На основании этих данных, а также того факта, что ионы Zn2+ стимулирует активность указанных нуклеаз, можно выдвинуть предположение о том, что они, помимо активного центра, связываются также с каким-то другим участком в молекулах изучаемых белков. Анализ аминокислотных последовательностей обнаруженных в данной работе эндонуклеаз выявил в них наличие участков, содержащих четыре остатка цистеина, расположение которых Друг относительно друга сходно с таковым в структуре эндонуклеазы l-Tevl (рис. 1в). Эти остатки цистеина эндонуклеазы l-Tevl связывают ион Zn2+ и участвуют в формировании "цинкового пальца", который определяет расстояние между последовательностями, узнаваемыми каталитическим и узнающим доменами (Van Roey et al., 2001). Можно предположить, что аналогичную роль указанные домены выполняют и в случае изучаемых эндонуклеаз. "Цинковый палец" в этих эндонуклеазах может также участвовать в стабилизации их структуры. Такое предположение может быть сделано на основе наших наблюдений о функциональной и протеолитической нестабильности эндонуклеазы F-7/7I в присутствии хелатирующих агентов.

8. Эндонуклеаза ¥-Т/11\ специфично связывается с двумя участками ДНК, расположенными на противоположных концах сайта узнавания.

При характеристике сайта узнавания эндонуклеазы Р-7^711 было использовано два подхода. В первом случае комплекс эндонуклеазы с фрагментом ДНК обрабатывали ДНКазой I или модифицирующими агентами (гидроксильными радикалами или диметилсульфатом). Во втором случае комплекс формировали с предварительно модифицированным ДНК-субстратом (метилированным, этилированным или субстратом с удаленным нуклеозидом). Затем образовавшийся комплекс Р-7/Ш-субстрат и несвязавшийся субстрат разделяли электрофорезом в неденатурирующих условиях с последующим анализом каждого из них. Как в первом, так и во втором случаях продукты реакций непосредственно или после гидролиза ДНК в местах модификации (метилированная или этилированная ДНК) разделяли электрофорезом в денатурирующих условиях и анализировали. Эксперименты по "защите" ДНК эндонуклеазой ¥-Т/Ш от действия ДНКазы I и модифицирующих агентов позволили установить границы сайта узнавания изучаемого фермента, а также выявили его контакты с отдельными основаниями и сахаро-фосфатным остовом ДНК. Напротив, существенные для узнавания основания были выявлены в экспериментах, в которых комплексообразование проводили с модифицированными субстратами. В качестве примера приведены результаты анализа комплексообразования с метилированными ДНК-субстратами (рис. 9). Результаты всех экспериментов обобщены на рисунке 10.

Как было показано при картировании границ сайта узнавания эндонуклеазы Б-7)711 с помощью ДНКазы I, изучаемая нуклеаза контактирует с протяженным участком ДНК-субстрата длиной 36 н.п. (положения -24 - +12). При картировании с использованием низкомолекулярных гидроксильных радикалов был выявлен менее протяженный участок длиной 29 н.п. (положения -21 - +8). В пределах этой последовательности были локализованы два участка контактов фермента с основаниями ДНК-субстрата, расположенных несимметрично относительно места гидролиза: участок 1 (положения +2 - +9)

(8)

* V * V Т ▼ л

51 -слосАотсшхссгглсСАТтАлсааяат4оАмаассАттотаттлАссот-э1

-20 -1*0 "" +10 +д*о

3' -СТССТСХОСТГ<8САТСатААТтаССТСАЙ№ГТСОвСТЛАСАСААТТООСА-5 •

Рис. 9. Локализация пуриновых оснований ДНК-субстрата, метилирование которых препятствует образованию комплекса Р-Т/Ш-ДНК. (а) 32Р-меченый по одной из цепей ДНК-субстрат обрабатывали диметилсульфатом и инкубировали с эндонуклеазой Р-7)711. Связанный (К) и несвязанный (С) с нуклеазой субстрат разделяли электрофорезом в 6% ПААГ и гидролизовали щелочью. Полученные фрагменты ДНК и продукты секвенирования ДНК-субстрата (А+О разделяли в 8% ПААГ, содержащем 8 М мочевину, с последующей радиоавтографией гелей, (б) Денситометрическое сканирование радиоавтографов, (в) Остатки пуринов, метилирование которых существенно или незначительно препятствует образованию комплекса Р-ТуТП-ДНК, обозначены соответственно черными или белыми треугольниками; нумерация нуклеотидов дана относительно сайта гидролиза ДНК эндонуклеазой Р-Т/111.

прилегает к месту гидролиза, тогда как участок 2 (-13 - -19) - удален от него. В

этих участках изучаемая эндонуклеаза связывается с ДНК в основном со

стороны большого желобка, и только вблизи точки гидролиза она контактирует

с малым желобком ДНК-субстрата, что было показано в экспериментах по

"защите" ДНК эндонуклеазой Б-7/711 от метилирования, а также при

образовании комплекса изучаемой нуклеазы с метилированными ДНК-

субстратами. Следует отметить, что результаты этих двух экспериментов

17

практически совпадают, что указывает на важность всех выявленных контактов для процесса узнавания. В двух локализованных участках эндонуклеаза Б-7)711 связывается как с основаниями, так и с остовом ДНК-субстрата, тогда как в центральной части сайта узнавания эндонуклеаза Р-7)711 контактирует только с сахаро-фосфатным остовом ДНК. Следует отметить, что при связывании эндонуклеазы Б-7/711 с ДНК-субстратом контакты с остовом ДНК не играют такой существенной роли, как контакты с основаниями, так как этилирование ни одного из фосфатов ДНК-субстрата существенно не препятствует комплексообразованию. При образовании комплекса Р-7)Л1-субстрат происходит, по-видимому, изгиб ДНК-субстрата в центральной части узнаваемой эндонуклеазой последовательности. Это предположение основано на том, что в этой области наблюдается усиление гидролиза ДНКазой I по сравнению с прилегающими участками. Кроме того, образование комплекса приводит к усилению метилирования некоторых пуринов, расположенных в центральной части сайта узнавания.

Как было сказано выше, эндонуклеазы ¥-Т/11, Я-Т/П! и Б-7)7111 гомологичны по всей длине аминокислотной последовательности (рис. 1а). Анализ всех сайтов узнавания эндонуклеазы Б- 7)711 с учетом данных о локализации двух участков, нуклеотидные остатки которых существенны для узнавания, позволил выделить следующие консенсусные последовательности: 5 '-ТСАААСО-З' (участок 1) и 5'-ТСОААСС-3' (участок 2) (рис. 56). Обе эти последовательности были обнаружены в структуре сайтов эндонуклеаз Т-Т/П и Р-7)7Ш (рис. 5а и в). Следует отметить, что эндонуклеазы Р-Т/11, Т-7)711 и Б-7)7111 гомологичны с \-Hmul только в области расположения ЫЦМ004- и Н-Ы-Н-мотивов. Из рисунка 5д видно, что участок ДНК, с которым контактирует ДНК-связывающий домен ЫЦМОБ4 эндонуклеазы \-Hmul, имеет приблизительно тот же размер и такое же расположение относительно места разрыва, что и участок 1 сайта узнавания эндонуклеазы р-7)711. Таким образом, можно предположить, что домен КЦМОВ4 эндонуклеаз ¥-Т/й, Р-7)711 и Р-7)71 II контактирует именно с участком 1.

Рис. 10. Характеристика сайта узнавания эндонуклеазы Р-Т/Ш. (а) Линейное представление результатов картирования, (б) Контакты эндонуклеазы Б-7/711 с ДНК-субстратом, отмеченные на модели В-формы двойной спирали ДНК (10,5 н.п. на виток спирали). Нумерация нуклеотидных остатков дана относительно сайта гидролиза эндонуклеазы Р-Г/7Н. Место разрыва указано стрелкой; черной линией выделен защищаемый от ДНКазы I участок ДНК; О - слабо защищаемые от ДНКазы I основания; • - защищаемые от действия гидроксильных радикалов остатки дезоксирибозы; ♦ - нуклеозиды, удаление которых препятствует образованию комплекса Р-7/7П-ДНК; ▼ - пурины, метилирование которых препятствует образованию комплекса Р-7/711-ДНК; ш — защищаемые от метилирования пурины; и - пурины, метилирование которых незначительно усиливается в присутствии эндонуклеазы Р-7/711. Необходимые для образования комплекса Р-7/711-ДНК основания, выявленные в экспериментах с ДНК-субстратами с удаленным нуклеозидом и метилированными ДНК-субстратами, расположены на фоне серого прямоугольника.

Остается неясным вопрос, какой участок в структуре изучаемых

эндонуклеаз связывается со второй консенсусной последовательностью.

Выяснению этого вопроса могут способствовать следующие наблюдения.

Аминокислотные последовательности эндонуклеазы Р-7/ЛУ и эндонуклеаз Р-

7/71, Р-7/711 и Р-7/71П гомологичны исключительно в области Н-Ы-Н-мотива и С-

конца (рис. 1а). В то же время, в структуре единственного сайта узнавания этой

эндонуклеазы выделены два консенсуса, соответствующих участку 2 (рис. 5г).

Таким образом, можно предположить, что в С-концевом участке всех

19

идентифицированных в данной работе нуклеаз присутствует какой-то неизвестный на сегодняшний день ДНК-связывающий домен, и именно он узнает участок 2 в сайтах этих нуклеаз.

Перечисленные выше факты и наблюдения позволяют сделать вывод, что эндонуклеазы Т-Т/П, Т-Т/П1, ¥-Т/П11 и ¥-Т/ИУ имеют общую структурную организацию. У всех этих ферментов присутствует по крайней мере два узнающих домена, которые фланкируют каталитический П-Ы-Н-домен. Интересно отметить, что несмотря на отмеченное сходство, первые три эндонуклеазы вносят одноцепочечные разрывы в ДНК, а четвертая -двуцепочечный. Это различие, видимо, связано с тем, что эндонуклеаза в отличие от остальных, является димером. В пользу этого предположения говорит симметричная организация сайта узнавания этой эндонуклеазы (рис. 5г), а также наличие в ее структуре только одного мотива (Н-М-Н-мотив), способного формировать каталитический центр.

9. Тонкие механизмы узнавания ДНК эндонуклеазами Т-Т/П, ¥-Т/П1 и Р-Т/1Ш., по-видимому, различаются.

Из рентгеноструктурных данных комплекса эндонуклеазы \-Hmul с ДНК известно, что ее ДНК-связывающий домен КиМСЮ4, в отличие от эндонуклеазы ¥-Т/111, образует незначительное количество специфических контактов с сайтом узнавания, что говорит о разном узнающем потенциале домена КЦМСЮ4 у этих нуклеаз (БЬеп е1 а!., 2004). В то же время, эндонуклеаза \-Hmul, в отличие от эндонуклеазы Р-Т^Ш, образует специфические контакты в центральной части сайта узнавания, причем в формировании этих контактов принимает участие а-спираль НЗ. Интересно, что эта спираль не выявляется стандартными программами предсказания вторичных структур. Таким образом, можно предположить, что этот неструктурированный участок структурируется только при связывании с ДНК. Учитывая то, что неструктурированные участки белков могут принимать участие в узнавании ДНК (Ка1о<Итоз е1 а1., 2004), был проведен поиск этих участков в аминокислотных последовательностях эндонуклеаз \-Hmul, ¥-Т/й, ¥-Т/П\, К-7/7111 и Б-ЗТЛУ (анализ проведен О.В.

20

Галзитской и С.О. Гарбузинским, ИБ РАН). В последовательности эндонуклеазы \-Нти\ в месте расположения НЗ-спирали (аминокислотные остатки 111-119) был выявлен неструктурированный участок, обогащенный заряженными аминокислотными остатками. Интересно, что приблизительно в той же области эндонуклеаз ¥-Т/П (а.о. 97-109) и Р-77Ш1 (а.о. 92-102), в отличие от эндонуклеазы ¥-ТА11 и ¥-Т/КЧ, также обнаружены неструктурированные участки. В то же время, можно отметить высокую гомологию центральных участков в сайтах узнавания эндонуклеаз ¥-Т/П и Е-777Ш, которая отсутствует в сайтах ¥-Т/П\ (рис. 5). Таким образом, можно предположить, что у эндонуклеаз Р-Т/Л и ¥-Т/И\\, также как у эндонуклеазы I-Нти\, при связывании с ДНК-субстратом происходит формирование дополнительного узнающего участка, аминокислотные остатки которого способны образовывать специфичные контакты в центральной части сайта узнавания. Если это предположение справедливо, то, учитывая отсутствие гомологии между центральными участками сайтов узнавания эндонуклеаз Е-7)71, I'-7)711 и ¥-Т/11\\, становится понятной неспособность эндонуклеаз Р-7)71 и Р-7)7111 узнавать сайты эндонуклеазы Р-7)Л1.

Сравнивая участки 2 сайтов эндонуклеазы Р-7)71, можно отметить их низкую гомологию по сравнению с соответствующими участками эндонуклеаз Е-7)7Н, ¥-Т/П.1\ и Р-7)ЛУ. Это обстоятельство, по-видимому, указывает на низкий узнающий потенциал С-концевого домена эндонуклеазы ¥-Т/П. и высокий - у эндонуклеаз Р-77Л1, ¥-Т/Ш1 и Р-Т/ЛУ. Разница в узнающих потенциалах этих доменов, возможно, объясняется отсутствием одного из неструктурированных участков в С-конце эндонуклеазы Т-Т/П. по сравнению с эндонуклеазами ¥-Т/1П (а.о. 176-192), Р-Т/ЛИ (а.о. 178-191) и Р-7/ЛУ (а.о. 214227).

Таким образом, эндонуклеазы Р-7)711 и Е-7/71У, по-видимому, специфически связываются с ДНК-субстратом двумя узнающими доменами, тогда как эндонуклеазы \-Нти\, Р-7)71 и Р-7)7111 — тремя доменами. На основании сказанного выше можно предположить, что наличие двух доменов (И- и С-концевого) с высоким узнающим потенциалом достаточно для

21

правильного узнавания и ориентации каталитического центра этих ферментов. В то же время, в ходе эволюции, по-видимому, ослабление узнающего потенциала одного из них компенсировалось возникновением нового узнающего домена или усилением узнающего потенциала другого домена, или наоборот. В результате такого перераспределения плотности специфических контактов между ферментом и ДНК, по-видимому, и происходило возникновение новой субстратной специфичности подобных ферментов. Другой способ создания белков с новой специфичностью — обмен доменами между разными группами белков можно проследить на примере эндонуклеазы ¥-Т/ИУ. Как уже было сказано выше, вместо домена ЫЦМСЮ4, присутствующего в эндонуклеазах ¥-Т/11, ¥-Т/111 и Б-7)7111, на Ы- конце этого фермента расположен домен НТН, который обнаруживается также в структуре транскрипционных регуляторов семейства ЬихИ.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружены четыре новые сайт-специфические Н-Ы-Н-эндонуклеазы (обозначены как ¥-Щ, ¥-Щ1, ¥-Tfn.il и ¥-Т/11У), кодируемые Т5-подобными бактериофагами. Показано, что эндонуклеаза ¥-Т/ПУ вносит двуцепочечный разрыв в ДНК, образуя 3'-выступающие концы из 1 н.о, тогда как гомологичные ей эндонуклеазы ¥-Т/й, ¥-Т/Т11 и ¥-Т/й11 вносят одноцепочечные разрывы.

2. Показано, что эндонуклеазы ¥-Т/[11 и Р-7/7111 являются неоизошизомерами: они способны узнавать одни и те же сайты в ДНК, однако, отличаются по характеру их гидролиза.

3. Подобраны оптимальные условия экспрессии генов, кодирующих эндонуклеазы ¥-Т/11 и Р-7/711, а также разработана схема их выделения, позволяющая получить препараты этих белков со степенью очистки более 90%. Показано, что в состав эндонуклеаз Р-7/71 и Б-7/711 входит один ион 2п2+ из расчета на одну молекулу белка.

4. Исследована зависимость активности эндонуклеаз F-7/7I и F-TJRI от ионной силы, рН и температуры. Показано, что максимальная активность этих нуклеаз проявляется при экстремальных значениях рН (рН 10) и температуры (50°С - 55°С).

5. Изучена зависимость активности эндонуклеаз F-TfR и ¥-TfRl от широкого ряда ионов двухвалентных металлов (Mg2+, Mn2+, Zn2+, Ni2+, Со2+, Cu2+ и Са2+). Показано, что все эти металлы, за исключением Сиг+ (в случае эндонуклеазы F-TfR) и Са2+ (в случае эндонуклеазы F-TfR\)> стимулируют активность этих ферментов.

6. Картирован сайт узнавания эндонуклеазы F-TfRl. Показано, что фермент связывается с протяженным участком ДНК (29 н.п.). В пределах этой последовательности локализованы два участка контактов фермента с основаниями ДНК-субстрата длиной 8 н.п. (участок 1) и 7 н.п. (участок 2). Эти участки расположены несимметрично относительно места разрыва и удалены друг от друга на расстояние 13 н.п. В данных участках фермент связывается не только с основаниями, но и с остовом ДНК-субстрата, тогда как в центральной части сайта узнавания эндонуклеаза F-7/7II контактирует только с сахаро-фосфатным остовом ДНК. Показано, что эндонуклеаза F-7)711 взаимодействует с сайтом узнавания в основном со стороны большого желобка ДНК.

7. Выдвинута гипотеза о возможных путях возникновения различной субстратной специфичности гомологичных H-N-H-эндонуклеаз.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Акуленко Н.В.. Ивашина Т.В., Шалойко Л.А., Шляпников М.Г., Ксензенко В.Н. (2004). Новые сайт-специфические эндонуклеазы F-TJfll, F-Tfll\ и F-7)7IV, кодируемые бактериофагом Т5. Молекуляр. биол. Т. 38, с. 632-641.

2. Kulakova A.N., Kulakov L.A., Akulenko N.V.. Ksenzenko V.N., Hamilton J.T., Quinn J.P. (2001). Structural and functional analysis of the phosphonoacetate

23

hydrolase (phnA) gene region in Pseudomonas fluorescens 23F. J. Bacterid. V. 183, p. 3268-3275.

3. Artukh R., Akulenko N.. Ksenzenko V., Bourenkov G., Kachalova G., Bartunik H. (2002). Identification of zinc in phage T5 site-specific endonuclease V-Tfll. HASYLAB Annual Report 2002, Part II, Preface MPG-ASMB. http://www-hasvlab.desv.de/science/annual reports/ 2002 report/index2.html.

4. Акуленко H.B.. Шестакова H.M., Калиман A.B., Ксензенко B.H. (2001). Клонирование и экспрессия гена shhB бактериофага Т5, кодирующего сайт-специфическую эндонуклеазу. Сборник тезисов 5-ой конференции молодых ученых "Биология — наука XXI века", Пущино, с. 353.

5. Ksenzenko V.N., Akulenko N.V. Kaliman A.V., Shestakova N.M., Krutilina A.I., Ustanina S.V., Mayorov S.G., Kanapin A.A., Shlyapnikov M.G. (2001). Phage T5 encoded site-specific endonucleases: identification, gene cloning, biochemical properties. Abstracts of 2001 Evergreen International Phage Biology Conference "Phage Around the World", Olympia, WA, p. 37.

6. Акуленко H.B.. Шестакова H.M., Калиман A.B., Ксензенко B.H. (2002). Сайт-специфические нуклеазы бактериофага Т5: идентификация, клонирование, сравнительная биохимическая характеристика. Сборник тезисов 14-ой международной зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, с. 45.

к исполнению 05/09/2006 Исполнено 05/09/2006

Заказ № 583 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495)975-78-56

www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Акуленко, Наталья Викторовна

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы

1.1. Хоуминг-эндонуклеазы.

1.2. H-N-H-эндонуклеазы.

1.3. Каталитический центр H-N-H-эндонуклеаз.

1.3.1. Структура каталитического центра H-N-H-эндонуклеаз.

1.3.2. Роль иона металла в структуре активного центра H-N-H-эндонуклеаз.

1.3.3. Единство структурной и функциональной организации каталитического центра нуклеаз суперсемейства "рра-Ме".

1.3.4. Модель катализа гидролиза ДНК эндонуклеазами семейства H-N-H.

1.4. Генетическая роль H-N-H-эндонуклеаз.

1.5. Узнавание ДНК-субстратов хоуминг-эндонуклеазами.

1.5.1. Специфическое узнавание последовательности

ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами.

1.5.2. Взаимодействие эндонуклеазы l-Crel с сайтом узнавания.

1.5.3. Взаимодействие эндонуклеазы 1-Рро1 с сайтом узнавания.

1.5.4. Взаимодействие эндонуклеазы I-7evI с сайтом узнавания.

1.5.5. Взаимодействие эндонуклеазы l-Hmul с сайтом узнавания.

2. Материалы и методы

2.1. Плазмиды.

2.2. Штаммы бактерий и бактериофагов.

2.3. Базовые методы молекулярной биологии и биохимии.

2.4. ДНК-субстраты.

2.5. Получение матричной ДНК для транскрипции in vitro.

2.6. Транскрипция in vitro.

2.7. Синтез белка в бесклеточной системе трансляции из зародышей пшеницы.

2.8. Анализ нуклеазной активности.

2.9. Картирование точек разрыва ДНК.

2.10. Экспрессия и очистка эндонуклеаз F-777I и F-777II.

2.11. Картирование сайта узнавания эндонуклеазы F-Tflll.

2.11.1. Защита ДНК белком от воздействия ДНКазы I, гидроксильных радикалов и диметилсульфата.

2.11.1.1. Защита от ДНКазы 1.

2.11.1.2. Защита от гидроксильных радикалов.

2.11.1.3. Защита от диметилсульфата.

2.11. 2. Эксперименты с использованием модифицированных

ДНК-субстратов (метилированных, этилированных или с удаленным нуклеозидом).

2.11.3. Секвенирование ДНК-субстрата по Максаму-Гилберту (A+G).

2.11.4. Анализ расщепленных фрагментов ДНК.

2.11.5. Количественная обработка результатов.

2.12. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей.

2.13. Олигонуклеотиды.

3. Результаты 3.1. В области генов тРНК бактериофагов Т5 и BF23 Escherichia coli, а также бактериофага 5 Salmonella enterica sv. Heidelberg обнаружены OPC, кодирующие предполагаемые H-N-H-эндонуклеазы.

3.2. Гены hegA, hegB, hegC и hegD кодируют сайт-специфические эндонуклеазы.

3.3. Выявление дополнительных сайтов гидролиза эндонуклеаз F-Щ, F-Tflll и F-T/ПП.

3.4. Разработана схема выделения и очистки эндонуклеаз F-Tfll и F-Tflll.

3.5. Эндонуклеазы F-Tfll и F-Tflll наиболее активны при экстремальных значениях рН и температуры.

3.6. Активность эндонуклеаз F-Tfll и F-Tflll стимулируется широким рядом ионов двухвалентных металлов.

3.7. Ион Zn , по-видимому, стабилизирует структуру изучаемых нуклеаз.

3.8. Эндонуклеаза F-Tflll специфично связывается с двумя участками ДНК, расположенными на противоположных концах сайта узнавания.

3.8.1. Эндонуклеаза F-Tflll связывает протяженный участок ДНК.

3.8.2. Контакты эндонуклеазы F-Tflll с остовом ДНК распределены по всему сайту узнавания.

3.8.3. Контакты эндонуклеазы F-Tflll с основаниями расположены в двух участках сайта узнавания.

3.8.4. Эндонуклеаза F-Tflll контактирует с основаниями сайта узнавания в основном со стороны большого желобка ДНК.

3.8.5. Контакты с остатками фосфатов остова ДНК не существенны для образования комплекса F-37711-ДНК.

4. Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика нового семейства сайт-специфических эндонуклеаз, кодируемых Т5-подобными бактериофагами"

В составе интронов типов I и II часто присутствуют открытые рамки считывания (ОРС), кодирующие сайт-специфические эндонуклеазы. Эти ферменты, как правило, вносят разрыв в лишенный данного интрона аллель гена, и, таким образом, инициируют перенос интрона в разрезаемый участок ДНК. Этот процесс получил название "хоуминг", а инициирующие его нуклеазы - "хоуминг-эндонуклеазами". На основании наличия в аминокислотных последовательностях этих ферментов специфических мотивов их подразделяют на 4 семейства: "LAGLIDADG", "GIY-YIG", "His-Cys box" и "H-N-H" (Guhan and Muniyappa, 2003; Stoddard, 2005).

Хоуминг-эндонуклеазы обнаруживаются у широкого круга организмов: у бактериофагов, эубактерий, архей, а также у эукариотических организмов. Геномы бактериофагов, по-видимому, наиболее обогащены этими ферментами (Edgell et al., 2000). Например, в геноме фага Т4 из 289 ОРС, кодирующих предполагаемые белки, по крайней мере, 14 кодируют хоуминг-эндонуклеазы (Miller et al., 2003), а у бактериофага Т5 - 9 из 162 (номер в базах данных "EMBL/GenBank/ DDBJ" - AY543070). Следует отметить, что эти нуклеазы, как правило, сосредоточены у одного из фагов, тогда как большая их часть отсутствует у других близкородственных фагов. Например, охарактеризованные эндонуклеазы I-7evI, 1-7Ы1 (Edgell et al., 2000), SegA (Sharma et al., 1992), SegF (Belle et al., 2002) и SegG (Liu et al., 2003), кодируемые бактериофагом T4, отсутствуют у фага Т2, а из обнаруженных в данной работе эндонуклеаз F-Tfll, F-Tflll, ¥-Т/1Ш и F-TfllV, кодируемых фагом Т5, только одна (F-TfllV) присутствует в геноме близкородственного фага BF23 (Ксензенко и др., неопубликованные данные). Следует также отметить, что большинство известных хоуминг-эндонуклеаз, кодируемых бактериофагами, имеют внеинтронную локализацию: только 2 из 14 указанных нуклеаз фага Т4 кодируются интронами (Miller et al., 2003). Для этих нуклеаз характерна еще одна интересная особенность - все они являются представителями семейств "GIY-YIG" или "H-N-H". Учитывая информационную насыщенность фаговых геномов, такое изобилие хоуминг-нуклеаз в сочетании с их неравномерным распределением среди близкородственных фагов, представляется неслучайным и возникает вопрос о функциональной роли этих ферментов.

Известно, что эндонуклеазы SegE, Seg¥ и SegG (семейство "GIY-YIG"), имеющие внеинтронную локализацию, способны инициировать процесс генной конверсии, аналогичный хоумингу (Kadyrov et al., 1997; Belle et al., 2002; Liu et al., 2003). В то же время, они, в отличие от большинства других хоуминг-эндонуклеаз, разрезают как ДНК "своего" фага, так и "чужого". Это обстоятельство позволяет предположить возможность участия этих ферментов также в других рекомбинационных событиях.

Представляет также интерес изучение генетической роли H-N-H-эндонуклеазы I-НтиI и ряда ее гомологов (\-Hmu\l, \-Twol и \-Basl), вносящих одноцепочечные разрывы в ДНК (Goodrich-Blair and Shub, 1996; Landthaler et al., 2002; Landthaler et al., 2003). Известно, что эндонуклеазы \-Hmul и \-Нти\\ инициируют процесс хоуминга (Landthaler et al., 2004), Механизм инициации этого процесса на молекулярном уровне еще предстоит раскрыть, поскольку до сих пор полагали, что перенос интронов инициируется внесением только двуцепочечных разрывов в ДНК, репарация которых и лежит в основе хоуминга.

Структурная организация, а также узнающие свойства эндонуклеаз семейств "GIY-YIG" и "H-N-H" намного менее изучены, чем у представителей семейства хоуминг-эндoнyклeaз"LAGLIDADG". Эндонуклеазы \-Tevl (семейство "GIY-YIG") и I-tfmwI -единственные представители указанных семейств с известной структурой комплексов белок-ДНК (Van Roey et al., 2001; Shen et al., 2004). В составе этих комплексов указанные нуклеазы обладают удивительно вытянутой структурой с множеством четко отделенных друг от друга ДНК-связывающих доменов и мотивов. В белках с подобной структурной организацией замены, как единичных аминокислотных остатков, так и целых доменов, повидимому, в меньшей степени отражаются на общей структуре, чем в случае глобулярных белков. Таким образом, эти ферменты, в отличие от таких глобулярных белков, как эндонуклеазы рестрикции и хоуминг-эндонуклеазы семейств "LAGLIDADG" и "His-Cys box", являются удобным объектом для изучения механизмов белок-нуклеиновых взаимодействий, а также для конструирования ферментов с заданной специфичностью. Следует отметить, что изучение структур эндонуклеаз \-Tevl и l-Hmul позволило выявить новые компактные ДНК-связывающие домены. Кроме того, оказалось, что известные ранее ДНК-связывающие домены в этих белках обладают совершенно другими узнающими свойствами. В связи с этим изучение ферментов подобных эндонуклеазам I-TevI и \-Hmul, несомненно, представляет большой интерес с точки зрения выявления в них новых ДНК-связывающих доменов, а также характеристики их структурных и узнающих свойств.

Цель и задачи работы. Основной целью данной работы являлось разностороннее изучение четырех гомологичных H-N-H-нуклеаз, кодируемых Т5-подобными фагами. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1) Доказательство функциональной активности четырех предполагаемых H-N-H-эндонуклеаз.

2) Картирование точек разрывов, вносимых в ДНК, эндонуклеазами F-TJJI, ¥-Т/111, F-Tfllll и F-TflW.

3) Разработка схемы очистки и выделения эндонуклеаз F-7/71 и F-7y7II.

4) Биохимическая характеристика эндонуклеаз F-Tfll и F-7/7II.

5) Картирование сайта узнавания эндонуклеазы F-7/711.

Научная новизна. В результате данной работы были впервые охарактеризованы четыре гомологичные сайт-специфические H-N-H-эндонуклеазы, гены которых расположены вне интронов. Впервые проведено картирование сайта узнавания подобных эндонуклеаз на примере эндонуклеазы F-Tflll, что позволило предложить возможный механизм узнавания ДНК этими ферментами. В результате анализа аминокислотных последовательностей исследумых эндонуклеаз, а также их предполагаемых сайтов узнавания, было выдвинуто предположение о причинах разной субстратной специфичности этих ферментов. Кроме того, эти результаты также послужили основанием для выдвижения гипотезы о возможном эволюционном происхождении подобных эндонуклеаз.

Практическая значимость работы. Полученные в данной работе результаты имеют в основном фундаментальное значение, однако некоторые из них могут найти и практическое применение. Изученные в данном исследовании ферменты могут быть использованы для создания нуклеаз с заданной специфичностью. Эндонуклеазы, вносящие одноцепочечные разрывы в ДНК, также могут быть использованы в ходе проведения олигонуклеотид-направленного мутагенеза на этапе удаления нити "дикого" типа. Кроме того, для эффективного клонирования ПЦР-фрагментов, получаемых с помощью ДНК-полимераз, у которых отсутствует корректирующая активность, могут быть сконструированы специализированные вектора, содержащие инвертированные сайты эндонуклеазы F-ЩУ.

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Акуленко, Наталья Викторовна

выводы

1. Обнаружены четыре новые сайт-специфические H-N-H-эндонуклеазы (обозначены как F-Щ, F-Tflll, F-Tfllll и F-TfllV), кодируемые Т5-подобными бактериофагами. Показано, что эндонуклеаза F-TfllV вносит двуцепочечный разрыв в ДНК, образуя 3'-выступающие концы из 1 н.о, тогда как гомологичные ей эндонуклеазы F-Tfll, F-Tflll и F-Tfllll вносят одноцепочечные разрывы.

2. Показано, что эндонуклеазы F-Tflll и F-Tfllll являются неоизошизомерами: они способны узнавать одни и те же сайты в ДНК, однако, отличаются по характеру их гидролиза.

3. Подобраны оптимальные условия экспрессии генов, кодирующих эндонуклеазы

F-Tfll и F-Tflll, а также разработана схема их выделения, позволяющая получить препараты этих белков со степенью очистки более 90%. Показано, что в состав эндонуклеаз F-Tfll и F-Tflll входит один ион Zn2+ из расчета на одну молекулу белка.

4. Исследована зависимость активности эндонуклеаз F-Tfll и F-Tflll от ионной силы, рН и температуры. Показано, что максимальная активность этих нуклеаз проявляется при экстремальных значениях рН (рН 10) и температуры (50°С -55°С).

5. Изучена зависимость активности эндонуклеаз F-Tfll и F-Tflll от широкого ряда ионов двухвалентных металлов (Mg2+, Mn2+, Zn2+, Ni2+, Со2+, Cu2+ и Са2+). Показано, что все эти металлы, за исключением Си2+ (в случае эндонуклеазы F-Tfll) и Са2+ (в случае эндонуклеазы F-Tflll), стимулируют активность этих ферментов.

6. Картирован сайт узнавания эндонуклеазы F-Tflll. Показано, что фермент связывается с протяженным участком ДНК (29 н.п.). В пределах этой последовательности локализованы два участка контактов фермента с основаниями ДНК-субстрата длиной 8 н.п. (участок 1) и 7 н.п. (участок 2). Эти участки расположены несимметрично относительно места разрыва и удалены друг от друга на расстояние 13 н.п. В данных участках фермент связывается не только с основаниями, но и с остовом ДНК-субстрата, тогда как в центральной части сайта узнавания эндонуклеаза F-Tflll контактирует только с сахаро-фосфатным остовом ДНК. Показано, что эндонуклеаза F-Tflll взаимодействует с сайтом узнавания в основном со стороны большого желобка ДНК.

7. Выдвинута гипотеза о возможных путях возникновения различной субстратной специфичности гомологичных H-N-H-эндонуклеаз.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Акуленко, Наталья Викторовна, Пущино

1. Aagaard, С., Awayez, M.J. and Garrett, R.A. 1997. Profile of the DNA recognition site of the archaeal homing endonuclease l-Dmol. Nucleic Acids Res. 25: 1523-1530.

2. Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. and Lipman, D. J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.

3. Argast, G.M., Stephens, K.M., Emond, M.J. and Monnat R.J. Jr. 1998. l-Ppol and I-CreI homing site sequence degeneracy determined by random mutagenesis and sequential in vitro enrichment. J. Mol. Biol. 280:345-353.

4. Belfort, M. and Roberts, R.J. 1997. Homing endonucleases: keeping the house in order. Nucleic Acids Res. 25: 3379-3388.

5. Belle A., Landthaler M., Shub D.A. 2002. Intronless homing: site-specific endonuclease SegF of bacteriophage T4 mediates localized marker exclusion analogous to homing endonucleases of group I introns. Genes Dev. 16: 351-362.

6. Bell-Pedersen, D., Quirk, S.M., Bryk, M. and Belfort, M. 1991. 1-7Ы, the endonuclease encoded by the mobile td intron, recognizes binding and cleavage domains on its DNA target. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7719-7723.

7. Beylot, B. and Spassky, A. 2001. Chemical probing shows that the intron-encoded endonuclease l-Scel distorts DNA through binding in monomeric form to its homing site. J. Biol. Chem. 276:25243-25253.

8. Bryk, M., Belisle, M., Mueller, J.E. and Belfort, M. 1995. Selection of a remote cleavage site by l-Tevl, the td intron-encoded endonuclease. J. Mol. Biol. 247:197-210.

9. Bryk, M., Quirk, S.M., Mueller, J.E., Loizos, N., Lawrence, C. and Belfort, M. 1993. The td intron endonuclease I-7evI makes extensive sequence-tolerant contacts across the minor groove of its DNA target. EMBO J. 12:2141-2149.

10. Chevalier, В., Turmel, M., Lemieux, С., Monnat R.J. Jr. and Stoddard, B.L. 2003. Flexible DNA target site recognition by divergent homing endonuclease isoschizomers I-CreI and l-Msol J. Mol. Biol. 329:253-269.

11. Chevalier, B.S. and Stoddard, B.L. 2001. Homing endonucleases: structural and functional insight into the catalysts of intron/intein mobility. Nucleic Acids Res. 29: 3757-3774.

12. Clyman, J. and Belfort, M. 1992. Trans and cis requirements for intron mobility in prokaryotic system. Genes Dev. 6:1269-1279.

13. Curcio, M.J. and Belfort, M. 1996. Retrohoming: cDNA-mediated mobility of group II introns requires a catalytic RNA. Cell 84: 9-12.

14. Dean, A.B., Stanger, M.J., Dansereau, J.T., Van Roey, P., Derbyshire, V. and Belfort, M. 2002. Zinc finger as distance determinant in the flexible linker of intron endonuclease \-Tev\. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 8554-8561.

15. Demczuk, W., Ahmed, R. and Ackermann, H. W. 2004. Morphology of Salmonella enterica serovar Heidelberg typing phages. Can. J. Microbiol. 50: 873-875.

16. Derbyshire, V., Kowalski, J.C., Dansereau, J.T., Hauer, C.R. and Belfort, M. 1997. Two-domain structure of the td intron-encoded endonuclease \-Tev\ correlates with the two-domain configuration of the homing site. J. Mol. Bol. 265:494-506.

17. Dixon, W.J., Hayes, J.J., Levin, J.R., Weidner, M.F., Dombroski, B.A. and Tullius, T.D. 1991. Hydroxyl radical footprinting. Methods Enzymol. 208: 380-413.

18. Drouin, M., Lucas, P., Otis, C., Lemieux, C. and Turmel, M. 2000. Biochemical characterization of 1-Cmoel reveals that this H-N-N homing endonuclease shares functional similarities with H-N-H colicins. Nucleic Acids Res. 28:4566-4572.

19. Eddy, S.R. and Gold, L. 1991. The phage T4 nrdB intron: a deletion mutant of a version found in the wild. Genes Dev. 5: 1032-1041.

20. Edgell, D.R., Belfort, M. and Shub, D.A. 2000. Barriers to intron promiscuity in bacteria. J. Bacterid. 182: 5281-5289.

21. Elde, M., Willassen, N.P. and Johansen, S. 2000. Functional characterization of isoschizomeric His-Cys box homing endonucleases from Naegleria. Eur. J. Biochem. 267: 7257-7265.

22. Falquet, L., Pagni, M., Bucher, P., Hulo, N., Sigrist, C.J., Hofmann, K. and Bairoch, A. 2002. The PROSITE database, its status in 2002. Nucleic Acids Res., 30:235-238.

23. Flick, K.E., Jurica, M.S., Monnat R.J. Jr, and Stoddard, B.L. 1998. DNA binding and cleavage by the nuclear intron-encoded homing endonuclease l-Ppol. Nature 394: 96101.

24. Friedhoff, P., Franke, I., Meiss, G., Wende, W.,. Krause, K.L. and Pingoud, A. 1999. A similar active site for non-specific and specific endonucleases. Nature Struct. Biol. 6: 112-113.

25. Galburt, E.A. and Stoddard, B.L. 2002. Catalytic mechanisms of restriction and homing endonucleases. Biochemistry 41:13851-13860.

26. Galzitskaya, O.V., Garbuzynskiy, S.O. and Lobanov M. Yu. 2006. Prediction of natively unfolded regions in protein chains. Mol. Biol. (Moscow) 40:341-348.

27. Garinot-Schneider, C., Pommer, A.J., Moore, G.R., Kleanthous, C. and James, R. 1996. Identification of putative active-site residues in the DNase domain of colicin E9 by random mutagenesis. J. Mol. Bol. 260:731-742.

28. Gimble, F.S. 2000. Invasion of a multitude of genetic niches by mobile endonuclease genes. FEMS Microbiol. Lett. 185:99-107.

29. Goodrich-Blair, H. and Shub, D.A. 1996. Beyond homing: competition between intron endonucleases confers a selective advantage on flanking genetic markers. Cell 84: 211221.

30. Gorbalenya, A.E. 1994. Self-splicing group I and group II introns encode homologous (putative) DNA endonucleses of a new family. Protein Sci. 3:1117-1120.

31. Gough, J., Karplus, K., Hughey, R. and Chotia, C. 2001. Assignment of homology to genome sequences using a library of hidden markov models that represent all proteins of known structure. J. Mol. Biol. 313:903-919.

32. Guhan, N. and Muniyappa, K. 2003. Structural and functional characteristics of homing endonucleases. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 38:199-248.

33. Gurevich, V.V., Pokrovskaya, I.D., Obukhova, T.A. and Zozulya, S.A. Preparative in vitro mRNA synthesis using SP6 and T7 polymerases. 1991. Anal. Biochem. 195:207213.

34. Hayes, J.J. and Tullius, T.D. 1989. The missing nucleoside experiment: a new technique to study recognition of DNA by protein. Biochemistry. 28: 9521-9527.

35. Hendrickson, W. and Schleif, R. 1985. A dimer of AraC protein contacts three adjacent major groove regions of the ara/DNA site. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3129-3133.

36. Hsia, K.C., Chak, K.F., Liang, P.H., Cheng, Y.S., Ku, W.Y. and Yuan, H.S. 2004. DNA binding and degradation by the HNH protein ColE7. Structure 12:205-214.

37. Huang. Y.J. Parker. M.M. and Belfort, M. 1999. Role of exonucleolytic degradation in group I intron homing in phage T4. Genetics. 153:1501-1512.

38. Jones, D.T. 1999. Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices. J. Mol. Biol. 292:195-202.

39. Jurica, M.S. and Stoddard, B.L. 1999. Homing endonucleases: structure, function and evolution. Cell. Mol. Life Sci. 55:1304-1326.

40. Jurica, M.S., Monnat, R.J. Jr. and Stoddard, B.L. 1998. DNA recognition and cleavage by the LAGLIDADG homing endonuclease I-Crel Mol. Cell 2:469-476.

41. Kadyrov, F.A., Shlyapnikov, M.G. and Kryukov, V.M. 1997. A phage T4 site-specific endonuclease, SegE, is responsible for a non-reciprocal genetic exchange between T-even-related phages. FEBS Lett. 415: 75-80.

42. Kalodimos, C.G., Biris, N., Bonvin, A.M.J.J., Levandoski, M.M., Guennuegues, M., Boelens, R. and Kaptein, R. 2004. Structure and flexibility adaptation in nonspecific and specific protein-DNA complexes. Science 305: 386-389.

43. Keeble, A.H., Hemmings, A.M., James, R., Moore, G.R. and Kleanthous, C. 2002. Multistep binding of transition metals to the H-N-H endonuclease toxin colicin E9. Biochemistry 41:10234-10244.

44. Kleanthous, С., Kuhlmann, U.C., Pommer, A.J., Ferguson, N., Radford, S.E., Moore, G.R., James, R. and Hemmings, A.M. 1999. Structural and mechanistic basis of immunity toward endonuclease colicins. Nature Struct. Biol. 6:243-252.

45. Ко, T.-P., Liao, C.-C., Ku, W.-Y., Chak, K.-F. and Yuan, H.S. 1999. The crystal structure of the DNase domain of colicin E7 in complex with its inhibitor Im7 protein. Structure 7: 91-102.

46. Kriukiene, E., Lubiene, J., Lagunavicius, A. and Lubys, A. 2005. Mnll the member of H-N-H subtype of type IIS restriction endonucleases. Biochim. Biophys. Acta. 1751: 194-204.

47. Kuhlmann, U.C., Moore, G.R., James, R., Kleanthous, C. and Hemmings,. A.M. 1999. Structural parsimony in endonuclease active sites: should the number of homing endonuclease families be redefined? FEBS Lett. 463:1-2.

48. Kulakova, A.N., Kulakov, L.A., Akulenko, N.V., Ksenzenko, V.N., Hamilton, J.T. and Quinn, J.P. 2001. Structural and functional analysis of the phosphonoacetate hydrolase (phnk) gene region in Pseudomonasfluoresceins 23F. J.Bacteriol. 183: 3268-3275.

49. Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.

50. Lambowitz, A.M. and Zimmerly, S. 2004. Mobile group II introns. Annu. Rev. Genet. 38:1-35.

51. Landthaler, M. and Shub, D.A. 2003. The nicking homing endonuclease l-Basl is encoded by a group I intron in the DNA polymerase gene of the Bacillus thuringiensis phage Bastille. Nucleic Acids Res. 31: 3071-3077.

52. Landthaler, M., Begley, U., Lau, N.C. and Shub, D.A. 2002. Two self-splicing group I introns in the ribonucleotide reductase large subunit gene of Staphylococcus aureus phage Twort. Nucleic Acids Res. 30:1935-1943.

53. Landthaler, M., Lau, N.C. and Shub, D.A. 2004. Group I intron homing in Bacillus phages SP01 and SP82: a gene conversion event initiated by a nicking homing endonuclease. J. Bacteriol. 186:4307-4314.

54. Landthaler, M., Shen, B.W., Stoddard and Shub, D.A. 2006. I-BasI and I-Hmul: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities. J. Mol. Biol. 358:1137-1151.

55. Li, C.L., Hor, L.I, Chang, Z.F., Tsai, L.C., Yang, W.Z. and Yuan, H.S. 2003. DNA binding and cleavage by the periplasmic nuclease Vvn: a novel structure with a known active site. EMBO J. 22:4014-4025.

56. Liu, Q., Belle, A., Shub, D.A., Belfort, M. and Edgell, D.R. 2003. SegG endonuclease promotes marker exclusion and mediates co-conversion from a distant cleavage site. J. Mol. Biol. 334:13-23.

57. Liu, Q., Derbyshire, V., Belfort, M. and Edgell, D.R. 2006. Distance determination by GIY-YIG intron endonucleases: discrimination between repression and cleavage functions. Nucleic Acids Res. 34: 1755-1764.

58. Lowery, R., Hung, L., Knoche, K. and Bandziulis, R. 1992. Properties of l-Ppol: a rare-cutting intron-encoded endonuclease. Promega Notes 38: 8-12.

59. Malik, H.S. and Henikoff, S. 2000. Dual recognition-incision enzymes might be involved in mismatch repair and meiosis. Trends Biochem. Sci. 25:414-418.

60. Maniatis, Т., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.

61. Marshall, P., Davis, T.B. and Lemieux, C. 1994. The \-Ceu\ endonuclease: purification and potential role in the evolution of Chlamydomonas group I introns. Eur. J. Biochem. 220: 855-859.

62. Martinez-Abarca, F. and Того, N. 2000. Group II introns in the bacterial world. Mol. Microbiol. 38:917-926.

63. Mate, M.J. and Kleanthous, C. 2004. Structure-based analysis of the metal-dependent mechanism of H-N-H endonucleases. J. Biol. Chem. 279: 34763-34769.

64. Maxam, A.M. and Gilbert, W. 1977. A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560-564.

65. Mehta, P., Katta, K. and Krishnaswamy, S. 2004. HNH family subclassification leads to identification of commonality in the His-Me endonuclease superfamily. Protein Sci. 13:295-300.

66. Miller, E.S., Kutter, E., Mosig, G., Arisaka, F., Kunisawa, Т., Ruger, W. 2003. Bacteriophage T4 genome. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67: 86-156

67. Mueller, J.E., Smith, D. and Belfort, M. 1996b. Exon coconversion biases accompanying intron homing: battle of the nucleases. Genes Dev. 10:2158-2166.

68. Mueller, J.E., Smith, D., Bryk, M. and Belfort, M. 1995. Intron -encoded endonuclease \-Tev\ binds as a monomer to effect sequential cleavage via conformational changes in the td homing site. EMBO J. 14: 5724-5735.

69. Nassif, N., Penney, J., Pal, S., Engels, W.R. and Gloor, G.B. 1994. Efficient copying of nonhomologous sequences from ectopic sites via P-element-induced gap repair. Mol. Cell. Biol. 14:1613-1625.

70. Oakley, M.G. and Dervan, P.B. 1990. Structural motif of the GCN4 DNA bindingdomain characterized by affinity cleaving. Science 248: 847-850.

71. Parker, M., Belisle, M. and Belfort, M. 1999. Intron homing with limited exon homology: illegitimate double-strand-break repair in intron acquisition by phage T4. Genetics. 153:1513-1523.

72. Pingoud, A. and Jeltsch, A. 2001. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Res. 29: 3705-3727.

73. Pokrovskaya, I.D. and Gurevich, V.V. 1994. In vitro transcription: preparative RNA yields in analytical scale reactions. Anal. Biochem. 220:420-423.

74. Pommer, A.J., Kuhlmann, U.C., Cooper, A., Hemmings, A.M., Moore, G.R., James, R. and Kleanthous, C. 1999. Homing in on the role of transition metals in the HNH motif of colicin endonucleases. J. Biol. Chem. 274:27153-27160.

75. Pommer, A.J., Wallis, R., Moore, G.R., James, R. and Kleanthous, C. 1998.ф

76. Enzymological characterization of the nuclease domain from the bacterial toxin colicin E9 from Escherichia coli. Biochem. J. 334: 387-392.

77. Raaijmakers, H., Того, I., Birkenbihl, R., Kemper, B. and Suck, D. 2001. Conformational flexibility in T4 endonuclease VII revealed by crystallography: implications for substrate binding and cleavage. J. Mol. Biol. 308:311-323.

78. Roberts, R.J., Belfort, M., Bestor, Т., Bhagwat, A.S., Bickle, T.A., Bitinaite, J.,

79. D.H., Lacks, S., Marinus, M.G., Miyahara, M., Morgan, R.D., Murray, N.E., Nagaraja, V., Piekarowicz, A., Pingoud, A., Raleigh, E., Rao, D.N., Reich, N., Repin, V.E., Selker,

80. E.U., Shaw, P.C., Stein, D.C., Stoddard, B.L., Szybalski, W., Trautner, T.A., Van Etten,

81. J.L., Vitor, J.M., Wilson, G.G. and Xu, S.Y. 2003. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res. 31:1805-1812.

82. Rykunov, D.S., Lobanov, M.Y. and Finkelstein, A.V. 2000. Search for the most stable folds of protein chains: III. Improvement in fold recognition by averaging over homologous sequences and 3D structures. Proteins. 40: 494-501.

83. Saravanan, M., Bujnicki, J.M., Cymerman, I.A., Rao, D.N. and Nagaraja, V. 2004. Type II restriction endonuclease R.KpnI is a member of the HNH nuclease superfamily. Nucleic Acids Res. 32:6129-6135.

84. Shaloiko, L.A., Granovsky, I.E., Ivashina, T.V., Ksenzenko, V.N., Shirokov, V.A. and Spirin, A.S. 2004. Effective non-viral leader for cap-independent translation in a eukaryotic cell-free system. Biotechnol. Bioeng. 88: 730-739.

85. Sharma, M., Ellis, R.L., Hinton, D.M. 1992. Identification of a family of bacteriophage T4 genes encoding proteins similar to those present in group I introns of fungi and phage. Proc. Natl Acad. Sci. USA 89: 6658-6662

86. Shen, B.W., Landthaler, M., Shub, D.A. and Stoddard, B.L. 2004. DNA binding and cleavage by the HNH homing endonuclease l-Hmul. J. Mol. Biol. 342:43-56.

87. Shub, D.A., Goodrich-Blair, H. and Eddy, S.R. 1994. Amino acid sequence motif of group I intron endonucleases is conserved in open reading frames of group II introns. Trends Biochem. Sci. 19:402-404.

88. Siebenlist, U. and Gilbert, W. 1980. Contacts between Escherichia coli RNA polymerase and early promoter of phage T7. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:122-126.

89. Sitbon, E. and Pietrokovski, S. 2003. New types of conserved sequence domains in DNA-binding regions of homing endonucleases. Trends Biochem. Sci. 28:473-477.

90. Stoddard, B.L. 2005. Homing endonuclease structure and function. Q. Rev. Biophys. 38:49-95.

91. Szostak, J.W., Orr-Weaver, T.L, Rothstein, R.J. and Stahl, F.W. 1983. The double-strand-break repair model for recombination. Cell 33:25-35.

92. Tullius, T.D. and Dombroski, B.A. 1986. Hydroxyl radical "footprinting": high-resolution information about DNA-protein contacts and application to X repressor and Cro protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5469-5473.

93. Van Roey, P., Waddling, C.A., Fox, K.M., Belfort, M. and Derbyshire, V. 2001. Intertwined structure of the DNA-binding domain of intron endonuclease I-7evI with its substrate. EMBO J. 20: 3631-3637.

94. Vannini, A., Cinzia, V., Gargioli, C., Muraglia, E., Cortese, R., De Francesco, R., Neddermann, P., and Di Marco, S. 2002. The crystal structure of the quorum sensing protein TraR bound to its autoinducer and target DNA. EMBO J. 21,4393-4401.

95. Wang, J., Kim, H.H., Yuan, X. and Herrin, D.L. 1997. Purification, biochemical characterization and protein-DNA interactions of the I-Crel endonuclease produced in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 25: 3767-3776.

96. Zaitsev, E.N., Zaitseva, E.M., Bakhlanova, I.V., Gorelov, V.N., Kuz'min, N.P. 1986. Cloning and characteristics of reck gene in Pseudomonas aeruginosa. Genetics (Moscow) 22:2721-2727.

97. Zimmerly, S., Guo, H., Eskes, R., Yang, J., Perlman, P.S. and Lambowitz, A.M. 1995b. A group II intron RNA is a catalytic component of a DNA endonuclease involved in intron mobility. Cell 83: 529-538.

98. Zimmerly, S., Guo, H., Perlman, P.S. and Lambowitz, A.M. 1995a. Group II intron mobility occurs by target DNA-primed reverse transcription. Cell 82: 545-554.I