Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВИЧ-инфекция в Республике Беларусь (вирусологические, серологические и молекулярно-биологические исследования)

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "ВИЧ-инфекция в Республике Беларусь (вирусологические, серологические и молекулярно-биологические исследования)"

- 3 MAP W7

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ БЕЛОРУССКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

УДК: 578.828.6:578.31.083.22 (476)

ЕРЁМИН Владимир Федорович

ВИЧ - ИНФЕКЦИЯ В РЕСПУБЛИКЕ БЕЛАРУСЬ

( вирусологические, серологические н молекулярно-бнологнческие исследования )

( 03.00.06. - вирусология )

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Минск -1997

Работа выполнена в Белорусском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Лукашевич И.О.

Официальные оппоненты: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Клименко С.М.

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Ершов Ф.И.

доктор медицинскюс наук

Борткевнч B.C.

Оппонирующая организация: Научно-исследовательский институт вирусных

препаратов РАМН, г. Москва

Зашита состоится «» jzU^^j ¡997 г. /С? часов

на заседании совета Д 03.02.01 в Белорусском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь по адресу: 220050 г. Минск, ул. К. Цеткин 4.

С диссертацией можно ознакомить» в библиотеке Белорусского орден Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института эпидемиологии i микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь.

Автореферат разослан » Л 1997г.

-у

Ученый секретарь совета

канд. м«л. наук Петкевнч A.C.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. СГП-Щ - это тяжелое инфекционное заболевание, юразнвшее практически все страны мира и продолжающее распространяться по всей гланете. В настоящее время болезнь приняла размеры пандемии и представляет ие только медицинскую и обшебнолсгнческую, но и социальную проблему.

В белорусски первый случай ВИЧ-инфекшш был выявлен в 1986 году у шостранного студента из Бурунди, а мере! год обнаружен внрусоноснтель - житель, республики. Первый больной СПИДом (зарегистрирован в 1990 году-) через год скончался.

На начало 1996 года в Республике Беларусь выявлено 113 ВИЧ-инфицированных, из лт 66 - местные жители и прибывшие из стран СНГ» 47 - иностранные граждане, 23 человека имели клиническую картину, 11 инфицированных и больных скончались.

Беларусь занимает особое географическое положение, и проведение исследования по выявлению ВИЧ-инфииированньгх, изучению структуры заболеваемости, определению основных групп риска является важньгм условием для проведения эффективных мероприятий по предупрежден!«» распространения инфекции в республике.

С обнаружением первых ВИЧ-инфицированных лиц и больных СПИДом а Республике Беларусь возникла необходимость выделения и изучения штаммов ВИЧ, циркулирующих на территория страны. Получение и исследование юолятов вирусов требуется для решения как фундаментальных, так и прикладных задач. Согласно программе ВОЗ по " Всеобщей борьбе со СПИДом" планируется выделение и изучение биологических, молекулярно-бнологических свойств В1ГЧ, изолированных в разных регионах мира. В этом плане важными представляются и молекулярио-зпидемнологические исследования, дающие возможность получить представление о подтипах вируса, циркулирующих на территории Республики Беларусь, закономерностях генетической изменчивости ВИЧ.

Как известно, вирус в организме ВИЧ-инфиц«рова|ШЬ!Х обнаруживается практически во всех органах и клеточных системах. Однако патогенез СПИДа до настоящего времени изучен недостаточно. Принято считать, что ВИЧ является не только лимфотропным, но и неПротропным агентом. С помощью иммунощпохимических методов исследования гнстосрезов умерших от СПИДа вирус обнаруживали в нейронах, астроцитах и микроглии. В то же время, роль различных клеток в развитии неПродегеиеративных процессов в ЦНС мало изучена.

Все эти вопросы явились предметом наших исследований.

СВЯЗЬ РАБОТЫ С КРУПНЫМИ НАУЧНЫМИ ПРОГРАММАМИ, ТЕМАМ» Настоящая работа выполнена в плане научно-исследовательских разработок Белорусского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь и является частью заданий, проведенных в рамках государственной научно-технической программы СССР " Борьба с наиболее распространенными болезнями " по проблеме СПИДа (темы К 96 и 175) , а также Государственного заказа Республики Беларусь по программе "Здоровье" ( N гос. регистрации 01.91.0 051246).

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Цель настоящей работы - анализ ситуации в отношении распространения ВИЧ-ннфекцни на территории Республики Беларусь, изолирование и изучение биологических свойств штаммов вируса, выработка стратегии и тактики по контролю н предупреждению заноса ВЛЧ-инфекцин в Беларусь.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Определить структуру и выделить основные группы риска в отношении ВИЧ-ннфекции в Республике Беларусь.

2. Провести исследования по серо- и генотипнровлнню вируса и определить подтипы ВИЧ. циркулирующие на территории Республики.

3. Исследовать биологические свойства выделенных штаммов в культурах лимфоцитов периферической крови человека, перевиваемых лимфобластоидных и моноиитарных линиях клеток.

4. Изучить особенности взаимодействия ВИЧ с клетками нейроглмалыюй природы.

5. Определить чувствительность выделенных в республике штаммов В1ГЧ к химическим соединениям и большим дозам гамма излучения.

6. Разработать методическую стратегию и тактику исследований материалов от ВИЧ-инфицированных и лиц, подозрительных а отношении ВИЧ-иифицнровання.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

При выполнении нестоящей работы были получены данные, имеющие как теоретическое, так и практическое значение.

1. Определена структура и выявлены основные группы риска по ВИЧ-инфекции на территории Республики Беларусь. Чаше всего инфекция регистрируется среди мужчин (76 -67,3 0 о), чем среди женщин (37 - 32,7 %).

2. Впервые установлено, что на территории Респ>-блнкн Беларусь выявляются генотнпически гетерогенные штаммы ВИЧ-1, относящиеся к подтипам А, В, С н Д. Выявлено, что даже внутри подтипа наблюдается значительная гетерогенность ВИЧ, что выражалось в различной реактивности в ИФА сывороток крови с синтетическими пептидами УЗ района белка £р120 разных штаммов ВИЧ-1, относящихся к подтипу В.

3. Показано, что изоляты ВИЧ, выделенные в республике, отличаются по биологическим свойствам: способности инфицировать чувствительные клетки, особенностям репродукции в них и цитопатическому эффекту в разных линиях клеток. По репродуктивной способности в лимфоцитах периферической крови, лимфобластоидных и моноцитарных линиях клеток изоляты ВИЧ можно разделить на низкоинфекционные и высокоинфекционные. К низкоинфекционным относятся изоляты, обладающие ограниченной репликативной способностью, низким уровнем накопления вирусного антигена я низким инфекционным титром (2-4 ^ ТЦДю'ш. К высокоинфекционным нзолятам относятся вирусы, реплицирующиеся в большом спектре чувствительных клеток с высоким уровнем вирусных антигенов и высоким инфекционным титром ( 6-9 ТЦГЬо'мл ).

4. Впервые (из республик бывшего СССР) в Белоруссии выделены высокоинфекционные штаммы ВИЧ-12тЬ и ВИЧ-^Кт!, которые по своим биологическим свойствам к антигенной репрезентативности могут быть использованы для производства. диагностических тест-систем и научных целей.

5. Доказано, что первичные диссоциированные культуры астроцитов человека чувствительны к ВИЧ и инфекция в них протекает по латентной и/или продуктивной формам. Обнаружена способность ВИЧ-1 инфицировать первичные диссоциированные культуры астроцитов морской свинки, преодолевая тем самым межвидовой барьер.

6. Установлено, что от вирусоносителей с ранними сроками инфицирования (6-8 месяцев ) из лимфоцитов периферической крови можно изолировать высокорепликативные штаммы ВИЧ.

7. Обнаружены вещества среди оригинально синтезированных и природных соединений. которые оказывают влияние на биологические • свойства ВИЧ, замедляя его репликацию в чувствительных линиях клеток. Показано, что большие дозы у-излучения

(3,0-3,6 Мрад) полностью ингибируют репликатианую активность ВИЧ в культурах чувствительных клеток.

8. Разработан комплексный подход для исследования клинического материала (кровь, сыворотка, плазма, пкгосрезы ) от пациентов с отягощенным эпидемиологическим анамнезом и отрицательными или сомнительными результатами в ИФА и 11Б с использованием серологических, вирусологических, молекулярно-бнологнческих и морфологических методов, позволявший повысить качество диагностики ВИЧ-инфекции.

ПРАКТИЧЕСКАЯ И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведенные исследования позволили определить ситуацию по ВИЧ-инфекции и СПИДу на территории Республики Беларусь, выявить основные группы риска и источники инфекции. Эксперименты по серо- и генотнпированию ВИЧ • дополняют результаты эпидемиологических расследований о путях заноса вируса на территории) республики н могут быть использованы при проведении профилактических мероприятий. В опытах на первнчной диссоциированной культуре астроцитов получены приоритетные данные о патогенезе ВИЧ - инфекции. Они дополняют ранее ошсаниые сведения по изучению ВИЧ-нейроинфекцин и дают возможность значительно расширить представления о роли этого типа нервных клеток в развитии патологического процесса в ЦНС.

По материалам диссертации получены авторские свидетельства на изобретения:

1. A.C. ( СССР ) N 1703686 Штамм вируса иммунного дефицита человека для приготовления диагностических систем ( совместно с Рытиком П.Г., Коломнец Н.Д., Поповым С.А.) от 19.01.1990 г.

2. A.C. ( СССР )N 1797350 Способ обнаружения ВИЧ in vijro ( совместно с Рытиком П.Г., Полешуком H.H., Квачевой З.Б., Поповым С.А.) от 23.04.1990 г.

3. A.C. ( СССР ) N 1822152 9-( Аллилоксиметцл ) аденин, обладающий анти-ВИЧ активностью ( совместно с Новиковым М.С., Озеровым A.A., Брелем А.Н., Рытиком П.Г., БорскоЕ.И.,ВладыкоГ.В.,КоробченкоЛ.В., КучеровымИ.И. )от26.06.1991 г. (ДСП).

4. А С (СССР ) N 1823443 1- ( Аллилохсиметил ) цитоэин, обладающий анти-ВИЧ активностью ( совместно с Новиковым М.С., Озеровым А. А., Рытиком П.Г., БорекоЕ.И., Владыко Г.В., Коробченко Л.В., Кучеровым И.И.) от 26.06.1991 г. (ДСП).

Разработана схема культивирования В!{4 в чувствительных клетках для накопления вирусной массы, используемой в производстве диагностических систем для выявления антител к антигенов ВИЧ.

На производстве "Антиген" (г. Электрогорск, Россия )и в БелНИИ ЭМ выпушены экспериментальные партии иммунофер.чентных тест-систем для выявления антител к ВИЧ-1.

В коллекцию ЕЭС переданы 7 нзолятов В1ГЧ-1, выделенных в Белоруссии, для проведения молекулярно-эпндемнологнческмх исследований, изучения общих закономерностей изменчивости о УЗ районе гена епу ВИЧ с целью создания в перспективе универсальной антн-ВИЧ вакцины.

ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

В качестве коммерческого продукта могут быть использованы изолированные и депонированные высокоинфекционные штаммы ВИЧ-1, а также новыП способ обнаружения вируса, защищенные авторскими свидетельствами.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Основным источником ВИЧ-иифекцни в Республике Беларусь являются иностранные граждане, главным образом прибывающие из стран Африки, и местные жители в возрасте 20-34 лет, страдающие венерическими заболеваниями л/илн вводящие наркотики внутривенно. Чаще инфекция регистрируется среди мужчин, чем сред» женщин ( соотношение 2:1).

2. Выделенные в республике изоляты ВИЧ по фенотипическнм признакам разделены на две группы: высоко* и низкоинфекционные, различающихся по инфекционной активности, спектру чувствительных клеток, характеру цктопатогенного действия в клеточных культурах, уроаио продукции антигенов. От вирусоносителей с ранними сроками после инфицирования ( 6-8 месяцев) можно изолировать высокоинфекционные изоляты ВИЧ.

3. На территории Республики Беларусь определяю«;* генотишгчески гетерогенные штаммы ВИЧ, родственные стандартным северо-американским/западно-европейским вирусам ЙР-2, МЫ и африканским ОУ1 и 16. Выявляемый в популяции ВИЧ-ннфииированиых вирус иммунодефицита человека относится к подтипам А, В, С и Д.

4. Клетки нейроглиачьной природы являются мишенью для ВИЧ-1. Характерным морфологическим признаком присутствия ВИЧ в первичной диссоциированной культуре

астроцитов, является формирование гигантских многоядернмх клеток. Инфекционный процесс в этой куль пре протекает по латентной и'шш продуктивной формам.

5. При исследовании клинического материала от ВИЧ-ннфицнроваиных и больных СПИДом, а также от лиц с отягощенным эпидемиологическим анамнезом ( половые контакты с ВИЧ-инфицированными, множественные переливания крови, нахождение в неблагополучных по инфекции районах и т.д. ) и имеющих неопределенные результаты в серологических тестах, необходимо использовать комплексный подход с применением вирусологических, серологических* иммунохимическнх и молекулярно-биологнческих методов.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД СОИСКАТЕЛЯ Работа выполнена лично автором на базе Белорусского НИИ эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь. Автору принадлежат организация и проведение экспериментальных исследований, теоретическое обобщение полученных результатов и выводы. Отдельные разделы выполнены совместно с сотрудниками БелНИИ ЭМ к.б.н. Квачевой З.Б., д.м.н.. Полещуком H.H., к.б.н. Лемешко H.H., к.б.н. Пыжовой Н.С., д.м.н., проф. МК. Недзьведем (Минский государственный медицинский институт ); совместно с сотрудниками института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН ( директор-академик РАМН Д.К. Львов, г. Москва), руководитель лаборатории Карамов Э.В.; на базе Центра СПИДа в институте Роберта Коха ( руководитель проф. Георг Паули г. Берлин, Германия); института тропической медицины им. Принца Леопольда ( руководитель проф. Гидо ван дер Гроен Антверпен, Бельгия); института физиологической химии (руководитель проф. Вернер Мюллер,

г. Майнц, Германия). Я приношу им свою искреннюю благодарность. По всем результатам имеются совместные публикации.

Я глубоко признателен за научную консультативную помошь и поддержку своему научному консультанту д.м.н., проф. Лукашевичу И.С. и руководителю лаборатории

д.м.н., проф. Рытику ПГ.

Особую благодарность за ценные советы и предложения при оформлении диссертационной работы выражаю академику АН РБ и РАМН, лроф. В.И. Вотякову и д.м.н. Т.В. Амвросье&ой.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные экспериментальные данные и положения диссертации были доложены и обсуждены на I Иммунологическом съезде Белоруссии "Экологические проблемы иммунологии и аллергологии" (г. Минск, 1990), на 1П Республиканской конференции " Примененне электронной микроскопии в науке и технике " (г. Минск, 1991), на 1,2,3 и 4 Международных конференциях "СПИД, рак и ретровнрусы человека" (г, Санкт - Петербург 1992, 1993, 1995, 1996), на LXH сессии обшего собрания Академии медниннскнх наук СССР (г. Москва, 1991 ), на VII Республиканской конференции " Актуальные проблемы аллергологии, иммунологии и СПИДа " (г. Каунас, 1992), на межд)иародной конференции " Прогресс в клинической вирусологии " (г. Прага, 1995 ).

ОПУБ-ПИКОВАНКОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ По материалам диссертации опубликовано 36 научных работ, из них 4 - авторские свидетельства на изобретения.

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертационная работ» изложена на 199 стр. машинописи и состоит из введения, обшей характеристики работы, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 27 графиками я рисунками.

Список цитируемой литературы включает 332 источника стран СНГ и зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ Материалы и методы. Сыворотки крови и моноклинальные антитела. В работе использовались сыворотки кров и от ВИЧ-инфицированных к больные СПИДом, диагностированных в лаборатории БелНИИ ЭМ, референс панель сывороток, содержащих антитела к ВИЧ-2 ( предоставленных National Institute of Allergy and Infectious

Diseases, AIDS Research and Reference Reagent Program ), а также моноклональные антитела к белкам gpl6Q/ gp41,gpl6(Vgpl20, gp41, reHaenv, p55/p24, p55/pl8 гена gag ( предоставленных Dr. H.C. Holmes, Dr. C.Thiriart, Dr. D.Fems and the MRC AIDS Directed Programme Reagent Repository ), p24'p25 ( предоставленных Dr. S.A.Stern, Dr. M.F. Matocha, Dr.K. Steimer, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, AIDS Research and Reference Reagent Program ), которые были использованы для проведения

иммунохимических методов и оценки эффективности работы нммуноферментных тест-систем.

Вирусы. В экспериментах использовали Bíf4-I штаммы 1ГШ, RF, М899, LAV-I и В11Ч-2 - LAV-2, а также вирусы, изолированные в лаборатории изучения ВИЧ БелШШ Э.М.

Культуры клеток. В исследованиях in vitro использовались первичные культуры лимфоцитов и астроцитов человека и морской свинки, а также перевиваемые Т-клеточные и моноцитарные линии клеток: Н9, HUT 78, Mplt-3, Molt-4, Molt-4/8, U-937, C-8166, MT4, Jurkat, Jurkat tal ГП. CEM-SS, СЕМ.

Химические препараты и вещества. В работе использовали более 600 веществ. Основное внимание было уделено оригинально синтезированным и природным соединениям относящихся к различным химическим классам.

Вирусологические методы исследования: выделение вируса из лимфоцитов периферической крови, сыворотки и плазмы ВИЧ-инфииированных и больных СПИДом; адаптация ВИЧ к перевиваемым культурам клеток; определение количества клеток и индекса пролиферации; консервация изолятов; изучение влияния больших доз у-нзлучения на реплнкативную активность ВИЧ.

Молекулярно-биолошчгские методы исследования: выделение ДНК из инфицированных клеток; полнмеразная цепная реакция (ПЦР); РТ-ПЦР; электрофорез в агарозном геле; гибридизация по Саузерну; выделение РНК из плазмы и сыворотки ВИЧ-инфицированных пациентов; сиквенирование ВИЧ по V3 району гена env; обнаружение обратнотранск-рнптазной (ОТ} активности вируса.

Серологические методы исследования: обнаружение антител н антигенов ВИЧ-1и 2 методом иммуноферментного анализа ( ИФА ); подтверждающие тесты иммунный блотлнг и ЛИА-тест.

Статистическая обработка результатов. Титрование вируса проводили методом предельных разведений с десятикратным шагом. За положительный результат принимали культуры, в которых насчитывалось 50 % снншпиев или 50 % клеток содержали вирусные антигены, определенные а НИФ. Титры вируса в lg ТЦДя>/мл вычисляли по методу Кербера (И.П. Ацшярин И А.А. Воробьёв, 1962). При статистической обработке результатов вирусологических и кммунохимнчесхих исследований использовали общепринятые методы ( П.Ф. Рокиихий, 1973 ) определения средней арифметической (х ), среднего каадратического отклонения ( а ), средней ошибки ( S-, ) и доверительного интервала ( ч i ).

Достоверность числовых результатов оценивали по критерию Стьюдента (»). Вероятность ошибки (р) определяли по таблица с помощью вычисленного значения t. Разницу считали статистически достоверной при Р< 0,05 ( П.Ф. Рокишшй, 1973 ),

ВЫЯВЛЕНИЕ ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ЛИЦ И ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ В РЕСПУБЛИКЕ БЕЛАРУСЬ Основной задачей при проведения лабораторной диагностики являлась выработка методологической стратегии и тактики исследовании клинического материала в отношении ВИЧ. Нами не ставилась цель определить чувствительность и специфичность отдельных диагностических наборов, а только отработать оптимальную схему исследования и иа ей основе определить структуру заболеваемости ВИЧ-инфекцией и определить основные группы риска в Республике Беларусь.

Первичный скрининг сывороток крови проводили с использованием иммунофер-ментных тест-систем отечественного и зарубежного производства. За период с мая 1987 по январь 1996 гг. в лаборатории изучения ВИЧ БелНИИ ЭМ МЗ Республики Беларусь первично было проверено 236427 сывороток крови или более 600000 анализов, 1714 образцов исследовались как повторные, т.е. давали положительную реакцию в ИФА в одной из диагностических лабораторий республики. Из них 419 были подтверждены как ИФА положительные и затем исследовались в подтверждающих тестах - иммунном блотннге и ЛИА-тесте. Из 419 образцов положительных в ИФА 222 (53.0 %) реагировали отрицательно, а в S4 (20.0 %) выявлены антитела к одному или нескольким белкам ВИЧ: в 71 (84.5 %) обнаружены антитела к одному из белков вируса (32-р24," 27-р55, 8-рбб, 3-р!7); в 12 (14.3 %) ■ к двум белкам (6-р24 и р55, 2-р24 и р65, 1-р55 и р17, 1-р65 и р31); в одном (1.2 %) - к трем белкам (р17.р24,р55); 107(25.7 %)-определены как положительные, в одном из которых определялись антитела к ВИЧ-2. У трех пациентов, сыворотки крови которых содержали антитела к белкам р-24 -1 и р24 н р55 - 2 произошла сероконверсия и в их сыворотке крови через 2 недели, 1 я 3 месяца были обнаружены антитела ко всем диагностическим белкам ВИЧ-1.

Согласно критериям оценки ВОЗ результатов ИБ, отсутствие полос, соответствующих гликопротеидам gpl60.gpl20 и gp4l дает основание считать реакцию неопределенной. Такие пациенты должны наблюдаться.в динамике, а повторное исследование крови проводиться не реже, чем через 3 месяца. Сыворотку крови необходимо обязательно титро-

вать, и при отсутствии прироста титров антител после двукратных исследований образец можно считать как отрицательный, при определении антител к одному из внутренних4 белков: р17, р31.р51 или р65 (Constantine N.T. ei al., 1990). В тоже время, антнтела к протеидам р24 и р55 могут являться показателями раннего инфицирования, и такие сыворотки крови должны исследоваться в динамике в серологических тестах и обязательно в ГЩР, особенно, если у пациента имеет место отягощенный анамнез в отношении возможности инфицирования ВИЧ (Josephson et al., 1989; Constantine N.T., et al., 1990). Результаты no тестированию трех сывороток, содержащих при первичном исследовании антнтела к р24 и р55 и давших в конечном итоге положительную реакцию в иммунном блотинге, подтверждают эти данные. С другой стороны, очень часто неопределенные реакции в ИБ могут давать сыворотки крови от пациентов, имеющих какие-либо соматические заболевания или клинические состояния (например, образцы от больных е аутоиммунными процессами, с коллагенозами, от беременных и многорожавших женшнн и т.д. ). Поэтому выяснив анамнез пациента и получив результаты повторного анализа, сыворотка его крови далее не исследуется, и пациент на диспансерный учет не берется. Например, в наших наблюдениях 65 сывороток крови, имевших неопределенные результаты в ИБ, были: 21 - от пациентов старше 50 лет, 23 - от доноров и 21 - от беременных. Все эти образцы в дальнейшем определялись как отрицательные.

Однако не всегда обычные серологические тесты в комплексе с клиническими и эпидемиологическими данными позволяют выявить ВИЧ-инфицирование. Например, при исследовании сывороток- крови- от детей, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями. Известно, что вирус от матери может передаваться ребенку с вероятностью 30 ±10 %, а материнские антитела сохраняются в сыворотке крови ребенка до 18-36 месяцев ( Покровский В.В. и др. 1988, Ziegler et al. 1985, Baherys М., et.al 1989,). В этом случае определить ВИЧ-инфицированне возможно с использованием ПЦР ( Read S., et " al.1992, Forghani et al. 1991 ).

Исследование с помощью ПЦР позволило нам в ряде наблюдений определить ВИЧ-инфицирование. Так, у двух детей ( M.-4-x лет н К.-11 месяцев), рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, в серологических тестах были получены отрицательные результаты. Однако использование ПЦР с гнездовыми праймерами дало возможность обнаружить в ДНК из лимфоцитов периферической крови пациентов ДНК-провирус ВИЧ-1. С другой стороны, в примере с пациенткой L.- девочкой 3-х лет. получившей обширные ожоги кожной поверхности, сыворотка крови которой была определена как ВИЧ-

и

инфицированная, применение ПЦР дало возможность снять ошнбочно поставленный диагноз. В данном случае необходимо отметить и такой момент, как не правильно интерпретированные результаты проведенного иммунного блотннга. Исследования ос)шествлялись на тест-системе фирмы "Diagnostik Pasteur" (Франция ), в которой полоса, соответсгв>к>шая белку р40, находится в непосредственной близости от gp41, что и послужило ошибкой при оценке результатов иммунного блотикга.

Как показал анализ сывороток крови пациентов 5f. и Г., при проверке сомнительных, по данным серологических тестов, и даже отрицательных сывороток крови от лиц с отягощенным анамнезом, необходим комплексный подход с использованием серологических, вирусологических, молекулярно-биологичеешх и даже морфологических методов. В обоих этих примерах имели место случаи обратной сероконверсни и "спящей" ВИЧ-инфекции, описанные раннее в литературе ( Groopman J.F. et al. 1985;Ameisen J-C et al. 1989; Haseltine W.A. 1989), когда определяемые первоначально В сыворотке крови пациента антитела исчезали и не появлялись вплоть до терминальной фазы. При этом ЛЦР позволяла обнаруживать ДНК провирус. В случае с пациенткой Sf. ВИЧ-инфицирование было доказано комплексом методов, включающих иммуноферментный анализ на р24 с диссоциацией иммунных комплексов, РТ-ПЦР и выделением ВИЧ в культуре клеток.

На основании наблюдений, нами предлагается следующая схема исследования образцов сыворотки крови в референс-лабораториях: двукратный ИФА на разных тест-системах на ВИЧ-1 и-2 с исследованием образца в параллельных лунках; ИФА на р24 с диссоциацией иммунных комплексов; ИБ; НИФ; ПЦР; выделение вируса. Только после проведения всего комплекса исследований сомнительная сыворотка может считаться положительной Или отрицательной. Данная схема отличается от предложенной ВОЗ тем, что добавляются ИФА на р24 с диссоциацией иммунных комплексов и выделение ВИЧ в культуре клеток. Именно, применение такого подхода при исследовании сомнительных образцов позволите большей вероятностью выявлять положительные образцы. Действительно, предлагаемая схема охватывает все этапы развития ВИЧ-инфекции в организме инфицированного - от виремни до сероконверсни и "спящей"- скрытой инфекции.

Анализируя ситуацию по ВИЧ-инфекции и • СПИДу в республике, необходимо отметить, что в целом ее можно определить как относительно стабильную. С 1987 г. по январь 1996 г. в Республике Беларусь было зарегистрировано ИЗ ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом пациентов. Из них 66 (58,4 %) - жители республики и стран СНГ. а 47 (41,6 %) - иностранные граждане ( в основном студенты из стран Африки ). Случаи ВИЧ-

инфекции зарегистрированы практически во всех областях, за исключением Гродненской, Наибольшее ;гх количество выявлено в г. Минске - 76 (67,2 % ).

Таким образом, на один миллион жителей в Республике приходится 10,5 случаев ВИЧ-инфицирования; в России этот показатель равняется 10,2, в Украине - 36,2, Литве - 10,3, Латвии - 16,8, Эстонии - 33,5. Итак, уровень ВИЧ-инфицирования в Белоруссии соответствует в среднем таковому в России и Литве, но значительно ниже, чем в Украине и Эстонии.

Основным источником инфицирования на территории Республики Беларусь остаются иностранные граждане, в основном прнбываюшие из стран Африки, и наши соотечественники сексуально активного возраста ( в основном 20-34 лет), страдающие венерическими заболеваниями и/или вводящие внутривенно наркотики. Чаще инфекция регистрируется среди мужчин (76 - 67,3 %), чем среди женщин (37 - 32,7 %), а основным механизмом инфицирования являются гетеросексуальные контакты. Эти данные сильно отличается от таковых в Западной Европе и США, где соотношение мужчин к женщинам равняется 7-11:1, а основными механизмами передачи ВИЧ-инфекции являются парентеральный ( внутривенное введение наркотиков -17-22 % ) и гомосексуальный ( 60-75 % ) Berkelman R.L. et al., 1989; Ccutinho R.A., et al 1992).

Таким образом, в целом ситуацию по ВИЧ-инфекшш в Республике Беларусь с 1987 г, по январь 1996 г. можно оценить как относительно благополучную. Однако мы склонны полагать, что ближайший и отдаленный прогноз ВИЧ-инфекции в Беларуси скорее тревожен, чем благополучен. Опасения связаны с упоминавшимися ранее признаками резкого ухудшения эпидемиологической ситуации в отношения многих заболеваний, передающихся сексуальным путем, н быстрого распространения в республике наркомании. Самым убедительным доводом в этом отношении служит недавний пример Украины, где за очень короткий срок на ограниченной территории произошли разительные перемены эпидемиологической обстановки: в течение лишь только 1995 г. количество ВИЧ-ннфииироаанньсх увеличилось на 1499 человек, т.е. их стало в 4,8 раза больше, чем было выявлено за все предыдущие 9 лет. Инфекция распространилась, главным образом, среди лиц. пользующихся наркотическими средствами.

Есть одно обстоятельство, требующее особо пристального внимания при составлении прогноза на ближайшие годы. В респ)<5лике ( впрочем, как и во всех остальных странах бывшего СССР) не налажен контроль за наличием в крови доноров вирусспецнфического

антигена. Именно такое упущение привело к трагическим событиям в Германии, где за короткий срок продуктами крови было инфицировано более 2000 реципиентов.

В качестве рекомендуемых, нам хотелось бы обратить внимание на следующие мероприятия;

1. Провести тшательный эпидемиологический анализ зпияситуашш, сложившейся среди таких групп риска как больные всеми видами венерических заболеваний и наркоманы. Расширит» объем серологического обследования этих групп населения 'в г. Минске, областных центрах и городах областного подчинения. По-прежнему, осуществлять тщательный контроль за прибывающими в Республику на долгий срок ( 3 месяца и более ) лицами из-за рубежа.

2. Разработать меры, предупреждающие возможность инфицирования реципиентов крови и ее просчетов ( внедрение в работу пунктов переливания крови диагностических систем для выявления антигенов ВИЧ, поэтапное Лредварительное тестирование образцов крови до их окончательной реализации и др.).

ХАРАКТЕРИСТИКА ВЫДЕЛЕННЫХ ШТАММОВ ВИЧ: ИЗУЧЕНИЕ В СИСТЕМЕ ПЕРВИЧНЫХ П ПЕРЕВИВАЕМЫХ ЛИМФОЦИТАРНЫХ И МОНОЦИТАРНЫХ ЛИНИЙ КЛЕТОК

После доказательства наличия ВИЧ-инфекция на территория республики необходимо было изучить биологические свойства ВИЧ, выявляемого в популяции ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом. Такие исследования в БелНИИ ЭМ начались с 1987 года после выявления первых инфицированных пациентов - студентов ВУЗов из африканских стран. Из 34 попыток изолировать вирус • 26 (74.5 %) завершились успешно. Из выделенных 26 штаммов ВИЧ 17 были изолированы от взрослых и ребенка без клинических признаков, 5 - от пациентов с пре-СПИДом я 2 от больных СПИДом.

В качестве источников вируса нами использовались лимфоциты периферической кровя, плазма и сыворотка пациентов.

Как показали исследования по контролю м репликацией ВИЧ, первые инфицированные клетки, по данным метода непрямой иммуиофлюоресценшш, появлялись на 5-12 сутки после добавления донорских лимфоцитов. В тоже время, у штамма 2тЪ внутриклеточные антигены удавалось выявить уже на' 3 сутки. Однако, эти сроки удлинялись до 16-27 дней у вирусов со слабой репликатавиой активностью и даже до 30-35 суток -уизолятов 2т 1, Ьотт, Уезт; при этом процент светящихся клеток варьировал от

3-5 % до 27-45 %. Время обнаружения антигенов ВИЧ в культурачьиой жидкости первичных лимфоцитов колебалось в зависимости от репликативной активности вируса и определялось у $1о\\'1о\% вирусов в пределах 2-3 и даже 4-6 недель и у гар!«!^^ - на 5 - 7 день. Титры антигенов варьировали в пределах 1:50 - 1:1000 и 1:1000 - 1:1600, соответственно. Данные по обнаружению реплицирующегося вируса в культуре первотиых лимфоцитов в обшем совпадают с раннее полученными результатами ( Львов Д.К. и др. 1989; Маренникова С.С. и ар. 1990; ТегетеПе М.Т. е1 а1. 1988; Кепуо Е.М., е(а1. 1988 ).

В процессе вьшелення вируса от аснмптоматичных пациентов был отмечен интересный факт: после достоверной регистрации репликации ВИЧ в первые 7-14 дней наступал период, во время которого в клетках только с помощью по.ишеразной цепной реакции можно было определить ДНК провирус. Фаза " молчания " продолжалась от 1 до 3 месяцев.

Адаптация ВИЧ для роста на перевиваемых культурах клеток - следующий этап в процессе выделения вируса. Как показала исследования, успешный перевод вируса на перевиваемые культуры клеток проходил при использовании больших доз инфицирующего материала. Оптимальными были соотношения: по объему культуральиой жидкости 1:1 и по количеству клеток - 1-2 хЮ6 : 1-2x106 кл/мл. Наилучшие результаты достигались при использовании культура клеток ЗиЛа! 1а1 Ш из 18 попыток в 16 (88.9 %) удалось адаптировать вирус для роста в этой линии клеток, а также МоИ-4/8 ( из 8 попыток 7 закончились успешно - 87.5 % ), 11-937 (из 14 - 9 - 64 % ) и Н 9 (из 9 - 5 • 55.6 % ).

Одной из важнейших характеристик биологических свойств В1ГЧ является его цитопатическое действие в культурах первнчных и перевиваемых клеток. Исследования показали, что вирус может вызывать различные типы цитопатлческого эффекта е культурах клеток, который зависел, в первую очередь, от репликативной активности изолятов и типов используемых линий клеток. Отмечалось образование гигантских клеток - сннцитиев ( в двух случаях ), цитодеструкция и гибель клеток (в 12 случаях), сочетание шггодеструктивного-цитошшного эффекта с формированием отдельных синцитиев (в шести случаях ) и не совсем объяснимый эффект, выражающийся в гшкнозе и гибели клеток наблюдали (• четырех случаях). И, наконец, в двух случаях вообще не наблюдалось цитопатическое действие, хотя нммуиохимическн методом непрямой иммунофлюо-ресиеншш ( НПФ ) Я клетках регистрировались вирусные антигены. Сроки появления шпопашческнх проявлений находились в прямой зависимости от репликативной

активности вируса. Так у ВИЧ-lZmb и ВИЧ-lShml цитопаткческое действие в виде образования синцнтнев в комбинации с невыраженным иитоиидным эффектом обнар)-живалось на 7-10 сутки после проведения сокультлвнрования лимфоцитов периферической крови от ВИЧ-инфицированного пациента со стимулированными фкто-гемагглютинином донорскими клетками. У вирусов с низкими реплнкативными характеристиками какое-либо их действие на клетки выявлялось только на 14-29 сутки после добавления донорсктс лимфоцитов. Необходимо отметить, что время появления цитопа-тического эффекта ВИЧ не было связано с моментом обнаружения антигенов вируса, которые, по данным метода непрямой иммунофлюоресценшш, регистрировались иа 2-3 дня раньше.

После сокультивнровання лимфоцитов периферической крови с перевиваемыми культурам! клеток характер цитопагического действия вирусов практически не изменялся. Хотя можно отметить, что у некоторых штаммов с невысокими репдикативными характеристиками цнтопатичесхий эффект обнаруживался гораздо позже И не во всех лнмфоидньгх и моноцитаряых линиях клеток. Например, изолят Kulm вызывал цитошшюе действие только в лимфоцитах периферической крови и моноцятарной культуре клеток U-937, а штамм Muzm, помимо этих двух культур, инфицировал клетки МТ4 на 12 и 16 сутки после сокультивирования. Штаммы Vesm, 2ml, Shm2 обнаруживали цитодеструктивный эффект с образованием небольшого количества синшттев на 4-х, б-и и 7-и использованных лимфоидных и ионоцитарпых клеточных культурах. С другой стороны, вирусы Zmb и ShmJ вызывали цитопатическое действие в виде образования гигантских многоядерных клеток - "цистерн" а "баллонов" во всех применявшихся клеточных культурах. В линиях клеток Molt-4/8, CÉM-SS и МТ4 после заражения их суттернатантом куль-туральной жидкости штамма Zmb цитопатическое действие регистрировалось в 80 %, 50 % и 5 %, соответственно, на 3 сутки после внесения вируса.

Полученные результаты по характеристике цитопатического действия ВИЧ в культурах лимфоцитов периферической крави'н на перепиваемых культурах клеток в целом соответствовали ранее опубликованным данным. Tersmette et al. (1988) показали, что вирусы с высокими репликатнвншш характеристиками вызывают образование снншггнев, в то время как ВИЧ с невысокой активностью не обладали таким свойством. Von Bliesen H.et al. (1987) и Fenyo E.M. et al. (1988) наблюдали отдельные' небольшие синцитии или их комбинацию с гибелью клеток. Такой же характер шггопагического действия был описан в представляемой работе с толятами Zml, Shm2, Vesm и некоторыми другими.

Оценивая биологические свойства ВИЧ по срокам и уровню накопления антигенов вируса в перевиваемых культурах клеток, нами было отмечено, что в максимальных значениях внчтриклеточные антигены определялись у высокоинфекционньк вирусов на 3-5 сутки и у низкоинфекшюнных - на 10-1808 сутки. Причем процент светящихся ¿теток зависел и от используемой культуры. Так, 80-90 % клеток CEM-SS, Jurkat tat III, С8166 содержали антигены вируса после 16 дней культивирования при использовании штаммов ВИЧ-lZmb и ВИЧ-lShml. В этих же культурах клеток удавалось определять 8-22 % инфицированных клеток при работе С изолятами Zml, Zm2, Shm2, Dm, Chrm, Vesm, Sin, Kalml, Loml и некоторыми другими. Антигены в культуральной жидкости определялись через 1-3 дня после достоверной регистрации вируса в клетках методом непрямой иммунофлюоресценшш, и их уровень зависел как от самого вируса, так и от вида используемой культуры. Наиболее чувствительными для накопления вирусной массы оказались линии CEM-SS, Molt-4,'8, Jurist tat Ш ti МТ4 . Так, при заражении клеток Jurkat tat ПГ и MoIt-4/8 штаммом Zmb на 3-й сутки титры вирусных антигенов достигали 1:100000 - 1: 160000, в то время как у штамма Zm2 они выявлялись на 5 сутки только в разведении 1:20. Уровень обратнотранскршпазной активности определялся а те же сроки, что н антигены в культуральной "жидкости и колебался в пределах от 6x10* до 4x10s им/мин в мл культуральной среды в зависимости от штамма и используемых клеток.

Полеченные результаты соответствовали ранее полученным данным, основанным на контроле за репликацией ВИЧ по определению уровня обратлотранскрнпгазной активности (Марешшкова С.С. и др. 1990; Evans L.A. et al. 1987). Однако накопление антигенов штамма Zmb происходило гораздо быстрее, чем у других описанных вирусов.

Важнейшей характеристикой ВИЧ является его инфекционная активность. Именно этот параметр дает возможность выбрать вирус с высокой репликативной активностью н использовать его для приготовления диагностических систем. Как показали исследования, инфекционные титры ВИЧ колебались в пределах 2-9 Jg ТЦД«/мл в зависимости от его реплнкативиой активности и используемой культуры клеток. Штаммы Zmb и Shml имели титры 7-9 !g ТЦДя/мл н 5-7 Ig ТЦДу/ил, соответственно. Ранее в литературе не были описаны вирусы с такой активностью. Обычно ТЦДс/мл колебалась в пределах 4-6 lg.

Многие авторы в своих исследованиях отмечали зависимость биологических свойств вирусов от стадия течения болезни у пациентов. Так. ВИЧ с выраженной еннци-тиообр&зукмаей активностью, с высокими реплнкатнвными характеристиками выделялся от больных иди пациентов со СПИД-родственным коматексом. В то время как вирусы с

п

выраженным иитоциякмм эффектом и невысокой релликативной зктнвностыо изолировали от ВИЧ-инфицированных пациентов без клинических симптомов (ТЫгу Ь., е! а|., 1985; Репуо Е-М е( а). 1989), С прогресснрованнем заболевания от пенмптоматнчной формы до выраженных клинических проявлений некоторые авторы (Львов Д.К. и др., 1989; Репуо Е-М, е! а(., 1989) отмечали и изменение биологических свойств ВИЧ, выделенных от одних и тех же пациентов на разных стадиях течения инфекции. При этом наблюдали превращение нткоинфекшкншых штаммов в вирусы с высокими репликативнымн свойствами и, соответственно, переход от цитощщного эффекта к сшщитнообразуюшему.

Изучая биологические свойства изоллтов ВИЧ, нами не било отмечено связи между стадией течения заболевания и типом вируса. Так, два штамма с высокими репликативнымн характеристиками 2тЬ и Экт! были выделены от вирусоносигелей, инфицированных в пределах 6-8 месяцев назад. С другой стороны, штаммы Ьэтт1 и Ит с инфекционными тиграми 1-2 % ТЩ&о'мл изолированы от' больных СПИДом, Попытки выделить вирус в динамике ( на протяжении 3-5 лет наблюдения ) от тех же пациентов, которые послужили источниками высокоинфекшюнных штаммов 2гпЬ и БЬя?!, завершились изолированием ВИЧ (3 и 2 штамма, соответственно), с низкими решшкатнвнымн характеристиками. Причем такие вирусы были получены даже тогда, когда у обоих пациентов появились клинические симптомы СПИДа, а соотношение клеток СД4:СД8 стало меньше единицы (0.6-0.7).

Исследования по выделению штаммов ВИЧ с высокими реплнкативными характеристиками от пациентов, инфицированных в пределах нескольких месяцев, дали нам возможность выдвинуть концепцию, что изначально в организм пациента проникают вирусы с высоким« решппсатнвньши свойствами. Действительно, чтобы преодолеть защитные барьеры иммунной системы в организме человека, ВИЧ должен быть высокоактивным. После проникновения и включения систем клеточного и тумморального иммунитета часть вирусных частиц элиминируется, другая же попадает в моноциты /макрофаги и позднее через клетка-клеточные контакты или по рецепторному пути проникают в СД4+- лимфоциты. При выделении клеток от бессимптомных, серопозитивных ВИЧ-инфицированных в градиенте фикола или другими общепринятыми методами, изолируется вся популяция лнмфондных клеток, в том числе и моноциты/макрофаги. После стимуляции лектинамн изолированных и отмытых клеток и последующего добавления активированных донорских лимфоцитов происходит освобождение вирусных частиц из инфицированных клеток и заражение ими чувствительных СД4+- мононуклеарных клеток. Наша

концепция подтверждается исследованиями ТегетеПе М., е1 а1. (1988), которые изолировали сшшитиообразуюише ВИЧ от бессимптомных вирусоносителей и недавно Р. ЬтосепП-РгапсШагд сх а1. (1994) доказали, что моноциты являются носителям» вирусов с различными характеристиками, в том числе, к синцитнообразующих типов.

Биохимичесхне, физико-химнческке и морфологические свойства ВИЧ были изучены на примере высокоинфекционных штаммов ¿тЬ и БЬш!. Как показали исследования, вирус имеет размеры порядка 100-130 нм и содержит конусовидный, электронношютный нуклеоид, иногда наблюдались вирионы в 2-3 раза превышающие обычные, с двумя нуклеоидамн. Плавучая плотность вирнонов равнялась в градиентах плотности сахарозы -1,16-1,18 г /см3, урографнна - 1,14 гкм% и хлорида цезия 1,19 г/см3. Максимальное значение обратнотранскриптазной активности соответствовало 1,16 г/см3 в градиенте плотности ( 20-60 % ) сахарозы и требовало присутствия ионов а не Мп 2\

Электрофоретически в 12 %-м и 7.5-15 %-м градиентном геле выявлялись 9 вирусспецифическнх белков с молекулярными массами 160, 120,65,55,51,41, 33,24/25 и р17/18 кД. Эта характеристики не отличались от раннее описанных и соответствовали ВИЧ-1.

Необходимо отметить, что изолированный нами ВИЧ-1 штамм 2тЬ по своим ростовым характеристикам заметно превосходил все ранее описанные шоллты н вместе с ВИЧ-1 5Ьт1 может быть использован дня производства диагностических наборов.

Подводя итоги по изучению биологических свойств штаммов ВИЧ, выделенных на территории Республики Беларусь, можно отметить следующее. Из 26 изолированных и исследованных штаммов ВИЧ, 24 характеризовались прн культивировании однотипным поведением. Главной их особенностью являлось наличие, так называемых, фаз "молчания," когда после регистрации антигенов ВИЧ в первые 5-14 дней у отдельных вирусов наступал период, во время которого в клетках только с помощью ПЦР выявлялся ДНК-провнрус, а все остальные методы тестирования давали отрицательные результаты. Фаза " молчания " продолжалась от 1 до 3 месяцев.

Другой особенностью этих штаммов был низкий уровень репликативной активности. Антигены в культуральной жидкости определялись либо в исходной жидкости, либо в разведенной 1:5 - 1:50. Внутриклеточные белки вируса выявлялись только в 7-12 % клеток. . .. .„, - о'

Цнтопзтическое действие в культуре первичных лимфоцитов н перевиваемых лнмфондных и моношгтарньк линиях клеток, инфицированных такими шоллтачи.

проявлялось в вше иитоцидного эффекта, а у отдельных игтаммов - сочетанием ш;толестр)-кптного воздействия с формированием отдельных, небольших по размеру сикшпчкв.

Еще одним характерным признаком штаммов этой группы была тропность к определенным культурам клеток, в том числе'к моноцитарной липни U-937. Для сокультнвнровання был использован большой спектр перевиваемых лимфоидных и моноцитарных линий клеток. Однако, адаптация происходила успешнее в том случае, когда применялась культура клеток Jurkat tat Ш. Все вышеописанные штаммы (изолированные от взрослых и ребенка без клинических признаков болезни -17, с лре-СГШДом -5 и со СПИДом - 2), хотя и не идентичны, но существенно не отличаются один от другого. Они были отнесены к типу ннзкоинфекцнонньк (slow/low).

Другая группа вирусов характеризовалась высокой реплнкативной активностью во многих лимфобластоидных и моноцитарных линиях клеток, с высоким уровнем внутри-н »неклеточных антигенов и обратнотранскриптазной активности. Особенностью взаимодействия этих штаммов ВИЧ с чувствительными клетками было формирование гигантских многоядерньк клеток-синиитиев - "баллонов" и "цистерн". Инфекционные титры этих нзолятов достигали 7-9 lg ТЦП^'мл, что значительно выше, чем у известных классических штаммов LAV, HTLV-Ш, ARV, М899 и RF. Эти вирусы были отнесены к типу высокоинфекционных (rapid/high). Значительный уровень репликатнвной активности ВИЧ-1 штаммов Zmb и Shml позволяет использовать их в производстве диагностических наборов, Изолят Zmb сдан во Всесоюзную коллекцшо вирусов в Институте вирусологии им Д.И. Ивановского АМН СССР • депонент Государственной коллекции вирусов ГКВ-878 от 14.03.90 г, и в коллекцию Института тропической медицины им. принца Леопольда (Антверпен, Бельгия ). 7 изолятов переданы в коллекцию Европейского Экономического Сообщества для проведения молекулярно-эпидемиологических исследований.

На выделенный оригинальный штамм Zmb получено авторское свидетельство N 1703686 " Штамм вируса нмм>-нного дефицита человека для приготовления диагностических систем " от 8 сентября 1991 г., приоритет изобретения от 19 января 1990 г. После изучения биологических свойств ВИЧ логично было обратить внимание и исследовать тот участок генома вируса, который определяет его фенотипнческие признаки, а именно, V3 вариабельный участок гена env. Показано, что тропизм к различным клеточным линиям, характер шпопатического действия вируса в культурах клеток зависит от изменений в данном участке генома (Leonard С.К., etal. 1990; Moor J.P. 1992). V3 райои

поверхностного белка gpUO является основной мишенью для типоспецнфнческих нейтрализующнх антител Goudsmit J„ et ab (1988). На основании анализа V3 последовательностей большой панели изолятов были описаны девять различных подтипов ВИЧ, обозначенные как A,B,C,D,E,F,G,H и О, которые, как оказалось, ассоциированы с определенными территориями и континентами ( Grez М., et ai., 1994; Gao F., et а!.. 1994).

Определение подтипов ВИЧ, выявляемых в популяции ВИЧ-инфииированных и больных СПИДом в Белоруссии, проводили методом иммуноферментного анализа с использованием синтетических пептидов V3 района gpl20 наиболее типичных представителей подтипов В и Д8ИЧ-1 н сывороток крови от пациентов-жителей республики (серотипированне), а также сиквенированием и последующим сравнением полученных результатов со стандартными последовательностями подтипов А, В, С и Д (гекотипировзние). В экспериментах были применены 8 различных пептидов, соответствующих наиболее распространенным и , хорошо изученным штаммам ВИЧ, ассоциированию! с определенными территориями.

Как показали исследования с набором из 28 сывороток крови от 18 пациентов, на территории республики преобладают штаммы ВИЧ-1 близкие к SF-2 (северо-американсккй/западно-европейский) - у 15 из 18 (83,3 %) исследованных ВИЧ-инфицированных и больных ( оптическая плотность от 1,0 и выше ); МЫ (северо-амернканс-кий/западно-европейский ) - у 9 из 18 (50,0 %); OYI (африканский ) - у 4 из 18. (22.2 %), относящиеся к подтипу В и Z6 (африканский) - у 1 из 18 (5,6 %), представителю подтипа Д. Практически не встречаются вирусы близкие к штаммам НХВ-2 и RF. Многие сыворотки крови перекрестно реагировали с пептидом, соответствующим штамму В1ТЧ-2 ROD (Африка, Сенегал ). Изучение парных образцов, взятых от одних и тех же пациентов в разные временные промежутки, показало, что у многих инфицированных происходит ' дрейф в геноме вируса. Это проявлялось в изменение реактивности их сывороток с разными пептидами. Так, у пациента Kai. наблюдалось заметное снижение реакции в ИФА со всеми из использованных пептидов. С другой стороны, у пациента Sm. было отмечено повышение титров типоспецифнческих антител. Напрймер, образец сыворотки крови, взятый в 1989 и 1990 гг., слабо, реагировал (1+ - 0,3>0п<0,5 ) с синтетическим пептидом, соответствующим штамму SF-2, но та же сыворотка от 1991 и 1993 гг. давала реакцию уже на 4+. Интересными представляются к данные по сравнительному исследованию сывороток крови от инфицированных матерей Chr. и Ког1.и их детей в

возрасте 3-х лет. Результаты опытов показали, что титры антител к различным штаммам ВИЧ у матерей и летей значительно отличаются. Вероятно, произошел сильный дрейф в геноме ВИЧ у детей и .возможно, идут изменения в геноме матерей. Наряду с высокой природной предрасположенностью к изменчивости в геноме ВИЧ, нельзя исключать и такой фактор, присутствующий в республике, как повышенный радиоционный фон. Ведь известно, что небольшие дозы радиации активируют провирус в инфицированных клетках, переводят его из состояния лзтенции в' фазу активной репликации и, естественно, повышают вероятность мутаций в вариабельных областях генома.

Результаты снквеннрования показали, что на территории республики выявляется ВИЧ, относящийся к подтипам А (Африка) и С (Африка, Индия ).

Таким образом, на основании проведетых молекулярно-эпндемиологическнх исследований можно отметить, что на территории республики в популяции ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом выявляются генетически гетерогенные штаммы ВИЧ, относящиеся к подтипам А,В,С и Д, то есть идет занос ВИЧ из-за рубежа.

Изучив биологические свойства выделенных штаммов ВИЧ в культурах лимфсидных клеток мы определяли чувствительность вируса к различньад соединениям как известных своей антивирусной активностью, так и оригинально синтезированным и природным веществам, действие которых в отношении ВИЧ еще не определено. Всего было проверено более 600 вешеств, относящихся к различным классам соединений, в основном оригинально синтезированным. Учет эффективности препаратов проводили с использованием комплекса методов, включающих подсчет живых и мертвых клеток, метод непрямой пммунофлюоресценции, подсчета количества сгшцитнез я формазяновый метод с применением МТТ и ХТТ. Исследования проводили в культурах клеток МТ4, СЕМ-ББ, МоИ-4/8 с применением ВИЧ-1 штаммов ШВ и ХтЬ.

Было выявлено 5 соединений, обладающих анти-ВИЧ активностью относящихся к ациклическим нукдеозидам - 2 : 9-( Аллилоксиметил ) аденин и 1-( Аллнлоксиметил ) шггозин, производным адаиантана - 2: 1-( 2-д!шеталаминоэтоксикарботш) амшго адамантана гндрохлоркд и 1 -амнно-З-трихлорметил адамаитана гндрохлория и природное соединение -1: биополимер. Как было показано ранее ( НауагЫ Б., е! а1. 1988; Раи\\е!5 К. а а1. 1988 ), ациклические нукпеозиды, по аналогии сазидотимиднном ингнбнруют репликацию ВИЧ на стадии транскрипции и мишенью для ннх является обратная транскриптаза вируса. Что касается адамантана, то отмечалось его эффективное действие в отношения ряда РНК содержащих онкогенных и неонкогенных вирусов. Механизм действия, также

как и природного соединения ПС-1 предстоит выяснить. В проведенных исследованиях не ставилось задачей определить как и на каких этапах действует то или иное обнаруженное соединение, а было необходимо выявить только их антивирусную активность и определить новые перспективные классы соединений. Несмотря на не высокий ХТИ (20200) препараты заслуживают дальнейшего внимания, поскольку в 10 раз менее токсичны в отношении лнмфобластоидных культур клеток по сравнению с аэидотимвднном.

На оба соединения, относящихся к классу ациклических нуклеозидов получены заявки на изобретение- N 1823443 и N 1822152 от 12.10.92.

Наши исследования показали, что при облучении ВИЧ ( свободного или в клетках ) дозами у-излучения от 3.0 до З.б Мрад наблюдается полная его инактивация.

ЛАТЕНТНАЯ И ПРОДУКТИВНАЯ ИНФЕКЦИЯ В КЛЕТКАХ НЕЙРОГЛИАЛШОЙ ПРИРОДЫ Известно, что ВИЧ является не только лимфотропным, но и нейротропным агентом, поражающим центральную и периферическую нервную систему. Неврологические проявления встречаются у 20-40 % больных СПИД, у 70-80 % всех умерших от СПИД в ЦНС обнаруживали дегенеративные изменения, а примерно у 10 % пациентов неврологические симптомы являлись первичными проявлениями ВИЧ-инфекщш { Carne С.А., et al, 1985; Berger J.R., et al, 1987; Dalakas M.C., Pèzeshkpour G.H., 1988 ).

Механизм проникновения вируса в ЦНС до настоящего времени не определен. Вероятнее всего ВИЧ попадает туда из крови, а не по нервным окончаниям. В тоже время, не известно как происходит инфицирование ЦНС - ассоциированным с клетками или свободным от них вирусом и какие клетки в центральной нервной системе первыми инфицируются ВИЧ. При виремии, вероятно, возможно непосредственное инфицирование эндотелналышх клеток и в некоторых исследованиях иммунохимнчески было подтверждено наличие вируса в данной популяции клеток ( Wiley С.А., et al. 1986; Но D.D., et al. 1989 ). Другие авторы предполагают проникновение вируса в мозг в инфицированных моноцитах, которые затем превращаются в макрофаги и микроглню. И действительно, во многих работах, при исследовании гистосрезов от умерших от СПИДа с неврологическими проявлениями авторы обнаруживали многоядерные клетки, которые были охарактеризованы как макрофаги ( Mirra S.S., del Rio С. 1989 ) Wiley С.А, с соавторами ( 1986) показали, что вирус в ЦНС может инфицировать еще астроцнты и нейроны. Поражаются также фибробластоподобные клетки мозга и олигодендроциты. В тоже время, данных о

роли тех или иных клеток ЦНС а развитии ВИЧ-неПроннфекщш в литературе практически нет.

Особый интерес в угон связи представляют астроииты (протоплазматические и фибрилярные ). Фиброжые асзроцнты сосредоточены главным образом в белом веществе мозга и одна из их функций состоит в поддержке, опоре центральных миелинизнрованных аксонов. Протоплазматические астроциты представляют собой самые крупные клетки нейроглнм. Они расположены главным образом в сером веществе мозга. Их отростки окружают капилляры, образуя иернваскулярные ножки. Протоплазматические астроциты принимают участие в образовании краевой глии на поверхности мозга, отростки астродитов благодаря многочисленным разветвлениям занимают значительную часть нейропнля ЦНС, находясь в контакте почти со всеми структурами нервной ткани ( Ройтбак А.П., 1993 ). Именно исходя из выше описанных структурных и функциональных особенностей асгронитов, мы решили исследовать возможную роль данных клеток в развитии ВИЧ-нейроннфекшш.

В опытах in vitro исследователи, как правило, использовали перевиваемые глиомные культуры клеток. Показано, что а;троцигы чувствительны к инфицированию ВИЧ и в них устанавливается латентная инфекция или вирус реплицируется не постоянно ( Hatch W.C., et al. 1994 ). Иммунохимическими методами было доказано присутствие в них антигенов ВИЧ. Сокультивированне таких клеток с перевиваемой моноиитарной культурой клеток U-937-I6 приводило к инфшшроёанто Последней ( Chiodi F, et al. 1987). Однако ни в одной из использованных глиомных линий клеток не наблюдали цитопатическсго эффекта.

В экспериментах использовали первичную диссоциированную культуру астроцитов человека, поскольку считали, что применение трансформированных глномных клеток не может дать реального представления о процессах, происходящих в естественных условиях.

Источником получеши культур служила нервная ткань полушарий большого мозга, мозжечка и другт отделов ЦНС практически здоровых людей, подлежащая удалению при хирургических вмешательствах по поводу черепно-мозговой травмы и новорожденных морских свинок. Для идентификации клеток использовали комплексный морфологический, ультраетрухтурный н иммуноштшйшческий анализ. В качестве специфического маркера использовали моноклональиме антитела к человеческому глиально фибрилярному кислому белку ( Dakopatts. Danmark), который является специфическим маркером для астрошгго». Электронно-микроскопические исследования дЛя идентификации астроиитоа позволили

обнаружить в цитоплазме клеток специфические пучки промежуточных филаментов. Наличие в соме и в отростках астроцитов фибрил - один из наиболее характерных признаков, отличающих их от других нейроглиальных клеток. Полученные перв!гчные монослойные культуры астроцитов состояли из 89- 92% астроцитов ( протоплаз-матических и фнбрнлярные ), 8-11% фибробяастов и макрофагоподобных клеток, а также 23% клеток точную природу которых установить не представлялось возможным. Астроциты in vitro имели свойства высоко дифференцированных клеток, сохраняющих некоторые из признаков, присущих им in situ.

Для заражения астроцитов использовали ВИЧ-1 штаммы ШВ и Zmb с инфекционным титром 51g ТЦДгс/мл. Инфицирование монослойных культур астроцитов проводили как вируссодержащей культуральной жидкостью ( I способ ), так и отмытыми лнмфо-бластонаными клетками продуцентами ВИЧ ( II способ ). В основу второго способа инфицирования была положена способность астроцитов in vitro участвовать в реакциях фагоцитоза.

Первичную культуру астроцитов человека выращивали в субпассажах (8-10 пассажей ). В течение всего времени культивирования клетки и супернатант культуральной жидкости исследовали на наличие ВИЧ. При наблюдении за культурами прижизненно и ка окрашенных препаратах уже на 1-м пассаже наблюдали стимуляцию роста клеток, инфицированных клеткамн-продуцентами ВИЧ, выражающуюся в изменении плотности насыщения, архитектоники монослоя и сроках его образования. Так формирование мояослоя в инфицированной культуре клеток происходило в течение 7-10 дней, а в ивтактных - 15-16 суток, первые цитопатические изменения в этих культурах были отмечены на 2-м пассаже ( 18 дней после инфицирования ) и выражались в формировании многоядерных астроцитов ( до 17 ядер ). Те же морфологические изменения, однако с меньшей степенью выраженности ( 4-5 % многоядерных клеток ), наблюдали на более поздних пассажах ( 5-6 пассаж ) в культурах астроцитов, инфицированных вируссодержащей культуральной жидкостью. Ультраструктурпый анализ многоядерных клеток в инфицированных астроцитах позволил определить в последних тенденцию к накоплению в их цитоплазме глиофибрил, формированию вакуолей и фаголйзосомных включений. При этом почкования вирусных частиц от плазматической мембраны обнаружено не было. Методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моиоклональных антител и поликлональной сыворотки в культурах инфицированных первым и вторым способами было обнаружено специфическое цитоплазматнческое

2Î

саеченне как в клетках с одним ядром, так и в много ядерных. Процент таких клеток составлял 10-12 % в культурах, инфицированных первым способом, И 20-25% и даже более вторым. Ревертазной активности в концентрате сулернатанга инфицированных культур определить не удалось, в тоже время, на протяжении всего времени наблюдения ( -7 пассажей ) дот-гибридизацией в зараженных клетках'определялся ДНК-провнрус ВИЧ-1.

Эксперименты подтвердили раннее полученные данные ( Wiley С.A., et al. 1986 ) о том, что астроциты человека могут быть инфицированы ВИЧ. В тоже время, впервые показано, что инфицирование клеток может происходить как по реиепторному пути ( при заражении внруссодержащей культуральной жидкостью ), так и путем фагоцитоза зараженных ВИЧ лимфоцитов с установлением, в данном случае, латентной формы течения инфекционного процесса. Также впервые в мировой практике показано, что инфицированные вирусом астроциты могут формировать многоядерные образования. До этого только при морфологических исследованиях материала от умерших больных со СПИДом в ЦНС удавалось обнаруживать многоядерные клетки, которые были определены как макрофаги ( Mirra S.S., del Rio С., 1989). Мы полагаем, что астроциты могут играть роль депо ВИЧ в центральной нервной системе. Учитывая непосредственный контакт клеток с капиллярами и возможность встроцитов к фагоцитозу можно предположить, что и в естественных условиях инфицирование клеток «ожег происходить двумя выше описанными способами. Прн этом дальнейшее развитие процесса в ЦНС может зависеть как дозы вируса, так и , вероятно, от обшей настроенности макроорганизма. Медленное, прогрессирующее течение дегенеративных процессов в ЦНС у ВИЧ-инфицированных, по всей вероятности, связано с длительной перснстениией вируса в клетках мозга, в том числе, и в астроцитах. На данный способ обнаружения ВИЧ в клетках ЦНС получена заявка на изобретение N 1797359.

Как известно, примерно у 10% ВИЧ-инфицированных пациентов первично встречается неврологическая симптоматика ( Саше C.A.et al.1985; Berger J.R. 1987 ). Естественно встает вопрос, а не может ли ВИЧ непосредственно вызывать поражение клеток ЦНС, в частности встроцитов, активно в них реплицироваться, вызывая их быструю гибель и таким образом приводить к появлению симптомов поражения центральной нервной системы.

Для получения продуктивной формы БИЧ-инфекши в культуру первичных встроцитов человека второго пассажа ( 3 сутки ) на 24 часа вносяти липополисахарид в концентрации 1 мкг чл. Основными целями, которые при этом преследовались были:

активация покоящихся клеток, увеличение соответственно пула митотически делящихся клеток, что приводило к повышению количества клеток-мишеней для ВИЧ. к улучшению условий для его проникновения в клетку. Заражение астроиитов проводили ВИЧ без клеток, поскольку в предварительных опытах с использованием моноклонатьных антител обнаружили рецепторы СД4+ на глиальных клеток.

Как показали проведенные исследования уже на 7-8 сутки после внесения ВИЧ в культуре стали появляться многоядерные клетки ( до 15-18 ядер ) и Щ1Д. Количество таких конгломератов достигало 20-30 %. Цитопатическое действие усиливалось в пассажах и на 4 достигало 50 %, что не дало возможности пассировать культуру датыле.

При морфологических исследованиях в культуре астроиитов отмечали реактивацию части клеток, заключающуюся в увеличении их размеров и гнперпродукшш глпаль-нофнбрилярного кислого белка. Формирование многоядерных клеток шло по пути слияния их оболочек и формирования гигантских симпластов. Методом непрямой иммуно-флюоресценшш в клетках с одним ядром и многоядерных отмечалось специфическое цитоплазматическое и оболочечное свечение при использовании полнклональных сывороток от инфицированных пациентов и моноклональных антител к поверхностным белкам gp!60'gp!20 и gp!60/gp41. В ПЦР были получены четкие положительные результаты начиная С первого пассажа. При исследовании в иммунноблотннге концентрата культлральной жидкости 3 и 4 пассажей, разделенном электрофоретически в 7,5-15 % градиентном геле и перенесенном затем на нитроцеллюлозиую мембрану нами были выявлены 9 вярусспецифических белков: gptöO, gpl20,gp41,p65, p55,p5t, рЗЗ,р24ир17, что явилось четким подтверждением репликации вируса в первичной культуре астроиитов человека. Последующее заражение перевиваемой культуры клеток Jurkat tat Ш супериатантом культлральной жидкости с астроиитов 4-го пассажа и их инфицирование бьюо ещё одним доказательством репликации ВИЧ в клетках астроглии.

Таким образом, наша концепция предполагает, что вирус может непосредственно инфицировать нервные клетки, в частности астроциты, сохраняться, репродуцироваться и разрушать их. Учитывая, что астроциты находятся в тесном контакте практически со всеми клеточными системами ЦНС, мы считаем, что скорее всего инфицирование ВИЧ клеток ЦНС и их последующее разрушение - процесс комплексный, включающий как непосредственное действие вируса на клетки, так и опосредованное через лимфокииы, специфические белки или другие механизмы.

ВЫВОДЫ

1. Ситуацию по ВИЧ-инфешни в Республике Беларусь с 1987г. на начало 1996 г . можно оценить как относительно благополучную ( относительный показатель 10,5 на млн. жителей ), сопоставимую по уровню инфицированности населения с Россией (10.2) и Литвой (10.3) и в несколько раз ниже, чем в Эстонии ( 33,5 ) и в Украине (36.2). Основным источником ВИЧ-инфекция в Республике Беларусь являются прибывшие в страну иностранные граждане, а главной группой риска среди местных жителей являются молодые люди в возрасте 20-34 года, страдающие венерическими заболеваниями и/или вводящие наркотики внутривенно. Чаще инфекция регистрируется у мужчин (76 - 67,3 %), чем у женщин (37- 32,7 %), соотношение 2:1. Основным механизмом инфицирования ВИЧ в республике являются гетеросексуальные контакты.

.2. Иа территории Республики выявлены разнообразные генетические варианты ВИЧ-1, родственные стандартным северо-американским/западно-европейским штаммам SF-2, MN и африканским OY1 и 26. Серо- и генотипировянием вируса установлено, что в стране у ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом определяется ВИЧ, относящийся к подтипам А, В, СиД

3. От внрусоносителей н больных СПИДом, в Республике Беларусь, изолировано и изучено 26 штаммов ВИЧ. Выделенные изоляты характеризуются гетерогенностью биологических свойств, что позволяет разделить их на низконнфекционные (slow/low ) и высоконнфекиионные ( rapid/high ). Slow/low вирусы обладают способностью реплицироваться в ограниченном ряде лимфобластоидных и моноцнтарных линий клеток и низким уровнем продукции вирусных антигенов, низким инфекционным титром (2-4 lg ТЦДод/мл), a rapidliigh размножаются в перевиваемых культурах лимфобластоидных и моноцитарных линий клеток с высоким уровнем вирусных антигенов и высоким инфекционным титром (6-9 lg ГЦ&о'мл). Впервые в структуре бывшего СССР в 1988 г. выделен и изучен высокоинфекционный штамм BJiM-l'Zmb ( 9 lg ТЦД5»'мл ).

4. Первичные диссоциированные культуры астроцитов являются пермнссивной системой для изучения ВИЧ-нейроинфекшш in vitro. Вирус инфицирует астроциты человека и инфекционный процесс в mtx протекает по латентному и'илн продуктивному пути, а характерным морфологическим признаком является формирование конгломератов гигантских многоядерных клеток.

5. Выявлено 5 веществ, относящихся к классам ациклических нуклеозидов -2, производным аллманта - 2 и природных соединений - 1 с ХТИ равным 20-400, влияющих

на биологические свойства ВИЧ и лнгибнруюших репликацию вируса in vitro. Установлено, что большие дозы гамма излучения (3,0-3,6 Мрад) полностью ингибируют ВИЧ как в культуре клеток, так и в супернатанте культуральиой жидкости. 6. Разработана схема лабораторного исследования клинического материала от ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом, а также от лиц с отягощенным эпидемиологическим анамнезом и с неопределенными результатами серологических тестов с применением комплекса вирусологических, иммуиохнмических, серологических и молекуллрно-биологическпх методов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Анализ сывороток кр°ви методом иммуноблота с использованием природного и рекомбинантного антигенов ВИЧ / Злобин А.Ю., Аракелов С. А., Попов С.А., Чаплннскас С .А., Еремин В.Ф., Корнеева М.Н., Носик Д.Н., Руднева И.А., Карамов Э.В., Рытик П.Г., Стаханова В.М., Урываев Л.П. // Вопросы вирусологии,- 1988,- N 6,- С. 700-703.

2. 9-(Аллилоксиметил) аденин, обладающий анти-ВИЧ активностью / Бредь H.H., Новиков М.С., Озеров A.A., Рытик П.Г., Еремин В.Ф., Бореко Е.И., Владыко Г.В., Коробченко Л.В., Кучеров И.И. II Авторское свидетельство N 1822152 от 12.10.1992.-приоретет от 26.06.1991.

3. 1-(Аллилоксимепш) цитозин, обладающий анти-ВИЧ активностью / Новиков М.С., Озеров A.A., Рытик П.Г., Еремин В.Ф., Бореко Е.И., Владыко Г.В., Коробченок Л.В., Кучеров И.И.//Авторское свидетельство N 1S23443 от 12.10.1992.- приоретет от 26.10.1991.

4. Биологические свойства ВИЧ, выделенного от жителя БССР / Рытик П.Г., Ван дер Гроен Г., Еремин В.Ф., Коломиец Н.Д., Попов С.А., Нис П., Виллемс В., Веркаугерен Г., Илькевнч Ю.Г., Лемешко H.H. // Здравоохранение Беларуси.- 1989.- N.11.- С. 11 -12.

5. Биологические свойства ВИЧ, выделенного от вирусоносителя, проживающего в БССР / Рытик П.Г., Ван дер Гроен Г., Еремин В.Ф., Коломиец Н.Д., Попов С.А., Нис П.. Виллемс

B., Веркаутереи Г., Илькевнч Ю.Г„ Лемешко H.H. И Вопросы вирусологии,-1990.-N 5.-

C.388-389.

6. Два случая СПИДа: клинико-анатомический анализ < Недзьведь М.К., Кулаженко Л.Г., Никифоров Б.Н., Новиков Л.П., Протас И.И.. Петрович И.В., Росса H.A., Кабушкнн И.И., РытикП.Г.. Еремин Б.Ф. / Здравоохранение Беларуси.- 1995.-N.2-С.14-18.

7. Еремин В.Ф., Рытнк П.Г., Попов С.А. Биологическая характеристика rapid'high штамма ВИЧ. выделенного в СССР // LX1I сессия общего собрания академии медицинских наук СССР. Тез.докл,- Москва, 1991.- С. 13.

8. Еремин В.Ф., Рытнк ИХ. Современные подходы к терапии ВИЧ-ннфекции // Здравоохранение Беларуси,- 1993,- N.4.- С.65-70.

9. Использование ноличеразной цепной реакции для контроля за латентной ВИЧ-ннфекцней in vitro / Еремин В.Ф., Попов С.А., Кучеров И,И., Рытик П.Г. // Вопросы вирусологии.-1991.-N 4,-С. 331-333.

10. Использование первичной культуры астроцнтов для моделирования ВИЧ-нейроинфекции /' Рышк П.Г., Еремин В.Ф., Полешух H.H., Попов С.А., Мюллер В.Е.Г., Ашер Д.М. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии,-1993,- N 2,- С.47-52.

11. К вопросу диагностики ВИЧ инфицнрованностн I Еремин В.Ф., Кучеров И.И., Попов С.А., Пыжова Н.С., Подольская И.А., Оганова Е.Г., Рытнк ГГГ. //Актуальные проблемы аллергологии, иммунологии и СПИД. Тез.докл. конф,- Каунас, 1992,- С.54.

12. Клинико-лабораторное наблюдение случаев ВИЧ-инфекции / Рытик П. Г., Коломиец Н.Д., Лучко В.П., Захаревич Р.И., Коломиец А.Г., Кравчук З.С., Еремин В.Ф. // Фундаментальные и прикладные аспекты СПИД. Маг. конф,- Москва, 1988.- С.42-48.

13. Комплексный подход к диагностике ВИЧ-1 - инфекции: использование полимеразной цепной реакции в качестве альтернативного подтверждающего теста. / Еремин В.Ф., Попов С.А,, Пыжова Н.С., Кучеров И.И., Кюхерер К., Паули Г., Рытик П.Г. // ЖМЭИ. -1996.--N.5,- С.23-27.

14. Культура астроцнтов человека как модель для изучения нейрологнческого аспекта патогенеза СПИД / Рытик П.Г., Полешук H.H., Квачева З.Б., Еремин В.Ф., Илькевнч Ю.Г., Капнтулец С.П.. Попов С.А. // Экологические проблемы иммунологии и аллергологии. Тез.докл.конф,- Минск, 1990.- С. 114-115.

15. Методы молекулярной биологии в комплексной диагностике ВИЧ-инфекции / Попов С.А., Еремин В.Ф., Кучеров И.И., Пыжова Н.С., Глазовский В.А., Рытнк П.Г. // Здравоохранение Беларуси.- 1993.- N 4,- С.29-32,

16. Морфологическая диагностика серонегативного наблюден!« ВИЧ-инфекции / Нед5ьвель М.К.. Еремин В.Ф., Протас И И., Почебыт Б.ФУ/ Архив Патологии,- 1995.- N 4.-С.80-83.

17. О достоверности лабораторной диагностики у детей младшего возраста ' Еремин В.Ф., Попов СЛ., Котович О.А., Пыжова Н.С., Кучеров И.И., Кожемякин А.К., Глазовский В.А., Рытик П.Г. // Здравоохранение Беларуси.- 1994.- N 1.- С.41-43.

18. Особенности формирования многоядерных астроиитов при моделировании ВИЧ-инфекции in vitro / Рытик П.Г., Полещук Н.Н., Квачева 3. Б., Илькевич Ю.Г., Еремнк

B.Ф., Капитулец С.П. // Применение электронной микроскопии в науке и технике. Тез. докл. конф.- Минск, 1991,- С. 8.

19. О штаммосых особенностях циркулирующего в СССР ВИЧ-1 по данным изучения свойств в клеточных культурах / Маренникова С.С., Степанова Л.Г., Носик М.Н., Рытик П.Г., Еремин В.Ф., Мацевич Г.Р., Янова Н.Н. // Вопросы вирусологии.- 1991,- N 5.- С. 356361.

20. Подавление репродукции вируса иммунодефицита человека ( ВИЧ ) цнтокиноподо-бным антивирусным фактором / Грибкова Н.В., Еремин В.Ф., Вотяков В.И., Щелканов М.Ю., Пашкова Т.А., Карамов Э.В. // ЖМЭИ. - 1996. - N.5. - С.27-29.

21. Применение молекулдрно-биологических методов для диагностики и изучения ВИЧ-инфекции в Республике Беларусь / Попов С.А., Еремни В.Ф., Кучеров И.И., Рытик П.Г. // Актуальные проблемы аллергологии, иммунологии и СПИД. Тез.докл.конф.-Каунас, 1992.-

C.75.

22. Рытик П.Г., Еремин В.Ф., Полещук Н.Н. Особенности моделирования ВИЧ-инфекции на лабораторных животных // Здравоохранение Беларуси. - 1992,- N 9.- С. 35-38.

23. Способ обнаружения ВИЧ in vitro / Рьггнк П.Г., Полещук Н.Н., Квачева З.Б., Еремин В.Ф., Попов СЛ. // Авторское свидетельство N 1797350 от 23.04.1990.

24. Штамм ВОТ длл приготовления диагностических систем / Рьггнк П.Г., Еремин В.Ф., Коломиец Н.Д., Попов С.А. //Авторское свидетельство N 1703686 от 8.09.1991.- приоритет от 19.01.1990.

25. Эпидемиология ВИЧ-ннфекшш в Беларуси / Рытик П.Г., Кучеров И.И., Подольская И.А., Еремин В.Ф., Бабин А.Ф. // Здравоохранение. - 1996. - №8. - с.29-32.

26. Accumulation of transcripts coding for prion protein in human astrocytes during infection with human immunodeficiency virus / Muller W.E.G., PfeiferK., Forrest J., RytikP.G., Eremirt V.F., Popov S.A., Schroder H-C. // Biochimica et Biophysica Acta.- 1992. - N 1139.- P. 32-40.

27. Biological properties of HIV strains isolated in Belarus I Eremin V.F., Pyzhova N.S., Kucherov I.I., Kvacheva Z.B., Podolskaja 1.А., Krapivina S.V., Petrovich I.V., Rytik P.G. // 4-th International Conference" AIDS, Cancer and Related Problems". - St.-Petersburg, 1996. - P. 101.

28. Complex evaluation of the laboratory testing. Data of the doubful HIV-infection cases / Rytik P.G., Eremirr, V.F., Popov S.A., Pyzhova N.S., Kucherov I.I. H, 2-nd International Conference "AIDS, cancer and human retroviruses.- St.- Petersburg, 1993.- P.17.

29. Complex approach to HIV-infection diagnosis / Eremire V.F., Kucherov I.I., Pyzhova N.S., Rytik P.G., Titov L.P. // International Joint Meeting " Progress in clinical virology ".Prague, 1995,- P.I01.

30. Inhibition of HIV-and Herpes Simplex viruses replication by cytokine-like antiviral factor / Gribkova N.V., Ereinre V.F., Votyakov V.l., Vladyko G.V. //3-rd International conference " AIDS, Cancer and Related Problems ".- St-Petersburg, 1995.-P. 47.

31. Molecular history of HIV-infection in the ax-USSR / Karamov E., Lukashov V., Yarosla\1seva N.. Chaplinskas S., Eremirt V., Rytik P., Papuashvili M., Kliaitov R. // 3-rd international conference " AIDS, Cancer and Related Problems ".- St.-Petersburg, I99S.- P.27.

32. Non-traditional approach to assesment of ¡ÍTV-infection model in laboratory animals / Rytik P.G., Eremin V.F., Poleschuk N.N.. Müller W.E.G. // International conference on AIDS, cancer and human retroviruses.- St.-Petersbtirg, 1992,- P.25.

33. Polymerase chain reaction like a evaluating criterion of HIV-infection in vivo / Rytik P.O., Koutcherov I.I., Müller W.E.G,, Podolskaya I.A., Kruzo M., Dooboyskaya G.P., Ere mire V.F., Rebenok G.A. // 3-rd international conference " AIDS, Cancer and Related Problems ".- St.-Petersburg, 1995,-P.29.

34. Serotype heterogenecitv analysis of HIV-I positive sera from the territory Byelorussia / Yudin A.N., Shchelkanov M.Yu., Yaroslavtseva N.G., Eremin V.F., Semiletov Yu.A., Karamov E.V. // 4-th International Conference " AIDS, Cancer and Related Problems ". - St.- Petersburg, 1996. -P.101.

35. Susceptibility of primary human glial fibrillary acidic protein positive brain cells to human immunodeficiency virus infection in vitro: anti-HIV activity of memantine / Rytik P.G., Eremiro V.F., Kvacheva Z.B., Poleschuk N.N., Popov S.A., Schroder H-C., Bachmann M„ Weiler B.E., Muller W.E.G. // AIDS Research and Human Retroviruses,- 1991,-Vol.7.-N l.-P. 89-95.

36. Use of astrocytes primary culture for modelling HIV-neuroinfection / Rytik P.G., Kvacheva Z.B., Eremirt V.F., Poleschuk N.N., Popov S.A., Muller W.E.G., Asher D.M. // International conference on AIDS, cancer and human retroviruses.-St.-Petersburg, 1992.-

РЭЗЮМЕ

ЕРЕМШ УЛАД31М1Р ФЕДАРАВ1Ч

В1Ч - 1НФЕКЦЫЯ У РЭСГГУБЛЩЫ БЕЛАРУСЬ (ВГРУСАЛАПЧНЫЯ, СЕРАЛАГР4НЫЯ И МАЛЕКУЛЯРНА-Б1ЯЛАГ1ЧНЫЕ ДАСЛЕДВАНН1)

Ключавыя словы: в^рус ¡мунадэфшыту чалзвека ( В1Ч ), В1Ч - шфекцыя. пярв1чныя и перав1ваемьш культуры лЫфощкьи \ неЙраглЫльных клеток, рэгцпкатьгуная актыунасць ВГЧ, сера -! генатыпаванне В1Ч. .

Абъект даследвання: Л1.мфацыты перыферычнай крыв! В1Ч - ¡нфии-раваных 1 хворых на СНЩ, аутапмйны матэрыял лзодзей, сываратка ! плазма крыв! В1Ч - ¡нфшраваных 1 хворых на СН1Д, ¡заляты ВГЧ.

Мэта пращ: анал!з атуацьи у адносшах распаусюда;аннасц1 В1Ч - шфекцьй на тэрыторьи РБ, вывучэнне фялагичных уласшвасцау вьцзеленых штамау вируса, выпрацоука стратэгп1 тактик! па контролю и папярэджаншо заносу В1Ч - ¡нфекцьи у Беларусь.

Методы даследвання: в1русалаг1чныя, сералапчныя, малекулярна - б1ялапчныя, !мунацытах!м1чныя, удьтраструктурныя, статыстычныя.

Апаратура: святавы, люмиисцентны» швертыраваны и элетронны мжраснопы, шзкахуткасныя 1 улырацэнтрыфуп СОг - термастат, ламтарныя боксы, ПЛР - тэрмаблок.

Атрыманыя выжнч: паказана, што основным ¡сточшкам шфшфаваккя на тзрыторьи РБ застаюцца замежныя грачадзяни, у осноуным прыбываючыя з краш Афрьгк!, { каши суанчыншм сзксуальна актыунагв узросту (20 - 35 гадо$),

пзкутуючыя на венерычньш захворванш ¡/або уводзячыя наркотыю унутрывенна. Устаноулена, што ¡задяты В1Ч, выдзеленыя ад ВГЧ шфщыраваных \ хворых на СНЩ адрозшваюцца па бЬлапчным уласщвасцям: спасобнасцы ¡нфщыраваць адчувальныя клеткг, асабл1васцям рэпрацушь» ¡нфшыраваных культурах клетак, цытапатьгчнаму эыекту У розных Л1Н!ях клеток. Паказана, што пярв5чныя лиссацправаныя культуры - астрашта? чалавека адчувальны да В1Ч « шфекцыя у ¡х працякае па латентнай з/або прадуктыунай формах. Устаноулена, што на тэрыторьи РБ выяулякшиа генатычныя гетерагенныя штамы В1Ч, як!я адносяцца да падтылау А, В, С 1 Д.

Навуковая иавЬна: Атрыманы новыя вгды аб структуры захворваннеу \ трупах рызьпо па В14 - шфекы! т тзррыторьн РБ, а таксама аб бгялапчных уласшвасцях штамау В1Ч, ¡заляваных у краше, аб сера м генатыпах В1руса, выяуляемых у папуляцьн В1Ч -шфшыраваных ) хворых на СНЩ.

Рэкаменаацы) па выкарыстанию: выкарыстанне новых падходау да дыягностьш цяжых вьшадкау В1Ч - ¡нфщыравання, выкарастанне высокашфекцыйных штамау В1Ч-1 для прыгатавання дыягнастычных тэст-сыстемау.

Гал1на выкарыстання: цэнтры папярзджанкя СНЩу, цэнтры ппеиы 1 этдэмтялоти,

НД1 вирусалапчната профипо, вьшладанне адпаведных раздела? в!русалогц на медзщьшсмх 1 б1ялаг!чных факультэтах ВНУ.

РЕЗЮМЕ

ЕРЁМИН ВЛАДИМИР ФЁДОРОВИЧ

ВИЧ - ИНФЕКЦИЯ В РЕСПУБЛИКЕ БЕЛАРУСЬ ( ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ, СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ )

Ключевые слова: вирус иммунодефицита человека ( ВИЧ ), ВИЧ-инфекция, первичные и перевиваемые культуры лимфоидных и нейроглиальных клеток, репликативная активность ВИЧ, серо- и генотипирование ВИЧ.

Обьскт исследования: лимфоциты периферической крови ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом, аутопснйный материал людей, сыворотка и плазма крови ВИЧ-икфинкрованных и больных СПИДом, изоляты ВИЧ.

Цель работы:' анализ ситуации в отношении распространения ВИЧ-инфекции на территории Республики Беларусь, изучение биологических свойств выделенных штаммов вируса, выработка стратегии и тактики по контролю и предупреждению заноса ВИЧ-инфекцнн в Беларусь.

Методы исследования: вирусологические, серологические, молекулярно-бнологическпе, иммуиошпохимнческие, ультрастр}КГ)риис, статистические.

Аппаратура: световой, люмшшсцентный, инвертированный и электронный микроскопы, низкоскоростные и ультрацентрифуги, СОз - термостат, ламинарные боксы, ПЦР-термоблок.

Полученные результаты. Показано, что основным источником инфицирования на территории Республики Беларусь остаются иностранные граждане, в основном прибывающие из стран Африки, и наши соотечественники сексуально активного возраста ( 20 - 35 лет ), страдающие венерическими заболеваниями и'или вводящие наркотики внутривенно. Установлено, что изоляты ВИЧ, выделенные от ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом отличаются по биологическим свойствам: способности инфицировать чувствительные клетки, особенностям репродукции в инфицированных культурах клеток, цнтопатическому эффекту в различных линиях клеток. Показано, что первичные диссоциированные культуры астроцитов человека чувствительны к ВИЧ и инфекция в шгх протекает по латентной к/или продуктивной формам. Установлено, что на территории Республики Беларусь выявляются генетически гетерогенные штаммы ВИЧ-1, относящиеся к подтипам А, С, В и Д.

Научная новизна. Получены новые знания о структуре заболеваемости и группах риска по ВИЧ-инфекции на территории Республики Беларусь, а также о биологических свойствах штаммов ВОТ, изолированных в стране, о серо- и генотипах вируса, выявляемых в популяции ВИЧ-ннфицированньгх и больных СПИДом.

Рекомендации по использованию. Применение новых подходов к диагностике сложных случаев ВИЧ-инфицирования, использование высокоинфеышонных штаммов ВИЧ-1 для приготовления диагностических тест-систем.

Область применения: центры профилактики СПИДа, центры гигиены и эпидемиологии, НИИ вирусологического профиля, преподавание соответствуют»« разделов вирусологии на медицинских и биологических факультетах ВУЗов.

ABSTRACT

EREMIN VLADIMIR FEDOROV1CH

HIV-INFECTION IN BELARUS ( VIROLOOICAL, SEROLOGICAL AND MOLECULAR-BIOLOGICAL INVESTIGATIONS )

Key-words: human immunodeficiency virus (HIV), HIV-infection, primary and continuous cultures of lymphoid and neuroglial cells, HIV replicative activity, HIV sero- and genotyping.

Subject ofinvestigations: peripheral blood lymphocytes from AIDS patients and HIV-infected individuals, human autopsy samples, blood sera and plasma from AIDS patients and HIV-infected individuals, HTV isolates.

Objectives of investigations: analysis of the situation with HIV-infection prevalence on the territory of Belarus, biologic properties of isolated virus strains, development of strategy to monitor and prevent HIV-infection import to Belarus.

Methods of investigations: virologic, serologic, molecular-biologic, immunocytochemical, ultrastructural and statistical methods.

Equipment: light, luminescent, inverted and electron microscopes, low rate- and ultracentrifuges, COj-thermostat, laminar boxes, PCR-thermoblock.

Findings: It was proved that foreign citizens (mainly from Africa) and native people in sexually active age (20-35 yrs.) with sexually transmitted diseases and/or intravenous drug abusers still remain the main source of the infection. HIV isolates from AIDS patients and HIV-infected individuals were determined to differ in their biologic properties such as ability to infect susceptible cells, reproduction peculiarities in infected cell cultures, cytopathic effect in various cell lines. It was shown that primary dissociated human astrocytes are susceptible to HIV and the infection in them is characterized by latent and/or productive forms. Genetically heterogenous HIV-1 strains from A,C,B and D subtypes were revealed among population on the territory' of Belarus.

Scientific novelty: New knowledge was obtained on the morbidity structure and HIV-infection risk groups on the territory of Belarus as well as on biologic properties of HTV strains, isolated from native population, on sero- and genotypes of the viruses from AIDS patients and HIV-infected individuals.

Recommendations for application: new approaches in diagnosis of complicated HTV -infection cases, usage of highly infective HIV-1 strains for the preparation of diagnostic testsystems.

Field of application: centres for HTV prevention, centres for hygiene and epidemiology, research institutions of virologic profile, teaching of appropriate virologic subjects at medical and biologic faculties of educational institutes.