Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Энергетика взаимодействия в нуклеиновых кислотах: анализ термодинамики модельных систем

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Энергетика взаимодействия в нуклеиновых кислотах: анализ термодинамики модельных систем"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ

На правах рукописи

УЛК 577.323

ГУКОВСКИЯ Илья Яковлевич

ЭНЕРГЕТИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТАХ: АНАЛИЗ ТЕРМОДИНАМИКИ МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ

03.00.02 - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Пущино - 1990

Работа выполнена в Институте биологической физики АН СССР.

Научный консультант: доктор хим. наук Б.И.Сухоруков

Официальные оппоненты: доктор фиэ.-мат. наук, профессор

В.Я.Малеев

доктор физ.-мат. наук В.И.Полтев Ведуетая организация: Институт молекулярной биологии АН СССР

Защита состоится:" О.'О" / .1. 1990 г. в _ часов на

заседании Специализированного совета К 002.61.01 при Институте биологической физики АН СССР по адресу: 142292 г.Пущино Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологической Физики АН СССР.

Автореферат разослан "_"_1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета канд. биол. наук

Л.В.Сложеникина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение энергетики взаимодействий, определяющих пространственную структуру, стабильность и функционирование нуклеиновых кислот, - одно из Лундаментальных направлений молекулярной биофизики. Целью исследований является, с одной стороны, определение термодинамических параметров этих взаимодействий: стэкинга и Н-связывания оснований, электростатического взаимодействия фосфатных групп и их экранировки противоионами, гидратации? а с другой - анализ энергетики различных элементов структуры нуклеиновых кислот: регулярных спиралей, "шпилек" и т.д. Их результаты используются при решении широкого круга задач - от теории денатурационных профилей ДНК (Warteil et al., 1985) до моделирования самосборки РНК в процессе биосинтеза и путей предбиологи-ческой эволюции (Orgel, 1986). Однако, несмотря на большой объем накопленной информации (Кантор, Шиммел, 1980; Hinz, 1986), оба аспекта проблемы исследованы совершенно недостаточно. Отметим хотя бы, что энергетика Г-Ц взаимодействий экспериментально изучена весьма слабо по сравнению со структурообразованием с участием А-Т и А-У пар. Практически не исследована в растворе термодинамика взаимодействия спирали с ее ион-гидратным окружением (Семенов, 1989); но и понимание энергетики более изученных стэкинга и Н-связывания в нуклеотидных системах разного структурного уровня далеко от полноты.

Актуальность проблемы стала еще более очевидной в свете недавних экспериментальных исследований, обнаруживших структурную гетерогенность двойной спирали (Dickerson et al., 1982), т.е. корреляцию между первичной и вторичной структурами нуклеиновых кислот, несомненно играющую важную роль в функционировании генома. Такая корреляция определяется локальными различиями в энергетике взаимодействий вдоль полинуклеотидной цепи, которые остаются во многом неизученными.

Анализ энергетики нуклеиновых кислот проводится ка разнообразиях модельных системах: мономерных ассоциатах, олигонуклеотидных, юлинуклеотидных и полинуклеотид-мономерных комплексах (Зенгер, L984) . Комплексы полинуклеотид-мономер являются простейшими си-:темами кооперативной адсорбции на линейной матрице и наиболее щекватными моделями для исследования неферментативного матричного синтеза и предбиологической эволюции. Однако этот класс спи-эальных структур изучен гораздо хуже, чем другие системы, и его 'никальные особенности не использовались в исследованиях термоди-!амики нуклеиновых кислот.

Среди экспериментальных методов исследования нужно особо выделить калориметрические, дающие прямую, не зависящую от модельных представлений, информацию. Но большая часть сведения об энергетике нуклеиновых кислот получена с помощью непрямых методов, использующих уравнение Вант-Гоффа. Сопоставление калориметрической ДН

кал

и Вант-Гоффовской АНот, величин энтальпии оказалось весьма плодо-ы

творным в термодинамике белков (Pri.val.ov, 1979; БЪи^еуап!:, 1987) применительно к нуклеиновым кислотам этот подход развит слабо.

Целью работы было выяснение закономерностей энергетики взаимодействий в нуклеиновых кислотах на основе анализа термодинамики модельных нуклеотидных систем. С использованием специфических особенностей комплексов полинуклеотид-мономер решались следующие основные задачи: 1) выяснение вклада энтальпийной и энтропийной составляющих электростатического взаимодействия фосфатных групп и их экранировки противоионами в энергетику спиральных структур;

2) определение с помощью прямого калориметрического метода термодинамических параметров Г-Ц взаимодействий в системах с каноническим и неканоническим спариванием оснований: Г-Ц, Ц-ЦН+ и Ц'Г-ЦН+;

3) выявление корреляций "химическая структура - термодинамические свойства" в АУ и ГЦ комплексах полинуклеотид-мономер при изменении (а) числа и местоположения фосфатных групп, (б) природы сахарного остатка мономера, (в) молекулярно-ионного равновесия компонентов системы; 4) анализ соотношения величин ДНкдл и ДНВГ, направленный на выяснение применимости модели взаимодействия ближайших соседей и модели двух состояний для описания термодинамики спирали; 5) выяснение природы кооперативности конформационных переходов в нуклеиновых кислотах, роли энтропийного фактора и проявления полярности хода цепи в энергетике рибо- и дезоксирибонуклеи-новых двойных спиралей.

Научная новизна. Впервые проведен систематический анализ термодинамики взаимодействия полинуклеотид-мономер. С помощью сканирующей микрокалориметрии определены термодинамические характеристики 14-ти трех- и двуспиральных комплексов поли(У) с адениновыми и поли(Ц) с гуаниновыми нуклеозидами и нуклеотидами, в том числе ранее не обнаруженных, а также двойных спиралей в поли(У) и протони-рованной поли(Ц).

Показано, что истинная (калориметрическая) энтальпия комплексо-

образования не меняется при изменении заряда на фосфатной группе

мономера. Обнаруженное постоянство ДН служит прямым эксперимен-

кал

тальным доказательством энтропийного механизма стабилизации спирали за счет экранировки фосфатных групп противоионами.

Выяснены закономерности изменения степени ионизации поли(Ц)при образовании двойных и тройных спиралей с участием протонированной поли(Ц). Это позволило впервые определить истинные значения термодинамических параметров неканонических структур Ц-ЦН+ и Ц-Г-ЦН+.

Прямым калориметрическим методом определена энтальпия Г-Ц пары в структуре двойной спирали, которая составляет 56.5 кДж/моль.

Обнаружен эффект влияния изомерии фосфатной группы в нуклеоти-дах на термодинамику их взаимодействия с комплементарными полинук-леотидными матрицами, определяющий один из возможных механизмов возникновения селективности матричного синтеза в процессе предбио-логической эволюции.

Установлен закономерный характер различий между величинами йнкал

и ДН , свидетельствующий о неадекватности модели взаимодействия вг

ближайших соседей для описания кооперативной адсорбции на полинук-леотидных матрицах.

Выявлен реципрокный характер различий в энергетике стэкинг-кон-тактов пар оснований, различающихся полярностью хода цепи, между рибонуклеиновыми и дезоксирибонуклеиновыми двойными спиралями.

Сделан вывод о существенном вкладе ион-гидратного окружения в энергетику стабилизации спиральных структур в нуклеиновых кислотах, несводимом к взаимодействию соседних по цепи пар или троек оснований. Исходя из этого, дано объяснение высокой кооперативно-сти конформационных переходов в нуклеиновых кислотах и вариабельности величин энтропии образования различных пар оснований в спирали, которая в большой степени определяет зависимость энергетики двойной спирали от нуклеотидной последовательности.

Научно-практическая значимость работы. Термодинамические характеристики канонических и неканонических структур, определенные в настоящей работе, могут быть использованы в исследованиях вторичной структуры РНК и ДНК; при построении детальной теории денатура-ционных профилей ДНК; для анализа природы внутри- и межмолекулярных взаимодействий в нуклеиновых кислотах. Полученные данные об энергетике и закономерностях комплексообразования полинуклеотид--мономер необходимы для рационального подбора катализаторов и условий неферментативного матричного синтеза, а также для моделирования возможных путей предбиологической эволюции.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были доложены или представлены на Ш и V Всесоюзных совещаниях по кон-формационным изменениям биополимеров в растворе (Тбилиси, 1975 и Телави, 1980); Ш, IV и V Симпозиумах СЭВ по биофизике нуклеиновых кислот и белков (Чехословакия, 1977; ГДР, 1980 и Венгрия, 1984); Международной конференции по квантовой химии, биологии и фармако-

логии (Киев, 1978) ; VIA Иенском симпозиуме "Узнавание в биополимерах" (ГДР, 1980); Международном симпозиуме по биокалориметрии (Тбилиси, 1981) ; Симпозиуме СЭВ по биофизике нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов (Таллинн, 1981) ; IV Всесоюзной конференции по спе ктроскопии биополимеров (Харьков, 1981); I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982) ; Международной конференции "перспективы биоорганической химии" (Рига, 1982) ; Всесоюзной школе по физике нуклеиновых кислот (Харьков, 1983)? Международном симпозиуме "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках"(Пуии-но, 1985); Международном симпозиуме "Phosphorus chemistry directe< towards biology" (Польша, 1986); Международном симпозиуме "Физико-химия ДНК и молекулярные механизмы функционирования генома (Тбилиси, 1987); Ш Всесоюзной конференции "Современные проблемы эволюционной биохимии и происхождения жизни" (Телави, 1988); Международном симпозиуме "Взаимодействие ДНК с белками и малыми лигандами. Новые подходы" (Тбилиси, 1990) ; на семинарах и конференциях в Институте биологической физики АН СССР.

По теме диссертации опубликовано 13 статей и 18 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из разделов: Введение, Обзор литературы (2 главы), Результаты эксперимента (5 глав), Выводы, а также списка цитируемой литературы, насчитывающего 433 наименования, из них 41 отечественная и 392 зарубежных публикаций. Работа изложена на 348 стр. машинописного текста, включая 47 рисунков и 27 таблиц (список литературы занимает 45 стр.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В работе использовали препараты полинуклео-тидов, очищенные от низкомолекулярных примесей с помощью диализа и затем лиофилизованные; иуклеозиды и нуклеотиды, чистоту которых проверяли с помощью хроматографии на бумаге. Калориметрические измерения проводили на микрокалориметре ДАСМ-1М. Одновременно на аликвоте исследуемого раствора контролировали физическое состояние образца (гелеобразование, преципитация и т.п.), что позволило проводить охлаждение растворов в ячейках калориметра и начинать измерения при температуре ниже 0°С. Описаны особенности применения методов ИК- и УФ-спектроскопии, кривых плавления, равновесного диализа и титрования для исследования полинуклеотидных и полинукле-тид-мономерных комплексов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Термодинамика образования комплексов поли(У) с адениновыми нуклеотидами и двойной спирали поли(У)

Калориметрическое исследование взаимодействия поли(У) с адениновыми нуклеотидами было предпринято для выяснения вопроса об эн-тальпийном и энтропийном вкладах электростатического взаимодействия фосфатных групп и их экранировки противоионами в энергетику спирали. Как известно, такая экранировка играет важную роль в стабилизации спирали, что проявляется в увеличении температуры ее плавления Тм с ростом ионной силы. Механизм этого феномена недостаточно выяснен (Франк-Каменецкий и др., 1987); предполагается (Privalov et al., 1969; Record et al., 1981), что в основе его лежит энтропийный эффект смешения противоионов, высвобождающихся при плавлении спирали, с раствором. Использование преимуществ системы полинуклеотид-мономер позволило нам предложить нестандартный подход для экспериментальной проверки этих представлений: исследовать

зависимость энтальпии ЛН и энтропии ÛS плавления спирали не

м м

только от параметра среды - ионной силы, но от изменения заряда на самой фосфатной группе, не затрагивая других взаимодействий в спирали.

' До настоящей работы были получены только нерастворимые комплексы поли(У) с аденилатами. Используя методы УФ- и ИК-спектроскопии и контролируя физическое состояние системы, мы нашли области существования растворимых трех- и двуспиральных комплексов полипирими-цинов с комплементарными нуклеозид moho-, ди- и трифосфатами. Таким образом, вопреки установившимся представлениям (Ts'o, 1974), 1ереход в конденсированную фазу не является необходимым условием комплексообразования.

Стехиометрия 2:1 комплексов поли(У) с аденилатами была установ-тена с помощью ИК-спектроскопии, исходя из характеристических раз-тачий между ИК-спектрами трех- и двуспиральных полинуклеотидных АУ комплексов в области валентных колебаний карбонильных групп (1500-L800 см-1) (Mlles, 1972) .

Как следует из калориметрических данных, константа образования i температура плавления комплексов поли(У) с аденилатами уменьшается в ряду: аденозин > 2',3'-цАМФ > 2'(3')-АМФ »■ 5'-АМФ > 5; 5'-АДФ i» 5'-АТФ. В то же время величина йНкал оказалась одина-совой для комплексов, образованных нуклеотидами с различным чистом фосфатных групп, степенью их ионизации ( рН 5.7 - 8.0), а также для циклического и нециклического нуклеозид монофосфатов. Диапазон изменения заряда мономера составляет от (-1) до (-4); ¡месте с зарядом фосфатной группы меняется и число экранирующих

ее противоионов.Во всех этих случаях изменяются положение и форма кривой плавления комплекса (рис. 1) , но не величина ДН .

кал

Таким образом, изменение электростатического взаимодействия фосфатных групп не вносит заметного вклада в энтальпию комплексообразования, что свидетельствует об определяющей роли энтропийного фактора в стабилизации спирали за счет экранировки фосфатных групп противоионами. Этот вывод служит экспериментальным обоснованием приближения полной экранировки заряда на фосфатных группах, используемого обычно в теоретическом конформационном анализе нуклеиновых кислот (Полтев, 1985; Туманян, 1985).

Термодинамические параметры двойной спирали поли(У) были получены с помощью сканирующей микрокалориметрии. Из-за низко! термостабильности этой структуры в 1 М NaCl (Т = 4.8°С) такое исследование было невозможно при существовавшем ранее уровне экспериментальной техники (Jones, 1979) . Оказалось, что при замене про-2+ +

тивоионов Mg на Na существенно уменьшаются как энтальпия, так

и энтропия неканонической пары У>У. Значение параметра кооператив--4

ности о г± 10 , найденное из сопоставления АН и ДН.,,, свиде-

ка л вг

тельствует, что плавление двойной спирали поли(У) характеризуется высокой кооперативностью.

ТНМПБРАТУРА,

Рис. 1. Микрокалориметрическая запись температурной зависимости теплоемкости в процессе плавления трехспирального комплекса поли(У) (1.96 мМ) с 2'(3')-АМФ (60 мМ) в 0.1 М Ыа-какодилатном буфере при рН 5.7 (кривая 1) и 7.2 (кривая 2).

П, Влияние ионизации компонентов системы на взаимодействие поли(У) с аденозином

Исследование протонирования и депротонирования комплекса поли(5 с аденозином позволяет выяснить особенности ионизации А-у и А*Т пар и провести анализ взаимосвязи процессов комплексообразования, конформационных перестроек и ионизации как мономерного, так и полимерного компонентов системы. На рис. 2 представлены рН-зависи-мости температуры плавления комплекса и степени связывания г аде-нозина с поли(У), определенной с помощью равновесного диализа. Эти данные показывают, что ионизация как мономера, так и полинук-леотида дестабилизирует исходный трехспиральный комплекс А-2 по-

ли(У). Отсутствует взаимодействие аденозина с депротонированной поли(У) (рН ■> 10) или полностью протонированного мономера с нейтральным полинуклеотидом (рН < 3). В рН-зависимости параметров ком-плексообразования обнаруживается асимметрия: в области щелочных рН уменьшение Тм опережает г, а при подкислении - отстает от уменьшения степени связывания (рис. 2).

В щелочной области рН зависимость оптической плотности Э от рН отражает как депротонирование полинуклеотида, так и конформа-ционные перестройки А-2 поли(У), что описывается формулой:

РрН 7-РРН СрН 7"СрН 12

Дес(1-е-а) - Де

с и-

+а (1)

Рис.2. рН-зависимость степени связывания г аденозина с поли (У) при 1°С и температуры

где а - степень ионизации комплекса, 8 - доля занятых мономером мест поли(У), Де и Де

. с и~

N801. Концентрации компонентов 3 мМ.

изменения коэффициента экстинк-ции поли(У) при образовании ком-лекса и при депротонировании. Из-за вклада первого слагаемого такие кривые спектрофотометричес-кого титрования на разных длинах волн не совпадают друг с другом и не дают истинных значений а. Однако даже на иэобестической длине волны 283 нм комплекса А-2 поли(У), где первое слагаемое формулы (1) исчезает (Дес = 0), кривые титрования обнаруживают двусту-пенчатый характер. Это позволило предположить, что диссоциация исходного трехспирального комплекса идет через образование промежуточной двуспиральной структуры: А-2 поли (У)-»-А-поли (У) + поли(У~) + + Н+. Этот вывод подтверждается исследованием рН-зависимостей изотерм связывания аденозина с поли(У), на которых в области рН ~ 9 также обнаруживается промежуточное плато, и разностных УФ-спектров системы.

В- области кислых рН, как показал анализ кривых потенциометри-ческого и спектрофотометрического титрования, УФ-спектров системы и изотерм связывания, некоторая часть протонированного аденозина может быть связана с пспи(У) в процессе разрушения исходного комплекса. Вероятность такого связывания п можно оценить, используя совместно данные титрования и равновесного диализа:

(о - в) „

П = а

(2)

где и - доля связанного протонированного аденозина, а - степень ионизации свободного мономера, р - отношение концентраций аденозина и полису). Оказалось, что эта вероятность может быть достаточнс велика: п = 0.1 - 0.25. Подход, основанный на формуле (2) , представляет собой простой метод определения "ошибки включения" иониз! рованного мономера при связывании его с полинуклеотидной матрицей,

Образование промежуточной двуспиральной структуры в области мелочных рН уменьшает термостабильность исходного комплекса А-2 поли (У), а частичное включение протонированного аденозина при кислы» рН увеличивает ее. Этим объясняется обнаруженная асимметрия в рН-зависимостях параметров комплексообразования (рис.2). Рассмотрение выше взаимное влияние процессов связывания мономера полинуклеотидной матрицей и ее ионизации проявляется в сдвиге рК полинуклеотида достигающем единицы рН, изменении термостабильности комплекса, сме щении изотермы связывания мономера. Эти эффекты весьма интересны в плане регуляции матричного синтеза нуклеиновых кислот.

Ш. Термодинамические характеристики двойной спирали протониро-ванной поли(Ц) и ее трехспиральных комплексов с гуаниновыми мономерами

Термодинамика двойной спирали поли(Ц)-поли (ЦН+) . Определение термодинамических параметров пары Ц-ЦН+ и тройки оснований Ц>Г*ЦН+ представляет большой интерес для понимания энергетики таких некано нических структур, как Н-форма ДНК (Lyamichev et al.,1985), механизма протонирования Г'Ц пар и природы структурных повреждений генома (Сухоруков,1988). При исследовании термодинамики спиралей(Образуемых с участием протонированной поли(Ц), возникает вопрос о

"ионизационном" вкладе в суммарные величины дн и AS теплового

м м

эффекта, связанного с изменениями степени ионизации системы при образовании или плавлении спирали. До сих пор оставалось неясным, каков характер этих изменений в поли(Ц) (Klump,1975; O'Connor et al.,1981) .

Для решения этого вопроса было проведено сравнение кривых титрования поли(Ц) в условиях существования двойной спирали и после ее плавления. Анализ показал, что для каждого значения ионной силы

имеется значение рН*(у) , при котором степень ионизации не меняется-,

х +

при рН>рН плавление поли(Ц)-поли(ЦН ) сопровождается депротониро-

у

ванием, а при рН < рН происходит дополнительное протонирование полинуклеотида. Это позволило объяснить эффекты "протонной" и "солевой" стабилизации и дестабилизации поли(Ц)"поли(ЦН+) (Guschlbauer, 1975) и получить уравнение, описывающее "ионизационный" вклад в наблюдаемую величину &Нм плавления спиралей, образуемых с участием протонированной поли(Ц):

ДН = АН* + (а - о ) (АН - ДН ) (3)

М ¿1 ИОН. буф.

В условиях, где степень протонирования двойной спирали а2 и развернутой поли(Ц) а^ одинаковы (при рН = рН ) второе слагаемое, обусловленное вкладом ионизации полинуклеотида ДН и буфера АН ,

ион. оуф•

исчезает и можно определить истинные термодинамические характеристики ДН* и ДБ* неканонической пары Ц-ЦН+.

Эти параметры были определены с помощью сканирующей микрокалориметрии в интервале у = 0.002 - 1 М. Их значения в 1 М ИаС1 составляют: АН" = -21.1 кДж/моль, ДБ" = -59.6 Дж/К-моль, ДС^о^ -3.3

кДж/моль пар. Кооперативность плавления поли(Ц)•поли(ЦН ) весьма

-4

высока и растет с ростом ионной силы: а = 2.7-10 при у = 1 М.

Изменение а - так же, как и возрастание Т с ростом и - имеет эн-

м

тропийную природу, поскольку величина остается постоянной.

Таким образом, предложенный подход позволил получить термодинамические параметры двойной спирали протонированной поли(Ц) и объяснить характер наблюдаемой зависимости их от рН и р.

В свою очередь, эти результаты позволили проанализировать энергетику образования трехспиральных комплексов поли(Ц)'ПОли(ЦН+) с гуаниновыми нуклеозидами и нуклеотидами. Как видно из рис.3, плавление таких комплексов представляет собой двустадийный процесс: разрушение комплекса приводит к образованию двуспиральной поли(Ц)• •поли(ЦН+), которая в свою очередь плавится при дальнейшем повышении температуры. Это описывается схемой:

поли(Ц) Т-поли(ЦН+) ==:Г+поли(Ц) •поли(ЦН+) I ==ьГ+поли(ЦН+)| (4) 1а | 2 1

где "а - степень протонирования комплекса. На основании схемы (4) с помощью закона Гесса были получены термодинамические характеристики неканоничес и ионной силы.

Термодинамические параметры комплексов поли(Ц)-поли(ЦН+) с гуа-

нозином и деэоксигуаноэином оказались одинаковыми (при рН =

кал

45.2 кДж/моль). Аналогичный результат был получен и для АУ комплексов. Таким образом, энергетика взаимодействия полинуклеотидов с комплементарными рибо- и дезоксирибонуклеозидами нечувствительна к изменению природы сахарного остатка и основной вклад в стабилизацию спирали вносит взаимодействие самих оснований. Этот вывод представляется весьма интересным для конформационного анализа нуклеиновых кислот.

ки неканонической структуры Ц-Г-ЦН+ и изучена их зависимость от рН

1>0 59 60 7° 90

Температура (°С)

Рис.3. Микрокалориметрические записи плавления трехспирального комплекса поли(Ц) с дезоксигуанозином (а) и двойной спирали поли(Ц) -поли (ЦН+) (Ь). Условия: 2 мМ Иа-аце-татный буфер, рн 4.75. Концентрации: (а) 1.14 мМ поли(Щ , 3.50 мм дезоксигуаноэин; (Ь) 2.28 мМ поли(Ц).

IV. Энергетика образования двуспиральных комплексов поли(Ц) с гуаниновыми мономерами. Термодинамика самоассоциации 5'-ГМФ

Выяснение условий существования и закономерностей плавления трехсгшральных ГЦ комплексов полинуклеотид-мономер дало возможность разграничить области фазового и конформационного равновесия между трехспиральной протонированной и двуспиральной структурами в системе поли(Ц) + дезоксигуаноэин. Использование этой модельной системы позволило впервые определить прямым калориметрическим методом термодинамические параметры Г*Ц пары в структуре регулярной двойной спирали. При достаточно низкой ионной силе и рН ~ 8 удалось зарегистрировать полную и обратимую кривую теплопоглощения двуспираль-ного комплекса (рис.4), резко отличающуюся от "размытого" пика, характеризующего плавление трехспирального комплекса Ц-Г>ЦН+ при рН 7. Отсюда была определена энтальпия стабилизации Г«ц пары в спирали, которая составляет 56.5 кДж/моль - в 1.7 раза выше энтальпии А-У пары. Недавно этот результат'был подтвержден в работе (Зайцев, Филимонов, 1990), выполненной на полинуклеотидной системе поли (Ц) 'ПОЛИ(Г).

Полная термодинамическая информация была получена и для другого дву-спирального комплекса, 51 -ГМФ- поли(1 При исследовании этой системы обнаружилось "калориметрическое проявле ние" самоассоциации мономерного ком понента, 5'-ГМФ. При кислых рН (в форме моноаниона) этот нуклеотид об разует гель, а в Форме дианиона -растворимые ассоциаты нескольких ти пов, структура и термодинамические

10 15 20 Температур« (°С)

Рис.4. Микрокалориметрическая запись плавления двуспирального

комплекса поли(Ц) (0.56 мМ) с характеристики которых остаются не-

дезоксигуанозином (9.5 мМ) в 2 . .__, , ,оол\

мМ трис-НС1 (рн 8). (1) - пер- известными (Иа1тз1еу еЪ а1.,1984).

вый, (2) - второй прогрев того как видно из рис.5, тепловой эффект же образца.

процесса обнаруживает резко нелинейную зависимость от концентрации нуклеотида CQ. Это свидетельствует о некорректности процедуры линейной экстраполяции к 0, применявшейся (Klump,1988) для получения термодинамических параметров ассоциации 5'-ГМФ. Предложенная

в работе схема термодинамики самоассоциации 5'-ГМФ позволила установить,что преобладающей формой ассоциатов являются октамеры дианиона 5'-ГМФ, и оценить величину константы их образования ( 5«106 М-7) .

Рис.5. Температурная зависимость избыточной теплоемкости 5'-ГМФ в 1 М NaCl, 50 мМ трис-HCl, pH 8. Концентрация нук-леотида: (а) 33 мМ, (Ь) 37 мМ, (с) 44 мМ. Штрихом показан ход базовой линии микрокалориметра.

V. Влияние изомерии фосфатной группы в нуклеотидах на термодинамику их взаимодействия с комплементарными полинуклео-тидными матрицами

В термодинамике взаимодействия полирибонуклеотидов с фосфат-изомерами АМФ и ГМФ были обнаружены закономерные различия: как в АУ, так и в ГЦ системах комплексы с участием 2'(3')-нуклеотидов оказались гораздо термостабильнее, чем комплексы, образуемые изомерными 5* -нуклеотидами (табл.1) . В зависимости от. системы, эти различия в термостабильности могут иметь как энтальпийную, так и энтропийную природу. Например, температура плавления трехспирального комплекса поли(Ц)-поли(ЦН+) с 2'(3')-ГМФ на 18 К выше, чем с 5'-ГМФ, хотя второй комплекс характеризуется существенно большей ДНм (табл.1 ).

Таблица 1. Различия в параметрах плавления комплексов, образуемых нуклеозид-5'- и 21(3')-фосфатами с комплементарными матрицами (ц = 1 М)

Полимер

Стехиометрия

Мономер

лнм

(кДж/моль)

тм Сс)

Поли(У)

Поли (Ц) -поли(ЦН+) Поли (Ц)

5'-АМФ 2'(З')-АМФ 5'-ГМФ 2'(З')-ГМФ

5'-ГМФ 21 (З')-ГМФ

29.2 43.8 30.5b 24.1Ь

20.1 10

2.3° 16.4а

30Ь 48b

-1.6а 13а

а - концентрация свободного мономера С = 10 мМ; Ь - С = 1 мМ; реакция: поли(Ц)•ГМФ.поли(ЦН+)^поли(ц)-поли(ЦН+) + ГМФ.

Анализ показал, что причиной этих различий могут быть различия в син-анти конформационном равновесии и/или гидратации нуклеозид 2"(34- и 5'-фосфатов. Обнаруженный эффект изомерии фосфатной группы важен для понимания эволюции механизмов матричного синтеза.

VI. Ограниченная применимость модели взаимодействия ближайших соседей для описания энергетики спирали

В работе проведено систематическое исследование различий между величинами калориметрической и эффективной энтальпий комплексообра-зования; оба параметра впервые получены из одних и тех же калориметрических данных для широкого круга систем (табл.2). Как видно из

таблицы, за исключением одного случая, значения ДН^,, существенно

m

превосходят ДН . Анализ этих результатов показал несостоятель-кал •

ность имеющихся в литературе (Franck et al.,1973; Wierzchowski et

al.,1984) объяснений различий между ДН и ДН-^ за счет вклада ас-

кал U1

социации свободного мономера или изменения конформации матрицы при комплексообразовании. Теоретическое описание систем полинуклеотид--мономер основано на естественном предположении, что взаимодействие вдоль матрицы ограничивается стэкингом ближайших соседей. Полученные данные (табл.2) приводят к выводу о неадекватности этого приближения и о том, что кооперативность связывания мономеров на поли-нуклеотидной матрице обеспечивается взаимодействиями, в которых участвуют несколько последовательных нуклеотидов вдоль цепи.

Таблица 2. Отношение величин эффективной ДНВГ и калориметрической

ДН„=„ энтальпий плавления комплексов полинуклеотид-моно-

КаЛ

мер3

полимер поли(Ц)•поли(ЦН+) поли (Ц) поли(5-ВгУ)

мономер drb 5'-ГМФ drb 5'-ГМФ А° 9-мАС

ДН^/ДН ВГ кал 3.50 2.02 0.91 2.70 1.25 1.27

поли (У)

А Ас 3',5'-4№M>d 2',3'-цАМ» 2" (З')-АМФ 5'-АМ1> 5'-АДО 5'-АТФ

1.45 1.40 1.43 1.92 2.08 3.03 3.57 3.57

a - обозначения мономеров; а - аденозин, 9_мд _ 9-метиладенин,

dr - дезоксигуанозин; условия среды: 1 M NaCl, если не указано иначе.

Ь - р = 2 мМ; с - 0.4 M NaCl (Hlguchi et al.,1984); d - 40 мМ MgSO, (Franck et al.,1973). 4

К выводу о неадекватности общепринятой модели взаимодействия ближайших соседей приводит и обсуждение вопроса о природе кооперативно-сти конформационных переходов в нуклеиновых кислотах. Она определяется дополнительной энергией границы характеризующей образование первого, изолированного,участка новой конформации. Для перехода В-ДНК-»-клубок значения Р^ составляют ~ 28 кДж/моль (Ргапк-КатепеЪв-к11 еЪ а1.,1974), и возникает вопрос: почему они столь велики? Обычно большие значения Г^ объясняют потерей стэкинг-контакта соседних пар оснований в спирали. Детальный анализ термодинамики стэкинга в различных нуклеотидных системах показал, однако, что ни на уровне мономерных ассоциатов, ни в полинуклеотидных спиралях Гиббсова энергия стэкинга не достигает столь больших величин.Выгодность стэкинг-контактов определяется энтальпийной составляющей, а природа энергии границы энтропийная. Стэкинг слабо зависит от ионной силы, в то время как значения ^ резко убывают с ростом у (Kozyavkin еъ а1.,1987). Пример высокой кооперативности демонстрирует исследованное в работе плавление двойных спиралей поли(У) и протонированной поли(Ц) (см. выше) - несмотря на слабую способность уридина и цитидина к стэкингу.

Таким образом, вопреки общепринятым представлениям, кооператив-ность конформационных переходов в нуклеиновых кислотах и связывания мономеров на полинуклеотидной матрице не может быть всецело обусловлена межплоскостным взаимодействием. Она в существенной степени определяется взаимодействиями, выходящими за пределы соседних вдоль цепи пар (или троек) оснований. Таким взаимодействием, по-видимому, является взаимодействие спирали с ее ион-гидратным окружением.

\Ш. Закономерности в энергетике двойных и тройных спиралей

В работе проведено детальное сопоставление данных по термодинамике двойных и тройных спиралей, полученных с помощью как калориметрических, так и непрямых методов на олигонуклеотидных, полинуклеотидных и полинуклеотид-мономерных комплексах. Проанализированы причины большого разброса значений термодинамических параметров и показано, что одной из них является ограниченная применимость модели двух состояний для описания энергетики олигонуклеотидных спиралей .

Анализ позволяет выявить ряд закономерностей в энергетике спирали, прежде всего - зависимость ее от нуклеотидной последовательности. Важно подчеркнуть, что эта "энергетическая гетерогенность" двойной спирали в существенной степени обусловлена вариациями величин энтропии стэкинг-контактов пар оснований. Например, из двух стэкинг-контактов А-Т и Г'Ц пар, различающихся полярностью хода цепи, ГА/ЦТ и АГ/ТЦ, в В-ДНК гораздо термостабильнее первый (ДТ =

= 40 К), несмотря на то, что его энтальпия гораздо меньше, чем у второго (Breslauer et al.,1986). Рассмотрение причин вариабельности величин AS стэкинг-контактов пар оснований привело к выводу, что она определяется ион-гидратным окружением спирали, структура которого различна для разных нуклеотидных последовательностей. Таким образом, растворитель вносит существенный вклад не только в потенциальную энергию, но и в энтропию образования двойной спирали.

Сравнительный анализ термодинамики рибо- и дезоксирибонуклеотид-ных систем позволил выявить реципрокный характер различий в энергетике стэкинг-контактов, различающихся полярностью хода цепи (пример которых был дан выше для последовательностей ГА/ЦТ и АГ/ТЦ). А именно, при переходе от рибо- к дезоксирибонуклеиновым последовательностям относительная термостабильность таких "полярно-иэомер-ных" стэкинг-контактов, как правило, меняется на противоположную. Так, в чередующихся пурин-пиримидиновых последовательностях во всем интервале температур 0-100°С для цитозина энергетически предпочтительнее 3' положение в рибонуклеотидных и 5' положение в дезоксири-бонуклеотидных двойных спиралях, а для гуанина, соответственно, 5'-и 3'-положения.

Проведено также сравнение термодинамики структур с каноническим и неканоническим типом спаривания оснований; двойных и тройных спиралей. Наиболее стабильными из таких структур оказываются тройные спирали, образуемые с участием протонированного цитозина.

ВЫВОДЫ

1. Методом дифференциальной адиабатической сканирующей микрокалориметрии изучена термодинамика взаимодействия поли(У) с аденино-выми и поли(Ц) с гуаниновыми нуклеоэидами и нуклеотидами в широком диапазоне изменения концентраций компонентов, температуры, рН и ионной силы. Найдены области существования растворимых комплексов полинуклеотидов с комплементарными нуклеозид moho-, ди- и трифос-фатами и показано, что вопреки существовавшим представлениям переход в конденсированную фазу не является необходимым условием образования таких комплексов. Определены термодинамические параметры плавления 14-ти трех- и двуспиральных комплексов полинуклеотид-мо-номер, в том числе ранее не обнаруженных, а также двойных спиралей в поли(У) и протонированной поли(Ц).

2. Показано, что константа образования и температура плавления комплексов поли(У) с адениновыми мономерами изменяются в ряду: аденозин >• 2' ,3'-цАМФ > 2' (З')-АМФ» 5'-АМФ > 5'-АДФ > 5'-АТФ. Калориметрическая величина энтальпии комплексообразования оказалась одинаковой для комплексов, образованных нуклеотидами с раз-

личным числом фосфатных групп, степенью их ионизации, а также для циклического и нециклического нуклеозид монофосфатов. Обнаруженная независимость энтальпии комплексообразования от величины заряда на фосфатной группе свидетельствует об определяющей роли энтропийного фактора в стабилизации спиральных структур нуклеиновых кислот за счет экранировки фосфатных групп противоионами.

3. С помощью сканирующей микрокалориметрии определены термодинамические характеристики образования двойной спирали в поли(У) и

+ 2+

показано, что при замене противоионов Иа на Мд существенно возрастает как энтальпия, так и энтропия образования неканонической пары У-У.

4. С помощью методов потенциометрического и спектрофотометричес-кого титрования, равновесного диализа и УФ-спектроскопии проанализирована взаимосвязь комплексообразования, конформационных перестроек, процессов протонирования и депротонирования как мономерного, так и полимерного компонентов в системе поли(У) + аденоэин. Разработаны способы, позволяющие разделить "ионизационный" и "кон-формационный" вклады в изменения спектральных параметров системы,

а также оценить "ошибку включения" ионизованного мономера при связывании его с полинуклеотидной матрицей. Обнаружена и объяснена асимметрия в рН-зависимостях термодинамических параметров комплексообразования.

5. На оснсь-з анализа кривых титрования поли(Ц) выяснены закономерности изменения степени ее ионизации в процессе образования или плавления двойной спирали поли (Ц) *поли (ЦН+). Предложен способ учета теплового эффекта, обусловленного изменением степени ионизации системы, в энергетике двойных и тройных спиралей, образуемых с участием протонированной поли(Ц). Это позволило определить истинные термодинамические параметры образования неканонических структур Ц>ЦН+ и Ц•Г•ЦН+ в соответствующих двойных и тройных спиралях.

6. Охарактеризованы фазовые и конформационные равновесия при образовании трехспиральных протонированных Ц-Г*ЦН+ и двуспиральных нейтральных Г.Ц комплексов. Прямым калориметрическим методом определены термодинамические характеристики Г-Ц пары в структуре спирали. Энтальпия ее стабилизации составляет 56.5 кДж/моль, что в 1.7 раза выше энтальпии А-У пары.

7. Изучена энергетика образования ассоциатов 5'-ГМФ в растворе и установлено, что преобладающей их формой являются октамеры ди-аниона 5'-ГМФ.

8. Обнаружен эффект влияния изомерии фосфатной группы в нуклео-тидах на термодинамику их взаимодействия с комплементарными поли-нуклеотидными матрицами: как в АУ, так и в ГЦ системах комплексы

с участием 2'(3')-нуклеотидов оказались гораздо термостабильнее, чем комплексы, образуемые изомерными 5'-нуклеотидами. В зависимости от природы комплексов, различия в их температурах плавления могут иметь как энтальпийную, так и энтропийную природу. Обнаруженные различия в энергетике комплексообразования определяют один из возможных механизмов возникновения селективности матричного синтеза нуклеиновых кислот в ходе предбиологической эволюции.

9. Показано, что термодинамические характеристики комплексов полирибонуклеотидов с комплементарными рибо- и дезоксирибонуклео-зидами одинаковы. Это свидетельствует, что энергетика взаимодействий в таких системах нечувствительна к изменению природы сахарного остатка и основной вклад в энергию стабилизации спирали вносит взаимодействие самих оснований.

10. Выявлен реципрокный характер различий в энергетике "полярно-изомерных" (различающихся полярностью хода цепи) стэкинг-контак-тов пар оснований между рибо- и дезоксирибонуклеиновыми двойными спиралями. Так, в чередующихся пурин-пиримидиновых последовательностях во всем интервале температур 0-100°С для цитозина энергетически предпочтительнее 3 *-положение в рибонуклеотидных и 51-положение - в дезоксирибонуклеотидных системах, а для гуанина, соответственно, 5'- и 3'-положения.

11. Проведен анализ соотношения калориметрической и полученной из уравнения Вант-Гоффа величин энтальпии процессов самоорганизации в нуклеотидных системах разного структурного уровня. Показано, что для ассоциации мономеров эти величины близки, тогда как при образовании комплексов полинуклеотид-мономер первая из них в несколько раз меньше второй. Это свидетельствует о неадекватности общепринятой модели взаимодействия ближайших соседей для описания кооперативной адсорбции на полинуклеотидных матрицах.

12. На основе анализа термодинамики олигонуклеотидных, полинуклеотидных и полинуклеотид-мономерных комплексов сделан вывод о существенном вкладе ион-гидратного окружения в энергетику стабилизации спиральных структур в нуклеиновых кислотах, несводимом к взаимодействию соседних вдоль цепи пар или троек оснований. Исходя из этого, дано объяснение высокой кооперативности конформационных переходов в нуклеиновых кислотах и большой вариабельности величин энтропии образования различных пар оснований в спирали, которая

в существенной степени определяет зависимость энергетики двойной спирали от нуклеотидной последовательности.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1.Гуковский И.Я., Сухоруков Б.И. Многоцентровая модель конформационных превращений в биополимерах // Биофизика - 1974,- Т.19.-

С. 415-419.

2.Гуковская А.С., Сухоруков Б.И., Гуковский И.Я. О влиянии солевого состава среды на стехиометрию и стабильность комплексов поли-нуклеотид-мономер // Биофизика - 1975,- Т. 20,- С. 1127-1128.

3.Gukovskaya A.S., Gukovsky I.Ya., Sukhorukov B.I. Study of salt effects on adenosine-polyuridylic acid interaction // Studia biophysica - 1978.- Bd. 67,- S. 15-16.

4.Сухоруков Б.И., Гуковский И.Я., Петров А.И., Гуковская А.С., Ма-евский А.А., Гусенкова н.М. Взаимодействия и самоорганизация нук-леотидных систем // Материалы Междунар. конф. по квантовой химии, биологии и фармакологии - Киев, 1978.- С. 24-25.

5.Гуковский И.Я., Гуковская А.С. Влияние ионизации компонентов на образование комплексов полинуклеотид-мономер // Материалы V Все-союзн. конф. по конформационным изменениям биополимеров в растворах - Телави, 1980,- С. 34.

6.Gukovskaya A.S., Gukovsky I.Ya., Sukhorukov B.I. Solvent effects on polynucleotide-monomer recognition // Материалы Via Иенского симпозиума "Recognition with biopolymers"- Веймар (ГДР), 1980.-

C. 46-47.

7.Sukhorukov B.I., Gukovsky I.Ya., Petrov A.I., Gukovskaya A,S., Maevsky A.A., Gusenkova N.M, Interactions and self-organization of nucleic bases, nucleotides and polynucleotides into ordered structures. Effect of ionization and solvent salt composition // Int.J.Quantum Chem.- 1980,- V. 17,- P. 339-359.

8,Gukovskaya A.S., Gukovsky I.Ya., Chikh V.P., Sukhorukov B.I. Study of salt effects on adenosine-polyurldyllc acid interaction // Biopolymers - 1980.- V. 19.- P. 453-468.

9.Gukovsky I.Ya., Gukovskaya A.S., Sukhorukov B.I, Effect of ionization of components on complex formation between adenosine and polyuridylic acid // Studia biophysica - 1980,- Bd.79.- S. 49-50,

10.Gukovsky I.Ya., Gukovskaya A.S., Sukhorukov B.I. Calorlmetric study of polyuridylic acid complexes with adenylic nucleotides// Материалы Междунар.симпозиума по биокалорйметрии - Тбилиси,1981. -С. 47.

11.Гуковский И.Я., Гуковская А.С., Сухомудренко А.Г., Сухоруков Б.И. ИК-спектроскопическое и калориметрическое исследование комплексов полиуридиловой кислоты с аденозин-5'- и 2'(3')-моиофосфата-ми // Материалы Всесоюзн. конф. по спектроскопии биополимеров -Харьков, 1981.- С. 49-51.

12.Gukovsky I.Ya., Gukovskaya A.S., Sukhomudrenko A.G., Sukhorukov

B.I, Calorimetric study of the complexes between polyuridylic acid and adenylic nucleotides // Nucleic Acids Res.- 1981.-V. 9.- P. 4061-4879.

13.Gukovsky I.Ya., Gukovskaya A.S. Thermodynamics of G«C interactions in poly(C) complexes with guanosine and deoxyguanosine // Studia biophysica -1982.- Bd. 87,- S. 83-84. .

14.Гуковский И.Я., Гуковская А.С., Гусенкова Н.М. Комплексы полинук-леотид^мономер как модельные системы для поиска и исследования механизма действия лекарственных препаратов // Материалы Междунар. симпозиума "Перспективы биоорганической химии" - Рига,1982.-

C. 163-164.

15.Гуковский И.Я. Термодинамика взаимодействий в нуклеиновых кислотах // I Всесоюзн. биофизический съезд. Тезисы докладов, Т. I»-Москва, 1982,- С. 67-68.

16.Гуковский И.Я., Гуковская А.С., Сухоруков Б.И. Влияние ионизации компонентов системы на взаимодействие полиуридиловой кислоты с аденозином. Депротонирование Полинуклеотида // Биофизика - 1983.Т. 28,- С. 381-387.

17.Гуковский И.Я., Гуковсжая А.С., Сухоруков Ь.И. Влияние протони-рования аденозина на его взаимодействие с полиуридиловой кислотой // Биофизика - 1983.- Т. 28.- С. 564-569.

18.Гуковский И.Я. Энергетика двойных и тройных нуклеиновых спиралей // Материалы симпозиума "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках" - Пуиино, 1985.- С. 82-83.

19.Gukovsky I.Ya. Differences in the energetics of interaction of 5'- and 2M3') -nucleotides with complementary polynucleotides//

"Blophosphates and their analogues« structure, synthesis, metabolism and activity" - Elsevier, Amsterdam, 1987.- P. 571-574.

20.Buckin V.A., Kankiya B.I., Bulichov N.V., Lebedev A.V., Gukovs-ky I.Ya., Chuprina V.P., Sarvazyan A.P., Williams A.R. Measurement of anomalously high hydration of (dA) *(dT)n double helices in dilute solution // Nature - 1989,- V. 340,- P. 321-322.

£8.8.90 г. Зак. 285IP Тир. 125 экз. Уч.изд.л.-I.O

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ НЦБИ