Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние внешних факторов на конформацию молекулы нуклеиновой кислоты в растворе

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние внешних факторов на конформацию молекулы нуклеиновой кислоты в растворе"

/о У я

/Л

МОСКОВСКИЙ_ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.В.М.ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

ВЕСЕЛКСВ АЛЕКСШ НИКОНСШЧ

УДК 547.963.3 + 539.2

ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ НА КШФОИ1АЦИЮ МОЛЕКУЛЫ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ В РАСТВОРЕ

Специальность 03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физЕко-гдатематическгх наук

С сТ>> > л-6 - н-аътя^г****

М - Ц 93

¿>Г J6.02.S4 i.

Москва 1988

Работа выполнена в научно-исследовательском физическом институте Ленинградского государственного университета и Севастопольском приборостроительном институте.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических

наук, главный научный сотрудник ИБС АН СССР Т.М.Бирштейн, доктор физико-математических наук, ведущий научный сотрудник института биофизики АН СССР В.И.Полтев,

доктор физико-математических наук, ведущий научный сотрудник ИМБ АН СССР В.И.Иванов.

Ведущая организация: Физико-технический институт низких температур АН УССР, г.Харьков.

Защита состоится "_" 1988 г. а _

часов на заседании Специализированного Совета Д.053.05.53 по пащите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при МГУ им. М.В.Ломоносова по адресу: ГО839, Москва, Ленинские горы. Биологический факультет МГУ,

Автореферат разослан " _,1988 года

Ученый секретарь ; г

Специализированного Совета ,^ '

доктор биологических наук Т.Е.Кренделева

' Актуальность работы. Одним из важных направлений молеку-,,с лярнай^буофизики является исследование конформации биологических полимеров, в частности, молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в растворе и происходящих в макромолекулах конфор-мационных изменений под влиянием внешних факторов. Известно, что конформация макромолекулы в значительной степени определяется ее взаимодействием с молекулами растворителя. Особую роль зти взаимодействия приобретают в случае структурированного растворителя, каким является вода. В связи с этим значительный интерес представляет исследование конформационных превращений в биологических макромолекулах, вызванных изменением состава растворителя. Исследование водно-неэлектролитных растворов на-тивной ДНК позволяет судить о природе сил, стабилизирующих ту или иную структуру макромолекулы, получить информацию о высших структурах макромолекулы в условиях дегидратации. Ввиду возможных локальных колебаний ионной силы и температуры в клетке интерес представляет также исследование информации ДНК при вариации температуры в растворе, содержащем соли различных концентраций.

Изучение конформации одноцепочной ДНК представляет интерес для понимания процессов передачи генетической информации. Изве-ствно также, что в некоторых бактериофагах молекула ДНК существует в виде одноцепочной структуры. Все это определяет интерес к изучению конформации молекулы денатурированной ДНК в водно-солевом растворе.

Многие антибиотики, канцерогены, мутагены оказывают свое действие главным образом путем прямого взаимодействия с ядерной ДНК. Связываясь с ДНК, эти вещества нарушают матричный ■ синтез и, как следствие, приводят к изменениям роста и деления клеток. Соответствующие теории взаимодействия, особенно интерполяционная модель связывания, внесли существенный вклад в

понимание биологических ссойетв и харсетеря, гЕа<ьяд®Ясгсая органических красителей (антибиотиков) с нукязшдаши гасло» теши. Однако для детального выяснения физико-хшгееокого па-ведения красителей к их биологических свойств необходимо знать молекулярную структуру образуицихся когплоксов красителя с компонентами нуклеино£чх кислот - нуклеотидами. Наиболее полную инфорюцио о структура образующихся комплексов ароматических молекул в раствора ковко получить с помощью метода ЯМР спектроскопии. Это определило интерес к соответствующему методу исследования и разработке связанной с ним методики расчета параметров коыплаксообразования и структуры молекулярных комплексов.

Гидродинамические исследований нэ позволяют решить вопрос о характере связывания красителя с ДНК в силу невоэ-моаности разделения влияния жесткости и удлинения молекулы на изааряедае гидродинамические параметры. Совксстное виско-зкметрическое к дикагосптическое изучение кокплегсоЕ органических красителей с шлекулоП хатнгаоЯ ДНК можот дать достаточно однознечкиа сссдска: кап о характере связывания красителя с ДНК, так и о параметрах образующегося молекулярного ;сб1'ллс::сс.

Даль ргхботы. Егдкшють экспоркмснталькио исследования ¿.штодгии вискозиметрии, сг.ектрсфстокстрия и дкноглгееского двойного лучепреломления конфориации ислекули денатурированной ДШ£ различной молекулярной касса ь водно-солевых растворах, конформацки молекулы натившй ДНК в водной растворо б Екроком интервала концентраций неэлектролита, при различных температурах, солях щэлочньгх металлов и ионных силах и в коитлекое с органически:! красителями. Для

опредзления детальной структуры молекулярного комплекса красителя с нуклео гадами в водном растворе применен метод спектроскопии адерно-магнитного резонанса (ЯИР). Поставлена задача экспериментального исследования водно-солевых растворов красителей с моно- и динуклеотвдами методом ШР, теоретического обоснования метода обработки экспериментальных данных ЯИР, разработки методики расчета параметров, структуры обраэущихся молекулярных комплексов в растворе и термодинамических параметров комплексообраазвания.

Научная новизна работы заключается в том, что впервые проведены оптические и гидродинамические исследования водно-солевых растворов денатурированной ДНК. Определены невозмущенные размеры, длина жесткого участка молекулы денатурированной ДНК при различных ионных силах среды ( JL ). Получены формулы, связывающие значения характеристической вязкости с молекулярной массой денатурированной ДНК при разных JU. . Изучено динамическое двойное лучепреломление растворов денатурированной ДНК в широком интервале иокных сил. Обнаружена зависимость собственной оптической анизотропии макромолекулы от концентрации поддерживающего электролита.

Впервые проведены вискозиметрические и динамооптиче-ские исследования водно-солевых растворов нативной ДНК в присутствии различных спиртов (метанола, этанола, н-пропано-ла, изо-пропанола, н-бутанола, трет-бутаяола), а также диок-сана в широком интервале концентраций неэлектролита и ионных сил. При составе бинарного растворителя, соответствующем границе стабилизации и разрушения структуры воды, обнаружен и

подробно исследован кооперативный конформационный переход в третичной структуре молекулы нативной ДНК. Концентрация спирта, соответствующая переходу, а также относительное изменение размеров молекулы ДНН при переходе зависят от длины углеводородного радикала и степени разветвленности спирта. Показано, что наблюдаемый кооперативный конформационный переход в. третичной структуре молекулы ДНК обусловлен нарушением пространственной структуры воды под действием неводного компонента. Предложен молекулярный механизм обнаруженных конфор-мационных изменений в третичной структуре молекулы нативной

ДНК.

Исследовано влияние температуры на гидродинамическое поведение молекулы нативной ДНК в водных растворах солей щелочных металлов. Обнаружено возрастание размеров макромолекулы в водно-солевом растворе независимо от вида катиона и его концентрации.> Получен новый результат, свидетельствующий о том, что пространственная (третичная) структура молекулы нативной ДНК зависит не только от ионной силы раствора, но также и от размера катиона, степени его гидратации, _ -.зможности образования направленных водородных связей с молекулами воды.

Проведены исследования водно-солевых растворов акридиновых красителей профлавина (НФ) и акридинового оранжевого (АО), а также Пф с моно- и дицуклеотидами методом протонного магнитного резонанса. Рассчитаны значения равновесных констант самоассоциации, значения протонных химических сдвигов молекул в мономерах и агрегатах красителей. Проведен расчет структур образующихся димерных агрегатов молекул акридиновых красителей в растворе.

Предложена методика расчета равновесных констант образования комплексов ароматических молекул, протонных химических

сдвигов молекул в составе комплекса. Рассчитаны равновесные константы образования комплекса ПФ с АО, ПФ с аденозинмоно-фосфатом (5'АМФ), антибиотика актиномицина D с дезоксиаде-нозинмонофосфатом (5'дАМФ) и с дезоксигуанозинмонофосфатом (5'дГ®), 1:1 и 1:2 комплексов ПФ с изомерными дирибонуклео-тидами ДФГ (цитозин - З1 - 51 - гуанозин) и ГФЦ (гуанозин - 3' - 51 - цитозин), комплексов 1:1 и 1:2 бромистого отидия (ЭБ) с дЦФдГ и антибиотика актиномицина D с ФдГФдЦ, а также значения протонных химических сдвигов молекул в комплексах. Произведен расчет структур комплексов 1:1 и 1:2 исследованных красителей с моно- и динуклеотидами в водном растворе. Исследованы температурные зависимости химических сдвигов протонов красителя ПФ и динуклеотидов в растворе. Предложена методика расчета термодинамических параметров реакций самоассоциации красителя, динуклеотида и образования 1:1 и 1:2 комплексов красителя с динуклеотидами в растворе. Определены свободная энергия Гиббса, энтальпия и энтропия этих реакций. Анализ данных позволил сделать заключение о существенной роли гидрофобных взаимодействий при образовании 1:2 комплекса красителя с рибодинуклеотидами. Получен важный результат о существовании преимущественного связывания ПФ с пиримидин.-пу-риновой последовательностью оснований.

Обоснован теоретически и продемонстрирован на характерных примерах метод, обработки экспериментальных данных с использованием ассоциативного вариационного принципа. Метод позволяет судить о степени соответствия теоретической модели экспериментальным данным, определить параметры модели в соответствии с задачей эксперимента и оценить их погрешности.

В настоящей работе впервые проведены совместные виско-зиметрические, динамооптические и спектрофотометрические

исследования водно-солевых растворов нативной ДНК в комплек-' се с дауношщинок и Пй. Получены данные о характере связыва-• > 1ШЕ молекулы ДНК с указанными лигрндами при различных ион- ках силах и о геоттркк обргяуюцкхся молекулярных комплексов в растворе.

Автор задияаст

1. Результаты гидродинамических и оптических исследований водно-солевых растворов денатуркровакной ДКХ, соотношения, связывающие значения характеристической вязкости с молекулярной массой денатурированной ДНК, значения равкозесноП жесткости молекулы денатурированной ДНК в различных конках силах, вывод о зависимости собственной оптической анизотропии молекулы денатурированной ДНК от конной силы среды.

2. Результаты вискозиметркческих и динамэоптыческих исследований водно-солевых растворов нативной ДНК в присутствии различных неэлектролитов (метанола, этанола, н-пропанола, изо-пропанола, н-бутекала, трет-бутаяола, диоксаяа), иоле-куляршй механизм обнаруккшых коифориагионкых изменений в третичной структуре иолекули нативной ДНК в водно-органических растворителях.

3. Вывод о существенной роли структуры растворителя при взаимодействии иизкомолекулярных органических веществ с молекулой нативной ДНК.

4. Результаты тбмператупкьпе исследований конфорлации молекулы нативной ДНК ь расгворах различных солей щелочных металлов, вывод о существенном влиянии гидратации ионов щелочных металлов на размеры молекулы нативной ДНК в растворе.

5. Результаты экспериментальных исследований водных растворов акридиновых красителей (ПФ, АО), ПФ с мою- и ди-нуклеотидами методом протонного магнитного резонанса; значения равновесных констант самоассоциации красителей, протонных химических сдвигов молекул в мономерной и димерной формах и рассчитанные структуры димерных агрегатов молекул исследованных акридиновых красителей в водном растворе.

6. Метод расчета равновесных констант образования комплексов ароматических молекул, протонных химических сдвигов молекул в составе комплекса и значения этих параметров для комплексов ПФ с АО, б'АМФ, актиномицина Л с 5'дАМФ и 5'д1Ш, для 1:1 и 1:2 комплексов ПФ с изомерными динуклео-тидами - ЦФГ и ГФЦ, ЭБ с дЦФдГ и актиномицина ^ с фцГфцЦ в водном растворе. Структуры 1:1 комплексов ПФ с АО и 5'да актиномицина с б'дАЫФ и б'дГМФ, 1:1 и 1:2 комплексов ПФ с динуклеотидами ЩГ и ГФЦ, ЭБ с дЦфдГ и актиномицина J) с фцГфдЦ в водном растворе.

7. Методику расчета термодинамических параметров самоассоциации красителя, образования 1:1 и 1:2 комплексов с динуклеотидами в растворе и полученные значения свободной энергии Гиббса, энтальпии и энтропии реаю Я ПФ с динуклеотидами в растворе.

8. Вывод о преимущественном связывании профлавина с пиримидин-пуриновой последовательностью оснований.

9. Метод обработки экспериментальных результатов, основанный на использовании ассоциативного вариационного принципа.

10. Результаты спектрофотоыетрических, вискозиметричес-ких и динамооптических исследований комплексов ПФ и

дауномицина с молекулой нативной ДНК, вывод об интеркаляци-ониом способе связывания рассмотренных красителей с ДНК и увеличении жесткости макромолекулы при взаимодействии с да-уномицином и с 1 ( =0,1).

Научная и практическая ценность работы. Полученные экспериментальные результаты ввхны для выяснения влияния различных внешних факторов на информацию молекулы нуклеиновой кислоты в растворе. Обнаружен кооперативный переход в третичной структуре молекулы нативной ДНК в области малых концентраций органических растворителей в водном растворе. На основе полученных экспериментальных данных сделан принципиально новый вывод о существенной роли структуры растворителя при взаимодействии низкомолекулярных органических веществ с молекулой нативной ДНК. Выяснение механизма влияния исследованных веществ на конформацию молекулы нативной ДНК важно в прикладном отношении, поскольку органические растворители -- спирты широко используются в фармацевтической промышленности при производстве лекарственных препаратов.

Изучена конформация молекулы нативной ДНК в видных растворах электролитов

при различных температурах для анализа действия локальных колебаний ионной силы и температуры в клетке. Обнаружено возрастание размеров молекулы ДНК в водно-солевом растворе с повышением температуры независимо от вида катиона и его концентрации. Получен новый результат о влиянии гидратации ионов на полиэлектролитное набухание молекулы ДНК. Проведено исследование конформации одноцепочной (денатурированной) ДНК в различных ионных силах ()• Определены длина жесткого участка молекулы денатурированной ДНК в зависимости от , а также невозцущенные размеры макромолекулы. Получены урсшко-

ния, связывающие характеристическую вязкость с молекулярной массой макромолекулы в различных ионных силах, которые можно применять на практике для определения молекулярных масс молекул денатурированной ДЖ. Изучение конформации денатурированной ДЖ важно для понимания процессов транскрипции и репликации дек.

Методом протонного магнитного резонанса (270 МГц) исследована самоассоциация красителей акридинового ряда, взаимодействие красителей и антибиотиков с олигонуклеотидами в водном растворе.

Предложен метод расчета равновесных констант образования комплексов ароматических молекул, протонных химических сдвигов молекул в составе комплексов. Рассчитаны константы ассоциации исследованных молекул и наиболее вероятные структуры образующихся молекулярных комплексов в растворе. Подобные исследования важны для оценки роли стякинг и электростатических взаимодействий в образовании шцелл, ассоциации нуклеотидов и нуклеозидов, связывании красителей с нуклеиновыми кислотами, конформационной стабильности биологических макромолекул в растворе.

Предложена методика расчета термодинамических параметров ассоциации молекул по данным ^Н-ЯМР. Рассчитаны изменение свободной энергии Гиббса, энтальпии и энтропии при комплексообра-зовании красителя с динуклеотидами. Анализ полученных результатов показывает, что взаимодействие Ш? с различными участками Д1К определяется существенно разными константами связывания, а, следовательно Физиологическая активность антибиотиков, мутагенов зависит от последовательности оснований в цепи Д1К.

Предложен и обоснован вариационный метод обработки экспериментальных данных ЯМР, который позволяет существенно

повысить эффективность оценок параметров математических моделей. Этот метод может быть использован на практике для анализа экспериментальных данных различных физических явлений.

Проведено сравнительное исследование взаимодействия ПФ и антибиотика дауномицина с полимерной молекулой ДНК оптическими и гидродинамическими методами. Сделан вывод о характере связывания лигаедов с ДНК при различных ионных силах. Установлено, что геометрия дауномицина в комплексе с ДНК в растворе отличается от наблюдаемой в кристалле.

Выяснение механизма взаимодействия исследованных лиган-дов с молекулой нативной ДНК важно в прикладном отношении. Анрвдиновые красители обладают мутагенной, канцерогенной активностью, ингибируют синтез ДНК и РНК и вызывают хр""осомные аберрации. Актиномицин В , дауномицин, ПФ и ЭБ обладают полезными химиотерапевтическими свойствами. Так, ПФ обладает бактериостатическим, ЭБ-трипаноцидным, актиномицин I) -антиопухолевым действием. Дауномицин является антиопухолевым препаратом, эффективным при лечении лейкозов и получившим широкое клиническое применение. В настоящее время неясно, чем вызвана чувствительность определенного типа клеток или организма к тому или иному антибиотику. Поэтому чрезвычайно важным является выяснение влияния низкомолекулярных лигандов различной химической структуры на геном клетки и, в первую очередь, характера их взаимодействия с молекулой нативной ДНК.

Некоторые экспериментальные результаты, полученные в настоящей работе, использованы в монографии А.Дж.Хопфингера "Межмолекулярные взаимодействия и биомолекулярная организация", Нью-Йорк, 1977 г.

Апробация работы. Основные результаты работы обсуждались

на:

Семинаре Всесоюзного химического общества им.Д.И.Менделеева "Молекулярная физика и биофизика водных систем", Ленинград, 1972, 1978, 1981, 1984, 1986; П и У1 Всесоюзных совещаниях по конформационным изменениям биополимеров в растворах, Тбилиси, 1973, 1985; X Всесоюзной конференции по физике жидкого состояния вещества, Самарканд, 1974; Ш Всесоюзном симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул, Пущино, 1976; Международной конференции по квантовой химии, биологии и фармакологии, Киев, 1978; Международном симпозиуме по структурной молекулярной биологии и генной инженерии, Лондон (Англия), 1978; Международной конференции по кристаллографии биополимеров, Лондон (Англия), 1979; семинарах по проблемам структурной молекулярной биологии в Кэмбрид-жском университете и Портмутском политехническом институте (Англия), 1979; Всесоюзной школе по молекулярной биофизике, Ленинград, 1980; Международной школе-семинаре: "Современные методы в структурной молекулярной биологии", Трапани (Италия), 1981; У1 симпозиуме по межмолекулярным взаимодействиям и конформациям молекул, Вильнюс, 1982;. I Всесоюзном биофизическом съезде, Москва, 1982; семинаре научного совета АН УССР по комплексной проблеме "Теоретическая электротехника, электроника и моделирование", Севастополь, 1984, 1985; П Всесоюзной конференции "Перспективные методы планирования и анализа экспериментов при исследовании случайных полей и процессов", Севастополь, 1985; 1У Всесоюзном симпозиуме "Методы теории и идентификации в задачах измерительной техники и метрологии", Новосибирск, 1985; Мевдународном симпозиуме (с участием стран-членов СЭВ и СОРЮ) "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках", Пущино, 1985; Международном конгрессе теоретической органической химии, Будапешт, 1987;

Международном симпозиуме (с участием стран-членов СЭВ и СФН)) "Гидратация биополимеров", Пущине, 1988.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 47 работ.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, трех приложений, выводов, списка цитированной литературы, включающего 660 наименований. Диссертация изложена на 462 страницах и содержит 300 страниц машинописного текста, 45 таблиц и 128 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность исследований, изложена постановка задачи, указана новизна и ценность работы, даны сведения об апробации работы.

I. ЮШРШЩЯ МОЛШМ НАТИВШЙ И ДЕНАТУРИРОВАННОЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ В РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ РАСТЗОгаГЕЯЯ

В разделах 1,2 и 4 главы I на основании литературных данных рассматриваются структура молекулы нативной дезоксирибо-нуклеиновой кислоты и физические факторы, определяющие её стабильность. Обсуидаются различные структурные формы молекулы нативной ДНК и условия их существования в растворе. Рассмотрены особенности водных растворов неэлектролитов и кон-формация молекулы нативной ДНК в водно-органических растворителях. Приводятся экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что в зависимости от воздействия на структуру воды неэлектролиты можно разделить на структуростабилизаторы и структуроразрушители. Сделан вывод о том, что для выяснения роли воды в стабилизации конформации молекулы нативной ДНК необходимы исследования в области малых концентраций неэлектролита в водном растворе, где наблвдаются значительные

структурные перестройки растворителя.

В разделе 3 главы рассмотрены экспериментальные результаты по изучению информации молекулы денатурированной ДНК в растворе. Отмечено, что исследования в этой области носят в основном качественный характер и сведения о физических характеристиках денатурированной ДНК весьма разноречивы. Проводится обсуждение вопроса об условиях полного расхождения полину-клеотидных цепей ДИК в процессе тепловой денатурации, механизма модификации нуклеиновой кислоты формальдегидом, исследований свойств денатурированной ДНК при различных ионных силах среды-

В разделе 5 рассматриваются результаты спектрального изучения взаимодействия органических красителей с олигонукле-огидами. Обсуждаются экспериментальные работы по изучению самоассоциации органических; красителей как модельных систем для оценки роли стэкянг и электростатических взаимодействий при ассоциации ароматических молекул. Приводятся результаты исследования взаимодействия красителей с коно- я динуклеотвдами в растворе методом ЯМР-спектроскопии. Подчеркивается, что для детального выяснения роли химической структуры оснований и красителей, ориентации молекул при связывании красителей с ДНК необходимо иметь количественную информацию о константах ассоциации и структуре молекулярных комплексов красителей с олигонуклеотидамн в растворе.

Раздел б посвягцен обзору литературы по комплексам органических красителей с нуклеиновыми кислотами. Здесь основное внимание уделено сравнительному анализу взаимодействия акридиновых красителей и антибиотика дауномицина с ДНК. Обсуждаются различные модели связывания красителей с нуклеиновыми кислотами, влияние химической структуры красителя, ионной силы на

параметры хомплехсообразования.

П. ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДОВ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В главе рассматриваются основы статической теории полимерных цепей, введены понятия о моделях свободно-сочленной и персистентной цепей, даны обозначения параметров этих моделей и связь между ними.

Излагаются теоретические основы используемых в работе методов вискозиметрии и динамического двойного лучепреломления. Рассматривается явление полиэлектролитного набухания заряженных макромолекул. Описан метод изоионного разбавления полиэлектролитов. Обсуждается возможность получения информации об анизотропии и термодинамической жесткости макромолекулы в случае концентрированных растворов, не прибегая к использованию концентрационной зависимости анизотропии и вязкости раствора.

Приведено описание установки для измерения ДЛП с использованием фотоэлектрического метода регистрации, изложены принципы её работы. Дана методика измерений характеристической вязкости ДНК.

Кратко рассмотрены вопросы теории ЯМР и экспериментальной техники получения и обработки спектров протонного магнитного резонанса, необходимые для анализа экспериментальных данных. Обоснована возможность применения модели эквивалентного диполя для расчета протонных химических сдвигов, вызванных кольцевыми токами в ароматических молекулах, находящихся в состоянии вертикального стэкинг взаимодействия.

111. ИОНФОРМАВДЯ МОЛЕКУЛЫ ДЕНАТУРИРОВАННОЙ

ДНК В РАСТВОРАХ РАЗНОЙ ИОННОЙ СИЛЫ Излагаются результаты экспериментального исследования конформации молекулы денатурированной ДНК различной молекулярной массы в растворах с разной ионной силой. Использована

г

Ма-соль ДНК тимуса теленка с молекулярной массой 28-10 Да. Денатурацию ДНК проводили путем инкубации бессолевого раствора ДНК в присутствии 6% формальдегида при температуре ~50°С. Образцы денатурированной ДНК разной молекулярной массы получали ультразвуковой деструкцией нативной ДНК с последующей тепловой денатурацией.

Молекулярную массу образцов определяли по угловой зависимости интенсивности света, рассеянного растворами различных концентраций денатурированной ДНК. Растворы для светорассеяния очищали центрифугированием. Описана методика приготовления растворов. Для фиксации денатурированного состояния в раствор ДНК добавлялся формальдегид. Приведено описание способа очистки формальдегида с помощью ионно-обменных смол.

Концентрацию ДНК определяли, спектрофотометрически по методу А.С.Спирина. Для всех образцов денатурированной ДНК измеряли атомный коэффициент экстинкции ^^{Р). Экспериментальные исследования выполнены при Температуре 21°С.

Гидродинамическое поведение молекулы денатурированной ДНК

Изучали вязкость растворов денатурированной ДНК различной молекулярной массы в широком диапазоне ионных сил ( уН- ). Опыт показывает, что зависимости характеристической вязкости £ от ионной силы в логарифмическом масштабе имеют вид прямых с тангенсом угла наклона 0,5 для денатурированной ДНК

различной молекулярной массы. Это хорошо согласуется с теорией и экспериментальную исследованиями для гибких синтетических полиэлектролитов. Полученные результаты показывают,что макромолекула находится в конформации статистического клубка и сходна по своим гидродинамическим свойствам с гибкими синтетическими полиионами.

Известно, что по невозмущенным размерам макромолекулы можно определить её термодинамическую жесткость. В свою очередь, невозмущенные размеры макромолекулы возможно найти с помощью теории объемных эффектов Штокмайера-Фиксмана, связывающей величину , измеренную в хорошего растворителе, с молекулярной массой ( Ы ) полимера:

среднеквадратичное расстояние мезду концами новозмущенноК цепи; .В - коэффициент, пропорционалы-шй исключенному объему макромолекулы.

натурированной ДНК в растворах разной ионной силы, позволяют заключить, что е пределах осибки опыта невоямущенные размеры совпадают между собой при^иэо,С05 . Для зтой области ионных сил найдэно число мономерных остатков с куновском сегменте денатурированной ДНК 5 =6, что соответствует длине сегмента А = 40 8. При уменьшении ионной силы нэвозцуцеиные размеры молекулы денатурированной ДНК возрас.'аят: величина

3 = 9 и А = 60 X при /Ц = 0,001; 5 - 13+15 (А « 85+100 А) при - 0,000Ь.

Из зависимости коэффициента £ от ионной силы среды

(I)

Зависимости

, построенные для де-

определены (У -условия для денатурированной ДНК (~-2,OMA/«CQ # Установлено, что водно-солевой растворитель является очень плохим для незаряженной молекулы денатурированной ДНК.

Получены зависимости характеристической вязкости денатурированной ДНК от молекулярной массы. Экспериментальные зависимости хорошо описываются уравнениями типа Марка-Куна-Ха-увинка:

ty] = (2)

При ß = o.lb [Iii = 2,МО-4 M0,68 ,

при ja =0,001 [ц] = I.O-IO-4 M0,89 .

В растворе с большой ионной силой ( ß = 0,15) отрицательно заряженные группы молекулы денатурированной ДНК до-польно сильно экранированы и последняя ведет себя подобно обычной гибкой макромолекуле. В этом случае Q^ лежит в пределах, предсказываемых экспериментально и теоретически для гибких макромолекул.0,5 < Q^ 0,8. Значение £ , характеризующее величину объемных эффектов, равно 0,12 и коэффициент линейного набухания ~ ( ß =0,15).

При ß = 0,001 величина > 0,8, что обычно имеет место при больших степенях набухания. Это может быть связано с увеличением жесткости, а, возможно, и ассиметрии цепи при малых ß .

Оптические свойства молекулы денатурированной ДНК в растворах с разной ионной силой Изучение динамического двойного лучепреломления денатурированной ДНК молекулярной массы 6,5-10 Да в различных ионных силах среды показано, что при малых ßx величина , пропорциональная оптической анизотропии макромолекулы, приобретает положительный знак. С учетом гидродинамических

исследований установлено, что перемена ашха величины М/гу при уменьшении jU в основном связана с изменением собственной оптической анизотропии ("¡(a. , зависяв^й от величины S и разности поляриэуемостей мономерного звена а„ - <зх в параллельном и перпендикулярном направлениях к цепи. Найденное возрастание 5 в области малых JU не может влиять на знак ( . Следовательно, можно считать, что с уменьше-

нием JU изменяется равновесное положение плоскостей азотистых оснований относительно цепи главных валентностей, определяющее величину и знак (а„ - ). По экспериментальному значению анизотропии мономерного звена можно оценить степень заторможенности вращения боковой группы относительно основной цепи:

(а„-Ог) = Да, + (3)

где &.С1, - разность поляриэуемостей связей основной цепи;

A^i - максимальное значение разности поляризуемости бокового циклического основания; Ч' - угол между нормалью к плоскости азотистого основания и направлением цепи. Проведенные оценки свидетельствуют о том, что угол изменяется от R: 10° до 40° при уменьшении JU от 0,015 до 0,0005MNaC£ . Этим, по-видимому, можно объяснить перемену знака величины Cftl/tyl в указанной области ионных сил.

На основании экспериментальных концентрационных зависимостей двойного лучепреломления растворов денатурированной ДНК сделан вывод о значительном стэкинг взаимодействии плоскостей азотистых оснований при больших ju

1У. К0НФ0РМАЦИЯ МОЛЕКУЛЫ НАТИВНОЙ ДОК В

ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЯХ Глава 1У посвящена исследованию влияния концентрации неэлектролитов, катионов щелочных металлов и температуры на конформацию молекулы нативной ДНК в водном растворе. Исследовали образцы ДНК тимуса теленка молекулярной массы 28-10 и

с

15*10 Да. Использовали промышленные препараты спиртов и мочевины квалификации "ЧДА" и "ХЧ" и диоксана квалификации "Ч". Спирты подвергались двухкратной перегонке при атмосферном давлении, очистку диоксана производили путем перегонки стандартного реактива на ректификационной колонке с предварительным освобождением от перекисей разложением их безводным бисульфитом натрия. Препараты мочевины, а также различных солей щелочных металлов

исе, ксе , ые,с$се ,с(^се, ше

использовали без дополнительной очистки. Растворы ДНК с определенной концентрацией электролитов готовили диализом против водных растворителей соответствующей концентрации соли. Исходный концентрированный раствор ДНК очищали центрифугированием. Концентрацию ДНК в растворе определяли спектрофотометрически по методу А.С.Спирина непосредственно в водно-органическом растворе. Изучали лишь те растворы, для которых величина Е^СР) соответствовала нативному состоянию ДНК.

Конформация молекулы нативной ДНК в спирто-водных растворителях и смесях диоксан-вода Опыт свидетельствует о довольно сложной зависимости характеристической вязкости ДНК от концентрации спирта в растворе. В некоторой области концентраций спирта в растворителе величина [(£] ДНК сохраняет постоянное значение. При определенной концентрации, характерной для данного спирта (метанола

(Смет) « 12 моль %, этанола (Сэт) л- 7,0 моль %, н-пропанола (Сн_пр0) » 5 моль %, изопропанола (Си_Пр0) » б моль %, н-бутанола (Сн_бут) 1,6 моль %, трет-бутаиола (Ст_бут)« 3,5 + 4 моль %), величина Г'У ДНК кооперативно уменьшается и тем больше, чем меньше ионная сила раствора. При дальнейшем добавлении спирта вновь обнаруживается область постоянства [<¿3 ДНК, после которой возникает монотонное падение .

Изучение динамического двойного лучепреломления показало, что в достаточно широкой области концентраций спирта он не оказывает влияние на величину С1^/^! , которая в пределах погрешности совпадает с полученной для ДНК в водно-солевых растворителях соответствующей ионной силы. Это означает, что присутствие спирта, мольная концентрация которого в растворителе Ссп< 40 моль %, не ьлияет на величину куновского сегмента (на близкодействие в цепи) и на ( йи -Оа ), а, следовательно, и на вторичную структуру молекулы ДНК. Таким образом, наблюдаемые зависимости величина ['¿З ДНК от концентрации спирта в растзорнтеле являются результатом конформвцн-онных переходов в третичной структуре, обусловленных изменением сил дальнодействия в молекуле ДНК.

Моано убедиться, что наблюдаекыз изменения [ ДНК коррелируют с поведением спирто-водшх растворителей, физические свойства которых прзторпеваэт резкие изменения в области малых концентраций спирта.

Опыт показывает, что кооперативное умзньпенне [*£] ДНК и начало структурного перехода в растворителе происходят при одинаковой концентрации спирта. Таким образом, третичная структура молекулы нативной ДНК чрезвычайно чувствительна к структурным перестройкам, происходящим в смашаиноы растворителе.

Зависимости [г|] и [п] /[*£] ДНК в смесях диоксан-вода

при разных ионных силах, как показал эксперимент, аналогичны наблюдаемым в спирто-водных смесях. Отсюда можно заключить, что кооперативное уменьшение характеристической вязкости молекулы ДНК обусловлено не специфическими свойствами спиртов, а наличием у них, также как и у диоксана, определенных гидрофобных и гидрофильных групп. Кооперативный переход в третичной структуре молекулы ДНК наблюдается при концентрации диоксана, равной ^ 3 моль %.

При больших концентрациях спирта наблюдалось частичное осаждение ДНК, увеличивающееся с возрастанием ]Л. . При концентрациях этанола Сзт= 75 и 80 об % ( ~ 50 моль %) и

= 0,001 в растворителе абсолютная величина №1 / претерпевает трехкратное уменьшение, что свидетельствует о конформационном переходе во вторичной структуре молекулы на-тивной ДНК. Сравнение с литературными данными позволяет высказать предположение о том, что наблюдаемые в макромолекуле конформационные изменения обусловлены переходом из В- в А-форму. По оптической анизотропии молекулы ДНК, вычисленной для В- и А-формы в предположении постоянства эффекта микроформы ДНК в водно-органических растворителях, сделан вывод о неизменности термодинамической жесткости молекулы ДНК в двух формах.

Исследования конформации молекулы ДНК в смесях метанол-вида при = 0,1 и Смет ^ 50 об % показали, что наблюдаемое методом НД закручивание спирали при этих условиях не оказывает влияния на величину термодинамической жесткости цепи ДНК.

Влияние температуры на конформацию молекулы нативной ДНК в растворах солей щелочных металлов и в смесях трет-бутанол-вода ^ ^

Исследовано влияние щелочных ионов N а, К\(У,

К^* и ионов гуанидиния различной концентрации (0,1-0,001 М) в температурном интервале 10 + 40°С на конформацию молекулы нативной тимусной ДНК. Опыт свидетельствует о возрастании ДНК в водно-солевом растворе с повышением температуры независимо от вида катиона и его концентрации. Температурный эффект увеличения размеров молекулы ДНК возрастает с уменьшением концентрации ионов в растворе. Значения ДНК, а, следо-

вательно, размеры макромолекулы различаются в растворах исследованных солей при одинаковой их концентрации и одной и той же температуре.

Измерения динамического двойного лучепреломления показали, что величина в пределах погрешности измерений не зависит от типа щелочного металла в растворе при фиксированной температуре. При увеличении температуры наблюдается некоторое падение ДНК в растворах электролитов. Учет зависимости собственной оптической анизотропии макромолекулы от температуры позволяет сделать вывод о неизменности персистентной длины молекулы ДНК в растворах различных щелочных металлов в исследованном температурном интервале.

Для интерпретации полученных результатов можно воспользоваться концепцией Самойлова О.Я., согласно которой с повышением температуры увеличивается гидратация ионов. Это уменьшает активность ионов, а следовательно, изменяет их взаимодействие с фосфатными группами ДНК. Последнее вызывает увеличение полиэлектролитного набухания молекулы ДНК, что проявляется в возрастании . Подтверждением предполагаемого

механизма изменения [*]} ДНК в растворе при вариации температуры может служить поведение макромолекулы в растворах хлористого гуанидиния и в растворах концентрированных солей ( ~ 5 М) щелочных металлов.

Зависимость [^3 ДНК от вида катиона при фиксированной температуре может быть связана с различной гидратацией ионов. Анализ результатов позволяет предположить, что повышение температуры по разному влияет на ближние и дальние электростатические взаимодействия в цепи молекулы ДНК. Проведенное исследование свидетельствует о том, что третичная структура молекулы ДНК чувствительна к состоянию катионов в растворе.

Изучено влияние температуры на конформацию молекулы ДНК в смешанном растворителе трет-бутанол-вода в 0,001 М МйС£ . В спирто-водных смесях также наблюдается возрастание С^З ДНК с повышением температуры. Область концентраций спирта, при которых наблюдается конформационный переход в третичной структуре молекулы ДНК в спирто-водном растворе, обусловленной структурными перестройками в растворителе, при повышении температуры расширяется и смещается в сторону меньших концентраций. Увеличение температур! приводит к дестабилизации структуры воды, поэтому вполне естественно, что начало структурного перехода молекулы ДНК смещается при возрастании температуры в область меньших концентраций спирта в растворителе. Опыт показывает, что изменение Г^] ДНК при переходе не зависит от температуры в исследуемом интервале температур.

Молекулярный механизм конформационных переходов в молекуле ДНК в водно-органических растворителях По своему влиянию на структуру воды органические растворители условно разделяют на два класса: структуростабилизи-

руюцие относительно неполярные соединения (добавки типа спиртов) и структуреразрушающие - высокополярные вещества (добавки типа мочевины).

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют об одинаковом влиянии одноатомных спиртов и диоксана на конфор-мацига молекулы ДНК. Следовательно, можно предположить, что молекулярный механизм воздействия этих неэлектролитов на структуру молекулы ДНК имеет одинаковую природу. Сопоставление с литературными данными по исследованию сметанных водно-органических растворителей позволяет заключить, что конформа-ционные изменения в молекуле нативной ДНК при добавлении в раствор различных неэлектролитов происходят вследствие структурных перестроек в смешанном растворителе.

В области малых концентраций (Снэ^ С°п) молекулы неэлектролита находятся в полостях пространственной структуры воды, и можно считать, равномерно распределены по её объему. Поэтому они не оказывают непосредственного влияния на конфор-мацию молекулы ДНК и незначительно понтаают диэлектрическую проницаемость раствора. Следовательно, можно заключить, что в этих условиях вторичная и третичная структуры ДНК остаются неизменными. Стабилизирующее влияние спирта становится максимальным при определенной концентрации зависящей от длины и разветвленности углеводородного радикала молекулы спирта. Дальнейшее незначительное добавление неэлектролита приводит к кооперативноцу изменению пространственной структуры воды, сопровождающемуся выходом растворенных молекул из водных полостей и образованием гидрофобных ассоциатов неводного компонента. Естественно предположить, что вследствие нарушения стру2.туры воды становится возможным непосредственное взаимодействие образовавшихся ассоциатов с гидратированной

поверхностью молекулы ДНК. Следствием этого является уменьшение величины диэлектрической проницаемости £ растворителя а непосредственной близости от макромолекулы. Опыт показывает, что относительное изменение Г^З ДНК, вызванное кооперативным переходом в третичной структуре молекулы ДНК в области малых ионных сил, возрастает с увеличением числа углеродных атомов в молекуле спирта в ряду МетОН < ЭтОН < нПроОН < нБутОН и уменьшается с увеличением разветвленности радикала молекулы спирта. В первом приближении данная последовательность коррелирует с уменьшением ё водных растворов этих неэлектролитов.

Согласно полиэлектролитной теории уменьшение £. растворителя приводит к дополнительной конденсации противоионов на поверхности полииона, то есть к уменьшению поверхностной плотности заряда, в результате которого уменьшается расталкивание сегментов, удаленных вдоль по цепи. Изменение диэлектрических свойств среды наиболее сильно сказывается на величине дебай-хюккелевских взаимодействий. Это связано с влиянием ¿, как на плотность поверхностного заряда макромолекулы, так и на степень экранирования фосфатных групп. Результатом этого является подавление объемных эффектов и, соответственно, уменьшение ДНК в водно-органических растворителях. Ко-оперативность наблюдаемого информационного перехода обусловлена кооперативностью плавления структуры воды.

Опыт показывает, что после кооперативного уменьшения величина (^ ] ДНК сохраняет постоянное значение в некоторой области концентраций неэлектролита. Можно предположить, что структура водно-органического растворителя остается неизменной э даньой области концентраций неэлектролита, что обуславливает неизменность эффективной степени ионизации, а, соответственно.

постоянство величины [7! Д!К в этих условиях.

За пределами рассматриваемой области, при больших концентрациях неэлектролита, подавление объемных эффектов является результатом дополнительной конденсации противоионов и усиления экранировки фосфатных групп вследствие значительного уменьшения средней величины диэлектрической проницаемости раствора.

Следует также иметь ввиду, что наряду с влиянием противоионов на конформацию Д1К при нарушении пространственной структуры вода может резко измениться качество растворителя для нативной ДОС. Анализ литературных данных по исследованию синтетических полимеров в водно-органических растворителях позволяет сделать вывод, что при концентрациях спирта в растворителе, соответствующих нарушению упорядоченной структуры вода, наблюдаются особенности в гидродинамическом поведении лишь тех молекул, в которых существенны гидрофобные взаимодействия.

Исследование конкурентного влияния агентов, стабилизирующих (малые добавки трет-бутанола) и разрушающих (малые добавки мочевины) структуру воды на конформацию молекулы Д№ показало, что присутствие спирта п растворителе в концентрациях, стабилизирующих структуру воды (Ссп^ С°сп), приводит к тому, что добавление значительной концентрации структурорязрушителя - мочевины в спирто-водный растворитель не вызывает изменения

нии мочевины в растворе. Опыт покалывает, что конформяционнмй переход в третичной структуре молекулы Д1К имеет место при определенном соотношении органических компонент я растворителе

Д1К. С увеличением концентрации спирта кооператипное ' 17/ Л'К происходит при большем процентном содержа-

(на три молекулы спирта приблизительно одна молекула мочевины). Это предполагает, что в растворе в результате нарушения структуры воды образуются соответствующие ассоциаты молекул мочевины и спирта, удерживаемые, по-видимому, водородными связями.

Таким образом, проведенное исследование позволяет сделать заключение, что взаимодействие низкомолекулярных соединений с молекулой ДНК в значительной степени определяется структурой растворителя. Характер этого взаимодействия прежде всего определяется типом имеющихся функциональных групп неэлектролита, от которых зависит природа молекулярных ассоциатов, ооразу-пцихся в растворе в результате нарушения структуры воды.

У. ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ БИОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫХ АРОМАТИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛ В ВОДНОМ РАСТВОРЕ МЕТОДОМ ПРОТОННОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА

Представлены результаты исследования самоассоциации и комплексообразования акридиновых красителей ПФ и АО, взаимодействия ПФ с мононуклеотидами (5'АМФ) и изомерными дирибо-нуклеозидмонофосфатами ЦФГ и ГФЦ в водном растворе методом fy-flMP. Образцы ПФ, 5'АМФ и динуклеотиды ЦФГ и ГФЦ ("Si^ma", США) использовали без дополнительной очистки. АО ("ii^MCL ", США) первоначально очищали путем трехкратной перекристаллизации метанолом. Определенное количество красителя растворяли в двуокиси дейтерия ( 3)20 ) с изотопной чистотой 99,8% и лио-филизовали. Растворы готовили растворением взвешенного количества исследуемого химического соединения в 0,1 М фосфатном буфере в D^O , pH 7,0. Концентрации исследуемых молекул определяли спектрофотометрически. Все спектры "^Н ЯМР измерены на импульсном спектрометре С ßi~uker VMZ7D'! ФРГ) при

резонансной частоте 270 МГц с применением фурье-преобразования. Стабилизация спектрометра осуществлялась по сигналу ЯМР2!) растворителя Л2О . Регистрация спектра проводилась при ширине развертки = 2000 Гц и = 1000 Гц. Максимальная разрешающая способность при этом равнялась 0,002 млн-3". Протонные химические сдвиги определяли относительно внутреннего стандарта - ацетона. Для контроля в качестве второго стандарта использовали бромид тетраметиламмония. В процессе измерений стабилизация температуры осуществлялась с точностью ± 0,1°С.

Для анализа концентрационных зависимостей протонных химических сдвигов использован метод обработки данных, построенный на вариационном принципе, сформулированном с привлечением двойственной задачи. Обоснование метода дано в приложении I диссертационной работы.

Исследование самоассоциации ароматическ и

молекул в водном растворе

Концентрационная зависимость спектров протонного магнитного резонанса молекул красителей анализировалась на основе теории -мерной некооперативной модели ассоциации молекул, в которой константы равновесия Кт для реакции

X ш + X ——

предполагаются одинаковыми для всех т , т.е. К", . .= К"п = к • Можно считать, что только круговые токи ближайших молекул дают вклад п химические сдвиги н область более сильного поля. Кроме того, в рамках принятой модели ассоциации молекул предполагается, что влияние соседних молекул одинаково. Тогда зависимость химического сдвига £ от концентрации X имеет вид

где ¿д; - химический сдвиг [ -ого протона молекулы красителя в ассоциате; ¿Mi - протонный химический сдвиг в мономере. Минимизация функции невязки для определения параметров ¿мt ' ^fli и К в модели (4) выполнялась численным методом переменной метрики Давидона-Флетчера-Пауэлла. В результате проведенных расчетов определены значения константы самоассоциации молекул ПФ Кр = (700 - 150) М-1 и молекул АО Кд = = ( 6100 ± 700 ) (Г1.

Величины химических сдвигов, вызванных кольцевыми токами (¿к) в ароматических молекулах, могут быть достаточно строго рассчитаны по формуле

b-Z/HOSCOsty/r?, (5)

<

где Jii - магнитный момент эквивалентного диполя / - ого ароматического кольца; fj - расстояние от i -ого диполя до рассматриваемого протона ( П ^ 0,3 нм); - угол между направлением поля и Г . Суммирование проводится по числу колец в молекуле. Взаимное расположение молекул в димере определяли путем установления соответствия значения , рассчитанного по формуле. (5), с величиной = учитывающей вклад в экранирование одной соседней молекулы. Установлено в результате расчетов, что плоскости хромофоров в димррах ПФ и АО параллельны друг другу и расположены на расстоянии 0,34 нм. В димере ПФ молекулы смещены вдоль продольной оси хромофора и повернуты друг относительно друга на угол V = -12°(168°), в случае же АО смещение молекул незначительное, однако угол поворота хромофоров возрастает до Т =-36°(144). Оценки показывают, что погрешность ЛТ не превышает ± 2°.

Равновесные константы димериоации ЦФГ и ГФЦ, определенные по описанной методике, в пределах экспериментальной ошибки совпадают для двух изомерных дирибонуклеотидов^К =

Исследование комплексов ароматических молекул в водном растворе

Рассмотрена схема бесконечномерной ассоциации молекул. Наблюдаемый химический сдвиг протонов исследуемого ароматического соединения может быть представлен в виде

(6)

(7-кр)г(-1-кла) \' С-1-*Га о) Л,

где , ¿4 , ¿с - протонные химические сдвиги в молекуле, находящейся в мономерной, димерной формах и в комплексе, соответственно; Р0 - исходная концентрация; Р - концентрация мономеров ароматического соединения; К , (Сд - равновесные контакты самоассоциации молекул. Входящие в (6) величины ¿¡т, ,

, К и К* могут быть определены исходя из концентрационных зависимостей протонных химических сдвигов для каждого отдельного ароматического соединения. Учет закона действующих масс для химических реакций и законе сохранения массы приводит к тому, что в выражение (6) входят лишь два неизвестных параметра Кс и ¿с , где Кс ~ равновесная константа компле-ксообразования. Минимизация функции невязки выполнялась численным методом переменной метрики, решение нелинейной системы, включающей равновесные константы ассоциации и концентрации молекул, проводилось методом Стеффенг.ена.

Рассчитаны равновесные константы ассоциации Г1Ф и АО ( Кс = 2800 - 300 М-1), ПФ с Ь'АМФ ( Кс = 30 ± 10 М-1), актино-мицина 2> с 5'дАМФ ( 48 ¿ й и актиномицина Ъ с

5 дГМФ ( кСс = 76 i 8 М-*), значения химических сдвигов протонов ¿с в комплексах. По найденшм значениям ¿с . с использованием модели кольцевых токов, определены наиболее вероятные структуры 1:1 комплексов ароматических молекул. В этих комплексах плоскости молекул параллельны друг другу и располагаются на расстоянии 0,34 нм. Угол поворота хромофоров красителей в 1:1 комплексе ПФ и АО Т = -I9°(I6I°) принимает промежуточное значение меаду углами поворота в димерах ПФ и АО. В 1:1 комплексе ПФ и б'АМФ угол поворота плосктей основания нуклеотида и хромофора красителя Г = 36°, что совпадает с углом поворота оснований в 6 -форме молекулы ДНК. В случае 1:1 комплексов актиномицина И с 5'дАМФ и 5'дГМФ основания мононуклеотидов располагаются над бензольным кольцом фено-ксаэонового хромофора антибиотика.

Взаимодействие органических красителей с

динуклеотидами в водном растворе

В рассмотренной схеме экспериментальный прогонный химический сдвиг в молекуле красителя может быть представлен в виде:

где 8~т , 8~<{ , Sz - протонные химические сдвиги в молекуле красителя в мономере, димере и в составе комплексов с одной и двумя молекулами динуклеотида, Кл , Кл , К* - равновесные константы самоассоциации красителя и образования комплексов , соответственно. Величины ¿<ц, ¿^ , Кд определяются исходя из концентрационных зависимостей протонных химических сдвигов красителя в тех же условиях растворителя. Концентрации

Q и d могут быть найдены исходя из закона сохранения массы с учетом закона действующих масс. Структуры комплексов

красителей с динуклеотидами определяли путем установления соответствия значений протонных химических сдвигов, полученных из экспериментальных концентрационных зависимостей ( ¿¡J -, i = 1,2) с величинами 6*к , рассчитанными по формуле (5).

Взаимодействие ПФ с изомерными дирибонуклеотидами №Г и ГФЦ. Среднее по всем параметрам и для протонов ПФ в комплексе с ЦФГ составляет = (140 - 30) М-1 и Кг = (700 - 150) М-*, а для комплекса ПФ с ГФЦ соотношение между расчетными константами обратное: Kf = (750 - 150) и К£= (150 ± 80) М"1 (0,1 Ы фосфатный буфер в ЭаО , рН 7,0, t = 21°С). Константа ассоциации комплекса ПФ с ЦФГ существенно выше константы ассоциации К* красителя с ГФЦ. Это свидетельствует о преимущественном взаимодействии ПФ с пиримидин-пуриновой последовательностью оснований.

В рассчитанных структурах комплексов 1:1 ПФ с ЦФГ и ГФЦ краситель интеркалирован между основаниями дирибонуклеотидов, располагаясь на расстоянии 0,34 нм от них, однако ориентации и степень перекрывания оснований и хромофора ПФ в этих комплексах разные. В случае 1:1 комплекса ПФ с ГФЦ взаимная ориентация молекул предполагает стабилизацию комплекса электростатическим взаимодействием медду положительно заряженным атомом азота N (10) ПФ и отрицательным фосфатом динуклеотида. На рис.1 представлена найденная в результате расчетов наиболее вероятная структура комплекса 1:2 ПФ с молекулами ЦФГ в водном растворе. Сходная структура получена и для комплекса красителя с двумя ГФЦ в силу близости значений (¿Mi "¿21 ). ПФ интеркалирован между двумя компле! ентарными динуклеотидами, плоскости оснований расположены на расстоянии 0,68 нм. Рассчитанная структура комплекса ПФ с ЦФГ в растворе находится в

Рис.I Структура 1:2 комплекса ПФ и 1Н>Г в водном растворе: а) рассчитанная структура. Вид сверху в направлении, перпендикулярном плоскостям пар оснований. Атомы верхних оснований, связи между ними, а также связи интеркалированного красителя окрашены черным; б) схематическое представление боковой проекции структуры комплекса, пунктиром обозначены Н-связи по данным кристаллографических исследований

хорошем согласии со структурой комплекса этих молекул в кристалле, полученной методом рентгеноструктурного анализа.

Взаимодействие бромистого этидия (ЗБ) с дезоксидирибо-нуклеозндмонофосфатом дЦФдГ. Константа ассоциации = (580 - 150) М-1 для комплекса 1:1 ЗБ и дЦФдГ в пределах погрешности её определения совпадает с Кг = (660 - 150) М-^ этих молекул з растворе (5 тМ фосфатный буфер в J)гО , pH 7.0, t = £5°С).

Определена наиболее вероятная структура комплекса 1:1 ЗБ и дД5дГ в водном растворе. ЭБ интеркалирован мезду двумя комплементарными динуклеотидами, плоскости оснований расположены на расстоянии 0,68 нм и параллельны хромофору красителя. Структура комплекса 1:2 ЭБ и дЦФдГ несколько отличается от

наблвдаемой в кристаллическом состоянии. Различное перекрывание азотистых оснований и хромофора красителя для комплексов в растворе и кристалле, изменение симметрии комплекса 1:2 ЭБ и дВДдГ в растворе, по-видимоцу, определяется значительными гидрофобными взаимодействиями фенольной и этильной групп ЭБ с молекулами динуклеотидов в водном растворе.

Взаимодействие актиномицина Д) с ФдГФдЦ в водном растворе. Константы К< = (480 ± 100) М"1 и = (600 ± 150) М"1 для комплексов 1:1 и 1:2 в этом случае, также как и при взаимодействии ЭБ с дВДцГ в тех же условиях растворителя, близки между Ьобой. Можно заключить, что равновесные константы ассоциации исследованных красителей, существенно отличающихся по химической структуре, при интеркаляционном связывании с динуклеотидами оказываются сравнимыми по величине. В рассчитанной наиболее вероятной структуре комплекса 1:2 актиномицина 2 И ФдГфдЦ феноксазоновый хромофор молекулы красителя параллелен плоскостям пар оснований. Степень перекрывания хромофора красителя и плоскостей азотистых оснований мала, так как интеркаляция антибиотика.актиномицина Л) с массивными пептидными лактонами в участок спйрали из комплементарных динуклеотидов затруднена по стерическим причинам. По-видимому, стабилизация комплекса, в основном, осуществляется за счет водородных связей мезду нуклеотидами и аминокислотными остатками антибиотика.

Определение термодинамических параметров самоассоциации и вэаимодействи красителя с динуклеотидами в водном растворе по данным ^Н-ЯМР Изучена температурная зависимость химических сдвигов ПФ в водном растворе с изомерными динуклеотидами ЦФГ и ГФЦ.

Результирующий химический сдвиг ( ) I -ого протона ПФ при температуре можно представить в виде

Щ) + (8)

где > /1^/)' ~ оавновесныг мольные доли

ПФ при температуре для мономерной и димерной форм ПФ, а также для комплексов с одной и двумя молекулами динуклеотидя соответственно. Мольные доли, являющиеся функцией от температуры, однозначно связаны с константами ассоциации молркул Кд , К| ,иК2, что позволяет определить и температурную зависимость зтих констант. Экспериментальные температурные зависимости химического сдвига аппроксимированы регрессионным уравнением второго порядка относительно температуры. Регрессионное уравнение, включающее 4 параметра, составлялось с учетом результатов концентрационных исследований, а также в предположении, что при ¿в = Ю0°С ПФ находится в мономерной форме, т.е. доля Параметры регрессионной модели определяли по измеренным значениям . Численная процедура минимизации функции невязки выполнялась с помощью симплексного метода Нелдера-- Мида. Построены зависимости Вант - Гоффа 61К = ^ (1/Т) для реакций самоассоциации ПФ и образования 1:1 и 1:2 комплексов с динуклеотидами в растворе. Определены изменения свободной энергии Гиббса ( Дб-), энтальпии ( дН ) и энтропии ( Дб ) для этих реакций. В случае 1:1 комплексов ПФ с динуклеотидами энтропия возрастает по сравнению с реакцией димеризации красителя и для 1:2 комплексов становится положительной. Следовательно, гидрофобные взаимодействия, дающие положительный вклад в Д 5 , оказываются существенными при комплексообраэовании, особенно в случае 1:2 комплекса кряси-

теля с динуклеотидами.

На основании температурных зависимостей химических сдвигов протонов ЦФГ и ГФЦ в водном растворе определены дНи дЭ для реакций самоассоциации двух изомерных дирибонуклеотидов.

У1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ОРГАШЧЕСКИХ КРАСИТЕШЕЙ С ПОЛИМЕРНОЙ МОЛЕКУЛОЙ ДНК

Исследовали препарат ДНК из селезенки крупною рогатого скота молекулярной массы 8-10® Да. Дауномицин *,

Италия) и ПФ (" ", США) использовали без дополнитель-

ной очистки. Концентрации лигандов и ДНК определяли спектро-фотометрически. Измерения проводили в двух растворителях. Первым служил фосфатный буфер рН 7,0, ^ = 0,001. Второй растворитель получали добавлением в первый МаСС до = 0,1. Комплексы готовили путем смешения растворов ДНК и лигачда соответствуицих концентраций. Определение количества связанного красителя (" , приходящегося на пару оснований ДНК, проводили спектрофотометрически. Титрование проводили на спектрофотометре " ЦУ - $ресог-с£ " (ГДР). Для разбавления раствора при концентрационных измерениях вязкости и ДЯП использовали растворитель, в котором концентрация лиганда равнялась концентрации свободного красителя в исходном растворе.

Взаимодействие молекулы катквной ДНК с акридиновыми красителями. Из кривых спектрофотометрического титрования следует, что константа связывания с ДНК при ^ =0,1 К = (2,0 - 0,2)•10^ ИГ1, число мест связывания П0 , приходящихся на пару оснований ДНК, равной (0,40 - О.Сй).

комплекса ДНК - 11Ф возрастает линейна с увеличением Ь . В отличие от 11Ф в тех же условиях растворителя по данным,

Опыт показал, что в 0,1 ММа(£

полученным в лаборатории Фрисман Э.В., комплексов ДНК с АО увеличивается с ростом Г" нелинейно, однако зависимость от Г носит линейный характер. Такое различие в поведении двух комплексов акридиновых красителей с ДНК можно качественно объяснить, если учесть, что равновесная константа самоассоциации АО почти на порядок превосходит Кд для ПФ. Это способствует интенсивной ассоциации молекул АО и внешнему связыванию с молекулой ДНК. Последнее приводит к уменьшению дальних электростатических взаимодействий в молекуле ДНК и соответственно к некоторому падению • В предположении, что объемные эффекты одинаковы для свободной ДНК и её комплекса с красителем, относительное изменение термодинамической жесткости цепи ДНК при взаимодействии с красителем может быть определено из вискозиметрических измерений следугацим образом

/у V [11в / Л м, / ' Ьг. ■ (9)

Л ' И."'

Здесь и далее индекс Г указывает на характеристику комплекса, а индекс " О " - на характеристику свободной ДНК;

1. - контурная длина макромолекулы.

Отношение независимым образом можно получить из

результатов исследования ДЯП, если воспользоваться соотношением

-о (сп]/01])0(а„ -а^

Величины ¿(,.11 (<3|,-<Эх)г, в соотношениях (9) и (10) вычисляются на основании модельных представлений комплекса. В случае правильно выбранной модели связывания величины полученные с помощью соотношений (9) и (10), должны совпадать.

Расчеты свидетельствуют о том, что интеркаляционная модель связывания ПФ с ДНК удовлетворяет экспериментальным результатам. При этом встраивание красителя происходит перпендикулярно оси двойной спирали ДНК и расстояние между хромофором красителя и парами оснований в месте интеркаляции равно длине нуклеотида в 6 -форме ( £ = 0,34 нм). Такая же модель вытекает и из результатов исследования комплексов ПФ с ди-нуклеотидами, рассмотренными в предыдущей главе. Иные углы наклона хромофора красителя к оси спирали и длины мономерного звена при интеркаляции лиганда, а также модель внешнего связывания ПФ с ДНК противоречат полученным экспериментальным данным.

Комплексы нативной ДНК с дауномицином. Оптические спектры дауномицина при его взаимодействии с ДНК приобретают мета-хромный характер и имеют хорошо выраженную изобестическую точку при ^ =0,1. Константа связывания дауномицина с ДНК в этих условиях К = (4,5 ± 0,1)-Ю5 ЬГ1 и Па = (0,32 -- 0,02). При ^ = 0,001 четкая изобестическая точка отсутствует. Оценка величины константы связывания дает следующие результаты: при малых Г К = (7,0 - 0,5)-Ю5 М-1, при

+ е; т

больших К = (1,8 - 0,2)-10 М . Следовательно, уменьшение ^уи на два порядка незначительно увеличивает значение константы энергетически сильного типа связывания дауномицина с ДНК и приводит к появлению энергетически слабого типа.

нелинейный характер.

Экспериментальные данные анализировались исходя из двух альтернативных моделей связывания дауномицина с ДНК: внешней и интеркаляционной. Расчет {О.,, - V в формуле (10) был

В отличие от комплексов ДНК - ПФ, зависимости ]

'[У}))* от 1Г для комплексов ДНК с дауномицином носят

и

сделан в предположении, что при связывании с ДНК плоскости хромофора и аминосахарного остатка молекулы дауномицина имеют некоторую свободу ориентации относительно оси двойной спирали ДНК: У и Ч' - углы меаду осью двойной спирали ДНК и перпендикулярами к плоскостям хромофора и аминосахарного кольца соответственно.

Расчет показал, что совпадение величин найден-

ных при помощи соотношений (9) и (10) для модели внешнего связывания имеет место лишь при = 77 - 5°, что противоречит литературным данным ( ^ ^ 30°). Для модели интеркаля-ции наилучшее совпадение ^ /Во » вычисленных по данным вискозиметрии и ДШ1, наблюдается при = О - 5° и ^ =25-- 5°. Равновесное положение аминосахарного остатка относительно хромофора в растворе существенно отличается от наблюдаемого в кристалле ( ^ = 90°).

Результаты гидродинамических и оптических исследований комплексов ДНК с дауномицином при ^ - 0,001 позволяет заключить: в области 0 < Г ^ 0,3 связывание, в основном, носит интеркаляционный характер. При дальнейшем связывании красителя с ДНК (0,3 0,6) одновременно реализуются

два типа присоединения молекул дауномицина к двойной спирали ДНК: интеркаляционноё и внешнее связывание. При Г > 0,6 решающую роль играет внешнее связывание.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ I. Исследовано гидродинамическое и оптическое поведение молекулы денатурированной ДНК разной молекулярной массы в широкой области ионных сил (^ ). Зависимости характеристической вязкости денатурированной ДНК различной молекулярной массы от ионной силы среда хорошо согласуются с соответствующими

теоретическими и экспериментальными данными для гибких полиионов. Определены невозмущенше размеры и термодинамическая жесткость молекулы денатурированной ДНК при различных ^/и. и -в- -условия для денатурированной ДНК.

2. Получены зависимости характеристической вязкости денатурированной ДНК от молекулярной массы полимера при различных ионных силах.

3. Установлено по данным оптической анизотропии молекулы денатурированной ДНК, что равновесное положение азотистых оснований относительно направления цепи главных валентностей зависит от ионной силы среды.

4. Обнаружен кооперативный конформационяый переход в третичной структуре молекулы ДНК в области малых концентраций спирта, обусловленный нарушением пространственной структуры воды. Концентрация спирта, соответствущая переходу, а тахжа относительное изменение размеров молекулы ДНК при переходе зависит от длины и разветвленности углеводородного радикала молекулы спирта.

5. Методами вискозиметрии и двойного лучепреломления в потоке обнаружено возрастание Щ] ДНК в водно-солевом растворе с повышением температуры в интервале 283-313 К вне зависимости от вида катиона щелочного металла и его концентрации (0,1 - 0,001 М). Влияние температуры на размеры молекулы ДНК возрастает с уменьшением концентрации ионов.

6. Область концентраций спирта, при которых наблюдается конформационный переход в третичной структуре молекулы ДНК

в смесях трет-бутанол-вода ( ^ = 0,001), обусловленный структурными перестройками в растворителе, при повышении температуры расширяется и смещается в сторону меньших концентраций. Изменение ДНК при переходе из з&сксйг от темпере,-

тура в исследуемом интервале температур.

7. Размеры молекулы ДНК в растворе зависят не только от величины ионной силы раствора, но также и от размера катиона, степени его гидратации, возможности образования направленных водородных связей с молекулами воды.

8. Характер поведения молекулы ДНК в смесях диоксан-вода не отличается от наблюдаемой в спирто-водных растворителях. Кооперативный переход в третичной структуре молекулы ДНК наблюдается при концентрации диоксана ~ 3 (мол %). Полученные результаты позволяют заключить, что диоксан следует отнести к. стабилизаторам, а не разрушителям структуры воды.

9. При анализе конкурентного влияния агентов, стабилизирующих (малые добавки трет-бутанола) и разрушающих (малые добавки мочевины) структуру воды на конформацию молекулы ДНК, обнаружено, что присутствие спирта в растворителе в концентрациях, стабилизирующих структуру воды, препятствует изменения ДНК при добавлении в раствор значительного количества структуроразрушителя - мочевины. Установлено, что кооперативный информационный переход в третичной структуре молекулы ДНК происходит при определенном соотношении молекул мочевины и спирта (на три молекулы трет-бутанола примерно одна молекула мочевины в растворителе).

10. Предложен молекулярный механизм наблюдаемых конформа-ционных изменений в третичной структуре молекулы нативной ДНК в водно-органических растворителях, который включает в себя следующие основные положения: а) взаимодействие низкомолекулярных органических соединений с молекулой ДНК в значительной степени определяется структурой растворителя; б) характер этого взаимодействия зависит от типа функциональных групп

молекулы неэлектролита, определяющих природу образующихся в воде молекулярных ассоциатор; в) уменьшение объемных эффектов в молекуле ДНК в растворах, содержащих структуростабили-эируицие неэлектролиты, в основном, связано с изменением электростатических взаимодействий противоионов с заряженными фосфатными группами молекулы ДНК; определенную роль в подавлении объемных аффектов в молекуле ДНК может играть ухудшение качества, растворителя при нарушении упорядоченной структуры воды.

11. При высоком содержании этанола в смеси (75 об % и 80 об %) и JH- = 0,001 наблюдается конформационный переход во вторичной структуре молекулы нативной ДНК (В А). В предположении постоянства эффекта микроформы ДНК в водно-органических растворителях можно сделать вывод о неизменности термодинамической жесткости молекулы ДНК в В- и А-формах.

12. Oí „ еделены значения равновесных констант самоассоциации красителей акридинового ряда, протонных химических сдвигов в мономерах и агрегатах и наиболее вероятные структуры димеров ПЗ и АО.

13. Предложены и обоснованы методики расчета гараметров ассоциации ароматических молекул, & также комплексообразова-ния красителей с моно- и динуклеотидами. Рассчитаны равновесные константы ассоциации ПФ и АО, образования 1:1 комплексов ПФ с 5'AMO, актиномицина Л) ' с 5'дАМФ и актиномицина Л

с б'дГЩ в водном растворе. Определены наиболее вероятные структуры 1:1 комплексов этих молекул. Найдены значения констант ассоциации для 1:1 и 1:2 комплексов ПФ с ГФЦ, бромистого этидия с дЦФдГ и актиномицина -2> с ФдГФдЦ. Определены наиболее вероятные структуры 1:1 и 1:2 комплекссв исследованных красителей с динуклеотидами.

14. Установлено преимущественносвязывание П<5 с пиримидин--пуриновой последовательностью оснований.

15. Определены изменения свободной энергии Гиббса, энтальпии и энтропии для реакций само ассоциации ПФ, динуклеоти-дов ЦФГ и ГФЦ, образования 1:1 и 1:2 комплексов Пф с ГФЦ и ЦФГ по температурным зависимостям химических сдвигов протонов исследованных молекул в видном растворе в диапазоне температур от 294 К до 354 Н.

16. Установлено, что гидрофобные взаимодействия играют существенную роль при образовании 1:2 комплексов красителя с динуклеотидами.

17. Гидродинамические и оптические исследования свидетельствуют з пользу интерполяционного связывания ПФ с ДНК

( JL = 0,1). При интеркаляции плоскость хромофора красителя ориентирована перпендикуляр! оси двойной спирали ДНК.

18. При JU »0,1 имеет место интерналяцчонноа взаимодействие даунсмицина с ДНК. Взаимная ориентация плоскостей хромофора и аминосахарного остатка молекулы дауномицина в кристалле отличается от наблюдаемой в растворе в составе комплекса с ДНК. При малых Г (0 ^ Г 0,3) и / . 0,001 связывание дауномицина с ДНК носит, а основном, интаркаляци-онный характер. Прг Г > 0,6 решающую роль играет внеянеа спязывание.

19. Проведенные исследования влияния различных вноэних Факторов (неэлектролитов и электролитов при разных концентрациях, температуры, низкомолокулярных ароматических лиги-щов) .ча конформацию молекулы нуклеиновой кислоты а растворе, сан ч-тельствует о том, что третичная и вторичная струн.урн макромолекулы чрезвычайно чувствительна к любому рассмотренному аяменению условий растворителя.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах

1. Фрисман Э.В., Веселков А.Н., Слоницкий C.B., Воробьев В.И. Влияние растворителя на конфошацив молекулы дезоксирибо-нуклеиновой кислоты. //Докл. АН СССР. - Й74. - Т.214,

*2. - С.468-471.

2. Веселков А.Н., Слоницкий C.B., Фрисман Э.В. Конформация молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в водно-этанольных растворителях. //Молекулярная физика и биофизика водных систем.-Л., 1974.-Вып.2.-С.104-Н4.

3. ?risnai В.V., Veselkov A.H., Slonitsky S.V.,et al.The influence of alcohol-water solvents on the confornation of B-oxyribonucleic Acid.//Biopolynexs.-1974.-УИЗ.--r.215^-3178.

4. Веселков A.H., Бильке К., Фрисман Э.В. Влияние структурных изменений в растворителе на конфоомацию молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). //Вестник Ленингр. ун-та.-1974.-Т.16.-С.62-67.

5. фрисман Э.В., Веселков А.Н. Влияние структуры растворителя на конфсрмацию молекулы ДНК. //Десятая Всесоюзн.конф. по физике жвдк.сост.вещества: Тез.докл.-Самарканд, 1974. -

С.19-20.

6. Веселков А.Н., Слоницкий C.B., йрисман Э.В. Исследование конформации молекулы ДНК в спирто-водных смесях. 7/Кон-^осмационные^изменения биополимеров в растворах.-Тбилиси,

7. Слоницкий C.B., Веселков А.Н., фрисман Э.В. Конформация молекулы нативной ДНК в водно-органических растворителях. // Третий Всесоюзн.симпозиум по межмолекулярному взаимодействии и конфорыациям молекул: Тез.докл.-Пущино,1976.

8. Веселков А.Н., корошкин В.А., Полякова И.Д., Шпунгин И.Л., Фрисман Э.В. Конформация молекулы денатурированной ДНК в растворах с разной ионной силой. //Молекуляр.биология. -1976.-Т. 10, Î5.-C.I050-I059.

9. Фрисман Э.Б., Слоницкий C.B., Веселков А.Н. Влияние структуры растворителя на конформацию молекулы нативной ДНК. //Материалы международной конференши по квантовой химии, биологии и фармакологии: Тез.докл.-Ш.-Киев, 1978,

- С.62.

10. ïxisuan S.V., Slonitsky S.V., Veseliov Zr-f luenc; of solvent structure on ti-e conformation of the na-ive DÖA aolecuie.//Inr.J.Quaiit.Che;;.-1S79.-'7 •

11. Веселков А.Н., Фрисман Э.В. Конформация молекул ДНК в спирто-водных растворителях, //молекуляр.биология.-1979.

12. Морошкина Е.Б., Веселков А.Н., Морошкин В.А. и др. Исследование комплексов ДНК с дауномицином и фрагментами гис-тонов. //Материалы шестого симпозиума по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул: Тез.докл.-Вильнюс, 1982.-С.42.

13. Веселков А.Н. Применение метода ЯМР высокого разрешения для исследования взаимодействия красителей с нуклеотида-ми в водном растворе. //Материалы первого Всесоюзн.биофизического съезда: Тез.докл.-М.,1982.-Т.I.-С.97.

14. Морошкина Е.Б., Веселков А.Н., Фрисман Э.В. Взаимодействие ДНК с дауномицином. //Материалы первого Всесоюзн.биофизического съезда: Тез.докл.-И.,1982.-Т.I.-С.98.

15. Веселков А.Н., Дэвис Д., Савдерсон М., Тернер К. Исследование взаимодействия профлавина с моно- и динуклеотидами в водном растворе методом ЯМР высокого разрешения. //Молекулярная физика и биофизика водных систем.-JI. ,1983.--Вып. 5.-С. 66-84.

16. Веселков А.Н., Дэвис Д., Сандерсон М., Тернер К. Исследование агрегации молекул красителей акридинового ряда в водном растворе методом ЯМР высокого разрешения. //Молекулярная Физика и биофизика водных систем.-JI. ,1983.-Вып. 5.—С•85—97.

17. Веселков А.Н., Морошкина Е.Б., Соболева О.И., Фрисман Э.В. Сравнительное исследование взаимодействия ДНК с дауномицином и профлавином в растворе. //Молекуляр.биология.-I984.-T.I8, № 2.-C.48I--48?.

Id. Куликов Э.Л., Веселков А.Н., Дымант Л.Н. Применение ассоциативного вариационного принципа для обработки данных физического эксперимента. //УФЖ.-1984.-Т.29, № 10.-C.I477-

19. Веселков А.Н., Дымант Л.Н., Куликов Э.Л. Применение вариационных методов обработки экспериментальных данных при исследовании агрегации молекул акридиновых красителей методом ядерного магнитного резонанса высокого разрешения. /Дим.физика.-1984.-Т.3, № 8.-C.II0I-II08.

20. Veselkov A.Ii., Djimant L.M., Karawaew L.3., Kulikov B.L. Investigation of the aggregation of acridine dyes in aqueous solution by proton Hfffl.//Stud.Biophysica.-l985.--V.IO6.-P.I7I-I8O.

21. Veselkov А.Й., Karawaew L.S. Effect of temperature 011 the D1IA conformation in water-tert-butanol mixturen.//

Stud.Ъ i ophysi ca.-1985.-V.107, .-P.7 5-S2.

22. Куликов Э.Л., Веселков А.Н., Дымант Л.Н. Вариационный метоп построения функции потерь в задачах идентификации. //Материалы четвертого Всесоюзного симпозиума "Методы теории идентификации в задачах измерительной техники и метрологии" :Тез.докл.-Новосибирск,1985.-С.207-208.

23. Веселков А.Н., Сибилева U.A., Фрисман Э.В. Влияние температуры на конформацию молекулы нативной ДНК в водных растворах электролитов. //Материалы симпозиума: "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках": Тез .докл. -Пущино,1985.-С.1Г'-I52.

24. Веселков А.Н., Дымант Л.Н., Куликов 8.Л. Исследование агрегации молекул акридинового оранжевого методом протонного магнитного резонанса. /ДСХ.-1985.-Т.26.-С.43-46.

25. Сибилева Ы.А., Веселков А.Н., Фрисман Э.В. Исследование конформации молекулы нативной ДНК в водных растворах солей щелочных металлов при различных температурах. //Материалы шестого симпозиума по конформационным изменениям биополимеров в растворах: Тез.докл.-Тбилиси.-1985.-C.I3I.

26. Веселков А.Н., Барановский С.Ф., Дымант Л.Н. Исследование ассоциации красителей акридинового ряда методом протонного магнитного резонанса. /Дим.физика.-1986.-Т.о.-С.318-323.

27. Дымант Л.Н., Веселков А.Н., Барановский С.Ф. Использование ассоциативного вариационного принципа для оптимизации обработки результатов наблюдений. //Изв.вузов СССР, сер. "Приборостроение".-1986, » II.-C.7-I3.

28. Куликов ЭЛ., Дымант Л.Н., Веселков А.Н., Барановский С.Ф. Повышение точности приборных устройств путем реализации алгоритма на основе ассоциативного вариационного принципа. //Приборостроение.-К., 1986.-Вып.38.35.83-88.

29. Веселков А.Н., Дымант Л.Н., Барановский С.Ф. Исследование взаимодействия профлавина с аденозинмонофосфатом в водном растворе методом протонного магнитного резонансе. /Дим. физика.-1986.-Л1.5I0.-C.I334-I339.

30. Веселков А.Н., Дымант Л.Н., Барановский С.Ф. Исследование взаимодействия профлавина с изомерными дирибонуклеозид-монофосфатами Ср& и GpC методом протонного магнитного резонанса. //Молекуляр.биология.-1986.-Т.20,» 5.-С.1244-1250.

31. Веселков А.Н., Дымант Л.Н. Исследование структур комплек-

Р®0™?0 методом

32. Дымант Л.Н., Веселков А.Н., Барановский С.Ф. Алгоритм обработки результатов измерений на основе ассоциативного вариационного принципа в задачах с несколькими параметрами. //Приборостроение.-К.,1987.-Вып.39.-С.81-84.

33. Веселков А.Н., Дымант Л.Н., Древаль С.С. Исследование самоассоциации молекул про}-------- " -----------------------

водном растворе метод" -I987.-TT23.-C.373-

34. Веселков А.Н., Дымант Л.Н., Барановский С.Ф. Определение термодинамических параметров взаимодействия профлавина с дирибонуклеозвдмонофосфатаыи CpG и GpC в водном растворе

мант л.п., древаль ъ.ъ. писледование ua-

кул профлавина и акридина оранжевого в зто^ом ЙМР-Н. /Деорет. и эксперим.химия.

по данным протонного магнитного резонанса- //Молекуляр. биология.-1987.-Т.21.-Вып.4.-С.1110-Шб.

35. Сибилева Ы.А., Веселксв А.Н., Шилов С.В., Фрисман Э.В. Влияние температуры на конформацию молекулы нативной ДНК в водных растворах щелочных металлов. //Молекуляр.биология. -1987.-Т.2П-Вып.З. -С. 647-653.

36. Veselkov A.N., Kaxawaew L.S., Djimant Ь.П. Proton magnetic resonance study of complex formation between proflavine and diribonucleoside monophosphates in aqueous solution:

I.Structure analysis.//Stud.biophysica.-1987.--У.120, П.-P.87-97-

37. Veselkov A.U., Karawaew L.S., Djiaant I.K. Pro ton magnetic resonance study of complex formation between proflavine and diribonucleoside monophosphates in aqueous solution:

II.Thernodynamiс analysis.//Stud.Biophysica.-19&7---7.120, !,f1,-P.99-Ю7.

38. Veselkov A.II. Proton magnetic resonance study of complex forraation between aromatic lignnds and dinucleotides in aqueous solution.//Proceedings of 7/AT0C-87 Congress.-Budapest.-1537.-P.£21.

39. Djicant ~L.r,.t Veselkov А.П. I" HiS determination of ttosr-modynamical parameters of isomeric diribonucleiside monophosphates CpG and GpC dineiizati on and complex fcrnation •in. th* proflavine in acueous solution,//Proceeding of '.7ATOC -37 0 ongr ess. -3udap est.-1967.-P.92.

40. Веселкоз A.H., Барановский С.Ф., Дымант JI.H., Рыбаков А.Г. Определение параметров комплексооОразования и структур комплексов ароматических лигандов с мононукдеотидами в растворе по даннымгН-ЯМР. //Ред.журн. "Еиофизика'.-М., I988.-25 с. - Библиогр.: 20 назв. Деп. в ВИНИТИ, 973-В87.

41. Веселков А.Н., Дымант Л.Н. Учет кооперативности при само-ассопиации молекул акридиновых красителей в водном растворе. //Хим .физика. -1988. -Т. 6. -С .337 -389.

42. Дымант Л.Н., Веселков А.Н., Барановский С.Ф., Рыбаков А.Г. Применение ассоциативного вариационного принципа в эада-че^ед^кции^к^за^анному прибору. //Приборостроение.-К.,

43. Веселков А.Н., Барановский С.Ф., Дымант Л.Н., Рыбаков А.Г. Определение параметров комплексообразования и структур комплексов ароматических лигавдов с динуклеотидами а раствор о по данным 1Н-ШР. //Ред.журн. "Биофизика".-М.. ¿988.: 2о С.- Библиогр.: 32 назв. - Деп. в ВИНИТИ, »74-387.

Зак. N9 157 БЯ 09092 16.02.88 г. т. 200 КМУ СПИ