Энергетика, структура и природа взаимодействий ионов металлов с ДНК в растворах

Брегалзе, Василий Григорьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Энергетика, структура и природа взаимодействий ионов металлов с ДНК в растворах
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Энергетика, структура и природа взаимодействий ионов металлов с ДНК в растворах"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ /С^

РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВШНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ЕРЕГАДЗЕ Василий Григорьевич

УДК 577.523

ЭНЕРГЕТИКА, СТРУКТУРА И ПРИРОДА ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ С ДНК В РАСТВОРАХ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва 1989

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте Физики- Ж Грузинской ССР

Официальное оппоненты:

локтор Физико-математических наук, профессор В.Я. Малеев, доктор Физико-математических наук В.Л. Носкин, доктор физико-математических наук В.И. Иванов

Ведущая организация:

Институт биологической физики ЛН СССР

Защита состоится "_"__1989 г. в_час.

на заседании специализированного совета Л 053.05.53 по биофизике при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 117234, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С -диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Авторег фат разослан __п__198_г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

.си..-

Т.Е. Кренделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Создание новых физических методов исследований в биологии и их совершенствование привело к резко-цу углубления наших знаний на молекулярном уровне. В частности, становится все более очевидным такой факт, что ионы металлов играют важную рель в самых разнообразна биологических процессах. 'Трудно переоценить роль ионов металлов в медицине. Известно, что концентрация свободных ионов жизненеобхедиыых металлов контролируется и поддерживается в живой материи чреавпчанно тонко, и нарушение ионного баланса в.системе вызывает растройства в ней, равно как и различные функциональные растройства ведут к нарушению этого баланса. Так, например, в сыворотке крови больных некоторыми раковыми заболеваниями наблюдается повышение уровня таких элементов как медь и цинк, поэтов юс изучение является актуальным для определения фактора риска на этапе диспансеризации практически здоровых лэдеЯ в амбулаторных условиях. Кроме того представляет важность исследование количества связанного с тем или иным компонентом сыворотки биологически активных элементов при различных заболеваниях. В настоящее время широко используется лечение металлами, находят применение ионы металлов и хелаты и в химиотерапии. Хелатотерапия используется для удаления из организма токсичных ионов и металлов.

Б последнее время, в связи с особой ролью ионоб металлов в функционировании живых организмов, сформировалась новая научная дисциплина - бионеорганическая химия, которая теснеШн:!и образом связана с молекулярной биофизикой и молекулярной биологией, поскольку связь между органикой и металлами осущеетзлязтся посучдегвом таК называемой координационной связи - промежуточной по энергии между химической и аандерваальссвой - особым взаимодействием - электронно-донорно-акцепторным. Все большее внимание обращается на то, что многие ионы двухвалентных металлов 1-го переходного ряда играют важную роль в суперспиральной организации ядерной ДНК, репликации ДНК, ее транскрипции в чРНК, а также в трансляции генетического кода. Кроме этого, ионы металлов могут вызывать различного рода дефекты в структуре ДНК, такие как депуринизация, однотяяевые разрывы, ошибки а синтезе нуклеиновых кислот.

Экспериментальные изучения специфичности взаимодействия ДНК е ионаш таких металлов как /Vo. CD » Mg(u) t Mn(iO i Co(") /V; (n) • Cu(ii) • CuO) . НпООи 4g(!) , структуры этих комплексов и энергетики связывания в них при различных внешних условиях (ионная сила, окружение, нуклеотидный состав, УФ- и гамг^1 «излучение и др.) являются важным и актуальным в поникании организации и функционирования генома на моле^улдрном уровне.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось экспериментальное исследование природы вэаимодейстшш ДНК с по» нами j/<W<J, Со (и), J/iO'), Си ("),

Б задачи работы входило:

-создание новых методов исследования, давщих ноличествзга^в информацию о взаимодействиях ионов металлов j ДНК в водных растворах;

- изучение влияния нуклеотидного состава на энергетику связи-вания;

- исследование влияния ионной силы на взаимодействие ДНК е ионами металлов;

- ыяснение роли оьфукения иона металла на кошл^ксообразо-вание ДНК;

- исследование действия УФ- и гаг.ша излучения на комплексы ДНК с UOi);

- изучение конкургнтоспособноети ыезду ионами кеталлов и интернирующими флюоресцирующими itpaci гелями при взаимодействии их с ДНК;

- выяснение роли гнетенного кора при взаимодействии ионов металлов с ыононуклеосоыаш.

Научная новизна. На основе УВЧ индуктивно-связанной плаэш пониженного давлени.; в качестве оптического источника света в атокно-эмиссионном спектральном анализе созданы два новых высокочувствительных метода: импульсный (одноканальный и многоканальный) экспрессный микроанализ биологически важных ..еталлов в растворах биомакромолекул и надмолекулярных структур, в том числе и в сыворотке периферийной крови, который в сочетании с равновесным диализом позволил определить константы связывания ионов металлов с ДНК, и плазменный эмиссионный метод для исследования кинетики десорбции газов и паров в изотермическом режима и в режиме флеш-десорбции с поверхности биологических молекул и ело-

v.khs соединений.

При помощи этих методов, а таете методов У§ и видимой аб= гсрбционной спестрофото.четрии и флс-сриметрки, получивших дальне-Гс:зз развитие в насой работа, s п а р в ы о стало возможным:

- изизрить термодинамические константы связывания Со fu) , JJiL») . Си (.'/) и Zh¿/>) с ДНК;

- получить концентрационные константы связывания Со(<i),J/¡(h), Cu(„) и Уть I'<) с мононуклеосогаш, ввделекными из ядер клеток ncr-ismi гглз.1 линии СЗНА;

- получить кривые десорбции и флеш-десорбции иолекул воды с пэгзрхностп ДНК и определить энергию активации десорбции воды с

:овзрхности увлажненных образцов ДНЯ .фи разных относительны?' слйзсностях и комплексов ДНК е нонами jjn [и], Ус (ni), Со (i;J> culi') и"3)>И при относительной влажности 92,5$;

~ охарактеризовать структуры кошлексов Со(и] , и Си (и)

а ДНК методом абсорбционной спектрометрии в видиьзй и ближней ИК областях спектра (Ы-*с1 - переходы);

исследовать влияние J/a.СС, лигандного окружения, ГЦ состава на взаимодействие ионов переходных металлов с ДНК;

- изучить действие УФ и гамма-излучения (кинетические исс-е-доваш:д) на взаимодействие Gu(n)o ДНК;

- показать применение экспрессного высокочувствительного импульсного плазменного эмиссионного метода определения ыеди в сыворотке периферийной крови человека (691 случай) для диагностики и эпидемиологических обследований в медицине.

Практическая значимость работы. Создано новое направление, заключ щееся а комплексном подходе, основанной на применении

У:чЧ HHnvwMBHn-^ocíewHnft гтттагигт! Д££ЛС1«ЛЯ и ICC^CCTIív

оптического источника света в атошо-эииссионном микроэлементном анализе:

- следовых количеств металлов в образах биологического происхождения ( таких как белки, ДНК, хроиатин, выворотка грози)j

- концентрации ионоа металлов в экспериментах по равновесному диьдизу;

- количества и кинетики водяного пара, десорби^ующего с поверхность ДНК, металлокомплвксоа ДНК и хроматина.

Использованы традиционные катоды УФ дифференциально* и видимой абсорбционной зпактрофэтоиетрии и фляюриметрии красите-

лей, кнтеркалированных в ДНК для исследования взаимодействия ионов металлов с биомакромолекулами и надмолекулярными соединениями в растворах, с целыо выяснения структур ь^энегретики и дркро-ды связывания ДНК с иенами металлов.

Разработанный нами способ определения меди методом импульсного УВЧ плазменного эмиссионного анализа сыворотки периферийной крови человека, позволил обнаружить цлктор риска в условиях обычной диспансеризации (691 случай), кайти перераспределение меди у человека больного лимфогранулематозом по сравнение с сывороткой здорового донора, показать достоверное увеличение меди в исследованных формах лейкозов.

Результаты этих исследований могут иметь диагностическую ценность при эпидемиологических н клинических обследованиях пациентов, Такие исследования ведутся в настоящее время совместно с институтом гематологии и переливания крови МЗ ГССР.

На зациту выносятся следующие основные положения и результаты:

I. Разработки и создание 2-х типов атомно-эмиссионных спектрометре, использующих УВЧ.индуктивно-связанную плазму пониженного давления и качестве оптического источника света;

- импульсного спектрометра для элементного микроанадиза (35 ыкл) растворов биологических молекул, включая сыворотку крови человека, с пределом обнаружения 10"^° - по абсолютной величине, и

- прецизионного спектрометра для кинетических исследований десорбции паров воды с образцов биологического происхождения.

2. Разработка методики совместного использования равновесного диализа и импульсного УВЧ плазменного эмиссионного анализа для получения изотерм адсорбции ионов металлов на биомакромоле-кулех в разбавленных растворах с цель» изучения энергетики ком-пленеообразования.

3. Определена энергия гидратации ДНК, металлокомплекссв ДНК и растворимого хроматина, в частности энергия активации десорбции воды, вычисленная из изотермической кинетической кривой для ткмусной ДНК равна 21,4 ккал/моль веды.

4. Исследован нелинейный характер изотерм адсорбции. Изучено влияние ионной силы, ГЦ состава, гистонового кора на энергетику связывания ионоз металлов с ДНК. Определены термодккамичес-

сие константы слязыкшия ДНК из тиц/са теленка и. константы связывания мононуклеосом из клеток печени шадеи линии СЗНА в 0,01 M растворе ЖИ с ионаш ¿о(и) ,-Л/;(и) .Cut") и2ь(и), рК которых равны для ДНК: 5,22; 5,56$ 5,77; 5,14; для ыононукяеосом -3,90; 3,99; 4,15; 3,63, соответственно.

5. Развитие методов абсорбционной спектрофотометрии d УФ н эдимой областях cneirrpa, применительно к слабопоглощакцшл (с адоффициенто" молярного поглощения в пределах 2-20) и относитель-ш пдохорастворимым объектам биологического происхождения, в ча-мноетн ДНК, а таете к спектрам поглощения, мало возмущаемая меж-.голзиулкрньв.'М взаимодействиям, каковыми являются взаимодействия у'асьпинства двухвалентных ионов I-ги переходного ряда с ДНК,

6. Определены структуры комплексов Со О1) ,^0') и Gu(») с ДНК летодом спектрофотометрии поглощения гз ввдимоЯ и ближней ИК областях спектра. Показано, что конн Co(iiJ и JVï(îiJ ,например, взаимо-'.бйзтпуст а ДНК как гидратированные ионы, т.е. образует с ней сислнесферный ке.'ллекс. Ион Од (и J с ДНК ¡¿сг.от взаимодействовать непосредственно, т.е. образовывать внутрисферный комплекс.

7. Методами видимой и ультрафиолетовой дифференциальной апвктроскопки поглощения и равновесного диализа изучена природа сззкыодейстЕий ионов металлов JJj(n),JUn(nJ ,Сэ(н) ,M;[itJt Cu(nj, Ga(i) , ïhU'j с Д^ влияние нуклеотидного состава, нали-œie гистонового кора, ионной силы, поляризуемости иона, его заряда и лигандного окружения, концентрации иона, УФ и гамул-излу-чэняя. Показано, что действие ионов металлов на ДНК связано с одной стороны с энергетикой, структурой и природой этих кошде-псов, с другой - с характерными зременгми для снутренней подвижности ДНК и ее групп.

8. Продемонстрирована возможность применения импульсного УЕЧ ицзуктивно—связеиного пламенного атошо-эш:зсионкого анализа 3 медицине, на примере >я?едсления меди в сыворотке периферийной кровк практически здоровых дядей и людей больных различными фошакг леГкоэ*, с цэлъл обнаружить фактор риска и использовать Ot'C для ранней диагностики лейкозов.

Структура и объем_работн. Диссертация состоит из ввэдгтия, 6 глав, выводов и списка цггиру-мой литературы, Она со"еригг 291 страницу, в том ч«мв 93 рисунков, 32 таблиц и список литературы. из 241 наименований.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 33 работы, среди ни 2 обзорные статьи и I авторское свидетельство.

Апробация работы. Результаты исследований, приведенных в диссертации, докладывглись в виде пленарных, секционных и стендовых сообщений на следующих Всесоюзных и международных конференциях: Л, 1У, 1УГ У и У1 Всесоюзных кои( ренциях по спектроскопии биополимеров (г.Харьков, 1974, 1977, 1981, 1984, 1968)| Ш, 1У, У и У1 Всесоюзных конференциях по конформационным изменениям биополимеров в растворах (г.Тбилиси, 1975, I977; г.Тела-ви, 1980; г.Тбилиси, 1985), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), П Всесоюзном рабочем совещании по физике комплексов бкомвкромоленул с металлами (Пущино, 1987), I Всесоюзном совещании по биофизике рака (Черноголовка,1987), научной сессии отделения физиологии и экспериментальной медицины АН ГСС1 "Мялигнизация и физико-химические свойства биополимеров и их надмолекулярных структур"(Тбилиси,1987), Ш симпозиуме стран-членов СЭВ по 61 физике нуклеиновых кислот (Брно.ЧССР,1977).симпозиум по изменениям в конформациях ДНК (Брно, ЧССР, 1977).Международной конференции по квантовой химии, биологии и фармакологии (Киев, 1978), Международном симпозиуме по биофизике нуклеиновых кислот (Таллинн, 1981), У1 симпозиуме по биофизике белко! и нуклеиновых кислот (Сегед, ВНР, 1983), Международной конференции пс воде и ионам в биологических системах (Бухарест, СРР,193' Ш Международной конференции по бионеорганической химии (Нордвех-ерхоут, Нидерланды, 1987), Международном симпозиуме по физико-химии ДНК и молекулярным механизмам функционирования генома (Тб1 лиси, 1987), симпозиуме с участием стран-членов СЗВ и СФРЮ по гидратации биополимеров (Цущино,1988) и Ш Международной конфере! цки по хелатам (Зааингтон, США, 1989).

Результаты докладывались на Всесоюзном семинаре по молану-лдрной физике и биофизике водных систем (Ленинград, 1989), Всесоюзных школах-семинарах по использованию ядерно-физических методов з биофизике и молекулярной биологии (ЛИЯФ:Луга,Ленинград, 1932 и пос.Усть-Нарва,ЭССР,1983), Всесоюзных семинарах по фотонике нуклеинокгс кислот (Ленинград, 1978 и 1980), Республиканской конференции по молекулярной биологии и молекулярной генетике (Тбилиси, 1977), семинаре Института биофизики АН СССР (Цущино,19£

- 9 -СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава I.Физико-химические свойства поверхности ДНК а ионов 1еталлов (обзор литературы).

В настоящей главе дана характеристика элестронно-дснорно-1Кцепторных групп ДНК, экспонированных в растворитель. Рассиот->ены электронные свойства ненов переходных металлов, влияние счм-ютрии поля на расщепление А -орбмталь>4 ионоз поле» лигандов. (риведены основные положения концепции жестких и мягких кислот [ оснований, с помощью которой дан качествеяний анализ ьдашаодей-¡твнй ДНК с ионами металлов. Кроме того, в этой главе приведен !бгор экспериментальных исследований комплексов двухэерддных ио-юв с модельными соединениями и нуклеиновыми кислотами.

Глава Новые экспериментальные методики для исследования ¡закыодейстЕИя ионов металлов и гадратации с биоыакроыэлекулами

Безэлзктродная плазма пониженного давления как источник ¡вета в атомно-аииссионном микроанализе.

Идеи, которая лежит в основе метода атомно-эмиссионной спе-строскопии (АХ) можно проиллюстрировать следующим образом:

А + энергия — Ь\) (I)

•да А , А* -атомы в газовой фазе в основном и возбужденном злек-?роннои состояниях, соответственно; квант сьзта исаускалия 1ри переходе Л в . Энергия исследуемому атоцу мо.«зт сообщаться >т соударений с электронами, атомами и молекулами, обладаэдшгл достаточной кинетической энергией. Таким образом, чтобы схиыЫ.1) иботала, необходимо анализируемое аелество авизировать и затем ломы перевести в возбужденное состояние.

Как правило, в АЗС источник возбуждения атомов одчовре^знло 1вляется и источником атомиза'ции. Еезэлектродннй разрлд может «меть хао&ктеп емкостный или инпуктипт-ч__ После"!!™ г.с.тбс~ 1ее широкое распространение. Безэлектродная плазма в АЗС исполняется как атмосферного, так и пониженного давления (1-10 торр). I дальнейшем под безэлектродной плазмой будем по,уразумевать ин-1уктпвн 5-евязанную плазму (ИСП), создаваемую электромагнитными юлями БЧ, УиЧ или СЬЧ диапазона. 3 плазме атмосферного давления Те ~ I тогда как в плазме пониженного давления Те >7 7«

Следовательно, в последнем случае атсш.зация я возбуждение ана-шзируемого элемента происходит почти исключительно за счет »лектренного удара. Зто, а своп очередь, приводит к более низ-сой степени атоыизации и возбуждения,чем н плазме атмосферного

давления. С другой стороны, в плазме атмосферного давления за счет большей величины частоты электрон-атомных и атом-атомных столкновений по сравнению с плазмой пониженного давления, сильно увеличена не только степень атомизации и возбуждения, но и вероятность тушения возбуждения (уменьшение времени жизни атома -з возбужденном состоянии), т.е. безызлучательного перехода из возбужденного состояния в основное. Кроме того, хорошо известно что спектральная ширина атомных линий в этой плазме на 2-3 порядка больше, чем при возбуждении плазмой пониженного давления, она оптически непрозрачна, обладает сильным фоном с максимумом из-лучек ;я в УФ области спектра, т.е. в области испускания большинства элементов, представляющих биологический интерес.

Исследованные нами в области 190-360 ны спектры испускания УВЧ ИСП пониженного давления (3-10 торр) как гелиевой, так и аргоновой, показывают практическое отсутствие фона в этой области спектр^. Кроме того, сравнение УВЧ и СВЧ (2,4 гГц) плазмотронов с пониженным давлением щ предела*« обнаружения элементов и влиянию щелочной присадки, например,Ji/a СС, на величину измеряемых сигналов показывает, что УВЧ ИСП пониженного давлен.*я не только может конкурировать с аналогичной плазмой на основе СВЧ поля, но и превосходит тем, что значительно меньше зависит отМ*(£рто при общей высокой чувствительности является бесспорным преимуществом, особенно в биологических исследованиях.

Итак, несмо ря на очевидные преимущества (стабильность,лучшее сопряжение с узлами оптических систем), УВЧ ИСП ранее не кз~ пользовалась в качестве источника света для оптического спектрального анализа. В институте физики АН ГССР созданы эмиссионные спектрометры на основе УВЧ плазмы пониженного давления, под руководством и при напосредственном участии автора, позволяющие проводить элементный анализ в 3-5 шел раствора с пределом обнаружения 10"^ - 10~^г по абсолютной величина и анализ паров и газов с целью исследования кинетики десорбции сорбата.

Импульсная УВЧ лндуктивно-связанна,. плазменная спектрометрия для элементного анализа в растворах. Рис.1 представляет блок схему одноканального прецизионного высокочувствительного импульсного плазменного спектрометра, собранного на светосильном коно-хроыаторе МДР-2. Цифровой вольтметр необходим для настройки спектрометра на нужную спектральную линию. Анализируемый раствор

лшросисим

ИСШРеккч

1|1№1>0в01» БО»оТМ£ТР

МСПР^Е^н«« КАМЕРб

'иромимиющим

ОСЦИ'.ЮГСД'Р

Ш ГЕНЕРАТОР

МОКОРСММО1'

ФЭЗ

?ЫСО!№Е

Гелий

80!1»

60 га ■ ■ Ь.

130

В I Г, ПК

Рчт

ЮкШСШРЬ

1 б

КШРС1ШЕ Ш80?йТШ

окжнш

ОЯШЧ1СКСГО М1ТЕРИЬА1

—I— 50

вЮРГИНпШСГ.ОЮ М (ПРИНЦ

--1----

Рш.2

^С-ЛГг.'-и

¡.V!г">\.

' »- л - * • -; {, , д.

ашжкш!

ьаыкд»» 1. »яге > «..*>• ■»» ж» ! г' - • I"• ■ 1«.- ?">•■>»I

> ■ .* I . ■. г, ..

ПШМ4 ¡03

ВРСМЯ С .-гк_ _

Рис.1. Блс^-схет одноканального »импульсного с п е ктр о к ет па

Рис.2. Последовательность опорацлй длл просэдения элементного анализа угтодсм импульсной УЬЧ ИСП вмисси-ониой спектрометрии

Рис.3. Осциллограмма, полуденная при эмиссионном анализе ыеди и раътвора Си^гИмпульстдг методом.Конце трацня нодч-1,7мкг/кя,натр*(я-0,15М; Д

Уо!и1снне-Г;0!,'Ь на деление.Рдз-Сертка-ЮОме на деление

вносится в испаритель, в котором с помощью гаэсзой системы я джоулева нагрева он высушивается, озоляется и испаряется, а за» тем заносится в виде аэрозоля в разрядную «рубку. В ней исследуемый э виде неорганического вещества образец атомизируется и возбуждается. Оптическая система, настроенная на измеряемые элементы, регистрирует световые потоки. Количественный анализ проводится путем сравнения световых потоков, испущенных исследуемым образцом и стандартом.

На рис.2 схематично показана последовательность операций для проведэния элементного анализа. Образец в виде раствора, например, сыворотки крови , в колк-естве 3 мкл, наносится михроли-петкой на танталовуп проволочку и устанавливается в испарительную камеру с проточным газообразным гелием. Начиная с момента включения конденсаторной батареи на зарядку и предварительного нагрева танталовой проволочки ( й =1,5-2 А) для испарения растворителя проводится отсчет времени. В течение 20-30с образец высушивается, затем газовым клапанным разъемом отключается линия гелкя и подключается воздушная линия для сухого озоления органического материала; одновременно необходимо увеличить ток через проволочку до 2-3 А. По истечении 20-40е (время, достаточное дл/. озоления) воздушная линия размыкается и подключается гелиевая и вакуумная линия. Спустя еще 5с включается УВЧ поле генератора П1!БЛ-3 и катушка Тесла для поджига плазмы. Через 5-10с в кварцевом капилляре устанавливается стабильная плазма. Установка готова к измерениям. На 100с от начала процедуры отключается разрядная конденсаторная батарея от источника питания. К 105с тиристор подключает конденсаторную батарею к танталовой нити находящейся под током, и сшгхронно с разрядом запускается запоминающий осциллограф, которым регистрируется величина и форма сигнала с фотоумножителя (рис.3). Затем увеличивается ток в нити до 3,5-3,7 А на 5с для полного испарения остатков. Отключается УВЧ поле, электросистема испарения, вакуумная линия и прибор готов к следующему анализу.

Особо сг ит отметить, что для элементного анализа разнообразных биологических образцов, особенно сыворотки крови человека, наличие воздушной или кислородной линии является необходимым. Отсутствие кислорода приводит к образованию продуктов неполного сгорания (сажи),что ведет к невоспроизводимым результата.

Методика элементного анализа. Наиболее важной характеристикой аналитического прибора является предел обнаружения (ПО) - предельно обнаруживаемая концентрация определяемого элемента. ПО сильно зависит от отношения сигнал/щум. Поэтов наименьший предел обнаружения и наилучшая воспроизводимость обеспечиваются максимализацией отношения сигнал/шум. Количеству анали. груемого элемента в образца пропорциональна площадь под фотоэлектрическим сигналом при условии линейности 1>радуиро ночного графика. В нашем случае, импульсной УВЧ-плазменной эмиссионной спектрометрии форма сигнала отражает прохождение исследуемого вещества • через разряд, что напоминает спектр десорбции при флещ-десорбции. Озциялоррафом точнее и надежнее регистрировать амплитуду фотоэлектрического сигнала, чем площадь под ним. Таким образом, мак-скмализировать сигнал, это в нашем случае, максикализкровать площадь под сигналом, а затем сузить сигнал во времени. Первое вв«зедо с эффективностью атомизации и возбуждения атомов анализируемого образца - температуры плазмы и плотности пдектроиоз в ней (давление, мощность УВЧ-по-" я, положение разрядной трубка относительно резонатора, природы инертного газа и концентрации легкоионизируемой щелочной присадки); второе - зависит ог процесса подготовки образца к анализу (сила тока и вречя высушивания и озоления), скорости испарения (напряжение кл конденсаторной батарое и сопроти&чение танталовой проволочки) и времени нахождения аэрозоля в плазме (скорость потока газа). Кроме этого, поскольку предел обнаружения за- чсэт от. отношения сигнал/ щум, увеличить это отношение можно, используя для ы.'делек л спектральной линии монохроматор высокого разрежения, что позволяет Проводить анализ с достаточно ¡гиреними щелями. Выбор малоиуня-Щвро 55У также способствует увеличению отношений сигкал/оум.

Итак, в УВЧ индуцированной плазменной эмиссионной спектрометрии для --адекного высокочувствительного элементного микроанализа требуется оптимизировать по крайней пере 14 параметроз. Наиболее важными для многих изучаемых в биологии элементе , являются: мощность УВЧ поля, дааленио инертнего газа и концентрация легкоионизируемой присадки, например, хлористого натри*. 3 таблице I приведены пределы обнаружения исследованных наш элементов - магния, вдяьция,хрома, железа, кобальта, никеля, меди,

- и -

цинка, кадмия и свинца, а также значения спектральных линий, использованных для их определений.

Таблица I

Пределы обнаружения различных элементов

Элемент Длина волны в нм Пределы обнаружения ы/одь/л пг

Магний 518,36 6 0,4

Кальций 422,67 г 0,2

Хром 425,43 80 13

Железо 373,49 30 5

Кобальт 345,35 100 18

Никель 351,94 200 35

Медь 324,75 5 I

Цинк 636,23 4 0,8

Кадмий 643,85 7 2

Свинец 405.78 150 90

УВЧ индуктквно-связ'анная плазменная спектрометрия кннетики десорбции газ oí и лахюь, адсорбированных образцами биологического ¡роисхсждения. Гало вакуумная система и УРЧ плазмотрон аналогичны описанному выше с той разницей, что э качестве испарительной камеры с таьталозой проволочкой и электросистемой испарения служат тефлоновые цилиндрические ампулы с внутренними объемами 6-1000 миг в зависимости от массы исследуемого образца. Ампула вставлена в медный стержень и с ним вместе герметично 1федится накидной гайкой к игольчатому вентилю. Медный стержень находится в сосуде, омываемом термостатической яидкостьа для поддержания постоянной температуры б опытах по десорбции воды в изотермическом режиме.

Разряд в трубке из кварца с проточным гелием при давлении I торр фокусируется конденсором на входную щель двойного светосильного дифракционного монохроматора спектрометра СДЛ-1. Ьькод усилителя СДЛ-1 связан с самописцем КСП-4 и цифр овьгм вольтметра; Ь7-28. Цифровой вольтметр через адаптер подключен CHJiAill к вхсп-ноцу модуля в стандарте KAí.íAK и далее к ЭЬМ СМ-3- Пары воды, ду-сороированные с поверхности ДЬК, проходя разрядную грубку, aro-мигируются и возбуждаются. Спектрометр, настроенный на одну м линий серии Бальмера НА= 656,284 нм или Hj п 4йс,133 нм пто-л

водорода, регистрирует во времени количество водяного пара, который проходит через разрядную трубку УВЧ плазмотрона.

Недостатком изотермической десорбции является неодноэнач-10сть подключения увлажненного образца к спектрометру, что моют быть причиной возникновения неустойчивости в плазме, ьозмож-10 даже тушение плаз 1-м из за быстрого открывания вентиля, йен ^достатки являются несущественными и могут быть учтены; они могут быть также устранены, в принципе, в режиме флеш-десорбции (т.е. при регистрации температурного спектра десорбции), где роль зентиля играет температура, достаточно низкая для сильного уменьшения десорбции (скорость десорбции сравнима с фоном). Подъем гегаературы вызывает постепенное увеличение скорости дессрбцш, »атем скорость достигает максимума и в конце снова уменьшается до уровня фона. Скорость мала в начале и в конце, т.к. в нача-'3 хотя и много воды, но температура низкая и низкое давление трав над образцом, а в конце - давление низкое из-за сильного (•мйньшения давления паров.

Преимуществом изотермической десорбции яаляотся простота юддернанкя постоянной температуры. Особенностью экспериментов !рн флеш-десорбции является точное знание температуры и неэбхо-;имость линейного изменения температуры, что позволяет довольно 1росто вычислять энергия активации десорбции воды.

Глава 3. Энергетика связывания ионов переходных металлов и молекул воды с ДНК и нуклеосомами

Прямым методом изучения энергетики комплексооСразования яэ-[яется равновесный диализ, который в сочетании с вксогмчуасгви-УВЧ ;п;дуц;;$гС «анньи* илазленннк &тоиьо~змигси— 1нныы микроанализом позволил получить изотермы адсорбции ионоз '.о (»), (.М- Ы , и О1) И ЗъЫна ДНК и мононуклеосомах при концен-■рацигос Ю""* и нихе.

Из изотермы адсорбции определяется константа связывания устойчивости или ассоциации), которая связана с изменением ста-дартной свободной энергии Гиббса соотношением

йв--ЯТ- СпК (2) де К - равновесная константа связывания, Т- абсолютная темпера-ура, Я - газовая постоянная равная 1,9872 кол.гр'ад^моль""".

Изотермы адсорбции ионов кобальта, никеля, меди и цинка на ДНК и мононуклеосомах.Влияние ионнс>', силы и ГЦ содержания на константы связывания и кооперативность. Изучены изотермы адсорбции ионов Со (и) , J/i(u) , (лхО<) и 2п(ч) с ДНК различного происхождения. Исследовано влияние ионной силы и гистонового кора. На рис.4 представлены изотермы адсорбции никеля(П) и медиСП; с ДНК при ионных силах 0,02 и 0,2М чЛ/аС£ , а также тех же металлов с мононуклеосомами при ионной силе 0,0IM J/*(l, в пордина-тах Скетчарда Х/т и Z , где Z -число ионов, сзязанных с ДНК или мононуклеосомами в моль/моль нуклеотндов, m -число свободных ионов в молях. Конце: грация ДНК - 2x10""* моля. Концентрация мононуклеосом моля, Выбор ионной силы в 0,0Т М в опытах с мононуклеосомами обусловлен необходимостью исключать возможную агрегацию их при дьализе этих растворов против исследованных ионов М(П). Соответственно бьша уменьшена вдвое концентрация мононуклзосом, чтобы сохранить отношение Ма.0)на ну-клеотид ДНК, равное 100, т.к. большинство экспериментов с ДНК проведены именно при этом отношении противоионов. Концентрация ионог М(П) в экспериментах по равновесному диализу варьировали

Рис.4. Изотермы адсорбции ионов «АЛ' £ 'i J и G*. (»j на ДНК (4 верхних рис. и мононуклеосомах (2 нижних рис.) при различных ионных сила,;.2 верхних левых рис. представляют изотермы адсорбции vAfr(»jHCu(iij с тимус ной ДНК при ионной силе в 0.02 И Л/«.й£ .Соответствующие им правые рис. представляют те же системы При ионной силе 0,2 МУа(С,2 нижних рис.-изотермы адсорбции Си (») и M¡(ii) с мононуклеосомами,вцделси ными из ддер печени мышей линии СЗНА цри ионной силе в 0,01

Очевидно, чго в случае взаимодействия ДНК с Л/|'(",!увеличе-!ие ионной силы или наличие гкстонового кора ведут к изменению :арактера связывания, а именно, два типа независимых мест свя-:ывания переходят в антикооперативное. Аналогичное поведение ха-:аетерно для взаимодействия Ы») и 2л (и) с ДНК. Ионы (м(и) при ааиыодейстаии с ДНК сохраняют свою индивидуальность. Дня них ха-гактерно два типа мест независимого связывания, несмотря на из-:енеш'.е ионной силы вплоть до 0,2М или наличия гистонового :ора.

Таблица 2.

Влияние ионной силы на величину макрокснстант и число мест

связывания

_рК_____!2__

Ионная 0,2" 0,'02 0,002 I натрий (I) 0,2 0,02 0,002 сила нуклеотид 1онн_______

{обальт (П) 3,83 4,30 4,75 5,22 0,36 0,-18 0,49 1икель (П) 4,15 4,64 5,06 5,56 0,33 0,50 0,51 1едь(П) 4,60 5,10 5,40 5,77 0,36 0,50 0,52

Динк (П) 3.75 4,20 4,69 _5Д4__0 , 35 0,42 0,49

Ь таблице 2 приведены значения логарифма макроскопической юнстангы рК и максимального числа мест связывания при трех ион-апс силах, также значения рК°, полученные при экстраполяции гонцентраг^оннюс констант к ионной силе I натряйШ на ¡[уклео-лзд, гак называемых термодинамических констант стабильности. Макро-гкопичес "ие константы отражают изменение свободной энергии й & реакци... Введем еще одну энергетическую величину /) = - й О ,

котируй ДО НйоЬоЛ СрОДСТййм рбапцип. Таким ииразим, а на—

ней случае, макроскопические константы отражают суммарное сродство [\ но но в М(П) к ДНК. Так, например, для случая двух тип-эв мест независимого связывания макроскопическая константа рав-чз К= К,и, + кглг , а для антикооперативного связывания К^к г"е к» к, и -микроскопические константы, а п„ , и у>г соответствующие им числа мест связывания. Поскольку при интерпретации нелинейных графиков Скэтчарда возможна некоторая неопределенность, то удобнее сравнивать между собой макроконстанты и максимальные одела ыюст связывания (заполнения) пове^ностыс ДНК.

Было изучено влияние ГЦ-содержания на энергетику связывания ДНК с ионами меди(П). Из анализа изотерм адсорбции ионов медиШ) на ДНК из CCoitr.^d¿^*m рсг/г;»-)^»^ , фага Т4 и ти-цуса теленка при ионной силе 0,02М МяС6 следует, что адсорбция меди(П) носит характер двух типов мест связывания. Таблица 3 представляет данные о сродстве этих ДНК к ионам меди(П),а также значения максимальных чисел мест связывай я.

Таблица 3.

Влитие ГЦ-пар на связывание ионов ДНК с медью(П)

ДНК Фаг Т-4 Тивдс теленка

ГЦ,Я 27 36 42

рК 4,01 4,86 5.10

JL__0j37____0j4_4_0,50_

Исследовано такте плияние гистонов на связывание ДНК с ионами М(П). С этой целью изучены изотермы адсорбции ионов Со00, ¿/¡Си) « Cut") и 2h (к) цононуклеосомами с нуклеосомным повтором 196+ Зп.н. C'^jgg) и ионоз J/tl") и Ы(и) с ДНК, выделенными из яде: печени мышей линии СЗНА. В таблице 4 приведены значения рК (логарифм макроскопической константы),п(максимальное число мест связывания), Ко и (микроскопические константы, равные К /п ) и UJ (параметр, связанный с энергией отталкивания ли-гакдов в антикооперативном связывании). Как известно, в этом случае уравнение Скетчарда представляют в виде г/гц--Кс(т-г)-^р(-^г)

Таблица 4

Параметры связывания MHjgg и ДНК с ионами М(П) в растворах 0,01 M л/* Ci

KHIg6 и ДНК из СЗНА Ионы рК Л uJ

Ш196 3,90 0,22 9,86

То же Mi lu) 3,99 0,25 10,70

Си Си) 4,15 0",28

ив г» tu) 3,88 0,22 9,02

ДН1С j/i (ni 4,59 0,48

То же Си tu) 4,98 0,50

- IS -

ДНК из СЗНА с ионами J/. ln) к Си {и) проявляет свойства двух типов мест связывания, также как и ДНК из разных источников, исследованных нами.

Уменьшение сродства к ионам М(П) в случае нуклеосом по сра-внешга с ДНК при тех яе внешних условиях объясняется уменьшением как микроконстант, так и числа мест связывания. Некоторое исключение составляет ионы цинка(П) и кобаль*а(П). С этими ионами никроконстанты для мононуклеосом практически совпадают с таковыми для ДНК. В случае взаимодействия ипнов металлов с моно-дентньши лигандами для данных лиганда и центрального иона микроконстанта должна в основном зависеть от ионной силы. Зависи-ость микроконстант от занятости мест связывания, в накем случае гистонами, однозначно указывает на то, что никельШ) и, в особенности медь(П), осуществляют связь с ДНК посредством хела-тирования. Этот эффект, в первую очередь, будет особенно ощутим для тех ионов, которые наиболее специфично взаимодействует. Поэгоцу никель(П) и медь(П) с уменьшением мест связывания за счет взаимодействия части поверхности ДНК в мононуклеосомах MHjgg с гистоновым кором и гистоном HI, переводят некоторое количество этих ионов, связанных с ДНК хелатно, в просто связанные ю.л даже в атносферно-связанные. Для ионов в этом состоянии как правило, преобладает антикооперативное связывание (связывание JJ.¿C<<) с полиАУ, Полалд (1978)).

Кроме того, антикооперативное связывание Cv(n} , J\f¿(n) и Zní") с шнонуклеосоыами при ионных силах 0,01М, когда ДНК еще облапает двумя типами мест независимого связывания, объясняется спецификой взаимодействия гистонового кора с ДНК. А именно, как показали Мирзабеков и сотр.(1978) гистоны взаимодействии« с дуплексом ДНК в основном со стороны главного желобка. Таким образом, в нуклеосомноЗ ДНК Jj 7 гуанина находится в главном желобке и, следовательно, недоступен или плохо доступен для взаимодействия с гидрированными ионами М(П). Исключение составляет ион меди(П), который может взаимодействовать Енутря-Суернс.

Итак, анализируя таблиц 2,3 и 4 мокко сделать вывод, что вэличвка рК сильнее всего зависят от типп двузарядного ионе металла, ионной силы, налитла гисюнового кора и ГЦ-сосглва.

Сшибка определения рК, приведенных в таблицах, составляет 0,02 логарифмической единицы. Этой величине соотвеитвует, например, изменение ионной силы на 10%. Стоит отметить, что зависимости рК от логарифма ионной силы и ГЦ состава достаточно хорошо описываются линейным законом.

Кинетика десорбции воды с ДНК. Другим интересным применением УВЧ индуктивно-связанной плазмы пониженного давления является ее использование в качестве оптического источника света в атомно-эмиссионном кинетическом анализе водяного пара, десорби-рованного с увлажненных образцов биологического происхождения с целью исследования кинетики и энергетики связывания молекул воды, адсорбированных их поверхностью. йто новый метод исследования гидратации биополимеров. Ниже, на примере кинетики десорбции воды с ДНК, будут рассмотрены две одификации этого метода -изотермический и флеш-десорбция.

Изучена кинетика десорбции водяного пара с тимусной Л/аДНК , увлажненной в равновесных условиях при разных относительных вля-кностях, и комплексов ДНК с ионами „-Uní'-' ,7с. (mj, Си О1)

и г. (u) s также увлажненных в равновесных условиях при относительной ыажности 92,5$ (насыщенный раствор К Л/¿з при температуре 25°C¡).

На рис. 5 приведена кинетическая кривая десорбции водяного пара с J/a ДНК в координатах dJ~>- / dt и t в относительных единицах. М-масеа водяного пара в единицу времени, t - время десорбции, Кинетическая кривая состоит из 4-х участков. Первый у íctok от t =-0 до t «35с отражает .тод ключе ни е испарительной камеры с образцом к газоваяуумной системе атомно-эмкссионного спектрометра. Десорбция пара начинается с момента времени t --35с и ей соответствует 34 молекулы воды на пару ЛАДНК. Второй участок - прямолинейный, которому соответствует десорбция пара от 34 до 24 на пару; третий - экспоненциальный (меньше 14 молекул на пару). Анализ кривой десорбции показывает,по крайней мере, три различных по энергетике Tima связывания молекул воды с Л/«ДИК. Количество воды, гидратнрованное тинусной ДНК, определенное калориметрическим методом, составляет 23 молекулы на пару. Зто то количество воды, которое не вымораживается б процессе охлаждения образца до температур жидкого гелия. Стоит отметить, что у кинетических кривых десорбции воды с комплексов

0 WO 2S0 300 Wt,e

liiK с ионами исследованных металлов, отсутствует прямолинейные гчастки.

Рис.5.Кинетическая криьая десорбции воды с JAДНК (t-20°G, 92,.Чо.ь.). По оси ординат в относительных единицах представлена интенсивность фотосигнала при Д =656,2Ьнм(линия водорода) , которая пропорциональна количеству водяного пара,проходящего через УВЧ-плазмотрон. Цифрами над кри-sjil обозначены количества воды, оставшиеся в образце ДНК во '■решт процесса десорбции к соответствующим моментам времени (в «ль Н?0 на моль ДНК).

В общем случае, как хорошо известно, r/роцесс сорбцми-адсор-5ц,.и носит многостадийный характер и, следовательно, скорост.» .-.србции (и десорбции) ОГТрбДбЛ Я6ТСЯ с корост ь г> наиболее медленной части. При абсорбции таковым часто является процесс диффузии горбата с поверхности в глубину образца. Однако, в ряде случаев, '.олее ыэдленчкм пооцессом мо"«г быть изменение структуры или :<онформации макромолекул.

На рис.6 показаны кинетические кривые десорбции воды длч ki резцов .Л/ч ДНК и „(ЛДНК + 7е(Ш). Кинетические кривее ir^'/ji-чексов ДНК с нонами магния(Н), кобальта(П), меди(П) и цинка(П) ¡■асполагзчтся «ему этими кривыми.Кинетические кривые на рча.б лриведенн в коорпинэ/гах €n[jje /{Мс-М^Цп t ,где t-время цееорбши.

Г: с.6. Кривые кинетики десорбции воды с образцов ДНК и комплекса ДНК+ 7с (ill) (состава 4:1) з твердом состоянии, увлажненных при 92,55? относительной вла;-:--носи и.

На DHK +Jef.„)

IllUli

illOIJ 4000

Т - Ьремч ь се к

UNJ

- -

Как видно из рис.в, уравнении Ленгкззра

С»[Ле/(Мс-М*)] = К * (3) подчиняются только начальные участки кривых. Из етнх участков методом наименьших квадратов определены константы скорости десорбции Кд, значения которых даны в таблице 5.

Таблица 5

Данные по сорбции, десорбции и кинетике десорбции воды с Л/*ДНК в комплексе с ионами металлов, увлажнен ых в равновесных условиях пт>и t = 25°С и о.в. 9^,5%

Ионы Сорбция* Остаточн:.л сорбция, Константа скорости _Мводы/Мпар__М воды/ м пар десорбции, с*тс!0

Без М№) 40,4 2,4 3,28

Мп(ь) 52,4 5,4 2,66

77,6 16,4 2,48

С о in) 44,8 3,2 2,82

Cu.(") 44,8 2,8 2,73

^уч(И) 46,2__3.6_2j85_

й Ошибки в определении ведичин сорбции и остаточной сорбции равны 5 и 10?£, соответственно.

Анализ данных таблицы 5 показывает хорошую сходимость результатов по сорбции воды молекулами .ЛЬ ДНК (— 40 молекул воды на пару нуклеотидов) с данными Фалка и сотр.(1962). Кроме этого видно, что ионы металлов увеличивает адсорбцию воды и уменьшают скорость десорбции ее с образцов этих комплексов.

Исследование кинетик" десорбции показывает, что црн десорбции большого количества воды (30-60$) она подчиняется закону Лэнгмюра. Константа скорости десорбции кд, в свою о--ередь, в случае реакции первого порядка, равна

(-еу/АТ) > (4)

где у„- предэкспоненциальный множитель (фактор), энергия активации десорбции. Если принять (обратная вели-

чина времени молекулярного колебания - 10"" - 10~^с), то для Е} получим 21,4 ккал/моль воды в случае десорбции зоды с Л*« ДНК. Так как = £«. + ф , где -енергия

активации адсорбции, а <р - теплота адсорбции, то таплота адсорбции воды на поверхности при температуре 20°С

равна как мкницуы 21,4 ккея/ноль вода пря условия, ~го данная адсорбция не является активированной

Итак, впервые для определения энергии гидратации биополимеров предложен кинетический метод УВЧ индуктигио-с вязанной плазмы пониженного давления в качестве оптического источника света в атонно-вмисс! онном анализе по водороду водяного пара, десорбированного е их поверхности.

Энергетику связывания гадав и паров не обязательно изучать в изотермическом режиме. В ряде случаев удобнее исследовать десорбцию в режиме так называемой флеш-десорбции, особенно, когда изучается гидратация при низких относительных вяажнозтях. В этом случае роль газового вентлля играет тешература настолько низкая, чтобы практически исклачитъ десорбцию до опыта, т.е. сделать десорбцию сравнимой а фоном.

На рис.7 представлен спектр флеш-дееорбции воды с Л/зДНК, увлажненной в равновесных условиях при теютературе 25°С и о.в. 92,5$ (0,84 г воды на г ДНК). На ©том спектре, также как и на изотермической кривой десорбгрш хорошо заметна гетерогенность гидратной воды ДНК.

тз

Рис.7. Спектр флеш-десорбции воды с увлажненной в равновесных условиях при 92,5% о.в. (0,84г Н20 на г сухого вещества)

■ .4

-¿О -20 -10 О Ю £0 Т*С

Цри постоянной скорости нагрева образца Т-Т0 - & * скорость десорбции в режиме флеш-десорбции описывается выражением

где обозначения прежние, а гл -порядок реакции десорбции. Вычисленная энергия активации для Т » 273°К и при условии, что т "I, оказалась равна £^.«19,5 ккал/моль. Эта величина в

хорошем согласии с ^21,4 ккал/моль, вычисленной из уравне-

ния (4) для изотермической кинетики десорбции.

Особо стоит отметить, что метод флеш-десорбции впервые при-ыонен для исследования гидратации ДНК.

Глава 4. Структурные исследования комплексов ДНК с ионами

переходных металлов методами спектрофотоызтрии в области 220 - 900 ны

Спектры поглощения комплексов '"o(nJ, J^fi(и) и Си.(ч) с ДНК в видимой и ближней ИК областях спектра. Электронная спектроскопия в водимой и ближней ПК-области спектра, широко распространенная в химии неорганических соединений, практически нз бша использована для изучения взаимодействий ионов переходных металлов (с( -»А - переходы) с нуклеиновыми кислотами и ас модельными соединениями. Одна из причин - относительно слабое вз&имодейстшо ионов с этиш лигакд:дм, нос ячее в основном внешесфзрный характер, а такя2 плохая растмршюеть ДНК и нуклооц-идов.Несио'.-ря на этч ограничения, использование кювет с длиной оптического хода в 5~ К! сы, ¿ также тщательность ь приготовлении образцов позволяет регистрировать поглощения Со (i,) , «V.O^ и Сц.(п] с ДНК и нуклео-твдаыи и с успехом применять оти данные для исследования струк-rypu шлетлексов, расчета количеств инутрисфврнцх комплексов и хи ¿.ичзского выхода ыеди(1) при ее восстановлении в комплексе кадь - ДНК. На рис. tí и 9 представлены спектры поглощения Со ("jx J/i [tij а ДНК и таь: же для сравнения дг-*ны спектры аквакш.лдексов Со(и)и j/.[u¡. Положение полос поглощения Со (hz0)£+ и .М; (н20)*' остается неизменным, наблэдаетсл небольшое изменение интенсивно-стк(на I0-2CÍ), чго свидетельствует о ьне^несферноы еышьшаыш гексаакваионов Со(п/ hMíC'Jc Д!1К.

Как известии, в центроеимиотричкых комлиексах и, в частности, октаодричееких, все с( d - переходы запрещены. U;m не менее, комплексы многих номов переходной группы окрашены. Причиной квллггея статическое и динамическое снятие центра симметрии, понижающее группу симметрии. Поскольку ъ приближении Ьорп>.~ Оипенгеймера полная волновая функция електрона с молаку,' ji-юй системе может быть разложена на электронную, колебательную и вращательную, то электронно-колебательное взчимэдейсткие в и,ен-троспмметричнж молекулах явится основном механизмом, который

Со^'-ВИК

нарушает правило отбора по четности. Чем про*<нее связывание комплексов, тем больше это взаимодействие.

Ркс.8. Спектры Со(нго)б+в воде и в растворе с ДНК из молок лосося. Отношение [Со О'ц/^НК] = = 0,1?. Концентрация ДНК 4,4«ИГ"; [ЛАС2]=0,2М. Спектра зарегистрированы в 10 см кюветах.

Рис.9. Спектры поглощения Л/.'/н^р}1^ и его комплекса с ткмусной ДНК в видимой области спектра. Концентрации: М.-О')- 0,8x10"- Ч; ДНК - 2,4хЮ~3Н(Р); „К/а 01-У- Н Ю"3^. Спектры зарегистркрсмии

.025 .02 .015 .01

.005

'.00

500 НТО ГС0 6Р0

А(чм)

в 5 см кварцет-т кяветах.

¿0000 2Б000 ?2000 16000 №000

у(см")

Ион Си(и) , в отличие от Со(ч) и Л/? (//^ .сильно искажен тетрагонально из за эффекта Яна - Теллера. С увеличением

тсТраГСмллЬпСГС пСг.'1,пс1щп оЛЯ!\ТрС/глЫс ( игииеииц^-Ч иш^и —

коГС полосы з ближней ПК области) сдвигеится в коротковолновую область спектра. Ион Ы^о)^ имеет пчр.чметр тетрагональности Т - 0,86-0,9(ГеЯди и Палмер, 1972). В частности, замещение молекул вопн в Си(н,на более сильные лчганды, например, амины, приводит к коротковолновое сдвигу осногноЯ полосы поглощения, и зависимость этого сдвига от теплоты образования нового комплекса в поде тлэакается прямой линией для различных аминов (ФяЙрицци, 1976).

- -

- 1)НК

Рис.Ю. Спектры поглощения Си и его комплексов с ДНК ¡ш ыолок лосося. Отношение [См.0<1]/[Х>нк2~ « 0,31. Концентрация ДНК равна ЗхЮ~3Ы£ концентрация М<* (Л ~ 2x10*"%. Спектры регистрировались о 10 см каветах.

эао А(«м)

Из ркс.Ю видно, что связывание ДНК с Си(н) вздет к корот-коеолновоьу сдвигу максимума полосы поглощения Си{Н20}^* на 35 на или 600 см""* и к значительно^ увеличении интенсивное! и полосы поглощения последнего. Взаимодействие гицусной ДНК с Бшывает значительно ы-зньииЗ сдша1 полосы поглощения - вг.зго 200 си"1. Отметки, что замещение одной иоде кули воды в аквакоип-лакзо Си(") на МН3 группу вызывает коротковолновый сдвиг в 1000 сы"1.

Ультрафиолетовая дифференциальная спектроскопия взаимодействий ДНК с ионами металлов. Изучено как ноны металлов - однозарядные и двузарядныа, к тому се разные по своим свойствам, влиявт на спектры поглощения ДНК в области 220-320 км. Ввиду значительно больших возможностей ( хорошо разрешенные интенсивные переходы в ближней Уё области) было подробно исследовано влияние на ДНК не только широкого класса ионов мзталлоь, но и влияние иг концентраций, ионной силы, нуивеотидного состава и лигьндного обувания иона. В атом же разделе дана интерпретация спектральные измен ний полос поглощения ДНК, вызванных ьзаимодзйотвием ионов с ДНК.

На ркс. II приведены ультрафиолетовые дифференциальные .пестры (УПР) ДНК, вызванные действием ,Мп (и) , Со С»)

. Ан лиз эти* УДС позволяет сделать вывод, чго они различайся лишь по величине, но не по характеру. Эти кои, взс.,ш-

действуя с ДНК,вызывают в основном сдвиг полосы поглощения в длинноволновую область. Это и небольшие изменения интенсивности спектров поглощения Со Снго)1* и при ксмплексо-

образовании с ДНК указывает на то,что М%(н) ,уМп(") ,СоО>) , М<С") и 2«[") взаимодействуют с азотистыми основаниями через молекулу воды. Таким образом, причину вызываемых ими спектральных изменений полосы поглощения ДКК можно свести к эффекту Н-связи, точнее- эффекту изменения Н-связи молекул воды, связанных с основаниями.

Л(мм)

гго . г^о 260 ¿00

Ж (и)

.(i -

г* /

. «1 / Y.мл(и»

<Г 0 - V4 / ' / ' /у /

< ~ //

\\Л ч

01 \'V \ \ J1

\ Y \ л \ ч V

' W000 <(0000 ЗЬООО 12000

г;о

гю

.«1

.01 1о -.01 -.4

?60 , ?¡80 300. А (нм)

I АуЛМ

,,/ в

' II

w00q 4ию0 ььош í2d0o

Рис.11. УДС между комплексами ДНК Рис. 12., У Ж! межпу кот.шекса-

I ,, Г / t ./1,1 ми ДНК (I)Cu(ii) , Zf- = ,0,25,

с ионами, Coi») о,0002 M,£a/¿ííJ= O.üIM;

2b(|')?v= ü.25 иона на нуклеотвд ¿)(мО) , tf = 0,1,[jJS&\*Ot000Ú6i

ДНК) и ДНК в отсутствии иона. Кон- М, = O М, аскоминовак

о^тпЛтж ттn-2u кислота ¿:I ¡i[Cu(u)J\ 3)^01 , центрации: 2,0xI0^M ДНК; IxIO М од r¿HKj= и,[Ащ]=

0,0(j5 м)и ДНК в отсутствии иона

Красное смещение полосы поглощения указывает на то, что Н-связь с молекулой в возбужденном состоянии усиливается по сравнению с основным состоянием, т.е. электроны неподеленной нары атома азота пиридинного типа .У(7) становятся более доступными для участия в Н-связывании. Это понятно, поскольку в несвязыва^ щем состоянии с77* на периферических частях молекулы увеличивается электронная плотность. Величина сдвига д \) должная быть пропорциональна электронному сродству £я иона, так как чем больше это сродство, тем больше протонодонорная способность ак-ваиона и тем больше энергия взаимодействия иона с ДНК, а это, в свою очередь, приведет к увеличению л \! • Таким образом, долена

быть корреляция мезду величина^-. & У тл Еа . Определенная наш (Ерегедзе,1980) для водных растворов конов сродство к электрону £„ как есть изменение стандартной свободной энергии ре-

акг-ин гидратированного электрона с акцептором в раствора. В сбои очередь, йС согласно теории Маркса, свизано со свободной онер-гисЯ Ектнвац:ш йбо. ^соответственно, с константой скорости реакции г;<драткро санного электрона . Таблиц б иллюстрирует пряцук коррелята) ыетду Белйчкнаш дуй ке- . Как ьидпо из блицц, эти взаимодействия не о^раничиваотся Н-евязью и их можно распространить на злектроннэ-донорно-акцзпторныа взаимодействия вообще. Вэл'лч2;:-га 1\! удобно определять из УДС. В херошзм цри» бдите« иш велп'-:;::а частого сдвига л У и л£. связаны ыенду собой Ецрг£8нпе:,1 & А Ь V- ¿У .В таблице б приведены величина а У о расгчйтсааш? как й)}= //( о^. 1 /о( V +

,1 » .1 ' I <• I V

. } , ГАС •

Таблица 6

Корреляций между величинами спектральных сдвигов полос поглоде».ля гицусноП ДНК ду и константами скоростей гэдрат иро ваге ¡о го электрона ке; с конами металлов для

Йога__ДУ, см"1_¿V .ккал/li_к«-«у . моль~Уг.

Магний(П) 40 0,12~~ I07

ШфганецШ) 230 0,65 7,7хЮ7

Кобавь? (П) 370 1,1 1,2хЮ10

Никвль(П) 470 1,35 2,2хЮ10

Ыадь(П) 640 1,80 3,0хЮ10

Шдь(1) 4500 13

Цдос(П) 300 0,8 1,0x10®

Сребро (I) 3100__8j9_3,6хЮ10__

Анализ УДС ДНК с кона*м Cu.Cn) , Cu(i) , пред-

ставленных на рис.12 показывает, что ::а.ряду со спектральным длинноволновые сдвигом '640-450" сы~*) наблюдается изменение в полосе поглощения в области 2d0 н_,, что наряду с коротковолновым сдвигом в спектре Си. (нг0}& -ДНК (ci-ci - переходы) указывает на непосредственное взаитодейстБиэ ионо с основаниями ДНК.

Для ксследова них в работе ионов харак ер концзетрадаонной вавиогаостн в интервала от 0,02 до 2-4 ыоляиот на моль ДНК, п -ка-увает, что только начальный ее участок ( 1 £ 0,25) мокно ий-

терпреткровать как участок с независимыми местами связывания. В целом кривые зависимостей свидетельствуют об ентикооперативном характере связывания ионов металлов с ДНК.

На примере ионов ЛЛ'С») изучено влияние лигг дного окружения на УДС ДНК. Показано, что замена двух молекул воды в цис-положе-нии в плоскости ху э комплексе J/;¿сп^НхО)^1* хелатным ли-гандом этилендиамидзм уменьшает УДС ДНК в 2 раза. Замена остальных молекул воды в vpc-Mi[(en)lfr0i)JJ<>vi транс-J/. [(е *>) х¿/o~*rns'J -риводит к р зкому уменьшению УДС ДНК. Это указывает на то, что J/Un) с октаэдрическим окружением лигацдов взаимодействует с ДНК двумя вершинами в плоскости ху .

Исследовано также влияние ионной силы на УДС ДНК, вызванные действием ионов М(П). Характер и величина зависимости которой несомненно говорят о наличии хелатннх комплексов ионов М(П) с ДНК типа "азотистое основание- фосфатная группа".

Влияние ГЧ-содержания на УДС ДНК с ионами металлов было исследовано на примера взаимодействия лонсв Со0<) , ) , (u("J , с ДНК. Наиболее подробно было изучено взаимодействие JW(«) с ДНК из £-се С.- , колок лосося, тимуса теленка, мышей линии СЗНА, tdjxitudiur» и полиd(A-T)-i(hT). В таблице 7 при-

ведены значения 4fc5 в пересчете на моль иона на моль ДНК при ионной силе 0,02 М Л/а .

Таблица 7

Влияние ГЦ-содержания на величину a£v УДС ДНК с М0>1

£. С.0 ti 15W Молок лосося (44%) Тю^ус теленка (40^) СЗНА ^К^'ГПоли Л (А -V (27%) сНя-т)

1420 1040 880 720 400 не обнаружено

Из таблицы следует, что чем больше в Д1П1 ГЦ-"пр, c;l~i>— нее воздействие иона М(П) на спектр ДНК. Необходимо отметить отсутствие линейности между ГЦ-содержалием в ДНК и величиной УДС, вызываемой М(П). Отсутствие заметного УДС для поли d[A-T) -dlfi-T) с ионом JJil») укрывает на то, что ионы М(п) из за относительно высокой концентрации JACL не могут взаимодействовать с азотистыми основаниями полинуклеотида со стороны малой бороздки,что же касается J/(7) аденина в главном желобке, то взаимодействия с этим атомом мешает JJH, группа аденина при С(6), Таким об-

разаи, на примере ионов ^¡(.н^ исследованные ионы М(П) будут взаимодействовать с азотистыми основаниями ДНК со стороны главного келобка и в основном с ЛД?) гуанина.

Достаточно сильно отличаются друг от друга УДС двух близких по ГЦ-содержанию ДНК - из тицуса теленка и печени мышей линии СЗНА. Это несомненно указывает на то, что при взаимодействии 1НН) играет роль первичная структура ДНК. Известно, что обе эти ДНК содержат сателитные участки, обогащенные в первом случав ГЦ, а во втором - АТ-ларами.

Глава 5. Природа взаимодействия ДНК с ионами металлов

Взаимодействие с ДНК. Кинетические исследования и

энергетика связывания. Для более глубокого понимания природы взаимодействий ионов металлов с ДНК необходимо исследовать один к уог ес ион в разных степенях окисления. Для этой цани наиболее подходящей является медь, для которой как двузарядное, так н од-нозервдное состояние является относительно стабильным, по крайней мере с ДНК. Однозарядное состояние меди в коштлексах С*(>ЩНК достигалось гамма-облучением ) или действием аскорбиновой

кислоты. Кинетика окисления регистрировалась спектрофотоцетри»-чески в области 800 нм №-с1 -переходы). Опыты с использованием аскорбиновой кислоты показывают, что процесс окисления Ся1|)до Си(|/) в комплексе с ДНК протекает в два этапа с константами скоростей, отличающимися друг от друга на 2 порядка: к^=2,9х 10 л/Мс и Вторая константа близка по значении

к величине Кд» которая наблюдается в экспериментах с гамьа-об-лучением («3=8,2х10~°л/Мс). Отметим, что условия эксперимента позволяли проводить измерения реакции с гамма-облучением через 10 мин после окончания облучения. Необходимо отметить также, что в отсутствие ДНК окисление Си(|) до СиО'}протекает настолько быстро, что обычной спектрофотометрией это зарегистрировать невозможно, ч»о говорит о том, что ДНК, взаимодействуя с ионами Cu.ii), обладает способность замедлять а:от процесс. Можно предположить, что на первом этапе происходит окисление СиО), связанной с поверхностью ДНК внутрисферно, а на втором-окисление црочносвязаннсй меди, например, между цепями ДНК.

Изучение кинетики реакции окисления СиО) до Си.(и)в комплексе Си(н)-ДНК позволяет определить прочность с дзиСи(|)с ДНК.

Процесс окисления Cu(') до См (") .адсорбированного поверхность*), з частности ДНК, можно представить как дееорбшго(и(')с ДНК (локализованная адсорбция - перемещение адеорбата как результат дегорбики и повторной адсорбции), затем быстрое окисление в отсутствии да СиМ* до (m(Hx0L + и уже потом адсорбция С«.(лО на ДНК. По существу, речь идет об открытой системе и такое представление этого процесса ничем не отличается от десорбции пара или газа с поверхности твердых тел в методе фяет-десорбции. Для случая изотермической десорбции можно воспользоваться уравнением к = у„е ,{4) где к - константа скорости окисления Cu. Ы до Си. (11) , Eg -энергия активации десорбции Gt(i) с ДНК, у„ - предэкепоненци-альный фактор равный Ю^с"^ (величина обратная времени релаксации вращательного и трансляционного движения молекул воды в растворах). Для трех значений констант Kj, к, и к^ £„

ленное из ( & ) равны: =20,5 ккалД1, =22,9 якал/М; =22,6 ккал/М. Теплоты адсорбции ионов Csx(.>) на ДНК равны как иини-мум £>»20,5 ккал/М, Ъ 22,9 якал/14 и 22,6 ккзя/М

при условии, что данная адсорбция не является активированной.

Двойственный характер действия ионов М(П) на термостабиль-ноетъ двойной спирали ДНК в растворе. Интерпретация. Из серия двухвалентных ионов vUj(u), jU«(ti), Со (ч) ,vAЛ Ct'} * СиО<)п

(и) только v^UjO«), СоЫ яМЦп} увеличивают термостабкльноеть двойной спирали ДНК (Эйхгорн и 1Гнн, 1966). Ио1ш JüuH Mu) я ^ 1ч) 8 небольших концентрациях также вызывают увеличение термоетаби-льнссти, а затем при дальнейшем увеличении их концентраций уменьшают ее. По этому свойству эти ионы располагаются в ряд &*.(«)>2*(i¡)>

С целью объяснения этого странного поведения ионов били «лплрпомны рН растворов этих ионов с ДНК и без нее._ Прецизионные измерения рН позволили зарегистрировать увеличение (Нг0 +j при растворении иоков М(П) при нейтральных рН=б,72, Ионы исследованных М(П) по этому свойству располагаются в следующий ряд: &л(«)>^«6!)> > jUwt'i) > Со С11) ~ Мс 00 > Му(и) в такой же как по степени их воздействия на термостабильность ДНК.

Воздействия ионов М(П) на термостабильность ДНК (концентрационная зависимость температуры плавления) заключается е том, что ионы М(П), растворяясь и обраэуч комплексы с ДНК, протониру-íct раствор и тчк как вода в ги.трят&етонной модели Дикерсона

(1982,1934) стабилизирует двойную спираль ДНК продольными связями (скрепками), что любая локгтьная донорно-акцепторная связь с теми грушами ДНК приведет к ослабления гидратации ДНК, а поскольку протон (ион гидроксония Н,о*) не может быть скрепкой из за которкого времени жизни Т =2хКГ*3с (в отличие от комплексов М(Ш), время жизни интересующих нас акваионов Ю~ -Ю^с, про-тонирование приведет к снижению термостабздьности двойной спирали. Стабилизирующее действие большинства ионов М(П) (поперечные хелатные комплексы- комплексы типа "основание-фосфатная группа" комплементарного основания) не должно сильно зависеть от типа ионов. Различное действие на термостабильность ДНК в основном будет определяться способностью этих ионов протонировать раствор. Другими словами, протон, взаимодействуя с ДНК, будет ускорять обмен гвдратной воды, что приведет к ослаблению стабилизирующего действия воды, т.е. протоны сократят время пребывания молекул воды в роли "скрепок", Кроме того, в силу высокой подвижности протона, его адсорбция на ДНК будет относиться к подвижной, размазанной по поверхности ДНК, что,конечно, также будет ускорять обмен гидратной воды. В отличие от этого типа адсорбции, адсорбция ионов ЫШ) является локализованной дискретной, т.е. адсорбированные ионы в этом случае перемещаются с одного центра на другой исключительно в результате десорбции и только затеи повторной адсорбции. Особо следует отметить, что отличие между этими вадаш адсорбции имеет глубокую физическую природу. Б подвюзшой адсорбции адсорбат ведет себя как двумерный газ,если, конечно, поверхность однородна. В случае ДНК-лодвинная безбарьерная адсорбция протона мокет быть и одномерной, если подвижность протона вдоль по желобкам будет значительно превосходить подвижность поперек двойной спирали.

Последствия взаимодействия ионов с ДНК. Действие ионов металлов на ДНК связано,с одной стороны, с энергетикой, структурой и природой этих комплексов, а о другой - с характерными продолжительностями времен для внутренней подвижности ДНК и ее групп. Можно постулировать, что время жизни комплексов т.е. время нахождения ионов и ДНК в комплексе, должно быть соизмеримо иди больше характерного времени тех или иных движений ДНК(колебание небольших групп атомов, раскручивание двойной спирали, раскрытие отдел шмг пар оснований, расплетание спирали свя- •

зывание белков и, наконец, деление клетки). Эти двидения характеризуются временами от 10~*°е до нескольких секунд и более. Выло показано, что ионы первого переходного ряда, такие как JJL»üi Со (и)., j/;(ii) , и , а также ионы Gu(/) hJj(i) взаимодейетчу-

ют с ДНК в растворе, образуя значительное многообразие внутрисфе-рных, внешнесферных и атмосферных комплексов. Внутрисферно и вне-шнесферно ионы будут взаимодействовать с ДНК в основном хелатно со стороны главного желобка с М(7) гуанина и атомом кислорода фосфатной группы как своего нуклеотида, так и нукяеотида комплементарного ему. В общем случае, равновесие между коьтлексами будет зависеть от ионной силы, Щ-состава, концентрации, типа иона и его заряда. Кроме того исследования взаимодействия ионов Си(') с ДНК методами УДС, тушения флюоресценции этидия бромида, интер-калированного в ДНК, кинетики окисления CuOj в («.(и) (две стадии), а также слабая зависимость силы взаимодействия ст ионной силы, привели к прямому подтверждению, что этот ион может образовывать два типа комплексов: первый-хелат Л/(?)-0(6) гуанина, второй -между гуанином и комплементарным еиу цитозинам.

Взаимодействие ионов металлов с атомами кислорода фосфатной группы приведет к ослаблению фосфодиэфирноЯ связи, а это, в свою очередь, будет облегчать однонитевые разрывы и'кинки? что в той или иной степени подтверждав*. ;я вискозиметрическими измерениями комплексов ДНК-ЩП).

Многообразие комплексов с определенной вероятностью приведет к различным таутомерным изменениям гуанина, наиболее интересным с точки зрения дефектов двойной спирйли ДНК является превращение атомов JV(9) и л/( I) пуринов в азоты пиридинного типа. Первое способно ослабить и вызвать разрыв глюкозидной связи -дз-пуринизацию; второе - сделает гуанин неузнаваемым для цитозина (Иванов и Минченкова,iyó/), что, в свою очередь может привести к точковой кутации транзиции (Акдроникашвили и Ескпова, 1982).

Обсудим это подробнее. В самом деле, разрыву глюкозидной связи в ДНК должны способствовать внутрпсфернке взаимодействия ионов гидроксония и металлов именно с атомами азота пиридинного типа JV(7) и J/Í3) пуринов, неподеленные электронные пары которых находятся на sj»1 гибридной орбитали. Однако в пиримидинннх ДНК доступны атаке лишь 0(2) и 0(4) тимина и 0(2) цитозина, т.е.

атош, находящиеся вне ароматических колец и, к тому не, имевшие по две неподеленные пары. Выше было показано, что из исследованных нами ионов с болыпей вероятностью могут взаимодействовать внутрисферно с азотистыми основаниями ионы Н30 иЯ^ Ионы Cu.li) и уД^Мпредпочитают взаимодействоьать внутрясфер-но меаду тяжами ДНК, в то время как ионы H-J0tи Gu(nJ будут связы-саться с J*/(?) и J/(3) пуринов. В силу стерических препятствий невозможны взаимодейсшм с J/(3) гуанина и J/(?) аденипа. Поскольку Л^ (3) аденина находится на дне шнорного иелобка, то ввиду его узости с этим атомом смогут взаимодействовать лкць ионы способные к вцутрисферному взаимодействию, в налшм сдучео H30t и Cu(ii). Эти ионы и должны в основном вызывать депуркчизацлз, чгще деаденизаци», так как адеьтш значительно слабее связан с тш^шои (энергия разрыва 5,6 ккал/ri) нежели гуанин с ццтозинои (19,2 ккалДО. Крогго этого для двузарядных ионов переходных металлов в растворах характерна прогоно-донорная способность гк~ дратированной. ими вода и по этоцу сзойству ионы располагаются Б следующий рад Си. С») > > > Со Ы ~-Л/i tu) > -Uglu).

Как известно, необходимым условием для трансформации! клетки ' является цутация оснований в ДНК, например, точховая для онкогена t&S . Но для того, чтобы эта ьутацня была закреплена необходимо, в егоз очередь, чтобы реларирукщая система не могла восстановить первичную структуру ДНК. С другой стороны, in vitzo ионы металлов способны вызвать нарушегаш электронных структур азотистых оснований лишь в тон случае, если взаимодействие хоть с ДНК будет приводить к образованно сильные кокиексов, т.е. комплексов с большим временем жизни, Но в жестких условиях существования к функционирования ДНК i* v;yo (0,1511 однозарядного катиона) сильной комплекс с ней макет образовываться в результате взаимодействия мягкого иона (иона, предпочитакцего коаалентиос связывание) с основанием ДНК.

Воз;пг.;ность мягкого взаимодействия ионов металлов с ДНК ыозет бтъ проиллюстрирована на примере восстановления Са.{л)до OjlC») в ее комплексах с ДНК. Как было показано, ионы Ск.(л*)в боль-кей стелет! образуют ьнешнесфорнке комплексы с ДНК и проимуц-вт-векио с гуаккном к яшвь на 15-2055 внутрисферные, причем как с J/(7) гуанина, так и с *//(3) ш/нинй, При восстановлении ОД»}да СиОЬ ивприуер, аскорбиновой кислотой, УФ ш,.. га^аса-облучением, вместо углз«1т!У< ксмпг.ексов будем икать Л/Г.) -0\6) холгт и ин-

корпорированный (еатабмлизованныЯ) между тягг.:я? ДНК комплекс (I)гуанинCp.ii)- ЛАЗ)цитозина. Такое хелатированив гуанина сделает его по Л(1) подобным аденину, что, в свою очередь, должно привести к точковой мутации - замене • комплекса гуаник-аедь (I) на аденин, т.е. к транзиции. Стоит особо отметить, что инкорпорированный комплекс со значительно большей вероятностью приведет к транзиции (время жизни комплексов 10**с).

Кром этого инкорпорированный комплекс Г-=медь(1)-Ц в силу высокого зна ения р!Ш6 приведет к образования с сивки между тго;5-плементарньтми цепями ДНК и с определенной вероятностью к точковой мутации - делеции.

В дополнение к сказанному отметим, что в координадаоккой химик существует явление сгалбиоза, закявчетцесая в том, что элеятроннодонорная группа, с большой поляризуемостью координируясь с ионом металла переходного рада,делает его более мягким. Например, ион никеля(П) в соединении с ЛЛ ,который находится в мягком окружении может солгзбшшзироваться мягкий! имида-золькыми группами гисткдиновкс остатков белковой молекулы я узе з мягком виде никель(П)-белок образует сильный комплекс с ДНК (Ли и др.,1982). Наконец, молекулы белка будут играть езэ и роль катализатор^ в связывании ШП) с ДНК, в особенности то, которыэ обладают высоким сродством к ДНК.

Глава 6. Применение импульсного плазменного анализа в медицинских исследованиях.

В этой главе описывается новый способ измерения меди в сыворотке периферийной крови человека (3-5 шш), который позволил провести систематическое экспрессное исследование так называемых практически здоровых лтздей (~700 пел.), проходивших диспансеризацию в поликлинике АН ГССР. НаДдена прямая корреляция между содержанием меди в сыворотке крови и С.О.5., чти пОооОЛлсх фактор риска. Изучено содержание меди в сыворотке периферийной крови ладей больных острым ликфолейкозом. Найдено хорошо заметное различие в содержании меди ( X «1,9+ 0,2мяг/мл) у больных острым лейкозом по сравнении с донорами ( X »1,34+ 0,22 ккг/мл). Исследованы расфракционированные образ гу сыворотки кровя донора и человека, больного лимфогранулематозом. Показано, что у доноров 89% всей '«:еди в сыворотке связано е церуллоплазмином, что

в хорошем согласии с литературными данными, а у больного лимфо-гранудсматозом - только 69% и это несмотря на общее повышение уровня церуллоплазмина у больного.

Данные этих исследований могут иметь диагностическую ценность при эпидемиологических и клинических обследованиях пациентов.

ВЫВОДЫ

1. Разработано и создано 2 типа высокочувствительных атом-но-эмиссионных спектрометра, использующих УВЧ' индуктивно -связанную плазцу (ИСП) пониженного давления в качестве оптического источника света, а именно:

- импульсный спектрометр для элементного микроанализа растворов биологических молекул (3-5 мкл) с пределом обнаружения Ю"*^ - р по абсолютной величине;

- прецизионный спектрометр для кинетических исследований десорбции паров воды с образцов биологического происхождения.

2. Разработана методика, сочетающая равновесный диализ и высокую чувствительность импульсного УВЧ плазменного эмиссионного анализа для получения изотерм едсзрбций двузарядных ионов металлов первого переходного ряда на биомакромолекулах в разбавленных растворах с целью изучения энергетики комплексообра-зования. Исследован нелинейный характер этих изотерм адсорбции. Изучено влияние ионной силы, ГЦ-ссстава, гистонового кора на энергетику связывания ионов металлов с ДНК. Определены термодинамические константы связывания ДНК из тицуса теленка и константы связывания мононуклеосом из печени мышей линии СЗНА в 0,01 М растворе Л/аС1 с ионами Сс(»), ,М'Н, СиСи) и Си), рК которых равны для ДНК: 5,22; 5,56; 5,77; 5,14; для моконуктеосом - 3,90; 3,99; 4,15; 3,88, соответственно.

3. Предложен кинетический метод УВЧ ИСП атомно-омиссионного анализа дееорбированного водяного пара по водороду с увлажненных образцов ДНК, хроматина и металлокомллексов ДНК в изотермическом режиме и режиме флеи-дееорбцли для опраделешш энергетики гипра-тации биополимеров. Энергия активации десорбции воды вычисленная из изотермической кинетической кривой равна 21,4 ккал/М воды. Определено количество связанной воды и В^ для растворимого хроматина печени мышей линии СЗНА, которое равно 1,25г На О

на Ir сухого веса и 22,5 якал/М, соответственно.

4. Изучена структура кошлексов ионовСо(|<|»-Л''(,,}и (м(.и)° ДНК методом абсорбционной спектрофотометра в видимой и ближней ИК областях спектра (d-d -переходы). Показано, что в комплексах сохраняется октаэдрическая симметрия, а в случае Cotч) и Jfiíu) сохраняется также и окружение.

5. Исследованы методические особенности ультрафиолетовой дифференциальной спектроскопии (УДС) для энергетической и структурной характеристик спектральных изменений полос поглощения ДНК, вызванных ее взаимодействием с исчами металлов. Методом УДС изучено влияние различных факторов на взаимодействие ионов металлов с ДНК, в частности, нуклеотидного состава и его последовательности, ионной силы, поляризуемости иона, его заряда

и лиг&ндного окружения, а также диэлектрической приницаемости среды. Показано, что причиной вызываемых ионами JA^tu) , Д1лО<), Со CuJ • чТ/.О'^и спектральных изменений полосы поглощения ДНК является эффект Н-связи (сдвиг полосы поглощения в длинноволновую область на 40-470 см ), т.е. они взаимодействуют с азотистыми основаниями через молекулу воды. Напротив, ионы Си.(и), CutiI и(i) с определенной вероятностью взаимодействуют с основаниями ДНК (длинноволновый сдвиг на 640-4500 см""* и изменение интенсивности в области 36000 см""*).

6. Изучены спектры поглощения и флюоресценции этидия бромида ОБ) и акридинового оранжевого (АО), кнтеркалированных в комплексе ДНК с ионами металлов, при различных концентрациях красителей, ионов металлов и ионных силах. Обнаружено явление туиения флюоресценции интеркалированкого в ДНК ЭБ и АО ионами CuO) что объясняется переносом электрона от красителя к иону инкорпорированному между тяжами ДНК.

7. Исследована кинетика окисления Cuti) до О*.С^ , Найдено, что ДНК обладает способностью сильно замедлять этот процесс. Показано, что представление процесса окисления Си.С') доСм(.и)в комплексе с ДНК как десорбции Cut') с ДНК в раствор с последующим быстрым окислением Ox(i) до Ca(iiJпозволяет определить энергию активации десорбции с использованием констант скоростей реакции. Определенная таким образом энергия взаимодействия равна, как минимум, 20ккал/М , что превосходит энтальпию плавления ДНК на пару оснований. Исследовано действие У® облучения на комплексы

ДНК-бДи]ме-.одом УДС. Показано, что УФ облучение приводит к практически необратимому переходу Сц.(») в (д(<) с квантовым выходом 0,2+0,04.

0, Методами видимой и ультрафиолетовой дифференциальной спектроскопии поглощения и равновесного диализа показано, что действие иона металлов на ДНК связано, с одной стороны, с энергетикой, Структурой и пркродой в чих комплексов, а с другой, с характерными временами для внутренней подвижности ДНК и ее групп. Доказано, ■¡ко многообразие во взаимодействии ионов металлов с ДНК приводит "1: ослаблении фоефодвэфирньк и гликозидных связей, нарушению ком-илеыентарности оснований к, как следствие, точсовш цутадеяи гика делецин и транзицди.

9. РазрсЗотанкнй способ определения элементов в растворах, содэргсалрпс высокуз концентрация органики (например,сыворотки кропи) позволил вперсыэ провести систематическое изучение содержания мздн б сыворотке перкфери&юй крови практичггки сдоро-бьк лэдей в услоьиях диспансеризации (около 700 чел.) и сонару--кеть фактор ркгк е помощью катода пкпульсного УВЧ ИСП атошо-ейшсионного ьи'.кро анализ а, При изучении мккроолемсктного состава ¡¡•пакцай сыворотки крови показано увеличение в 3 раза "свободной* кзсвяэамноП с церуллсипьамкпои мгдн в сыворо1-лЗ крови больного «шс.|»грьну«:оаатозоа. Найдено хорошо заветное различие в содержи-как аеди в периферийной крови больнш острим лш^олейкезоы по ераснешэ с донором, Даыныа о тих исследований могут явиться вспомогательным средством для диагностически целей при ваидо-миологически и клинических обследованиях пациентов.

Осноспго результаты диссертации! изложены в следуЕцлх публикациях:

В виде статей:

1.Брегздзс В.Г. Нзкоторые методические Особенности удьтрсф;-ояетоьой дВДсраицидьнеа спектроскогчи белков. Сообценкя Ал ГССР, т.о8, 3, 1970. с.701-704

Й.Брогедсс В.Г. Интерпретация ультрафиолетовых диффзренц^г'-ль« ньк спектров ДНК в комплексе с нэкоторьин ионами первого переходное ряда. Биофизика, XIX, I, 1974. с.179-181

З.Брагедэо В.Г., Ефреио в« Е.Ю. Спектры огяощения комплексов ДНК с некоторыми двух вале ищки кокаин в области 220-900т.1.В сб.

"Конформационные изменения биополимеров в растворах",Тбилиси, Мецниереба, 1975. с.90-105

4,Bregadze V.G., Gelaguteshvili E.S., Kharetishvili ll.a. Electron spectroscopy of ША raetel complexes In solution in the range of 220-900nm. Studia blophyalca, Berlin, Band 67,1978. 3.25-26 und Microfiche 2/17-26

б.Брегадзе В.Г., Беспалова С.Н., Гелагуташвили Э.С. Ультрафиолетовые дифференциальные спектры комплексов ДНК с металлами в растворе. Биофизика, Х1У, 4, 1979. с.749-751

6.Брегадзе В.Г., X арат текли Й.Г. Спектроскопическое исследование гамма-облученных комплексов меди(П) с ДНК. Биофизика, Ш, 4, I960, с.615-617

7.Bregadse V.G. Nature of ША Interaction with Cations: UV Spectroscopic Investigations and Marcos Theory. Inter.J. Quantum Chemistry, XVII,1960. p.1213-1219

8j3regadae V.G., Bezhieshvili G.N., Gelaguteshvili 3.3. RP inductively coupled plasma spectrometry of ША netal complexes» binding constants and water deeorption kinetics.St.bio.Ю1,1984

9.Брегадзе В. Г. УВЧ-индувдрованная плазменная эмиссионная спектрометрия. В кн.: "Новые физические методы в биологических исследованиях", М., Наука, 1987. с.33-45

- Ю. Andronikaehvili Е.Ь., Bregadze 7.G., Monaselidze J.R~ OTA end nickel(II) Ions. Recueil dea Treveux Chimiques dee Pays-Bas, 106/6-7, June/July, 1987. p.193

П.Гслагутаявили Э.С., Брегадзе В .Г. Константы устойчивости ионовСо(и),Л?(||),См(») и^п(||]с ДНК при различных ионных силах. Сообщения АН ГССР, т. 128, I, 1987. с.ПЗ-116

12/ndronicashvili E.L.,Bregadze V.O, ,^onsaelidze J.E. Interactions between nickel and DllAsConaiderations about the role of HiCKei in G&rciliU^tjIieb io . I^'T'oltil lOi ш iii IjioiCi^yC»! "jTCtCZ^;",

H.Sigel,Ed.Parcel Decker Inc.H.Y., Basel, 23, 1988,p.331-357

13.Брегадзе В.Г., Гелагуташвили Э.С. Способ определения содержания меди в сыворотке крови. А.с. №1276989, Б.И., 46,1986.

В виде тезисов:

14.Брегадзе В.Г., Ефремова Е.Ю. Интерпретация ультрафиолетовых дифференциальных спектров ДНК, выззанных рТ взаимодействием. В сб.: П Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров", Харьков, 1974. с.16-17

15. Брегадзе Б.Г., Ефремова Е.Ю. Механизмы взаимодействия ДНК о Juin (и) , Со(ц] , jy.4l>) , и С") и2и(||] . В с J.-П Всесоюзной конференции по спектроскопии Счополкыеровн, Харьков, 1974.с.17-13

16.Брйгадзе ВвГ», Хараткавкяк М.Г. Электропила спектра поглощения коьашекаоа двухвалентной изди с ДНК, РНК и р=РНК. В сб. "Наторкали 11! Всесоюзной конференции по конфсрглацлонннх изкензни-ал в растворах"s Тбилиси, И«?п«сре5а, 1975. е.50-51

17.Брегедзе В.Г., Погребецкая М.И., Хпратклспли М.Г. Изменение спектров поглощения ко:лтлекгоа (и,Ы)с ДНК под действием ионизирующего излучения. В еб. :"Материалы Ш Всесоюзной коифорзн-цяи по спектроскопии биополимеров", Харьков, 1977. с.19-20

18«Брэгадзе В.Г. Природа взаимодействий ДНК с катнонаги. ^пеетроскопичзскис исследования к теория Маркуса, в cô. s "Международная кокфзрен1£5я по ква"."Еоеой xr.;r.sn, биолог .и и фзрыакото-гии", Киев, s.3, 1978. с.19

19.Брэгэдзе В.Г., Харатишвияи М.Г. ВьиокоцуЕСТвптелький атомно-змисскониый спектрометр с УВЧ~плазыенн1лл • возбуждением. В сб."Материвa: J совещания по конформационшм кзпененисл бис» полимеров в растворах", Телави, 1980. с.151

20.Брегадзе В.Г., Гелагугашвили Э.С. Электрокно-спектроеко-пичеекис исследования взаимодействий красителей интеркалирс ван= !п.к в ДНК. В сб. "Материалы У совещания по конфорггационныы изменениям биополимеров в растворах", Телави, 1980. с.125

21.Брегадзе В. Г., Цакадзе К .Д. Стабилизирующее и дестейкли-зируидее действие ионов двухвалентных металлов на двойную спирать ДНК. В сб."Материалы У всесоюзного совещания по конфор-шщмоннш изменениям биополимеров в растворах", Телави, 1980. с.28

22. Breeetoe V.O. .Gclaguteshvili E.S. ,Khar6tiabvili M.O.Irs-teroctiono of ШA with dyes end ne tel Ions. Electron-epectroocopie studies, In:"Sympoaiuia on btchyaico of jaicleic acids. Tallinn, 1981. p.181

23.Гелагутаа1_или Э.С., Брегадзе В,Г. Тушение фл„ аресценции красителей интеркалированных в ДНК ионами металлов, в сб."£ всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров",Харьков, 198-. C.14C

24.^регадзе В. Г. Приман;; ко УВЧ»индуцированной вшссио^ой

спектроскопии в биофизических исследованиях. В сб. "Тезисы докладов пленарных лекций и симпозиальннх заседаний I всесоюзного биофизического съезда",М., 1982. с.154

25.Брегадзе В.Г., Вардидзе Э.В., Гарибашвили Ц.И., Джагаров Л.Г., Шрапштейн С.А. Сопряжение импульсного атомно-омиссионного и люминесцентного спектрометров с ЭВМ серии СМ. В сб."У всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров", Харьков,1984.

с.31-32

26.Андроникашвили Э.Л., Бвлокобыльский А.И., Брегадзе В.Г., Гела!угаивили Э.С., Гинтури Э.Н. Анализ Jig , Се , Ci , Те , Си » in , Cd и PS в образцах хроматина, выделенных из клеток ас-цитной ^епатомы и печени мышей линии СЗНА. Веб. "Материалы У1 всесоюзного симпозиума по конформационным изменениям биополимеров в растворах", Тбилиси, 1985. с.171

27.Белокобыльекий А.И., Брегадзе В.Г., Гелагуташвили Э.С. Изотерма адсорбции меди(П) на ДНК, вцделенных из доброкачественной и злокачественной опухоли молодой иелезы человека. В еб."Материалы У1 всесоюзного симпозиума по конформационным из-менериям биополимеров в растворах", Тбилиси, 1985. е.197

28.Брегадзе В.Г., Гелагуташвили Э.С. Исследование содержания иеда в сыворотке периферийной крови человека» В еб."Материалы У1 всесоюзного симпозиума по конфор««ационнкм изменениям бнополпме-ров в растворах", Тбилиси, 1985. с.193а

29.Брегадзе В.Г., Гелагуташвили Э.С., Кмяадзе A.A. Пере^г.е-пределение меди в сыворотке крови человека при лиьгфогранулопа-тозс. В еб."Материалы 21 всесоюзного симпозиума по конфор^.са-кионным изменениям биополимеров в растворах",Тбилиси,1985.с.180

30.Брегадзе В.Г., Гарибашвили Д.И., Кочяамазашвили К.Г..Попов П.А. Автоматизированный импульсный многоканальны», плазменно-

змиссиинный слыприметр. В сб."материалы У1 всесоюзного симпозиума по конформационным изменениям биополимеров в растворах", Тбилиси, 1985. с.193

31.Андроникал1Экли Э.Л., Брегадзе В.Г., Белокобыльский А.И., Гелагуташвили З.С. Сапожникова H.A. Взаимодействие ионов металлов и молекул воды с нукяеоеомами нормальных и опухолевых члетов. В сб."Тезисы международного симпозиума по физико-химии ДНК и молекулярным механизмам 'функционирования генома" Дбилисн, 198?. с. 163-15

32. Брегедзе В.Г., Кочя&мазаавили К.Г., Хуцишвили И.Г. Взаимодействие воды и ионов металлов с ДНК, В сб."Тезисы мет-дународногэ симпозиума по физико-хюяш ДОК и молекулярный механизмам функционирования генома", Тбилиси, 1937. с.84-86

33.Брегадзе В.Г., Дкагаров А,Г., Кочламазашвили К.Г, ,Ухае-ва Н.Е. Плазменный эмиссионный спектрометр с ЭВМ для исследования кинетики десорбции газов и паров. В сб."У1 конференции по спектроскопии биополимеров®, Харьков, 1988. с.621-61

doUK artoat'Rou do глиао-эо

ыьолозэи еивочво опбиапь <№8-<мь эйшоомлобо^заоь окшивПчй, ь«лзс!«а<н) то assoto

03«Vi380rt0«1

0»(ГСШ) 1989

Подписано к печати 18 августа 1989 г. УЭ 02326

Объем 2 п.л. Тираж 150 Заказ №

Бесплатно

Напечатано на ротапринте книжной фабрики г.Тбилиси

ПОЧТОВАЯ КАРТОЧКА

Куда

кМ ГУ ЛЛ Щ -иг ыи..1.и ор - КГ^ 1С.« ср. Ьи о ср^у ШСМ,

__Мт-о.уш и ( сА^Г_

Кому __Т<?СГ& _£ ^ _

Индекс предприятия связи и адрес отправителя

Министерство связи СССР. 1989. 3. 105870. ППФ Гознака. Ц. 4 к.

из "сь

Çs.

Ь-Ч

O-J í*

CS—>

)

ПОЧТОВАЯ КАРТОЧКА

Як

ИШДШ

Куд 2

ц чЛЛ» ил

ДД

00,1

У ^_£7_. г? /

Кому

ЗЕь

Индекс предприятия связи и адрес отправителя

Министерство связи СССР, 1989. 3. 105870. ППФ Гознака. Ц. 4 к

Q «.J

Va) ^-ní

o fe o

o 9~P

es—.

Информация о работе

Брегалзе, Василий Григорьевич
доктора физико-математических наук
Москва, 1989
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Энергетика, структура и природа взаимодействий ионов металлов с ДНК в растворах ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Энергетика, структура и природа взаимодействий ионов металлов с ДНК в растворах"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Энергетика, структура и природа взаимодействий ионов металлов с ДНК в растворах
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика