Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение нуклеотидных последовательностей и серологических свойств V 3 петли ВИЧ-I на материале из Санкт-Петербурга и Украины

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Набатов, Алексей Анатольевич, Санкт-Петербург

1 $ /

> I- I 1 }

/

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

НАБАТОВ Алексей Анатольевич

ИЗУЧЕНИЕ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ И СЕРОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ УЗ ПЕТЛИ ВИЧ-1 НА МАТЕРИАЛЕ ИЗ САНКТ-ПЕТЕРБУРГА И УКРАИНЫ

03.00.04-Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук КОЗЛОВ А.П.

Санкт-Петербург 1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ...................................................................................................................................................2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ............................................................................................4

1. ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................................................................5

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................................................................И

2.1. Развитие эпидемии ВИЧ/СПИД в мире...............................................................................................11

2.2. ГеномВИЧ-1, свойстваи функции вирус-специфичных белков....................................................14

2.3. Вариабельность ВИЧ-1...............г..........................................................................................................20

2.4. Структурам функции поверхностного гликопротеина....................................................................22

ОР120 ВИЧ-1...................................................................................................................................................22

2.5. Гуморальный ответ на ВИЧ.................................................................................................................23

2.6. Субтипы ВИЧ-1 и методы определения субтипов ВИЧ-1..................................................................25

2.6.1. ПЦР-секвенирование.......................................................................................................................26

2.6.2. Серотшшрование.............................................................................................................................27

2.6.3. Гетеродуплексный анализ................................................................................................................33

2.7. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-инфекции................................................................................34

2.7.1. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-инфекции в мире...................................................................34

2.7.2. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-инфекции в странах бывшего СССР.....................................35

3.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................................................................................37

3.1. Пациенты..............................................................................................................................................37

3.2.Метод пептидного ИФА........................................................................................................................42

3.2.1. Синтетические пептиды...................................................................................................................42

КОД........................................................................................................................................43

3.2.2.Твердофазный иммуноферменшый анализ...................................................^

3.3. Получение материала из периферической крови ВИЧ-инфщщроаддных пациентов..................45

3.3.1 Получение сывороток.......................................................................................................................45

3.3.2 Получение плазм иМКПК................................................................................................................45

3.4. Методы очистки ДНК............................................................................................................................46

3.4.1. Выделение ДНК из МКПК ВИЧ-инфицированных пациентов.......................................................46

3.4.2. Выделение плазмидной ДНК...........................................................................................................46

3.4.3. Выделение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы..................................................................47

3.4.4. Очистка ДНК между ферментативными реакциями.......................................................................47

3.5. Амплификация ВИЧ-специфичных фрагментов...............................................................................48

3.6. Анализ нуклеиновых кислот...............................................................................................................50

3.6.1. Электрофорез препаратов ДНК.......................................................................................................50

3.6.2. Препаративный электрофорез препаратов ДНК в легкоплавкой агарозе.......................................50

3.6.3. Электрофорез препаратов ДНК в ПААГ в неденатурируюхцих условиях......................................51

3.6.4. Электрофорез препаратов ДНК в ПААГ в денатурирующих условиях.........................................51

3.6.5. Перенос и иммобилизация препаратов ДНК на фильтрах..............................................................51

3.6.6. Методы молекулярной гибридизации.............................................................................................52

3.6.6.1. Мечете ДНК радиоактивными изотопами.................................................................................52

3. б. 6.2. Гибридизация нуклеиновых кислот на фильтрах.........................................................................53

3.7. Клонирование амплифицированных ВИЧ-специфичных фрагментов..........................................53

3.7.1. Подготовка плазмидного вектора для клонирования......................................................................53

3.7.2. Подготовка амплифицированного фрагмента для клонирования...................................................54

3.7.2.1. Выделение и очистка фрагментов амплифицированной ДНК из легкоплавкой агарозы............54

3.7.2.2. Модификация концов амплифицированных фрагментов.............................................................55

3.7.2.3. Фосфорилирование концов амплифицированных фрагментов....................................................55

3.7.3. Лигирование.....................................................................................................................................56

3.7.4. Подготовка компетентных клеток Е.соН для трансформацииТ.......................................................56

3.7.5. Трансформация клеток Е.соН рекомбинантными плазмидами.......................................................57

3.7.6. Огбор рекомбинантных клонов.......................................................................................................57

3.7.7. Анализ клонированных фрагментов................................................................................................57

3.7.7.1. Рестрищионный анализ рекомбинантных плазмид....................................................................57

3.7.7.2. Анализ рекомбинантных плазмид методом ПЦР........................................................................58

3.8. Секвенирование фрагментов ДНК......................................................................................................59

3.8.1 Секвенирование клонированных фрагментов ДНК.........................................................................59

3.8.2. Прямое секвенирование ампшфицированных фрагментов ДНК...................................................59

3.9. Математические методы анализа данных........................................................................................60

3.9.1. Методы анализа многомерных данных при серотшшровании.......................................................60

3.9.2. Методы анализа нуклеотидных последовательностей....................................................................61

3.9.2.1 Поиск межсубтипных рекомбинаций в последовательностях ВИЧ-1.........................................62

3.9.2.2 Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей.................................................63

3.9.3. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей................................................64

4. РЕЗУЛЬТАТЫ........................................................................................................................................65

4.1. Нуклеотидные последовательности УЗ петли ВИЧ-1 на материале Санкт-Петербурга и Украины........................................................................................................................................................65

4.1.1. Амплификация <?т>-специфичных фрагментов вариантов ВИЧ-1 из г. Санкт-Петербург и Украины.....................................................................................................................................................65

4.1.2. Результаты клошфования еиу-специфичных фрагментов.............................................................68

4.1.3. Определение нуклеотидных последовательностей еиу-специфичных фрагментов ВИЧ-1............71

4.1.3.1. Определение нуклеотидных последовательностей участков гена ет> вариантов ВИЧ-1 методом секвенирования клонированных фрагментов............................................................................71

4.1.3.2. Определение нуклеотидных последовательностей ВИЧ-специфичных участков гена ет> методом прямого секвенирования............................................................................................................72

4.1.4. Результаты поиска максимально гомологичных последовательностей в Банке генов...................74

4.1.5. Результаты филогенетического анализа нуклеотвдных последовательностей..............................75

4.2. Изучение антигенного разнообразия ВИЧ-1......................................................................................78

4.2.1. Изучение гомологии реконструированных аминокислотных последовательностей ВИЧ и синтетических пептидов, взятых для анализа...........................................................................................78

4.2.2. Изучение спектров иммунореакгивности сывороток, взятых на различных сроках ВИЧ-инфекции....................................:..............................................................................................................81

4.2.3. Изучение спектров иммунореакгивности сывороток в популяции украинских ВИЧ-инфицированных .......................................................................................................................................81

5.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................................................................87

«.ВЫВОДЫ....................................................................................................................................................103

7.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................................................104

8.ПРИЛОЖЕНИ Я..........................................................................................................................................122

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

АТФ Аденозин трифосфат

а/к Аминокислоты

БСА Бычий сывороточный альбумин

ВИО Вирус иммунодефицита обезьян

ВИЧ-1(2) Вирус иммунодефицита человека первого (второго) типа

ВОЗ Всемирная Организация Здравоохранения

ДЕАЕ Диэтиламиноэтил

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

дНТФ Дезоксинуклеотид трифосфат

ДТТ Дитиотреитол

мкпк Мононуклеарные клетки периферической крови

мРНК Информационная РНК

О.Е. Оптическая единица

ОПы Оптическая плотность при длине волны N

ПЦР Полимеразная цепная реакция

РНК Рибонуклеиновая кислота

СПИД Синдром приобретенного иммунодефицита

т.п.н. тысячи пар нуклеотидов

тРНК Транспортная РНК

ТАЕ 40мМ Трис-ацетат; 2мМ EDTA, рН 8,0

ТЕ 20мМ Трис-HCl рН 8,0; 1мМ EDTA

Трис Трис(гидроксиметил)аминометан

УФ Ультрафиолет

CIP ( \ Щелочная фосфатаза теленка

DMSO 1 Диметилсульфоксид

EDTA ' Этилендиаминотетраацетат динатриевая соль

НМА Метод гетеродуплексного анализа (heteroduplex mobility assay)

IPTG Изопропил-Р-тио-галактопиранозид

kD Килодальтон

LB Среда Luria-Bertani (1% бакто-триптон; 0,5% дрожжевого

экстракта; l%NaCl)

LB-агар 1% бакто-триптон; 0,5% дрожжевого экстракта; 1% NaCl

1,5% бакто-агар

LTR Длинный концевой повтор (от англ. long terminal repeat)

PBS Натрий-фосфатный буфер (150мМ NaCl; 20мМ

Na2HP04/NaH2P04, рН 7,6)

SDS Додецилсульфат натрия

SSC 0.15М NaCl; 0.015М Na-цитрэт, рН 6,8

TBE 0,089М Трис-борат;89 мМ борная кислота; 2мМ EDTA, рН 8,0

WHO World Health Organization (то же, что ВОЗ)

X-gal 5-бромо-4-хлоро-3-индолил- P-D-галактопиранозид

X Длина волны

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является возбудителем опасного инфекционного заболевания - ВИЧ-инфекции, конечной стадией которой является СПИД. Первые случаи СПИДа в США были зарегистрированы в 1981 году (Gottlib et al., 1981; Masur et al., 1981). В настоящее время распространение этого заболевания приобрело характер пандемии. По мнению экспертов ВОЗ, интенсивное распространение ВИЧ началось в конце 70-х - начале 80-х годов. К началу 80-х годов уровень инфицирования ВИЧ-1 оценивался в 100 тысяч человек, а к началу 90-х годов это число увеличилось в 100 раз и составило 10 миллионов человек (Mann, 1992). По данным Всемирной организации по борьбе со СПИДом (UNAIDS), представленным в докладе о глобальной СПИД/ВИЧ эпидемии общее число инфицированных в мире составляет 30,6 миллиона человек, из которых 5,8 миллиона было инфицировано в 1997 году, а количество смертных случаев от СПИД на конец 1997 года составляет 11,7 миллиона человек. Наиболее пострадавшим регионом является Африка, где количество случаев заболевания СПИДом оценивается более чем в 21 миллион человек. В настоящее время эпидемия наиболее быстро распространяется в Южной и Юго-Восточной Азии. На данный момент развития эпидемии число инфицированных в Азии составляет свыше 6 млн. человек (Report on the global HIV/AIDS epidemic, 1998).

По современной классификации для эпидемии ВИЧ/СПИД выделяются три стадии ее развития: ранняя (nascent), на которой уровень инфицированности в определенных группах риска составляет менее 5%; концентрированная (concentrated), на которой уровень инфицированности в определенных групп риска составляет более 5%, а уровень. инфицированности среди беременных женщин составляет менее 5% и генерализованная (generalized), на которой распространение ВИЧ-инфекции выходит за

пределы групп риска, а уровень инфицированности среди беременных женщин составляет 5% и более (A World Bank policy report, 1997)

Первые случаи ВИЧ-инфекции на Украине были зарегистрированы в 1987 году, при этом доминировал половой путь передачи инфекции. За период 1987-1994 гг. было зарегистрировано только 183 ВИЧ-инфицированных. Но в конце 1994 года были обнаружены первые единичные случаи ВИЧ-инфекции среди наркоманов, использующих внутривенное введение наркотиков. За 1995 год было зафиксировано 1490 новых случаев ВИЧ-инфекции, из них 1021 (68%) - наркоманы (Kobyshcha et al., 1996). На конец 1997 года оценочное число ВИЧ-инфицированных на Украине составляло 110 ООО (Report on the global HIV/AIDS epidemic, 1998), из которых 76% составляли наркоманы, 15% заразились гетеросексуальным путем, причем источником полового пути передачи ВИЧ-1 в большинстве случаев являлись ВИЧ-инфицированные наркоманы.

Взрывообразное распространение эпидемии ВИЧ/СПИД на Украине в 1995 году явилось подобным примером данной эпидемии в странах бывшего СССР.

В соседних с Украиной странах - бывших республиках Советского Союза (Россия, Беларусь, Литва) - наблюдается такая же тенденция в развитии эпидемии. В 1996 году зафиксировано взрывообразное распространение ВИЧ-инфекции среди наркоманов в Светлогорске (Беларусь) (Рытик и др., 1997). В ряде регионов России, в частности в Калининградской области, в 1996 году также зарегистрировано быстрое распространение ВИЧ-инфекции среди наркоманов (Момот и др., 1997). Так, в Поволжском регионе с апреля 1996 по январь 1997 года выявлено 346 ВИЧ-инфицированных, из которых более 90% - внутривенные наркоманы. В Калининградской области, начиная с июля 1996 года по апрель 1997, выявлено более 1200 ВИЧ-инфицированных, среди которых 75% внутривенные наркоманы. В целом по России на конец 1997 года выявлено 5123 ВИЧ-инфицированных (в т.ч. 323 ребенка), из них 2516 - за 7 месяцев 1997 года.

Одной из особенностей ВИЧ является исключительно высокий уровень генетической изменчивости, обусловленной значительной скоростью репродукции вируса и селективным отбором мутантных вирусов в процессе развития заболевания. Развитие методов ферментативной амплификации нуклеиновых кислот с последующим их структурным анализом позволило проводить прямой мониторинг генетической изменчивости ВИЧ в организме инфицированного, в популяции ВИЧ-инфицированных и в географическом регионе. С увеличением объема данных о первичных последовательностях ВИЧ-1, полученных из основных центров пандемии СПИДа, оказалось, что можно идентифицировать 2 отличающихся друг от друга группы ВИЧ-1 (Myers et al., 1996; Kostrikis, 1995), которые обозначают - М (major) и О (outliner). В свою очередь группа М включает . в себя 10 подгрупп. Эти подгруппы в настоящее время принято называть субтипами ВИЧ-1 и обозначать латинскими буквами от А до J.

В последнее время, в связи с работами по созданию вакцины против ВИЧ/СПИД, все большее внимание исследователей занимает изучение субтип-зависимой иммунологической реакции организма на ВИЧ-1. В связи с этим быстро развиваются методы серотипирования ВИЧ. Серотипирование на основе УЗ-субтипимитирующих пептидов как метод анализа субтипического разнообразия ВИЧ-1 находится на начальном уровне, о чем свидетельствует продолжающаяся дискуссия о взаимоотношении между серотипом и генотипом ВИЧ-1 (Cheingsong-Popov et al., 1998, Zolla-Pazner et al., 1998). Одним из выходов из создавшегося положения все больше исследователей видят в выделении серотипа в отдельную таксономическую единицу ВИЧ-1 (Cheingsong-Popov et al., 1998) или во введении новых понятий вроде "иммунотип" (Zolla-Pazner et al., 1998).

Для Украины, несмотря на то, что эпидемия ВИЧ там приобрела взрывообразный характер раньше, чем в других странах бывшего СССР, многие молекулярно-биологические характеристики данной эпидемии, такие как частота представленности

субтипов ВИЧ-1, их географическое и популяциоиное распределение все еще остаются неясными. На Украине существует возможность изучить эти параметры параллельно с прогрессией начальной стадии эпидемии ВИЧ/СПИД при переходе ее в стадию концентрированной эпидемии.

Учитывая уникальность эпидемической ситуации на Украине как возможного источника распространения ВИЧ в другие страны бывшего СССР и в первую очередь в Россию, изучение молекулярно-биологических характеристик изолятов ВИЧ-1, которые выявляются в различных группах риска на Украине, могут помочь в дальнейшем в работе по разработке вакцин и лекарств против ВИЧ/СПИД.

Цели и задачи исследования.

Целью исследования было изучение различными биохимическими методами факторов определяющих результаты серотипирования ВИЧ-1, а также изучение субтипического разнообразия изолятов ВИЧ-1, которые выявляются в популяции наркоманов на Украине.

Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

1. Изучить возможные изменения в реактивности антител к основному нейтрализуемому домену ВИЧ-1 с течением инфекции.

2. Осуществить широкомасштабный серотипический анализ сывороток ВИЧ-инфицированных.

3. Определить нуклеотидные последовательности гена еп\ ВИЧ-1 и провести их филогенетический анализ с целью определения их субтипов ВИЧ-1.

4. Сопо