Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Энергетика, структура и природа взаимодействий ионов металлов с ДНК в растворах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Энергетика, структура и природа взаимодействий ионов металлов с ДНК в растворах"



МОСКОВСКИЙ ОРДША ЛЕНИНА, ОРДША ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДША ТРУДОВОГО КРАСНОГО 'ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ЕРЕГАДЗЕ Василий Григорьевич

У.ЦК 577.323

ЭНЕРГЕТИКА, СТРУКТУРА И ПРИРОДА ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ИОНОВ 1ЖГАЛЛОВ С ДНК В РАСТВОРАХ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва 1989

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте Физики АН Грузинской ССР

Сфишалыше- оппонептн:

доктор Физико-математических наук, профессор В.Я. Малеев, доктор физико-математических наук В.Л. Носкин, доктор физико-математических наук В.И. Иванов

Ведущая организация:

Институт биологической физики АН СССР

Защита состоится "_"__1989 г. в_ час.

на заседании специализированного совета Л 053.05.53 по биофизике при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 117234, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Авторе^ фат разослан "]__"_198_г.

Учений секретарь специализированного совета доктор биологических наук

■I

и

Т.Е. Кренделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЕОТИ

Актуальность проблемы. Создание новых физических методов исследований в биологии и их совершенствование привело к реакс-цу углубления наших знаний на молекулярном уровне. В частности, становится все более очевидным такой факт, что ионы металлов играют вазкную роль в самых разнообразная биологических процессах. Трудно переоценить роль ионов металлов в медицине. Известно, что концентрация свободных ионов жизненеобходимих металлов контролируется и поддерживается в живой материи чрезвычайно тонко, и нарушение ионного баланса в системе вызывает растройства и ней, равно как и различные функционалы-ме растройства ведут к нарушении этого баланса. Так, например, в сыворотке крови больных некоторыми раковыми заболеваниями наблюцается повышение уровня такта элементов как медь и цинк, поэтоуу их изучения является актуальным для определения фактора риска на этапе диспансеризации практически здоровых лвдей в амбулаторных условиях. Кроне того представляет важность исследование количества обязанного с тем или иным ко!Понентом сыворотки биологически активных элементов при различных заболеваничх. В настоящее время Еироко используется лечение металлами, находят применение ионы металлов и хелатн и в химиотерапии. Хелатогерапня испсльзуется для удаления из организма '¡гоксичкцх ионов и металлов.

В последнее время, в связи с особой ролью ионов металлов в функционировании «игдо организмов, сформировалась новая научная дисциплина - бионеорганическая химия, которая теснейшим образом связана с молекулярной биофизикой и молекулярной биологией, поскольку связь между органикой и металлами осущегталязтся посредством так называемой координационной связи - промежуточной по энергии между химической и вандерваальссвой - особым взаимодействием - электронно-донорно-акцепторным. Все большее внимание обращается на то, что многие ионы двухвалентна металлов 1-го переходного рада играпт важную роль в суперспиральной организации ядерной ДНК, репликации ДНК, ее транскрипции в чРНК, а таете в трансляции генетического кода. Кроме этого, ионы металлов могут вызывать различного рода дефекты в структуре ДНК, такие как депуринизация, однотяяевые разрывы, сшибки а еячтеэа нуклеиновых кислот.

Э к е п op ше иг ад ь ни ~ изучения специфичности взаикодвйатвня ДНК е ионами таких металлов как Na.it> . в Mn(u) • Со('0

/Vi (||) • Cu(ii) » Cu (О .En (i.) и Лд(|) , структуры этих комплексов и энергетики связыва(шя в них при различных внешних условиях (ионная сила, окружение, цумеотиднцй состав, УФ- и гага^»-получение и др.) являются важным и актуальным в понимании организации и функционирования генома на молекулярном уровне.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось экспериментальное исследование природы взаимодействия ДНК б нонами , ЛдС»), JH» (н)} Со (и), Mi 00, Cuíi'J, Cu 0),thl"ldjl'j

В задачи работы входило:

-создание новых методов исследования, далцих количествеш^'Е информацию о взаимодействиях ионов металлов j ДНК в водных реет-" ворах;

- изучение влияния нуклеотидного состава на энергетику связывания;

- исследование влияния ионной силы на взаимодействие ДНК с ионами металлов;

- ыяснение роли окружения иона металла на комшг''ксообразо-вание ДНК;

- исследование действия УФ- и гамма излучения на кошдексы ДНК с Cuín);

- изучение конкурентоспособности ыезду ионами металлов и ннтеркалцрупцими флюоресцирующими крас: гелями при взаиыо/тействш! их с ДНК;

- выяснение роли гистонного кора при взаимодействии ионов металлов с мононуклеосомамн.

Научная новизна. На основе УВЧ индуетивно-евязанной шшзки пониженного давленк.; в качестве оптического источника света в атомно-эмиссионнои спектральном анализе созданы два новых высокочувствительных метода: импульсный (идноканальный и многоканальный) экспрессный микроанализ биологически важных ..еталлов в растворах биомакромолекул и надмолекулярных стру..гур, в том числе и в сыворотке периферийной крови, который в сочетании с равновесным диализом позволил определить константы связывания ионов металлов с ДНК, и плазменный эмиссионный метод для исследования кинетики десорбции газов и паров в изотермическом режиме и в режиме флеш-десорбции с поверхности биологических молекул и ело-

"як соединений.

При помощи отнх методов, а такяа методов У£ и видимой аб~ тсьэцгюнлоП спеотрофото^трпп флвориьетри-л, получивших далькз-,*5зсз разшггкз s нсазй работа, г. п о р a u а стало возмогшим:

~ иаизрить термодинамические константы связывания Со О1 ) «

JA0<) , См. Lu) И 2_h0') с ДНИ;

- получить концентрационные константы связывания Loi Cui») н ?>, ( <ij с MoiioHyiueocoîïMii, ввделзннши из ядер клеток ззчзна liaefi линии СЗНА;

<= получить кривые десорбции и фиеш-деоорбцни молекул коды с иоюрхнссти ДНК и определить энергию активации десорбции воды с '.оЕзрхности увлажненных образцов ДНК ..ри разных относительных азг>:ностях и комплексов ДНК с ионами lu), 3-е. (ш)» Со (ч), Cuf^ иЗнИпри относительной вла.лости

- охарактеризовать структуры комплексов Со(н] и Си (и) о ДНК методом абсорбционной спектрометрии в видимой :: блшшей ИК областях спектра (cA-^d - переходы) ;

- исследовать влияние J/niC, лигандного окружения, ГЦ состава на взаимодействие ионов переходных металлов с ДНК;

- изучить действие УФ и гамма-излучения (кинетические иссе-дован^д) на взаимодействие Си(н)с ДНК;

- показать применение экспрессного высокочувствительного им-цульсноги плазменного змиссионнаго метода определения ыеди в сыворотке периферийной кроэи человека (691 случай) для диагностики и зпвдеьмологических обследований в медицине.

Практическая значимость работы. Создано новое направление, заключ тщееся в комплексном подходе, основанной на применении УЗЧ индуктивно-связанной плазмы пониженного давления в качестве оптического источника света в атоино-эииссионном ыикроэлеиент-ноу анализе:

- следовых количеств ыеталлов в образцах биологического происхождения ( таких как белки, ДНК, хроматин, сыворотка крови);

- концентрации ионое металлов а экспериментах по равновесному диализу;

- количества и кинетики водяного пара, десорбкуущего с поверхности ДНК, ыеталлокоцплоясоа ДИК и хрснапша.

Использованы траднцк^шыэ иатоды У5 дкффзреншахько'» и видимой абсорбционной зллггрофотоиетрии и {ярориметрии красите-

лей, кнтеркалированных в ДНК для исследования взаимодействия ионов металлов с биоыакромолекулами и надмолекулярными соединениями в растворах, с целью выяснения структуры}анегретики и природы связывания ДНК с иенами металлов.

Разработанный нами способ определения меди методом импульсного УВЧ плазменного эмиссионного анализа сыворотки периферийной крови человека, позволил обнаружить «^актор риска в условиях обычной диспансеризации (691 случай), найти перераспределение 1.:еди у человека больного лимфогранулематозом по сравнению с сывороткой здорового донора, показать достоверное увеличение меди в исследованных формах лейкозов.

Результаты этих исследований могут иметь диагностическую ценность при эпидемиологических и клинических обследованиях пациентов. Такие исследования ведутся в настоящее время совместно с институтом гематологии и переливания крови МЗ ГССР.

На защиту выносятся следующие основные положения и результаты:

I. Разработка и создание 2-х типов атомно-эмиссионных спект-ргчет^лэв, использующих УЗЧ индуктивно-связанную плазму пониженного давления и качестзе оптического источника света;

- импульсного спектрометра для элементного микроанздиэа (35 мкл) растворов биологических ма воротку крови

величине, и

- прецизионного спектрометра для кинетических исследований десорбции паров воды с образцов биологического происхождения.

2. Разработка методики совместного использования равновесного диализа и импульсного УВЧ плазменного эмиссионного анализа для подучения изотерм адсорбции ионов металлов на биомакромолекулах в разбавленных растворах с целью изучения энергетики ком-плексообразования.

3. Определена энергия гидратации ДНК, металлокомплексов ДНК и растворимого хроматина, в частности энергия активации десорбции воды, вычисленная из изотермической кинетической кривой для тимусной ДНК равна 21,4 ккал/моль веды.

4. Исследован нелинейный характер изотерм адсорбции. Изучено влияние ионной силы, ГЦ состава, гистонового кора на энергетику связывания ионоз металлов с ДНК, Определены термодикамичес-

человека, с пределом обнаружения

абсолютной

ао константи связывания ДИК из тшдуса теленка ц. консганти сья-1НЕЗНИЯ кои сну кле ос ом из клеток печени шшей линии СЗНА в U,ül LI lacteope Jjetll с ионами ^о(и) , -Л/i(u} ,Си(п) и pK koto-

iiix рашы для ДНК:' 5,22; 5,56; 5,77; 5,14; для мононуклеогс:* -1,90; 3,99; 4,15; 3,68, соответственно.

5. Развитие методов абсорбционной спектрофотонотрни в УФ и атплэй областях спектра, применительно к слабопоглощакдии (с •сз£*,иц1:енто" молярного поглощения в пределах 2-20) и относитсяь-:а гиохораствориыш объектам биологического происхокденил, в ча~ «•псята ДНК, а тагсге к спектрам поглощения, поло возмущаемым uez-

"з^лярни™.-! взакиодейетвияии, иакош£: являются взаимодействия ап.'^уда'па двухвалентных ионов 1-го переходного ряда с ДНК,

6. Определены структуры комплексов Со(п) и («(") С ДНК "годом еп-п:трофотометрии поглощения в еидимой и ближней ИК об-зе^ях спектра. Показано, что uouu Cofuj;{ vA/i'(nJ .например5 пэаимо-^Птгпуот с ДНК как гццратировзншо кон:;, р.е. образует с ной

ко."ПЯеке. Кон ги (и) с ДНК взаимодействовать

т.ч. 0бр150"Ч1\пть г-нутрип^ерный коыплека.

7. Методами видимо''. ¡i ультрафиолетовой дифференциальной ■пестрое кет:* поглощен:;,? к равновесного диализа изучена природа •гаксодейсзий аоноз металлов Mj(ii)t>M*(") tCo(u) tM(ii¡, Си.(и), Ca(i) Hv^í1) с Дг!К: влияние нухлеогиднс-r ^ состава, налиме гист«нового корд, ионк.1Й силы, поляризуемости иона, его за-•ада и лигандного окр;.же>.*ля, концентрации иона, УФ и гамма-излу-[ения. Показано, что цейгтгиз ионоп ыетп ,vío э на ДНК связано с 1ДН0Й стороны с энергетикой, структурой и природе.", этих комплотов, с другой - с хар-г;ггепн1с,;и гременаы? для внутренней почетности ДНК и ее групп,

В. Продемонстрирована юзмояность применения импульсного "ВЧ нндуктивне-евлознного плоенного ато.мно-эмиссионного аналн-:п в медицине, на при^-зрз определения неди в сиссрсггке периферяй-гай крови практически здоровых людей и людей больных различными лейкоз... а пали ебнару^кть ^акгор риска и использовать и'О для ранчей диагностика лзйкозоз.

grpy¿synajt_o6-beM работу Дка;вр*ацич осстс'гг из вездетп'я» i «лав, выводов и списка м :тиру,-мой xr :ератури. Он-г соперяет 91 страницу, в том ч»сле 98 рисунков, 32 таблгп} ь олисо^лите-

йтури.из 241 наименован;'.?!.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 33 работы, среди них 2 обзорные статьи и I авторское свидетельство.

Апробация работы. Результаты исследований, приведенных в диссертации, докладывались в виде пленарных, секционных и стендовых сообщений на следующих Всесоюзных и международных конференциях: П, Ш, 1У, У и У1 Всесоюзных кон^ ренциях по спектроскоп™ биополимеров (г.Харьков, 1974, 1977, 1961, 1984, 1968); III, Р, У и У! Всесоюзных конференциях по конформационным изменениям биополимеров з растворах (г.Тбилиси, 1975, .1977; г.Тела-ви, 1980; г.Тбилиси, 1985), I Всесоюзном биофизическом съезде (Моекза, 1932), П Всесоюзном рабочем совещании по физике комплексов биомакромолекул с металлами (Пущино, 1987), I Всесоюзном совещании по биофизике рака (Черноголовка,1987), научной сессии отделения физиологии и экспериментальной медицины АН ГСС "Мялигнизация и физико-химические свойства биополимеров и их надмолекулярных структур"(Тбилиси,1987), Ш симпозиуме стран-членов СЭВ по бу физике нуклеиновых кислот (Брно,ЧССР,1977),сиы позиу;-: по изменениям в конформациях ДНК (Брно, ЧССР, 1977).Международной конференции по квантовой химии, биологии и фармакологии (Киев, 1978), Международном симпозиуме по биофизике нукле иновнх кислот (Таллинн, 1981), У! симпозиуме по биофизике белке и нуклеиновых кислот (Сегед, ВНР, 1983), Международной конферсн ции пс воде и ионам в биологических системах (Бухарест, СРР,19Е Ш Международной конференции по бионеоргаиической химии (Нордвех ерхоут, Нидерланды, 1987), Мездунвродном симпозиуме по физико-химии ДНК и молекулярным механизмам функционирования генома (Тс лиси, 1987), симпозиуме с участием стран-членов СЗВ и СФН) по гидратации биополимеров (Пущино,1988) и Ш Международной конфер? цки по хелатам (Вашингтон, США, 1989).

Результаты доклады&здись ка. бсесоюэком семинаре по молекулярной физике и биофизике водных систем (Ленинград, 1989), Всесоюзных школах-семинарах по использованию ядерно-физических методов в биофизике и молекулярной биологии (ЛИЯФ:Луга,Ленинград, 1932 и пос.Усть—Нарва,ЭССР,1983), Всесоюзных семинарах по фото* нике нуклеиновых кислот (Ленинград, 1978 и 1980), Республиканской конференции по молекулярной биологии и молекулярной генети1 (Тбилиси, 1977), семинаре Института биофизики АН СССР (Цущино,15

~ 9 -СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1,Сж<:»-'.о-кимнческие свойства поьерхности и ионов егаллов (обзор литературы).

В настоящей главе дана характеристика элзкп'ронио-дсиорно-кцепторных групп ДНК, экйюнированюус а раствор;«'ель. Рассмот-ены электронные свойства иснов переходных иегаллов, влияниз сям-отрин поля на расщепление (к -орбитален ионаз полем лигандов. риведены основнда положения концрлции кесгких и мягких кислот основания, с поыощыэ которой дан качесгвеяний анализ ьг.аимоде»1.-гвкй ДКК с ионами мзталлоо. Кроме того, а этой глазе приведен бэор экспериментальных исследований комплексов двухэердцных ио-ов с модельными соединениями и клеймовщиц кислотами.

Глава ¿, Новыь экспериментальные .методики для исследования зашлодейатвия ионов металлов и гидратации с биоыакроуэлекулами

Беаэлзктроднал плазма пониженного давления ка^ источник зета п атоино-оииссионнок! микроанализа.

Идяа, которая лечит в основе метода атомно-уииссионной с:;е-троскопии (АЗС) можно проиллюстрировать следующим образом;

Д + энергия—• Ь\> (1)

до А , А"-атомы Я газовой фазе в основном и зозбузд&наом э.'(ёк-ронноы состояниях, соответственно; квант свзта испускания

ри переходе Л в А . Энергия исследуемому атому мо-.<зт сообцг-гьсн г соударений с электронам.», атомами и молекула»,з», облада^и.та остаточной кинетической энергией. Таким образом, ч?ойы схемьШ абстала, необходимо анализируемое иелество атокизировать и загвм гоыы перевести в возбужденное состояние.

Как правило, в АЗС источник возбуждения атомов одногре:.;е.-№; вляотсд и источником атомнзацни. Бозэлеетро[;нын разряд мсжет аеть характер емкостный или индуктивней. Последний получил бо-эе широкое распространение. Безэлектродная плазма в АЗС исполь-/ется как атмосферного, так и пониженного давления (1-10 торр). дальнейшем пол, безэлектродной плазмой Судом подразумевать ин-/кти вн 1-е вяз аннув плазму (ИСП), создаваемую электромагнитными элями ВЧ, УоЧ или СЬЧ диапазона. 3 плазме атмосферного давлен»».? Т& ~ . тогда ка»{ в плазме потаенного давления Те >? Тх

недовательно, в последнем случае атсмизация и возбуждение авизируемого элемента происходит почти исключительно за счет 1вкхрсн.чого удара. Зто, а своп очередь, приводит к 6 ад ее низ-гл степени атоыизации п возбукдеьня.чем и плазме атмосферного

давления. С другой стороны, в плазме атмосферного давления за счет большей величины частоты электрон-атомных и атом-атомных столкновений по сравнению с плазмой пониженного давления, сильно увеличена не только степень атомизаши и возбуждения, но и вероятность тушения возбуждения (уменьшение времени жизни атома з возбужденном состоянии), т.е. безыздучательного перехода из возбужденного состояния в основное. Кроме того, хорошо известно что спектральная ширина атомных линий в этой плазме на 2-3 порядка больше, чем при возбуждении плазмой пониженного давления, она оптически непрозрачна, обладает сильным фоном с максимумом нэ-лучек ;я в УФ области спектра, т.е. в области испускания большинства элементов, представляющих" биологический интерес.

Исследованные нами в области 190-360 им спектры испускания УБЧ ИСП пониженного давления (3-10 торр) как гелиевой, так и аргоновой, показывают практическое отсутствие фона в этой области спектр^. Кроме того, сравнение УВЧ и СВЧ (2,4 гГц) плазмотронов с пониженным давлением п<? пределам обнаружения элементов и влиянию щелочной присадки, например,JJ*CCt на величину измеряемых сигналов показывает, что УЬЧ ИСП пониженного давлен, я не только может конкурировать с аналогичной плазмой на основе СВЧ поля, ж и превосходит тем, что значительно меньше зависит отJ/лtftrro npi общей высокой чувствительности является бесспорным преимущество! особенно в биологических исследованиях.

Итак, несмо ря на очевидные преимущества (стабильность,лучшее сопряжение с узлами оптических систем), УВЧ ИСП ранее не использовалась в качестве источника света для оптического спектрального анализа. В институте физики АН ГССР созданы эмиссионные спектрометры на основе УВЧ плазмы пониженного давления, под руководством и при нвлосредственном участии автора, позволяющие проводить элементный анализ в 3-5 мкл раствора с пределом обнаружения - Ю"^г по абсолютной величине и анализ паров и газов с целью исследования кинетики десорбции сорбата.

. Импульсная УВЧ лндуктивно-связакна,. плазменная спектрометрия для элементного анализа в растворах, Рис.1 представляет бло1 схему одноканального прецизионного высокочувствительного импульсного плазменного спектрометра, собранного на светосильном моно хроматоре МДР-2, Цифровой вольтметр необходим для настройки спектрометра на нужную спектральную ликяо. Анализируемый раствор

ЧШРОСИСШМ

цс л(репин

ВСЛоТ«ШР

Р и.Л.

йстр-ни^лк

'ипомищюц)1т осца'.огРЛ'Р

У5Ч (ШР&то?

МОИОРСМИО''

фэз

гели

возт

60 ю

ТыСОКО[ 1

иьг.ряч'.г.иц!. | 12 с

1еши

Ь I К л м

РЮТ1

КОШНСНОРИ

3 о

нмни«

¡•¡£творит1к

ОЮ1№£

ОИНИЧЮЮГО

чштм

оьр13ц вша иеоршии^есг.ого М4ТЕРЦЦЦ

_т„ 50

Рис.1

. * г. •' >

/ у,, ^

".IV'К- ■'' .'У. 'У* ' г - - • . ' ' ■!■

V

•5 ^

¿1 «*А ,/*. 5 Л Ь. «. (и. V'!?" 1 ¿Л. Л - '¿г.-¿г

* : х' , » . ? • *»:•

- • I—1------

ьо 70 ПШМ» (05

6РеМ5< В се^- _

Бис Л. Блок-схет одноканального импульсного спектрометра

Рис.2. Последовательность операций для проведения элементного анчлкза методом импульсной УВЧ ИСП омисси-онной спектрометрии

Ркс.З. Осциллограмма, полученная прн эмиссионном енал-'зе меди в раетхюрс-Сч (^импульсным изтодом.Конце грация неди-1,7мкг/мя,1тр:1я-0,15М; Л =324, Уеиление-Мшз на деление.Раз» йергкч-ЮОмс на деление

вносится з испаритель, в котором с помощь» газезой системы ■ дасулееа нагрева он высушивается, озодяется и испаряется, а затем заносится в виде аэрозоля в разрядную трубцу. В ней исследуемый э виде неорганического вещества образец атомизируется и возбуждается. Оптическая система, настроенная на измеряемые еле-мэнты, регистрирует световые потоки. Количественный анализ проводится сутом сравнения световых потоков, испущенных исследуемым образцом и стандартом.

На рис.2 схематично показана последовательность операций для проведения элементного анализа. Образец в виде раствора, например, сыворотки кроэя , в колг-естве 3 шел, наносится микропипеткой на такталоцуи проволочку и устанавливается в испарит ельцу» камеру с проточным газообразным гелием. Начиная с момента включения конденсаторной батареи на зарядку и предварительного нагрева таиталовой проволочки ( О =1,5-2 А) для испарения растворителя проводится отсчет времени. В течение 20-30с образец высушивается, затем газовым клапанным разъемом отключается линия гелия и подключается воздушная линия для сухого озодения органического материала; одновременно необходимо увеличить ток через проволочку до 2-3 А. По истечении 20-40с (время, достаточное дл;. озоления) воздушная линия размыкается и подключается гелиевая и вакуумная линия. Спустя еще 5с включается УВЧ поле генератора ПНБЛ-З и катушка Тесла для пэдкига плазмы. Через 5-10с в кварцевом капилляре устанавливается стабильная плазма. Установка готова к измерениям. На 100с от начала процедуры отключается разрядная конденсаторная батарея от источника питания. К 105с тиристор подключает конденсаторную батарею к танталовой нити находящейся под током, и сшгхронно с разрядом запускается запоминающий осциллограф, которым регистрируется величина и форма сигнала с фотоумножителя (рис.З). Затем увеличивается ток в нити до 3,5-3,7 А на 5с для полного испарения остатков. Отключается УВЧ поле, электросистема испарения, вакуумная линия и прибор готов к следующему анализу.

Особо ст~ит отметить, что для элементного анализа разнообразных биологических образцов, особенно сыворотки крови человека, наличие воздушной или кислородной линии является необходимым. Отсутствие кислорода приводит к образованию продуктов неполного сгорания (сажи),что ведет к невоспроизводимым результата.

Методика элементного анализа. Наиболее важной характеристикой аналитического прибора является предел обнаружения (ПО) - предельно обнаруживаемая концентрация определяемого элемента. ПО сильно зависит от отношения сигнал/аум. Поэтов наименьший предел обнаружения и наилучшая воспроизводимость обеспечиваются максимализацией отношения сигнал/нум. Количеству анализ ируемого элемента в образца пропорциональна площадь под фотоэлектрическим сигналом при условии линейности градуироночного графика. В налеы случав, импульсной УВЧ-плазменной эмиссионной спектро-иетрин форма сигнала отражает прохождение исследуемого вещества через разряд, что напоминает спектр десорбции при фдеш-десорбцки. Эсцяллографом точнее и надежнее регистрировать ашшитуду фотоэлектрического сигнала, чем площадь под ним. Таким образом, мак-ВЕшализировать сигнал, это в нашей случае, максннализировать площадь под сигналом, а затем сузить сигнал во времени. Первое зв«зано о эффективностью атоыизации и возбуждения атомов анализируемого образца - температуры плазмы и плотности электронов о ней (давление, мощность УВЧ-поля, подменив разрядной трубки относительно резонатора, природы инертного газа и концентрации пегкоионизируемоЯ щелочной присадки); второе - зависит от процесса подготовки образца к анализу (сила тока и время высушивания и озоления), скорости испарения (напряжение на конденсаторной батарее и сопротивление танталовой проволочки) и времени нахождения аэрозоля в плазме (скорость потока газа). Кроме э'ге-го, поскольку предел обнаружения за-поит от отнопения сигнал/ цум, увеличить это отношение можно, используя для выделен л спектральной лиши монохроматор высокого разрешения, что позволяет тр о водить анализ с достаточно широкими целями. Еибор малоиумя-циго ФЭУ" также способствует увеличению отношений сигк&л/цум.

Итак, в УВЧ индуцированной плазменной эмиссионной спектрометрии для -здеаного высокочувствительного элементного микра-шализа требуется оптимизировать по крайней мере 14 параыетроз. Наиболее важичш для многих изучаемых в биологии элементе , яв-1яются: мощность УВЧ поля, дааленио инертного газа и концентрация лзгкоконизируемой присадки, например, хлористого натрия. 8 таблице I приведены пределы обнаружения исследованных нами элементов - магния, вдльция, хрома, железа, кобальта, никеля, меди,

цинка, кадмия и свинца, а также значения спектральных линий, использованных для их определений.

Таблица I

Пределы обнаружения различных элементов

Элемент Длина волны в нм Пределы обнаружения ы.:оль/л пг

Магний 518,36 6 0,4

КальциЯ 422,67 2 0,2

Хром 425,43 80 13

Железо 373,49 30 5

Кобальт 345,35 100 18

Никель 351,94 200 35

Мэдь 324,75 5 I

Цинк 636,23 4 0,8

Кадмий 643,85 7 2

Свинец 405,78 150 90

УВЧ индугктквно-связ'анная плазменная спектрометрия кинетики десорбции газо! и пароь, адсорбированных образцами биологического .роисхсждения. Галовакуумная система и УРЧ плазмотрон аналогичны описаньоуу выше с той разницей, что в качестве испарительной камеры с таьталозой проволочкой и электросистемой испарения служат тефлоновые цилиндрические ампулы с внутренними объемами 6-1000 мкл в зависимости от массы исследуемого образца. Ампула вставлена в медный степень и с ним вместе герметично крепится накидной гайкой к игольчатому вентилю. Медный стержень находится в сосуде, омываемом термостатической яидкостыо для поддержания постоянной температуры б опытах по десорбции ¡к ды в изотермическом режиме.

Разряд в трубке из кварца с проточным гелием при давлении I торр фокус1груется конденсором на входнуг щель дгойного светосильного дифракционного монохроматора спектрометра СДЛ-1. пыхо; усилителя СДЛ-1 связан с самописцем КСП-4 и цифровым вольтметре Б7-28. Цифровой вольтметр через адаптер подключен СШиШ) к нхсх ному модуля в стандарте КАМАК и далее к ЭЬМ СИ-3. ¡Тары воды, д<: сорбированные с поверхности ДИК, проходя разрядную трубку, ато-кизируются и вэзбучдялтел. Спектрометр, настроенный на одну из линии Сйрпи Бальмера НА= 656,284 нм или Н^ « 4в6, 133 им птг.мл

здсрода, регистрирует во времени количество водяного пара, ко-зрый проходит через разрядную трубку УВЧ плазмотрона.

Недостатком изотерической десорбции является неоднознач-эсть подключения увлажненного образца к спектрометру, что поэт бить причиной возникновения неустойчивости в плазме, оозмо.к-э да*е тушение плазнн из за быстрого открывания вентиля. Зги едостатки являются несущественными и могут быть учтены; они моП' быть также устранены, в принципе, в режиме ^неш-десорбции г.е. при регистрации температурного спектра десорбции), где роль гнтиля играет температура, достаточно низкая для сильного укень-эння десорбции (скорость десорбции сравнима с фоной). Подъем гштературы вызывает постепенное увеличение скорости десорбции, лтеы скорость достигает максимума и в конце сноЕа уменьшается з уровня фона. Скорость шла в начале и в конца, т.к. в нача-з хотя и 1лкого воды, но температура низкая и низкое давление зрзв над образцом, а в конце - давление низкое из-за сильного ааньшекия давления паров.

Прекцутцеством изотермической десорбции является простота эддерзания постоянной температуры. Особенностью экспериментов ри флеш-десорбции является точное знание температуры и необхо-имость линейного изменения температуры, что пойволяпт довольно росто вычислять энергия активации десорбции воды.

Глава 3. Энергетика связывания ионов переходных металлов и молекул воды с ДНК и цуклеосоуаии

Прямым методой изучения энергетики коыплексоэбразивяния яэ-яется равновесный диализ, который в сочетании с высокочуветви-эльным импульсный УВЧ индуцированным плазыенным атомьо-эмисса-чным шкроанализои позволял получить изотерм адсорбции иоиоз а (") • сА/; (и) , Си (.и) и "2м (ч) на ДНК и мононуклеосомах при концен-эациях и нихе.

Из изотермы адсорбции определяется константа связывания остойчивости или ассоциации), которая связана с иэкзнениеи стандартной свободной энергии Гиббса соотношением

= .(2) ;е К - равновесная константа связывания, Т- абсолютная, тендера-фа, ' Я - газовая постоянная равная 1,9872 ¡«чл.грзд^моль-".

Изотермы адсорбции ионов кобальта, никеля, меди и цинка на ДНИ и мононуклеосомах.Блияние ионнсИ силы и ГЦ содержания на константы связывания и кооперативность» Изучены изотермы адсорб ции ионов Со(н) | Си.Ы л2п(ч) с ДНК различного проис-

хоздения. Исследовано влияние ионной силы и гистонового кора. На ркс.4 представлены изотермы адсорбции никеля(П) и кеди'П; с ДНК при ионных силах 0,02 и 0,2М <Л/а. (Л , а также тех же металлов с мононуклеосомами при ионной силе 0,01М в пордина-тах Скетчарда %/т иг, где X -число ионов, связанных с ДНК или мононуклеосомами в моль/моль нуклеотидов, т -число свободных ионов в молях. Конце: грация ДНК - 2хЮ~^ моля. Концентрация мононуклеосом -10""^ моля. Выбор ионной силы в 0,0Т М в опытах с мононуклеосомаш обусловлен необходимостью исключить возможную агрегацию их при дьализе этих растворов против исследованных ионов ЖП). Соответственно была уменьшена вдвое концентрация мононуклеосом, чтобы сохранить отношение цу-клеотвд ДНК, равное 100, т.к. большинство экспериментов с ДНК Проведены именно при этом отношении противоионов. Концентрации ионог М(П) в вкспериментах по равновесно^ диализу варьировали

Рис.4. Изотермы адсорбции ионов Мин)н(н1и)"в. ДНК (4 верхних рис и мононуклеосоыах (2 нижних рис. цри различных ионных сила.;.2 вер хних левых рис. представляют изо термы адсорбции ¿/¡(и)и(и(11) с тиму ной ДНК при ионной силе в 0-02 М чУл-ОЙ .Соответствующие им правые рис. представляют те ке системы При ионной силе 0,2 Ш/аС?,2 ния< них рис.-изо.ерш адсорбции Си. (к и с мононуклеосомами, вьщеле! ными из .¡дер печени мышей линии СЗНА цри ионной силе в 0,01 УЦ/а.

Очевидно, что в случае взаимодействия ДНК с ^/'("]упаличе-э ионной силы или наличие гнстсноеого кора ведут к изменению рактера связывания, а именно, два типа независимых мест свя-;вшшя переход.« в антикооперативное. Аналогичное поведение ха-.ктерно для взаимодействия Сз{ч) и 2п (ч) с ДНК. Иокы Си.(п] при акиодействин с ДНК сохраняют свою индивидуальность. Для них ха~ .ятерно два типа мест независимого связыв-пия, несмотря на изменив конной силы вплоть до 0,2М ^/«С/или наличия гистонового :ра.

Таблица 2.

Влияние ионной силы на величину макрокснстант и число мест

связывания

РК п

Ионная 0,2". 0/02 0,002 I натрий ( I) U,2 о,ог 0,002

сила irai нуклеотид

*баяьт (П) 3,83 4,30 4,75 5,22 0,36 0,48 0,49

:кель (П) 4; 15 4,64 5,06 о 15S 0,33 0,50 0,о1

¡дь(П) 4,60 5,10 5,40 5,77 0,36 0,50 0,52

шк (11) 3J5 4,20 4,69 5,14 0,35 0,4£ 3,19

b таблице 2 приведены значения логарифма макроскопической шстанты рК и максимального числа мест связывании при трех ион-ас силах, таете значения pli0, полученныа при экстраполяция жцентрационных констант к ионной силе I на?рий(1) на ¡[уклеоаид, ш называемых термодинамических констант стабильности. Макро-сопичес не константы ospa^aoT изменение свободной энергии й G шеци,,. Введем еще одну энергетическую величину fi - - й (у , лоруа де Донде назвал сродством реакции. Таким образом, а наги случае, макроскопические константы отражают суммарное срод-,'во /\ конов M (Л) к ДНК. Так,например, для случая двух тип; !î?ct независимого связывания макроскопическая константа рав-i К = К, v-i, + к1ш1 , а для антикооперативного связывания К-к.и >е к. к, к -макроскопические константы, а п. , yi, и х соотЕетстзуцдие им числа мест связывания. Поскольку при ин-грлретаини нелинейных графиков Скэтчарда возможна некоторая не-гределешость, то удобнее сравнивать меаду собой маирокекман-i и максимальные одела ькст связывания (заполнения) лозо-сисстно 1К.

Бычо иэуюно влияние ГЦ-еодержания на внергетику связывания ДНК с ионами меди(П). Из анализа изотерм адсорбции ионов меди(П) на ДНК из ССо$ ¿п'<!(й/т , фага Т4 и ти-

муса теленка при ионной силе 0,02М Л-'« (€ следует, что адсорбция медиШ) носит характер двух типов мест связывания. Таблица 3 представляет данные о сродстве этих ДНК к ионам ыеди(П),а также значения максимальных чисел мест связывай я.

Таблица 3.

Влияние ГЦ-пар на связывание ионов ДНК с ыедью(П)

ДНК ССо < Ь гссИит фаг Т-4 Тивдс теленка

ГЦ,* 27 36 42

р!С 4,01 4,86 5.10

(г 0.37 0,44 0,50

Исследовано такта влияние гистонои на связывание ДНК с ионами М(П). С этой целью изучены изотермы адсорбции ионов Со (к), чЛЛС") « Сй('0 и 3?» (ч) цононуклеосомаыи с цуклеосомным повтором 196+ Зп.н. (' ^196^ и ионоэ М{(н) и Ы(и) с ДНК, вццеленными из ядс^ печени мшей линии СЗНА. В таблице 4 приведены значения рК (логарифм макроскопической константы),л(максимальное число мест связывания), К'« и (микроскопические константы, равные К /п ) и ш (параметр, связанный с энергией отталкивания яи-гаедов в антикооперативном связывании). Как известно, в этом случае уравнение Скетчарда представляют в виде г/т =

Таблица 4

Параметры связывания ^195 и ДНК с ионами М(П) в растворах 0,01 М А'ьСС

Ш1д6 и ДНК из СЗНА Ионы рК . Л

Ш196 ио>) 3,90 0,22 9,86

То же М (и) 3,99 0,25 10,70

Си Си) 4,15 0',28

Си) 3,88 0,22 9,02

ДНК Мс Со) 4,59 0,48

То же Си (п) 4,98 0,50

- ía -

ДНК из СЗНА с нонаш! М ОО и Си (и) проявляет свойства двух типов кест связывания, тесте как и ДНК из разных источников, ис-следованюяс нами.

Уменьшение сродства к ионаы М(П) в случае нуклеосом по сравнению с ДНК при тех пе внешних условиях объясняется уменьшением как шпфоконстант, так и числа мест связывания. Некоторое ис-клзчекие составляют ионы цинкаШ) и кобаль-а(П). С этими нона-ш ыикроконстанты для мононуклеосом практически совпадает с та-К0В13Я1 для ДНК. В случае взаимодействия ианоз металлов с моно-дентныии лигандаш для данных лиганда и центрального иона ыик-роконстанта доляна в основной зависеть от ионной силы. Зависи-:ость иикроконстант от занятости пест связызания, в ныпем случае гистонзии, однозначно указывает на то, что никель(П) и, в особенности медь(П), осуществляют связь с ДНК посредством хела-тирования. Этот эффзтг, в перзуп очередь, будет особенно ощу-тнп для тех ионов, которые наиболее специфично взаимодействуют, Поэтоцу никель(П) и иедь(П) с уменьшением мест связывания за счет взаимодействия части поверхности ДНК в нононуклеосомах Uijgg с гистоновыы корой и гистоном HI, переводят некоторое количество этих ненов, связанных с ДНК хелатно, в просто связанные 4J.A даже в атмосферно-свнэанные. Для ионов в это» состоянии как правило, преобладает антикооперативноа связывание (связывание JX^Cu) С полиАУ, Поланд (1978)).

Кроыз того, антикооперативноо связывание Ca(n¡ и

2hí") о иононуклесссмзми при ионных силах 0,0I!ís когда ДНК еще облегает двумя типами мог? нез^Еиаимого еи'-зыв&ния, об-ьяс-няется спецификой взаимодействия гистонового кора с ДНК. А именно, как показали Нирзабеков и сотр.(1978) гистоны взаимодействуют с дуплексом ДНК з основном со стороны главного яелобка. Таким образом, в нуклеосо^ой ДНК JJ 7 гуанина находится в главном желобке и, следовательно, недоступен или плохо доступен для взаимодействия с гндратированными ионами И(П). Исключение составляет нон иеди(П), который может взаимодействовать внутри-Суерно.

Итак, анализируя таблиц 2,3 к 4 uo-¡"> сделав;» еывод, "то велачетя р К сильнее всего зависх? в? типа двузарядного но яг. мэ-талла, йотой силы, назш-ta глеюнового кора и ГЦ-оос?1ва.

Сшибка определения рК, приведенных в таблицах, составляет 0,02 логарифмической единицы. Этой величине соответствует, например, изменение ионной силы на 10%. Стоит отметить, что зависимости рК от логарифма ионной силы и ГЦ состава достаточно хорошо описываются линейным законом.

Кинетика десорбции воды с ДНК. Другим интересным применением УВЧ индуктивно-связанной плазмы пониженного давления является ее использование в качестве оптического источника света в атомно-.эмиссионаом кинетическом анализе водяного пара, десорби-рованного с увлажненных образцов биологического происхождения с целью исследования кинетики и энергетики связывания молекул воды, адсорбированных их поверхностью. Это новый метод исследования гидратации биополимеров. Ниже, на примере кинетики десорбцш воды с ДНК, будут рассмотрены дне одификации этого метода -изотермический и флеш-дееорбция.

Изучена кинетика десорбции водяного пара с тимусной Л/аДНК увлажненной в равновесных условиях при разных относительных вла-кностях, и комплексов ДНК с ионами ^«(с1 <,с(»), Си(<

и ^^(.п) 5 также увлажненных в равновосных условиях при относительной влажности 92,5$ (насыщенный раствор \{МОг при температуре 25°С).

На рис. 5 приведена кинетическая кривая десорбции водяного пара с Л/а ДНК в координатах и t в относительных

единицах. М-масса водяного пара в единицу времени, t - время десорбции. Кинетическая кривая состоит из 4-х участков. Первый у деток от Ь =0 до 1 = 35с отражает подключение испарительной камеры с образцом и газовакуумной системе атомно-эмиссионного спектрометра. Десорбция пара начинается с момента времени 1; = 35с и ей соответствует 34 молекулы води на пару лАДКК. Второй участок - прямолинейный, которому соответствует десорбция пара от 34 до 24 на перу;- третий - экспоненциальный (меньше 14 молекул на пару). Анализ кривой десорбции показывает,по крайней мере, три различных по энергетике типа связывания молекул воды с .//<*ДНК. Количество воды, гидратированиое тюусной ДНК, определенное калориметрическим методом, составляет 23 молекулы на пару, 31'0 то количество воды, которое не выморатшБается б процессе охлаждения образца до температур жидкого гелия. Стоит отметить, что у кинетических кривых десорбции воды с комплексов

ЮЗ 200 300 «03 i,с

iK о ионами исследован»!« металлов, отсутствуют прямолинейные

4йстки.

Рис.5.Кинетическая кривая десорбции воды с JS*ДНК (t-20°C, 92,^0. в.). По оси ординат в относительных единицах представлена интенсивность фото-еигнала при Д -656,2Ьнм(линия водорода) ,которая пропорциональна количеству водяного пара,проходящего через УВЧ-плазмотрон. Цифрами над кри-jíí обозначены количества води, оставшиеся в образца ДНК во ромя процосса десорбции к соответствующим моментам времени (а пль Н^О на моль ДНК).

В об'це;.' случае, как хорошо известно, процесс сорбцчи-адсор-а.и носит многостадийный характер и, следовательно, скорость cpSiriK (и десорбции) определяетеч скоростью наиболее медленной астк. При абсорбции тякоенм часто является процесс диффузии орбата с поверхности в глубину образца. Однако, а ряде случаев, ояео мпгь1°ньч.п4 процессом моче? быть изменение структуры ки он ¡юрмации макромолекул.

На рис.6 иокяэанн кинетические кримк десорбции вопи для чразцэв Л/яД::к и jA ДНК +■ ~ft<X). Кинетические кривы? кодексов ДНК с ионами 1'агнин(!1), ко5альта(!1), меди(П) и ц.пи;а(П) аеполагаится между этими гсрчвь!\к .Кинетические кривые на fie. 6

ривецены в коо} пинатр.-: /fMe-Mtjj\i t

,гд,:

-виемя

есорб1$ии

•Jn IHIK

innc

tju DíjK * ?e í"i)

, £ -'.оси

X - ь сек

Г:.с.6. Кривые ккнн-тикл десорбции воды с образцов ДНК и комплекса ДИКч- Уе Cili) (состава 4:1) в твердом состоянии, уз-лажнетллс прч 92 „ 5% относительной вл.г*-

норлл.

- -

Как видно из рис.в, уравнению Ленгмара

о)

подчиняются только начальные участки кривых. Из етих участков методом наименьших квадратов определены константы скорости десорбции Кд, значения которых даны в таблице 5.

Таблица 5

Данные по сорбции, десорбции и кинетике десорбции воды с чА/аДИК в комплексе с ионами металлов, увлажнен ых в равновесных условиях пли t = 25°С и о.в. 9^,5$

Ионы Сорбция* Остаточн.чя сорбция, Константа сковости _Мводы/Мпар__М воды/ tf пар десорбции, с tcIO

Без М(П) 40,4 2,4 3,28

JJLni«} 52,4 5,4 2,66

3-сО») 77,6 16,4 2,48

Сс(п) 44,8 3,2 2,82

Си-С") 44,8 2,8 2,73

Ы 46.2_ 3.6_^85_

* Ошибки в определении ведичин сорбции и остаточной сорбции равны 5 и 1056, соответственно.

Анализ данных таблицы 5 показывает хорошую сходимость результатов по сорбции воды молекулами .А&ДНК (~40 молекул воды на пару нуклеотедов) с данными Фалка и сотр. (1962). Кроме от о го видно, что ионы металлов увеличивает адсорбцию воды и уменьшают скорость десорбции ее с образцов этих комплексов.

Исследование кинетик- десорбции показывает, что при десорбции большого количества воды (30-ЭД6) она подчиняется закону Лэнгмюра. Константа скорости десорбции кд, в свою середь, в случае реакции первого порядка, равна

1\де у„- предэкспоненциальный множитель (фактор), энергия активации десорбции. Если принять Ув «=

(обратная величина времени молекулярного колебания - 10"*® - 10~^с), то для £3 получим 21,4 ккал/моль воды в случае десорбции зоды с Л'а ДНК. Так как = Е«. + ф , где /^-енергия

активации адсорбции, а <р - теплота адсорбции, то таплота адсорбции воды на поверхности Л'ЬсДНК при температуре 20°С

равна как кнниыуы 21,4 ккал/коль води при условия, что данная адсорбция но является активированной

Итак, впервые для определения энергии гидратации биоподн-кэров предложен кинетический метод УВЧ нндупти:но-связанной плазпониженного давления в качестве оптического источника света в атомно-омисс: онном анализе по водороду водяного пара, десорбированного с их поверхности.

Энергетику связывания газов и паров не обязательно изучать в изотермической режиме. В раде случаев удобнее исследовать десорбцию в рехиие так назысаеыой флеш-десорбции, особенно, когда изучается гидратация при низких относительных вяаяноетях. В этом случае роль газового вентиля играет тешература настолько низкая, чтобы практически исключить десорбцию до опыта, т.е. сделать десорбцию сравнимой о фоном.

На рис.7 представлен спектр флеш-дееорбции воды с Л/я ДНК, увлажненной в равновесных условиях при температуре 25°С и о.в. 92,(0,84 г воды на г ДНК). На атог: спектре, также как и на изотермической привой десорбция хорошо заветна гетерогенность гидрятной води ДНК.

Рис.7, Спектр флеш-де-сорбцгга воды с ^«ДНК, увлажненной в равновесных условиях при 92,5% о.в. (0,84г 1^0 на г сухого вещества)

Т'с

Дри постоянной скорости нагрева образца Т-Т0 скорость десорбции в реаиме флеш-десорбции описывается выражением

с( М^/ЫЬ = /ЯТ). (Ме-Мг)™(5) •

где обозначения прежние, а т -порядок реакции десорбции. Вычисленная энергия активации для Т » 273°К и при условии, что ГП =1» оказалась равна £_ »19,5 ккал/моль. Эта величина в

-й

хорозем согласии с «21,4 ккал/иоль, вычисленной из уравне-

ния (4) для изотермической кинетики десорбции.

Особо стоит отметить, что метод флеш-десорбции впервые применен для исследования гидратации ДНК.

Глава 4. Структурные исследования комплексов ДНК с ионами

переходных металлов методами спектрофотомзтрии в области 220 - 900 ни

Спектры поглощения кашхлексов ''оСк), и Си. (и) с ДНК

видимой и ближней ИК об л гостях спектра. Эл е ктро нн ая сп е ктро с к о-гшя в видимой и ближней ИК-ойласти спектра, широко распространенная в химии неорганических соединений, практически не была использована для изучения взаимодействий ионов переходные металлов (¿-»(А - переходы) с нуклеиновыми кислотам и их ыодельныъш соеди-ненигом. Одна из причин - относительно слабое взаимодействие ионии а этими лигаедаии, нося-цее в основном внеинесфгрныЯ характер, с. «акжо плохая раетьоршмегь ДНК и нуклаотидов.Иегмо^ря на этч ограничения, использование кювет с длиной оптического хода в Ь-10 сы, а также тщательность в приготовлении образцов позволяет регистрировать поглощения Со00.» ^ ('О Си (и] с ДНК и нуклео-тццами и с успехом применять эти данные для исследования структуры комплексов, расчета количеств внутрнсфорных комплексов и химического выхода ¡лециШ при ее восстановлении в комплексе медь - ДНК. На рис. в и 9 предстивленц егшдтры поглощения Со (и) а (>>1 с ДНК и так же для сравнения даны спектры икьькс^ллекеов Со ("/и Л/; (и). Положение полос поглошеннл Со (нг0)£* и .Л/','(н2 С))* ' остеется неизменный, наблюдается небольшое изменение интенсивно-оти (на Ю-20С), чго свидетельствует о ьнеьнесфорноы связывании гексаакваионов £>("/ иЛЛ(///с ДНК.

Как известно, а центросимнетрпчкых коьыкексах и, в частности, октаэдрических, все с- переходы запрещены. не ке-нее, комплексы многих ионов переходной группы окрашены. Нрнчи-ний пвлягтея статическое и динамическое снятие цзнтра синиег-рик, понижающее группу симметрии, Поскольку в приолиженил Ьориа-Онпенгеймера полная волновая функция электрона в ирлаку/. рной системе может быть разложена на електроннуы, колебательную и вращательную, то электронно-колебательное в*<чшюдейогвив в ¡¡.гн -трошшметри'шмх молекулах- авитг-я основным механизмом, когорци

нарушает прасило отбора по четности. Чем про'гиее ссязшзангя комплексов, тем больше это взаимодействие.

Со"-ПНК

Рис.8. Спекгри Со(нго)год1?

б

и в растворе с ДНК из молок лосося. Отношение [Со (»)]/(? Н К] = 0,17. Концентрация ДНК 4,4«1(П';

Спектры гарегистрпч-ванн в 10 см кюветах.

Рис.9. Спектры поглощения .'/./»')' и его комплекса с тинуеной ДНК в видимой области спектра, Кои-центрами: Л/, 0') - 0,6x10"'' ДНК - ¿ПхЮ^ЖР); ь

Ю""3^. Спектры эарегистрирсряни

еоо гпо боо

в 5 см кварцр ¡ответах.

¿0000 2БООО ?21>0Я 160011 1^000

^(см"1)

Ион Си. [и) , п отличив от Со(н) и И/'('/^ ,силыю искажен тетрагонально из за эффекта Яна - Теллера. С увеличением тетрагонального искажения электронный переходы (огибающая пшро-кой полосы з ближней ¡й области) сдвигвятся в коротковолновую область спектра. Ион Сч(н2о)^' пикет параметр тетрагональности Т - 0,86-0,9(ГеЛли м Палмер, 1972). В частности, замещение молекул вошг в Си(нго}£* на Солее сильнее лигалды, например, амины, приводит к коротковолновое едгнгу основной полосы поглощения, и зависимость этого сдвига от теплоты обратосамия нового комплекса р поде пфакавтея прямой линией для различных аминов (■Г^рицпи, 1976).

Cu+* - DHK

v Ршг.Ю. Спектры поглощения с* М6Ч

^ и его комплексов о ДНК из полок

доеося. Отношение Си(На0)ь „ 0,31. Концентрация ДНК равна ч. ЗхЮ~3И; концентрация J*/а UL -

2х10~*М. Спектры рвгистркровались в 10 см кюветах.

i , , . . i . , . . i . . . . i-«-

бао 700 sai

А(нм)

Из рис.10 видно, что связывание ДНК с Cu.(nj ведет к коротковолновому сдвигу максимума полосы поглощения Си (Н7 0)1* на 35 ни или 600 си"1 и и значительно^ увеяичаниэ интенсивности полосы поглощения последнего. Взаимодействие тицусной ДНК с вкзизает значительно меньший сдвиг полосы поглощения - вс.зго £00 см"*. Отметим, что замещение одной молекулы воды в аквакош-декса Си(«) на МН3 группу вызывает коротковолновый сдвиг в i000 см"1.

Ультрафиолетовая дифференциальная спектроскопия взаимодействий ДНК с конами металлов. Изучено как ионы металлов - однозарядные и двузарядные, к тому се разные по своим свойствам, влияет на спектры поглощения ДНК в области 220-320 ни. Ввиду значительно больших возможностей ( хорошо разрешенные интенсивные переходы в ближней УФ области) бшо подробно исследовано влияние на ДНК не только широкого класса ионов металлов, но и влияние иг концентраций i нокной силы, нук*еотвдного состава и лигандного 01фукения кона. В этом же разделе дана интерпретация спектральных измен чий полос поглощения ДНК, вызванных июиыодейотвием ионов с ДНК.

На рис. II приведены ультрафиолетовые дифференциальные ле-ктры (УП,С) ДНК, вызванные дойствием JJ3¿u) ,Мп(н/ , Со О'} и ¿n ji¡. Ан лйз этих УДС позволяет сделать вывод, чго они различается лишь по велиегше, но не по xapc.Ki.spy. Эти ноны, взшшо-

.2

t

<с

действуя с ДНИ,вызывают в основном сдвиг полосы поглощения в длинноволновую область. Это и небольшие изменения интенсивности спектров поглощения СоСнго)1+ и при ксмллексо-

образовании с ДНК указывает на то,что ,О>0>) ,

М<Сн) и 2г.О'1 взаимодействуют с азотистыми основаниями через молекулу воды. Таким образом, причину вызываемых ими спектральных изменений полосы поглощения ДНК можно свести к эффекту Н-связи, точнее- эффекту изменения Н-связи молекул воды, связанных с основаниями.

.и

<с

01

-.«2

А(нм)

2Ю . . гри . Ц 0 , 300

/М")

- „ - (П)

/ ' /

- V

/ / / у —

\\А ч

\ \ч \ \

\ * \ ч у ¿ыхкГ Хси"

цооо «гОООО 52000

2?0

?40

.в г

1о

-.01

-.01

?60 ?,г0 }М Л (им)

' >А|0>

ьто 4вс® ььооо «ооо

Рис.II. УДС между комплексами ДНК Р:;сД2. УЯС между кошлакса-

II. г .л/„) ¡¿и днк (I)Си(ч) , гл= о,2Ь,

с ионами (Н , Со (.") ,ил (»;, = 0 _м ( п/ки]= 0,01М;

0,25 иона на нуклеотвд 2)Ы(<) , ^гt = О Л, [ДНК)*0,0<10М ДНК) и ДНК в отсутствии иона. Кон- = 0 01 Ы аскороиновак

„ „ пит, т тп-^н кислота 2:1 к|Си(ну: 3) ,

центрами: 2,0x10"% ДНК; ЬсЮ^М ^ 0.О0С1

^/лОс 0,005 м)и ДНК в отсутствии иона

Красное смещение полосы поглощения указывает на то, что Н-связь с молекулой в возбужденном состоянии усиливается по сравнению с основным состоянием, т.е. электроны неподеленной пары атома азота пиридинного типа .У(7) становятся более доступными для участия в Н-связывании. Это понятно, поскольку в несвязыва-вщем состоянии 77* на периферических частях молекулы увеличивается электронная плотность. Величина сдвига л\) должная быть пропорциональна электронному сродству £а иона, так пак чем больие это сродство, тем больше протонодонорная способность ах-ваиона и тем больше энергия взаимодействия иона с ДНК, а это, в свою очередь, приведет к увеличению • Таким образом, должна

I

2а -

быть корреляция иеад величинами и 13а . Определенная паки (Брегадзе,1930) для вод1ак рктворо.. гонов с^- дство к электрону как ' есть изменение стандартной свободной анергии ре-

ш гцзрат^ваякого електрона е акцептором в растворе. В своп очзродь, йСй согласно теории Маркуаа, связано со свободно."» енер-глсГ аетиьгрпз к, соответственно,с константой скорода реак-гон; гвдратированного £лектрона . Таблица б иллострирует

пргауо корреляцию кекду величинами & f и ке- . Как видно из таблица, эти взаимодействия не ограничивается Н-связьи и к: ыохнэ распространить на олектронно-донорно-акцепторкыз взаимодействия вэобцз. Всдкг.г.ш д\1 удобно спрздвлятъ из УДС. В хороша:: приближении величина частого сдвига дУ н ût связаны ыезду собой

Кфа-петаеы & (\j) ~ d Ъ (\J)/di V - . В таблице 6 приведены

+

I te/dV^^} , где

и*.

величины fiVs рассчитанные как £])= дё$ ¡ ск ¿/ci ^

Таблица 6

Корреляции наяду ьелкчм*аш спектральных сдвигов полос поглс^еь/.п тюусной ДНК. л у и константацк скоростей гкдратированного электрона к£- с ионами металлов для =1

Кс:п

ау\ сы"х

¿V ,ккал/и

К'«.;,

Магний(П)

Марганец(П)

Коиальт(П)

Нкка&ьШ)

Кздь(П)

Недь(1)

фих(П)

Г,аребро(I)

40 230 370 470 640 4500 300 3100

0,12 0,65 1,1 1,35 1,80 13 0,8 8,9

, моль /с

7,7x10 I,2xI010 2,2xI010 3,0хЮ10

1,0x10' 3,6x10

10

Анализ УДС ДНК с ионами Cu(n J , Cu(i) , С>) . представленных на рноД2 показывает, "iro наряду со спектральным декнново^яов5ы сдвигом '640-450' см""*) наблодаетск изменение в полосе поглощения в области 2d0 tu, что наряду с коротковолновш едьигоц в спектре Си (Н20)^-ДНК (d-cf - переходы) указывает на непоер-дственноо взаимодействие ионо с основаниями ДНК.

Для исследове ¡шх в работа ионов iарак ер концентрационной »авиогьчости в интервале от 0,02 до 2-4 моляиоиа на моль ДНК, п -ка-ывает, что только нячалький ее участок ( X £ 0,25) можно ин-

терпретировать как участок с независимыми места).«! связывания. В целом кривые зависимостей свидетельствуют об антикооперативном характере связывания ионов металлов с ДНК.

На примере ионов ЛЛ'С") изучено влияние лигг дно го окружения на УДС ДНК. Показано, что замена двух иоле кул воды в цис-полояв-нии в плоскости ху з комплексе Л"«хелатным ли-гандом этилендиамидэм уменьшает УДС ДНК в 2 раза. Замене осталь-с ных молекул воды в цис-транс-„V;[(ел)^ -риводит к р экому уменьшению УДС ДНК. Это указывает на то, что М>(ч) с октаэдрическим окружением лигандов взаимодействует с ДНК двумя вершинами в плоскости .

Исследовано также влияние ионной силы на УДС ДНК, вызванные действием ионов М(П). Характер и величина зависимости которой несошенно говорят о наличии хелатных комплексов ионов !1(П) с ДНК типа "азотистое основание- фосфатная группа".

Влияние ГЧ-содсржания на УДС ДНК с иенами металлов было исследовано на пример» взаимодействия ионов СоО'/ ,к//Цч) • , и2к(»| с ДНК. Наиболее подробно было изучено взаимодействие М1ч) с ДНК из , колок лосося, тимуса теленка, иыаеЯ линии СЗНА,

¿ис/.ит рег/и'*}«.*: и полио((Л-Т]• сф-Т), в таблице 7 приведены значения Д^ в пересчете на моль иона на моль ДНК при ионной силе 0,02 М Л/« С£ .

Таблица 7

Влияние ГЦ-содержания на величину УДС ДНК с

ъ. со (л (5Ш Молоя лосося (4455) Тимус те-ленка(40$) СЗНА ^л^'^ГПоли л (Л -V (27%) сА(А -т)

1420 1040 880 /20 400 не обнаружено

Из таблицы следует, что чем больше в ДНК ГЦ-пар, тем сильнее воздействие иона М(П) на спектр ДНК. Необходимо отметить отсутствие линейности между ГЦ-содертанием в ДНК и величиноГ УДС, вызываемой М(П). Отсутствие заметного УДС для поли с((А-т) ■ <1 (А-т) с ионом ^С") укрывает на то, что ионы Л/.(и) из за относительно высокой концентрации С С, не могут взаимодействовать с азотистыми основаниями полинуклеотида со стороны малой бороздки,что же касается 01/(7) аденина в главном желобке, то взаимодействия с этим атомом мешает Л/Н, группа аденина при С(6). Таким сб-

разом, на цргаере ионов исследованные ионы М(П) будут вза-

имодействовать с азотистыми основаниями ДНК со стороаы главного желобка и в основном с ,ЛМ7) гуанина.

Достаточно сильно отличаются друг от друга УДС двух близких по ГЦ-содержанию ДНК - из тимусе, теленка и печени мышей линии СЗНА. Это несомненно указывает на то, что при взаимодействии L1СГ1> играет роль первичная структура ДНК. Известно, что обе эти ДНК содержат сателитные участки, обогащенные в первом случае ГЦ, а во втором - АТ-парами.

Глава 5. Природа взаимодействия ДНК с ионами металлов

Взаимодействие Сц(') с ДНК. Кинетические исследования и р-кергеткка связывания. Для более глубокого понимания природы вза~ киодзйствий ионов металлов с ДНК необходимо исследовать один и çot rie ион в разные степенях окисления. Для этой цели наиболее подходящей является медь, для которой как двузарядное, так и однозарядное состояние является относительно стабильным, по крайней мзре с ДНК. Однозарядное состояние меди в комплексах £*С»ЩНК достигалось гамма-облучением (^Сс ) или действием аскорбиновой кислоты. Кинетика окисления регистрировалась спектрофотометри-чески в области 800 км {ct—oí.-переходы). Опыты с использованием аскорбиновой кислоты показывают, что процесс окисления 0>. 1>) до Cu(li) в комплексе с ДНК протекает в два этапа с константами скоростей, отличающимися друг от друга на 2 порядка: Kj=2,9x 10 л/Мс и К2»5,ЗхЮ~®лА(с. Вторая константа близка по значении к величине Kg. которая наблюдается в экспериментах с галша-об-лучением (кз=8,2х 10~°лДс). Отметим, что условия эксперимента позволяли проводить измерения реакции с гамма-облучением через 10 мин после окончания облучения. Необходимо отметить также, что в отсутствие ДНК окисление Cu(l)до Сд(и)протекает настолько быстро, что обычной спектрофотометрией это зарегистрировать невозможно, что говорит о том, что ДНК, взаимодействуя с ионами Cu(ij, обладает способность замедлять з;от процесс. Когкно предположить, что на первом атапе происходит окисление Cu(i), связанной с поверхностью ДНК внутрисферно, а на второ«-окисление црочносвязаннсй меди, например, между цепями ДНК.

Изучение кинетики реакции окисления Си. О) до Си(.и) в комплексе Си(и)-ДНК позволяет определить прочность с дзи Culi) с ДНК.

Процесс окисления OtO) до (м(ч) ,адсорбированного поверхностью, в частности ДНИ, можно представить как дееорбшгаCuOJe ДНК (локализованная адсорбция - перемещение адеорбата как результат десорб-пии и повторной адсорбции), затем быстрое окисление в отсутствии ДНК СиМ* до См(Нг0)/" и уже потом адсорбция Си (и) на ДНК. По существу, речь вдет об открытой системе и такое представление этого процесса ничем не отличается от десорбции пара или газа с поверхности твердых тел в методе флет-десорбции. Для случая изотермической десорбции можно воспользоваться уравнением ч = уо е где к - константа скорости окисления Си 10 до Си С") , -энергия активации десорбции Cu(i) с ДНК, \!с - предэкспоиенци-альный фактор равный Ю^с"^ (величина обратная Бремени релаксации вращательного и трансляционного движения талекул роды в растворах). Дяя трех значений констант Kj, Rq и кз £д. .вычисленное из ( 6 ) равны: =20,5 кквл/И, Ег?=22,9 гагал/М; =22,6 ккал/М. Теплоты адсорбции ионов ItxO) на ДНК равна как минимум Ç, » 20,5 ккал/М, 22,9 ккал/ii и Q3>, 22,6 ккал/М при условии, что данная адсорбция не яатяется активированной.

Двойственный характер действия ионов M СП) на терт.тостабиль-ность двойной спирали ДНК в растворе. Интерпретация. Из серии двухвалентных ионов JKj (и), Л1ПЫ > Со (") , «ЛЛ O'j » Cu.(mJji

(tij только JUj.0'1» Co(.nj я JVil'i) увеличивают термостабильнсеть двойной спирали ДНК (Эйхгорн и ILjîh,I968). Ис:ш JJ^Oi Cul») в небольших концентрациях также вызывают увеличение теряистаби-льности, а затем при дальнейшем увеличении их концентраций уменьшают ее. По этому свойству эти ионы располагаются в ряд Си(.»)> 2ь(и)> >,Д»\(и|. С црлыо объяснения этого странного поведения ионов были исследованы рН растворов этих ионов с ДНК и без нее. Прецизионные измерения рН позволили зарегистрировать увеличение £н л 0 при растворении ионов М(П) при нейтральных рН=б,72, Ионы исследованных М(П) по этому свойству располагаются в следующий ряд: Си.(п)>1'л(,|)> > JU« 00 > Со C"i ~ Mi (.'О > JU^(k) в такой *е как по степени их воздействия на териестабильность ДНК,

Воздействия ионов .М(П) на термостабильность ДШ (концентрационная зависимость температуры плавления) заключается в том, что îîohiiT ;.!(П), растворяясь и образуя комплексы с ДНК, протониру-вт раствор и так как водя r гидраташонной модели Дикерсона

(1982,1934) стабилизирует двойную спираль ДНК продольными связями (скрепками), что любая лани 1ьная донорно-акцвпторная связь с теми группами ДНК приведет к ослаблению гидратации ДНК, а поскольку протон (ион гидроксония Н1о») не может быть скрепкой из за которкоро времени жизни Т =2хЮ""13о (в отличив от комплексов М(П)), время жизни интересующих нас акваионов НГ'-НГ^с, про-тонирование приведет к снижению термостабильности двойной спирали. Стабилизирующее действие большинства ионов М(П) (поперечные хелатные комплексы- комплексы типа "основание-фосфатная группа" комплементарного основания) не должно сильно зависеть от типа ионов. Различное действие на термостабильность ДНК в основном будет определяться способностью этих ионов протонировать раствор. Другими словами, цротон, взаимодействуя с ДНК, будет ускорять обмен гидратной воды, что приведет к ослаблению стабилизирующего действия воды, т.е. протоны сократят цремя пребывания моленул воды в роли "скрепок". Кроме того, в силу высокой подвижности протона, его адсорбция на ДНК будет относиться к подвижной, размазанной по поверхности ДНК, что,конечно, также будет ускорять обмен гидратной воды. В отличие от этого типа адсорбции, адсорбция ионов М(П) является локализованной дискретной, т.е. адсорбированные ионы в этом случае перемещаются с одного центра на другой исключительно а результате десорбции и только затем повторной адсорбции. Особо следует отметить, «го отличие между этими ведами адсорбции имеет глубокую физическую природу. Б подвижной адсорбции адсорбат ведет себя как двумерный газ,если, конечно, поверхность однородна. В случае ДНК-подвикная безбарьерная адсорбция протона может быть и одномерной, если подвижность протона вдоль по желобкам будет значительно превосходить подвижность поперек двойной спирали.

Последствия взаимодействия ионов с ДНК. Действие ионов металлов на ДНК связано,с одной стороны, с энергетикой, структурой и природой этих комплексов, а с другой - с характерными продолжительностями времен для внутренней подвижности ДНК и ее Груш. Цохнэ постулировать, что время жизни комплексов т.е. время нахождения ионов и ДНК в комплексе, должно быть соизмеримо или больше характерного времени тех или иных движений ДНК(колебание небольшие групп атомов, раскручивание двойной спирали, раскрытие отделшых пар оснований, расплетание спирали свя- -

зывание белков и, наконец, деление клетки). Эти движения характеризуются временами от 1СГ1 в до нескольких секунд и более. Было показано, что ионы первого пфеходного ряда, такие как JJLkO^ Св(и), jM") , Cul») и , а также ионы Cufi) nj<j0) взаимодейетчу-

ют с ДНК в растворе, образуя значительное многообразие внутрисфе-рных, внешнесферных и атмосферных комплексов. Внутрисферно и внешне сферн о ионы будут взаимодействовать с ДНК в основной хелатно со стороны главного нелобка о J/(7) гуанина и атомом кислорода фосфатной группы как своего цуклеотвда, так и нуклеотида иошле-ментарного ему. В общем случае, равновесие меаду комплексами будет зависеть от ионной силы, ГЦ-состава, концентрации, типа иона и его заряда. Кроме того исследования взаимодействия ионов Cu(i) с ДНК методами УДС, тушения флюоресценции этвдия бромида, интер-калированного в ДНК, кинетики окисления Cu(i) вСи.(»)(две стадии), а тагосе слабая зависимость силы взаимодействия от ионной силы, привели к прямоцу подтверждению, что этот ион может образовывать два типа комплексов: первый-хелат л/(7)-0(6) гуанина, второй -между гуанином и комплементарным ецу цитозигам.

Взаимодействие ионов металлов с атомами кислорода фосфатной группы приведет к ослаблению фосфодиэфирной связи, а это, в свою очередь, будет облегчать однонитевые разрывы и"кинкиу что в той или иной степени подтверждает. ;я вискоэиметрическими измерениями комплексов ДНК-М(П).

Многообразие комплексов с определенной вероятностью приведет к различным таутомерным изменениям гуанина, наиболее интересным с точки зрения дефектов двойной спирали ДНК является превращение атомов jV(9) и ЛЛI) пуринов в азоты пиридинного типа. Первое способно ослабить и вызвать разрыв глюкоэидной связи -да-пуринизацию; второе - сделает гуанин неузнаваемым для цитозина (Иванов и Минченкова,1967), что, в свою очередь может привести к точковой мутации транзиции (Андроникашвили и ¿скпова, 1982).

Обсудим это подробнее. В самом деле, разрыву глюкоэидной связи в ДНК должны способствовать внутрксфернке взаимодействия ионов гидроксония и металлов именно с атомами азота пиридинного типа yN(7) и J/(3) пуринов, неподеленные электронные пары которых находятся на s р1 гибридной орбитали. Однако в пириюадинннх ДНК доступны атаке лишь 0(2) и 0(4) тимина и 0(2) цитозина, т.е.

атомы, находящиеся вне ароматических колец и, к тоцу ие, имеющие по две неподеленкые пары. Выше было показано, что из исследованных нами ионов с большей вероятностью могут взаимодействовать внугриеферно с эзотистыш основаниями ионы Hi0t, Cu(11 ]» к-AjOj. Ноны (ub) v-jiji'}предпочитают взаимодействоьать внутрисфер-но между тяжа;« ДНК, в то время как ионы H,0tи Gu(uj будут связываться с J/(7) и Jj{3) пуринов. В силу стерическкх препятствий невозможны взаимодейс1вид с J/(3) гуанина и J/(7) аден«па. Поскольку Л'(З) вденина находится на дне шнорного келобка, то ввиду его узости с avirn атомом смогут взаимодействовать лкдь пони способниз к вцутрксферному взаимодействию, с налеа случае HjQ*H Cu(it). Эти ионы и должны в осноенои вызывать депуринизаци»{ чаще деаденкзацив, таи как адекин значительно слабее связан с ткдиоы (энергия разрыва 5,6 ккалДО нежели гуанин с цнтозиноц (19,2 ккал/М). Црозсо этого для двузаредных ионов переходных иа-таллов в растворах характерна протоно-донорная способность гк-дратцровалной ими воды и по этому свойству ионы располагаются в следующий ряд См (и) > > ДиЫ ь Со Ы ~ -Л/с 1ч) >

Как известно, необходимы условием для трансформации клетс:: ' является ц/тация оснований в ДНК, например, точкоьая для онкогена tas . Но для того, чтобы эта ьутация была закреплена необходимо, в свою очередь, чтобы репарирунцая система не могла восстановить первичную структуру ДНК. С другой стороны, cu vltzo коны мгталлов способны вызвать нарушение электронных структур азотистых оснований лишь в том случае, если взаимодействие ионоь с ДНК будет приводить к образованию сильных комплексов, т.е. комплексов с большим временем ензнн. Но в жестких условиях существования и функционирования ДНК I* v^vo (0,1511 однозарядного катиона) сильный комплекс с ней цо.иет образовываться в результате взаимодействия мягкого иона (иона, предпочитающего ковалентноо связывание) с основанием ДНЙ.

Возможность мягкого взаимодействия ионов металлов с ДНК vr-íCT бшь проиллюстрирована на примере восстановления См (.к) до СаСО в ее комплексах с ДНК. Как бшо показано, ионы Ы.»)в боль-иэГ, степени образуют внешесферные комплексы с ДНК и преимущественно с гуанином и лишь на 15-20$ внутриеферные, придам как с J/(7) гуанина, тек к с- W(3) гучмя-.иа. При восстановлении Си.С») до iixb), например, аскорбиновой кислотой, УФ ил.. гамуа-облучением, вместо указанны* комплексов будем иметь ,А/(?) -(НС-) yar.vx и ¡-и-

корлорированный (солюбилизованннй) между tots;.™ ДНК комплекс гуанина-Си О)- ^(З)цитозина. Такое хелатирование гуанина сделает его по J/(I) подобным адекину, что, в своп очередь, дол-дно привести к точковой мутации - замене • комтлс. :еа гуан!ш-медь (I) на аденин, т.е. к транзиции. Стоит особо ответить, что инкорпорированный комплекс со значительно большей вероятностью приведет к транзиции (время жизни комплексов Ю^с).

Кром этого инкорпорированный комплекс Г-медь(1)-Ц в силу высокого зна ения рКМб приведет я образовшгаа ссивяи кеаду rro?j— плементарными цеп таи ДНК и с определенной вероятность*) к точковой мутации - делеции.

В дополнение к сказанному отметим, что в координационной химии существует явление симбиоза, закяочазцесся в том, что элпктроннодонорная группа, с большой поляризуемостью координируясь с ионом металла переходного ряда,делает его более нягяим. Например, ион никеля(П) в соединении с J/i .который находится в мягком окружении может солябил^зироваться мягкими иииде-зольчыми группам! гкстидкновгос остатков белковой /¿олекулы я уио в мягком виде никель (П)-б елок образует скльнкЗ комплекс с ДНК (Ли и др.,1982). Наконзц, молекулы балка бурун играть сцэ и роль катализатор^ з связывании М(П) с ДНК, з особенности то, которко обладают зысоким сродством к ДНК.

Глава б. Применение импульсного плазменного скализя в кэдици.чскнх исследованиях.

В этой главе описывается новый способ измерения меди в сыворотке периферийной крови человека (3-5 ьсся), который позвоги провести систематическое экспрессное исследование тай называемых практически здоровых ляд ей (~700 чел.), проходиЕгнх диспансеризацию в поликлинике АН ПХР. Найдена пркглл корреляция между содержанием меди в сыворотке крови и С.О.Э., что позволяет выявить фактор риска. Изучено содержание меди о сыворотке периферийноЯ крови людей больных острым лш.фэлейяозом, Найдено хорошо заметное различие в содержании меди ( X «1,9+ 0,2:гаг/ш) у больных острым лейкозом по сравнении с донорами ( 7 =1,34+ 0,22 мкг/кл). Исследованы р&ефрахционироваьные образе! сыворотки крови донора и человека, больного лимфогрануломатозом. Показано, что у доноров 09% всей меди в сыворотке связано с цзрулдоплазмином, что

е хорошем согласии с литератур.гоми данными, а у больного лиьфо-х'ра-чуломатозом - только 69% и ого несмотря на общее повышение уровня церуллоплазмина у больного.

Данные этих исследований могут иметь диагностическую ценность при эпидемиологических и клинических обследованиях пациентов.

ВЫВОДЫ

1. Разработано и создано 2 типа высокочувствительных: атом-но-эыиссионних спектрометра, использующих УВЧ индуктивно -свя-заннуи плазцу (ИСП) пониженного давления в качестве оптического источника света, а именно:

- импульсный спектрометр для элементного микроанализа растворов биологических иолекул (3--5 ыкл) с пределом обнаружения jq~IO _ ю-12 г по абсолютной величине;

- прецизионный спектрометр для кинетических исследований десорбции паров б оды с образцов биологического происхождения.

2. Разработана методика, сочетающая размоьесный диализ и высокую чувствительность импульсного УВЧ плазменного эмиссионного анализа для получения изотерм адсорбций деузарядных ионой металлов первого переходного ряда на биомакромолекулах в разбавленных растворах с целью изучения энергетики комплексообра-зованмя. Исследован нелинейный характер этих изотерм адсорбции. Изучено влияние ионной силы, ГЦ-ссстава, гистонового кора на энергетику связывания ионов металлов с ДНК. Определены термодинамические константы связывания ДНК из тицуса теленка и константы связывания мснокуклеосом из печени мьшей линии СЗНА а 0,01 И растворе J/aCi с ионами Со(и), vA/V(n) , СмСч] и iwO^, рК которых равны для ДНК: 5,22; 5,56; 5,77; 5,14; для ыоконуклеосом - 3,90; 3,99; 4,15; 3,88, соответственно.

3. Предложен кинетический метод УВЧ ИСП атомно-омиссионного анализа дееорбнрованного водяного пара по водороду с увлажнению образцов ДНК, хроматина и металлокомллексов ДНК в изотермическом режима и режиме флеш-десорбцли для определения энергетики гидратации биополимеров. Энергия активации десорбции воды Eg. вычисленная из изотермической кинетической кривой равна 21,4 ккал/М воды. Определено количество связанной воды и Е& для рествори-мого хроматина печени мшей линии СЗНА, которое равно 1,25г Нг0

на 1г сухого веса и 22,5 хкал/М, соответственно.

4. Изучена структура комплексов ионов Co(ti),.M (и) и lu(.u)c ДНК методом абсорбционной спектрофотометрни в видимой и ближней ИК областях спектра (d—d -переходы). Показано, что в комплексах сохраняется октаэдрическая симметрия, а в «yiytae СоО') и сохраняется такие и окружение.

5. Исследованы методические особенности ультрафиолетовой дифференциальной спектроскопии (УДС) для энергетической и структурной характеристик спектральных изменений полос поглощения ДНК, вызванных ее взаимодействием с исчами металлов. Методом УДС изучено влияние различных факторов на взаимодействие ионов металлов с ДНК, в частности, нуклеотидного состава и его последовательном. ., ионной силы, поляризуемости иона, его заряда

и лигавдного окружения, а также диэлектрической приницаемости среды. Показано, что причиной вызываемых ионами JA^lu) , JU.n(.nJi G>li>) » спектральных изменений полосы поглощения

ДНК является эффект Н-связи (сдвиг полосы поглощения в длинноволновую область на 40-470 см ), т.е. они взаимодействуют с азотистыми основаниями через молекулу воды. Напротив, поны 0x0'), Cut') nJJjli) с определенной вероятностью взаимодействует с основаниями ДНК (длинноволновый сдвиг на 640-4500 см~* и изменение интенсивности в области 36000 см"*).

6. Изучены спектры поглощения и флюоресценции этмдия бромида (ЗБ) и акридинового оранжевого (АО), ¡штеркопированных в комплексе ДНК с ионами металлов, при различных концентрациях красителей, ионов металлов и ионных силах. Обнаружено явление тушения флюоресценции интеркалированного в ДНК ЗБ и АО ионами СмЛО I' ^s(') I что объясняется переносом электрона от красителя к иону инкорпорированному между тяжами ДНК.

7. ИсследоЕана кинетика окисления СиС') до СдСи) . Найдено, что ДНК обладает способностью сильно замедлять этот процесс. Показано, что представление процесса окисления Си.(•') до (м1<>) в комплексе с ДНК как десорбции СыСО с ДНК в раствор с последующ!™ быстрым окислениемOx(i)доСи(н/позволяет определять энергию активации десорбции с использованием констант скоростей реакции. Определенная таким образом энергия взаимодействия равна, как минимум, 20ккат/М , что прегюсходит энтальпию плавления ДНК на пару ocHOBainifi. Исследовано действие УО облучения на комплексы

- за -

ДНК-.Си(и] методом УДС. Показано, что УФ облучение приводит к практически необратимому переходу Си_0>; в Си(|) с квантовым выходом 0,2+0,04.

В. Мзтрдаш видимой и ультрафиолетовой дифференциальной спектроскопии 1.огло;дения и равновесного диализа показано, что действие ¿юна мсл'&ллов п:. ДНК связано, с одной стороны, с энергетикой, структурой к природой йих коьаглексов, а с другой, с характерными 'Зреыенаш для внутренней подвижности ДНК и ее групп. Доказано, что многообразие со взаимодействии ионов металлов с ДНК приводит и ослаблен:«э фосфодйэфирных и гликозидных связей, нарушению ком-где.-гзатсрмости оснэвашй и, кек следствие, точковым цутицикы г;и-йй делещи и тргшзицяи.

9. Раз£&аотодиЗ способ определения олемзнтов в растворах, "^сгд'.сс шсо1;у;) иоицгтр&дос органики (например,сыворотки кро^-л) позволил вяерыэ пролети аутентическое изучение со-д^&н::« мс;;* г сы^орог-ке пери^еригной крови практически здоро-ьог ладей в условиях диспансер: эицди (около 700 чзл.) и обнару-4риск с псмс^ъэ ыогода импульсного УВЧ ИСП атошо-с-~»ссио;1нэго Еглсроишлиза, Црн изучении шифозлементного состава (¡^¿¡"цлй сивэротки крови показано увеличение в 3 раза "свободно;:" несвязанной с деруллондаомлюи меди в сыворотке креа: больного х.{у}огранулэаат?зок<. Найдено хорошо зсметное различие в содераь-г.ии ыеди в пери^.'р;и:аой крош большое острга ли>фзлейкозоц по сравнения с донорам. Д&иние етих исследований ыогтт явиться £.8ло..згательн1й! средством для дшдоюстаческнх цзлей при евидс-кюлогичееккх и клинически обследованиях пациентов.

Осноенгз результаты дизсергащш изложены в сведукдих цубяикацият:

В ' статей:

1.Брегздзо В,Г, Нохоторио мстодкч^зккз особенное?:: ультрсф;™ олйтогой Дк^еренц-^ьноЛ спектгоскогчл белков. Сообщения АН ГССР, т.о8, 3, 1970. с.701-704 ^

Й.Брегадзе В.Г, Интерпретация ультрафиолетовых дифференциальна спектров Д1К е цоьгплексв с гекоторыьа кокаин первого пьре-ходно.о радг:, Биофиаича, XIX, I, 1974. с.179-101

З.Брегадзе В.Г., Ефремова Ё.Ю. Спектры огяоцения комплексов ДНК с некоторым;? двухвелетим коками в сС;:асч.<, 220-900ни.В еб.

"Конфорулционные изменения биополимеров в растворах",Тбилиси, Мецниереба, 1975. с.98-105

A.Bregadze T.G., Gelagutaijhvili Е.З., Kharatishvili И.О. Electron opectroocopy of CIIA met&l complexes In solution In the range of 220-900ПШ. Studia biophysicn, Berlin, Band 67,1970. 3.25-26 and Microfiche 2/17-26

о.Брегадзе В.Г., Беспалова С.Н., Гелагуташвили Э.С. Ультра/фиолетовые дифференциальные спектры комплексов ДНК с металлами в растворе. Биофизика, Х1У, 4, 1979. с.749-751

6.Брегадзе В.Г., Харатилвили М.Г. Спектроскопическое исследование гамма-облученных комплексов меди (Г!) с ДНК. Биофизика, Ш, 4, 1980. с.615-617

7.Bregedze V.G. Nature of Ш1А Interaction with Cations: UV Spectroscopic Investigations and Marcos Theory. Inter,J. Quantum Chenistry, XVII,1960. p.1213-1219

8j3regadz6 V.G., Bezhieshvili О.И., Gelegutrahvili E.3. HP inductively coupled plasma spectrometry of ША metal ooriplexeo binding constants and water deaorption kinetics.St.bio.101,1984

Э.Брэгадзе В.Г. УБЧ-индуцированная плазменная эмиссионная спектрометрия. В кн.: "Ноше физические методы в биологических исследованиях", М., Наука, 1987. с.33—i5

10. Andronikaehvili E.L., Bregadze V.G., Honaselidze J.H~ ША and TJickelfll) Ions. Becueil des Travoux Chimiquea des Рауо-Вьз, 106/6-7, June/July, 1987, p.193

11.Гелагуташвили Э.С., Брегадэе В.Г. Константы устойчивости ионов Со(п|,Gui'i) и^-hinjc ДНК при различных ионных силах. Сообщения АН ГССР, т. 128, I, 1987. с.ИЗ-116

12 Andronicaahvili 'E.L. ,Bregadse V. 0. .I-'onnoelidze J.R.Inter-actions between nickel and DliAsConsiderations about the role of nickel in carcinogenesis. I^'Tetal Ions in Biologycal Systems", IT.Sigel jEd.T'arcel Decker Inc.W.Y., Basel, 23, 1988,p.331-357

13.Брегадзе В.Г., Гелагуталшили Э.С. Способ определения содержания меди в сыворотке крови. А.с. №1276989, Б.И., 46,1986.

В виде тезисов:

14.Брегадзе В.Г., Ефремова Е.Ю. Интерпретация ультрафиолетовых дифференциальна спектров ДНК, вызванных ,чТ взаимодействием. В сб.: ¡1 Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров", Харьков, 1974. с.15-17

15. Брегадзе В.Г., Ефремова E.L. Механизмы взаимодействия ДНК с JuU(ü) , Coi?;) , J/;U>) , UlO'} и2и(и) . в Всесоюзной конференции по спектроскопии Счополимеров", Харьков, 1974.с,I7™К

16.Брьгадзе В.Г., Харзткавили М.Г. Электронные спектра поглощения кокялекеоз двухвалентной кэди с ДНК, РНК и i «РНК. В сб. "Материалы Ш Всесоюзной конфзренц!ш по конфорыациошшс кзиоиа:-а:-г,л в растворах", Тбилиси, Мецшерсба, 1975. с.50-51

Г7.Брегедзе В.Г., Погребец^ая И.И., Хвратшскли М.Г. ние спектров поглощения коглшоксов Cxt'Oc ДНК под действием ионизирующего излучения. В ей.: "Материалы Ш Всесоюзной кон£оран-ц,ш по спектроскопии биополимеров", Харьков, 1977. с.19-20

186Брегадзэ В.Г. Природа взаимодействий ДНК с катионами. У§ ■щеятроскопическке исследования и теория Мар:суса. в сб. ^Международная конференция по ква,-ловой хишк, биологии и фараакото-гии", ¡{иев, т.З, 1978. е. 19

19.Брегадзз В.Г., ХаратишЕНли М.Г. ВьяокоцувствитеяыщЯ атоыно-эмкссионний спектроизтр с УВЧ-шхазьденкнм Еозбуэденио::. В сб. "Материалы Ь совещания по конфорцационшш измзненклзл бис-' полимеров в растворах", Телави, 1980. с. 151

20.Брегадзе В.Г., Гелагуташвили Э.С. Электронно-спектрос::о~ пические исследования взаимодействий красителей интеркалирсвол~ них в ДНК. В сЗ."Материалы У совещания по конформационнкм на-менениям биополимеров в растворах", Телави, 1980. с.125

21.Брегадзе В.Г., Цакадзе К.Д. Стабилизирующее и дестабилизирующее действие ионов двухвалентных металлов на двойную спираль ДНК. В сб."Материалы У всесоюзного совещания по информационным изменениям биополимеров в растворах", Телави, 1980. с.28

22. Bregodze V.O. .Oeleguteahvili E.S. , KherBtiShvili 13.0.Interactions of ШЛ with dyes end net el loos. Blectroa-epectrceco-plo etuüiea. In:"Symposiua oil bio-->iyBico of nucleic acids. Tallinn, 1981, p.181

23.Гелагуташ-или Э.С., Epeгадзс В.Г. Тушение фл„оресценции красителей интерполированных в ДНК ионами металлов, в сб."И всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров",Харьков, 198.. с.14С

24.Rperwisft В. Р. Примени ие УВЧ-индувдрованной эмиссионной

спектроскопии в биофизических ¡"еследованнлх. 3 сб. "Тезиен докладов пленарных лекций и сишозиалькых заседаний I веесоизно-го биофизического съезда",М., 1982. с.154

ЕБ.Брегадзе В.Г., Вардидэе Э.В., Гарибашвили Ч.И., Дкагарсв А.Г., Шрапштейн С.А. Сопряжение импульсного атомно-омиссионного и люминесцентного спектрометров с ЭВМ серии СМ. В сб."У всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров", Харьков,1984. с. 31-32

26.Андроникашвили Э.Л., Белокобильский А.И., Брегадзе В.Г., Гелагуталвили Э.С., Гинтури Э.Н. Анализ^ , Со , Ci , Те , Сч » 3:у\ , Cd и PI в образцах хроматина, выделенных из клеток ас-цш'ной ¿'enaTowi и печени кыяей линии СЗНА. Есб. "Материалы У1 всесоюзного симпозиума по конформационннм изменениям биополимеров в растворах", Тбилиси, 1985. с.171

27„Белокобыльский А.И., Брегадзе В.Г., Гелагуташвили Э.С. Изотермы адсорбции меди(П) на ДНК, выделенных из доброкачественной и злокачественной опухоли молечой яелезы человека. В гб. "Материалы У1 всесоюзного симпозиума по конформационннм из-чэнериям биополимеров в растворах", Тбилиси, 1935. с ,197

28.Брегадзе В.Г., Гелагутсшвили Э.С. Исследование содержания геди d еяворотке периферийной крови человека. В сб."Материалы У1 з^зссюзного симпозиума по чонформационкнм изменения:! биополк>;з-эов в растворах", Тбилиси, 1985. с.193а

29.Брегадзе В.Г., Гелагуташвили Э.С., Киладза A.A. Перераспределение меди в сыворотке крови человека при лик^ягранудока— :озе. В сб."Материалы 31 всесоюзного спетоз^угл по кокформа-ионным изменениям биополимеров в растворах|*,Тбшн;с!1,1985.с.180

30.Брегадзе В.Г., Гарибагавили Д.И., Кочламазелвили К.Г.,По— юв П.А. Автоматизированный импульсный многоканальны», плазменно-¡миссионный спектрометр. В сб. "Материалы У1 всесоюзного симпо-1иума по конформациошгым изменениям биополимеров в растворах", Тбилиси, 1985. с.193

31.Андроникашвили ЭЛ., Брегадзе В.Г., Бел о кобылье кий А.И., 'елагутанвили Э.С. Сапожником H.A. Взаимодействие ионов ме-■аллов и молекул воды с нуклеосомами нормальных и опухолевых :летон. В сб."Тезисы международного сиотозиума по физико-химии

и молекулярном механизмам функционирования генома",'Тбилиси, У6 с ЛбЗ-i зг5

32. Брегадз« В.Г., Кочи&ыазашвияи К.Г., Хуцкшпили И.Г. . Взаикодейсгьие воды и ионов металлов с ДНК. В сб. "Тезисы международного симпозиума по физике химии и молекулярным ма-канизкам функционирования генома", Тбилиси, 1937. с.84-8Б

33.Брегадзе В.Г., Джагаров Л.Г., Кочлаиазапвкли К.Г.,Ухае~ ва Н.Е. Плазменный эмиссионный спектрометр с ЭВМ для исследования кинетики десорбции газов и паров. В сб."У1 конференции по спектроскопии биополимеров", Харьков, 1988. с.бЕ-61