Пространственная структура модифицированных нуклеозидов и ее связь с биологической активностью

Гурская, Галина Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Пространственная структура модифицированных нуклеозидов и ее связь с биологической активностью
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Пространственная структура модифицированных нуклеозидов и ее связь с биологической активностью"

*V Б од

2 5 СЕЙ

российская академия наук

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им.В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

гурская галина викторовна

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА МОДИФИЦИРОВАННЫХ НУКЛЕОЗИДОВ И ЕЕ СВЯЗЬ С БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

03.00.03 - молекулярная биология

диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора химических наук

москва 1995

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор, академик

А.А. КРАЕВСКИИ

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, академик

доктор химических наук , профессор доктор химических наук, профессор

А .А. БОГДАНОВ Г.Н. ТИЩЕНКО С.Н. КОЧЕТКОВ

Ведущая организация: ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ ИМ.

М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА РАН

1 Защита диссертации состоится " & ^У^Щ^' 1995 г. в часов на

заседании Диссертационного совета Д 002.79.01 по защите докторских диссертаций при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, В-334, ул. Вавилова, дом 32.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Диссертация в виде научного доклада разослана

995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

А.М. КРИЦЫН

Актуальность темы. Пространственная структура биологически активных соединений является одним из основных факторов, определяющих особенности их функционального поведения на молекулярном уровне. Поэтому не удивительно, что основные фундаментальные успехи в области молекулярной биологии в значительной степени достигнуты благодаря результатам рентгеноструктурных исследований. В процессе жизнедеятельности биологических систем одна из ведущих ролей принадлежит нуклеиновым кислотам и их компонентам -нуклеозидам и нуклеотидам. Благодаря участию в метаболических процессах и взаимодействию с ключевыми ферментными системами, компоненты нуклеиновых кислот и их многочисленные производные имеют важное значение для поиска новых лекарственных веществ. Среди соединений этого класса обнаружены эффективные противовирусные, противоопухолевые, кардиотонические и иммуномодулирующие агенты.

Разработка научных основ целенаправленного поиска биологически активных соединений с заданным спектром активности является одной из главных задач современной молекулярной биологии, биоорганической химии и фармакологии. Решение этой задачи неразрывно связано со знанием пространственных структур исследуемых соединений и их корреляции с биологической активностью.

Основными химическими подходами при создании новых биологически активных аналогов нуклеозидов и нуклеотидов являются: а) замена или удаление функциональных групп в углеводном или гетероциклическом фрагментах ; б) замена углеводного компонента молекул ациклическим; в) создание конъюгатов с другими биологически активными соединениями; г) введение химически инертных заместителей (например, СНз-групп) вместо атомов водорода в углеводных фрагментах с сохранением всех функциональных групп, характерных для природных соединений.

Проведенные нами серии рентгеноструктурных исследований пространственного строения аналогов нуклеозидов охватывают почти все вышеприведенные типы модификаций. Однако, особое внимание нами уделено изучению закономерностей в строении молекул З'-замещенных 2',3'-дидезоксинуклеозидов, в число которых входят основные лекарственные соединения, используемые в медицинской практике для лечения больных СПИДом.

В настоящее время установлено, что нуклеотидные остатки 5'-трифосфатов некоторых З'-замещенных 2',3'-дидезоксинуклеозидов могут включаться в 3'-конец новосинтезируемой цепи ДНК и, из-за отсутствия у них З'-гидроксила или же изменения его реакционной способности, прерывать (терминировать) ее дальнейшую элонгацию. В случае вирусов это влечет ингибирование их репродукции. Такие свойства З'-замещенных аналогов нуклеозидов широко используются для создания новых лекарственных препаратов, а также для фундаментальных исследований механизмов функционирования ДНК-полимераз различного происхожения.

Сродство и специфичность модифицированных нуклеозид-5'-трифосфатов к тому или иному виду ДНК-полимераз зависит как от химического структуры заместителя в З'-положении, так и от пространственного строения молекулы в целом. В- целях выяснения стереохимических аспектов субстратной специфичности ряда ДНК-полимераз нами исследовано пространственное строение молекул конфориационно подвижных и конформационно ограниченных, специфичных и неспецифичных терминаторов синтеза ДНК, подавляющих репродукцию рет-ровирусов, в том числе вирусов иммунодефицита человека (ВИЧ), изучена корреляция пространственных структур этих соединений с их биологической активностью, выявлены структурные закономерности, ответственные за узнавание и специфичность модифицированных нуклеозидов. Последнее крайне необходимо для организации целенаправленного поиска селективных ингибиторов обратных транскриптаз ретровирусов, включая ВИЧ.

Цель работы. Основной задачей настоящей работы было получение кристаллов и исследование методом рентгеноструктурного анализа пространственного строения молекул семи групп модифицированных нуклеозидов, включая известные антивирусные агенты, выявление основных конформационных закономерностей строения их молекул и установление корреляции между ' пространственной структурой и биологической активностью исследуемых классов соединений. Особое внимание в работе уделено изучению нескольких групп родительских нуклеозидов терминаторных субстратов ДНК-пояимераз различного происхождения с целью получения структурной информации для целенаправленного поиска новых эффективных блокаторов ВИЧ.

Научная новизна и практическая ценность

I. На основе рентгеноструктурных исследований впервые установлены пространственные структуры и получены конформационные параметры нескольких групп соединений: 1. Группы конформационно подвижных З'-замещенных 2',3'-дидезоксинуклео-зидов: блокатора репродукции ВИЧ 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидина (¿сЩЗ'Ыз), AZT), 5'-трифосфат которого является специфичным ингибитором обратных транскриптаз, неспецифичного ингибитора биосинтеза ДНК З'-ами-но-2',3'-дидезокситимидина (сМТ(3'>Щ2)) , 5'-трифосфат которого проявляет свойства терминаторного субстрата ДНК-полимераз различного происхождения, и его аналога 3'-метиламино-2',3'-дидезокситимидина (сЫТ(З'ЫНМе)), специфичных ингибиторов репродукции ВИЧ 3'-нитро-2',3'-дидезокситимидина (сМТЙЗТМОг)), 3'-гидроксимино-2',3'-дидезокситимидина (сМТ(3'=КОН)) и его метильного аналога 3'-метоксимино-2',3'-дидезокситимидина (сМТ(З-ЫОМе)) > соединений с объемными ациклическими и циклическими заместителями З'-О-метилтиометил-2'-дезокситимидина (сЩЗ'ОСНгЗ Ме)), З'-О-метилсульфинил-метил-2'-дезокситимидина ((ЩЗ'ОСНгБОМе)), 3'-(теграз6л-2"-ил)-2',3'-дидезок-ситимидина (ddT(3,tetг)) и 3'-(5"-метилтетразол-2"-ил)-2',3'-дидезокситимидина (сШТ(ЗЧе1г-5"Ме)).

2. Конформационно ограниченных по фуранозному циклу блокаторов биосинтеза ДНК: 2',3-ликсоангидротимидина (1аТ), 2',3'-рибоангидроаденозина (гаА), 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидина (й-ГГ), З'-метил-г'-дезокситимидина (<1ТЗ'Ме)

3. Конформационно подвижных и конформационно ограниченных соединений

с двойной модификацией по углеводному циклу : З'-хлор^'-метил^'.З'-дидезок-ситимидина (¿ёТ(3'С1,4'Ме)), 4'-гидроксиметил-2',3'-ликсоангидроцитидина (1аС(4'СНЮН)), 4'-гидроксиметил-2',3'-рибоангидроаденозина (гаА(4'СН20Н)), 3,(8)-метил-3'(К)-фтор-2',3'-дидезокситимидина(д<1Т(3'Ме,Р)).

4. Группы диоксолановых аналогов 2',3'-дидезоксинуклеозидов: уис-4(К,5)-гидроксиметил-2(8Д)-(тимин- 1-илметил)-1,3-диоксолана (цис-4(11,5)Т-1,3ди-окс), ^ис-2(К,8)-гидроксиметил-4(8Д)-(тимин-1-илметил)-1,3-диоксолана (цис-2 (К,8)Т-1,Здиокс) и трайс-4(К,8)-гидроксиметил;-2(8,К)-(урацил-1-илметил)-1,3-диоксолана (транс-4(К,8)С-1 ,Здиокс).

5. Аналогов нуклеозидов, в которых сохранены все функциональные группы природных нуклеозидов, потенциально необходимые для связывания с ферментами биосинтеза нуклеиновых кислот: 2'-метилуридина (и(2'Ме)), З'-ме-тилцитидина (С(З'Ме)), 5'(К)-метилцитидина (С(5'(К)Ме)), 5'(3)-метилцитидина (С(5'(8)Ме)), 5'(5)-метил-2-дезокситимидина (с1Т(5'(8)Ме)) и Г-гидроксиметил-цитидина (С(1'СН*ОН)).

6. Ангидронуклеозидов с закрепленной ам-конформацией вокруг гликозидной связи: 6,1'-ангидро-6-гидрокси-1-(2-Р-0-псикофуранозил)цитозина (б.Г-О-аО) и 8,Г-ангидро-8-гидрокси-9-(2-)3-0-псикофуранозил)аденина (8,Г-0-аАр).

7. Ациклических аналогов рибавирина и ацикловира, проявляющих различную степень антигерпесной активности: 1-(2-гидроксиэтоксимегил)-1,2,4-триазол-5-карбоксамида (5-НЕМТ), 1-(1,5-дигидрокси-3-оксапент-2-ил)-1,2,4-

триазол-5-карбоксамида (5-DHPT), 1-(2-гидроксиэтоксиметил)-1,2,4-триазол-З-карбоксамида (3-НЕМТ) и (8)-9-(2,3-дигидроксипропнл) аденина ( (S)-DHPA).' •

II. Впервые определены пространственные структуры лекарственных соединений, используемых в медицинской практике для лечения больных СПИДом -3'-азидо-2',3'-дидезокситимидина ( зидовудина, ретровира, тимазида, AZT) и 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидр0тимидина (ставудина), проанализированы основные конформационные свойства этих соединений, ответственные за активность, включая конформационную подвижность молекул и ориентацию азидогруппы, имитирующую ориентацию гидроксигруппы природных нуклеозидов, в случае первого соединения и плоскостное строение углеводного цикла - в случае второго.

III. На основе стереохимических данных, полученных для конформационно ограниченных соединений 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидина, 2',3'-ликсоан-гидротимидина и 2',3'-рибоангидроаденозина, показано, что высокое сродство и относительно низкая специфичность 5-трифосфатов 2',3'-дидезокси-2',3'-диде-гидронуклеотидов к различным ДНК-полимеразам, включая обратные транкриптазы ретровирусов, коррелируют с плоскостным строением их фу-ранозных циклов, которое, по-видимому, моделирует структуру природного dNTP в ДНК-синтезирущем комплексе. Выявлена пониженная субстратная специфичность обратных транскриптаз по сравнению с другими ДНК-полимеразами к различным конформационным состояниям субстрата.

IV. Изучено влияние на конформацию молекул нуклеозидов введения вместо атомов водорода метальных заместителей по атомам углерода в 2'-, 3'- и 5'-положениях их углеводных фрагментов. Установлено увеличение длин С-О-связей при всех метилированных атомах углерода в углеводных остатках, которое может приводить к уменьшению реакционной способности соответствующих гидроксильных групп. Обнаружена конформационная ограниченность у З'-ме-тилпиримидиновых нуклеозидов, обусловленная стерическими затруднениями, возникающими между атомами объемных метальных групп, расположенных над углеводными циклами со стороны оснований, атомами оснований и атомами 5'-гидроксиметильных групп. Дано возможное стереохимическое объяснение причин наличия у 5*-трифосфатов З'-мегилнуклеозидов свойств терминаторных субстратов в РНК-синтезирующих системах и отсутствие их в ДНК-синтезирующих комплексах.

Полученный обширный рентгеноструктурный материал внесен в Международный Кристаллографический Банк Данных (Кембридж, Великобритания) и может служить структурной базой для целенаправленного конструирования и синтеза новых объектов с заданным спектром биологической активности, для фундаментальных и прикладных исследований в области биологии, химии и медицины.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на : I Всесоюзном Биофизическом Съезде (Москва, 1982); Всесоюзной конференции "Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов" (Рига, 1982); VIII Международном Конгрессе Кристаллографов (Гамбург, ФРГ, 1984); IV и VI Всесоюзных совещаниях по органической кристаллохимии (Звенигород, 1984; Киев, 1991); VII Международном симпозиуме по химии компонентов нуклеиновых кислот (Бехине, ЧССР, 1987); Международном симпозиуме по компьютерным методам в молекулярном моделировании (Шлосс-Эльмау, ФРГ, 1988); Международной школе по трехмерной молекулярной структуре и действию лекарств (Эриче, Италия, 1989); Международном симпозиуме по органической кристаллохимии (Познань, Польша, 1989); XII Европейском совещании кристаллографов (Москва, 1989); Международном симпозиуме "Синтез' олигонуклеотидов, проблемы и границы практического

применения" (Москва, 1991); IV и V Международных конференциях по росту кристаллов биологических макромолекул (Фрайбург, Германия, 1991; Сан-Диего, США, 1993); Международной конференции "СПИД, рак и ретровирусы человека" (Санкт-Петербург, 1992); X и XI Международных круглых столах "Нуклеозиды, нуклеотиды и их биологическое применение" (Парк-сити, США, 1992; Лувен, Бельгия, 1994); XVI Европейском совещании кристаллографов (Лунд, Швеция, 1995).

Структура работы. Диссертация изложена в виде научного доклада. Основная часть результатов получена в соавторстве с E.H. Цапкиной, Г.М. Джавадо-вой, A.B. Бочкаревым, В.Е. Заводником. Вклад других соавторов отражен в публикациях по теме диссертации. Исследованные соединения были синтезированы в Институте молекулярной биологии РАН (в лабораториях A.A. Краевского, С.Н. Михайлова, Б.П. Готтиха и В.Л. Флорентьева), в Московской медицинской академии им. Сеченова (И.И. Федоров, Э.М. Казьмина), в Институте тонкой химической технологии (А.Д.Шуталев, Ю.Е. Райфельд), в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова (С.Г.Завгородний), в Самарском государственном университете (А.В.Папчихин, П.П. Пурыгин). Всем коллегам приношу глубокую благодарность за участие в совместных работах. Искренне признательна A.A. Краевскому за постоянный интерес, поддержку и обсуждение работы.

Список остальных сокращений

dNTP - 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфат ВИЧ-вирус иммунодефицита человека AMV - вирус птичьего миелобластоза d«N - 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидронуклеозид raN - 2\3'-рибоангидронуклеозид laN - 2',3'-ликсоангидронуклеозид dT -тимидин

ddT(3'F) - 3'- фтор-2',3'-дидезокситимидин

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для изучения корреляции между пространственным строением молекул различных групп модифицированных нуклеозидов и их биологической активностью нами были проведены рентгеноструктурные исследования более 30 соединений, являющихся аналогами нуклеозидов деэохси- и рибо-рядов.

Необходимые для. рентгеновской съемки кристаллы всех исследованных соединений были выращены из их насыщенных растворов в различных органических растворителях либо методом медленного испарения растворителей при комнатной температуре или при Т=4°С, либо методом медленного охлаждения раствора от Т= 40-60°С до комнатной температуры.

Рентгеновская съемка кристаллов проводилась на автоматических дифрактометрах CAD4, Syntex P2i , Hilger-Watts методами 0/29- или ш/0-сканироваиия на СиКа- или МоКа - излучениях.

Пространственные структуры исследованных соединений определялись прямым методом по программам РЕНТГЕН-75, MULTAN и SHELX. Структуры уточнялись в основном полноматричным методом наименьших квадратов (МНК) в анизотропном приближении для атомов О, N, С. Положения атомов водорода в большинстве случаев определялись из разностных синтезов Фурье и уточнялись МНК в изотропном приближении. Некоторые кристаллографические данные для исследованных соединений приведены в табл.1.

Таблица 1. Некоторые параметры кристаллических структур исследованных соединений

Соединение Пространственная группа Число молекул в ячейке, Ъ Я-ф актор, %

(ШТ(ЗИ3) (АХТ) Р2( 4 3.5

асЩЗТМНг) Р2, 2(аат(зтмн2)-нс1) 2.4

¿сЩЗ'ЫНМе) Р2,2,2, 4 4.8

¿сЩЗ-МОг) Р21212, 4 2.1

аат(3'=ыон> Р1 1 4.2

сМТ(3'=>ГОМе) Р2, 2(йсИ(3,=ЫОМе)-Н20) 3.0

атСЗ'ОСНгЗМе) Р2,2,2, 4(с1Т(3'ОСН28Ме)Н20) 3.8

аТ(3'0СН250Ме) Р2| 2 2.8

(МТ(ЗЧе1г) Р212121 4 3.7

(Ш(ЗЧе12-5"-Ме) Р2,2,2, 4 5.9

1аТ Р1 2 3.8

гаА Р1 2 4.1

ч4т Р1 2 3.4

(ЗТ(З'Ме) Р2[ 2 2.3

1аС(4'СН2ОН) Р212121 4 3.7

гаА(4'СН2ОН) Р2,2,2, 4(гаА(4'СН2С>Н)Н20) 2.3

аат(3'С1,4'Ме) Р2[ 4 2.6

<МТ(3'(5)Ме,Р) Р2М 4 2.8

1*ис-4(К,8)Т-(1,3 диокс) Р1 2 4.4

)/»с-2'(К,8)Т-{1,3 диокс.) Р2,/Ь 4 3.9

/иранс-4(К,8)-и(1,3 диокс.) Р1 2 4.0

С(5'(Я)Ме) Р212121 4 3.9

С(5'(8)Ме) 4 3.2

<1Т(5'(3)Ме) Р212121 4 2.7

С(З'Ме) Р212121 4 6.2

С(1'СН2ОН) Р2,2,2, 4(С(1'СН2ОН)-2Н20) 4.0

и(1'Ме) рг^г 4(Щ2'Ме)-2Н20) 3.8

6,1-0-аСр) Р2, 2 5.6

В,1-0-аАр) Р1 2((8,1-0-аАР)-6Н20) 5.0

5-НЕМТ Р2,/с 4 4.5

5-ОНРТ Р2,/п 4 2.9

3-НЕМТ Р1 2 3.7

(З)-БНРА Р2| 2 4.2

Напомним, что метод рентгеноструктурного анализа дает наиболее полную и объективную, по сравнению с другими методами, информацию о пространственном строении исследуемых объектов, в том числе и биологически

активных соединений. Однако, этот метод имеет дело с кристаллами, а упаковка молекул в них иногда влияет на конформационные параметры конформационно подвижных фрагментов молекул, что может приводить к конформациям, отличным от конформаций в растворах. Поэтому наиболее полная информация о строении биологически активных соединений может быть получена при совокупном использовании методов рентгеноструктурного анализа для кристаллов, физико-химических методов для растворов, а также грамотно проведенных теоретических конформационных расчетов. В случаях, когда помимо рентгеноструктурной информации в нашем распоряжении имелись структурные данные, полученные другими методами, эти данные привлекались при анализе конформаций исследованных нами соединений. Отметим, что для изученных нами модифицированных нуклеозидов проведены полные рентгеноструктурные исследования с достаточно высокой точностью, но, в силу ограниченности объема диссертации, мы приводим только анализ конформационных особенностей молекул этих соединений, а длины валентных связей и величины валентных углов рассматриваются только в случае крайней необходимости. Полная же структурная информация представлена в оригинальных статьях, опубликованных по теме диссертации.

Для описания конформаций нуклеозидов в работе приняты рекомендованные комиссией ШРАС-IUB обозначения конформаций и торсионных углов (Eur. J. Biochem. 1983, V.131, р.9).

Конформацию молекул нуклеозидов принято описывать тремя основными параметрами: торсионными углами % , у и типом изгиба углеводного цикла.

Гликозидный торсионный угол x(04'-Cl'-Nl-C2) для пиримидинов или Х(04'-С 1-N9-C4) для пуринов характеризует взаимную ориентацию нуклеинового основания и сахарного остатка. Интервал углов х=0±90° определяется как область сии-конформации нуклеозидов, а интервал х='8О±90° - как область ашпи-конформации. Интервал углов % от 270" до ~ 300" принято называть областью высоких аи/иы-конформаций, а интервал углов от 90° до ~ 120° - высоких син-конформаций.

Торсионный угол у(05'-С5'-С4'-СЗ') описывает конформацию нуклеозида относительно С4-С5' экзоциклической связи. В структурах нуклеотидов и нуклеозидов обычно реализуется одна их трех конформаций: гош+ при у ~ 60°, гош" - при у~ -60° и транс - при у~ 180°.

Изгиб фуранозного цикла однозначно описывается с помощью параметров псевдовращения - фазового угла псевдовращения Р и максимальной амплитуды псевдовращения Ym. Фазовый угол Р характеризует азимутальное положение изгиба в пределах фуранозного цикла, a I'm описывает величину этого изгиба.

Р=0° и Р=180° соответствуют конформациям симметричного твиста- СЗ'-эндо-СХ-жзо СТг) и С2'-эндо-СУ-экзо (2Тз) . Конформации фуранозных циклов в пределах углов Р=0±90° относятся к N-популяции, а конформации углеводных циклов с Р=180±90" - S-популяции.

Отсчет торсионных углов ведется от заслоненной конформации. Значение торсионного угла A-B-C-D считается положительным, если для перекрытия дальней связи C-D ближняя связь А-В вращается по часовой стрелке.

МОДИФИЦИРОВАННЫЕ 2'-ДЕЗОКСИНУКЛЕОЗИДЫ. КОРРЕЛЯЦИЯ ПРОСТРАНСТВЕННЫХ СТРУКТУР С БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

В последние годы выявлены несколько групп модифицированных нуклеозидов (нуклеотидов) , проявляющих селективную антивирусную активность. Лидирующая) роль среди них занимают 3' -замещенные 2',3' -диде-зоксинуклеозиды , в числе которых найдено много соединений, эффективно

подавляющих ВИЧ в клетках. Для пяти из них уже дано разрешение на использование в клинической практике для лечения больных СПИДом, но у этих соединений обнаружена высокая токсичность и возникновение к ним резистентности у вирусов. Поэтому вопрос о поиске новых эффективных блокаторов ВИЧ остается открытым.

Молекулярный механизм действия З'-замещенных нуклеозидов включает их превращение в соответствующие монофосфаты, затем в дифосфаты и, наконец, в 5'-трифосфаты. Последние, встраиваясь в новосинтезируемую цепь ДНК, ингнбируют синтез провирусной ДНК по терминаторному механизму.

Многие нуклеозиды плохо фосфорилируются в клетках соответствующими нуклеозид- и нуклеотидкиназами из-за высокой специфичности этих ферментов. Такие соединения, несмотря на высокую активность на уровне их 5'-трифосфатов в модельных системах с ДНК-полимеразами, проявляют очень слабую активность в подавлении ВИЧ, либо вообще неактивны. Поэтому в процессе поиска Новых лекарственных соединений к З'-замещенным нуклеозидам предъявляются три основных требования: фосфоршшровакие в клетках, высокая активность на уровне трифосфатов и высокая селективность к обратным транскриптазам. Последнее требование подчеркивает важность и необходимость сравнительного изучения ' функционирования и специфичности к субстратным ингибиторам ДНК-полимераз человека и обратных транскриптаз ретровирусов.

Конструирование и направленный синтез субстратных ингибиторов биосинтеза нуклеиновых кислот с ожидаемыми свойствами проводился эмпирически, по формальным структурным признакам. Эти признаки не учитывали конформации нуклеозидов и их 5'-тркфосфатов как самих по себе, так и в комплексах с ферментами, и, главным образом, с ДНК-полимеразами. Причины, обусловливающие специфические свойства терминаторных субстратов, до сих пор не совсем ясны в рамках строгих физико-химических терминов: свой вклад должны вносить как химическая и электронная структуры терминаторных субстратов, так и их пространственное строение.

Сложность исследований взаимосвязи пространственных структур с биологической активностью связана с тем, что природные субстраты ДНК-полимераз (сМТР), также как и наиболее известные терминаторные субстраты, например, 2',3'-дидезоксинуклеозид-5'-трифосфаты с заместителями в 3'-положении - азидо-, амино-группами, фтором , протоном и др., конформационно подвижны, что обусловлено свойствами фуранозного цикла. Поэтому в процессе взаимодействия с ферментными системами из различных популяций конформеров всех этих соединений могут отбираться лишь отдельные и в таком виде фиксироваться в продуктивном комплексе. Далее, при прохождении ферментативной реакции, конформации субстратов могут претерпевать определенные изменения.

Изменения конформации субстрата при связывании с ферментными комплексами и в процессе ферментативных реакций могут охватывать все фрагменты молекул субстрата - углеводный остаток, нуклеиновое основание (вращение вокруг гликозидной связи) и трифосфатный остаток. При этом положение нуклеинового основания относительно гликозидной связи должно обеспечивать образование уотсон-криковской пары с нуклеотидом матрицы и для этого нуклеиновое основание должно иметь достаточную свободу вращения, а-Фосфатный остаток непосредственно участвует в реакции образования новой фосфоэфнрной связи, и поэтому его положение и расположение заместителей вокруг атома фосфора должны обеспечивать правильность связывания в реакционном центре. у-Фосфат также должен связываться с ферментным комплексом, ибо его отсутствие в субстрате приводит к снижению сродства последнего до 100 раз. Роль углеводного остатка остается невыясненной, хотя очевидно, что одна из его функций в субстрате в процессе его включения в 3'-конец ДНК заключается в обеспечении расположения на нужном расстоянии и в

правильной ориентации нуклеинового основания относительно а-фосфатного остатка. Кроме того, сахарный остаток не должен создавать стерических помех вращению в определенных пределах нуклеинового основания вокруг гликозидной связи.

Таким образом, формулируется вопрос: какая конформация сахарного остатка (или набор конформаций) могут удовлетворять этим условиям? Нами сделана попытка ответить на этот вопрос с помощью рентгеноструктурного анализа нуклеозидных компонентов субстратов как с конформационно подвижными, так и конформационно ограниченными углеводными остатками. Одновременно, с целью изучения стереохимических аспектов специфических свойств различных терминаторных субстратов нами проведены рентгено-струкгурные исследования и проанализированы точные геометрические параметры и конформации нуклеозидных компонентов рада активных и неактивных, селективных и неселективных ингибиторов синтеза ДНК, катализируемого различными ДНК-полимеразами. Среди изученных нуклеозидов были соединения с конформационно подвижными гликонами, а также с гликонами, имеющими конформационные ограничения. В некоторых случаях конформационные ограничения гликонов приводили к ограничению вращений вокруг гликозидной связи. В процессе исследований формировались определенные представления, которые, в свою очередь, помогали формулировать последующие этапы поиска новых селективных ингибиторов различных ДНК-полимераз, а также блскаторов репродукции ретровирусов, нуклеозидные компоненты которых далее также подвергались ренттеноструктурным исследованиям. Таким образом, настоящая работа является частью комплексной работы по формированию общих принципов целенаправленного синтеза противовирусных агентов в рядах нуклеозидов и нуклеотидов, проводимой в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Конформационно подвижные 3'-замещенные 2',3'-дидезоксинуклеозиды

3'-Азцдо-2',3'-дидезокситимидин ((МТ(3'№), AZT) относится к числу наиболее специфичных ингибиторов репродукции ретровирусов. Его У-трифосфат не узнается ДНК-полимеразами а, ß, е, у, 5 и концевой дезокси-нуклеотидилтрансферазой, а является терминаторным субстратом обратных транскриптаз ретровирусного происхождения. В связи с этим ddT(3'N3) представляет большой практический интерес и в настоящее время широко используется в клинической практике для лечения больных СПИДом. Нами в 1986 году опубликовано рентгеноструктурное исследование моноклинных кристаллов ddT(3'№), в элементарной ячейке которых присутствуют две кристаллографически независимые молекулы нуклеозида. Следует отметить, что в течение последующих двух лет аналогичные работы с той же формой кристаллов были проведены в четырех других лабораториях мира ( Birnbaum G. et al. Can. J. Chem. 1987, V.65, p.2135; Camerman A. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1987, V.84, p.8239; Van Roey P. et al. J. Amer. Chem. Soc. 1988, V.110, p.2277; Parthasarathy R. et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1988, V.152, p.351). Кристаллы с другой симметрией исследователям получить так и не удалось.

На рис. 1 показано строение двух кристаллографически независимых молекул ddT(3'№). Азидные заместители при атомах СЗ' углеводных фрагментов в молекулах ddT(3'№) имитируют расположение тидроксильных З'ОН-групп в природных нуклеозидах и не ограничивают характерную дчя последних конформационную подвижность фуранозных циклов. Взаимная ориентация плоскостей основания и углеводного цикла в обеих молекулах соответствует анти-конформации относительно N-гликозидной связи. Однако абсолютные значения торсионных углов x(04'-Cl'-Nl-C2) существенно различаются: ха=-125.4°, а 172.0°. Изгиб фуранозного цикла молекулы А описывается фазовым углом

3'-Азидо-2',3'-дидезокситимидин

А: х=-125.4° (апП ) Р=173.3°; *>т=32.4° С2'-епс1о/СЗ'-ехо (2Т3) Т= 50.8° ^аис!1е+)

В: дг=-172.0° (апсО Р=212.2°; ф =36.3°

т 4

СЗ*-ехо/С4'-епс1о ( 3"Г ) Г= 173.5° О гаде)

НЗ'З!

кз'зв

Рис. 1. Строение кристаллографически независимых молекул «ИЦЗИз).

псевдовращения Ра= 173.3°, что соответствует С2'-эндо-СУ-экзо (*Тз) конформации сахара. Максимальная амплитуда псевдовращения Ч'Ат равна 32.4°. Конформация дезоксирибозы молекулы В - СУ-экзо-СА'-эндо (зТ4), соответствующие параметры псевдовращения Рв=212.2° и Ч/Вт=36.3°. Конформация молекулы А относительно экзоциклической С4'-С5'-связи - гош+, уа(05'-С5'-С4'-СЗ')=50.80. Во второй молекуле реализована от^аис-конформация, ув(05'-С5'-С4'-СЗ')= 172.8°. Наблюдаемое конформационное различие молекул может быть связано с действующей в кристалле системой водородных связей. Роль доноров в водородных связях в обеих молекулах выполняют 05'-Н и N3-H группы, а роль акцепторов - атомы Оа2, Оа.4 и Оа4' в молекуле А и атом Ов2 в молекуле В. Кроме того, в молекулах А действуют внутримолекулярные С6-Н--05' водородные связи. Длины C-N и N-N связей в азидной группе указывают на то, что в структуре доминируют две резонансные формы C-N"-N+sN и C-N=N+=N~.

Исследование конформации молекул ddT(3'N3) в растворе методом ЯМР-спектросхопии (Plavec J. et al. Tetrahedron. 1991, V.47, p.7363) и теоретические кон-формационные расчеты ( Herzuk Р. et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1987, V.145, p.1556) показали близость конформационных свойств с№Г(3'№) и природного нуклеозида.

На основании полученных данных можно заключить, что присутствие азидной группы в З'-положении углеводного цикла ddT(3'N3) не приводит к принципиальным изменениям конформационных свойств аналога по сравнению с природным тимидином (Young D. et al. Acta Cryst. 1969, V. B25, p.1423). Благодаря некоторой конформациоиной подвижности молекулы ddT(3'N3) сохраняется ее конформационная близость с молекулой природного тимидина. Стерео-электронные свойства самой азидной группы и ее ориентация относительно углеводного цикла, вероятнее всего, и определяют высокую специфичность 5'-трифосфата ddT(3'N3) по отношению к обратным транскриптазам. В настоящее время в нескольких лабораториях США и Англии установлена пространственная структура обратной транскриптазы ВИЧ-1 и ее комплексов с ингибиторами ненуклеозидной природы, а также тройного комплекса с двухцепочечной ДНК и ненуклеозидным ингибитором с разрешениями вплоть до 2.2 Ä (Ren J. et al. Struct. Biol. 1995, V.2, p.293; Rodgers D.W. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1995, V.92, p. 1222; Jacobo-Molina A. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1993, V.90, p.6320; Kohlstaedt L. et al. Science 1992, V.256, p.1783). Определены места связывания матрицы-праймера и ингибиторов ненуклеозидной природы. Однако до сих пор не имеется прямой структурной информации о строении участка связывания субстратов и субстратных ингибиторов, о строении субстратов в комплексах с обратной транскриптазой и о роли объемных заместителей в субстратных ингибиторах в специфичности их узнавания и связывания обратными транскриптазами.

3'-Амино-2',3'-дидезокситимидин ddT(3'NHj). 5'-Трифосфат этого соединения способен ингибировать синтез ДНК, катализируемый почти всеми изученными к настоящему времени ДНК-полимеразами. Строение молекулы ddT(3'NH2) в форме гидрохлорида представлено на рис.2а. Взаимная ориентация основания и углеводного цикла в ddT(3'NH3)+ соответствует анти-конформации (x(04'-Cl'-Nl-C2)=-167.4°). Конформация фуранозного цикла - СУ-эндо-С2'-экзо СТг ), фазовый угол псевдо-вращения Р=3.8°, максимальная амплитуда псевдовращения Ч,т=36.6°. Конформация молекулы относительно

экзоциклической связи С4'-С5' - гош+ ( у(05'-С5-С4'-СЗ')=57.00). Го«/+-конфор-мация и малое значение торсионного угла 04'-Cl'-Nl-C6, равное 14.4°, благоприятствуют образованию внутримолекулярной водородной связи С6-Н6...051. В исследованной структуре ddT(3'NH2)HCl все атомы водорода, потенциально способные образовывать водородные связи, включены в них. , -

X=-167.4° (ant i ) P= 3.8°; t =36.6°

Ш -

C3'-endo/C2'-exo ( T2) y= 57.0° (gauche"1")

3'-Амино-2',3'-дидезокситимидин

*=-105.7° (ant i ) P= 28.8°; ^=31.6° C3'-endo/C4'-exo (3T4 ) 3"= 45.8° (gauche+)

3'-Метиламино-2',3'-дидезокситимидин

Рис. 2 . Строение молекул ddT(3'NH2) (а) и ddT(3'NHMe)(6 ).

Объемное подобие аминогруппы сШХЗ'ЫНг) с гидроксильной группой тимидина, а также большая способность аминогруппы в З'-положении по сравнению с З'ОН-группой природного 2'-дезоксинуклеозида активно включаться в межмолекулярные водородные связи (при наличии большего числа доноров для их образования), по-видимому, и объясняют легкость узнавания 5'-трифосфата йсЩЗ'МНг) большинством ДНК-полимераз.

3'-Метиламиио-2',3'-дидезокситимидин «МТ(3'1ЧНМе). Это соединение является наиболее простой модификацией 3'-амино-2',3'-дидезокситимидина. Введение в молекулу последнего метальной группы приводит, как показали биохимические исследования, к некоторому повышению селективности 5'-трифосфата сИТ(З'МНМе) к обратным транскриптазам ретровирусов при общем понижении субстратного сродства по сравнению с аналогичными свойствами 5-трифасфата <Ш\3№Ь).

На рис.2 б представлено строение молекулы ¿сЩЗ'ЫНМе). Молекула <ИТ(3'ЫНМе) характеризуется сиоти-конформацией вокруг Ы-гликозидной связи (х (04'-СГ-Ы1-С2)=-106.7°), СУ-эндо-С4'-экзо конформацией фуранозного цикла (Р=28.8°, 4*111=31.5°) и гош+-конформацией относительно экзоциклической С4-С5'-связи (ф (СЗ'-С4'-С5'-05')=45.1'>).

Данные рентгеноструктурного анализа показывают, что З'-амино- и 3'-метиламино-тимидины имеют сходные конформации молекул. Однако, переход от первичной аминогруппы в <1с1Т(3'МН2) ко вторичной - в ¿сЩЗ'ЫНМе) приводит к некоторому уменьшению гликозидного угла и увеличению фазового угла псевдовращения в пределах одной СЗ'-эидо-популяции фуранозного цикла. Вероятно, повышение селективности 5'-трифосфата <1<ГГ(3'>ЩМе) связано, в основном, с присутствием объемного заместителя при СЗ'-атоме, который пространственно затрудняет узнавание ДНК-полимеразами, но меньше влияет на узнавание обратными транскриптазами.

3'-Нитро-2',3'-дадезокснткмидин ((ЮЦЗ'ЬЮа)); З'-гидроксимино-^З'-диде-зокситимноин (¡ИТ(3'=К0Н)) и его метальный аналог 3'-метоксимино-2',3'-дндезокснтимидин ddT(3'=NOMe). Эти соединения содержат в З'-положении объемные полярные заместителя и, тем самым, имеют некоторое сходство с сШТ(5'№). Испытания на анти-ВИЧ- активность (см. табл.2) показали высокую активность у сШ^З-ИОН), умеренную - у ёсЩЗ'МОг) и очень низкую - у (1сЩЗ-МОМе) . Для сравнения в табл. 2, а также 3 приведены данные для сИТ(3'№) и ат.

Таблица 2. Антивирусная активность и клеточная токсичность в культуре клеток МТ-4, инфицированных ВИЧ (данные получены в лаборатории Э. Де Клерка, Бельгия)

Соединение 1С50(цМ)* СС50 (цМ)** 81***

ВИЧ-1 ВИЧ-2 ВИЧ-1 ВИЧ-2

сШХЗ'ЫОг) 3.8 7.8 384.0 101 49

аат(з'=ыон) 0.06 0.08 13.5 225 169

сИТ(3'=>ЮМе) 12.2 16.0 750.0 62 47

а<1Т(3'ы3) 0.02 - 75.0 3750 -

* Ю50 - концентрация вещества, при которой происходит 50%-подавление репродукции вируса;

** СС50 - концентрация вещества, при которой рост клеток подавляется на 50%. •"Б! - индекс селективности, 81=СС5о/1С5о

Пространственное строение молекул этих соединений показано на рис.3, их конформационные параметры приведены в табл.3.

3'-Нитро-2',3'-дидезокситимидин

3'-Гидроксимино-2',3'-дидезокситимидин

%= -118.9 0 (ап^)

Рис. 3. Строение молекул сШКЗИОг) (а), с1с1Т(3'=КОН) (б) и с1(1Т(3'=ЫОМе) (в).

Таблица 3. Конформационные параметры , полученные на основе рентгеноструктурных данных

Соединение ёсЩЗ'= N04) сШТ(3'= ЫОМе) <МТ(3'-N0,) аёТ(3№) мол. А мол. В ат

х(04'Ст1С2) (°), конформация вокруг Ш-СГ-связи -118.1 анти -118.9 анти -121.9 анти -125.4 анти -172.0 анти -139.4 анти

Р (°), фазовый угол псевдо- 115.6 147.7 174.9 173.3 212.2 187.5

вращения;

"Рщ ("), максимальная ам- 25.7 31.2 30.5 32.4 36.3 37.8

плитуда псев-

довращения

Конформация сахара СГ-э кзо-ОА'-эндо С Г-экзо-С2'-э ндо С2'-э/1до-СУ-экзо С2'-э ндо-СЗ'-э кзо С4 '-зндо-СЗ '-экзо С2'-э ндо-СЗ'-э кзо

у(05-С5-С4'- 43.1 48.8 -71.9 50.8 173.5 172.8

СЗ1) (°), кон-

формация гош+ гош+ гош' гош+ транс транс

вокруг С4'-С5-связи

Из табл. 3 видна некоторая близость конформационных параметров молекул дсЩЗ'ЫОг) и молекулы А ё(1Т(3'Ыз). В обоих случаях в молекулах реализована <шии-конформация вокруг Ы-гликозидной связи и С2'-эндо-СЗ'-экзо-конформация гликозидного цикла. Атомы С2' и СЗ' отклонены от плоскости атомов С Г, С4', 04' на 0.307 и 0.181 А в молекуле ¿«ЩЗТЧСЬ) и на 0.352 и 0.170 А в молекуле А сШ"(3'№). Наблюдаемое различие в конформации вокруг экзоциклических С4'-С5'-связей может быть обусловлено межмолекулярными взаимодействиями в кристалле.

К другой группе конформационно близких молекул относятся соединения сМТ(3'=>ЮН) и <1<1Т(3'=1>ЮМе). Гликозидные торсионные углы и конформации вокруг экзоциклических С4'-С5'-связей в молекулах этих соединений совпадают, а изгиб фуранозных циклов относится к СГ-экзо популяции. В молекулах <МТ(3'=НОН) реализована С\'-экзо-ОА'-эндо (сгГ04) конформация фуранозного цикла. Атомы С Г и С4' отклонены в разные стороны от плоскбсти атомов С2', СЗ', С4' на 0.292 и 0.087 А соответственно. Атомы З'-оксиминогруппы (ЫОН) лежат в плоскости атомов С21, СЗ', С4'.

В молекуле сИТ(3'=ЫОМе) наблюдается С\'-экзо-С2'-зндо (^Тсг) конформация сахара с отклонением атомов СГ и С21 в разные стороны от плоскости атомов СЗ1, С4', 04' на 0.183 и 0.302 А соответственно. З'-Метоксиминогруппа образует с этой плоскостью угол, равный 26°. В то же время, атомы метоксиминогруппы лежат в одной плоскости с атомами СЗ' и С4\ В молекулах всех исследованных соединений наблюдается некоторое уплощение фуранозных циклов по сравнению с природным тимидином.

З'-О-Метилтиометил - 2'- дезокситимидин («ГЩ'ОСШЗМе)) и З'-О-метил-сульфинилметил-2'-дезокситимидин (сГЦЗ'ОСНгЗОМе)) относятся к конформационно подвижным соединениям, в настоящее время они исследованы рентгенографически (рис.4а, б) и методом ЯМР.

Установлено, что для молекул обоих соединений характерна анти-конформация вокруг Ы-гликозидной связи (х[04'-СГ->П-С2] = -116.2° для

Z=-116.4° (ant i ) P=167.7°; 0m=34.9° C2*-endo/C3'-exo (2T3; T= 52.0° (gauche+)

CI.

C5 I

. 05'

c6 n1

I C5'

(a)

I cr

i 03-

eis-

c2sm

hn' 0^1.

CH, CH,

3'-0-Метилтиомегал-2'-дезокситимидин

3'-0-Метилсульфинилметил-2'-дезокситимидин

Рис. 4. Строение молекул dT(3'OCH2SMe) (а) и dT(3'OCH2SOMe) (б).

сЩЗ'ОСШЗМе и -148.8» для dT(3'OCH2SOMe), и гош+ - конформация относительно экзоциклической связи С4-С51 ( ф[СЗ'-С4'-С5'-05'] = 52.1° для аТ(З'ОСНгЗМе) и 41.1° для аТСЗ'ОСНгБОМе)). Близкие значения аналогичных конформационных параметров наблюдаются в молекуле А ддТ(3'№). Конформации фуранозных циклов в изученных аналогах относятся к Б-популяции : аТ(3'ОСН25Ме) - С2'-эндо-СУ-экзо изгиб сахара, Р=167.8° , чРт=34.8° , ¿Тр'ОСНгЭОМе) - С2'-эпдо-С1'-экзо -конформация фуранозного цикла, Р=148.4°, Ч'т=35.40. Эти данные близки к величинам, наблюдаемым в молекуле А АХТ, в которой реализован С2'-эндо-СЗ'-экзо изгиб сахара, Р= 173.3°, <Рт=32.4°

По результатам ЯМР исследований дТ(3'ОСН1БМе) предпочтительная конформация сахарного остатка этого соединения в водном растворе С2'-эндо-С\'-экзо, Р=158.0° с мольной долей Кв = 0.73, что находится в хорошем согласии с данными рентгеноструктурного анализа.

Исходя из близости конформационных параметров молекул А2Т, ёТр'ОСНгЭМе) и ёДЗ'ОСНгЗОМг), у исследованных аналогов отсутствие антиретровирусной активности, вероятно, объясняется слишком большими пространственными размерами заместителей.

3'-(Тетразол-2"-ил)-2',3'-дидезокситимидии (¿аТ(ЗЧе(г)) и 3'-(5"-метнл-тетразол-2"-ил)-2',3'-дидезокситимиди11 (<МТ(ЗЧйг-5"Ме)) являются З'-азольными аналогами тимидина. Установлено, что в кристаллах молекулы этих соединений имеют сходную конформацию (рис.5а,5). В обеих молекулах наблюдается ашпи-ориентация тимина относительно фуранозного цикла. Торсионный угол % (04-С1'-№-С2) равен -113.0° для ¿аТ(ЗЧе1г) и -125.8° для ааТОЧеи-УМе). Фазовые углы Р псевдовращения для фуранозных циклов равны 173.0° для ¿¿Т'(ЗЧе1г) и 165.1° для ¿¿ТрЧеи-УМе), максимальной амплитуды псевдовращения 4*111 составляют 28.4° для первого соединения и 25.8° - для второго. Таким образом, в обоих соединениях фуранозный цикл имеет конформацию С2'-эндо-СУ-экзо с отклонениями атомов С2' и СЗ' от плоскости атомов СГ,С4',04' равными 0.309 и 0.173 А для ddT(3'tetr) и 0.366 и 0.037Адля ddT(3'tetr-5"Me). Конформации молекул относительно экзоциклических С4-С5-связей - гош* с торсионными углами у(05'-С5'-С4'-С3'), равными соответственно 50.3° и 47.8°. Можно отметить близость полученных конформаций и конформации кристаллографически независимой молекулы А ddT(3,№).

Энзимологические исследования 5'-трифосфата ё<1Т(ЗЧе1г) в модельных системах показали его чрезвычайно слабые субстратные свойства по отношению к обратной транскриптазе миелобластоза птиц, и отсутствие таковых в отношении обратной транстриптазы ВИЧ и ДНК-полимераз человека. Отсутствие у 5'-трифосфата ddT(3'tetr) субстратных свойств к этим ферментам, по-видимому, обусловлено слишком большим объемом З'-заместителя.

В табл. 4 суммированы конформационные параметры и информация об активности для изученных нами конформационно подвижных З'-замещенных нуклеозидов, а также для исследованных другими авторами наиболее активных блокаторов ВИЧ. Видно, что одни и те же (или близкие) конформации реализуются как в биологически активных, так и в биологически неактивных соединениях. В то же время, высокоэффективные ингибиторы ВИЧ: ddT(3,^ÍJ). ddT(ЗlF) и ddT(3-NOH) имеют разные конформации. Это дополнительно свидетельствует о том, что, опираясь только на статистику рентгеноструктурных данных для конформационно подвижных соединений, нельзя сделать однозначный вывод о том, какая конформация нуклеозида соответствует активной конформации субстрата в комплексах с ДНК-синтезирующими ферментами.

Х = -113.0°(атО Р= 173.0° Тш=28.4° С2'-епс1о-СЗ'-ехо у = 50.3°^аис11е+-)

3'-(5"-Метилтетразол-2"-ил)-2',3'-двдезокситимидин ШТП'-1е1г-5"МеУ) Рис. 5. Строение молекул сЫТ(ЗЧеи) (а) и ¿сПХ-ЗЧе^ - 5"Ме) (б).

Таблица 4. Конформационные параметры конформационно подвижных 3'-замещенных нуклеозидов и терминаторная активность их 5-трифосфатов относительно обратной транскриптазы ВИЧ

Соединение Х(04'-СГ- N1-02) (град.) Конформ. фураноз. кольца Р(град.) У» (град.) 7(05-05'- С4-СЗ') (град.) Активность *)

(¡(ЩЗ-Мэ), ыол.А ыол.В -125.4 анти -172.0 анти С2]-эндо СЗ'-э кзо СЪ'-экзо СЛ'-эн до 173.3 212.2 32.4 36.3 50.8 гош+ 173.5 транс +++

аатсзггнз) -167.4 анти СЪ'-эндо С2'-э кзо 3.8 36.6 57.0 гош+ ++

ddT(3, ЫНМе) -106.7 анти СЪ'-эндо С4-э кзо 28.8 31.6 45.8 гош+ +

ddT(3'= ЮН) -118.1 анти СГ-экзо 04'-эпдо 115.5 25.7 43.1 гош+ +++

ddT(3-ИОМе) -118.9 анти СГ-экзо С2'-э ндо 147.7 31.2 48.8 гоиг+ —

ddT(3,N02) -121.9 анти С2'-э ндо СЗ'-экз о 174.9 30.5 -71.9 гош ' ++

dT(3,OCH2 вМе) -116.4 анти С2'-эндо СЗ'-э кзо 167.7 34.9 52.0 гош+ —

ат(3'осн2 БОМе) -148.8 анти С2'-э ндо СГ-экзо 148.8 35.4 41.4 гош+ ?

дТ(31е1г) -113.0 анти С2'-э ндо СЪ'-экзо 173.0 38.4 50.3 гош+ ?

ёТ(31йг-5"Ме) -125.8 анти С2 '-эндо СЪ'-экзо 165.1 25.8 47.8 гош+ —

ddT [1] мол.А ыол-В -129.1 анти -170.9 анти С2'-эидо СЪ'-экзо СЪ'-эндо С2'-э кзо 164.5 12.9 39.9 39.6 60.2 гош+ 62.1 гош+ +++

ddC [2] -156.7 анти СЪ'-экзо С4'-эндо 207.5 33.9 165.4 транс +++

ddA[3] -96.1 выс. анти СЪ'-экзо С2'-экдо 193.0 35.6 180.0 транс +++

ddU [4] -163.5 анти СЪ'-эндо С2 '-экзо 7.0 36.7 ' 177.9 транс ++

ddT(3,F) [5] иол~А иол.В ЫОЛ.С иол.О -137.6 анти -153.2 анти -129.5 анти -149.4 анти СЪ'-экзо-С2'-э ндо СЪ'-экзо-С2'-эндо СЪ'-экзо-С2 '-эндо СЗ'-экзо-С2 '-эндо 174.0 175.0 171.0 176.0 32.5 34.0 33.9 32.4 48.3 гош+ 51.9 гош+ 45.8 гош+ 50.5 - гоиЛ +++

ТИМИДИН (<т М -139.4 анти СЪ'-экзо С2'-эндо 187.5 37.2 175.3 транс субстрат

*) "+" указывает на наличие активности. Степень активности пропорциональна числу знаков "+" - отсутствие активности.

[1] Harte W. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, V.175, p.298.

[2] Birnbaum G. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988, V.151, p.608.

[3] Chu С. et al. J. Org. Chem. 1989, V.54, p.2217.

[4] Van Roey P. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1989, V.86, p.3929.

[5] Van Roey P. et al. Antiviral Chem. & Chemother. 1990, V.l, p.93.

[6] Young D. et al. Acta Cryst. 1969, V. B25, p.1423.

Во всех исследованных структурах сохраняются необходимые для проявления субстратных свойств а/отш-конформации вокруг N-гликоэиднбй связи н конформацнонная подвижность фуранозных циклов, позволяющая этим соединениям принимать конформацию, неоходимую для связывания с ферментами биосинтеза ДНК. Более информативными в этом плане являются конформационно ограниченные соединения.

Копформациопно ограниченные нуклеозиды

Соединения с конформационными ограничениями в молекулах могут обладать биологической активностью лишь в случае совпадения их конформаций с конформациями субстратов в продуктивных комплексах с ферментами, следовательно, такого рода соединения могут быть использованы для моделирования активных конформаций субстратов. С целью получения информации о возможной конформаций субстратов в ДНК-синтезирующих комплексах нами изучены пространственные структуры ряда модифицированных нуклеозидов с существенными ограничениями конформационной подвижности фуранозных циклов.

2',3'-Ликсоангидротимидин (1аТ). 5'-Трифосфат этого соединения действует как селективный терминаторный субстрат обратных траскриптаз ретровирусов и концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы. На рис.6 представлено строение двух кристаллографически независимых молекул 1аТ. Ренгеноструктурное исследование 1аТ показало, что включение С2' и СЗ' атомов фуранозных циклов в эпоксидный цикл сопровождается укорочением С2'-СЗ'-связи в среднем на 0.06 Â (до1.460Д) и увеличением прилежащих валентных углов примерно на 3-6°, что соответствует промежуточному состоянию между одинарной и двойной связями. Присутствие трехчленного эпоксидного цикла с эйдо-расположением относительно фу-ранозного кольца, приводит к ограничению конформационной подвижности как углеводного цикла, так и нуклеинового основания относительно N-гликозидной связи. В результате в кристаллографически независимых молекулах А и В реализована одна и таже конформация фуранозных циклов 04'-эндо-С1'-экзо с очень близкими значениями фазовых углов псевдовращения ( Ра=98.9°, Рв=97.6<>). Атомы 04' отклонены от плоскостей атомов С2',СЗ' и С4' в среднем на 0.339Â в сторону нуклеиновых оснований, а атомы СГ - на 0.11зА в обратную сторону, т.е. отклонения атомов 04' превышают отклонения атомов С Г почти в три раза. Если же провести среднеквадратичную плоскость через все атомы углерода фуранозных циклов, то максимальные значения отклонений атомов углерода составляют 0.026Â, а атомы 04' оказываются выведенными из этих плоскостей на 0.425Ä. В этом приближении можно говорить о плоскостном расположении атомов углерода фуранозных циклов в молекулах 1аТ и выводе атомов 04' в эндо-положение. Кроме того, в молекулах наблюдается некоторое общее уплощение фуранозных циклов, о чем свидетельствуют заниженные значения амплитуд псевдовращения (4^=29.2°, хУтв=ЗЗ.Г) по сравнению с "Рт природного тимидина (Ч'т=37.8°). Как будет показано ниже, эта конформация фуранозного цикла сохраняется также в растворе, что является еще одним подтверждением высокой степени конформационной ограниченности молекулы

2', З'-Ликсоангидротимиднн

А: *=-121.9° (апп) Р= 98.9°; ф =29.2°

04'-епёо/С1 '-ехо С0!^) ЗГ=—167.7° ОгапБ)

Х= 121.2° Буп)

Р= 97.6°; ^=33.1° .(М'-епао/СГ-ехо (°Т1) у=-177.5° (1гап5)

Рис. 6. Строение кристаллографически независимых молекул 1аТ.

1аТ. Далее такие молекулы мы будем условно называть конформационно "жесткими".

Ориентация связей С5'- 051 относительно фуранозных циклов в обеих молекулах одинаковая и соответствует т/?аис-конформации. Однако, вокруг № гликозидной связи в кристаллографически независимых молекулах реализованы две разные конформации, соответствующие допустимым предельным положениям оснований в присутствии эпоксидного кислорода и связанных с ним стерических затруднений. Торсионный угол х(04'-СГ-N1-С2) в молекуле А равен -121.9°, что соответствует обычной аи/ии-конформации, в молекуле В он составляет 121.9° и соответствует редко встречающейся в структурах высокой сык-конформации.

Таким образом, если сМТ(3'№), как и природный тимидин, в составе 5-трифосфатов за счет высокой конформационной подвижности может принимать в комплексах с ДНК-полимеразами конформацию, необходимую для образования продуктивного комплекса, то 1аТ, напротив, конформационно ограничен, и активность его трифосфата как субстрата для некоторых ДНК-полимераз позволяет сузить набор конформеров, фиксируемых в фермент-субстратных комплексах.

Углеводный цикл 1аТ имеет "жесткое" строение с некоторым уплощением фуранозного цикла и выводом атома 04' в эт/д<?-положение, вокруг Ы-гликозидной связи возможны две конформации - анти и высокая сии. По-видимому, один из этих двух конформеров и должен реализовываться в продуктивном комплексе, синтезирующем ДНК. Вероятнее всего это будет конформер с анти-кок-формацией, торсионный угол % которого очень близок к значению х в одной из молекул сШТ(3'№), и который способен образовывать с матрицей правильную уотсон-криковскую пару.

2\3'-Рнбоангидроаденозин (гаА) и 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидин (сЬТ). 5-Трифосфагы этих соединений проявляют свойства терминаторкых субстратов широкого спектра действия. Так, трифосфат гаА ингибирует синтез ДНК, катализируемый обратными транскриптазами, ДНК-полимеразой I из Е.СоН, ДНК-полимеразой р и концевой дезоксинуклеотидилтрансферазой. Трифосфат <3<Т - высокоэффективный терминаторный субстрат тех же ДНК-полимераз. Однако, следует отметить, что его сродство к активным центрам ДНК-полимераз на 1-2 порядка величины выше сродства других известных модифицированных субстратов. Характерной особенностью строения молекул этих соединений является значительное уплощение циклических фрагментов их гликонов за счет присутствия двоесвязности между атомами С2' и СЗ'.

Строение молекулы гаА показано на рис.7. Установлена близость средних геометрических размеров углеводных остатков в молекулах гаА и 1аТ при принципиальном различии конформации их молекул.

Конформации фуранозных циклов в молекулах А и В гаА несколько различаются между собой. В молекуле А максимальная амплитуда псевдовращения Ч/ша=8.1°, фазовый угол псевдовращения Ра= 122.8°. Это соответствует Г-экзо-конформации сахара. Атом СГ выведен из плоскости атомов С2\ СЗ', С4' и 04' на 0.1 иА. В молекуле В максимальная амплитуда псевдовращения |Ушв=9.1°, фазовый угол псевдовращения Рв=250.8°, что соответствует С4'-эж>о-04' -экзо-изгибу. Атомы С4' и 04' отклонены от плоскости атомов СГ, С21, СЗ' на 0.075 и 0.059А соответственно. Если провести среднеквадратичные плоскости через все атомы фуранозных циклов, то максимальные отклонения от них атомов, образующих фуранозные циклы, составят 0.04бА в молекуле А и 0.049А в молекуле В. В пределах этих отклонений фуранозные циклы можно рассматривать как плоские.

На рис.8 показано строение двух кристаллографически независимых молекул сЬТ. Циклические фрагменты гликонов с двойной С2'-СЗ'-связью в молекулах ДЛ- более плоские, чем в гаА. Максимальная амплитуда псевдо-

2\3'-Рибоангидроаденозин

А: *= 56.8° ( Буи) Р=122.8°; |»т = 8.1° С1'-ехо (1Е) ц= 42.9° (ёаисЬе+)

*=-170.8° (апН ) Р=250.8°; 9.1° С4'-еп1)о/04'-ехо (дТ) у= 43.9° (ёаисНе+)

02'3'В

Рис. 7. Строение кристаллографически независимых молекул гаА.

вращения *Fm в молекуле А составляет 4.8°, а в молекуле В - 6.2°. Напомним, что обычно величины 4V для нуклеозидов и нухлеотидов находятся в интервале 3545°. Фазовый угол псевдовращения Р в молекуле А равен 90.4°, т.е. реализована 04'-эндо-конформация сахарного цикла. В молекуле В угол псевдовращения равен 103.6°, что соответствует 04'-эндо-С Г-экзо-конформации циклического фрагмента гликона. Если же провести среднеквадратичные плоскости через все атомы дигидрофурановых циклов, то отклонения атомов находятся в случае молекулы А в интервале 0.008-0.027А, а для молекулы В - в интервале 0.002-0.035А. В настоящее время имеется структурная информация для 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегироаденозина (d<A) (Hutcheon W. et al. Acta Cryst. 1974, V. B30, p. 1777), 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегироцитидина (djC) (Birnbaum G. et al. Nucleosides and Nucleotides. 1989, V.8, p. 1259) и 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидрогуанозина (Van Roey P. Nucleosides and Nucleotides, 1992, V.ll, p.1226), а также одновременно с нашей публикацией появилось сообщение о структуре моноклинных кристаллов d<T (Harte W. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, Y.175, p.298). Проведенный нами статистический анализ структур и расчет среднеквадратичных плоскостей через атомы циклических фрагментов гликонов показали, что во всех соединениях дидегидрофурановые циклы практически плоские. Значения максимальных амплитуд псевдовращения колеблются от 4.8° до 7.8°. Максимальные отклонения от среднеквадратичных плоскостей дидегидрофурановых циклов составляют от 0.027 до 0.045А. В этих пределах может легко осуществляться конформационное подстраивание молекул при образовании различного рода комплексов с ферментами, и в этих же пределах можно говорить о конформационной "жесткости" и плоском строении циклических фрагментов гликонов соединений doN.

Конформации молекул гаА и d<T относительно экзоциклических связей С4'-С5' - гош+ , т.е. в них реализована одна и та же конформация, несмотря на возросшие потенциальные возможности конформационной подвижности из-за вывода атомов водорода НЗ' в экваториальное положение в результате уплощения углеводных циклов. В то же время в молекулах d<A и d<C присутствуют как транс, так и гош+ -конформация вокруг С4'-С5'-связей. Однако, вокруг N-гликозидных связей в структурах гаА и d<T реализуется широкий спектр конформаций, возможность которого обусловлена уплощением фуранозных циклов и связанным с этим значительным уменьшением стерических препятствий между атомами нуклеиновых оснований и атомами водорода Н2' гликонов, выведенных в экваториальное положение. Так, в молекуле А гаА торсионный угол х(04'-СГ-N9-C4) равен 56.8° и соответствует сии-конформации нуклеозида, молекула же В имеет оноти-конформациию и хв=-170.8°. В молекулах diT значения ха(04'-СГ-Nl-C2)=-172.6°, хв=-85.1° соответствуют анти- и редко встречающейся высокой анти-конформациям.

Высокая конформационная подвижность вокруг гликозидных и экзоциклических С4'-С5'-связей позволяет гаА и d<T легко приобретать конформации, характерные для продуктивных комплексов. Кроме того, в силу субстратной активности 5,-трифосфатов соединений гаА и diT в отношении ряда ДНК-полимераз и конформационной "жесткости" их плоских циклических фрагментов гликонов, конформация гликона в этих соединениях, по-видимому, моделирует конформацню углеводных циклов субстратов в синтезирующих ДНК комплексах. Наши рентгеноструктурные данные по d<T находятся в хорошем согласии с результатами работы Ferrin L.J. и др. ( Biochemistry, 1986, V.25, p.5I31), в которой методом ЯМР в растворе показано, что в комплексах [ДНК-полимераза I + поли N(MaTpn4a)+dNTP] дезоксирибозный фрагмент субстрата приобретает примерно плоское строение с незначительным выводом атома 041 в эндо-положение в dNTP.

2', З'-Д идезокси-2', З'-дидегидротимидин

£=-172.6 (ant i ) Р= 90.4°; i/»m= 4.8° 04'-endo (0E°) 7= 54.1° (gauche"1")

x= -85.1° (high anti) P=103.6°; (ûm= 6.2° 04'-endo/Cl'-exo (°T1) 1= 55.6° (gauche+)

СЗ'В C2'B

Рис. 8. Строение кристаллографически независимых молекул CÍ4T.

Из сравнения структур селективного ингибитора обратных транскриптаэ ретровирусов 1аТ и неспецифичных терминаторов большинства известных ДНК-полимераз гаА и сит видно, что обратные транскриптазы предъявляют к субстратам менее жесткие конформационные требования, чем другие ДНК-полимеразы.

Проанализированные выше рентгеноструктурные данные по конформации молекул 1аТ и гаА хорошо согласуются с результатами конформационных исследований в растворе с помощью ЯМР-спектроскопии и теоретических конформационных расчетов, проведенных в Швеции в лаборатории Дж. Чаттопа-дайа и приведенных в нашей совместной публикации. Изучены две серии ^'-модифицированных р-О-нуклеозидов с дополнительными трехчленными циклами, расположенными:

1) в экзо-положении по отношениию к нуклеиновому основанию (рис.9, соединения 1-4: 2',3'-дидезокси-2',3'- а-метиленуридин (I); 1-(2',3'- дидезокси-2',3'-эпимино-р-0-рибофуранозил)урацил (2); 1 -(2',3'-дидезокси-2',3'-эпитио-р-П-рибофуранозил)урацил (3); 2',3'-рибоангидроаденозин (4);

2) в эндо-положении (рис.9, соединения 5-8: 1-(2',3'-дидезокси-2',3'-эпитио-3-0-ликсофуранозил)урацил (5); 2',3'-ликсоангидроуридин (6); 2\3'-ликсоангидро-аденозин (7); 2',3'-ликсоангидротимидин (8).

Показано, что в молекулах с экзо-ориентацией трехчленных циклов (соединения 1-4), как и в кристалле 2',3'-рибоангидроаденозина, фуранозные циклы имеют фактически плоское строение. В соединениях 6-8 с эвйо-расположением трехчленных циклов, подобно молекулам 2',3'-ликсоангидротимидина в кристалле, в фуранозных циклах молекул реализуется 04'-эяс)о-изгиб. Молекулы 1-(2',3'-дидезокси-2',3'-эпитио-р-0-ликсофуранозил) урацила (5) в растворе имеют промежуточное между структурными типами 1-4 и 6-8 строение фуранозных циклов, что, по-видимому, обусловлено дополнительными стерическими взаимодействиями, возникающими в молекулах из-за значительно большего объема атома серы по сравнению с атомом кислорода (Ио = 1.53Д, = 1.80 А).

Аналогичные ЯМР-исследования были проведены при температуре 65°С. Отсутствие изменения в константах Знглг, Диу-щ, Лнз'-ш1 однозначно подтверждает достаточно высокую степень конформационной ограниченности ("жесткости") гликонов и, как следствие, присутствие в растворах одного конформера для каждого из соединений.

Таким образом, полное согласие рентгеноструктурных данных, полученных для кристаллов, ЯМР данных для растворов и конформационных расчетов подтверждают высказанное нами на основе рентгенографических исследований предположение об относительно "жестком" строении фуранозных циклов в молекулах этих групп соединений.

1-(3'-С-Метнл-2-дезокснрибофуранозил)тимин ((ЩЗ'Ме)). В этом соединении сохранены все функциональные группы, необходимые для участия в процессе биосинтеза ДНК. Вопреки ожидаемой аналогии с З'-метильными рибонуклеозидами, 5'-трифосфат сЩЗ'Ме) субстратных свойств по отношению к ДНК-полимеразам не проявляет. Более подробно соединения с подобным видом модификаций будут рассмотрены в разделе, посвященном аналогам рибо-нуклеозидов.

Замещение протона при атоме СЗ'-дезоксирибозного фрагмента тимидина на метальную группу в сЩЗ'Ме) сопровождается конформационными изменениями (рис.10). Фазовый угол псевдовращения Р в сЩЗ'Ме) равен 157.5", максимальная амплитуда псевдовращения Ч'т=38.0о . Это соответствует конформации сахара С2'-эндо-С1'-экзо (ТО- Углеродные атомы С2' и С Г отклонены от плоскости, проведенной через атомы С3\ С4', 04' на 0.521 и 0.063 А соответственно. Относительно малое значение отклонения атома С Г свидетельствует о значительном сдвиге твист -конформации в сторону С2'-эндо конформации.

3'-Метил-2'-дезокситимидин

Рис.10. Строение молекулы dT(3'Me).

Конформация углеводного никла в природном тимидине другая - СЗ'-э/сзо-С2'-эндо, Р=187.5° , x?m=38.2° (Young В. et al. Acta Cryst. 1969, V.B25, p.1432), атомы СЗ' и С21 выведены из плоскости атомов Cl', С4', 04' на 0.420 и 0.180Â соответственно.

Конформация молекулы dT(3'Me) относительно экзоциклической связи С4'-С5' - гош+ , торсионный угол 7(05'-С5'-С4'-СЗ') равен 50.1° . В тимидине у= 172.8° и соответствует /я/ямс-конформации.

Ориентация нуклеинового основания относительно углеводного цикла в молекуле dT(3'Me), также как и в dT, соответствует ймим-конформации, но наблюдается различие в величинах торсионных углов % (04'-Cl'-Nl-C2), в dT(3'Me) он равен -116.6° , а в dT- - 139.4°.

Конформационные параметры молекулы dT(3'Me) близки к величинам, наблюдаемым в структуре З'-С-метилцитидина (dC(3'Me), которые будут приведены ниже в разделе, посвященном рибонуклеозидам.

Таким образом, молекулы пиримидиновых З'-С-метилнуклеозидов рибо- и дезоксирибо- рядов имеют близкое пространственное строение, не зависящее от природы сахара и нуклеинового основания. В целом, реализация одного и того же типа конформации в молекулах этих соединений, по-видимому, обусловлена стерическими затруднениями ("наталкиваниями") между атомами объемных З'-С-метильных заместителей, расположенных над углеводными циклами со стороны оснований, атомами оснований и атомами С5-05-Н - экзоциклических групп.

Отметим, что, согласно физико-химическим исследованиям конформации некоторых З'-метилированных пиримидиновых нуклеозидов в растворе, предпочтительными для них являются а«иш-конформация вокруг гликозидной связи, S-конформер фуранозы и гош+-ротамер вокруг экзоциклической С4'-С5-связи (Бейгельман Л.Н. и др., Биоорган, химия, 1981, Т.7, стр.1701; Федоров И.И. и др., Хим.-фарм. ж., 1992, Т.26, сгр.14). Это совпадает с рентгеноструктурными

данными и позволяет говорить об относительной конформационной "жесткости" молекул пиримидиновых нуклеозидов, содержащих в З'-положении объемный метальный заместитель.

В случае З'С-метилрибонуклеозидов конформации молекул аналогов, вероятно близки к конформации субстрата в продуктивных комплексах биосинтеза РНК, что, по-видимому, и обусловливает их терминаторные свойства. Отсутствие субстратных свойств у З'-метилтимидин-У-трифосфата можегг быть объяснено конформационным различием субстратов в продуктивных комплексах биосинтеза ДНК и РНК. Ограниченность же конформационной подвижности молекул 3'- С-метильных производных не позволяет последним приобретать конформацию, характерную для фермент-субстратных комплексов ДНК-полимераз. С другой стороны, это свидетельствует в пользу того, что СТ-эндо-конформация фуранозного цикла не является активной конформацией для субстратов ДНК-полимераз. Это хорошо согласуется с вышеприведенной информацией по хонформационно ограниченным соединениям.

Структуры и свойства соединений с дополнительной модификацией по 4'-

попожетио

В последние годы в процессе поиска новых лекарственных препаратов против СПИД анти-ВИЧ-активносгь была обнаружена у различных аналогов нуклеозидов, модифицированных по 4'-положению (Prisbe Е. et al., Nucleosides and Nucleotides as Antitumor and Antiviral Agents, New York, 1993, p.101-113). С целью изучения взаимосвязи структура-активность в ряду 4'-замещенных нуклеозидов нами были исследованы два 4'-гидроксиметилированных соединения.

4'-Гидроксиметил-2',3'-ликсоангидроцитидин (1аС(4'СНЮН)) и 4'-гндрок-симетил - 2\3'- рибоангидроаденозин (гаА (4'СНгОН)). Строение молекул 1аС(4'СНЮН) и гаА(4'СШОН) показано на рис. 1 la ,б. Эти соединения выбраны нами для исследования по причине ожидаемого их конформационного подобия соединениям 1аС и гаА, однако, в отличие от 1аС, они полностью лишены анти-ВИЧ-активности. Прежде всего следует отметить близость геометрических размеров фуранозных и эпоксидных циклов как в молекулах 1аС(4'СНЮН) и гаА(4'СНгОН), с одной стороны, так и в соединениях 1аТ и гаА, с другой стороны. Во всех названных выше структурах наблюдается одна и таже закономерность -сокращение по сравнению с природными иуклеозидами примерно на 0.05 - 0.08Â одинарных С2'-СЗ'-связей, включенных в эпоксидный цикл, и увеличение на 5-7" прилежащих валентных углов. Конформация же углеводных циклов и молекул нуклеозидов в целом зависит от типа ориентации эпоксидного цикла - эндо- или экзо-.

В молекуле 1аС(4'СН20Н), также как и в 1аТ с элйо-ориенгацией эпоксидного цикла, конформация фуранозы - 04'-звдо-СГ-экзо. Фазовый угод псевдовращения Р=92.9\ максимальная амплитуда псевдовращения хРт=26.8°. Отклонения атомов 04' и С Г от плоскости атомов С2', С3\ С4' составляют 0.342 и 0.031Â соответственно. Если же пренебречь относительно малым значением отклонения атома С Г по сравнению с 04' и провести среднеквадратичную плоскость через четыре атома углерода, то атом 04' оказывается в эндо-положении на расстоянии 0.366Â от этой плоскости. В кристаллографически независимых молекулах А и В 1аТ эти отклонения составляют 0.397 и 0.452Â соответственно. Таким образом, фуранозный цикл в молекуле 1аС(4'СНгОН) уплощен несколько больше, чем в молекуле 1аТ.

Относительная ориентация основания и фуранозного цикла в молекуле laC(4'-CHiOH) описывается торсионным углом х(04'-С 1 '-N1-С2) равным -118.3° и

х= - 118.3°(апи) Р= 92.9 °; хРт= 26.8 0 04'- епс!о- С Г- ехо

4,-Гидроксиметил-2',3'-ликсоангидроцитидин

4'-Гидроксиметш1-2',3'-рибоангидроаденозин

Рис. 11. Строение молекул 1аС(4'СШОН) (а) и гаА(4'СН20Н) (Ь).

попадающим в область алти-конформаций. Аналогичная конформация вокруг гликозидной связи реализована в молекуле А 1аТ (х= -121.9"). Таким образом, основные конформационные параметры, характерные для конформационо жесткой молехулы 1аТ, сохраняются и в молекуле 1аС(4'СН20Н). Как уже отмечалось, конформационные параметры молекул 1аТ в кристалле и в растворе совпадают и являются характерными для аналогов нуклеозидов с другими основаниями при эндо-ориентации эпоксидных циклов. Следовательно, можно говорить и о совпадении конформаций молекул 1аС и 1аС(4'СНЮН).

Конформация молекул в кристалле относительно экзоциклических связей С4-С5 и С4'-С5" зависит во многом от межмолекулярных взаимодействий. В молекуле 1аС(4'СНЮН) вокруг С4'-С5'-связи реализована гош'-конформация (у(05,-С5'-С4,-СЗ') = -60.5°), связь С5"-05" находится в транс-положении относительно связи С3'-С4' (<р (05"-С5"-С4'-СЗ')=-169.7") и гош - относительно С4'-04'-связи (<р (05"-С5"-С4'-04')=-56.0°).

В гаА(4'СН20Н) эпоксидный цикл находится в экзо-ориентации. В результате в этой молекуле реализована конформация, отличающаяся от конформаций, наблюдаемых в структуре 1аС(4'СНгОН). Фуранозный цикл в молекуле гаА(4'СН:ОН) практически плоский. Фазовый угол псевдовращения Р=258.9°, максимальная амплитуда псевдовращения 4,п=13.5°. Эти значения близки к величинам Р=250.8° и Ч,ш=9.1°, наблюдаемым в молекуле гаА и соответствуют 04'-экзо-С4'-э»<)о-конформации сахара. Отклонения атомов С4' и 04' от плоскости атомов CI', С21, СЗ' составляют всего 0.130 и О.ОббА. Если же провести среднеквадратичную плоскость через все атомы фуранозного цикла, то максимальное значение отклонения атомов равно 0.076А, и в этих пределах цикл можно рассматривать, как плоский.

Конформация молекулы относительно экзоциклической связи С4'-С5' -транс (у(05-С5'-С4'-СЗ')= 166.2°), связь С5"-05" находится в ш/гдис-ориентации относительно С4'-04'-связи ((р(05"-С5"-С4'-04') = 170.6°) и гош - относительно СЗ'-С4'-связи (ф(05"-С5"-С4'-СЗ') = -56.6°).

Величина торсионного угла х(04'-С 1 '-N9-C4), описывающего взаимную ориентацию основания и фуранозного цикла, равна -98.0° и соответствует анти-конформации нухлеозида. В кристаллографически независимых молекулах гаА вокруг гликозидной связи реализованы два конформера с отличными от приведенного выше значения углов х: X* (04'-Cl'-N9-C4)= 56.8° (син) и хъ (04'-СГ-N9-C4)= -170.8° (анти).

Итак, полученные для молекул гаА(4'СНгОН) конформационные параметры еще раз свидетельствуют об уплощенном строении фуранозных циклов в соединениях с эюо-ориентацией эпоксидных циклов и повышенной конформациокной подвижности вокруг N-гликозидной связи.

Суммируя приведенные в настоящем сообщении рентгеноструктурные данные, отметим, что, независимо от присутствия дополнительного заместителя при атоме С4', в молекулах 1аС(4'СНЮН) и гаА(4'СНЮН) реализуются те же конформационные параметры, что и в молекулах коиформационно ограниченных соединений 2',3.'-ликсо- и 2,,3'-рибоангидронуклеозцдов.

Однако, 1аС является высокоэффективным ингибитором репродукции ВИЧ, а у 1аС(4'СНз0Н) анти-ВИЧ активность практически отсутствует. (Данные проф. X. Мицуя, Национальный Раковый Ин-т, Бетесда). Одной из возможных причин потери активности у 1аС(4'СНзОН) может являться значительная экранировка объемным заместителем, расположенным в 4'-положении, доступа к атомам фуранозного цикла с его экзо-стороны. Это может затруднять взаимодействие 4'-гидроксиметилъных нуклеозидов с ферментами биосинтеза ДНК. Подтверждением вышесказанного может служить отсутствие анти-ВИЧ-активности у других конформационно ограниченных соединений, таких как 4'-азидо- и 4'-гядрок-симетил-2,,3'-дидезокси-2',3'-дндегкдротимидинов (Prisbe Е. et al., Nucleosides and

Рис. 12. Строение кристаллографически независимых молекул ¿сЩЗ'СМ'Ме).

Nucleotides as Antitumor and Antiviral Agents, New York, 1993, p.101-113), в то время как d4T является сильным ингибитором репродукции ВИЧ и в настоящее время используется в медицинской практике.

3'-Хлор-4'-метил-2',3'-дидезокситимидин (ddT(3'Cl,4'Me)) относится к конформационно подвижным соединениям с двойной модификацией по 3'- и 4'-положениям. Согласно полученным реитгеноструктурным данным, обе кристаллографически независимые молекулы ddT(3'Cl,4'Me) (рис.12 ) характеризуются аити-конформацией вокруг N-гликозидной связи (торсионный угол xa(C2-N 1 -С Г-041) = -165,8°, a xb(C2-N1-C1'-04') = -156,7°) и по конформации сахара относятся к N-популяции. Первая молекула имеет фазовый угол псевдовращения Рл=18.04°, максимальную амплитуду псевдовращения 4*01=37.9°, что соответствует СЪ'-эндо-конформации (3Е) фуранозного цикла. Атом СЗ' отклонен от плоскости атомов 04',СГ,С2' и С4' на 0,568Â. У второй молекулы Рв=24.92°, ^=39.2°, что соответствует СЗ'-эидо-С4'-зкзо-изгибу фуранозного цикла ОТО- Атомы СЗ' и С4' отклонены от плоскости атомов 04\Cl',С2' на 0.496 и 0.118Â соответственно. Конформация молекул относительно экзоциклической С4'-С5'-связи - гош+ ул(СЗ'-С4'-С5'-05') = 52,5°; уа= 46,7°). Это соединение не подавляет репродукцию ВИЧ в клеточных культурах, что, по-видимому, обусловлено эффектом экранировки объемной метальной группой в 4'-положении, как и в случае предыдущих соединений.

3'(5)-Мепш-3'(^-фтор-2',3'-дидезокситимидин (ddT(3'(S)Me,F)) сочетает в себе структурные элементы как dT(3'Me), так и 3'-фтор-2',3'-дидезокситимидина (ddT(3'F)), обладающего высокой анти-ВИЧ активностью, близкой к активности AZT. В то же время ddT(3'Me,F)) не подавляет репродукцию ВИЧ в клеточных культурах. 5'-Трифосфат этого соединения также не проявляет субстратных свойств по отношению к ДНК-полимеразам и обратным транскриптазам.

Реитгеноструктурным исследованием установлено, что конформация молекул ddT(3'Me,F) (рис.13 ) очень близка к конформации молекул dT(3'Me), dC(3'Me) и ddT(3'F).

Конформация ddT(3'Me,F) относительно N-гликозидной связи - анти, торсионный угол x(C2-Nl-Cl'-04')= - 127.3° .Это значение близко к величинам х> наблюдаемым в молекулах аналогов с одним метальным замещением при атоме СЗ', а именно, в (dT(3'Me)) (х=-116.6°) и (С(З'Ме) (х=-130.9°). Кроме того, во всех этих соединениях реализована одна и та же го««+-конформация молекул .относительно С4'-С5'-зкзоциклической связи. Торсионный угол у(05'-С5'-С4'-СЗ') в молекуле ddT(3'Me,F) равен 56.8° , а в молекулах dT(3'Me) и С(З'Ме) он соответственно составляет 50.1° и 61.7°.

Конформация фуранозного цикла молекулы ddT(3'Me,F) описывается фазовым углом псевдовращения Р= 173.0° и максимальной амплитудой псевдовращения 4V=38.43. Это соответствует С2'-эндо-СУ-жзо (гТз) изгибу сахарного цикла с выводом атомов С2' и СЗ' из плоскости С Г, С4', 04' атомов на 0.414Â и 0.192Ä . Конформация сахара в молекуле dT(3'Me) - С2'-эндо-С\'-экзо (*Ti , Р= 157.5", Ч,т=38.0°), а в молекуле С(З'Ме) - С2'-зндо-СУ-эхзо (2Тз, Р= 167.0°, 4Jm=37.8°). Таким образом, во всех рассмотренных СЗ'-метильных аналогах нукле-озидов конформации сахарных циклов принадлежат к S-популяции.

Итак, из вышеприведенных данных видно, что молекулы пиримидиновых нуклеозидов, в которых атом водорода в СЗ'-положении замещен на метальную группу, независимо от природы сахара, дополнительной его модификации и типа основания имеют одинаковые конформации: оити-конформацию относительно N-глнкозидной связки, гош+- конформацкю - вокруг экзоциклической С4'-С5-связи и эк<)о-положение атома С2' в фуранозных циклах (S-популяция). В молекулах этих соединений либо нуклеиновые основания, либо метальные группы в СЗ'- положении выводятся в экваториальное положение, в силу чего

3'(8)-Метил-3'(11)-фтор-2\3'-дидезокситимидин

Рис. 13. Строение молекулы ddT(3'(S)Me,(R)F).

уменьшаются возможные пространственные затруднения между атомами названных объемных фрагментов. Эти данные согласуются с результатами изучения ddT(3'Me,F) в растворе методом ЯМР.

В то же время, конформация молекул высокоактивного ингибитора репродукции ВИЧ-1 ddT(3'F) очень близка к конформации молекул ddT(3'F,Me). Усредненные по четырем кристаллографически независимым, но имеющим близкую конформацию, молекулам по работе P. Van Roey et al. (Antiviral Chem. Chemother., 1990, V.l, p.93) конформационные параметры имеют следующие значения : х=-137.6°, Р=174.0° ( СЛ'-эндо-СЗ'-зкзо (3Тз)), Ч/т=32.5°, у = 48.3°, а усредненные по работе N.Camerman et al. (Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1990, V.87, p.3534) по двум кристаллографически независимым молекулам : х=-'3?.4°, Р= 164.0" ( С2'-эндо-СУ-зкзо (2Тз)), Ч^Зб.О", у = 53.0». Напомним, что ddT(3J) относится к числу конформационно подвижных соединений. Несмотря на конформационное сходство с ddT(3'F), трифосфагы ни одного из исследованных нами З'-метильных аналогов 2'-дезоксинуклеозидов не являются субстратами биосинтеза ДНК, т.е. не включаются в растущую цепь ДНК, а проявляют очень слабые ингибирующие свойства по отношению к различным ДНК-полимеразам и обратным транскриптазам по конкурентному к dTTP механизму. Однако, у трифосфата З'-метилуридина обнаружены свойства терминаторных субстратов биосинтеза РНК. Следовательно, можно предположить, что либо относительно "жесткая" конформация фуранозных циклов с выводом атомов С2' в зпдо-положение в 3'-метил-2'-дезоксинуклеозидах является запретной для продуктив-

ных комплексов биосинтеза ДНК, и конформационно ограниченный нуклеозид не может приобрести конформацию активного субстрата, либо присутствие объемного заместителя со стороны нуклеинового основания затрудняет образование необходимых в процессе синтеза ДНК комплексов нуклеотида с ферментами.

Диаксамшоеыеаналоги2\ 3-дезоксинуклеозидов

Недавно было установлено, что 2\3'-дезоксинуклеозиды, содержащие вместо рибозы диоксолановый или оксатиолановый циклы, являются эффективными ингибиторами репликации ВИЧ. Кроме того, было обнаружено, что анти-ВИЧ-активностью обладают соединения, моделирующие как В-, так и Ь-ряды нуклеозидов. Поэтому интерес к этому классу соединений возрос, и поиск среди них новых блокаторов ВИЧ продолжается.

В ИМБ были синтезированы две серии а- и Р -аномеров диоксолановых нуклеозидов с атомами кислорода в 2'- и З'-положениях (см. рис.14), которые отличались от уже известных подобного рода соединений наличием дополнительной СНз-группы между гетероциклическим основанием и диоксолановым циклом. Такая модификация приводит к увеличению расстояния между основанием и атомами С Г и С51 по сравнению с природными нуклео-зидами и повышает конформационную подвижность молекул за счет введения дополнительной экзоцкклкчеекой одинарной связи.

//ис-4(К,8)-г1щр0Ксиметил-2(5,ННт,,ми,,-1"илметил)-11^-Ди0КС()-',ан> («<«£-

4(14,8)Т-1 ;3-диокс) , цис-2(К,8)-гндрока1метил-4(8,В)-(тамин-1-илметил)-1,3-диок-солан ( ч"с-2(Н,8)Т -1,Здиокс) и яуанс-4(К,5)-гиароксиметил-2(5>КНУрацил-1-ил-метил)-1,3-диоксолан (т/>я«с-4(К,8)С-1,Зднокс) были закристаллизованы, и было проведено их рентгеноструктуряое исследование. На рис.14 показано строение молекул изученных соединений и приведена использованная нумерация атомов, которая для облегчения сравнений совпадает с общепринятой для нуклеозидов. Все нижеприведенные данные соответствуют энантиомерам, изображенным на рис.14. Взаимная ориентация оснований и диоксолановых циклов в исследованных структурах может быть описана двумя торсионными углами (04'-СГ-С1"-Ы1) и (С1'-С1"-1Ч1-С2) в отличие от нуклеозидов с Ь'-гликозэдной связью, в которых она определяется одним торсионным углом х(04'-СГ-М1-С2). Величины двух указанных углов составляют соответственно для структуры (а) - 65.64" и 95.37", для структуры (б) -51.21" и -92.18°, для структуры (в) - -103.72° и 175.88°. Двухгранные углы между среднеквадратичными плоскостями, проведенными через экдоциклические атомы оснований и диоксолановые циклы, равны 104.3°(а), 34.4° (б) и 30.6° (в). Только в соединении (а) этот угол близок к углу в природных нуклеозидах.

Экзоцикпическая гидроксиметилькая группа находится в транс-конформации в структуре (а) (торсионный угол у(СЗ'-С4'-С5'-05')=-178.4"), в трсдс-конформации в структуре (в) (у= 178.4°) и в гои/+-конформации в структуре (б) (у=60.0°). Все эти конформацки характерны для структур природных нуклеозидов. •

Конформация диоксоланового цикла в структуре (а) - СУ-экзо-02'-эндо (фазовый угол псевдовращения Р равен 166.5°, максимальная амплитуда псевдовращения Уп составляет 39.4°), в (в) - С1'-экзо-02'-эндо (Р= 137.2°, 4^=31.7°), и в (б) - 03'-экдо-С2'-экзо (Р=9.5°, 4'»=42.7°). Таким образом, атомы кислорода в 2' (У)-положениях в исследованных нами структурах (а-в) находятся в эндо-конформации. Аналогичная ситуация наблюдается и в структурах диоксолановых аналогов (-)Ч2К,4К)-1-[2-(гидроксиметил>1,3-диоксолан-4-ил]-тимина и (+)-(2К,4Я>1-[2-(гидроксиметил>1,3-диоксолан-4-ил]-цитозина, прояв-

Thy

HOCH, C»2

-о

i|uc-4(R,S)-rnflpoKciiMernm-2(S,R)-(тимин-Ьилмегил)- 1,3-диоксолан

Thy

HOCHj CH2

"О

¡/¡/f-2(R,S)-nmpoKCJiMeTJW-4-(S,R)-(тнмин- l-шшетил)- 1,3-диоксолан

носн2

ç„,

Lita

ХЛ12

О:

транс-4(R,S)-niflpoKcnMerim-2(S,R)-(урадил-1 -илметил)-1,3-диоксолан

0(4)

Рис. 14. Строение молекул !{wc-4(R,S)T-(1,3-äiiokc.), t(MC-2(R,S)T-(l,3-диокс.) и /;?pa;/c-4(R,S)U-(l,3-flH0Kc.).

ляющих высокую антн-ВИЧ-активиость (Kim Н. et al. J. Med. Chem. 1992 ,V.35, p.1987).

Исследование биологических свойств диоксолановых аналогов (а-в) на клеточных культурах показало, что эти соединения не обладают цито-токсичностью и не проявляют активности против ВИЧ-I и ряда вирусов группы герпеса (E.R.Kern, R.Schultz, неопубликованные данные). В то же время результаты изучения субстратных свойств диоксолановых нуклеозидтрифосфатов свидетельствуют, что они терминируют синтез ДНК, катализируемый ДНК-по-лимеразами и обратными траскриптазами из различных источников (табл.5). Однако их активность по отношению к обратным транскриптазам на 1-2 порядка величины ниже, чем у AZT и ddT(3'F). Поэтому можно предположить, что проведенная модификация 2', 3'- дидезоксинуклеозидов - замена фуранозного цикла на диоксолановый и введение дополнительной СН2-группы между гетероциклическими основаниями и диохсолановыми фрагментами - в принципе не препятствует узнаванию нуклеозидов на уровне их трифосфатов ДНК-полимеразами. Конформационная гибкость молекул диоксолановых аналогов тимидинтрифосфата, по-видимому, позволяет им приобретать в активном центре фермента конформацию, подобную конформации природного субстрата.

Таблица 5. Субстратные свойства трифосфатов диоксолановых аналогов в реакциях синтеза ДНК

Фермент tyuc-4(R,S)T-1 ,Здиок y!/c-2(R,S)-1 .Здиокс

ДНК-полимераза I Обратная транскриптаза ВИЧ Обратная транскриптаза AMV Концевая дезоксинуклеотидил -грансфераза терминатор терминатор терминатор терминатор терминатор

---аналог нуклеозидтрифосфата не включается в цепь ДНК.

Субстратные свойства трифосфатов изучены в лабораториях химического и биологического анализа биополимеров и клеток ИМБ РАН и генной инженерии Института экспериментальной кардиологии КНЦ РАМН

АНАЛОГИ РИБОНУКЛЕОЗИДОВ: ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

Рибонуклеозиды с метальными заместителями при различных атомах углерода углеводных фрагментов

Наиболее распространенными приемами создания модифицированных нуклеозидов является замена или удаление их функциональных групп. Ниже будут рассмотрены модифицированные нуклеозиды, в которых сохраняются все функциональные группы природных нуклеозидов, потенциально необходимые для связывания с ферментами биосинтеза нуклеиновых кислот, а замещаются атомы водорода СН-групп углеводного остатка химически инертной объемной метальной группой. При этом не меняется характерная для природных нуклеозидов конфигурация функциональных групп.

Введение метальных групп должно влиять на конформацию фуранозного кольца и, возможно, молекулы нуклеозида в целом, а также на реакционную способность соответствующих гидроксильных групп, так как при введении метальных заместителей в С5'- или в СЗ'-, С2'-положения происходит переход соответственно от первичной спиртовой группы ко вторичной, и от вторичной к третичной. У соединений с уменьшенной реакционной способностью З'-гидрок-сильных групп можно было ожидать появление свойств терминаторных субстратов ДНК- и РНК - полимераз.

Нами проведены рентгеноструктурные исследования ряда метилированных аналогов нуклеозидов и установлено влияние на пространственное строение и конформацию молекул нуклеозидов введения метальных заместителей в С2'-, СЗ'-, С5'- положения. Изучена также структура аналога с гидроксиметильным заместителем в СГ-положение и показано, что присутствие заместителя в этом положении фактически не оказывает влияния на конформацию молекулы в целом. Рентгеноструктурные данные для <ГГ(3'Ме) рассмотрены в разделе модифицированных дезоксинуклеозидов.

5'(К)-Метилцитцдин (С(5'(й)Ме)), 5'(8)-Метилщт1дин (С(5'(8)Ме)) и 5'(8)-метил-2'-дезокситимидин (<1Т(5'(5)Ме)). Исследования 5'-замещенных нуклеозид-5'-трифосфатов в реакциях, катализируемых некоторыми ДНК и РНК полиме-разами, показали, что ряд ферментов дискриминирует (Я)- и (З)-стереоизомеры 5'-метилнуклеогидов. Так ДНК-полимераза I Е.соИ, ДНК-полимераза а и концевая дезоксинуклеотидилтрансфераза тимуса теленка дискриминируют 5-трифосфаты У-метильных производных тимидина, а ДНК-зависимая РНК-полимераза Е.соИ -5'-трифосфаты (Я)- и (З)-диастсрсомеров 5'-метилуридина. Остается неясным, чем обусловлена эта стереоспецифичность - общей конформацией молекул субстратов или же только конфигурацией атомов при С5'. Чтобы получить ответ на этот вопрос, нами был проведен рентгеноструктурный анализ двух аналогов из рибо-ряда - С(5'(Я)Ме), С(5'(3)Ме) и одного из дезокси-ряда - с1Т(5'(3)Ме) (рис. 15а,б,в ).

Полученные рентгенострутурные данные свидетельствуют о конформа-ционной близости этих трех нуклеозидов. Так, в структурах С(5'(1?)Ме), С(5'(3)Ме) и сГГ(5'(3)Ме) относительная ориентация плоскостей основания и фуранозных циклов соответствует дитли-конформация нуклеозидов. Торсионные углы х(04'-СГ-К1-С2) имеют близкие значения и соответственно равны -122.0°, -119.0° и -129.8°. Конформация молекул обоих диастереомеров С(5'(11)Ме) и С(5'(3)Ме), а также <1Т(5'(8)Ме) относительно экзоциклической С4'-С5'-связи - гош+ , торсионные углы у(05'-С5'-С4'-СЗ') и ф (05'-С5'-С4'-04') соответственно равны 51.5° и -68.0° для С(5'(Я)Ме), 52.1° и -67.2° для С(5'(8)Ме) и 58.3° и -61.1° для -сГГ(5'(5)Ме).

Наблюдаемые в изученных структурах конформации аити вокруг гликозидной связи и гош+ - вокруг связи С4-С5'-являются типичными для природных нуклеозидов.

Фуранозные циклы в молекулах обоих сгереоизомеров С(5'(Л)Ме), С(5'(3)Ме), а также <ЗТ(5'(3)Ме), имеют скошенную конформацию С2'-эндо-СУ-экзо (!Тз). Атомы С2' и СЗ' расположены по разные стороны от плоскостей, проведенных через атомы С Г, С4', 04', и находятся на расстояниях, соответственно равных 0.423 и 0.160 А для С(5'(К)Ме), 0.445 и 0.140 А для С(5'(3)Ме)- аналога и 0.446 и 0.139 А для <Щ5'(3)Ме). Угол псевдовращения Р равен 171.5°, максимальная амплитуда псевдовращения Ут = 35.6° для С(5'(Я)Ме), во втором аналоге цитидина им соответствуют значения Р = 169.9° и Ч'т=36.2°, в (1Т(5'(3)Ме) - Р = 169.9° и хРт=36.4°.

Напомним, что конформация фуранозного цикла в структуре природного цитидина - СУ-эндо-С2'-экзо, а природного тимидина - СУ-экзо-СТ-эндо. Кроме

5'(R) - Метилцитидин

X - -122.0°(anti) Р= 171.5° >Pm=35.60 C2'-endo-C3'-exo Y = 51.5°(gauche+)

'ïMf'":" 5'(S) - Метилцитидин

X = -I19.0o (anti) P= 169.9° ^т=36.2° C2'-endo-C3'-exo Я11| r = 52.1°(gauche+)

5'(S)- Метил-2-дезокситимидин

X = -129.8° (anti) P = 169.9° •Pm=36.4° C2'-endo-C3'-exo Y = 58.3°(gauche+)

Рис. 15. Строение молекул C(5'(R)Me), C(5'(S)Me) и dT(5'S(Me».

того, в молекулах С(5,(Я)Ме), С(5'(5)Ме) и (Щ5'(5)Ме) наблюдается некоторое удлинение С5'-05'-связей (см. табл. 6) и уменьшение валентного угла СД'-СУ-ОУ по сравнению с природными соединениями. Таким образом, установлена конформационная идентичность молекул С(5,(К)Ме), С(5'(8)Ме) и с1Т(5'(8)Ме), для которых характерны: анти-конформация вокруг Ы-гликозидной связи, гош+ относительно экзоциклической С4'-С5-связи и С2'-эндо-СУ-экзо-югиб сахарного цикла и близкие значения соответствующих торсионных углов. С2'-эндо-СУ-экзо-конформация фуранозного цикла, по-видимому, является наиболее выгодной для этих соединений.

Приведенные выше данные хорошо согласуются с результатами исследований конформации 5'-замещенных нуклеозидов в растворе методами ЯМР- и КД-спектроскопии. С.Н.Михайловым с соавторами (Ъиоорган. химия. 1982, т.8, с.926) было установлено, что введение метальной группы в 5'- положение существенно не сказывается на конформации молекул в целом, но при этом наблюдается некоторое увеличение доли в-конформеров.

Различия между структурами молекул (И)- и (8)-диастереомеров цитидина проявляется только в расположении метальной группы относительно хирального атома С 5'. Следовательно, обнаруженная у ряда ферментов способность дискриминировать диастереомеры У-метилзамещенных нуклеозидов и нуклеотидов может быть связана с распознаванием этой хиральной конфигурации.

1-{3'-С-Метил-р-0-рибофуранозил)цитознн (С(З'Ме)) относится к группе рибонуклеозидов с модификацией по 3'-положению. Это соединение представляет интерес в связи с обнаружением у трифосфагов некоторых З'-метилри-бонуклеозидов свойств эффективных терминаторных субстратов ДНК-зависимой РНК-полимеразы Е. соН, а также наличием антивирусной активности у 3'-метилзамещенных нуклеозидов против вируса осповакцины. Биологическая активность, по-видимому, обусловлена изменением реакционной способности их З'ОН-гидроксильных групп, в результате перехода от вторичной (в природных нуклеозидах) к третичной гидрооксильной группе в С(3'Ме).

З'-Мегшщитидин Рис. 16. Строение молекулы С(З'Ме).

Установлено, что для молекулы С(З'Ме) (рис.16) характерна анти-конформация вокруг гликозидной связи (х(04'-С 1 '-N1 -С2)=-130.9°), гош+-конформация относительно экзоциклической связи С4'-С5' (у(СЗ'-С4'-С5'-05')=61.7°) и С2'-э/1до-СЗ'-жзо (2Tj) изгиб сахара (Р= 167.0°, 4>т=37.8°). Отклонения атомов С2' и СЗ' от плоскости, проведенной через атомы С Г, С2' и 04', составляют 0.496 и 0.107Ä, т.е. имеет место явно выраженная С2'-э//до-конформация фуранозного цикла. Как уже отмечалось, эти конформационные параметры близки к параметрам, наблюдаемым в структуре dT(3'Me). Кроме того, в молекуле С(3'Ме) связь СЗ'-ОЗ'Н (третичная гидроксильная группа) несколько удлинена по сравнению с природным нуклеозидом (табл.6), в котором 3'-гидроксильная группа является вторичной.

Таким образом, молекулы З'-мегилпиримидиновых нуклеозидов рибо- и дезоксирибо-рядов имеют близкое пространственное строение, не зависящее от природы их сахарных остатков. В них либо нуклеиновое основание, либо метальная группа выводятся в экваториальное положение, а атом С2' всегда находится в эндо-положении. Этим достигается уменьшение пространственных затруднений между атомами названных объемных фрагментов молекул.

В случае З'С-метилрибонуклеозидов конформация молекул, по-видимому, близка к конформации молекул субстрата в продуктивных комплексах биосинтеза РНК, из чего следуют и их терминаторные свойства.

2'-С-Метилуридин (U(2'Me)) - это соединение, в котором мет ильная группа расположена в 2'-положении над фуранозным циклом со стороны основания.

Введение объемной метильной группы в 2'-положение природных нуклеозидов вызывает значительное увеличение энергетического барьера вращения вокруг гликозидной связи при переходе от анти- к син- конформации из-за значительных стерических затруднений, возникающих между атомами 2'-метильной группы и атомами 02 карбонильной группы и Н6 пиримидинового основания (N3, Н8 - в случае пуринового основания). Это может привести к раздельному существованию син- и алиш-стереоизомеров в растворе при комнатной температуре и совпадению конформаций в растворе и кристалле. Согласно данным ЯМР- и КД-спектроскопии (Beigelman L. et al. Carbohydr. Res. 1987, V.166, p.219), молекулы 2'-метилнуклеозидов в растворе преимущественно или полностью находятся в а/даш-конформации относительно гликозидной связи, и их фуранозные циклы относятся к N-популяции. Из рентгеноструктурных данных (рис.17) также следует, что молекула U(2'Me) относительно гликозидной евязи имеет амоти-конформацию с торсионным углом x(04'-Cl'-Nl-C2), равным -145.5°. Конформация аналога относительно С4'-С5'-связи - гош+. Соответствующие торсионные углы равны: у(СЗ'-С4'-С5'-05')=60.8° и ф(05'-С5'-С4'-04')=-56.8°. Конформация фуранозного цикла в молекуле U(2'Me) - СЗ'-экдо-С4'-жзо (3Т4). Атомы СЗ' и С41 расположены по разные стороны от плоскости атомов СГ, С2' и 04' на расстояниях 0.445Ä и 0.085Ä соответственно. Угол псевдовращения Р=24.8°, максимальная амплитуда псевдовращения Ч'т=33.4°. Отметим, что в природном уридине конформация фуранозного цикла - СЗ '-эндо, а конформация вокруг гликозидной связи - анти. В молекуле U(2'Me), как и в предыдущих структурах, наблюдается удлинение связи С2-02' и уменьшение экзоцихлического угла СГ-С2-02'.

. Таким образом, во всех исследованных нами структурах аналогов нуклеозидов с метальными заместителями наблюдается увеличение (превышающее 3-5 ст) длин С'-О-связей при метилированном атоме углерода углеводного остатка по сравнению с природными нуклеозидами. Соответствующие данные суммированы в табл. 6.

Из табл. 6 видно, что наибольшее удлинение С'-ОН-связи наблюдается в структуре С(З'Ме). Аналогичные удлинения С-О-связей обнаружены в ряду первичный-вторичный - третичный спирт при анализе большого числа кристаллических

Таблица 6. Длины С'-О-связей (Â) гидроксильных групп в нуклеозидах

Нуклеозид ' С5'-05'Н СЗ'-ОЗ'Н С2'-02'Н

аС(5'Ме) 1.423 1.425 1.419

tC(5'Me) 1.434 1.416 1.421

С(З'Ме) 1.420 1.450 1.426

dT(3'Me) 1.431 1.444 —

U(2'Me) 1.423 1.410 1.431

цитидин 1.404 1.410 1.425

уридин 1.414 1.412 1.418

тимидин 1.425 1.488 —

структур спиртов и их производных по кристаллографическому банку данных ( Allen F. et al. J. Amer. Chem. Soc. 1984, V.106, p.6197). Этот эффект объясняется авторами увеличением полярности или ионного характера данных связей. По аналогии можно предположить, что и в нашем случае переход от вторичной спиртовой группы к третичной сопровождается увеличением вклада структур RC+ "ОН и удлинением RC-OH связи. Последнее, в свою очередь, может обусловливать увеличение рК спиртовых групп и, следовательно, понижение реакционной способности гидроксильных групп в реакции нуклеофильного замещения протона в них в условиях основного катализа. Это объясняет наблюдаемую способность 3'-метилцитидин-5'-трифосфата терминировать синтез РНК, катализируемый ДНК-зависимой РНК-полимеразой Е. coli.

1-(2-р-0-Псикофуранозил) цитозин С(ГСНЮН). Несмотря на то, что некоторые нуклеозиды - производные D-псикофуранозы - являются природными антибиотиками и ингибиторами некоторых ферментов, до настоящего времени нам не известно ни одного примера исследования их пространственного строения рентгеноструктурным методом. Следует отметить, что эти соединения, кроме вышеуказанной активности, могут представлять значительный интерес для исследования ферментов и нуклеиновых кислот в связи с возможностью получения различных производных по 1'СНгОН-группе, сохраняя при этом все функциональные группы, а также конфигурацию всех хиральных центров природных нуклеозидов. Целью настоящего исследования псикоцитозина является выяснение влияния на конформацию цитидина наличия дополнительной гидроксиметильной группы при СГ-атоме углеводного остатка. На рис. 18 представлено строение молекулы СО'СНгОН). Как видно из рис.18, относительная ориентация плоскостей основания и рибозы соответствует анти-конформа-ции нуклеозида. Торсионный угол x(04'-Cl'-Nl-C2) равен -174.5°. Конформация молекул относительно экзоциклической С4'-С5'-связи - гош+, торсионные углы -Те(СЗ'-С4'-С5'-05')=46.8° и <?(05'-С5'-С4'-04')=-70.10. Конформация рибозы - СЗ'-эндо-С2'-экзо (3Тг). Атом СЗ' отклонен от плоскости, проведенной через атомы 04', СГ и С4', на расстояние 0.478А в сторону экзоциклического атома С5'. Атом С21 находится с противоположной стороны плоскости на расстоянии 0.159А. Угол псевдовращения Р рибозы равен 9.6°, максимальная амплитуда псевдовращения составляет 39.6".

Конформация молекулы природного цитидина такова: ашии-ориентация основания относительно углеводной части, СУ-эндо-С2'-экзо (3Тг)- изгиб фуранозы и гош+-конформация экзоциклической С4'-С5'-связи.

Из сравнения видно, что присутствие гидроксиметильного заместителя при атоме Cl' принципиальных конформационных изменений в структуре аналога цитидина не вызывает.

X = —145.5°(anti) 1)5

P = 24.8° 4,m=13.4° C3'-endo-C4'-exo у = 60.8°(gauche+)

2'-Метилуридин (U(2'Me) Рис. 17. Строение молекулы U(2'Me).

нет

l-{2'- ß-D-пснкофуранозил) цитоз кн CO'CHiOH))

Рис. 18. Строение молекулы СО'СНгОН)

Молекулярные структуры циклических нуклеозидов с сил-конформацией

Химия и кристаллохимия циклических ангидронуклеозидов достаточно хорошо изучена в настоящее время для пиримидинового и пуринового рядов. Однако прогресс в этом направлении достигнут, в основном, в области цикло-нуклеозидов, моделирующих ан/ли-конформеры природных соединений, в которых в циклизацию включена одна из функциональных гвдроксильных групп нуклеозида.

Поэтому было актуально установление кристаллических и молекулярных структур представителей новой группы ангидронуклеозидов, циклизация в которых осуществлена между атомом С6 для пиримидинов или атомом С8 для пуринов с атомом кислорода гидроксимегильной группы при модифицированном СГ-атоме углеводного остатка 2-Р-0-псикофуранозидов. При такой циклизации сохраняются все функциональные группы природного нуклеозида, и циклонуклеозид представляет собой модель сын-формы нуклеозида.

8,1'-Ангидро-8-гидрокси-9-(2-Р-0-псикофуранозил)адени11 (8,1'-0-аА') и 6,1 '-ангидро-6-гидрокси-1-(2-Р-В-псикофуранозил)цитоз1Ш (бД'-О-аО). На рис. 19 , 20 показано строение двух кристаллографически независимых молекул 8,1'-0-аАр и молекулы 6,Г-0-аС>. Установлено, что при циклизации 1'С-гидроксиметильной группы с атомами С8 аденинового основания (или Сб - цитозинового) образуются син-и иклонуклеозиды, характеризующиеся одинаковыми конформациями относительно Ы-гликозидных и С4'-С5'-экзоциклических связей, не зависящими от природы основания. Соответствующие торсионные углы в сильно гидрати-рованной структуре 8,1-О-аАр для двух кристаллографически независимых молекул равны хл(04'-СГ-М9-С4)=68.°, хв(04'-С Г-Ы9-С4)=65.7° и уд= 175.0°, ув= 178.3°, в структуре 6,Г-0-аС>> - х(О4'-СГ-Ы1-С2)=65.0° и у=180.0°.

В исследованном типе сик-ангидронуклеозидов сохраняется свойственная для природных соединений подвижность фуранозного цикла. В 8,Г-0-аА'> и 6,Г-0-аО обнаружены три конформации углеводного остатка. Так в молекуле А 8.Г-0-аАр реализована СТ-эндо-СЗ'-экзо (^Тз) конформация фуранозного цикла, атомы С2' и СЗ' отклонены от плоскости атомов СГ, С4', 04' на 0.401А и 0.201 А (Р=174.2°; 4^=38.0°). В молекуле В 8,1'-0-аАе конформация сахара близка к симметричному твисту - СЗ'-экзо-С2'-эндо (VI) с отклонениями атомов СЗ1 и С2' от плоскости атомов С Г, С4\ 04' равными 0.332 и 0.306 А (Р= 180.7°; 4^=38.9°). В молекуле б.Г-О-аО обнаружено СУ-эндо-СА'-экзо (^4) конформация углеводного цикла ( Р=24.4°; Ч'т=32.7°) атомы СЗ' и С4' выведены из плоскости атомов СГ, С2', 04' на 0.429 и 0.096 А соответственно.

Интересные результаты получены также относительно геометрии пятичленного ангидроцикла типа Ы-С-С-О-С. Анализ строения оксазолидиновых циклов в структурах в.Г-О-аО* и 6,Г-0-аС> выявил асимметрию длин связей С-0 и О-С, существенное укорочение О-С-связи, примыкающей к основанию, и удлинение второй С-О-связи. Четыре валентных угла оказались приблизительно, тетраэдрическими, а пятый угол Ы-С-С - приблизительно 100°. Аналогичная ситуация имеет место в ряде других структур, в которых пятичленный ангидроцикл Ы-С-С-О-С образован другими атомами основания и углеводного остатка.

Конформации ангидроциклов в двух кристаллографически независимых молекулах 6,1'-0-а0 и в.Г-О-аО'' несколько различаются. В молекуле А первого соединения из плоскости нуклеинового основания и атома О Г выведены агом С Г в сторону атома 04' и атом СГ' - в обратную сторону на 0.197 и 0.118 А соответственно. Следовательно, конформация ангидроцикла - твист (^''Тсг). В молекуле В реализована конформация конверта (срЕ). Атом СГ выведен из плоскости атомов нуклеинового основания и остальных атомов ангидроцикла в сторону атома 04' на 0.147 А. В молекуле 6,1 '-О-аС атомы оксазолвдинового

х = 65.0°(зуп)

Р = 24.4° 32.7°

СЗ'-еп(1о-С4'-ехо

6, Г-Ангидро-6-гидрокси-1-(2-Р-В-псикофураиозил)цитозин Рис.20. Строение молекулы 6,1'-аОр.

цикла и атомы нуклеинового основания приблизительно копланарны.

Циклизация в исследованных структурах привела к существенному искажению (на ~4-10°) по сравнению с природными соединениями углов при гликозидной связи.

Из сравнения кристаллических структур 6,Г-0-аС> и 8,1'-С)-аО (табл. 1) видна высокая склонность адениновых оснований второго из этих соединений к гидратации. Несмотря на одинаковые условия кристаллизации, структура 6,Г-0-аО оказалась безводной, а в структуре 8, Г-О-аО на каждую молекулу нуклеози-да приходится по шесть молекул воды. В структурированной жидкости обнаружены два пятичленных кластера молекул воды, структура которых более гибка и менее детерминирована, чем в клатратной структуре льда. Очень вероятно, что подобные гибкие структуры реализуются в первичных и вторичных гидратных оболочках 'макромолекул. Более подробная информация представлена в соответствующей статье (см. список публикаций).

АЦИКЛИЧЕСКИЕ АНАЛОГИ НУКЛЕОЗИДОВ С РАЗЛИЧНЫМИ МОЛЕКУЛЯРНЫМИ МЕХАНИЗМАМИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ, ИХ СТРУКТУРА И СВОЙСТВА

В настоящее время в качестве перспективных биологически активных соединений рассматриваются аналоги нуклеозидов, несущие вместо остатков

рибозы или дезоксирибозы ациклические гидроксиалкильные заместители, имитирующие тот или иной фрагмент углеводного цикла. Среди этих соединений уже найдены высокоэффективные противовирусные агенты, ряд которых используется в клинической практике (ацикловир, ганцикловир, рибавирин). С целью поиска новых противовирусных препаратов в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН была синтезирована серия аналогов рибавирина и ацикловира . Изучению пространственного строения некоторых из этих соединений (рис.21) и выявлению связи основных закономерностей их строения с биологической активностью и посвящен настоящий раздел диссертации.

1- (2-Гкдроксиэтоксиметил) - 1,2,4-триазол - 5-карбоксамид (5-НЕМТ). 5-НЕМТ является антивирусным агентом, подавляющим репродукцию вируса простого герпеса и обладающим большей активностью и меньшим цито-токсическим действием в клеточных культурах (Галегов Г.А. и др. 1124559 СССР. - Б. И., 1986, N25, с.277), чем рибавирин, аналогом которого он является. Строение молекулы 5-НЕМТ показано на рис.22я. В состав молекулы 5-НЕМТ входят характерные для рибавирина пятичленное кольцо триазола и кар-боксамидная группа, а также гидроксиэтоксиметильная группа, содержащаяся в молекуле ацикловира. Таким образом, это соединение является одновременно аналогом двух противовирусных агентов - рибавирина ( Prusiner Р. et el. Acta Cryst. 1976, V. B32, p.419) и ацикловира (Birnbaum G. et al. Can. J. Chem. 1984, V.62, p.2646).

Изменение места присоединения карбоксамидной группы в 5-НЕМТ по сравнению с рибавирином и ее поворот на 180° приводят к иной ориентации карбоксамидной группы относительно связи N1-N2 триазольного цикла.

Псевдогликозидная связь в молекуле 5-НЕМТ расположена асимметрично относительно триазольного цикла. Разница между экзоциклическими углами при атоме N1 составляет 13.3°. Так же как и в молекулах ацикловира, связь СГ-04' приблизительно перпендикулярна к плоскости агликона. Торсионные углы N2-N1-СГ-04' и C5-N1-C1-04' равны соответственно -76.2° и 103.0°, валентный угол 04', СГ, N1 равен 111.7°. Карбоксамидная группа образует угол 5.6° с плоскостью триазольного цикла. Взаимная ориентация связей OS-C5 и С4'-04' соответствует гош+-ротамеру в нуклеозидах (05'-С5'-С4'-04' = 73.9°). В молекуле 5-НЕМТ реализована транс-конформация относительно связи 04-С4' (СГ-04'-С4'-С5' = -167.9°). Аналогичные конформации встречаются в двух из трех кристаллографически независимых молекулах ацикловира. Конформация молекулы 5-НЕМТ дополнительно стабилизирована внутримолекулярной водородной связью СГ-Н...06.

1- (1,5-Дигидрокси-3-01ссапент-2-ил)-1,2,4-триазол-5-карбоксамкд (5-DHPT).

Молекула 5-DHPT (рис.22в) отличается от молекулы 5-НЕМТ лишь наличием гидроксиметильного заместителя при атоме СГ, но при этом 5-DHPT обладает меньшей по сравнению с 5-НЕМТ и рибавирином противовирусной активностью по отношению к вирусу простого герпеса (Кройча Ю.Г. канд. дисс. 1986, Инст. вирусологии РАМН). Псевдогликозидная связь ориентирована асимметрично относительно триазольного цикла, причем степень асимметрии значительно превышает величины, характерные для соединений с нуклеиновыми основаниями. Связь СГ-С2' приблизительно перпендикулярна к плоскости агликона, о чем свидетельствуют значения торсионных и валентных углов (N2-N1-CT-C2' )= 63.9° и (C5-Nl-Cl'-C2') = -102.1°), валентный угол CW'.CI'.NI равен 110.6°. В молекуле 5-DHPT можно выделить три плоские группировки атомов: атомы триазольного цикла, атомы карбоксамидной группы и атом CS, а также атомы СГ, С2', О2', 04'. Угол между двумя первыми плоскостями равен 20.1°, а третья плоскость фактически перпендикулярна плоскости кольца триазола (92.8°). Оставшиеся атомы C4',CS,05 лежат в плоскости, почти перпендикулярной (88.6°) к плоскости

но

гг ^

но он

Рибавирин (виразол)

МО

5-НЕМТ П И

\ Лр^-МН»

но

'Ч

Ацикловир

НО ОН

(8)-9-(2,3-дигидроксипропил) аденин ф-БНРА

5- БНРТ П м

3-НЕМТ N

НО

1 -(2-гидроксиэтоксиметил)-1,2,4-триазол-5-карбоксамид

ОН

1-(2-гидроксиэтоксиметил)-1,2,4-триазол-3-карбоксамид

1-(1,5-дигидрокси-3-оксапент-2-ил)-1,2,4-триазол-5-карбоксамид

Рис. 21. Структурные формулы рибаверина, ацикловира и исследованных ациклических аналогов.

атомов СГ,С2',02',04' и приблизительно парадельной плоскости кольца триазола (28.5°). Торсионный угол 05'-С5'-С4'-04', равный -71.8°> соответствует энергетически наиболее выгодному гош-ротамеру в нуклеозидах. Такая же конформация реализуется в молекуле 5-НЕМТ и в двух кристаллографически независимых молекулах ацикловира. В молекуле 5-DHPT, как и в 5-НЕМТ, а также в трех кристаллографически независимых молекулах ацикловира, наблюдается /л/декс-конформация относительно связи 04'-С4' (угол СГ-04'-С4'-С5 равны -165.1°). Конформация молекулы 5-DHPT стабилизирована внутримолекулярной водородной связью СР-Н"'06.

1-(2-Гидроксиэтоксиметил)-1,2,4-триазол-3-карбоксамид (3-НЕМТ). В отличие от 5-НЕМТ и 5-DHPT соединение 3-НЕМТ биологической активности не обнаруживает (Кройча Ю.Г. канд. дисс. 1986, Инст. вирусологии РАМН). По аналогии с рибавирином, в 3-НЕМТ карбоксамвдная группа присоединена к атому СЗ триазольного цикла, но, как и в 5-НЕМТ и 5-DHPT, она повернута вокруг связи СЗ-Сб-связи на 180° по сравнению с карбоксамидной группой рибавирина(рис.22г). В структуре 3-НЕМТ имеет место разупорядоченность ациклического фрагмента, в результате чего в ячейке статистически сосуществует два конформера (А и В). На рис. 22г один из конформеров (А) представлен сплошной линией, а другой (В) - штриховой. Конформеры А и В различаются между собой конформациями вокруг связей СГ-04' и С4'-С5'. Торсионные углы N1 -С 1 '-04'А-С4'А и N1-C1'-04'B-C4'B равны соответственно -67.9° и 81.8°. Взаимная ориентация связей 05-С5' и С4-04' в обоих конформерах соответствует гош-ротамерам в нуклеозидах, торсионный угол 05'-С5'-С4'-04' равен 82.4° в конформере А и -71.3° в конформере В. Связь СГ-04' приблизительно перпендикулярна к плоскости агликона. Торсионные углы C5-N1-СГ-04' и N2-N1-СГ-04' в конформере А равны 114.4° и -61.9°, в конформере В составляют 74,8° и -101.5°. В обоих конформерах наблюдается транс-конформация относительно связи 04-С4', соответствующие углы равны -179.5° (А) и -177.0° (В). Ориентация псевдогликозидной связи относительно основания более симметрична, чем в 5-НЕМТ и 5-DHPT. Разница между экзоциклическими углами при атоме N1 составляет лишь 7.3°, в то время как в 5-DHPT и рибавирине она колеблется от

II.0° до 15.4°.Триазольное кольцо и карбоксамидная группа находятся в одной плоскости. Атомы СГ, 04', С4', С5' в каждом конформере образуют плоские группировки, первая из которых, соответствующая А-конформеру, составляет с

. плоскостью триазольного цикла угол 97.1°, а вторая (В) - угол 102.8°. Угол между плоскостями, проведенными через СГ, 04', С4', С51, в отдельных конформерах равен 41.3°.

(8)-9-(2,3-Дигидроксипропил)адеиин ((S)-DHPA) является аналогом пуринового нуклеозида, в котором циклический углеводный фрагмент замещен алифатическим, сходным с частью рибозы (Крицын A.M., Хим. гетероцик. соед. 1975, N1, с.125). (S)-DHPA проявляет антивирусную активность в отношении как ДНК-, так и РНК-содержащих вирусов (герпеса, осповакцины, везикулярного стоматита, кори). Механизм его противовирусного действия пока не ясен (De Clercq Е., Holy А. /. Med. Chem. 1979, V.22, р.510). В молекуле (S)-DHPA (рис.226) псевдогликозидная связь ориентирована более симметрично относительно аденинового цикла по сравнению с аденозином и другими ациклическими соединениями. Конформация молекул (S)-DHPA такова, что все тяжелые атомы (C.N.O) молекулы сосредоточены в двух плоскостях. Первую составляют атомы пуринового цикла и атомы N6 и СГ, вторую - атомы С2', СЗ' и атомы кислорода гидроксильных групп. Угол между этими плоскостями равен 54.3°. Связь СГ-С2' так же, как и в других ациклических соединениях, приблизительно перпендикулярна к плоскости агликона, торсионные углы C8-N9-C1'-C2' и C4-N9-СГ-С2' равны -68.7° и 105.1° соответственно, а валентный угол 04', СГ, N1 равен

III.6°. Атомы кислорода гидроксильных групп находятся не в ^-положении, как обычно в нуклеозидах, а в транс, торсионный угол 02'-C2'-C3'-03' равен -172.1°.

1-(2-гидроксиэтоксиметил)-.1,2,4-триазол-5-карбоксамид (5-НЕМТ)

„'1

(Б)-9-(2,3-дигидроксипропил) аденин ( (Б)-ВНРА)

т.1

НН6 1

1,23713)^ £6 ^ 06

^N6.2 N6

Ht.IL/gtl НС2В ^Щ^ Ъ /.'/Ы?) оч'щЖ^/сч'д

■ "'С'В '¿Ж 0Н5.11

НЧ1В

!,Ч№Г$и

Н5.1А

(г)

1-(1>5-дигидрокси-3-оксапент-2-ил)-1,2,4- [ -(2-гидроксиэтоксиметил)-1,2,4-триазол-триазол-5-карбоксамид (5-ДНРТ) -3-карбоксамид (3-НЕМТ)

Рис. 22. Строение молекул ациклических аналогов 5-НЕМТ (а), (БЭ-БНРА (б), 5-ОНРТ (в) и 3-НЕМТ (г).

Рис.23. Молекулы рибавирина, ацикловира, (S)-DHPA, 5-НЕМТ, 5-DHPT и 3-НЕМТ, совмещенные по фрагментам N2-N1-C1' триа-зольных циклов и C4(C8)-N9-C1' нуклеиновых оснований.

В результате З'ОН-гидроксильная группа ориентирована приблизительно так же, как и У-ОН гщцюксил ацикловира.

Для анализа связи основных закономерностей строения исследованных ациклических соединений с их биологической активностью с помощью компьютерной графики (программа HOMOLOGY (Д.Васильев, ИМБ РАН)) нами был построен рис.23, на котором были представлены молекулы соединений 5-НЕМТ, 5-DHPT, 3-НЕМТ, (S)-DHPA, молекулы двух полиморфных форм рибавирина (Prusiner Р. et al. Acta Cryst. 1976, V. B32, p.419) и трех кристаллографически независимых молекул ацикловира (Birnbaum G. et al, Cañad. J. Chem. 1984, V.62, p.2646), совмещенные по фрагментам N1-N2-CI' триазольных циклов и C4(C8)-N9-Cr оснований. Как видно из рис.23, все конформеры противовирусных агентов ацикловира и рибавирина, а также исследованных ациклических аналогов, образуют два конформационных спектра. В первый попадают молекулы 5-НЕМТ, (S)-DHPA, конформеры 3-НЕМТ, гидроксиэтокси-фрагмент молекулы 5-DHPT, молекула второй полиморфной формы рибавирина и три кристаллографически независимые молекулы ацикловира. Во второй конформационный набор входят молекула первой полиморфной формы рибавирина и гидроксиметильный фрагмент молекулы 5-DHPT. Если принять во внимание, что именно S-, а не R-ротамер DHPA проявляет биологическую активность, то можно полагать, что первый конформационный набор и соответствует активным формам соединений.

Одним из характерных свойств всех ациклических нуклеозидных аналогов является приблизительная препендикулярность СГ-04' (С2>связей к плоскости агликона. Величины торсионных углов N2-N1-C1-04' в исследованных ациклических аналогах и во второй полиморфной форме рибавирина лежат в области высокой anmu-конформации, тогда как конформация первой полиморфной формы рибавирина вокруг псевдогликозидной связи соответствует обычной enmu-конформации.

Механизм противовирусного действия исследованных ациклических соединений различен и не выяснен.

Однако, из структурной аналогии 5-НЕМТ и ацикловира можно ожидать подобие механизмов их биологической активности. Так 5-НЕМТ, обладающий наибольшей из исследованных нами соединений антигерпесной активностью, и ацикловир, мощный селективный ингибитор, имеют одинаковые алифатические фрагменты. К тому же, в молекулах 5-НЕМТ и 5-DHPT триазольные циклы с присоединенными к ним по С5-положению карбоксамидными группами моделируют сходную с гуанином ориентацию активных групп доноров (NH2) и акцепторов (О и N) водородных связей.

Кроме того, в молекулах 5-НЕМТ и 5-DHPT взаимное расположение карбоксамидных групп и ациклических фрагментов создает стерические возможности для образования внутримолекулярных водородных связей СГ-Н---06, которые дополнительно стабилизируют взаимную ориентацию ациклических фрагментов и кольца триазола. Снижение биологической активности соединения 5-DHPT по сравнению с 5-НЕМТ может быть связано с присутствием дополнительной гидроксиметильной группы при атоме С Г, попадающего в спектр неактивных конформеров (рис. 23).

В случае соединения 3-НЕМТ отсутствие стерической возможности для образования внутримолекулярной водородной связи, а также перестановка местами в агликоне донора (NH2-rpynnbi) и акцептора (Об-атома) за счет разворота карбоксамидной группы на 180" по сравнению с рибавирином, приводят, как видно, к утрате биологической активности.

ВЫВОДЫ

I. Методом рентгеноструктурного анализа определены с высокой точностью пространственные структуры семи групп модифицированных нуклео-зидов. На основе полученных стереохимических данных установлены следующие структурно-функциональные взаимосвязи.

1. Для конформационно подвижных модифицированных нуклеозидов выявить однозначно активную по отношению к ДНК-полимеразам конформацию субстрата практически невозможно . Сохранение характерной для природных нуклеозидов конформационной подвижности в молекулах сЙТ(З'Ыэ) , ddT(3rNH2), ddT(3'N02) и ddT(3-NOH) позволяет их У-трифосфатам приобретать конформацию, необходимую для связывания с ДНК-полимеразами, и , по-видимому, является одним из факторов, обусловливающих биологическую активность этих соединений. В то же время, конформационные ограничения в случае соединений dT(3'Me) и ddT(3'(S)Me,F) приводят к потере активности. Высокая специфичность ddT(3'N3) при подавлении ВИЧ может быть обусловлена стереоэлек-тронными свойствами и ориентацией объемной азидной группы. Понижение же сродства к ДНК-полимеразам, сопровождающееся повышением субстратной специфичности к обратным транскриптазам у трифосфатов ddT(3'NHMe) и ddT(3'=NOMe) по сравнению с ddT(3'NH2) и ddT(3'=NOH), по-видимому, связано с присутствием в заместителях дополнительных метальных групп и увеличением общего объема заместителей.

2. Напротив, для нуклеозидов с конформационно ограниченными гли-конами можно с высокой степенью вероятности предсказать их потенциальную активность. Если гликон имеет уплощенную структуру, подобную наблюдаемым в соединениях diN и raN, то их 5*-трифосфаты, как правило, являются субстратами для ряда ДНК-полимераз и, в первую очередь, для обратных транскриптаз ретровирусов. По-видимому, плоскостное строение гликона в структурах d<N и raN моделирует промежуточное состояние углеводных циклов субстратов в активных центрах ДНК-полимераз.

При этом следует иметь в виду, что дополнительные модификации путем введения заместителей не должны препятствовать взаимодействию модифицированных нуклеозидов в реакциях фосфорилирования и полимеризации, как это имеет место в случае соединений raN(4'CH20H), laN(4'C№OH) и <Ш(4'С№ОН).

3. На примере структур cUT, гаА и 1аТ объяснена более низкая субстратная стереоспецифичность обратных транскриптаз по сравнению с ДНК-полимеразами человека. Для фуранозных циклов субстратов в комплексах с обратными транскриптазами допускается набор конформаций от плоских до конформаций конверта со значительным выходом (~ 0.3-0.4 А) атомов 04' в эидо-положение.

4. Конформационные ограничения модифицированных нуклеозидов, при которых углеводный цикл неплоский и его конформация не совпадает с конформацией активного субстрата, практически исключают взаимодействие 5-трифосфатов этих нуклеозидов с ДНК-синтезирующими комплексами. Поэтому, несмотря на наличие у ddT(3'Me) всех функциональных групп, необходимых для участия в биосинтезе ДНК, это соединение не обладает антивирусной активностью, и его 5'-трифосфат не взаимодействует с ДНК-полимеразами.

Для РНК-полимераз из E.coli стереохимические требования к конформациям активных субстратов, по-видимому, отличаются от требований для ДНК-полимераз^и поэтому конформационно ограниченные З'-метильные аналоги рибонуклеозидов узнаются РНК-полимеразами и проявляют свойства терминаторных субстратов.

5. Изучено влияние на конформацию молекул пиримидиновых нуклеозидов введения метальных заместителей по 2', 3' и 5' -положениям. Показано, что введение .метальных групп вместо протонов в 5-положение, а также гидроксиметильной группы в 1'-положение фуранозных циклов пиримидиновых нуклеозидов принципиальных хонформационных изменений в их молекулах не вызывает. Замена протонов на метальные группы в 2'- и 3'- положениях фуранозных циклов нуклеозидов приводит к существенному уменьшению конформационной подвижности молекул и сдвигу конформаций фуранозных циклов в этих соединениях в N- и S- популяции соответственно. При этом основные конформационные параметры молекул пиримидиновых 3'-метилнуклеозидов не зависят от природы сахара и основания.

Во всех соединениях с метальными заместителями обнаружено увеличение длин связей С'-ОН при метилированных атомах углерода в углеводных остатках, что коррелирует с уменьшением реакционной способности З'-гидроксильных групп в реакциях нуклеофильного замещения в условиях основного катализа.

II. Полученный обширный структурный материал внесен в Международный Кристаллографический Банк Данных (Кембридж, Великобритания) и служит базой структурной информации, позволяющей уточнить принципы целенаправленного синтеза новых нуклеозидов, селективно подавляющих репродукцию вирусов, включая ВИЧ, а также может быть использован в исследованиях стереохимических аспектов строения и функционирования многих ферментов метаболизма нуклеиновых кислот, в том числе различных ДНК- и РНК-полимераз, ферментов фосфорилирования, и в других фундаментальных и прикладных исследованиях в области молекулярной биологии, химии и медицины.

СПИСОК работ, опубликованных по теме диссертации

1. Gurskaya G.V., Zhdanov А.А., Mikhailov S.N.; Tzapkina E.N. II X-RAY CRY-1 STALLOGRAPHIC STUDIES OF NUCLEOSIDE ANALOGS. I. The Crystal Struc-

ture of l-(6-Deoxy-D-allofuranosyl)cytosine // Crystal Structure Commun. 1982. V.l 1. N4. P. 1245-1252.

2. Gurskaya G.V.,Javadova G.M., Mikhailov S.N. // X-RAY CRYSTALLOGRAPHY STUDIES OF NUCLEOSIDE ANALOGS. II.The Crystal Structure of l-(3'-C-Methyl-p-D-ribofurajiosyl)cytosine // Crysral Structure Communications. 1982. V.U. N4. P. 1253-1258.

3. Gurskaya G.V., Javadova G.M., Mikhailov S.N. // X-RAY CRYSTALLOGRAPHY STUDIES OF NUCLEOSIDE ANALOGS. III. The Crystal Structure of l-(2'-3-D-psicofuranosyl)cytosine Dihydrate // Crysral Structure Communications. 1982. V.ll. N4. P. 1259-1264.

4. Mikhailov S.N., Beigelman L.N., Gurskaya G.Y., Padyukova N.Sh., Yakovlev G.I., Karpeisky M.Ya. // Synthesis and Properties of З'-C-Methylnucleosides and their Phosphoric Esters//CarbohydrateResearch. 1983. V.l24. P.75-96.

5. Гурская Г.В., Джавадова Г.М., Цапкина E.T., Цилевич Т.Д., Завгородний С.Г., Флорентьев b.ji. // Рентгенографическое исследование молекулярной структуры 6,1'-ангидро-6-окси-1-(2-Р-0-псикофуранозил)цитозина // Докл. АН СССР. 1983. Т.273. С.340-343.

6. Гурская Г.В., Джавадова Г.М., Васильев Д.Г., Цилевич Т.Д., Завгородний С.Г., Флорентьев В.Л. // Рентгеноструктурное исследование противовирусного агента (8)-9-(2,3-диоксипропил)аденина//Биоорган, химия. 1984.T.10.N 10. С. 1414-1420.

7. Гурская Г.В.,Цапкина Е.Н., Скапцова Н.В., Краевский А.А., Линдеман С.В., Стручков Ю.Т. // Рентгеноструктурное исследование специфического ингибитора обратной транскриптазы - 3'-азидо-2\3'-дидезокситимидина // Докл. АН СССР. Т.291. N4. С.854-859. .

8. Beigelman L.N., Ermolinsky B.S.,Gurskaya G.V., Tsapkina E.N., Karpeisky M.Ya., Mikhailov S.N. // New Syntheses of 2'-C-Methylnucleosides Starting from D-Glucose and D-Ribose//Carbohydrate Res. 1987. V.166. P.219-232.

9. Гурская Г.В., Джавадова Г.М., Завгородний С.Г., Флорентьев В.Л., Готтих Б.П. // Рентгенографическое исследование ангидронуклеозидов. I. Молекулярная и кристаллическая структура 6,Г-ангидро-6-гидрокси-1-(2-Р-0-псикофуранозил) ци-тозина // Биоорган, химия. 1987. Т.13. N 10. С. 1382-1387.

10. Гурская Г.В., Джавадова Г.М., Соболев А.Н., Черникова Н.Ю., Завгородний С.Г., Флорентьев В.Л., Готтих Б.П. // Рентгенографическое исследование ангидронуклеозидов. II. Молекулярная и кристаллическая структура 8,Г-ангидро-8-гидрокси-9-(2-Р-0-псикофуранозил)аденина // Биоорган, химия. 1987. Т.13. N10. С. 1388-1398.

11. Гурская Г.В., Цапкина Е.Н., Линдеман С.В., Стручков Ю.Т., Краевский А.А. // Рентгеноструктурное исследование 3'-амино-2',3'-дидезокситимидина хлор-гидрата - терминаторного субстрата ДНК-лолимераз // Докл. АН СССР. 1988. Т.303, N6. С. 1378-1382.

12. Джавадова Г.М., Гурская Г.В., Горелик Е.Ш.-Б., Михайлов С.Н.// Молекулярные и кристаллические структуры 1-(6-дезокси-Р-0-аллофура-нозил)цитозина и 1-(6-дезокси-а^-талофуранозил) цитозина // Кристаллография. 1988. Т.ЗЗ. N6. С.1408-1414.

13. Цапкина Е.Н., Джавадова Г.М., Гурская Г.В., Бейгельман Л.Н. Михайлов С.Н., Линдеман С.В. //Молекулярная и кристаллическая структура 1-(2-С-метил-р-0-рибофуранозил)урацила // Кристаллография. 1988. Т.ЗЗ, N6. С. 1415-1420.

14. Цапкина Е.Н., Гурская Г.В., Цилевич Т.П., Завгородний С.Г., Готтих Б.П., Флорентьев В.Л.//Структура и противовирусная активность аналогов рибавирина. 1. Молекулярная и кристаллическая структура 1-(2-гидрокси-этоксиметил)-1,2,4-триазол-5-карбоксамида//Биоорган, химия. 1988. Т.14. N8. С.1086-1091.

15. Цапкина Е.Н., Гурская Г.В., Завгородний С.Г., Линдеман С.В., Стручков Ю.Т., Флорентьев В.Л. // Структура и противовирусная активность аналогов

рибавирина. 2. Молекулярная и кристаллическая структура 1-(1,5-дигидрокси-3-оксапент-2-ил)-1,2,4-триазол-5-карбоксамида //Биоорган, химия. 1988. Т.Н. N 8. С. 1092-1097.

16. Цапкина E.H., Гурская Г.В., Цилевич Т.Л., Линдеман С.В., Стручков Ю.Т., Флорентьев В.Л. // Структура и противовирусная активность аналогов рибавирина. 3. Молекулярная и кристаллическая структура 1-(2-гидрокси-этоксиметил)-1,2,4-триазол-З-карбоксамида//Биоорган, химия. 1988. Т. 14. N8. С. 1098-1102.

17. Beigelman L.N., Gurskaya G.V., Tsapkina E.N., Mikhailov S.N.//Epimerization During the Acetolysis of 3-0-Acetyl-5-0-benzoyl-l,2-0-isopropylidene-3-C-methyl-a-D-ribofuranose. Synthesis of З'-C-Methylnucleosides with the ß-D-Ribo- and a-D-Arabino Configurations //Carbohyd. Res. 1988. V.181. P.77-88.

18. Джавадова Г.М., Гурская Г.В., Падюкова Н.Ш., Михайлов С.Н. //Молекулярная и кристаллическая структура 1-(2,6-дидезокси-а-Ь-ликсогексофура-нозил)-тимина (У-С-метилтимидина) //Биоорган, химия. 1989. Т.15, N 7. C.976-98I.

19. Gurskaya G.V., Bochkarev A.V., Zdanov A.S., Papchikhin A.V., Purygin P.P., Krayevsky A.A. // X-ray Analysis of 2',3'- Lyxoanhydro Thymidine, a Confor-mationally Restricted Inhibitor of Retroviral Reverse Transcriptases // FEBS Lett.

1990. V. 265. P.63-66.

20. Гурская Г.В., Бочкарев A.B., Жданов A.A., Папчихин A.B., Краевский A.A. II Рентгеноструктурное исследование 2',3'- ликсоангидротимидина, конфор-мационно ограниченного ингибитора обратных транскриптаз ретровирусов // Докл. АН СССР. 1990. Т.312. N1. С. 123-126.

21. Бочкарев A.B., Гурская Г.В., Жданов A.C., Казьмина Э.М., Федоров И.И.

// Молекулярная и кристаллическая структура 1-(3'-С-метил-2'- дезоксифурано-зил)тимина // Биоорган, химия. 1991. Т. 17. N 8. С. 1094-1100.

22. Гурская Г.В., Бочкарев A.B., Жданов A.C., Дяткина Н.Б., Краевский A.A.

// Рентгеноструктурное исследование 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидина -терминаторного субстрата ДНК-полимераз с ограниченной конформационной подвижностью//Молекуляр. биология. 1991. Т.25. N2. С.483-491.

23. Гурская Г.В., Бочкарев A.B., Жданов A.C., Папчихин A.B., Пурыгин П.П., Краевский A.A. // Рентгеноструктурное исследование 2',3'-рибоангидроаденозина - конформационно ограниченного терминаторного субстрата ДНК-полимераз // Докл. АН СССР. 1991. Т.316. N 6. С.1401-1405.

24. Gurskaya G.V., Bochkarev A.V., Zdanov A.S., Dyatkina N.B., Krayevsky A.A.

// X-Ray Crystallographic Study of 2',3'-Dideoxy-2',3,-didehydrothyniidine, Conforma-tionally Restricted Termination Substrate of DNA Polymerases // Int. J. Pur. Руг. Res.

1991. V.2. 1. P.55-60.

25. Zavgorodny S., Pokrovskaya M., Gurskaya G., LonnbergH., AzhayevA.

// 1-Alkylthioalkylation of Nucleoside Hydroxyl Functions and Its Synthetic Applications: A New Versatile Method in Nucleoside Chemistry II Tetrahedron Letters. 1991. V.32. No 51. P.7593-7596.

26. Koole L., Neidle S., Crawfold M., Krayevsky A., Gurskaya G., Sandstrom A., Wu J.C., Tong W., Chattopadyaya J. // Comparative Structural Studies of [3.1.0]-Fused 2',3'-Modified ß-D-Nucleosides by X-Ray Crystallography, NMR Spectroscopy, and Molecular Mechanics Calculations//J. Org. Chem. 1991. 56. No 24. P.6884-6892.

27. Бочкарев A.B., Ясько M.B., Жданов A.C., Федоров И.И., Гурская Г.В.

// Молекулярная и кристаллическая структура 3'-метиламино-2',3'-дезокси-рибозилтимидина - потенциального ингибитора ВИЧ // Биоорган, химия. 1992. Т. 18. N7. С. 996-1001.

28. Fedorov I.I. , Kasmina Е.М., Novikova N.A., Gurskaya G.V., Bochkarev A.V., Krayevsky A.A. et all. // 3'-Branched-2'-deoxy-5-methyluridines: Synthesis, Enzyme Inhibition, and Antiviral Properties // J. Med. Chem. 1992. V.35. N 24. P. 4567-4575.

29. Gurskaya G., Bochkarev A., Zdanov A., Papchikhin A., Krayevsky A.. II Structural Features 2\3'-Riboanhydroadenosine, a Conformational^ Restricted

Termination Substrate of DNA Polymerases // Nucleosides and Nucleotides. 1992. V.ll. N1. P. 1-9.

30. Федоров И.И., Казмина Э.М., Новикова H.A., Гурская Г.В., Бочкарев А.В., Ясько М.В., Викторова JI.C., Куханова М.К., Краевский А.А., Бапьзарини Я., Де Клерк Э. // Синтез, структура и некоторые биохимические свойства З'-разветвленных тимидинов и их У-фосфатных производных // Хим. фарм. ж. 1992. Т.26. N5. С. 14-23.

31. Ефимцева Е.В., Михайлов С.Н., Мешков С.В., Бочкарев А.В., Гурская Г.В.

II Диоксолановые производные З'-дезокситимидина // Биоорган, химия. 1993. Т. 19. N1. С.103-112.

32. Бочкарев А.В., Ефимцева Е.В., Михайлов С.Н., Гурская Г.В. // Рент-геноструктурное исследование новых диоксолановых производных 2',3-диде-зоксинуклеозидов // Кристаллография. 1994. Т. 39. N4. С.635-640.

33. Shutalev A.D., Mikerin I.E., Aishava B.M., Nikitenko A.A., Raifeld Yu.E., Ya Vid G., Lee V.J., Gurskaya G.V., Viktorova L.S., Semisarov D.G., Zavodnik V.E.

// Synthesis and Crystal Structure of 3'-Fluoro-3'-methyl-2',3'-dideoxythymidine.Inhibi-tory Properties of 3l-Fluoro-3'-methyl-2,,3,-dideoxythymidine-5-triphosphate in the Synthesis of DNA in Cell-free Media // Bioorg. Med. Chem. Lett.. 1994. V.4. N5. P.761-768.

34. Островский B.A., Студенцов Е.П., Поплавский B.C., Иванова H.B., Гурская Г.В., Заводник В.Е., Ясько М.В., Семизаров Д.Г. II 3'-(Тетразол-2"-ил)-3'-дидезокситимидин) и его 5"-замещенные: синтез и конформация в кристаллическом состоянии. Субстратные свойства 3'-(тетразол-2"-ил)-3'-дезокситимидин-5'-трифосфата по отношению к ДНК-полимеразам // Био-орган.химия. 1995. Т.21. N1. С. 49-54.

35. Jasko М., Fedorov I., Atrazhev A.M., Moz2herin D.Yu., Novicov N.A., Bochkarev A.Y., Gurskaya G.V., Krayevsky A.A. // Synthesis, Molecular and Crystal Structure of 3'-N-Alkylamino-3'-Deoxythymidines and Some Biochemical Properties of Their Phosphorous Esters//Nucleosides and Nucleotides. 1995. V.14. N1-2. P.23-37.

36. Бочкарев А.И., Завгородний С.Г., Жданов A.C., Гурская Г.В. // Рент-геноструктурное исследование З'-О-метилтиометилтимидина и З'-О-метилсуль-финилметилтимидина - потенциальных ингибиторов ВИЧ И Биоорган, химия. 1995. Т.21. N3. С.206-211.

37. Кузнецова Е.В., Куханова М.К., Гурская Г.В., Федоров И.И., Ясько М.В., Чатопаддайа Д., Краевский А.А. // Конформация 3'-нитро-2',3'-дидезокси-тимидина в кристалле и свойства его У-трифосфата как терминаторного субстрата обратных транскриптаз ретровирусов // Молекуляр. биология. 1995. Т.29. N2. С. 407-414.

Тир. 100

ШЛ "¿гоыполиграфсервис"

Зак. 491

Информация о работе

Гурская, Галина Викторовна
доктора химических наук
Москва, 1995
ВАК 03.00.03

Автореферат

Похожие работы