Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействия белка VPR вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) с клеточными структурами и белками ВИЧ-1 в процессе формирования вирусоподобных частиц

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чикова, Анна Константиновна, Москва

_ /«•«/ ^ ^

*г г ..;4

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ ИМЕНИ Д.И. ИВАНОВСКОГО

ЧИКОВА Анна Константиновна

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БЕЛКА УРИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ПЕРВОГО ТИПА (ВИЧ-1) С КЛЕТОЧНЫМИ СТРУКТУРАМИ И БЕЛКАМИ ВИЧ-1 В ПРОЦЕССЕ ФОРМИРОВАНИЯ ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ

Специальность 03.00.03. - молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель доктор медицинских наук ГИБАДУЛИН Р.А.

Москва -1998 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................11

1.1. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).

Общие сведения....................................................................11

1.2. Vpr - вспомогательный белок ВИЧ-1..............................14

1.3. Структура и свойства белка..............................................16

1.4. 2 Взаимодействие Vpr с белками ВИЧ-1........................20

1.5.2 Взаимодействие Vpr с клетками....................................24

1.5.1. Взаимодействие Vpr с клеточными мембранами.....................................................................25

1.5.2. Особенности внутриклеточного транспорта белка Vpr. Взаимодействие с клеточными белками и нуклеиновыми кислотами..........................28

1.6. 2 Влияние Vpr на инфицированные клетки...................32

1.6.1. Торможение клеточного цикла на

стадии G2/M...............................................................32

1.6.2. Активизация механизма апоптоза, индукция дифференциации клеток в присутствии Vpr..............36

1.7. Функции белка Vpr в жизненном цикле ВИЧ-1.............37

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...................................42

2.1 Культивирование бактериальных штаммов...................42

2.1.1. Использованные штаммы бактерий Escherichia coli.................................................................42

2.1.2. Питательные среды.....................................................42

2.2. Культивирование клеток насекомых и вируов..............43

2.2.1. Культивирование клеток насекомых.......................43

1. Культуры клеток.........................................................43

2. Условия культивирования........................................43

2.2.2. Вирусы..........................................................................43

2.3. Получение рекомбинантных штаммов...........................44

2.3.1. Полимеразная цепная реакция.................................44

1. Праймеры для амплификации vpr...........................44

2. Условия реакции.........................................................44

2.3.2. Получение рекомбинантных штаммов Escherichia coli................................................................46

1. Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток................................................46

а. Экспресс-метод.........................................................46

б. Препаративное выделение плазмидной

ДНК с помощью горячей щелочи.........................46

2. Рестрикция..................................................................47

3. Электрофоретическое разделение

препаратов ДНК.........................................................48

4. Выделение фрагментов ДНК из агарозного

геля................................................................................48

5. Лигирование...............................................................49

6. Приготовление компетентных клеток Е. coli и трансформация их препаратами плазмидной ДНК.......................................................49

7. Селекция рекомбинантных клонов........................50

2.3.3. Получение рекомбинантных вирусных штаммов........................................................................51

1. Получение вирусной ДНК,

51

2. Трансфекция..........................................................52

3. Селекция рекомбинантных клонов....................52

2.4. Получение белковых препаратов.............................53

2.4.1.Получение препаратов клеток..............................53

2.4.2. Фракционирование клеток..................................53

2.4.3. Выделение ВПЧ......................................................55

2.4.4. Подготовка препаратов для анализа..................55

2.5. Анализ белковых препаратов.......................................55

2.5.1. Электрофорез..........................................................55

2.5.2. Иммуноблот............................................................56

2.6. Синтез и очистка 1Ч-концевого пептида белка Ург...56

2.7. Получение иммунной сыворотки к белку Ург с использованием синтетического пептида.....................58

2.7.1. Иммунизация кроликов.........................................58

2.7.2. Методика ИФА.......................................................59

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ........................................................60

3.1. Конструирование рекомбинантных плазмид..............60

3.1.1. Получение фрагмента ДНК гена ург и

конструирование рекомбинантной плазмиды риСург..........................................................................61

3.1.3. Конструирование инсерционных плазмид...........64

1. Конструирование инсерционной

плазмиды рУЬург.....................................................64

2. Конструирование инсерционной плазмиды рАСург.......................................................................66

3.2. Получениеи анализ иммунной сыворотки к Vpr с использованием синтетического пептида.........................68

3.3. Экспрессия Vpr в Е. coli......................................................70

3.3.1. Получение прокариотической системы экспрессии белка Vpr на основе плазмиды

pUC18...............................................................................70

3.3.2. Анализ экспрессии белка Vpr в Е. coli.....................73

3.4. Изучение взаимодействия сывороток крови больных СПИД с рекомбинантным белком Vpr в иммуноблоте..76

3.5. Анализ продукции Vpr штаммов РБВ rBVACvpr.........83

3.5.1. Получение штамма rBVACvpr...........................83

3.5.2. Изучение экспрессии белка Vpr

штаммом rBVACvpr...............................................85

3.5.3. Изучение секреции Vpr в культуральную среду.............................................87

3.5.4. Выделение белка Vpr из клеток

насекомых................................................................88

3.5.5. Анализ взаимодействия Vpr со структурами клетки методом субклеточного фракционирования.....................90

3.6. Изучение взаимодействия белка Vpr со структурными белками ВИЧ-1.........................................93

3.5.1. Изучение инкорпорации белка Vpr в вирусоподобные частицы............................................93

3.5.2. Изучение взаимодействия Vpr с полипротеином Gag в процессе формирования ВПЧ..............................................................................95

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................99

5. ВЫВОДЫ.................................................................................103

6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.......104

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

а.к. - аминокислотных остатков БОЕ - бляшкообразующая единица BSA - бычий сывороточный альбумин ВИЧ - вирус иммунодефицита человека ВПЧ - вирусоподобные частицы. ИФА - иммуноферментный анализ kb - тысяч пар оснований ПЦР - полимеразная цепная реакция PBS - фосфатно-буферный раствор РБВ, гВУ - рекомбинантные бакуловирусы. SIV - smian immunodeficiency virus (вирус иммунодефицита обезьян)

TBS - трис-буферный раствор

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) был впервые описан в 1981 г. Основными признаками СПИД являются иммунологические расстройства организма, сопровождающиеся, оппортунистическими инфекциями, неврологическими заболеваниями и необычными формами рака. Роль лен-тивирусного агента в этиологии этого заболевания в 1983 г. подтвердило открытие вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в лаборатории Монтанье в институте Пастера в Париже.

Лентивирусы отличаются от других представителей семейства ретровирусов более широким спектром регуляторных белков, влияющих как на активность тех или иных функций вируса, так и на физиологическое состояние клетки-хозяина.

Регуляторные белки Vpr, Nef, Vpu и Vif ВИЧ1, по мнению некоторых исследователей, не являются необходимыми для инфекци-онности вируса, но существенно влияют на его репродукцию в некоторых клеточных линиях. Такие белки были определены как «вспомогательные».

Одним из «вспомогательных» белков ВИЧ является Vpr — полипептид массой 14кДа, продукт поздней вирусной транскрипции. Этот белок обнаруживается в каждой из пяти групп лентивирусов приматов и отличается высокой консервативностью. К настоящему моменту известны некоторые функции Vpr: участие в транспорте вирусного преинтеграционного комплекса к ядру инфицированной клетки, активация вирусных и некоторых клеточных промоторов, торможение клеточного цикла на стадии G2/M и др., что указывает на большую роль данного белка в жизненном цикле ВИЧ.

Значительное число экспериментальных данных подтверждает

способность Vpr к взаимодействию с различными клеточными структурами и активное влияние этого белка на физиологические процессы инфицированной клетки. Интересно, что Vpr несет сильный нуклеофильный сигнал, необходимый для ядерного транспорта преинтеграционного комплекса ВИЧ, и большая часть синтезируемого белка обнаруживается в ядре инфицированной клетки. Тем не менее, в присутствии р17, р7 и рб доменов Gag этот белок инкорпорируется в вирионы в количествах, эквимолярных основным структурным белкам вирусной сердцевины. Показано, что для некоторых функций Vpr, необходимых на поздних стадиях жизненного цикла вируса, также не требуется ядерная локализация данного белка. Таким образом, некоторые авторы выделяют ранние функции Vpr, связанные с ядерным импортом, и поздние функции, не требующие ядерной локализации. С этой точки зрения «переключение» механизмов внутриклеточного транспорта Vpr на разных этапах жизненного цикла вируса представляется одним из возможных способов регуляции активности белка на разных стадиях репродукции. Если на ранних стадиях доминирует нуклеофильный сигнал, то при накоплении в цитоплазме поздних вирусных продуктов включается система, составляющая конкуренцию ядерному импорту и направляющая белок на мебрану клетки к почкующимся частицам. По некоторым данным, структурные белки ВИЧ-1 влияют на биологическую активность Vpr, однако, механизмы регуляции к настоящему моменту не выяснены.

Исследование механизмов, ответственных за внутриклеточный транспорт Vpr, представляет большой интерес не только для изучения жизненного цикла ВИЧ, но и для клеточной биологии в целом.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение взаимодействия

Ург ВИЧ1 с клеточными структурами и изменений внутриклеточного транспорта данного белка под влиянием gag-продуктов в процессе формирования ВПЧ.

В задачи исследования входило.

1. Получение рекомбинантных штаммов бакуловируса, эффективно экспрессирующих Vpr в клетках насекомых.

2. Отработка иммунологических методов тестирования белка Vpr.

3. Изучение особенностей внутриклеточного транспорта белка Vpr, несущего сигнал секреции, и его взаимодействие с различными структурами клетки.

4. Изучение инкорпорации рекомбинантного белка Vpr в вирусоподобные частицы (ВПЧ).

5. Изучение взаимодействия рекомбинантного бежа Vpr с полипротеином предшественником Pr55Gag в процессе формирования ВПЧ.

Научная новизна работы.

Для исследования биохимических свойств белка Vpr ВИЧ-1 впервые была использована модельная система на основе рекомбинантных штаммов бакуловируса.

Показано, что химерный белок Vpr, снабженный сигналом секреции, эффективно инкорпорируется в ВПЧ, формируемые Pr55Gag, при экспрессии in trans, что указывает на отсутствие значительных конформационных отличий от нативного белка ВИЧ 4.

Показано, что инкорпорация Vpr в частицы, по-видимому, не зависит от его взаимодействия с плазматической мембраной клетки-хозяина, а обеспечивается только связыванием с молекулами Pr55Gag.

Впервые показано, что благодаря высокой активности механи-

зма ядерного импорта Ург происходит подавление секреции химерного белка, содержащего лидерную последовательность поверхностного гликопротеина Ор67 вируса ядерного полиэдроза.

Полученные данные позволяют предположить, для инкорпорации Ург в частицы необходимо подавление ядерного импорта данного белка одним из доменов Рг55Са^.

* * *

Автор считает своим приятным долгом поблагодарить Юрия Аркадьевича Семилетова за осуществление синтеза олигопептида, Мансура Мухамедовича Гараева за предоставление исходной плаз-миды для амплификации Ург и рекомендации по оформлению работы, Людмилу Мидатовну Селимову и Олега Петровича Жирно-ва за предоставление ультрацентрифуги для выделения ВПЧ, сотрудников НПО «Нарвак» Татьяну Владимировну Гребенникову и Алексея Дмитривича Забережного за предоставление ДНК-ампли-фикатора и методические рекомендации, Галину Константиновну Воркунову за консультации по методу субклеточного фракционирования. И, конечно, пользуясь возможностью, автор выражает глубокую признательность коллективу лаборатории генноинже-нерных препаратов под руководством Рашита Абдрахмановича Гибадулина за терпение, поддержку и неоценимую помощь в работе.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). Общие сведения.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) относится к семейству ретровирусов (11е1:гоутс1ае). Это обширное семейство вирусов, выделенных от млекопитающих и человека. Название связано с ферментом обратной транскриптазой, который содержится в составе вирионов и является катализатором процесса обратной транскрипции. Отличительной особенностью представителей этого семейства от других РНК-содержащих вирусов является способность ретро-вирусов к интеграции в геном клетки-хозяина, которую определяет содержание в составе вириона фермента интегразы.

Вирионы ретровирусов сходны по морфологии. Они имеют диаметр 80—130нм и содержат внутренний электроноплотный нуклеоид (сердцевина), который окружен наружной оболочкой. Внешняя оболочка вирионов представляет собой липидсодержа-щую мембрану, образующуюся при почковании вирусов от плазматической мембраны клетки хозяина. Между капсидом и оболочкой находится матриксный белок. Наружная поверхность оболочки несет гликопротеиновые выросты.

В дополнение к морфологическому сходству вирионы ретровирусов имеют много общих физических, химических и ферментативных свойств. Они содержат 60—70% белка, 30—40% липидов, 2—4% углеводов и 1% РНК; их плавучая плотность 1,16 — 1,18 г/мл. Они чрезвычайно чувствительны к гидрофобным растворителям, детергентам и повышенной температуре (56 С, 30 мин).

Вирусный геном состоит из двух идентичных одноцепочечных позитивных молекул РНК, несущих как и большинство зрелых клеточных мРНК, кэп на 5'- и ро1у(А) на 3х-конце.

Две цепи РНК нековалентно связаны друг с другом вблизи 5"концов. Длина каждой из них колеблется от 3.5 до 9 kb в зависимости от вида вируса. Клеточная тРНК, специфичная для конкретного вируса и необходимая для инициации процесса обратной транскрипции, нековалентно связана с 5"-концом вирусной РНК.

Семейство ретровирусов включает Зрода: Oncovirinae, Spu-mavirinae и Lentivirinae.

Особое место среди ретровирусов занимают представители рода лентивирусов — возбудителей летальных инфекций. К этому роду относится вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вызывающий СПИД— синдром приобретенного иммунодефицита. Исследованию структуры и свойств ВИЧ посвещено множество публикаций и обзорных работ. В этом разделе обзора литературы использованы следующие работы: Р. М. Хаитов с соавт. (1992), Ха-зелтайн У. А. с соавт. (1988), Иорданский с соавт. (1997).

Вирионы ВИЧ имеют сферическую форму 100—120 нм в диаметре и по своей структуре близки к другим лентивирусам. Внешняя оболочка вирионов образована двойным липидным слоем с расположенными на нем гликопротеидными «шипами» — поверхностными рецепторами вируса, каждый из которых состоит из двух субъединиц, образованных белками Gp41 и Gpl20. Первый пронизывает липидный слой, второй связан с ним нековалентно и находится снаружи. Образование указанных белков происходит в результате процессинга Gp 160— гликопротеида, продукта гена env.

Нуклеокапсид вируса образован по экосаэдрическому типу симметрии в результате регулярного взаимодействия между молекулами матриксного белка Р17(МА). Конусовидную сердцевину вириона формирует капсидный белок Р24(СА). Предполагается,

что суженная часть нуклеокапсида взаимодействует с оболочкой вириона. Возможно, что в указанном взаимодействии участвует так называемый «линкерный» белок Р6 (LI). Внутри капсида находятся две молекулы геномной вирусной РНК, связанные своими 5!-концами с нуклеокапсидным белком Р7 (NC). Взаимодействие данного белка с нуклеиновой кислотой обеспечивает консервативный для большинства ретровирусов мотив: так называемые «цинковые пальцы». Этот регион богат остатками цистеина и гистиди-на, связанными с атомами цинка. Взаимодействие данного домена с нуклеиновой кислотой обеспечивает инкорпорацию геномной РНК в вирионы.

В состав вирусных частиц входят также специфические ферменты ВИЧ: ревертаза (RT), интеграза (IN), протеаза (PR) и РНКаза Н. Ревертаза осуществляет процесс обратной транскрипции вирусного генома в инфицированной клетке. Этот фермент представляет собой гетеродимер р66/р51. Интеграза (Р31) обеспечивает интеграцию ДНК провируса в геном клетки-хозяина. Протеаза ВИЧ-1 представлена в виде гомодимеров Р10. Этот фермент активизируется в результате димеризации молекул полипротеина-предшественника PrlóOGag в процессе сборки вирионов. Функцией вирусной протеазы, по-видимому, является процессинг структурных полипротеинов ВИЧ 4 в составе почкующихся частиц — «созревание» вирионов.

В результате транскрипции вирусного генома в инфицированной клетке образуется только один вид пре-мРНК. Синтез различных вирусных продуктов обеспечивается процессингом пре-мРНК или сдвигом рамки считывания в про