Гидратация и структурные переходы нуклеиновых кислот в конденсированном состоянии

Семенов, Михаил Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гидратация и структурные переходы нуклеиновых кислот в конденсированном состоянии
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Гидратация и структурные переходы нуклеиновых кислот в конденсированном состоянии"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ .

На правам рукописи

СЕМЕНОВ Михаил Алексеевич

УДК 577.323.425

ГИДРАТАЦИЯ И'СТРУКТУРНЫЕ ПЕРЕХОДЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В КОНДЕНСИРОВАННОМ СОСТОЯНИИ

(03.00.02 - биофизика"»

АВТОРЕФЕРАТ,

диссерта-ции на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва - 1989

Работа выполнена в Институте, радиофизики и,электроники АН УССР

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

ведущий научный сотрудник ШБ АН СССР В.И.Иванов

доктор физико-математических наук, профессор Г.М.Мревлитвили

доктор физико-математических наук, ведущий научный сотрудник ИБФ АН СССР Ю.А.Лазарев

Ведущая организация - Физико-технический институт низких

температур АН УССР.

Защита состоится " " _ 19 г. в ___ часов

на заседании социализированного совета Д.053.05.53 по биофизике при МГУ по адресу:' 119899 ГСП, Москва, Ленинские горы, .МГУ, биологический факультет, аудитория _

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета ИГУ.

Автореферат разослан "

19 г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук

Т.Е.Кренделева

ОЫДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема гидратации нуклеиновых кислот а последние десять лет приобрела особую актуальность в молекулярной биофизике, поскольку стало очевидным, что без знания детальных механизмов взаимодействия биомакромолекул с их гвдрат-но-ионным окружением нельзя понять физико-химические закономерности, определяющие свойства и функционирование биополимеров. В^ связи с этим в настоящее время проводятся интенсивные экспериментальные и теоретические исследования такого взаимодействия для нуклеиновых кислот разного уровня организации с целью выявления влияния растворителя Своды) и ионов на структуру, стабильность, структурные переходы и конформационную подвижность ДНК, РНК, по-линухлеотидов и других биополимеров нуклеиновой природы.

В последние годы методами структурного анализа достигнуты определенные успехи в исследовании расположения воды и противо-ионов вблизи олигомерных молекул нуклеиновых кислот. Однако, имеющиеся экспериментальные данные и результаты теоретического рассмотрения пока еще недостаточны для понимания полной картины взаимодействия полимерных нуклеиновых кислот с водой, ионами, лигандами, а также механизмов их влияния на структурные переходы, стабильность и подвижность ДНК. Успешное решение этих вопросов, связанных с проблемой гидратации, во многом определяется разработкой весьма чувствительных физических экспериментальных мето-дэь, позволяющих выявить тонкие эффекты взаимодействия воды с биомолекулами.

аерспективным в этом плане является сочетание нескольких экспериментальных методов - инфракрасной спектроскопии, пьезограви-метрии, микрокалориметрии, диэлектрометрии, а также теоретических расчетов. Применение такого комбинированного подхода дает возможность охарактеризовать структурные и термодинамические свойства конденсированного состояния нуклеиновых кислот, физическое состояние растворителя, учесть вклад воды в стабильность биомолекул. Кроме того, обнаружение и характеристика особенностей структурных периодов нуклеиновых кислот с малым содержанием воды в присутствии лигандэв (БАБ, белков) позволяет связать эти переходы с ¿функциональными особенностями биополимеров и выяснить молекулярные механизмы взаимодействия.

• Цель и задачи исследования. Содержание настоящей работы эк-

спериментальное исследование связи спектроскопических и термодинамических свойств нуклеиновых кислот различного уровня организации с их структурой и гидратацией в широком интервале температур (100-400°К) с целью выяснения структуры и энергетики гидратного окружения ДНК.

В задачу работы входило:

1. Разработка комплексного подхода исследования пленок нуклеиновых кислот, включаицего: а) создание прецизионного метода (кварцевого резонатора) получения изотерм гидратации НК при различных температурах; б) разработка методик выращивания пленок нуклеотидов, полинуклеотидов, ДНК и комплексов ДНК с лигандами; в) получение ИК-спектров пленок в области поглощения азотистых оснований, сакаро-фосфатных групп и сорбированной воды в широком диапазоне температур (100-400°Ю и относительных влажностей.

2. ИК-спектроскопическое исследование гидратации и структурного состояния нуклеотидов, полинуклеотидов, ДНК и эе комплексов с БАВ и белками.

3. Теоретическое обоснование спектроскопического проявления гидратации и структурных переходов нуклеотидов и полинуклеотидов на основании квантово-химических расчетов и использования представлений молекулярной теории якситонов.

4. Определение структурного состояния нуклеиновых кислот различного уровня организации при конформационныт переходах,

а также центров гидратации и степени их заполнения молекулами воды.

5. Получение термодинамических параметров гидратации нуклеотидов, полинуклеотидов и ДНК с помощью изотерм гидратации и модельных представлений о процессе адсорбции воды, ИК-спек-троскопических данных о поведении Н-связей и микрокалориметрических измерений теплот десорбции.

6. Определение энергетики гидратации двухспиральннх полинуклеотидов и ДНК.

'7. Детальная характеристика гидратации нуклеиновых кислот и выяснение молекулярных механизмов взаимодействия молекул растворителя с их.конкретными структурами. Оценка вклада воды в стабилизацию спиральных структур нуклеиновых кислот.

8. Определение состояния воды в гидратной оболочке ДЧК и анализ динамики ее структурных переходов.

9. Выяснение возможностей практического использована предло-

женного комплексного подхода изучения нуклеиновых кислот и их комплексов с биологически активными веществами и белками в конденсированном состоянии.

Научное значение и новизна. В работе впервые

- получены спектры увлажненных мононуклеотидов. Обнаруженные высокочастотные сдвиги и ИК-птохромизм связаны с образованием "стопок" азотистых оснований;

- показано, что в водном растворе энергетически выгоднее формирование гидратных комплексов азотистых оснований, чем водсродно-связанных уотсон-криковских пар;

- с помощь« определенных спектральных параметров полос поглощения азотистых оснований расшифрована тонкая структура и выполнено корректное отнесение коьтонент карбонильного поглощения для большой группы одно-и двухспиральных полинуклезткдов и в некоторых случаях уточнены детали их структуры;

- получены изотермы гидратации и определены степени гидратации клубкових и спиральных форм полинуклеотидов. На основании этих данных и анализа спектроскопических свойств сорбированной воды определены термодинамические параметры гидратации и оценен вклад гидратной оболочки в стабилизацию Л—ДНК;

- на основании квантово-химичееких- расчетов электронной плотности нуклеотидов качественно объяснена природа обнаруженных- низкочастотных сдвигов и эффект возрастания ин-тенсивностеЯ ЯК-полос поглощения нуклеиновых кислот при низкой степени их гидратации;

- анализ статистико-механических моделей изотерм гидратации, спектральных параметров полос поглощения азотистых оснований, сах&ро-фосфатного остова и сорбированной воды дал возможность выявить значительные различия по энергии связывания молекул воды в гидратноП оболочке ДНК. Знание энергетики гидратации ДНК позволило оценить вклад молекул воды в стабилмозЬш ее В-£ормы;

-показана реяаотая роль воды г динамике структурных переводов ДНК {?;;!;£. Р-»А-форма, А—»5« £орма), а также установить, что теплосая денгтурация ДНК сопровождается двустадийным разрушекл-;м се гкдратной оболочки. В совокупности все эти данные пег золили пл-новсму взглянуть на процессы "гидрата-

ционных" и тепловых структурных переходов ДНК в конденсированном состоянии и существенно уточнить их молекулярный механизм;

- разработанный подход был применен для изучения влияния гидратации на комплексообразование нуклеиновых кислот с БАВ и белками в конденсированном состоянии.

Практическая ценность. Практическая значимость научных результатов заключается в том, что выявлены основные закономерности гидратации, влияния температуры и др. внешних факторов на структуру и стабильность нуклеиновых кислот разного уровня организации в конденсированном состоянии. Это позволило углубить существующие представления о стабилизирующей роли воды в построении спиральных структур природных нуклеиновых кислот и создать предпосылки для целенаправленного воздействия на структуру и функции ДНК.

Результаты настоящей работы могут быть применены в различных областях биологии, медицин" и химии. Прежде всего они представляют интерес для фармакологии и криобиологии при расшифровке молекулярных механизмов повреждения органов и тканей при воздействии низких температур и биологически активных веществ. Исследование белково-нуклеинэвых комплексов позволяет выработать научные рекомендации для выбора оптимальных технологических условий крио-консервации и хранения генома. Некоторые технические разработки могут бьггь использованы в других научно-исследовательских учреждениях АН СССР.

Публикации. Основные результаты диссертации представлены в 59 печатных работах, включающих 18 статей в отечественных изданиях и 7 статей в международных журналах.

Апробация. Основные результаты работы обсуждались на 1У Международном биофизическом конгрессе (Москва, Т972), на 1ой , П-ой, Ш-ей, 1У-ой, У-ой и У1 Всесоюзных конференциях пз спектроскопии биополимеров (Харьков, 1971,1974, 1977,Т981, 1984, 1988), на 1У-ом и У1-ом Всесоюзных совещаниях по конформационныы изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1975,1985), на Всесоюзной конференции по механизмам радиационного поражения и восстановления нуклеиновых кислот (Пущино,1980), на Международном симпозиуме по биофизике нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов (Таллин, 1981), на У1 Республиканской школе-семинаре по спектроскопии молекул и

кристаллов (Чернигов, 1983), на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), на рабочем,совещании по гидратации биологических соединений (Пущино,1983), на Международном симпозиуме по (физико-химическим свойствам биополимеров в растворе и клетках (Пущино, 1985), на-Международннх конференциях по квантовой химии, биологии и фармакологии (Будапешт, 1986, Загреб 1988)., на ХУШ и XIX Европейски» конгрессах по молекулярной спектроскопии ЧАмстердам, 1987, Дрезден,'1989), на Ш симпозиуме по равновесной динамике и структуре биополимеров (Пущино, 1987), на Международном симпозиуме по гидратации биополимеров (Пущино, 1988), на Международном симпозиуме по физико-химии ДНК и молекулярным механизмам функционирования генома (Тбилиси, 1987), на Международной конференции "Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины" (Харьков,1988).

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения,б глав, приложения к 17 главе, выводов и списка литературы. Во введении сформулирована научная проблема и обосновывается актуальность исследования, перечислены основные задачи работы, указана новизна и ценность работы, даны сведения об апробации работы. 1-ая глава содержит обзор литературы, где анализируется современное состояние исследований гидратации, структуры нуклеиновых кислот и физических факторов,определяющих их стабильность, указываются нерешенные вопросы и обосновывается постановка задачи. Во Пюй главе дано описание возможностей основных методов исследования и материалов, указано программное обеспечение численной обработки экспериментальных результатов и теоретических расчетов. В 111-ей главе приведены данные о гидратации нуклеоти-дов, полученные на основании ИК-спектроскопических данных и диэлектрических измерений. В 1У-ой главе изучены особенности гидратации полирибонуклеотидов, рассмотрено поэтапное образование одно- и двухспиральных структур в процессе гидратации полшуклеотидов, дано теоретическое описание связи тонкой структуры полосы карбонильного поглощений с конформацией нуклеиновых кислот. В У-ой главе рассмотрено поэтапное формирование А - и В-форм ДНК и ее.гвдратной оболочки в конденсированном состоянии в процессе гидратации,приведены результаты определе-. ння энергетических параметров гидратации ДНК и оценен вклад воды и других факторов в стабилизацию спиральной структуры. В

. 5 '

У1-ой главе проанализировано влияние внешних факторов на гидратацию и структурные переходы ДНК.

• На защиту выносятся:

1. Развитие комбинированного подхода, включающего .методы ИК-спектроскопии, пьезогравиметрии и в некоторых случаях микрокалориметрии в приложении к изучению гидратации нуклеиновых кислот разного уровня организации и их комплексов с БАВ и белкакя в конденсированном состоянии.

2. Данные ИК-спектроскопического исследования гидратации нуклеотидов в аморфном и кристаллическом состояниях, а таюке результаты квантовохимических расчетов влияния гидратации и про-тивоионов на распределение электронной плотности и порядков связей на азотистых основаниях исахаро-фосфатных группах нуклеотидов. I

3. Вывод об энергетической предпочтительности образования в водаых растворах гидратных комплексов азотистых оснований по сравнению с уотсон-криковскими парами.

4. Результаты ИК-спектроскопического и пьезогравиметричзско-го исследования гидратации и обнаруженных структурных переходов полинуклеотидов во влажных пленках; а также полученные на основании расчета резонансных частот результаты расшифровки тонкой структуры полос поглощения внутри- и внекольцевых колебаний азотистых оснований и деталей структуры некоторых полинуклеотидов.

5. "Контурный" метод расчета вторичной структуры транспортных РЖ и углов поворота азотистых оснований в спиральных участках на основе анализа абсолютных интенсивностей полос поглощения карбонильных колебаний и их' резонансных частот.

6. Метод расчета энтальпийного вклада молекул воды, стэкинг-взаимодействия и Н-связей в стабилизацию спиральной структуры полинуклеотида.

7. Результаты расчета энергий гидратации азотистых оснований и сахаро-фосфатных групп полинуклеотидов на основании получении* пьезогравиметрических изотерм и Д'Арси-Ваттовской модели адсорбции.

8. Результаты исследования температурной зависимости гидратации и структуры ДНК во влажных пленках; вывод о том, что разрушение верхних слоев гидратной оболочки, примыкающих к сахаро-Фосфат-ноцу остову,происходит в рамках двойной спирали ДНК, которая разрушается при более высоких температурах вместе с нижними слоями

гидратной оболочки.

9. Вывод об одновременной гидратации при низких относительных влажностях азотистых оснований и сахаро-фосфатного остова ДНК.

10. Динамика молекулярного механизма структурных переходов ДНК при гидратации в конденсированном состоянии.

11. Вывод о существенном вкладе молекул воды в стабилизация спиральной структуры ДНК.

12. Результаты ИК-спектроскопического и пьезогравиметрическо-го изучения влияния воды на комплексообразование ДНК-этидий бромид, ДНК-кофеин и ДНК-белок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. Проблема гццратации и современные представления о взаимодействиях, стабилизирующих структуру нуклеиновых кислот

В параграфах 1.1 и 1.2 на основании литературных данных рассматриваются структуры трех правоспиральных (А,В и Н) и левоспи-ральной ( 2 ) ДНК и РНК и факторы, определяющие условия их существования и переходы между ними. Сделан вывод о том, что полиморфизм ДНК определяется как окружением (вода, ионы, спирт), так и внутренними факторами (нуклеотидный состав, последовательность -оснований), причем во всех случаях существования той или иной формы нуклеиновых кисло? и переходов между ними необходима вода. Подробно по даннш рентгеновской дифракции рассмотрена структура гидратно-ионных оболочек А- и В-форм ДНК и выяснено, что характер встраивания молекул воды и ионов в структуру ДНК может быть одним из факторов стабилизации ее спиральной структуры. Однако в настоящее время физические свойства гидратно-ионкых оболочек изучены недостаточно, особенно энергетические параметры гидратации нуклеиновые кислот. Указано, что перспективным подходом исследования является сочетание таких физических методов, как ИК-спек-троскопия, пьезогравиметрия и микрокалоркметрия, что позволяет на любой этапе гидратации уст&ЧЕтшивать структурное состояние растворителя и нуклеиновой кислоты, а такие изучать энергетические параметры.гидратации.

В параграфах 1.3 и 1.4. рассмотрены -молекулярно-динамичес-кие аспекты системы ДНК-вода-противоионы и проблема стабильности зтой системы несвязанная с ней проблема структурных переходов ,ДНК б конденсированном состоянии. Обсувдаэтся экспериментальные . ' ' • 7

(РСА.ЯМР) и теоретические (методы Монте-Карло и молекулярной динамики) работы по изучение подвижности элементов структуры нукле- а иновых кислот, что позволяет "главной молекуле" - ДИК (Франк- Ка-менецкий,1988) отправлять основные биологические фикции и считать, что она "живет и дышит" (Сперсер, 1979). Отмечено, что ДНК в конденсированном состоянии и ее ионгидратная оболочка представляют собой взаимосвязанную динамическую систему; изменение одного из ее элементов немедленно приводит к изменению состояния системы в целом. Однако динамические ' параметры гидратной оболочки изучены слабо, особенно недостаточно выяснена роль воды и состояние гидратного окружения при переходе ДНК из одного структурного состояния в другое. Сделан вывод о том, что недостаточный объем экспериментальной информации тормозит развитие теоретических модельных представлений о.структурных переходах нуклеиновых кислот в'конденсированном состоянии.

Параграф 1.5 содержит обзор литературы по комплексам нуклеиновых кислот с БАВ и белками. Основное внимание уделено сравнительному анализу взаимодействия фармакологических веществ и белков. Обсуждаются модели встраивания лигандов'. в структуру нуклеи- • новых кислот и выясняется, какую структурную функцию при этом выполняет вода.

В конце главы дана постановка задачи работы и обобщены нерешенные вопросы. Указано, что успешное решение задач возможно при с гетании различных физических методов., (ИК-спектроскопия, пьезогра-виметрия, микрокалориметрия) и теоретических подходов, при исследовании гедратации нуклеиновых кислот.

Глава П. Методы исследований и материалы

В главе кратко рассмотрена теория колебаний многоатомных молекул и физические особенности метода пьезогравиметрии, основанного на использовании кварцевого резонатора, для получения изотерм гидратации макромолекул биологического происхождения.

Колебательный спектр полимерных нуклеиновых кйслот довольно сложный и надежность его интерпретации основывается на характеристичности колебаний и теоретических расчетах частот при решении колебательной задачи азотистых оснований (Шиманоучи, Тзубои,1973) и сахаро-фосфатного остова ДНК в А и В-формах (Пятиколос, 1971, Проховск^й с соавт, 1977). Для некоторых частот колебаний атомов установлены корреляции с типом спиральной структуры нуклеиновых

8 •

кислот. Подчеркнуто, что колебательный спектр обладает высокой чувствительностью к внутри- и межмолекулярным взаимодействиям, тем не менее тонкая структура полос поглощения в настоящее время почти не расшифрована. Обсуждаются возможности ИК-спектроскопии -для получения сведений о гидратации и структуре нуклеиновых кислот в конденсированном состоянии. Такая информация может быть получена в отличие от РСА при различном содержании поды в пленках. Однако при этом возникают трудности учета'различных межмолекулярных взаимодействий и эффекта светового поля в конденсированных средах. Развиваемые представления в спектроскопии межмолекулярных взаимодействий (Бахшиев, 1972) могут быть использованы для относительно малых молекул, для которых известны многие молекулярные характеристики. В то же время для таких многоатомных молекул, как нуклеотиды,не говоря уже о полинуклеотидах, сделать корректные оценки влияния вандерваальсовых взаимодействий среды на спектральные параметры молекулы в настоящее время не представляйся возможным. Чтобы в значительной степени ослабить действие межмолекулярных сил, спектральные параметры ИК-спектров получают при исследовании отдельных компонент нуклеотидов в неполярных жидкостях.

Проведено описание пьезогравиметрической установки для измерения изотерм гидратации нуклеиновых кислот в условиях, исключающих воздействие на них окружающей среды. Приведена методика измерения изотерм с высокой точностью ( ~ 0,05 молекул воды на нуклеотид) при малом содержании вещества (до 10~^г).

Описана нестандартная кювета для получения ИК-спектров пленок нуклеиновых кислот в широком температурном интервале - 190° + 100°С при различных относительных влажностях.

Объектами исследования служили нуклеотиды и полинуклеотиды, моделирующие пространственную структуру РНК и ДНК. В работе использовались динатриевые соли (АМФ,ГМФ,ЦМФ,УМФ) фирмы " !?еапо£щ (Венгрия), дТШ^ фирмы " ^а^^'осЛ^т » (США), тимидин фирмы " Ж " (Швейцария), чистые калиевые соли полинуклео-

тидов (поли рА.поли У, поли рГ и поли рЦ) фирмы " (ФРГ),

Двухспиральные комплексы поли А.поли У.поли А.поли А и поли рГ. поли рЦ были получены с помощью известных методик.

ДНК из разных источников (тимуса теленка, молок осетровых рыб, фага Т2 и селезенки крупного рогатого скота были выделены в нашей лаборатории, в Шституте биофизики Минздрава СССР, в Ин-

ституте биоорганической химии АН БССР, в Институте биойизики АН СССР, использовались так же препараты тимусной ДНК фирмы, . Образцы ДНЯ и гистоны получены в нашей лаборатории. Комплексы ДНК с этидием бромидом и кофеином готовились & помощью известных методик.

Количество элементов Мо и £ в препаратах нуклеиновых кислот контролировали с помощью пламенного фотометра ФПЛ-1, содержание хлора измеряли'с помощью хлорсеребряного электрода на ионо-метре И-102.

Тонкие и однородные пленки нуклеиновых кислот готовились с помощью специально разработанной технологии, существенным моментом которой являлось медленное высушивание при температуре +4°С на строго горизонтальной поверхности подложки. Для получения аморфных пленок полинуклеотидов эта технология изменялась с целью уменьшения поверхностного натяжения испаряемого раствора.

Инфракрасные спектры регистрировались на спектрофотометрах ¿^-10, ¿Л?-20 (Карл Цейсе, Йена, ГДР).

Теплоту испарения воды с образцов ДНК измеряли с помощью 'микрокалориметра ДСК-101 фирмы "Сетарам" (Франция).

Предохранение от высушивания и разогрева пленок радиацией глобара осуществлялось с помощью разработанного фильтра из германия, отрезающего излучение до 1,8 мк.

Разложение сложного контура нуклеотидов и воды на составляющие компоненты осуществляли на ЭВМ БЭСМ-6 по соответствующим программам и с помощью 5-канального электронного синтезатора кривых СК-2 (СКВ БП АН СССР). Контуры отдельных компонентов аппроксимировали функцией Гаусса и линейной суммой функций Гаусса и Лорент-ца.

.Измерение комплексной диэлектрической проницаемости растворов нуклеотвдов проведено на дифференциальном диэлектрометре, сконструированном в нашей Лаборатории В.А.Кашпуром.

В ходе выполнения работы проводилась машинная обработка экспериментальных результатов и теоретических расчетов спектров, электронной плотности и порядков связей на нуклеотидах.

Термодинамические параметры уравнения БЭТ в модификации Гас-койна и Петига и Д'Арси-Ваттовского разложения изотерм гидратации оценивались с помощью метода наименьших квадратов на основе подпрограммы - "условной минимизации#/^-0/°.5^ <5.Г

Квантово-хИиические расчеты проводились полуэмпирическим ме-

10 '

тодом ПДЦП/2 в $/><!■ - базисе волновых Функций по программам на ЭВМ БЭСМ-6, представленным Ю.Ф.Педашом.

Расчет резонансных частот в спиральных полинуклеотида* и РНК выполняли по специально разработанным программам.

Глава Ш. ГИДРАТАЦИЯ И КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ НУКЛЕОТИДОВ В ПЛЕНКАХ

Излагаются результаты систематического спектроскопического и тэоретического изучения гидратации и ассоциации нуклеотидов в конденсированном состоянии и в растворе при различных температурах. Это позволило выявить характерные признаки ИК-спектроскопи-ческого проявления гидратации, межплоскостного взаимодействия при формировании стопок азотистых оснований в кристаллах и уот-сон-криковского спаривания азотистых оснований. На основании полученных данных проведен термодинамический анализ водородных связей в гидратных комплексах азотистых оснований и в их уотсон-крнковских парах в водных растворах.

Благодаря разработанной методике выращивания аморфных, достаточно равномерных по толщине и устойчивых пленок солей нуклеотидов (АМФ, дТМФ,УМФ, ИФ,ЦМФ) и некоторых нуклеотидов впервые получены и исследованы ИК-спектры в области 900-1800 в широком интервале относительной влажности (ОВ).

Анализ спектров нуклеотидов, как и в случае полимерных нуклеиновых кислот, проводился путем построения зависимостей частот V, интенсивностей £ полос поглощения азотистых оснований и сахаро-фосфатных групп от ОВ и числа сорбированных молей воды на моль нуклеотида п , определенных пьезогравиметрическим методом. Отнесение полос основывалось на характеристичности колебаний и теоретических расчетах (Тзубои, 1973, Благой, 1985).

Типичные зависимости для полос поглощения вне-и внутриколь-цевьк колебаний азотистых оснований и сахаро-фосфатных групп показаны на рис. I. Такой анализ показал, что существенные изменения спектральных параметров для нуклеотидов АМФ,ШФ и ЦМФ наблю-даятся в двух интервалах ОВ. В гервом интервале до ОВ боль-

шинство полос поглощения валентного колебания атомов (Р=0, С=0, С~Ы , С—0) уменьшают частоту колебаний V (волновое число) и уве-личиваот интенсивность Я . На основании эмпирических правил образования Н-связи такой характер изменения V и К связан с установлением Еодородных связей между молекулами воды и соответствующими гкдр&тно-активными центрами .нуклеотидов. Об этом также сви-

Рис.1. Зависимости частот(У) и интенсивностей в относительны* • единицах ( А ) от количества молекул воды на нуклеотид (л ) и ОВ для полос поглощения 5 - ЩфЛЬд (а,г.д)* 5'- АГЛФА^ (б) и

5' - дТМ®2 (в).

дет.ельствуют проведенные квантово-химические расчеты распределения электронной плотности на хорошо изученном методом РСА гидрате 5' - д ЩФЛ^ (Висвамитра, 1983). Расчет проводился полуэмпирическим методом Л11ДП/2 в - базисе волновых функций для гидра-тированного и дегидратированного дианиона 5'- дВДФ""^. На рис. 2 показана разностная диаграмма зарядов на атомах и порядков связей для этих двух состояний нуклертида. Видно уменьшение порядков связей Р = 0, С = 0иС=Л/и увеличение их поляризации (зарядов на атомах) в гидратированном цитозинмонофосфате. Эти данные, наряду с эмпирическими правилами Н-связи, качественно объясняют причины низкочастотных сдвигов и рост интенсивности полос поглощения при , 12

Рис.2.Разностная схема распределения электронной плотности ( х Ю3) (5' - дЦМФ)2" ЛОН20 и (5' - дЩФ)2" (разности зарядов обведены кружками).

связывании молекул воды нуклеотидами. Однако в эти эффекты кроме воды могут дать вклад противоионы, о чем свидетельствуют проведенные расчеты распределения электронной плотности на атомах 5 - в зависимости от их положения.

Сорбция воды во втором интервале ОВ (77 — 3-4) сопровождается "'резкими" изменениями спектров АМФ, ГМФ и ВДФ. Полосы поглощения внутри-и внекольцевых колебаний азотистых оснований претерпевают высокочастотные сдвиги и уменьшаются по интенсивности (рис.Л Кроме этого в спектрах наблюдаются многочисленные расщепления и сужения полос. Эти спектральные изменения свидетельствуют о переходе этих нуклеотидов в кристаллическое состояние. Как показывает РСА.нуклеотиды при этом кристаллизуются в слоистые структуры, в которых азотистые основания образуют стопки (гидрофобные каналы), а катион-сахаро-фосфатные группы - гидрофильные каналы. Однако в отличие от этих нуклеотидов в спектрах 5'- дТМЭХГ^ и 5'- УМФЛ£?г, которые, как известнее кристаллизуются, во всем интервале ОВ полосы поглощения изменяют свои параметры плавно, до насыщения (рис. 1в). Поэтому наблюдаемые во 2^ интервале ОВ "резкие" высокочастотные сдвиги н инфракрасный гипохромизм полос вне- и внутри-кольцевых колебаний азотистых оснований являются характерными признаками- проявления ксшиоскостного-стэкинг-взаииодействия этих,

' 13 »

колебательных движений в инфракрасном спектре.

Температурные исследования спектров нуклеотидов в растворах тяжелой воды подтвердили закономерности ИК-спектроскопического проявления их гидратации и ассоциации.

Подробное исследование зависимостей V и £ от п и диэлектрические измерения в растворах позволило установить центры гидратации на азотистых основаниях и сахаро-фосфатных группах, найти степени гидратации и построить модели гидратации пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов.

Для оценки энергии стабилизации спиральных молекул нуклеиновых кислот необходимы сведения об энергии Н-евязей в уотсон-кри-ковских парах и молекул гидратированной воды. Однако получение таких данных с помощью анализа валентного колебания групп 0-Н, /V// иЛ*/^ практически невозможно даже в пленках из-за сильного поглощения и перекрытия полос. Удобньы в этом плане оказалось изучение спектров водородносвязанного состояния карбонильного поглощения. На основании собственных измерений и многочисленных литературных данных о частотах карбонильных колебаний в водородно- ' связанном состоянии различных веществ (включая азотистые основания) установлена эмпирическая зависимость, близкая к линейной, между частотным-, сдвигом а V и энтальпией Н-связи.

Используя это соотношение, а так^же данные, полученные при изучении уотсон-криковских пар азотистых оснований в неводных растворителях (Куогоки, 1967, Томас и Лорд, 1968) и гидратных комплексов нуклеотидов в воде (Сорокин,1988)„ проведен термодинамический анализ Н-связей (табл.1). Видно, что энтальпия Н-связей в уотсон-криксвских парах меньше, чем в гвдратных комлексах. Анализ рентгеноструктурных данных длин Н-связей также свидетельствует о том, что они в гидратах меньше на ^ 0,1-0,15А°. по сравнению с парами азотистых оснований. Из оценок свободных энергий следует, что связывание молекул воды гидратно-активными группами азотистых оснований в водных растворах предпочтительнее, чем образование водородносвязанных пар азотистых оснований. - .

Таким образом, изучение нуклеотидов выявило характерные признаки ИК-спектроскопического проявления.гидратации, межплоскостного взаимодействия и уотсон-криковского спаривания азотистых оснований, что позволило количественно связать их с термодинами- ■ ческими параметрами образования Н-связей.. "

Таблица I

Термодинамические параметры Н-связей в гидратных комплексах азотистых оснований и в уотсон-криковских-парах

Пары азотистых оснований, ~ЛЧ Гл^г

типы Н-связей (ккал/моль) (кал/град) (ккал/моль)

А-У г-ц 3,0(+0,2) 3,2(+0,2) 3,9(+0,4) 0,9(+0,2) 4,9(+0,4) 1,7(+0,2)

Средняя Н-связь в А-У - " - ' Г-Ц 1,0(+0,1) 1,К+0,1) • . 1,9(+0,2)0,4(+0,2) 1,б(+0,1) 0,77+0,2) .

С4=0 ... Н-Л'-Н (А-У) (А-У,Г-Ц) С6=0 ... Н-А^-Н (Г-Ц) С2=0 ... Н-ЛМКГ-Щ 1,1 (+0,2) 0,7 (+0,1) 1,4 (+0,2) 1,1 (+0,1) ' -

н20 ... Н-И-Н н20 ... Н н20 ... 0=С- 1,1 1,2 2,0 — —

Глава 1У. ГИДРАТАЦИЯ И КОНФОШАЦИОННОЕ СОСТОЯНИЕ ПОЛИРИБОНУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В ПЛЕНКАХ

В отличие от нуклеотидов синтетическим полинуклёотидам присуща вторичная (спиральная) конформация, хорошо моделирующая структуру природных нуклеиновых кислот. Это обстоятельство, а также относительная простота и 'изученность ИК-спектров и их связи со струк?урой явились хорошей основой для исследования гидратации полинуклеотидов и -ее влиянил наструктуру и стабильность дву-спиральной канонической А-формы ДНК..

С этой целью в этой главе проводятся систематические исследования ИК-спектров и впервые полученных изотерм гидратации пленок клубковых, одно- и двуспиральных форм полирибонуклеотидов при различных относительных влажностях.

Сравнительный анализ зависимостей спектральных параметров частот У и интеисивностей К структурно-чувствительных полос поглощения внутри- и внекольцевых колебаний азотистых оснований от числа сорбированных молекул воды /2 для этих форм полинукле— отидов показал, что однонитевые полинуклеотиды гидратируются;и формируют спиральную структуру начиная с низких ОВ (рис.3), что видно, например, для поли рА по высокочастотному сдвигу и росту

Я £5 ни 1.1 I II-!■

к и ¡еьч то к_л»_*л.ов

■ и 1Л _I—__1

.и«*

20' П

а 2 Н 6.8 10 12 п.

Рис.3. Зависимости частот V И" интеисивностей И отП и ОВ для полос поглощения поли рА (а) и поли рА поли рА (б).

интенсивности полосы 1618 см~* (колебание С=,/У). Двунитевые гомо-полинуклеотиды только гидратируются, сохраняя свою двуспиральную структуру при,нулевой ОВ (см,рис,3б), поскольку во всем интервале ОВ частота того же колебания остается неизменной.

Иной характер 'зависимостей обнаружен у двунитевых гетеро-полинуклеотидов (см.рис.4), что свидетельствует о существенном различии механизма формирования гидратных оболочек и структур этих полинуклеотидов. На начальном этапе сорбции воды полинуклеотиды поли рА *поли У и поли рЦ • поли рГ гидратируются, о чем свидетельствуют низкочастотные сдвиги и рост интенсивности полос поглощения- внутри- и внекольцевых колебаний, затем в узком интервале изменения л. они переходят в двуспиральную конформацию, что , видно по "резким" изменениям спектральных параметров (см.рис.4 и рис.5). Однако высокочастотные сдвиги и уменьшение интенсивности полос поглощения валентного колебания С-О-групп и других внутри-кольцевых колебаний является неожиданным, поскольку при переходе полинуклеотидов в двуспиральную конформацию устанавливаются Н-связи в уотсон-криковских парах. Это должно приводить, как это следует из гл.Ш, наоборот, к низкочастотным сдвигам колебаний С=0-

'Ь ' 16 . .

-групп и росту интенсивности соответствующих полос. По-видимому, природа этого эффекта определяется другим типом физического взаимодействия.

Согласно модели слабоевязанных осцилляторов (Миядзява,1960) частота карбонильного колебания V в спиральных молекулах с соответствующими правилами отбора (Хигс, 1953, Тадокоро, 1960) определяется для А и Е компонент тан:

Ъ = V, -4 +Д * ■ • ■ * А (2)

где - невозмущенная частота; 3)е — член, рпределяпщий

взаимодействие в Н-связи, Д^ ... Да- члены взаимодействия других типов.

Для многих полинужлеотидов в работе было рассмотрено динамическое (резонансное) взаимодействие колебательных моментов переходов в диполь-дипольном приближении. В этом случае третий член в уравнениях (I) и (2) для компонент А к Е принимает вид:

А* = $У^с^пу; (4)

где /4 - постоянная Планка, V - элемент резонансного взаимодействия, У - угол поворота.

В диполь-дипольном приближении резонансное взаимодействие в общем гаде записывается в виде: с

^г* ' ^^ *. ;5)

где Д^е! и А- векторы дипольннх моментов переходов;

Яот- вектор, направленный от центра диполя . ПЖ к диполж , , £ — диэлектрическая процнцаемость. Поскольку колебание в основном локализовано на связи С=0 (Тзубоя, 1973), а расстояние между этими связями в большинстве спиральных полкиухлеотядов в 3-4 раза больше, чем расстояние мезду зарэдами диполя ( ~ 1,2А°), то, как было* показано (Гирга-. фельдер, 1961), диполь-дипольное приближение может быть с хорошей точностью (5-10?) использовано для расчета резонаяеннг час-

Г7

Рис.4. Зависимости частот V и интенсивностейК полос поглощения

Рис.5. Спектры деИтерированных пленок полинуклеотидов: поли рА • поли У (ОВ: 1-036,- 2-15Я, 3-445?, 4-80^); поли рР * поли рЦ.(0В:1> ¿¿,'3-336, 3-645?, 4-8058);

° . тот.

Измерив абсолютные интенсивности полос поглощения карбонильных колебаний нуклеотидов и некоторых внутрикольцевьк колебаний

(С -//) и используя величины невозмущенных частот ( V, с учетом Н-связи для С40,С60 и С20 цитозина равно 1640 см-1, С20 тимина и урацила-1681 см""*) и. координаты атомов структурных моделей поли-нуклеотидов (Арнотт, 1974, 1983, Скуратовский с'соавт.,1986),были рассчитаны резонансные частоты и давьщовское расщепление. Для карбонильных колебаний полинуклеотидов результаты расчета и экспери-ментальньв данные представлены в таблице 2, Видно хорошее соответствие рассчитанных резонансных частот и расщеплений и экспериментально наблюдаемых.

Реалистичность этих расчетов и знание направлений моментов переходов, определенных из дихроичных отношений поляризованных ИК-спектров (Барет, 1978), позволили сделать выбор из предложенных , структурных моделей и уточнить детали структуры некоторых полинуклеотидов.

Кроме того, на основании расчета резонансных частот и анали- . за абсолютных интенсивностей полос поглощения карбонильных колебаний в дальнейшем был предложен и апробирован "контурный" метод аналяза вторичных структур» который вполне удовлетворительно за-рекокендовал себя при расчете некоторых геометрических параметров в структурах транспортных Р НК. 4

Таким образом, обнаруженные при гидратации полинуклеотидов высокочастотные сдвиги и ИК-гипохромизм полос поглощения внутри-и внекольцевых колебаний свидетельствуют о переходе полинуклеотидов в спиральную А-форму.

Анализ частот. V и интенсивностей Я от п полос поглощения сахаро-фосфатного -.остова, наряду с азотистыми основаниямими, позволил установить степень гидратации клубковой, одно- и двуспи-ральной форт полинуклеотидов (таблица 3). .

Найдено, что степень гидратации клубковых форм ниже односпи-ралышх полинуклеотидов. Однако, если степень гидратации двуспираль-ного поли А • поли У близка к односпиральным полинуклеотедам, то гидратация поли рГ.• поли рЦ ниже гидратации его компонент. Это связано с тем, что "выход" аминогрупп в минорный желобок не позволяет' образовывать з'нем регулярную сетку молекул воды* Увеличение степени гидратации спиральных структур полинуклеотидов по сравнению с их одноименнши нуклеотидами и клубковой формой поли У свидетельствует о том, что для формирования вторичной структуры необходимы дополнительные молекулы воды, которые стабилизируют спиральные кон-

формации. Достигается это тем,, что между гидратно-активными группами устанавливаются "мостики" из молекул воды.

Таблица 2

Резонансные частоты и расп^епление компонент карбонильных колебаний в двуспиральных полинуклеотидах

Группы - Величина Экспериментально наблю- Вычисленные частоты

карбо- момента даемые частоты и расще- и расщепления

нилов перехода Ш№ (см-1>

С=0

(см"1)

:СКР

ул

ИКС :.,

СКР

икс

' Уа

V*,

7.4-*/

• У поли дА - поли дТ

С20 0,47 1686,0 1700,3 1696,6 3,7

с4о 0,39 1669,0 1664,0 5,0 1669,9 1663,4 6,5

с2о 0,47 поли дАТ-поли дАТ л 1689,4® 1669,0 а>,46 1690,1а 1671,9 18,215

с4о 0,39 . 1663,0а 1615,0 4В,О6 1663,4а 1616,6 46,8б

с2о 0,45 поли рГ • поли рЦ 1650,0 1647,0 3,0 1648,4 1647,1 1,3

с6о 0,49 1699,0 1698,0 11,0 1697,0 1687,9 9,1

поли А • поли У - .-'

СрО 0,52 ^ - 1692,0 1694,6 1692,0 2,6

с4о 0,36 1681 1672,0 9,0 1682,3 1672,5 9Д

Обозначение: Я~

->2 ■ ? уИг г На существование таких "мостиков" указывают результата расчетов, полученные при решении колебательной задачи (пятиатомная ~ модель Ехневича, 1973). Такая задача с привлечением -экспериментально установленных чзотот валентного и деформационного колебаний связанных молекул воды и энергия Н-связей решена для уточ-нанР модели односпиракьной структуре поли рА. Найдено, ото воз= с »южны "мостики" молекул воды кежду атомами К1 и между еячэиами /{3 для соседних еденинов. вдоль спирали, а также между атомами , кислородных фосфатов сахаро-фосфатного остова. Между атоиайк аденина и сахаро-фосфатной цопн ногут устанавливаться двойжз к тройные "мостики" кз-ыь'хёЕг/а гсдо,

Для гогучэнкд окзргетачсзх-х параметров гвдратацкк кзута:;-

Таблица 3

Степени гидратации нуклеиновых кислот

Вещество Средние числа гидратации на нуклеотид

_ клубка односпиральной конфорыации двуспиральной конформации

Нуклеотид

пиримидиновый 8 - -

пуриновый 10 - - .

Поли рУ 7

Поли рА 12 -

Поли рГ - 12 -

Поли рЦ - 10 -

Поли рА.поли рА" - 8

Поли А.поли У - - 14

Поли рГ.поли рЦ — - 8

ных полинуклеотидов привлекались современные подходы для объяснения полученных изотерм гидратации. В рамках общей статистико--ыеханической модели-адсорбции идеального газа на твердой поверхности , лежащей в основе представлений об изотермах гидратации биополимеров, возможен обоснованный учет неоднородности поверхности, т.е. существование N - независимых типов первичных гидратно-ак-тивных центров. Общее уравнение в этом случае записывается в виде (Гасконе и Петиг,1977): . /

где у - число типов первичных центров ( / = 1,2,..., );

^ алг/^у ^ чу*3

функция ■распределения для одного первичного центра J - того типа; X - относительная влажности; ¿? ■ • - активность воды в / -ом гидратном слое над центром у - того типа; 1/^у - адсорбционная емкость монослоя (или адсорбционная емкость одного первичного центра J - того типа); - полная сорбция. При детальном исследовании уравнения (б)' установлено, что выражение вида (Д,Арси и Ватт, 1971)

хорошо аппроксимирует уравнение (б).

Уравнение (7) применено к анализу изотерм гидратами пояи-иуклеотидов и их компонентов. Удовлетворительным приближением пля экспериментальных изотерм оказалось выражение

где соответственно, 1-й член "ленгмюровский", 2-й - "генриевский" и 3-й - мультислойный члены адсорбции.

Привлечение ИК-спектроскопических данных позволило выделенные три типа связанной воды в гидратной оболочке отнести к слецу-ацим центрам гидратации: "ленгмюровская" вода связывается с полярными центрами азотистых оснований и, возможно, сахаро-фосфатного остова, "генриевская" вода без насыцения связывается с фосфатами и противоионами, "мультислойная" вода - это молекулы воды верхнего слоя гидратной оболочки полинуклеотида.

В работе на основании определенных констант равновесия (, Ог. ) с учетом энтропии найдены энергии гидратации азотистых оснований и катион-фосфатных групп (таблица 4) относительно энергии взаимодействия вода-вода. В таблице также приведены емкости

Таблица 4

Энтальпии гидратации по Д'Арси и Ватту

гидратные центры гидратные центры

Вещество азотистых оснований катион-фосфатных

1/т, (ккал/моль) ^(ккал/моль^

поли. рГ 1.9. 2,10 4,2 ■ 1,26

поли рЦ 1,3 2,10 3,5 1,25

поли рА 1,8 2,00 3,4 * 1,24

поли рУ 1,5; 2,00 1,2' 0,68 .

поли А.поли А..- - 3,2 0,83

поли А.поли У 0,8 1,21 4,0 . 1,31

гкдратно-активных центров, т.е. число связанных молекул воды, по которым усреднялась энергия. Видно, что энергия взаимодействия молекул воды с азотистыми основаниями в 1;5 - 2 раза выше (исключение поли А . поли У), чем их взаимодействие с катион-фосфатнши группами. Можно так же отметить, что поскольку наи-

22.

более •активные (функциональные) центры двуспиральньк полинуклео-твдов поли А • поли У и поли рА • поли рА "эакрагы", то энергия взаимодействия остальных центров ,с водойлзначительно ниже,.

Разложение Д'Арси и Ватта хотя и учитывает существование независимых типов первичных гидратноактивных центров, но оно является достаточно грубым и не позволяет получить полный энергетический "спектр" молекул воды гвдр&тной.оболочки полинуклеотидов, необходимый для оценки вклада воды в. стабилизацию вторичной структуры. Нуяны другие подходы. " • .

С этой целью в работе анализировались спектры сорбированной воды на пленках полинуклеотидов в области валентного колебания (рис.б). Выло обнаружено, что максимум поглощения Я77ах сорбированной воды зависит от ее количества п . Используя известное соотношение Баджера-Бауэра, учитывающее зависимость. Ута* от энергии Н-связи, строились зависимости избыточной энергии гидрата-

Йм*

(см-1) зио

3¥0 3390 3370 ■

(якал/г**)

н п

Рис.6. Спектры поглощения валентного колебания сорбированной воды на поли рА . поли У (а) при ОВ: 1-0£, 2-15^,3-44^, 4-801. Зависимость частоты этого колебания Уп?ах от п и энергии гидратации л£; поли рА • поли У (б)..

тации^.=Д. от п » где Е0 - энергия взаимодействия

вода-вода в объеьяой фазе. На рис. 7 показан энергетический "спектр" молекул воды, образующих гидратнута ободочку, и зависимости интенсивности структурно-чувствительных групп поли А • поли У от числа сорбированных молекул воды п . Из этих данных установлено, что сорбция молекул воды в интервале 5 < П- < 14 приводит к переходу

полинуклеотида в спиральное состояние. Этим 9 молекулам воды соответствует суммарная энтальпия гидратации Л4-" 5 ккал в пересчете на пару оснований, что составляет приблизительно 50-6055» от полной энергии перехода спираль-клубок (Акерман,197б). Эти оценки показывают, что вода вносит весомый вклад в,энергию стабилизации спи-

Рис.7.Зависимость энергии гидратации л ¿у от п. (3) и £ от п. для полос поглощения (Г,2) поли рА . поли У.

ральной структуры А-формы ДНК.

Таким образом, исследование гидратации и структурного состояния нуклеотидов и полинуклеотидов, с одной стороны, "показывало высокую эффективность комплексного подхода изучения нуклеиновых кислот. С другой стороны, полученные результаты являются хорошей базой для изучения влияния гидратации на структуру и физико-химические свойства природных биомолекул - ДНК, белково-нуклеиновых комплексов ДНИ и комплексов ДНК с биологически активными веществами.

Глава У. ГИДРАТАЦИЯ И СТРУКТУРНЫЕ ПЕРЕХОДЫ ДНК В ПЛЕНКАХ

В этой главе приводятся результаты исследования связи спектроскопических свойств с конфорыацией ДНК и влияния гидратации и температуры на ее структурные переходы в конденсированном состоянии. Подробно изучены спектроскопические, термодинамические и динамические свойства гидратной оболочки и ее взаимосвязь со структурой ДНК. С помощью анализа спектров сорбированной воды, пьезо-гравиметрических изотерм и микрокалориметрических измерений эн-

тальпии испарения связанной воды определены энергетические параметры молекул воды гидратной оболочки ДНК и оценен вклад воды в стабилизацию В-формы ДНК.

Полученные в совокупности экспериментальные данные и современные представления о динамике полинуклеотидной матрицы позволили рассмотреть молекулярный механизм гидратации и формирования спиральных структур ДНК в конденсированном состоянии.

ИК-спектроскопическое проявление гидратации и конйотзлапион-ного состояния ДНК. Известно, что конформационное состояние ДНК в' волокнах и пленках зависит от нуклеотидного состава, влажности и примесных солей. Инфракрасные спектры ДНК при контролируемом содержании соли и различных ОВ (и п. ) получены в области 9003800 см~* для дейтерированных и недейтерированннх образцов.

В отличие от полинуклеотидов это довольно сложные спектрн (рис.8) и поэтому для анализа привлекались только сильные (интен-

Рис.8. Спектры поглощения ДНК из молок осетровых рыб в недейтери-рованном (а) и дейтерированном (в) состояниях п^и ОВ: I - 0£, 2- 15%, 3 - Ш, 4 - 65/?, 5 - 92Ж, Разностный сПектр (б).

сивные) и хорошо разрешенные полосы поглощения с надежным отнесением, основанным на характеристичности и теоретических расчетах.

В работе проведены систематические исследования зависимостей частотных сдвигов и интёнсивностей от п. и ОВ полос поглощения сахаро-фосфатног'о остова, азотистых оснований и сорбирован-

25 • ■

ной воды на нативной (н) и денатурированной (д).ДНК. Для интерпретации зависимостей использовались теоретические расчеты (гяа-ва 1У), данные рентгеноструктурного анализа и поляризационных спектров.

Анализ показал (см. рис.9), что в интервале .0-60^ СВ — С>

Рис.Э. Зависимости чартот V и интенсивностей К от и ОВ для полос поглощения нативной (1,2,3,4) и денатурированной (I', 2', 3', 4' ) ДНК.

происходит одновременная гидратация азотистых оснований (кр.1, 2) и еахаро-фосфатного остова (кр.З и 4). В интервале 64-80Й (6 < /г ^ Ю) дщ переходит в А-форму, о чем свидетельствует "плато" на зависимости V и Я от п для полос поглощения де-зоксирибозы и "резкие" высокочастотные сдвиги и гипохромизм по-

лос поглощения вне- и внутрикольцевых колебаний азотистых осно- , ваний у н-ДНК в отличие от д-ДНК. Дальнейшая сорбпия воды в интервале 80-92% ОВ (дол — 20) сопровождается в присутствии примесных, солей переходом ДНК в В-форму, что отмечено высокочастотным сдвигом и ростом интенсивности, полосы дезоксирибозы 972 см-*, появлением и ростом интенсивности другой полосы дезоксирибозы при. 1053 см"1. Такие структурные состояния ДНК ранее обнаружены методом РСА и другими методами (Купер,1966, Бредбари, 1961, Пилет, 1972).

Таким образом, A-форма ДНК формируется при связывании Л — 10 молекул воды на нуклеотид, а полная гидратная оболочка ДНК в В-форме составляет — 20 молекул воды.

Подробный анализ спектров в области I550-I750 гм~* н- и д-ДНК при ОВ до 50-60"? показал, что полосы поглощения внутрикольцевых колебаний (1573 см~* и 1618 см"*), чувствительные к образованию уотсон-криковских пар, в спектрах д-ДНК имеют более вы.окуп-частоту (на 5-7 см-*) по сравнению с н-ДНК. Поэтому в этом состоянии у н-ДНК сохраняются Н-связи (возможно искривленные и потому ослабленные) в парах, но^стэкинг азотистых оснований отсутствует, на что указывает значительный гиперхромиам полос поглощения внутрикольцевых колебаний. Такая форма ДНК, названная Р - формой, легко переходит при увеличении /г в спиральную конформациго в -отличие от денатурированного состояния. • . -

Сравнительный анализ зависимостей спектральных параметров от Á и изотерм гвдратации д- и н-ДНК показал, что сорбционная способность их сахаро-фосфатных групп близка, в то время как сорбционная способность' азотистых оснований различна (рис.9). Аэотис-' тые основания для создания регулярной сетки молекул воды в желобках н-ДНК связывают большее количество молекул воды, чем у д-ДНК, Анализ изотерм гидратации также показал, что уровень сорбции воды на н-ДНК до 95$ ОВ выше, чем у'д-ДНК, но при ОВ больше 95£ этот уровень даже несколько ниже, чем у д-ДНК.

Различие в сорбционных свойствах н- и д-ДНК и использование уравнения адсорбции Гаскойна и Петига, разложения изотерм гидратации по Д'Арси и Ватта позволило для первых пяти сорбированные молекул воды определить константы адсорбционного равновесия н-ДНКвода ( о, = 22, 12,8,- = 5,8). Эти данные

свидетельствуют о том, что молекулы воды связываются с н-ДНК с различными энергиями.

Таким обратом, анализ спектров показал, что гидратация ДНК опровождается переходом ее из Р вА-иВ - формы. Подобные переходы при возрастании активности воды наблюдаются в водно-опир-^ товнх растворах (Яванов, 1973).

Спектроскопические и термодинамические' особенности гидрат-ноГ; оболочки ДНК. Как и в случае полинуклеотицов,анализ состояния молекул воды в гвдратной"оболочке ДЖ проводился по ее инфракрасному спектру в области валентного колебания ОН-групп при поэтапном увлажнении пленок.

Опыт показал, что максимум полосы поглощения сорбированной воды (рис.10) по мере увлажнения пленки ДНК сдвигается в высоко-

го П.

Рис, 10. Зависимости частоты ( ^тах ) и интенсивности (-<") полосы поглощения сорбированной воды от л и энергии гидратации л £/ от п для ДНК.

частотную область и при п. > 10-12 его частота совпадает с соответствующим значением частоты ( У/пах — 3420'жидкой воды. На зависимости интенсивности КС") полосы в максимуме поглощения при п — II обнаружен излом, свидетельствующий о существовании в гидратной оболочке двух "массивов" молекул воды, различающихся по спектроскопическим параметрам (рис.Ю).

Контур полосы жидкой и сорбированной на ДНК воды (Д20) подробно исследовался путем разложения его на симметричные гауссовы формы. Хотя эта процедура не имеет достаточного физического обоснования, тем не менее использование базиса симметричных функций представляется полезным для сравнительного анализа. Найдено, что

синфазное () н антифаэное ( ^и/) колебания молекул сорбиро-рованной воды имеют более низкие частоты С = 2474 см" ,

= 2570 см"1) , чем соответствующие колебания для жидкой воды ( = 2484 см-1, "¿а/ = 2602 см"1), а полуширины иг полос и разности частот по сравнению с этим случаем (У<//-У/ ) уменьшились, соответственно, на 5-102 и 20?. Эти данные также свидетельствуют о том, что молекулы воды в гидратной оболочке образовали по сравнению с яидкой водой более сильные Н-связи.

Используя соотношение между частотой валентного колебания и энтальпией Н-связи,в работе определена энергия гидратации ДНК относительно энергии взаимодействия вода-вода.(рте.10). В верхних слоях гидратной оболочки молекулы воды по энергии связывания, по-видимому5 мало отличаются от жидкоЧ'воды.

С целью проверка справедливости этого утверждения проведено исследование термоустойчивости гидратной оболочки н-ДНК в пленках в закрытой системе. Для сравнительного анализа на рис.11 показаны зависимости интенсивности от температуры полосы положения воды пщратной оболочки (кр.1) и объемной (кр.2), а также подобные зависимости для структурно-чувствительных полос ДНК (кр.З и 4). Обнаружено, что эти два"массива" воды кооперативно разрушаются в двух температурных интервалах. В первом интервале происходит разрушение верхних слоев молекул воды гидратной оболочки., примыкающих к сахаро-фосфатным группам,и во втором интервале кооперативно разрушается спиральная структура. ДНК и регулярная сетка молекул воды, примыкающая к азотистым основаниям (кр.4) и нижним слоям фосфатных групп (кр.З);

В открытой системе в условиях тепловой дегидратции кроме потери этих"массивов" воды обнаружен интервал , в котором происходит дегидратация моногидратного слоя (рис.12) при температурах свыпе Ю5°С.

Отсутствие существенных конформационных изменений ДНК в интервале температур Ю-45°С позволяет для анализа термодинамики рассматриваемого процесса применить уравнение Вант-Гоффа (Бреыенфельд, 1974). Выполненные таким образом оценки энтальпии связыеения молекул воды в верхних слоях гидратной оболочки показали, что ее величина близка к энергии взаимодействия вода-вода в жидкой фазе.

На существенное различие молекул воды в гидратной оболочке

нчего^

Л |1 ■■ч|11||> ||| '—Л-Л л Л 4—

о О -о Т СО --г-

но

1,0 к

1.0

100

Рчс.II. Зависимости интенсивности % жидкой воды (2) л сорбированной воды на нативной ДНК при 94%(В(фт температуры. Такие же зависимости для полос поглощения ДНК (3,4).

Рис.12. Термограммы гидратов ДНК,полученных увлажнением сухого образца при 94£ (I) и 76% (2) ОВ.

го ив бо ао юо пот'й

указывают также низкотемпературные спектры сорбированной воды на пленке ДЦК. При 86Й ОВ в спектре .такой пленки появляется полоса, отнесенная к вымерзающей фракции"воды (лед) в отличие от_спектр&в этой пленки при меньших влажностях. Оценки показали, что- при содержании примесных солей до от сухого веер. ДНК >*> вдаоражявввт-

ся около 12 молекул воды, а при 8* содержании соли невымораживае-мая фракция уменьшается до П =8. Обнаруженные эффекты имеют важное -значение для криоконсервации генома, поскольку позволяют выбрать такое соотношение воды и соли, при котором будет сохраняться нативное состояние ДНК, защищенное от повреждающего действия льда при замораживании.

Анализ структурно-чувствительных полос поглощения спектров ДНК при низких (-190°С) и комнатных температурах показйл высокую обратимость наблюдаемых спектральных параметров при изменении температуры, что свидетельствует об обратимости структурных изменений. Эти изменения в основном связаны с низкочастотными сдвигами полос связанной воды (до ~ 50 см-^) и фосфатов (^Vaí 9-12см~^ при понижении температуры до -190°С. Эти данные свидстольствуют об усилении водородных связей. Такое усиление Н-связей должно привести к. их сокращению. Расчет показал, что при наличии иепочки из 3-4 молекул воды между противоположными сахзро-фосфзтныш цеп?мм такое,сокращение приведет к уменьшению поперечных размеров желобков ДНК при температуре -190°С на 0,3-0,4 А0 и уменьшению расстояния ыекду соседними атомами кислорода фосфатов на 0,1А°. Таким образом, полученные данные и расчеты объясняют обнаруженное ранее при понижении температуры до 1б°К сужение желобков в додекамере (Декерсон с соавт., 1992) и вместе с тем показывают, ито состояние молекул воды отражает взаимосвязь гидратной оболочки и гтрук-туры ДНК.

Энергетика гидратации и стабильность спиральной структуры ДНК. Наряду со спектроскопическими оценками энергии гидратации в работе проводились прямые микрокалориметрические измерения энтальпии испарения воды с.влажной пленки ДНК. Предварительно увлажненные образцы ДНК (сухого веса ~ 20 мг) до л = 20 молекул воды на нуклеотид вкладывали в калориметрическую ячейку, которая помещалась в сухую атмосферу камеры микрокалориметра ДСК-I0Í. В процессе испарения контролируемого количества воды с образца ДНК определялось теплопоглощение и затем рассчитывалась энтальпия испарения на один моль воды.

Стабильность спиральной структуры ДНК определяется различными типами внутри- и межмолекулярных.взаимодействий. Суммарное изменение свободной энергии Гиббса при переходе ДНК из, неупорядоченного в спкральное состояние включает несколько членов: - •

л/^конф.^/дак +^ЛдНК+НгО«1оии) + ^Н20-Н20, С9>

где А г ДНК - учитывает изменение свободной энергии за счет внутримолекулярных сил, включающих водородное связывание и стэ- , кинг-взаимодействие; ДИМ^О+ионы) - содержит-слагаемые, соответствующим разным типа» связывания воды с ДНК (водородное связывание, взаимодействие с ионами, гидрофобное взаимодействие); А Рч10~НлР - учитывает изменение взаимодействия связана* вода - объешая вода.' В общем случае независимое количественное опре- ^ деление разных вкладов в общую энергию стабилизации спиральной структуры ДНК затруднено.

Тем не менее полученные результаты позволили оценить энталь-пийнуп составляющую первого и второго слагаемых уравнений (9).

С энергетической точки зрения " но молекулу воды можно считать "связанной", еели ее энергия взаимодействия

л£(п;} - В/(10)

о соответствупцим гидратно-активным центром превыпает среднюю 1 -энергию взаимодействия вода-вода Е0 в *вдкой фазе, равную 9,7 юсал/моль в пересчете На две Н-связи. В этом случае полная . энергия гидратации ДНК (Егид.) равна;

£ги? =£п;аЕ; V. <И)

где - п; - число молекул воды на нуклеотвд с энергией взаимодействия л £,' , А/ .- число молекул воды в гидратной оболочке 20 для В - формы ДНК). .

На рис. 13А приведена зависимость А Е^ {п;) , полученная на основании различных методов-ыикрокалориметрии, ИК-спектроскопии, пьезогравиметрии и термогравиметрии. Видно, что эта зависимость; в пределах точности экспериментов представляет монотонно убывающую функцию.

Проведенный с помощью калориметрических измерений (ряс. 13В) расчет теплоемкости' Ср (кр.1) воды гидратной оболочки и приведенной энтальпии перехода А&/п ДОС (кр.2) показал, что I) "пик" теплоемкости связанной воды находится в интервале /г — 4+10, когда формируется А-форма ДНК; 2) приведенная энтальпия перехода

лН/п не зависит от л . Это свидетельствует о том, что наблццавиое" изменение теплопоглоцения связано в значительной сте-- пени с изменением структуры гддратного окружения системы ДНК-вода. Подученные результаты с учетом зависимости л £/ {п] позволяет заключить, что основной энергетический эффект гидратации обусловлен образованием А-формы, в то время как переход в В-форьгу не " V ' • 32 -

Рис.13. А. Зависимость энергия гидратации ДНК Л от П . Б. Зависимости частот У и интенсивностей & от п для полос поглощения дезоксирибозы (а - 970 см-1, б - 1053 см-*) и азотистых оснований (в - 1577 см-1). Пунктиром изображена термогравиметрическая зависимость. В. Зависимость теплоемкости (Срвода) сорбированной воды (кр.1) и приведенной энтальпии (кр.2) дН/я от п.

требует больших энтальпнйных затрат и имеет тем самый, по-видимому, энтропийную природу. Можно предположить, что стабилизация В-ДНК достигается за счет возрастания энтропии системы ДНК-вода-ионы при переходе из "жесткогидратиро ванно й" А-формы в "мягко-'гвдратированную" В-форму. Этот вывод находится в соответствии с концепцией "экономии гидратации" (Зенгер и соавт., 1986).

- Основываясь на ИК-спектроскопических данных на рис.13Б, можно разбить гидратную оболочку.ДНК на три слоя: моногидратньгй, "А-формиругаций" и"В-формирующий". Такое деление гвдратной оболочки, знание энергии Н-связей и зависимости л Е;(п) позволил оценить вклад энергии гидратации и стэкинг-взаимодействия в энтальпию стабилизации спиральной структуры В-формы ДНК, а именно, величина энергий гидратации ДНК в соответствии с формулой (II) равна: у а м ^ 4 Ещд. п/ дЕ; п* д£к + ^ /7/ а +

¿-1 к*1 '

"в

+ 7. Лт А £т ~ /О/, +24 + Р;? ~ /3;

Однако не вся эта энергия необходима для стабилизации спирального состояния ДНК, е только два послэдних члена,поскольку образование В-формы ДНК происходит при сорбции молекул воды в интервале 6 < П ^ 20. Таким образом, соответствующая энергия гидратации на один куклеотид составляет величину ~ 3,0 ккал/моль. Средняя энергия одной Н-связи в паре составляет 1,0 ккал (табл.1), для средней пары по этим оценкам энтальпия стабилизации за счет гидратации и водородного связывания, соответственно, равны 6 ккал/моль и 2,5 ккал/моль. Известно, что энтальпия перехода при плавлении 3-формы Д1К во влажных пленках лН^ 9,6 ккал/моль (Андроникошвили с соавт., 1973, Гасан,1988) и поэтому на энергию взаимодействия для парк азотистых оснований в стопке приходится ~ 1,0 ккал/моль. ч

Таким образом, приведенные оценки энтальпии 1-го и 2-го членов уравнения (9) показывают, что вода вносит.значительный вклад в стабилизацию спиральной структуры ДНК.

Гидратация и молекулярный механизм сформирования динамической структуры ДНК. Совокупность экспериментальных данных, результатов теоретических расчетов и оценок, полученных при изучении гидрата-

ции и структурного состояния нуклеиновых кислот разного уровня организации, позволило в работе рассмотреть наиболее общие зачо-; номерности формирования упорядоченных динамических структур ДНК в конденсированном состоянии при взаимодействии их с водой.

Независимо от уровня организации нуклеиновых кислот начальная стадия сорбции воды сопровождается одновременным связыванием ее молекул с гидратно-активныиицентрами азотистых оснований и катион-сахаро-фосфатными группами. При этом в процессе формирования полного моногидратного слоя (для ДНК п.— б, двунитевых по-линуклеотидов п. — 3-4) молекулы воды вступают во взаимодействие с центрами гидратации с различной энергией (рис.13), понижая свою энтропию, что видно из найденной нами (кр.1) зависимости дифференциальной энтропии "от п (рис.14). Однако структура по-линуклеотидной матрицы ДНК не претерпевает никаких изменений, находясь в Р - форме, характеризующейся искривленными Н-св^зями " в уотсон-криковских парах и отсутствием упорядоченных стопок азотистых оснований, подвижность кот&рых (кр.З), как и сахаро-*г>с-фатного остова (кр.4) минимальна (Жардэцкий, 1983, Брадес,1986>.

Изучение фазичосгсой природы ззаимодействия молекул воды в моногидратном слое показало, что при этом происходит такое перераспределение электронной плотности на гетероциклах и сахаро-фос-фатных группах, которое сопровождается различной степенью изменения порядков связей и поляризуемостей взаимодействующих атомов. Вместе с гидратно-активными группами поляризованные молекулы воды при этом образуют активный моногидратный слой, способный связывать поступающие новые порции молекул воды.

Дальнейшая сорбция воды до П — 10-12 приводит к "размораживанию" псевдовращения дезоксирибоэы, к увеличению амплитуды подвижности элементов структуры ДНК (кр.З и 4) и ее гидратной оболочки (кр.1), что способствует замыканию отдельных атомных групп , через "мостики" молекул воды. Возникшие связи сближают атомные группы нуклеиновых кислот и "закручивают" азотистые основания вокруг гликозидных связей так, что при этом происходит усиление Н-связей в уотсон-криковских парах, связывание фосфатов по цепи и появление стзкинг-взаимодействия (кр.2. и 5). Это сопровождается формированием "десткогидратированной" спиральной А-формы ДЩ, -

Реалистичность существования в такой структуре, как показы-, вало теоретическое рассмотрение, динамического взаимодействия в упорядоченных стопках азотистых оснований на колебательных уровнях позволяет указать каналы - взаимодействующие карбонильные

35 :" .. ■

Рис.14. Зависимости дифференциальной эн-' тропии (I), интенсивности (2) и частоты 20 (5) полосы поглощения 1576 см-1, амплитуды подвижности (1/1^ азотистых оснований (3> и фосфатных групп (4) ДНК от п .

колебания вдоль полинуклеотидной матрицы. По этим каналам может передаваться вибронная энергия при коллективных взаимодействиях солитонного типа (Давьщов, 1979), что имеет по-видимому смысл при функционировании нуклеиновых кислот в живых системах.

Для формирования В-ДНК и ее полной гидратной оболочки (N с? 20 молекул воды) требуется -дополнительное увеличение активности воды и присутствие примесных солей. Эти молекулы воды, взаимодействуя с фосфатами, приводят к разрыву водных "мостиков" между ними (фосфаты становятся гидратированными индивидуально).При этом так же происходит перераспределение связанной воды в желобках ДНК. Все это, с одной стороны, сопровождается существенным увеличением амплитуды движения сахаро-фосфатного остова (кр.4) и азотистых оснований (кр.З), с другой стороны, приводит к смещении катионов и- проникновению их в гидратную оболочку. Очевидно перестройка гидратной структуры главного и минорного желобков ДНК приводит к переходу ее в стабильную "мягкогидратированную" и вместе с тем динамическую структуру В-формы. Такие свойства "главной молекулы" жизни облегчают вшолнять ей основные функции в живой клетке.

Таким образом, проведенные исследования выявили закономерности формирования гидратных структур ДНК, выяснили механизмы влияния гидратации и изменения температуры на стабильность ее кон^ормаций. . . 36

Это позволило углубить существующие представления о стабилизирующей роли воды в построении спиральных структур нуклеиновых кислот.

Глава У1. ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ НА ГЭДРАТАЦИЮ И СТРУКТУРНОЕ СОСТОЯНИЕ ДНК

Высокая надежность и результативность комплексного подхода для исследования гидратации нуклеиновых кислот разного уровня организации позволили применить его для изучения влияния гидратации на балее сложные надмолекулярные структуры - дезоксинуклеопротеи-ды <ДНП) и комплексы ДНК с биологически активными веществами.

В этой главе излагаются результаты исследования гидратации ДНИ и комплексов ДНК с этидием бромидом и кофеином в конденсиро--ванном состоянии.

Сравнительный анализ спектров ДНК и ДНК с этидием бромидом (Р/д = 4) свидетельствует' о том, что при низких ОВ (до 58%) бромистый 'зтидий непосредстзенно не взаимодействует с азотистыми основаниями ДНК, но, находясь на ее поверхности, оказывает дегидратирующее влияние на сахаро-фосфатный остов. В интервале 56-92^ ОВ происходит, как известно, формирование вторичной структуры ДНК, которое сопровождается избирательной интеркаляцией бромистого эти-дия преимущественно.в Г-Ц-пары со стороны минорной бороздки ДНК и при ОВ, равной 92заканчивается формирование гидратной оболочки комплекса'ДЦК-бромистый этидий. При этом в местах интеркаляции бромистого этидия искажается не только структура ДНК, но и ее гид-ратная оболочка.

Исследование гидратации системы кофеин-ДНК в пленках выявило другой тип связывания нуклеиновой кислоты с лигандом. Оказалось, что образование кошлекеа кофеина с ДНК происходит по модели внешнего связывания с участием катион-фосфатньк групп. При этом степень гидратации ДНК уменьшается на 3-4 молекулы воды в пересчете на нуклеотид без деформации спиральной структуры ДНК.

Выяснение влияния воды на механизм взаимодействия ДНК и белка исследовано на естественном комплексе - ДНП. Проведенный сравнительный анализ зависимости пьеэогравиметрических изотерм и спектральных параметров полос поглощения от ОВ и п. для ДНП,ДНК и суммарного гистона показал, что по уровню сорбции воды ■чти вещества могут быть расположены в ряд:

ДНК > ДНП ■> суммарный белок

Установлено, что неаддитивность гидратации составляет 10% и она зависит от состава белково-нуклеи^ового комплекса и взаимо-

действующих функциональных групп.

По характеру зависимостей спектральных параметров идентифицированные полос поглощения ДНП найдены интервалы формирования А- и В-форм ДНК и белковых«* иуЗ - структур. Установлено, что переход ДНК в составе ДНП в спиральную конформацию происходит при более низких ОВ и ее гидратная оболочка содержит на 2-3 молекулы меньше в пересчете на нуклеотид, чем ДНК в свободном состоянии.

ВЫВОДЫ

1.Проведена классификация характера зависимостей спектральных параметров полос поглощения сахаро-фосфатных групп и азотистых оснований нуклеиновых кислот разного уровня организации в конденсированном состоянии от содержания воды. Характер изменения эти* полос отражают процесс гидраташи и изменения конформации нуклеиновых кислот.

2. С помощью высокочувствительного пьезогравиметрического метода впервые получены изотермы гидратадии нуклеотидов, полинуклео-

' тидов и ДНК разного происхождения. Анализ их с помощью современных представлений адсорбции позволил получить термодинамические пара- . метры гидратации и классифицировать гидратно-активные группы нуклеиновых кислот по энергии связывания с молекулами воды.

3. На основании анализа ИК-спектроскопических и рентгенострук-турных данных показе.-и, что связывание молекул воды гидратно-ак-тивными атомными группами азотистых оснований в водных растворах энергетически предпочтительнее, чем образование водородно-овязан- ' ных пар азотистых оснований.

4. Показано, что сорбция воды при низких относительных влаж-нсстях на пленках солей мононуклеотидов 'АМФ, ТМФ, ИЗ и сопровождается "красным" сдвигом и ростом интенсивности полос поглощений вне- и внутрикольцевых колебаний азотистых оснований и сахаро-фосфатных групп. В рамках квантово-химического расчета электронной плотности методом ПГЩП/2 в базисе з/><1 - волновых функций эти эффекты качественно объяснены связыванием молекул во-ч ды гидратно-активными группами нуклеотидов.

5. Обнаруженные "резкие" изменения спектральных параметров полос поглощения азотистых оснований и сахаро-фосфатных групп при гидратации нуклеотидов и полинуклеотидов, включая ДНК, объясне-

■ны соответственно их кристаллизацией и переходом полимерных нуклеиновых кислот в спиральное состояние.

6. ¿нализ тонкой структуры полученных спектров полинуклеоти-

. 38

дов на основании теории молекулярные экситонов позволил в ци-поль-дипольном приближении объяснить высокочастотные сдвиги,давы-довское расщепление и 11К-гипохромизм вне- и внутрикольиевчг колебаний азотистых,оснований и уточнить структурные чодечи некоторых полинуклеотидов.

7. Экспериментальный и теоретический анализ иастотны сдвигов и' интенсивностей полос поглощения при ИК-спектроскопическом изучении гидратации ДНК показал", что при низких относительных ■ влажностях происходит одновременная гидратация азотистых оснований и катион-сахарэ-фосфатных групп.!

8. Исследование ИК-спектров и изотерм гидратации нуктгиновы/ кислот'разного уровня организации позволило заключить, что для формирования спиральных структур необходимо дополнительное количество молекул воды. Ло энергии связывания и конформационному состоянию ДНК ее гидратная оболочка разделена на три ело*: чоно-гидратный ( п = 5-6), "А-формируадий" ( п -- 3-4) и "В-<Торми-руюций" ( П. - 8-10) слои.'Изучение термоустойчив ::сти гидратнор оболочки В-формы ДНК показалочто разрушение спиральной структуры сопровождается разругаением гидрйтных слоев в трог температурных интервалах: лТт .= 32-45°С, дТ2 = 70-57°С и л 7] = 100-112°С.

9. При исследовании системы ДНК-вода при нгтзких температуре/ (_50°С+ - 180°С) обнаружены две фракции (невымерзагощеП и вымерзающей) воды, которые различаются по энзргии водородного связывания с ДНК. Оценки показали, что относительный вклад этих фракций воды зависит от содержания солей в исследуемой системе. Найдена высокая обратимость структурных изменений ДНК, наблюдаемых при низких температурах, что имеет важное значение для выбора оптимальных условий криоконсервации генома.

10. Впервые на основе ИК-спектроскопических, пьезогравиметри-ческих и калориметрических данных получено распределение 20 молекул воды гидратной оболочки.В-формы ДНК по энергии связывания с ее гидратно-активными■группами. Показано, что энергетический эффект, связанный с' образованием упорядоченной А-формы в интервале П = 5+10, в большей степени обусловлен взаимодействием ДНК с гидратным окружением. В то же время переход из А - в В--форму не требует заметного энтальпийного вклада, в связи с чем предположено, что стабилизация В-ДНК достигается за счет, возрастания энтальпии системы ДНК-вода при переходе из "жесткогидрати-рованной" А-формы в "мягкогидратированную" В-форму.

'39

11. Проведены оценки энтальпийного вклада в энергию стабилизации спиральной В-формы ДОК Н-связей уотсон-криковских пар, стэ-кинг-взаимодействия и гидратной оболочки ДНК. Показано, что эа счет взаимодействия с водой вносится значительный вклад в общую • энергию стабилизации спиральной структуры В-формы ДНК.

12. Анализ зависимости дифференциальной энтропии ¿aS/Эя от числа сорбированных молекул воды п показал, что подвижность воды при переходе ДНК в спиральную конформацию возрастает, при этом увеличивается подвижность азотистых оснований и сахаро-фос-фатного остова ДНК. Эти -данные совместно с ИК-спектроскопическк-ыи результатами о характере изменений спектральных параметров поглощения азотистых оснований и сахаро-фосфатного остова при изменении содержания воды и температуры, а также калориметрические данные об энергетике гидратации свидетельствуют о том, что динамика структурных переходов ДНК обусловлена ее взаимодействием с молекулами воды.

13. На основании полученных экспериментальных данных и теоретических расчетов предложен молекулярный механизм формирования упорядоченных А- и В-форм ДНК в конденсированном состоянии.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Малеев В.Я., Семенов М.А. Гиперхромизм нуклеиновых кислот -в инфракрасной области.// Биофизика. - 1971. 17, в.З. - С.389-■397.

2. Малеев В.Я., Семенов М.А., Шостенко А.Ю. ИК-гипохромизм пленки ДНК при изменении ее влажности // Тез.докл. Всесоюз.конф. по спектроскопии растворов биополимеров. - Харьков, 1971. -С.25.'

3. Семенов М.А.,Гасан А.И.,Малеев В.Я. Исследование процесса термического разрушения фага Tg и его компонентов методами Ж-спе-

- ктроскопии и адиабатической калориметрии // Докл.АН СССР. -1971. 198, №6. - C.I449-I45I.

4. Гасан А.И., Семенов М.А., Малеев В.Я., Давьщов М.И., Блок Л.Н., Кабутовская Л.Ы. Спектроскопическое исследование термической устойчивости ДНП // Тез.докл. Всесоюзной конференции по спектроскопии растворов биополимеров. - Харьков. ИРЭ АН УССР.19^1. - С.13-14.

5. Малеев В.Я., Семенов М.А., Белов Ю.А. Гипохромизм нуклеиновых кислот на колебательных уровнях // Тез.докл., 1У Международного биофизического конгресса. - Москва. - 1972. - С,238.

6. Семенов М.А., Шестенко А.Ю. Спектральные параметры полос по. глощения карбонила в области 1620-1780 см"1, полученные для-некоторых карбоксил содержащих веществ в растворах Д2О //Тез. докл. - П Всесоюзная конференция по спектроскопии биополимеров. - Харьков. Ин-т радиофизики и электроники АН УССР. -1974. - С.95-96. 7.. Семенов М.А., Сухоруков Б.И., Малеев В.Я-. и др. ИК-спектро-скопическое исследование структурных превращений в системе ДНК-вода. В кн.: Конформационные изменения биополимеров в ^растворах. Мат. Ш Всесоюзной конференции. - Тбилиси, Институт физики ГССР. 1975. - С.40-41.

8. Семенов М.А., Суэтова В.П., Малеев В.Я. Исследование спектральных параметров полос поглощения нуклеотидов и их комплексов в области 1200-2400 см в Д2О при различных температурах // Тез. докл. Ш Всесоюзная конф. tío спектроскопии

, биополимеров. - Харьков: Институт радиофизики и электроники АН УССР. -1977. - C.I09-II0.

9. Семенов. М.А., Малеев В.Я..Сухоруков Б.И.,Шабарчина Л.И. Тем. пературная аномалия воды, сорбированной на ДНК по данным ИК-

спектроскопии // Тез.докл. Ш Всесоюзная конференция по спектроскопии биополимеров. - Харьков, 1977. - С.108-109. Ю.Семенов М.А., Малеев В.Я., Сухоруков Б.И. Исследование стабильности гидрата ДНК методом термогравиметрии // Биофизика.

- 1978, 23, в.6. - C.I097-I098.

П.Малеев В.Я., Семенов М.А., Блок Л.М. Продольный гиперхромный - эффект у полинуклеотидов в инфракрасной области // ДАН УССР.'

- 1970. Сер.Б. - С.448-451.

12.Семенов М.А.., Сухоруков Б.И.-, Малеев В.Я., Шабарчина Л.И. Исследование температурной аномалии воды, сорбированной на ..ДНК, методом ИК-спектроскопии // Биофизика. - 1979. - 24, ' в.2. - С.210-216.

ТЗ.Семе|Нов М.А., Суэтова В.П. Исследование спектральных пара-■ метров полос поглощения нуклеотидов в, области 1000-2400 см"'' в' рас.творах flgO при различных температурах // "Молекулярная генетика, и биофизика". - Киев. Изд-во К1У, 1979^- С.24-31. 14.Сухоруков Б.И. Семенов М.А., Малеев В.Я«, Шабарчинй Л.^Исследование структурных превращений сахаро-фосфатной.цепи иазо'

тистых оснований гидрата ДНК методом ИК-спектроск'опии // Биофизика. - 1979. 24, в.4. - C.6II-6I9.

15. ¡Лабарчина JI.II., Сухоруков Б.И., Семенов М.А. j Малеев ВЛ. Исследование температурной зависимости ИК-спектра Y ~ облученной ДИК // Тез.докл. симпозиума по механизмам радиационного поражения и восстановления нуклеиновых кислот. Пущино. 1980. - С.41.

16. Sukhorukov B.I., Semenov M.A., Maleev V.ïai, Shabarchina L.I. IR-spectroscopic study of structural transitions of hydrate shell, sugar-phosphate chain and nucleic bases of DNA hydrate// Studia biophysica.- 1980. 2â." P-75-76.

17. Semenov M.A., Sukhprukov B.I., Maleev V.Ya. Infrared studies of hydration mechanism and conformation state of DNA.

В кн.: Симпозиум по биофизике нуклеиновых кислот и нуклеопро-теидов. - Таллин, IS3I. Г-6, - С.175.

18. Семенов М.А., Больбух Т.В. Резонансные взаимодействия карбонильных колебаний в спиральных полинуклеотидах и ДНК // Тез. докл. 1У Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров. - Харьков. 1981. - С.162.

19. Семенов М.А. Исследование спектральных параметров полос по-t глощения полинуклеотидов в области 1500-1800 см-* в Д20 //•

Тез. докл. 1У Все ;юзной конференции по спектроскопии биополимеров. - Харьков, 1981. - С.162-163.

20. Semenov М.А., Bolbuch T.V. Investigation of conformations-depending hydration isotherms for.DM.

В кн.: Симпозиум по биофизике нуклеиновых кислот и нуклеопро-теидов. - Таллин, 1981. Г-7. - с.176.

21. Семенов М.А.,Сухорукое Б.И., Малеев В.Я, Гидратируются ли азотистые основания в ДНК при низких влажностях?// Биофизика

- 1981. 26, в.6. - С.979-984.

22. Больбух Т*В., Семенов М.А. ИК-спектроскопическое исследование "гидратации пленок полинуклеотидов // Тез.докл. 1У Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров. - Харьков. 198Г.

- С.24. ,

23. Семенов М.А. Экспериментальное исследование энергетического вклада гидратации в стабилизацию спиральной структуры. ДНК // Тез. докл. I Всесоюзный биофизический съезд. — Москва,1982.— С.58. • ■

24. Больбух T.B., Семенов M.А. Исследование изотерм гидратации ДЖ, полученных методом пьезочлектрического микровзвешивания // Тез.докл. I Всесоюзный биофизический съезд. - Москва, 1982, - 58-59. '

25. Семенов М.А., Больбух Т.В. Резонансные взаимодействия колебаний в ДНК-подобных спиральных полинуклеотидах // Тез.докл. -Москва, 1982. - С.82.

2о. Семенов М.А., Больбух Т.В. Резонансные взаимодействия карбонильных колебаний в спиральных полинуклеотидах // ДАН УССР,-1982. - Сер."Б", »12, - С.66-69.

27. SemeriQv U.A., Bolbukh T.V. Investigation of conformations-depending .hydration isotherms for DNA // Studia hiophysica.-1982.- §2, N 213.- p.227-228.

28. Семенов ¡i.A., Больбух T.B., Малеев В.Я. Гидратация двухспи-р&льного полинуклеотида поли А . поли У по данным ^-спектроскопии и пьезогравиметрии // Тез.докл. У Всесоюзной конференции по. спектроскопии биополимеров. - Харьков. 1984.-С.199-201.

29. Семенов М.А., Стариков Е.Б. ИК-спектроскопическиЯ анализ вторичной структуры транспортных РНК и резонансные взаимодействия карбонильных колебаний // Тез.докл. У Всесоюзной конйе-' ренции по спектроскопии биополимеров. - Хаоъков. 1984. -

С.201-202. * г :

30. Semenov М.А. and Bolbukh T.V. Carbonyl vibration resonance interactions of helical polynucleotides Poly(dA)•Poly(dT) and Poly G'Poly С // Studia biophysica.- 1984.- 102, N 3-- P-2I5-22C

31. Семенов М.А. ИК-спектроскопическое проявление гидатации и конформационного состояния ДНК // Молекулярная генетика и биофизика. - Киев: КГУ, 1984. - С.25-33. '

32. Семенов М.А.Больбух Т.В. Исследование конформаштонно-зави-симых изотерм гидратации ДНК // Биофизика. - 1984. 29, в.З,- . - 377-382. - - • „' , ' •

33. .Семенов М.А., Малеев В.Я. ИК-спектроскопические и термодинамические аспекты гидратации пленок нуклеиновых кислот //

. Тез.докл. У Всесоюзная конференция по спектроскопии биополимеров. - Харьков, 1984. - С.200-201.

34. Semenov М.А., Bolbukh t.v.t Starikov E.B. Infrared-spectroscopic study of the hydration of polyaderiylic acid potassium salt films // Studia biophysica.-"1935. 106. N 3-- p.I8I-I92,\

35. Кашпур В.А., Семенов М.А., Больбух Т.В., Малеев В.Я. Сравни- • тельный анализ гидратации нуклеиновых кислот и их компонентов. Симпозиум с участием стран-членов СЭВ 1л C3PD "Фиэико-хи-

ыические свойства биополимеров в растворе и клетках 0" // Jea, . . докл. - Пущино. 1985. С.23.

36. Больбух Т.В., Семенов М.А. Изотермы гидратации полинуклеоти- • дов // Биофизика. - 1985. - 30, в.3.-/С.409-413.

37. Семенов М.А., Больбух Т.В. ИК-спектроскопическое исследова-f . ние комплексообразования зтидия бромида с.ДНК во влажных пленках. В кн.Информационные изменения биополимеров в растворах. Материалы У1 симпозиума. Тбилиси, Мецниереба, 1985. -С.151.

23. Bolbukh T.vi, Starikov Е.В., Semenov М.А. The hydrate-ion Of double-helical poly(rA) films by IR-spectroscopy and piezo-', microbalance // Studia Biophysica.- 1985. 108, N 3.- p.I99-207 ' .

39. Семенов М.А., Малеев В.Я. Энергетика гидратации ДНК // Тез." докл. Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках. - Пущино. 1985. - С.27. ' ' . .

40. Семенов М.А., Больбух Т.В., Малеев В.Я. Исследование гидратации двухспирального комплекса поли А.поли У методами ИК-спвк-троскопии и пьезогравиметрии // Биофизика. - 1985. 30, в.4, • С,571-577. - • '

41. Семенов М.А., Малеев В.Я. Энергетика гидратации ДНК // Биофизика. - 1986. - 3Tj в.5. - С.764-767.

42.'Maleev V.Уа., Semenov М.А., Gasan A.I. The energetic aspecta Of

dna. hydration.- В кн.: Международный-симпозиум "Физико-хи-мия ДНК и молекулярные механизмы функционирования генома. -. Тбилиси. Мецниереба, 1987, с.36-37.

43. Семенов М.В., Больбух Т.В. Исследование комплексообразования бромистого этидия с ДНК во влажных пленках методом инфракрасной спектроскопии // Биополимеры и клетка. - 1987. -

• 3, № 5. - С.234-240. -

44. Semenov М.А. IR-spe'ctra of hydrated nucleic asids. XVIIIth European Congress on Molecular Spectroscopy. Abstracts, Amsterdao.-1987.- p-263 •

45. Semenov M.A., Starikov Б.В. On infrared spectroscopic analysis , (of .^transfer RNA secondary structure // Studia biophyaica.,-

X98ip.- T20, ,H 2.- p. 187-196..

45. Kashpur V.A., Semenov U.A., Maleev V.Ya. Interaction of nucleic acid monomers with water. Book of abstracts WATOC 87.- Budapest,

1987. PBj50,- p.267.

47. Семенов U.A.-, Кашпур В.А., Больбух T.B., Малеев В.Я. Исследование гидратации компонентов нуклеиновых кислот методами инфракрасной спектроскопии.и сверхвысокочастотной диэлектромет-рии // Биополимеры и клетка. - 1987. - 3, № I. - С.18-22.

48. Semenov М.А., Starikov Е.В., Bolbukh T.V. Hydration Isotherms And The Structural State Of Nucleotides. And Polynucleotides. International symposium "Physico-chemistry.of.DNA and molecular mechanisms of genome functioning" // Abstracts.- Tbilisi.: Metsnierebe, 1987.- p.32

•49. Веревкин А.Г., Березняк Е.Г., Семенов М.А., Малеев В.Я. Сравнительный анализ состояния нативной и денатурированной'ДНК во влажных пленках при низких температурах // Тез»до*л.У1 конференции по спектроскопии биополимеров. - Харьков. ИРЭ АН УССР.

1988. - С.69-70.

'50. Суэтова В.П;, Семенов H.A., Больбух Т.В., Красницкая A.A.

Гидратация ДНД по даннш пьезогравиметрии и ИК-спектроскЬпии // Тез.докл. У1 конференции по спектроскопии биополимеров. -- Харьков. 1988. - С.290-291.

51. Семенов U.A., Скуратовский И.Я., Больбух Т.В., Липанов A.A. Сравнительный анализ структурных моделей поли дА.поли дТ по данным ИК-спектроскопии и расчета резонансных частот // Тез. докл.,У1 конференции по спектроскопии биополимеров. - Харьков. IS88. - G.265-2ÔÔ, , ; \ .

52. Семенов-М.А., Березняк Е.Г. ИК-спектроскопические особенности гвдратации одно- и двухспиральных полинуклеотидов поли рГ и Поли рЦ // Тез.докл. У1 конференции по спектроскопии биополимеров., - Харьков., Л988. - С.264-265.

53. Больбух Т.В., Семенов М.А., Малеев В.Я.'Особенности гидратации клубковой и спиральных форм поли рЦ // ТеЬ.докл. У1 конференции по спектроскопии биополимеров. - Харьков. 1988. -254-265. ^ '... -

54. Шестоп'алова A.B., Семенов М.А..Больбух Т.В. ЙК-спектроскопи-ческое изучение гидратации кофеина и его влияние на гвдратное окружение ДНК // Тез.докл, У1 конференции по спектроскопии

бистолимеров. - Харьков. 1988. - С.322-323.

' • -

Се;.;>но5 ¡'.А., Старик J б Е.Б., Больбу:-: Т.В., Малеев В. а. Гидратация сдносниоальноР поли рЦ по данный 'Г'-спектроскопин и пьезэгравиметрии // Биофизика. - 1989. 34. в.З. С.335-353.

jC'. Semenov Л1.А., Starikov Е.В., BoXbukh T.V. Hydration Isotherms and Structural State of Nucleotides and Polynucleotides // Studia Biophysics.- T93S. T2£, N 5.- p.217-224.

■Л. Веревкин А. Г., Семенов 'Л. к,, '.'.аленв В.Ч;, Березняк Е.Г. Ближний' нкзких температур ча ион-гидратную оболочку и конфэрмациго ДНК // Тез.докл. международной конференции: Достижения и перспективы разбит¿1ч криобиологии и криомедлцины. - Харьков, 1988. С.12.

38. Semenov at .A.-, Starikov E-E.,.Pedash Y.R. IH-srectroscopic and cuantumehenii cal study of hydration of mononucleotide.-Book of ahstracts International Symposium on the Electronic Structure and Properties of Moleculs and Crystals, ZagreT-.' ■ 1988,- P.21.

59. Семенов :J.A,, Гасан А.Я., Малеев В.л. Гидратация и структурные переходы ДНК в пленках // Равновесная динамика структуры биополимеров. Лзд-во Наука. 1889. - С.

60. Стариков Е.Б., Семенов ¡¿.А. Ж-спектроскопическое и квинтово--химическое изучение гидратации динатриевой соли цитидин- 5' -монофосфат // >Пу: :ал few.химии. - 1938 . 42, "-8. - С.2120-2125.

Информация о работе

Семенов, Михаил Алексеевич
доктора физико-математических наук
Москва, 1989
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы