Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микрокалориметрическое исследование ДНК в ширококй области концентраций ионов металлов и некоторых биологически активных соединений

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Микрокалориметрическое исследование ДНК в ширококй области концентраций ионов металлов и некоторых биологически активных соединений"

РГ6 од

......... " АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ

ИНСТИТУТ ООТОБИОЛОГИИ

На права* — УЖ ът лгз

ВЛАСОВ Александр Павлович

МЖРОКАЛОРШЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ДНК В ШИРОКОЙ ОБЛАСТИ КОНЦЕНТРАЦИЙ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ И НЕКОТОРЫХ ■ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОт МНЕНИИ

/ 03.00.02 биофизика /

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 1993

Работа выполнена в Институте биоорганической химии Академии наук Беларуси.

Научный руководитель: кандидат химических наук, ст.науч.сотр.,

Андрианов Вилор Трофимович. Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, . Хечинаивили Николай Николаевич, кандидат биологических наук, Лука Зигмунд Антонович.

Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН (г. Пущино),

Защита состоится 1993 г. в /^час.

на заседании Специализированного Ученого Совета Д.0С>.05.01 по защи- з докторских диссертаций при "нституте фотобиологии Академии наук Беларуси по ад^зсу: 220733, г. Минск, ул. Скорины 27.

С диссертаций можно ознакомиться в библиотеке Института фотобиологии Академии наук Беларуси.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного Совета

кандидат биологических наук Л.М.Иейко

Институт фотобиологии АН Беларуси

Об^ая характеристика рзбсты.

ЛктУзльност*. пттоблемн. Теркодинамичоск."е исследования б"ополимеров являются относительно новым и взыщи направлением современной молекулярной биологии. Равновесная терыодина-мика и мякрокалориметрия позволяют получить данные дая расчз-та энтальпии, энтропии и энергии Гиббса процессов образования макромолокул, их равновесных конформационных перестроек, а так.т.е явлений связывания лигандов с участием этих молекул. 3 первую очередь это интересно для тех, кто имеет дело с внутримолекулярными кооперативными трансформациям;; биополимеров, стабильностью их пространственных структи, внутримолекулярным взаимодействием с растворителем и малыми молекула!,та, которые во многом определяют структуру и структурные трансформации биополимеров в растворе.

Важной областью термодинамических исследований является изучение свойств ДНК в растворе как в присутствии, так и в отсутствии взаимодействующих с биополимером ионов металлов и малых молекул. Изучение состояния ДНК в бессолевых растворах в отсутствии противоионов имеет большое биологическое значение, так как показано, что в клеточном ядре во. :дствяе высокой концентрации ДНК отношение числа фосфатных групп и низкомолекулярных катионов почти такое яе, как и в бессолевых' растворах ДНК. Такое концентрированное бессолевое состояние ДНК исследовано крайне мало и только в последнее время стало интенсивно изучаться. Не менее интересной областью термодинамических' исследований ДНК является изучение взаимодействия ДНК с такими лигаддами как ионы металлов,- интеркалируицие красители,-антибиотики, малые белки и другие. Хорошо известно, что ионы металлов необходимы для поддержания нативного состояния ДНК в живой клетке, а также являются фактором, необходимым для сохранения целостности многих других биологических структур. Многие малые молекулы способны влиять на структуру и биолог/ -ческие функции нуклеиновых кислот, в первую очередь на процессы передачи генетической информации. Широко известна роль малых молекул в процессах мутагенеза и канцерогенеза, а также их возможности выступать в качестве химиотерапевтическихи противоопухолевых средств.

Несмотря на то, что проблема взаимодействия малых молекул с ДЖ привлекает к себе большее внимание, конкретные места связывания многих из малых молекул с ДНК, взаимодействие их

с определенным типом азотистых оснований и/или нуклеотидными последовательностями, влияние их на локальную конформацию, кооперативные ¡информационные переходы и термодинамические свойства ДНК в растворе во многих случаях остаются неясными. В связис этим микрокалориметрическое исследование термодинамических свойств ДНК в аироксм диапазоне концентраций одно-и двухвалентных катионов (включая бессолевые растворы), интер-калирующих красителей, противоопухолевого антибиотика актино-мицина Д и гиетона Н1 представляется актуальным.

Работа выполнена в рамках теш: "Изучить механизм самосборки хроматина, используя термодинамические параметры кооперативных переходов ДНК и гистоновых ассоциатов и их комплексов с биологически активными веществами", зходящей в республиканскую программу фундаментальных исследований для медицины.

Цель работы. Целью данной работы являлось микрокалориметрическое исследование термодинамических свойств ДНК в широком диапазоне концентраций одно-и двухвалентных катионов (включая бессолевые растворы), интеркалирующих красителей, противоопухолевого антибиотик актикомицина Д и гистона Н1.

Научная новизна работы. В работе впервые проведено микрокалориметрическое исследование концентрированных бессолевых растворов ДНК из тимуса теленка и определены термодинамические параметры денатурации ДНК в этих растворах. Обнаружена линейная зависимость температуры плавления тимусной ДНК в бессолевых растворах в очень широком диапазоне концентраций биополимера и сделан вывод о сходстве механизмов стабилизации ДНК в бессолевых и содержащих поддерживающий электролит раст-* ворах. Впервые показано, что линейная зависимость энтальпии . денатурации (ЛН^) от температуры плавления (Тпл) ДНК в растворах НаС1 непосредственно связана с величиной разности теплоемкости нативного и денатурированного состояния ДНК (ДСр). Обнаружено, что величина скачка теплоемкости при денатурации ДНК; определенная непосредственно на кривой плавления, в пределах ошибки измерений совпадает со значениемСр, определенным из зависимости ДН^ от Т^ ДНК. Полученные термодинамические данные доказывают, что механизм стабилизации ДНК одно-одковалентныыи электролитами имеет энтропийную природу и представляют интерес для развития существующих теорий сильнозаряженных шлиэлектролитов типа ДНК.

Методом микрокалориметрии впервые изучена тепловая дена-

турация ДНК в широком диапазоне концентраций ионов магния и кальция при физиологической концентрации tfaci . Показано, что тгрмостабильнос.ь ДНК увеличивается при низких концентрациях катионов, а при высоких - уменьшается. Обнаружено wro при средних и высоких концентрациях магния и кальция после частичкой денатурации ДНК образуется агрегированная (компактная) форма ДНК, которая кооперативно разрушается при значительно более высоких температурах.

Впервые проведено микрокалориметрическое исследование тепловой денатурации ДНК в присутствии интеркалирующих красителей (этидиум бромид, акридин оранжегчй) и противоопухолевого антибиотика актиномкцина Д. Показано, что эти значительно стабилизирующие ДНК соединения преимущественно взаимодействуют с последовательностями ДНК, обогащенными гуанин-цитозиновыми парами оснований, причем очень высокую специфичность к определенным последовательностям ДНК проявляет актиномицин Д.

В работе разработан метод фракционирования ДНК по ГЦ-сос-таву гистоном KI и проведена оценка степени фракционирования с помощью сканирующей микрокалориметрии.

Вышеупомянутые результаты, а также ргпработанные в диссертации методы исследования ДНК выносятся на защиту.

Апробация аботы и публикации. Результаты работы были ■ представлены на Международном симпозиуме по биокалориметрии (Тбилиси, 1981), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Меадународном симпозиуме по физико-химическим свойствам биополимеров в растворе и клетке (Пущино, 1985), Всесоюзном симпозиуме по конформационным изменениям биголимеров в растворе (Тбилиси, 1985). Основные результаты работы опубликованы в 14 печатных работах.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, глав литературного обзора, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы ( 165 наименований). Работа изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 38 рисунков и 13 таблиц.

Содержание работы.

Получение бессолевых концентрнрованных растворов ДНК. ДНК ввделяли из тимуса теленка детергентным методом с использованием додецилсульфата натрия. Содержание белка в препарате, оп-

ределенное по методу Лоури не превышало 1%. Молекулярный вес ДНК, определенный визкозиметрически составлял ~10^ Дальтон. Коэффициент молярной экстинкции ДНК в солевых растворах составлял 6600 M-л-*-см""*.

Для получения чистых по катиону бессолевых растворов ДНК переосаждали из водного раствора при концентрации 1-2 мг/мл пятикратным объемом спирта. Осадок несколько раз промывали спиртом, высушивали на воздухе и растворяли в деконизованной воде до концентрации 5-8 мг/мл. Полученный раствор ДНК пропускали под избыточным давлением в I атм через слой ионктов КУ-2 в На+-форме, AB-I7 - в ОН" - форме (5:1 по объему). При этом все примеси катионов обменивались на iia+ , а солевые примеси на НаОН . Значение pH раствора изменялось от 6,5 до 7,5, что свидетельствует о ничтожном количестве противоинов На в полученном растворе. Приготовленный таким образом препарат был проверен на количество лримесей на атомно-адсорбционном спектрофотометре. Препарат содержал один атом кальция на 400 фосфатных групп ДНК и один атом магния на 2000 фосфатных групп. Таким образом ионообменный способ получения бессолевых раство ров ДНК позволяет провести чрезвычайно эффективную счистку ДНК от примесных катионов, дане следовые количества которых сильно влияют на термодинамические свойства ДНК в бессолевом растворе. Концентрированные растворы бессолевой Ка -ДНК хранили в полиэтиленовой посуде при 4 °С и использовали для приготовления бессолевых и .содержащих поддерживающий электролит растворов ДНК.

Термодинамические свойства ДНК в солевых и бессолевых растворах. ¡Сак известно, денатурация является одним из широко используемых методов исследования биополимеров. Полученные при изучении денатурации ДНК термодинамические данные позволяют пролить свет нг природу сил, стабилизирующих нативную двухс-.иральную структуру ДНК, а также получить представление о тех условиях, при которых полностью или частично расплетают ся нити ДНК, что составляет суть биологического функционирования ДНК.

В настоящей работе впервьр проведено микрокалориметричес кое'исследование тепловой денатурации тимусной ДНК в концентрированных бессолевых растворах, что позволило получить тер-модинг'ические характеристики перехода спираль-клубок: температуру плавления и энтальпию денатурации.

Данные о зависимости Т^ от концентрации полимера в бессолевых растворах весьма противоречивы. Нами получена линейная зависимость Тпл от логарифма концентрации ДНК (рис.1, прямая 2), которая с большой точностью описывается соотношением:

пл

17,6 1с С. + 91,8

(I)

где Ср - концентрация нуклеинового фосфора в молях. Для сравнения на этом же ристаке показана зависимость Т^ ДНК от концентрации соли. Она описывается соотношением:

Тпл = 17,8 18С + 100,9 , где С - концентрация ионов натрия в растворе.

Тпл- °С

Рис. I. Зависимость Тпл ДКК ЮО от концентрации цас1 (С) при рН 7,6 (прямая I) в солевых и от концентрации полимера (Ср) в бессолевых растворах (прямая 2). Прямая I: (о) _ микрокалориметрия, (о) - спект-рофотометрия. Прямая 2 - микрокалориметрия; (+) - серия в присутствии слабого фосфатного буфера.

(2)

80

60

40-

-3 -2 -I

1в с(°р)

Следует отметить более значительный разброс точек на зависимости (I) по сравнению с зависимостью (2). Это связано с неконтролируемым изменением рН неэабуференного бессолевого раствора ДНК в пределах 7,5-6,5 вследствие контакта с СО2 воз-[уха. Чтобы уменьшить влияние этого фактора была проведена серия экспериментов с использованием слабого натрий-фосфатного 5уфера (7- Ы) с рН 7,5. Формально такой раствор не является 5ессолевым, однако присутствие буфера не изменяет Тпл ДНК в пределах ошибки эксперимента. Эти результаты также показаны на рис.1.

Из рис.1 видно, что при увеличении концентрации ДНК Т[1Л метет. Это явление объясняется на наш взгляд тем, что часть

ионов натрия бессолевой ДШ находится в диссоциированном состоянии и с ростом концентрации полимера возрастает общая концентрация диссоциированных ионов натрия. В этом отношении влияние концентрации ДНК на Тпл в бессолевых растворах аналогично изменению конной силы среды в солевых растворах ДОК. В настоящей работе мы определили степень диссоциации ионов натрия нативной и денатурированной бессолевой Д11К ионселективным методом. Зти величины в широком диапазоне концентраций полимера равны 0,33 - 0,03 и 0,60 ^ 0,02 для нативной и денатурированной ДНК соответственно. Величина степени диссоциации ионов натрия денатурированной ДНК в бессолевых растворах хорошо совпадает со значениями, известными для соловых растворов ДНК. В то же время величина 0,33 степени диссоциации нативной бессолевой ДНК заметно выше, чем для солевых растворов ДНК (0,24). Это означает, что в отсутствии противоионав электростатический потенциал ДНК заметно снижен и свидетельствует о более вытянутом состоянии ДНК в бессолевых растворах.

Значения энтальпии денатурации ДИК п бессолевых растворах имеют большую величину и совладают со значениями, полученными при денатурации ДНК в солевых растворах при близких значениях Тпл. Эти данные, а также тог факт, что величины наклонов зависимостей Тпл от концентрации соли и полимора совпадают, говорят о том, что механизм стабилизации ДНК в солевых и бессолевых растворах одинаков. Если считать, что это так, то можно ожидать совпадения прямых на рис.1, когда по оси абсцисс отложена вместо 1вСр величина 1еС = ХвСр + 1еЛ. Наоборот иожно рассчитать величины степени диссоциации оС в Т^ ДНК по расстоянию, на которое сменены эти прямые по оси Псцисс. Такой анализ показывает, что при Ср » КГ2 Ц в Тдд бессолевой ДНК Л« 0,3. Экстраполяция *е экспериментальных значение, на Т^ бессолевой ДНК дает значительно большую величину степени диссоциации:

Л ■ 0,33 + (0,6 - 0,33)/2 * 0,465. Столь большая разница в расчетном и экспериментальном значении степени диссоциации может быть объяснена тем, что термостабильность ДНК в бессолевых растворах снижена по сравнению с солевыми растворами. Расчеты показывают, что снижение Т^ бессолевой ДНК от расчетных значений составляет 3,5 °С, а температуры начала плаплення - на 6-8 °С.

Наиболее вероятной причиной снижения Тпл в бессолевых растворах может быть частичное протонироввние протонакцвпторных групп и областей ДНК, значения рК которых сильно увеличиваются при снижении концентрации соли. Для проверки этого предположения

нами было проведено изучение термической денатурации бессолевой ДНК, протонируемой длительным диализом против воды, в результате чего рН раствора снижался из-за поглощения СО^ воздуха.

На рис. 2 представлены зависимости Тпд| а также температуры начала (Ъ% денатурации) и чонца (95% денатурации) плагления бессолевой ДНК от рН раствора. Приведены также температуры плавления ДИК в присутствии слабого ацетатного буфера, используемого для создания более низких значений рН.

Из рис.2 видно, что даже в нейтральной области от рН 7 до рН 6,5-5,5 наблюдается заметное снижение Тпл бессолевой ДНК. Наиболее сильное снижение температуры в нейтральной области наблюдается для правой ветви кривой плавления, отражающей денатурацию областей ДНК, обогащенных гуанин-цитозиновыми парами оснований (рис.2, кривая 3). Особенно это заметно по сравнению с изменением низкотемпературной части кривой, отражающей плапление' АТ-богатых участков ДНК. Заметное уменьшение Тпл бессолевой ДНК при нейтральных рН свидетельствует о наличии в бессолевой ДНК протонакцепторных групп с высокими значениями рК. Это явлсмио подтверждается известными литературными донными о существовании высококооперативных протонированных областей ДНК, а также значительной буферной емкости этого биополимера при р!1>4,2, в условиях, близких к бессолевым растворам и приводит к проблема соотношения протонакцепторных и меспнцфгаеских полирлпктролитж-гс

Т, °С

3

Рис. 2. Зависимость температур Ъ% (I), 50% (2) и 95^-ной (3) степени денатурации бессолевой ДНК от рН раствора. рН снижался диализом против воды (о), а также диализом против 0,1 мМ (а) и I мМ (и) ацетатного буфера рН 4,6.

4 6 8 рН

свойств ДНК, которые наиболее сильно проявляются в бессолевых растворах.

В заключение описания свойств ДНК в бессолевых растворах следует сказать, что по всем изученным параметрам (сравнимая с солевыми.растворами энтальпия денатурации, низкий коэффициент молярной экстинкции, высокая температура плавления, совпадение спектров кругового дихроизма солевых и бессолевых растворов) бессолевая ДНК, полученная ионообменным методом сохраняет натив-ную двухспиральную структуру в широком диапазоне концентраций биополимера. Небольшое снижение термостабильности бессолевой ДНК по сравнению с солевыми растворами вследствие частичного прото-нирования является полностью обратимым и нивелируете ' при переводе бессолевой ДНК в солевые буферные растворы.

Высокая степень очистки ДНК от примесей катионов, достигаемая ионообменным методом является методически важным моментом, поскольку позволяет исследовать взаимодействие ДНК с лигандами в наиболее чистом вцде, исключая влияние примесей. В настоящей работе примером такого исследования является изучение термической денатурации ДНК в широком диапазоне концентраций ионов натрия.

Зависимость Тпл ДНК от "онцентрации ионов натрия в растворе показана на рис.1. Видно, что как микрокалоримотрические, так и спектрофотометрические данные хорошо укладываются на одну прямую, описываемую соотношением (2). При концентрации соли 0,2 М и выше наблюдается отклонение Тпл от линейной зависимости. Значение наклона ¿Тпл/с11вС, определенное в данной работе двумя независимыми методам!. при использовании концентраций ДНК, различающихся более чем на поредок равно 17,8 °С. В то же время эта величина, играющая важную роль в современных теориях сильнозарякен-ных полнэлектролитов, по данным разных авторов колеблется в довольно широких пределах (11,5 - 2С,5 °С). Наши результаты, а также анализ литературных данных позволяют понять причины столь большого колебания этой величины. На наш взгляд низкие значения наклона связаны с завышением Тш ДНК в низкой ионной силе вследствие недостаточной очистки препаратов от примесных катионов, константы связывания которых сильно возрастают при уменьшении концентрации соли. Высокие же значения наклонов, как показывают ■ результаты исследования бессолевой ДНК, очевидно связаны с занижением Тдл ДНК вследствие протонирования биополимера в среде с низкой ионной силой при использовании буферных систем с небольшой емкостью или слабокислым рН.

Другим ванным параметром, характеризующим переход спираль-клубок является энтальпия денатурации ДНК. Знание величин Тпл, А Нпл, а такчсе изменения теплоемкости при денатурации биополимера (ЛСр) позволяет из термодинамических соотношений получить значения разности свободной энергии, энтальпии и энтропии нативного и денатурированного состояния ДНК при стандартной температуре, которые дают информацию о вкладах различных нековалентных взаимодействий в стабильность спирали. Значение ЛНпд ДНК, а также зависимость ЛНпл от ионной с^лы раствора (и соответственно от Тпд) важна такке в расчетах параметра плотности заряда и связанного с ним расстояния между фосфатными группами в современных теориях сильнозаряженных полиэлектролитов типа ДНК.

К сожалению немногочисленные определения величины ДН^ ДНК в среде с разной тонной силой достаточно противоречивы. Результаты микрокалориметрических исследований зависимости ДНПЛ от Тпл ДНК, полученные в настоящей работе, а также литературные данные представлены на рис.3 и в табл.1. Из рис.3 видно, что зависимость ДН от Тпл ДНК имеет линейный характер и описывается соотношением:

АН,

пл

0,147 Тпд + 27,7

где ДН выражена в кДж/мпо, а Гпл - в °С.

пл

(3)

ДНПЛ, кДк/мпо

35

Рис. 3. Зависимость энтальпии денатурации .ДНК от 'Гпл при нейтральном рН. (в) -средние значения из 4-9 измерений; (о) - одиночные измерения. С*,*,^,®) - данные из работ /1-4/ соответ- 30 ственно.

, 25

50

70

90 Т, °С

Значение изменения теплоемкости между денатурированным и нативкым состоянием ДНК, полученное из этой зависимости составляет 147±13 Д*/мпо.грид. Из рис.3 таете видно значительнее расхождение в данных' разных авторов как в значениях ДППЛ» так и ч

наклоне зависимости ДНПЛ от Тпд ДНК ( ДСр). Наши результаты хорошо согласуются с данными работы Привалова /I/, полученными на ДНК фага Т2 (35$ ГЦ) при использовании высокочувствительного прибора типа ДА СМ. Значения ДНпд близки к результатам работы Грмнведеля /2/, полученными на ДНК из тимуса теленка при высокой концентрации соли, но сильно расходятся в низкосолевых растворах. Кроме того, вызывают сомнение более высокие значения ДНПЛ для поли а(А-Т), по сравнению со значениями ДНПЛ для тимусной ДНК, полученные одним и тем автором в одинаковой среде /3/. По-видимому, более высокие значения ДНПЛ, полученные в настоящей работе, так же как и в работе Привалова по сравнению с другими авторами связаны с использованием высокочувствительной техники и хорошо очищенных от примесей катионов, сильно искажающих значения Тпл, препаратов ДНК.

На наш взгляд линейная зависимость ДНпд от Тпл ДНК связана с непосредственным влиянием температуры на энтальпию денатурации и мочсет быть объяснена изменением теплоемкости между нативным и денатурированным состоянием ДНК. В настоящей работе это было доказано прямим измерением величины ДСр непосредственно на кривой плаиления при высокой концентрации биополимера. Величина ДСр оказалась равной 1б5±8 Дк/мпо-град, т.е. в пределах ошибки эксперимента совпадает с величиной ДСр из зависимости ДНПЛ от Тпл ДНК. Гто означает, что при расчетах разности свободной энергии (Дй0 ), энтропии ( ДЭ0) и энтальпии (АН0) нативного и денатурированного состояния ДНК при стандартной физиологической температуре (Т0 = 310 К) можно использовать величину ДСр из соотноше-Н';ч (3). Результаты этих расчетов представлены в табл.1.

Таблица I. Термодинамические параметры денатурации ДНК в растворах НаС1 при рН 7,6.

рИа' °С ¿«пл. кДк ДБ . пл* Д* лн0, кД* Дз0, д* Д0о, кДж

мпо мпо' град мпо мпо - 1'рад мпо

2,42 57,0 36,0 108,4 33,1 99,2 2,36

2,08' 63,5 36,5 108,4 32,6 96,7 2,67

1,69 70,7 37,3 108,9 32,4 93,8 3,35

1,24 79,3 39,2 П\4 33,0 92,5 4,25

0,84 87,1 41,1 114,3 33,8 92,1 5,28

Из таблицы I видно, что значения ДН0 при разных концентрациях iíaCl остаются практически постоянными. В то же время величина изменения энтропии при переходе от нативного к денатурированному состоянию ДНК значительно увеличивается при уменьшении ионной силы среды, а величина Д0о соответственно растет. Эти данные доказывают, что механизм стабилизирующего действия одно-одновалентных электролитов на нативную двухспиральную структуру ДОК имеет энтропийную, а не энтальпийную природу.

Термодинамические свойства ДНК в присутствии ионов магния и кальция. Ионы магния и кальция играют важную и разнообразную роль в функционировании яивьгх систем. Они являются фактором, необходимым для сохранения целостности биологических структур, принимают участие в раде ферментативных реакций, оказывают существенное влияние на течение многих биологических процессов, протекающих с участием нуклеиновых кислот. Влияние этих катионов на термодинамические свойства ДНК в растворе при физиологической концентрации соли и высокой концентрации ДНК, т.е. в условиях наиболее близких к in vivo изучено крайне недостаточно. Это связано с методическими сложностями в виде светорассеяния, развивающегося в процессе денатурации при относительно низких концентрациях катионов и сильно искажающего спектрофотометричес-кие кривые плавления ДНК. Метод микрокалориметрии'лгчен этого недостатка. Он позволяет исследовать не только светорассеивающие образцы, но и осадки.

Дифференциальные кривые плавления и термодинамические параметры денатурации ДНК в широком диапазоне концентраций ионов магния и кальция представлены на рис.4,5 и в табл.2,3. Из рис.4 видно , что при увеличении концентрации ионов магния до 4 мМ ( Kg/2P »2), что близко к физиологическому содержанию ионов магния в ядре, наблюдается стабилизация АТ-богатых участков ДНК (сдвиг низкотемпературной части кривой плавления на 1,5 °С) и менее заметная стабилизация ГЦ-богатых сателлитных фракций (сдвиг пика III в сторону больших температур на 0,5 °С). При дальнейшем увеличении концентрации ионов магния в растворе (0<jjg/2P<30) Tjy, ДНК уменьшается до первоначального значения, температура начала плавления не изменяется, а температуры плавления ГЦ-богатых сателлитных фракций существенно уменьшаются. Снижение температур плавления сателлитных фракций приводит к значительному сужению всей кривой плавления, что свидетельствует о сближении термостабильности AT и ГЦ-пар ДНК.

Рис. 4. Кривые теплопог-дощения (1-6) и светорассеяния Ctó) ДНК в присутствии ионов магния. От- v ношение Kg/2P: 1,1'- 0; § 2,2?- 2; 3,3'- 10; 4,4'- | 15; 5,5'- 35; 6 - 120; £ 7 - 300;8 - 740. Бу- § фер: 0,15 Ы Nací, g

0,01 М трис-HCI, eh

pH 7,6. Римскими цифрами пронумерованы пики на кривой теплопзглощения.

100 Т, °С

Таблица 2. Термодинамические параметры денатурации ДНК в присутствии ионов магния.

Mg/2P Тпл» °С AIW кДк НПО AS пл Д« лн0. кД* As 0, Д* ДО 0, кДж ■ ММ ■

мпо-град мпо JIIMMMrtil

0 86,8 41,4 ¡ П5,1 33,9 92,7 5,19

2 87,9 45,2 125,2 37,6 102,5 5,79

6 88,0 47,3 131,0 39,7 108,1 6,12

10 87,9 1 49,0 135,8 41,4 113,0 6,32

35 86,8 50,2 139,5 42,7 117,2 6,41

120 66,2 49,4 137,5 42,0 115,4 6,23

• 300 83,5 45,4 127,4 38,4 106,4 5,44

740 79,3 41,4 117,5 35,1 98,4 4,56

■ Значения энтальпии денатурации и свободной энергии стабили вации ДНК при физиологической температуре (Т0 = 310 К) в присут ствии ионов магнкя представлены в табл.2. Из табл.2 видно, что

диапазоне концентраций 0<11з/2Р«а30 стабильность вторичной структуры ДКК увеличивается, причем стабилизация имеет преимущественно энталыш? "кП характер. Очевидно это связано с бо'льшим с :ранирующим эффектом фосфатных групп ДНК ионами магния, "ем донами натрия. Известно, '~?о ионы Ca в 16 раз сильнее чем ионы Ка связываются с ДНК. Учитывая, что константы связывания Ca и i'S с ДНК при физиологических условиях одинаковы, можно показать, что в 0,15 М ifeCl до 2(% фосфатных групп будет экранировано ионами магния уже при отношении Дг/2Р = 2 . Экранирующий эффект ионов магния выае, чем ионов натрия, чго и приводит к стабилизации нативной структуры ДНК.

Уменькение температуры плавления ¿'Ц-богатых сателлитных фракций ДНК очевидно связано с тем, что ионы магния взаимодействует не только с фосфатными группами ДНК, но как показано в работах Благого с сотрудниками /5,6/, и с азотистыми основаниями ДНК (в основном цитозином). Также известно, что константы связывания ионов магния с основаниями ДНК значительно меньше, чем с фосфатными группами. Это приводит к тому, что на фоне общей стабилизации молекулы ДНК за счет экранировки фосфатных групп, термостабильность ГЦ-богатых участков ДНК уменьшается из-за взаимодействия магния с гуанин-цитозиновыми парами оснований.

Влияние н^ольяих концентраций ионов кальция 'на тепловую денатурацию ДНК во многом схоже с влиянием ионов магния. В диапазоне концентраций 0<Ca/2P«SI5 энтальпия денатурации и свободная энергия стабилизации ДИК (табл.3) значительно увеличиваются. Как и в случае ионов магния происходит значительное сужение перехода. Из рис.5 видно, что при увеличении кок .ентрации ионов кальция до отношения Са/2Р = 15 наблюдается сильное снижение температур плавления ГЦ-богатых участков ДНК (пик III смещается в низкотемпературную область на 8 °С) и обусловленное этим некоторое снижение Тпл ДНК (на 2,6 °С). Таким образом влияние ионов кальция на стабильность вторичной структуры ДНК проявляется в двух направлениях: I) преимущественно энтальлийное стабилизирующие действие за счет экранировки фосфатных групп н 2) более сильное, чем ионами магния дестабилизирующее действие не ГЦ-богатые участки ДНК, обусловленное взаимодействием ионов Ca с гуанин-цитозиновыми парами оснований, причем стабилизирующий эффект является преобладающим.

При дальнейшем увеличении концентрации ионов магния и кальция в растворе ( l.!s/2P>30 , Са/2Р>15) наблюдается снижение термостибильности ДНК. Энтальпия денатурации и свободная энергия

Рис. 5. Кривые теплопог-лощения ДНК в присутствии ионов кальция. Отношение Са/2Р: I - 0;. 2 -0,5; 3 - 3; 4 - 6; 5 -10; 6 - 30; 7 - 100; 8 - 350. Остальные условия как на рис.4.

100 Т,

Таблица 3. Термодинамические параметры денатурации ДНК в присутствии ионов кальция.

Са/2Р °С кД* Д3пл-Д* ДН0> кДк. ^0' Д* А<30, кДж

"МШ мпо-град мпо мпо.град " МПО 1

0 86,9 41,ч 115,0 33,9 92,ь 5,21

0,5 86,8 43,5 120,9 36,0 98,5 5,49

3 85,8 46,0 128,8 38,7 106,4 5,70

6 85,7 48,0 133,8 40,7 112,0 5,98

10 85,0 50,2 140,2 43,0 118,6 6,23

30 84,1 50 ,-0 140,0 42,9 118,8 6,11

350 74,5 44,4 127,8 38,8 111,9 4,09

800 67,4 41,2 1 121,0 36,6 106,8 3,53

стабилизации ПНК значительно уменьшаются (табл.2,3). Дестабилизирующий эффект имеет преимущественно энтальпийную природу. Дифференциальные кривые плавления ДНК смещаются в сторону низких температур. Ширина перехода, расстояние между пиками на дифференциальных кривых плавления при этом меняются слабо. Эти изменения по-видимому отражают значительно» изменение активности воды в высокосолевых растворах магниевых и кальциевых солей.

Интересной особенностью денатурации ДНК при физиологической концентрации НаС1 является появление нового пика теплопогло-щения в высокотемпературной области при отношении Ь'гг/2Р >1 5 и Са/2Р>6 (рис.4,5, пик V). Появление его сопровождается светорассеянием, интенсивность которого растет при увеличении концентрации катионов. Подобное явление наблюдали при спектрофотометричес-ком изучении денатурации разбавленных растворов ДНК в присутствии высоких концентраций магниевых солей. Пик V характеризуется рядом особенностей: I) он появляется при значительной ¿ермостабилизации ГЦ-богатых областей ДНК, 2) амплитуда его достигает максимального значения в узкой зоне концентраций воздействующего агента, 3) доля ДЩ, претерпевающая денатурацию в области пика V составляет 30-5С$, 4) ширина пика V практически не изменяется с концентрацией ионов магния и кальция, 5) температура этого пика примерно на 10 °С выше температуры плавления основной части ДНК и эта разница сохраняется вплоть до очень высоких концентраций катионов.

На наш взгляд пик V отражает плавление конденсированной (агрегированной) формы ДНК. Как известно, переход ДНК в конденсированную форму происходит при значительной степени нейтрализации фосфатных групп ДНК (>9055). В исследуемой среде это условие вред ли может быть реализовано, хотя оценки показывают, что степень нейтрализации фосфатных групп превышает 80^. Кроме того, присутствие ионов магния и кальция даже в очень высоких концентрациях не изменяет светорассеяние препаратов ДНК при комнатной температуре. Это означает, что конденсированная форма ДНК, представленная в концентрированных растворах агрегатами появляется в процессе нагревания, вероятнее всего после денатурации менее термостабильных областей ДНК. Связывание ионов магния и кальция с денатурированной ДИК более значительно, чем с нативной. Поэтому стабилизация конденсированных двухспиральных образований ДНК очевидно происходит через связывание в присутствии ионов магния и кальция соседних со спиральными участками денатурированных областей ДНК.

Таким образом микрокалориметрический метод, в отличие от спектрофотометрического, позволил получить полные кривые денатурации ДНК в присутствии ионов магния и кальция в условиях частичной агрегации. В зависимости от концентрации катионов установлена стабилизация, дестабилизация и конденсация ДНК в физиологических условиях.

Взаимодействие некоторые биологически а'-тивных соединений с ДНК. В последние годы значительно возрос интерес к исследованию взаимодействия интеркалирушщих красителей и антибиотиков с ДНК с целью понимания токсических и химиотерапевтических эффектов этих малых молекул. В настоящей работе проведено микрокалориметрическое исследование влияния интеркалирующих красителей (эти-диум бромид, акридин оранжевый) и противоопухолевого антибиотика актиномицина Д на термодинамические свойства ДНК в растворе при физиологической ионной силе среды. На рис.6 показаны кригче плавления ДНК в присутствии этидиума бромида ОБ).

Гис. 6. Кривые теплопоглощения ДИК в присутствии этвдиума бром еда. Отношение ЭБ/2Р-Ю3: I - 0; 2 - 7,6; '3 - 24; 4 - 89? 5 - 269; 6 - 928. СдНК = 1,5-2,5 мг/мл. Буфер: 0,15 У 1<цС1, 0,01 М йа-ДЩ, р!1 7,6.

Из рис.С видно, что добавление в раствор ЭВ приводит к значи только Я тормастпбияизпции ДНК. При небольших концентрациях Э13 ипКг.ч/^гггл 1ф»имуцоственнпя стабилизация ГЦ-бэгатых участков С. иирч^иптел п резком увеличении температур плавления

ГЦ-богатых сателлитных франций, небольшом их уширении и слабом изменении температуры начала плавления. Это приводит к значительному увеличению ширины перехода ДНК. Так при отношении ЭВ/2Р = 8,9-10"^, что соответствует одной молекуле ЭБ на II пар оснований ДНК, ширина перехода ДТ ^ увеличивается до 13,3 °С против 8,6 °С у контрольной ДНК в отсутствии лигандов. Уширение перехода ДНК при малой концентрации ЭБ может быть обусловлено перераспределением лигандов в процессе плавления с денатурированных на двух-спиральные участки биополимера. Однако расчеты и литературные данные, приведенные в работах /7,8/ показывают, что взаимодействие ЭБ с ДНК осуществляется двумя способами." При малых концентрациях ЭБ на кривых плавления ДНК проявляется по-видимому редкое, но сильное связывание с ГЦ-богатыми сателлитными фракциями, а при средних концентрациях красителя - частое, но слабое связывание с основной частью ДЩ. В табл.4 представлены термодинамические параметры денатурации ДНК в присутствии ЭБ.

Таблица 4. Термодинамические параметры денатурации ДНК в присутствии этидиума бромида.

ЭВ/2Р» Ю3 к- мпо Л* ДН0, - кД* Дз0, Д* ДС0, кД* мпо

мпо.град ыпо лпо.град

0 87,1 40,2 111,6 32,7 89,2 5,06

7,6 87,6 41,6 115,4 34,0 92,7 5,26

24 88,4 41,3 114,3 33,6 91,3 5,30

43 89,9 42,5 117,1 34,6 93,4 5,59

89 93,0 46,2 126,2 37,8 10 Ь, 2 6,42

157 95,6 46,4 125,9 37,6 99,9 6,63

193 9М 50,0 134,8 40,9 107,8 7,42

269 99,3 50,4 135,4 41,1 107,9 7,60

612 104,1 54,3 144,0 44,2 114,7 8,58

928 108,0 53,2 139,6 42,6 108,7 8,85

Из табл.4 видно, что энтальпия денатурации и свободная энергия стабилизации ДНК быстро увеличиваются при малых концентрациях ЭБ, а при больших концентрациях стремятся к кзсыцешю. Термодинамические параметры денатурации ДНК показывают, что ста-

билиэирующев действие ЭВ на вторичную структуру ДНК имеет преимущественно энтальпийную природу.

Акридин оранжевый (АО) при прямом смешении с растворов ДНК вызывает частичную агрегацию. В связи с этим количественное определение термодинамических параметров денатурации ДНК становится невозможным, хотя качественное изменение дифференциальных кривых плавления в присутствии АО во многом схогч с изменениями кривых в присутствии ЭБ.

На рис.7 показаны дифференциальные кривые плавления ДОК в присутствии актиномицнна Д (АВД).

Рис. 7. Кривые теплопоглощения ДНК в присутствии актиномицнна Д.

Отношение АВДгёР.Ю3: I - 0; 2 - 2,2;,3 - 25; 4 - 89;

' & - 124; 6 - &02. Остальные условия как на рис.6.

Из рис.7 видно, ««»-о даже небольшие концентрации АЗД существенно изменяют форму кривой плавления ДНК. Сильная термостабилизация ГЦ-бэгптых сателлитных фракций наблюдается уже в том случае, когда одна молекула кЧЛ приходита- на 450 пар оснований ДНК. ¡.ри отношении АМД/2Р * 2,5* Ю"2, что соответствует одной молекуле А.ЦЦ на 40 пар оснований на кривой, плавления видно завер шение обрпвэрпния лика теплологлощения с Тпл » НО °С (пик I, рис.7). Этот пик отражает плавление наиболее чувствительных к АВД ГЦ-бяг.^нх участк в ДНК. Для максимальной термо стабилизации менее ГЦ-богатнх учостков ДНК требуются большие концентрации АЦЛ Тпкио участии рьтлпплямтся другим пиком тпплопоглощения с

60 90 100 НО Т, °С

Тпл = 105 °С (пик II, рис.7). Площадь под этим пиком достигаем максимальной величины, когда одна молекула АЭД приходится на 10 пар оснований ДНК и не изменяется при дальнейшем увеличении., отношения АМД/2Р. В этом диапазоне концентраций лиганда (A¡4V2P49,7.I0~2) температура начала денатурации почти не изменяется, а плавление основной части ДН" происходит в том не температурном интервале, как и контрольной ДНК в отсутствии лиган-дов. При дальнейшем увеличении концентрации АВД происходит стабилизация основной части ДНК. Резко увеличиваются значения Тпл, ДНпд и свободной энергии стабилизации ДНК (табл.5), а температура начала плавления при этом меняется незначительно.

Таблица 5. Термодинамические параметры денатурации ДНК в присутствии актиномицина Д.

АМД/2Р-ТО3 Т ¿пл» °С ДНПЛ' кДч пл> Дк АН0, кДч ¿3о> Лтс Дй0, кД*

мпо мпо-град; мпо мпо•град МПО

0 67,1 40,2 111,6 32,7 89,2 5,06

2,21 87,2 39,4 109,4 31,9 86,9 4,93

5,31 87,3 40,4 112,1 32,9 89,6 5,07

9,79 87,7 40,7 112,8 33,1 90,1 5,17-

24,8 89,0 41,8 115,3 3-1,0 92,5 5,33

61,7 89,2 42,7 117,9 34,9 94,6 5,53

96,8 91,9 44,9 123,1 36,7 98,6 6,10

124 97,1 45,8 123,8 3§,8 97,2 6,66

240 96,8 47,2 127,6 38,2 101,2 6,86

502 96,6 47,2 128,5 38,6 102,3 6,86

Срапнение данных, полученных при исследовании влияния ЩД и ЭБ на тепловую денатурацию ДНК приводит к следующим вьгао-Оба эти соединения значительно стабилизируют ДНК, особенно эе ГЦ-'огатые участки. СтаОчлизирую'цее действие ЭБ на вторичную структуру ДНК (увеличение Т1Ш на 20 °С и ДНпд на 32Я очевидно ' :вязто с интеркаляцией ЭВ нетщу плоскостями оснований ДНК. Тэтой механизм хорошо изучен и общепринят. Следует тактсе отметить, гго ЭВ менее.специфичен к взаимодействию с ГЦ-богатыми сателлит-шми фракциями, чем АЭД. Это выражается в том, что при больших

концентрациях ЭБ температура плавления ГЦ-богатых сателлитных фракций не достигает постоянной максимальной величины, а продолжает увеличиваться по мере увеличения концентрации л :ганда (рис.6). Температура начала плавления при этом быстро растет. Это означает, что после заполнения ГЦ-богатых уча лт ко в ДНК, ЭВ начинает встраиваться в участки ДНК, обогащенные АТ-парами. АВД при взаимодействии с ДНК проявляет себя.совершенно отличным обр< эом. Стабилизация ГЦ-богатых участков, составляющих небольшую часть ДНК, завершается при крайне низких концентрациях лиганда (одна молекула АВД на 40 пар оснований ДНК). Участки с меньшим ГЦ-составом для достижения максимальной термостабильности требуют больших концентраций лиганда, и только при очень высоких концентрациях АВД незначительно повышается термостабильность АТ-бэгатых участков ДНК. Представленные результаты согласуются с литературными данными о взаимодействии АВД с ДНК. Известно, что АВД наибольшую специфичность проявляет к последовательностям СрО , имеющим особое соседство других оснований. Такие пос ледовательности имеются в тимуеной ДНК и сосредоточены они в ос новном в ГЦ-богатых сателлитных фракциях. Плавление таких участ ков с благоприятным для взаимодействия с АВД окружением (тимин, пденин) очевидно происходит в области с Тпл = ПО °С (пик I, рис.7), а области GpC с менее благоприятным для взаимодействия с АМД окружением (гуанин, цитозин) плавятся в области температур 105 °С и 90 °С (пики И,III, рис.7).

Взаимодействие гистона НТ с ДНК. В настоящей работе провес но исследование взаимодействия гистона HI с ДНК. Этот лизинбога тый гистон иг{»ет главную роль в процессе конденсации и формиро вании высших структур хроматина. Исследование специфичности вза модсйствия его с ДИК представляют большой биологический интерес Известно, что гистон HI предпочтительно взаимодействует с последовательностями ДНК, обогащенными АТ-парами. При кг [центра ции соли выше 40 mIí гистон HI связывает часть молекул ДНК, оса* дли irx из раствора. Это свойство гистона HI было использовано t нмстнящей работе дпя изучения специфики взаимодействия его с Д1

Комплексы гистон HI—ДНК» при различном весовом отношении HI/ДНК готовили п 0,7 М ИаС1, где гистон'НI полностьы диссоцш ртаан. Затек комплекс переводили диализом в SSC и осаждали ei цгнтри^угирогапием. Г1рг>мытьй осадок и с; ^рнатант переводили диализом обратка в 0,7 М ШСХ. .Дифференциальные кривые плавле( arftv^Uiiofl гистоном III ДНК в 0,7 М KaCl показаны на рис.Ья. ilpi внеокой концентрации соли комплекс полностью диссоциирован, п

денатурация гистона Н1 происходит на 20 °С ниже денатурации ДНК и не перекрывается с ней. Из рис.6а видно, что осажденная ДНК практически полностью лишена ГЦ-богатых сателлитных фракций. Наименьший ГЦ-состав, определенный иэ значений Тпл, имеет фракция ДНК, осажденная при отношении Н1/ДНК = 0,1 (39,6$ ГЦ, 2Ъ% осаждения). При большой концентрации гистона (Ш/ДНК « 0,6) осаждается 90$ ДНК, захватывая и небольшую часть сателлитных компонентов. Отсутствие сателлитных фракций у осажденной ДНК приводит к уменьшению ширины ее денатурационного перехода ДТ^'^ от 7,1 до 5,9 - 6,4 °С.

а) я а: <и =Г о ч и о с о ч с о

а)

90 100 90 100 Т, °С

Рис.8. Кривые теплопоглощения ДНК, осажденной гистоном Н1 (а) и ДНК, остающейся в супернатанте (б). Отношение Н1/ДНК: I - 0,1 (......); 2 - 0,3 (-—-); 3 - 0,6 (-—); 4 - контрольная нефракционированная ДНК.

На рис.8б показаны кривые плапления фракций ДНК, . ста^щих-ся в супернатанте после осаждения комплекса Н1/ДИК. Как видно иэ кривых пллвления эти фракции представляют собой популяции молекул ДНК, сильно обогащенные ГЦ-богатши сателлитными компонентами. Из значений Т можно рассчитать ГЦ-состав таких фракций, полученных при отношении Н1/ЦНК равном 0,1; 0,3 и 0,6 (25£, и 90$ осатдения). Эти величины равны 43,8; "9,Т и 55,СЙ ГЦ-пар соответственно, что значительно нише, чом у контрольной нефракцганирэванноЯ ДНК. Осибеннэ большое ур~п.--чение ГЦ-сост'апа (н?. П,7£) наблддается а супсрнатанттЯ фрак-

ции, полученной при отношении Н1/ДНК = 0,6. В этой фракции количество сателлитных ДНК ст 1,715 и ст 1,709, плавление которых в 0,7 М NaCl происходит в районе 100 °С увеличивается до 50$ против lOfo у контрольной ДНК.

Таким образом представленные результаты говорят о том, что в физиологических условиях гистон HI предпочтительно взак модействует с основной АТ-с^гатой частью тгчусной ДНК и практически не взаимодействует с ГЦ-богатыми сателлитными компонентами. Это свойство гистона HI можно успешно использовать для фракционирования ДНК эукариот и выделения сателлитных компонентов.

ВЫВОДЫ-

1. Методом микрокалориметрии впервые проведено исследование концентрированных бессолевых растворов ДНК из тимуса теленка и определены термодинамические параметры денатурации ДНК

в этих растворах. Обнаружена линейная зависимость Тпл от логарифма концентрации ДНК в бессолевых растворах и сделан вывод о сходстве механизмов стабилизации ДНК в бессолевых и содержащих поддерживающий электролит растворах.

2. Показано, что ДНК в бессолевых растворах при длительном диализе против воды значительно протонируется, причем преимущественно по ГЦ-богатым областям. Это приводит к резкому снижению термостабильности биополимера в бессолевых растворах.

3. Методом микрокалориметрии исследована тепловая денатурация ДНК в солевых растворах. Количественно определены зависимости Т^ от логарифма концентрации соли и ДНШ от Тпд. Объяснены расхоздения данных разных авторов в указанных зависимостях.

4. Впервые показано, что линейная зависимость ДН^ от Тпд ДНК -в растворах 1,аС1 непосредственно связана с величиной разности теплоемкости нативного и денатурированного состояния ЧНК ДСр. Обнаружено, что величина скачка теплоемкости при денатурации ДНК, определенная непосредственно на кривой плавления, в пределах ошибки эксперимента совпадает со значением ДСр из зивисимости ДН^ от Тдд ДНК. Полученные термодинамические дпшшо доказывают, что моханизм стабилизации ДНК одно-однова-лпнтннми электролитами имеет энтропийную природу и представ-ллот интерес для развития современных теорий силыюзаряженных шли;>л(М(Тролнтов типа ДНК.

5. Методом микрокалориметрии впервые изучена твачовая денатурация ДНК в широком диапазоне концентраций ионов магния и кальция. Показано, что термостабильность ДНК увеличивается при низких концентрациях катионов, а при высоких - уменьшается. Обнаружено, что при определенной степени денатурации

и концентрации ионов магния и кальция происходит переход части ДНК в компактную (агрегированную) форму, которая кооперативно разрушается при значительно более высокой температуре, чем основная часть ДНК.

6. Впервые проведено микрокалориметрическое исследование тепловой денатурации ДНК в присутствии интернирующих красителей (этвдиум бромцд, акридин оранжевый) и противоопухолевого антибиотика актиномицина Д. Показано, что эти значительно стабилизирующие ДНК соединения преимущественно взаимодействуют

с последовательностями ДНК, обогащенными гуьнин-цитозиновыми парами оснований, причем очень высокую специфичность к определенным последовательностям проявляет актинсиицин Д.

7. Предложен метод фракционирования ДНК по Щ-со ставу с • помощью гистона HI. Дифференциальные кривые плпмления фракционированной этим методом ДНК показывают, что в физиологических условиях гистон HI предпочтительно взаимодействует с основной ЛТ-ОогатоЙ часть» ДИК и практически не взаимодействует с ГЦ-богатыми сателлитными компонентами.

Цитируемая литература.

1. Prlvalov P.L., Ptitsyn O.B., 3irohtoln T.1J. // Biopolymors. 1969. V. 0. II 5. F. 559-571.

2. Gruenwedel D.W. // Biochim. Biophys. Aota. 1974. V. 340. N 1. F. 16-30.

3. Gruenwedel D.W. // Mochte. Biophya. Acta. 1375. V. 395, И 3. P. 246-257.

4. Shiao D.D.Ii., Sturtevant J.U. // Biopoiymera. 1973. V. 12. H в. Р. 1в2Э-1в36.

Blagoi Yu.P., Sorokin Y.A., Valoev V.A., Khonenko S.A., Glbdchenko 0.0.// Biopolymera. 1973. V. 17. И 5. P.1103-1118.

6. Влагой Ю.П., Сорокин B.A., Валеев B.A. // йолекуляр. биология. I960. Т. 14. X' 3. С. 595-605.

7. Карапетян А.Т., Пермогоров В.И., Фрзнх-Каменсцкий и.Д., Лазуркин D.C. // Молекуляр. биология. 1972. Т. 6. № 6. С. 667-d74.

8. Карапетян А.Т. // Молекуляр. биология. 1991. Т. 25. № 2. С. 325-336.

Основное содержание диссертации изложено в следующих печатных работах:

X. Akhrem A.A., Vlasov А.P., Andrianov V.T. Microcalorimetric study of DNA destabilization by Mg2+ and Ca2+ ions in physiological salt. // International symposium on bio-calori-metry. Tbilisi. 1981. F. 23.

2. Andrianov V.T., Vlasov A.?., Akhrem A.A. Effect of Hg2+ and CaZ+ ions on themal denaturation of DNA. // Symposium on biophysics of nucleio acids and nucleoproteins. Tallinn. 1981. P. 189.

3. Власов А.П., Андрианов В.Т. Микрокалориметрическое исследование тепловой денатурации ДНК в присутствии одно и двухва-

■ лентных катионов. // I Всесоюзный биофизический съезд. Тезисы докладов стендовых сообщений. Москва. 1982. Т. I. С. 62.

4. Власов А.П., Андрианов В.Т. Изучение взаимодействия некоторых антибиотиков и красителей с ДНК методом сканирующей микрокалориметрии. //'I Всесоюзный биофизический съезд. Тезисы докладов стендовых сообщений. Москва. 1982. T.I. С. 100.

5. Аццрианов В.Т., Власов А.П. Термодинамическое исследование тепловой денатурации ДЦК при различных концентрациях соли и полимера в солевых и бессолевых растворах. // Международный симпозиум по физико-химическим свойствам биополимеров в растворе и клетке. Тезисы докладов. Пущино. 1985. С. 79-80.

6. Ахрем A.A., Андрианов В.Т., Власов А.П., Королев Н.И., Кузнецов И.А. Термическая денатурация ДНК в концентрированных бессолевых растворах: сопоставление микрокалориметрических и спектрофотометрических данных. // Молекуляр. биология. 1985. Т. 19. № 3. С. 623-628.

7. Андрианов В.Т., Власов А.П. Микрокалориметрическое изучение тепловой денатурации солевых и бессолевых растворов ДНК. // ■Всесоюзный симпозиум по конформационным изменениям биополимеров в растворе. Тезисы докладов. Тбилиси. 1985. С. ПО.

8. Власов А.П., Андрианов В.Т. Изучение степени нативности бессолевых растворов ДНК. // ДАН БССР. 1987. Т. 31. № 3. С. 273-276.

9. Власов А.П., Синякин А.Н., Андрианов В.Т. Влияние ионной силы срды нп стабильность двойной спирали ДНК. '// ДАН БССР. Ш7. Т. 31. М 6. С. 563-566.

10. Власов А.Т., Андрианов В.Т. Микрокалориметрическое исследование тепловой денатурации бессолевых растворов ДНК. // Изв. АН БССР. Сер. хим. наук. 1988. № 2. С. 41-45.

11. Власов А.П., Синякин Л.Н., Ан,.рианов В.Т. Влияние ионной силы раствора на тепловую денатурацию ДНК. // Изв. АН БССР. Сер. хим. наук. 1988. № 3. С. 70-71.

12. Власов А.П., Синякин А.Н., Андрианов В.Т. Определение параметров денатурации AT- и ГЦ-пар ДНК методом адиабатной сканирующей микрокалориметрии. // Изв. АН БССР. Сер. хим. наук. 1988. № 4. С. 55-59.

13. Власов А.П., Андрианов В.Т. Влияние рН и метода получения на термическую денатурацию тимусной ДНК в бессолевых растворах. // Биофизика. 1991. Т. 36. № I. С. 31-34.

14. Власов А.П., Яхонтова Л.И., Андрианов В.Т. Микрокалориметрическое исследование тепловой денатурации ДНК из тимуса теленка в присутствии ионов магния. // Биофизика. 1991.

Т. 36. № 3. С. 437-440.