Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-биологическая характеристика изолятов ВИЧ-1 в Санкт-Петербурге

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологическая характеристика изолятов ВИЧ-1 в Санкт-Петербурге"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

РГ6 од

1 1 НОЯ 1986

ЕМЕЛЬЯНОВ Александр Васильевич

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГНЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛЯТОВ ВИЧ-1В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ

03.00.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в Государственном Научно-исследовательском институте особо чистых биопрепаратов Министерства здравоохранения и медицинской промышленности РФ.

Научный руководитель: Канд идат биологических наук,

КОЗЛОВ А.П.

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор,

ШВАРЦЕ.И.

Кандидат биологических наук, ст.н.с., ПЕРЕВОЗЧИКОВ АЛ.

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт

онкологии им. Н.Н.Петрова

Защита диссертации состоится " !ЛуО Л года в 16

часов на заседании Диссертационного Совета К О63.57.0У по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Петербургском государственном Университете по адресу 199034, Санкт-Петербург, Университетская набережная, 7/9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М.Горысого Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан "_"_1996 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат биологических наук старший научный сотрудник

Р.ИКоваленко

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является возбудителем опасного инфекционного заболевания — синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). Первые случаи СПИДа в США были зарегистрированы в 1981 году (Gottlib et al., 1981; Masur et al., 1981). В настоящее время распространение этого заболевания приобрело характер пандемии. По мнению экспертов Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), интенсивное распространение ВИЧ началось в гонце 70-х — начале 80-х годов. К началу 80-х годов уровень инфицирования ВИЧ-1 оценивался в 100 тысяч человек, а к началу 90-х годов это число увеличилось в 100 раз и составило 10 миллионов человек (Mann, 1992). По данным, представленным на X Всемирной конференции по СПИДу, состоявшейся в августе 1994 года в Йокогаме, с момента начала пандемия около 4 миллионов человек в мире заболело СПИДом, из них 1,5 миллиона за 1993-1994 годы. Наиболее пострадавшим регионом является Африка, где количество случаев заболевания СПИДом оценивается более чем в 2,5 миллиона человек (Merson, 1994). В настоящее время эпидемия наиболее быстро распространяется в Южной и Юго-Восточной Азии. За 1993 год количество заболевших в этом регионе увеличилось в восемь раз — с 30 тыс. до 250 тыс. человек, что в 1994 году составило 6% заболевших во всем мире по сравнению с 1% в 1993 году (Sarda et al., 1994). Количество инфицированных в мире в настоящее время, по оценкам ВОЗ, составляет 20 миллионов человек. Общее количество взрослых, инфицированных ВИЧ с конца семидесятых годов по настоящее время, в Африке оценивается более чем в 10 млн. человек (Lewis, 1994). Количество инфицированных в Азии составляет около 2,5 млн. человек, 40% из которых составляют женщины. Темпы развития эпидемии в Азии указывают на то, что к 2000 году число инфицированных в Азии возрастет в 4 раза и достигнет 10 млн. человек (Lewis, 1994).

До настоящего времени уровень ВИЧ-инфицированности в России остается низким по сравнению с другими странами. Так, по результатам эпидемиологического анализа в Санкт-Петербурге уровень ВИЧ-инфици-рованности составляет лишь 0,0025%. Выявляемосгь новых случаев ВИЧ-1 инфицирования в течение ряда лет не показывала резкого нарастания эпидемии. Такая ситуация предполагает, что эпидемия ВИЧ/СПИД в Санкт-Петербурге и России находится в начальной стадии. По результатам анализа ВИЧ-инфицирования среди иностранцев можно предположить, что вирус мог проникнуть в Санкт-Петербург непосредственно из Африки, благодаря большому количеству студентов из стран Африки с высоким уровнем ВИЧ-инфицированносга населения, и значительно раньше, чем это предполагалось ранее. Низкая скорость развития эпидемии не исключает возможности взрывообразного развития эпидемии ВИЧ/СПИД в Северо-Западном регионе, Санкт-Петербурге и России в целом, как это происходило в других странах (Kozlov et aL, 1993;KozIovetaL, 1994).

Одной из особенностей ВИЧ является исключительно высокий уровень генетической изменчивости, обусловленной высокой скоростью репродукции вируса и селективным отбором мутантных вирусов в процессе развития заболевания. Развитие методов ферментативной амплификации нуклеиновых кислот с последующим структурным анализом нуклеиновых кислот позволило проводить прямой мониторинг генетической изменчивости ВИЧ в организме инфицированного, в популяции ВИЧ-инфицированных и в географическом регионе. С увеличением количества данных о первичных последовательностях ВИЧ-1, полученных из основных центров пандемии СПИДа, оказалось, что можно идентифицировать 10 отличающихся друг от друга групп вирусных изолятов (Myers etal., 1994; Kostrikis, 1995). Эти группы в настоящее время принято называть субтипами ВИЧ-1 (или серотипамиВИЧ-1, если использовать иммунологические термины).

Для России многие вопросы, такие как степень генетической вариабельности, частота представленности вариантов ВИЧ-1, их географическое и попующионное распределение, все еще остаются неясными. В России существует уникальная возможность изучить эти параметры параллельно с прогрессией ранней стадии эпидемии ВИЧ/СПИД, тогда как во всех остальных странах с высоким уровнем инфицированное™ населения эта стадия была пропущена и осталась неизученной.

Учитывая уникальность эпидемической ситуации в России и то обстоятельство, что распространение ВИЧ-1 в мире приобрело характер пандемии, изучение молекупярно-биологических характеристик изолятов ВИЧ-1, которые циркулируют в регионе, поможет в дальнейшем в работе по разработке вакцин и лекарств против ВИЧ/СПИД. Цель и задача исследования.

Целью исследования было изучение генетического разнообразия изолятов ВИЧ-1, циркулирующих в Санкт-Петербурге, и представленности субтипов ВИЧ-1 в различных группах ВИЧ-инфицированных пациентов. Исхода из этого, были поставлены следующие задачи:

1. Сбор образцов лимфоцитов, плазм и сывороток от ВИЧ-инфицированных пациентов. Создание банка нуклеиновых кислот го клеток ВИЧ-инфицированных пациентов.

2 Определение первичной последовательности и проведение структурного анализа участков генома ВИЧ-1, кодирующих область основного нейтрализуемого домена.

3. Филогенетический анализ изолятов ВИЧ-1 с целью определения субтипов ВИЧ-1, которые циркулируют в Санкт-Петербурге. Основные положения, выносимые на защиту.

1. В популяциях ВИЧ-инфицированных в Санкт-Петербурге циркулирует вирус субтипа "В". -

2. Генетическое разнообразие изолятов ВИЧ-1 предполагает множественные и независимые проникновения различных изолятов ВИЧ-1 субтипа "В" в Санкт-Петербург.

3. Высокий уровень генетического разнообразия изолятов ВИЧ-1,

циркулирующих в популяции ВИЧ-инфицированных пациентов в

Санкт-Петербурге, по-видимому, является одной из характеристик

ранней стадии эпидемии ВИЧ/СПИД.

Научная новизна работы.

Впервые установлено, что среди инфицированных гомосексуалистов, а также среди ВИЧ-инфицированных женщин циркулируют штаммы ВИЧ-1 субтипа "В".

Научно-прастическая значимость работы.

Исследование относится к разряду научно-практических работ. Полученные данные о субтипах ВИЧ-1, циркулирующих в Санкт-Петербурге, являются начальным этапом в научных разработках вакцины против ВИЧ/ СПИД

Форма выполнения диссертационной работы.

Работа была выполнена в рамках финансирования по грантам No. R1B000 от Международного Научного Фонда (Фонд Сороса) и No. 5D43TW00010 от Международного Фонда Фогарти (Fogarty International Center).

Апробация работы.

Материалы, представленныевдиссертации,докладывались наXВсемирной конференции по СПИДу (Йокогама, 1994). Результаты диссертационной работы представлены на 2-й и 3-ей Международных конференциях: "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург, 1993,1995); на Международной конференции Лаборатории биологии опухолевой клетки (Бетезда, США, 1995).

Основное содержание работы отражено в 4-х научных публикациях.

Объем и структура работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 185 страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 рисунками (фотографиями) и 20 таблицами. Указатель литературы содержит 188 ссылок на публикации отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментах использовались образцы сывороток и клеток периферической крови от ВИЧ-инфицированных пациентов, выявленных в лаборатории клинической иммунологии на базе городской инфекционной больницы №30 им. С.П.Боткина. Серопозитивность пациентов была подтверждена с помощью различных коммерческих тест-систем для иммуно-ферментпого анализа (ELISA) и иммуноблота.

Из мононуклеарных клеток периферической крови ВИЧ-инфицированных пациентов выделяли высокомолекулярную ДНК с помощью коммерческого набора для выделения ДНК—DNAttractor (Санкт-Петербург,

Россия). Выделенную ДНК впоследствии использовали в полимеразной цепной реакции.

Для получения ВИЧ-специфических фрагментов использовались синтетические олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие участок прови-русной ДНК, кодирующей белок gpl20 и основной нейтрализующий домен (С2-У4-домены). Использовался принцип ПЦР с использованием гнездовых праймеров (nested PCR). В реакции ПЦР использовался принцип комбинации различных пар внешних и внутренних праймеров. Амшшфициро- . ванные фрагменты в дальнейшем анализировались посредством электрофореза в агарозном геле с последующей гибридизацией с ВИЧ-специфичной пробой. Амплифицированные фрагменты клопировали в плазмидных векторах pBluescript SK(+) и pZero-1 в клетках E.coli. Отбор рекомбинангных плазмид осуществляли селекцией клонов на селективных средах и гибридизацией с ВИЧ-специфичной пробой. Рекомбинангные клоны анализировали рестрикционным картированием на наличие полноразмерной вставки фрагмента, пригодного для секвенирования. Из отобранных рекомбинант-ных клонов выделяли плазмвдную ДНК, которую впоследствии использовали в реакции секвенирования. Реакцию секвенирования проводили по методу Сенджера с использованием коммерческих наборов д ля секвенирования. Результаты секвенирования определяли визуально на авторадиограммах геля после электрофореза. Компьютерный анализ первичных последовательностей амплифицированных фрагментов ДНК и белков проводился с помощью суперкомпьютера HELIX с использованием пакета программ для анализа GCG (Wisconsin Package program, DCRT, National Institute of Health, Бетезда, США). Нуклеотидные последовательности амплифициро-ванных фрагментов были выровнены с помощью программы PILEUP (GCG) множественного выравнивания последовательностей по способности образовывать гомологичные пары, с учетом минимизации образования мутаций типа вставок/делеций (gaps) между образовавшимися парами. Кон-сенсусная последовательность для амплифицированных фрагментов была определена с помощью программы построения консенсусных последова-теяьностей PRETTY (GCG). Для выравнивания нуклеотидных последовательностей наших нзолятов ВИЧ-1 и последовательностей из базы данных (GeneBank HIV Sequence Database; Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, США), а также для поиска гомологичных участков использовалась программа GAPS (GCG). Анализ значимости нуклеотидных и синонимичности аминокислотных замен определяли с помощью программы PEPSTRUCTURE (GCG). Филогенетический анализ первичных последовательностей ампл ифицированных фрагментов ДНК проводили с использованием программы по определению эволюционных различий между выровненными последовательностями DISTANCES (GCG). Эволюционные (генетические) различия (distances) амплифицированных последовательностей были определены как количества нуклеотидных замен на 100 нуклеоти-дов с использованием 5 различных методов. Для определения генетических различий на уровне полипептидных последовательностей использовалась

программа PEPDIST. На основании результатов определения эволюционных различий последовательностей с помощью программы Growtree (GCG) были построены филогенетические деревья в системе UPGMA (Unpaired Group Method Analysis), учитывающей постоянную скорость эволюции и в системе NJ (neighbor joining), по принципу наибольшего родства нуклео-тидных последовательностей, определяемого многоматричным анализом. Первичные последовательности изолятов ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV были выбраны с использованием базы данных иуклеотидных последовательностей GeneBank HIV Sequence Database (Los Alamos "National Laboratory, Los Alamos, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЯ

1. Амплификация env-специфнчпых фрагментов

В связи с высокой степенью изменчивости гена gpl20 для амплификации еп\-специфичных фрагментов в данной работе мы использовали модифицированный метод "nested-ПЦР", который заключался в использовании комбинации различных пар внутренних и внешних праймеров для амплификации ВИЧ-специфичных фрагментов на матрице ДНК ВИЧ-инфицированных пациентов. Данный подход к детекции провирусного генома ВИЧ-1 в клетках ВИЧ-инфицированных пациентов с использованием множественных наборов праймеров получил название "PCR-fingerprintwg". Так, каждый образец Д НК был использован в первом раунде ПЦР с двумя парами праймеров: OP-1 /ОР-2 и ОР-З/ОР-4. После ПЦР ДНК с внешними праймера-ми образовавшиеся ампликоны использовались во втором раунде амплификации с пятью различными комбинациями внутренних праймеров: IP-1/ IP-2,1Р-ЗЛР-4,1Р-5ЛР-6,1Р-ЗЯР-2, ПЧ/ОР-4 иПЧЛР-4.

На рисунке 1 представлены результаты электрофореза в 1,2% агароз-ном геле env-специфичных фрагментов ДНК после полимеразной ценной реакции нативной ДНК пациента G999 с различными комбинациями праймеров. В большинстве случаев при аналитическом фракционировании продуктов ПЦР не удавалось визуально обнаружить ВИЧ-специфичные фрагменты. По-видимому, это было связано с низким уровнем инфицирован-ности клеток периферической крови. Большинство го выбранных для исследования ВИЧ-инфицированных пациентов находилось в асимптомати-чесюой стадии заболевания, которая характеризуется низким уровнем инфицированных ВИЧ-1 клеток (Zazä et aL, 1992). Использование методов гибридизации продуктов ПЦР с ВИЧ-специфичной пробой и препаративного электрофореза продуктов ПЦР позволило детектировать наличие ВИЧ-специфичных фрагментов. На рисунке 2 представлены результаты такой гибридизации.

Нам удалось детектировал, провирусную ДНК ВИЧ-1 у 83% (29 из 35) пациентов. Несмотря на то, что выбранные нами праймеры соответствовали относительно консервативным участка генома ВИЧ-1, не удалось полу-

Рисунок 1. Электрофорез амплифицированных фрагментов ДНК пациента 0999 с различными комбинациями праймеров.

1,2,3 — Маркеры; 4 — Результаты первого раунда ПЦР с ОР-1/ОР-2; 5-10 — Результаты двух раундов ПЦР: первый раунд ПЦР с ОР-1/ОР-2, второй раунд ПЦР с различными комбинациями праймеров: 5 — 1Р-1/1Р-2 6 — 1Р-3/1Р-4, 7— 1Р-5/1Р-6, 8— 1Р-3/1Р-2, 9— 1Р-1/ОР-4, 10-1Р-1/1Р-4.

Рисунок 2. Саузерн-гибридизация амплифицированных фрагментов ДНК пациентов 4336(А), 3916(Б),6942(В).- ' ;

1 — Результаты первого раунда ПЦР с ОР-1ЮР-2; 2-7—Результаты двух раундов ПЦР: первый раунд ПЦР с 0Р-1/0Р-2, второй раунд ПЦР с различными комбинациями праймеров: 2 —г 1Р-1/1Р-2, 3-1Р-3/1Р-4, 4-1Р-5/1Р-6, 5 — 1Р-3/1Р-2, 6— 1Р-1/ОР-4, 7—1Р-ШР-4.

чить положительного результата амплификации у 6 пациентов. Следует отметить, что эти пациенты являлись женщинами и у большинства из них, по эпидемиологическим данным, была установлена гетеросексуальная передача инфекции от ВИЧ-инфицированных иностранцев из стран Африки.

По-видимому, эти пациенты инфицированы субтипами ВИЧ-1, отличными от субтипа "В", в то время как последовательности праймеров для амплификации были выбраны из последовательности HIV HXB2R (субтип "В"). У 5 пациентов провирусная ДНК амплифицировалась при использовании обоих внешних пар праймеров (17,2% случаев); у 16 пациентов — только после амплификации с внешней парой праймеров ОР-1/ОР-2 (55,2% случаев); и у 8 пациентов—только при использовании внешних праймеров ОР-З/ОР-4 (27,6% случаев). Реакционная способность различных комбинаций внутренних праймеров оказалась различной. Так, лишь провирусная ДНК пяти пациентов амплифицировалась со всеми наборами внутренних праймеров. Реакционная способность праймеров 1Р-1ЛР-2 составляла 62% (18 пациентов), 1Р-ЗЛР^—51,7%(16 пациентов), IP-5/IP-6—41,4%(12 пациентов), 1Р-ЗЛР-2—65,5% (19 пациентов), IP-1 /ОР-4—34,5% (10 пациентов) и ПЧЯР-4 — 38% (II пациентов). Таким образом, ни одна из комбинаций внешних и внутренних праймеров не давала выявляемости выше 65,5%. Провирусная ДНК 10 пациентов амплифицировалась лишь с одним набором праймеров.

2. Результаты определенна первичных последовательностей клонированных ВИЧ-спецнфнчпых

фрагментов

В результате амплификации провирусных епу-специфичных последовательностей было получено 86 различных фрагментов из 29 пациентов. Для клонирования нами было отобрано 14 различных амплифицированных епу-специфичных фрагментов из 14 пациентов.

Для определения первичной последовательности амплифицированных фрагментов было секвенировано от 2 до 6 индивидуальных клонов от каждого пациента. Секвенирование нескольких клонов амплифицирован-ного фрагмента позволяет получить некую консенсусную нуклеотиднуга последовательность, которая соответствует генотипу наиболее представленного вируса. В ряде случаев, особенно при филогенетическом анализе, данная последовательность связывается с понятием изоляшвируса определенного генотипа, а различные ее варианты — с понятием квазивидов этого изолята (Cichutek et al., 1992). Построение консенсусных последовательностей и алайнментов (выровненных последовательностей) проводилось компьютерным методом, при этом использовался критерий допуска существования мутаций типа вставок/делеций, определяющий максимальное количество таких мутаций и их длину. Консенсусные нуклеотидные последовательности епу-специфичных фрагментов отдельных пациентов (длина сек-венированных последовательностей варьировала от 283 до 469 нуклеоти-дов) сравнивали с консенсусной последовательностью для всех пациентов.

В результате было обнаружено 459 нуклеотидных замен и 27 мутаций типа вставка/делеция. Наибольшее количество делеций было обнаружено в изо-лятах rus3818 и rusp 190 (по 4 делении), в то время как в большинстве изоля-тов их количество не превышало двух. Все обнаруженные делеции были локализованы в областях, соответствующих вариабельным участкам gpl20. 459 мутаций типа нуклеотидных замен были обнаружены в 206 положениях консенсусной последовательности. В области С2 было обнаружено 97 замен в 40 положениях нуклеотидов, в области УЗ-петли—54 замены в 27 положениях, в вариабельной области V3-V4—177 замены в 60 положениях, в области У4-петли — 103 замены в 53 положениях, и в константной области СЗ —28 замен в 26 положениях. Различные изоляты отличались по количеству нуклеотидных замен. Наибольшее количество нуклеотидных замен (70) было обнаружено в изоляте rusG999, а наименьшее (14) в изолятеrusl0120.

Как показал анализ частоты мутаций, их наибольшая частота наблюдалась в области V3-V4 gpl20 (средняячастота замен—9,98%), а также в области У4-иетли (средняя частота замен —■ 12,53%). Заслуживает внимания высокая частота замен в области С2 (средняя частота замен—9,75%), и необычайно высокая частота замен в области СЗ у rus154—74,3%. Уровень нуклеотидных замен в области УЗ-петли варьировал от 0,98% (изоляты nisl0120Hrus5852) до 7,84% (изолят rus5014). Частота нуклеотидных замен в области V3-V4 gpl20 варьировала от 3,62% (изолят rusp 190) до 14,2% (изолят rusG999).

Был проведен сравнительный анализ соответствия мутационных событий на уровне нуклеотидных и аминокислотных последовательностей различных областей вирусного белка gpl20. Консенсусные аминокислотные последовательности для отдельных пациентов были получены из соответствующих нуклеотидных последовательностей в рамке считывания белка gpl20. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей проводился относительно консенсусной аминокислотной последовательности RUS SP (Рис.3).

В результате анализа полипетидных последовательностей во всех пациентах было обнаружено 30 делеций аминокислот. Сравнение полипептидных последовательностей из различных пациентов с консенсусной последовательностью RUS SP показало наличие 248 аминокислотных замен: 58 из них были локализованы в С2-области gp 120 и обнаруживались в 17 положениях, 36 аминокислотных замен находились в области УЗ-петли и были расположены в 14 позициях, 45 замен аминокислот, локализованных в 19 положениях, были обнаружены в области У4-петли. Наибольшее количество аминокислотных замен (107 замен) было обнаружено в вариабельной области V3-V4. Эти мутации наблюдались в 27 положениях аминокислот. В константной области белка gpl20 — СЗ, было обнаружено лишь 2 аминокислотные замены в двух положениях. Наибольшее количество мутаций (35), связанных с заменой аминокислот, было обнаружено в изоляте rusG999. Наименьшее количество таких мутаций (7) детектировалось в изолятах rusl0120 и rus5852. Все значимые мутации были разделены на 3 группы:

С-2 регнонФОУЗпетля

Нумерация УЗ-петли 1

УЗ-петля ^^ V3-V4 область

26 32

RUS SP MB SVQINCTRHí NNTRKSIBIG PGRAFYAT03 IIGDIRQñHC NLSRíQWmJT LKQIV7KLRE

rus4035 .. . .V.............VP........T..E..............T.........AK. .E

rus4114 .. ..V.............V............E..............T......Q..AK..S

rus20637 .. T.K......G____R.......K...-..E...............E. .K. .G...S...

rus5014 .. Т.К. .R.. .G____R.......K...-..E...............E..K. .G. ..K...

rusl0120 .. .1....................К.........................3......Г...

rus5852 .. .1....................К.................D..............Г...

ruspl90 .. .1............................ ...N.....................T...

rus3818 .. .1.................A..S.....'.....N......I.N.T.......K.AT...

rus4439 TK-I.......................................I.G...........T...

rus 154 .. T.K...............M. ..GT.....E .. .N.......I..R...D. .ПОЛА...

rus4261 .. T.T................A..CT.....E...N.......X..T...S. .SUMA...

rus2236 ..Т.К..-A..........P.......................I.GTK.....EK.-K. ..

rusg999 S. .1............FG......G...r..Q...........I.LTK...: -G..AK...

rus4112 K. P.V............G...........................MECA..D. .R...I..K

Рисунок 3. Неполные консенсусные полипептидные последовательности ВИЧ-специфичных фрагментов для различных пациентов.

RUS SP—консепсусная аминокислотная последовательность для всех пациентов.

Мутации типа замены аминокислот выделены полужирным шрифтом. Мутации типа делеций/'вставок выделены подчеркиванием в RUS SP и черточками в полипептидных последовательностях.

синонимичные замены, то есть замены, не приводящие к резкому изменению физико-химических параметров полипептида в данном положении; несниошшичные замены, приводящие к таким изменениям, и неопределенные. В константной области белка gp 120 — С2 из 58 аминокислотных замен 31 носила синонимичный характер, 24—несинонимичный, и 3 замены имели неопределенный характер. В результате анализа значимости аминокислотных замен в участке УЗ-петли белка gp 120 из 36 аминокислотных замен 20 носили синонимичный характер, 12 замен были несинонимичными, и 4 аминокислотные замены носили неопределенный характер.

Консенсусный тетрапеттгид вершины V3-петли, подученный д ля всех последовательностей "Санкт-Петербургских" изолятов, представляет собой аминокислотную последовательность глицин-пролин-глицин-аргинин (GPGR). Эта последовательность является консенсусной для субтипа "В" ВИЧ-1 (Albertet al., 1992). В изолятахгш20637, rus5014, rusl0120 nrus5852 была обнаружена тетрапептидная последовательность птицин-пролин-ши-цин-лизин (GPGK), которая также чаще всего встречается среди изолятов ВИЧ-1 субтапа "В" (Myers et al., 1994). В шолятахпв154 и rusG999 тетрапептидная последовательность вершины V3-петли была представлена аминокислотами глицин-пролин-глицин-глицин (GPGG). Данный тетралегггид ранее был обнаружен лишь для двух изолятов ВИЧ-Í — HTVHT.H6022 (Гаити), hHIVBR.10591 (Бразилия) (Myers et al., 1994). Кроме того, были обнаружены две тетрапептидные последовательности—аланин-пролин-пшцин-се-рин (APGS) (изопят rus3 818) и аланин-пролин-пгацин-пппщн (APGG) (изо-лят rus4261)—ранее не описанные в литературе ни для одного из известных изолятов ВИЧ-1.

Анализ октамеров вершины УЗ-петли "Санкт-Петербургских" изоля-тов ВИЧ-1 показал, что чаще всего обнаруживается октамер представленный аминокислотами H(P)IGPGR(K)AF. Такой октапептид наиболее часто также обнаруживается среди изолятов ВИЧ-1 субтипа "В" (Myers et al., 1994). Октапептид HMGPGGTF, обнаруженный нами в изоляте rusl54, ранее не был описан, тоща как октапептид HIGPGGAF полностью совпадает с последовательностью вершины изолятов из Гаити и Бразилии (Myers et al., 1994).

Анализ аминокислотных замен в вариабельной области V3-V4 белка gpl20 показал, что из 107 аминокислотных замен 36 были синонимичными, 59—несинонимичными и 12—неопределенными. В области У4-петли из 45 аминокислотных замен 16 замен аминокислот носили синонимичный характер, 28 замен—несинонимичный, и 4 замены носили неопределенный характер. В константной области СЗ было обнаружено лишь 2 замены которые носили синонимичный характер.

Таким образом, в результате анализа вариабельности полипептидных последовательностей изолятов ВИЧ-1, циркулирующих в Санкт-Петербурге, было обнаружено, что в константных областях белка gp 120 на уровне аминокислотных замен в большей мере происходят синонимичные замены аминокислот. Напротив, в вариабельных областях в большей мере происходят несинонимичные аминокислотные замены. Был обнаружен необычайно высокий уровень вариабельности константной области белка gpl20 — С2. Подобный уровень вариабельности до сих пор не наблюдался при изучении вирусных популяций ВИЧ-1 в отдельных географических регионах.

4. Филогенетический анализ изолятов ВИЧ-1, присутствующих в Санкт-Петербурге

Для определения генетических различий между нуклеотидными последовательностями ВИЧ-1, циркулирующими в Санкт-Петербурге, нуклео-тидные последовательности были модифицированы таким образом, чтобы они полностью перекрывались и количество мутаций типа делеция/вставка было при этом минимально. Длина полученных таким образом нуклеотидных алайнментов составила274 нуклеотида. Они полностью включали последовательности, кодирующиеУЗ-петлю белкаgpl20. Анализ генетических дистанций изолятов ВИЧ-1 проводили с помощью программы DISTANCES в пакете программ GCG. Наименьшее различие (1,6%) было обнаружено между rusl0120 и rus5852. Небольшие различия были обнаружены между raspl90 Hrusl0120 (2%), ruspl90 игш5852 (2,8%). Эти различия не превышали величины вариабельности квазивидов ВИЧ-1 у пациента р190 (4,88%). Максимальная генетическая разница (18,2%) была обнаружена между изо-лятамигиз4261 Hrus4112.

Для филогенетического анализа последовательностей ВИЧ-1, циркулирующих в Санкт-Петербурге, с целью определения принадлежности этих последовательностей к определенному субтипу ВИЧ-1 нами были выбраны из банка данных LosAlamos HIV Database нуклеотидные последовательности изолятов ВИЧ-1 различных субтипов.

Анализ полученных результатов показывает, что меньше всего последовательности ВИЧ-1, представленные в Санкт-Петербурге, отличаются от последовательностей ВИЧ-1 HIV MN и HIV JRCSF, относящихся к субтипу "В". В этом случае генетическая разница варьирует от 7,1 % (для изолятов rusl0120 и HIV JRCSF) до 18,3% (для изолятов rus4112 и HI V MN). Наблюдаемый уровень различий между "Санкт-Петербургскими" последовательностями и последовательностями "Северо-Американской/Европейской" группы находится в пределах различий между самими "Санкт-Петербургскими" последовательностями. Разница с последовательностями ВИЧ-1 других субтипов превышала 20% и варьировала от 21 % (д ля rus4035 и HTV BR2-субтип "F') до 42% (для rus20637 и HIV GALBV и для rus5014 и HIV GALBV-субтип "G"). Последовательности изолятов HIV MVP5080, HIV-2 САМ и SIV CPZ образуют так называемую внешнюю группу (outgroup), для которой уровень дивергенции с анализируемыми нуклеотидными последовательностями необычайно высок и превышает 62%.

На основании данных генетической разницы нуклеотидных последовательностей изолятов ВИЧ-1, полученных различными методами были, построены филогенетические деревья. На рисунке 4 представлено филогенетическое дерево изолятов ВИЧ-1 построенное в системе UPGMA на основании данных генетической разницы, полученных двухпараметрическим методом Кимуры.

Анализ филогенетического дерева, построенного в системе UPGMA, показал, что "Санкт-Петербургские" изолята группируются с изолятами ВИЧ-1 субтипа "В" (HIV MN и HIV JRCSF). Внутри этой группы при этом наблюдается тенденция к образованию отдельных групп изолятов, что указывает на гетерогенность изолятов ВИЧ-1 субтипа "В", циркулирующих в Санкт-Петербурге. Величина генетических различий между изолятами ВИЧ-1 в Санкт-Петербурге (11,7%) сопоставима с аналогичной величиной в США (10-11%) при очевидном отличии в степени развития эпидемии. Можно предположить, что ситуация в Санкт-Петербурге напоминает ситуацию в Бразилии, то есть связана с независимым проникновением нескольких вариантов ВИЧ-1 одного субтипа.

Был проведен анализ генетических различий нуклеотидных последовательностей изолятов ВИЧ-1, циркулирующих в Санкт-Петербурге, и нуклеотидных последовательностей различных известных изолятов ВИЧ-1 субтипа "В", полученные в различных географических регионах. Меньше всего "Санкт-Петербургские" последовательности отличаются от последовательностей HIV JRCSF и HIV NL4 (6,7-15,7%). Наименьший уровень дивергенции был обнаружен для rusp 190 и HIV JRCSF (6,7%). Максимальная генетическая разница (28%) наблюдалась между последовательностями rus5014 HHIVCA5. '

На рисунке 5 представлено филогенетическое дерево, построенное в системе UPGMA на основании данных генетических различий нуклеотидных последовательностей изолятов ВИЧ-1 одного субтипа, полученных двухпараметрическим методом Кимуры.

_г- hi.vgal.bv

р—М- Ьз^р882 '— М. уса13

»йу^243 hivsf1703 1йуид268 — 1иуу1557 Ыуг32\

гиэ20637 гиБ5014

гиэ4035 гиз4714

г[

Ч-

г!

т:

)ги510120 гиз5852 гиэр!90 - гиз3818 гиз4439 hivjгscf риБ2236 гиэ154 гиз4261 и Ыутп и гиэд999 гиэ4112 — И1уЬГ2 Ьгугоа!

Ч1

— Ь1у23

Ь1утур5180

Ыу2сат1

Рисунок 4. Филогенетическое дерево нуклеотидных последовательностей ВИЧ-1, циркулирующих в Санкт-Петербурге.

Генетические различия определены по двухпараметрическому методу Кимуры. Филогенетическое дерево построено в системе БРОМА,

Анализ результатов филогенетических отношений между последовательностями ВИЧ-1 показал, что последовательности ВИЧ-1, циркулирующих в Санкт-Петербурге, образуют кластрированные группы с последовательностями ВИЧ-1 субтипа "В" из различных географических регионов. Так, rus 10120, rus5852, mspl90, rus3818, rus4439 и rus2236 образовывали группу с последовательностями ВИЧ-1 Североамериканского происхождения HIV JRCSF и HIV SF2, rus4035 и ras4714 образовывали группу с парой HIV NL4 (Нидерланды) и HIV ТН1 (Таиланд). Последовательности ВИЧ-1 rus 154, rus4261, rusG999, rus20637 и rus 5014 образовывали 2 отдельные группы, одна из которых образовывали кластер с так называемыми вирусами группы MN. Изолят rus4112 не образовывал группы ни с одним из представленных изолятов.

Можно констатировать широкое распределение изолятов ВИЧ-1, циркулирующих в Санкт-Петербурге по филогенетическому дереву изолятов субтипа "В" различного географического происхождения. Совокупность данных позволяет предположить, что высокое разнообразие ВИЧ-1 внутри определенного субтипа является одной из характеристик ранней фазы эпидемии ВИЧ/СПИД, которую можно изучать в России, и связано с множественным и независимым проникновением различных изолятов. С течением эпидемии происходит селекция доминантного варианта(ов) ВИЧ-1, разнообразие которого связано с дивергенцией от исходного варианта.

ВЫВОДЫ

1. С помощью "nested''-ПЦР с использованием множественных наборов праймеров удалось получить env-специфичные фрагменты у большинства ВИЧ-инфицированных пациентов в нашем исследовании. Ни одна из комбинаций праймеров не обладала реакционнойспособкосгыо выше 65,5%. При различных комбинациях праймеров у одного пациента могут амплифицироваться последовательности различных вариантов ВИЧ-1.

Z Анализ структуры и изменчивости "Санкт-Петербургских" изолятов ВИЧ-1 на уровне нуклеотидных и аминокислотных последовательностей показал как наличие общих черт с уже описанными в литературе, так и существенных отличий, к которым относятся необычайно высокая частота мутаций в областях С2 и СЗ у "Санкт-Петербургских" изолятов и отличия в наиболее вариабельных аминокислотных позициях V3-nenra(позиции 18,25и29). Выявленные отличия могут быть связаны с особенностями ранней стадии эпидемии ВИЧ/СПИД и/или ранней стадия ВИЧ-инфекции.

3. Впервые обнаружены последовательности APGS, APGG hHMGPGGTF, расположенные на вершине V3-петли у "Санкт-Петербургских" roajmTOBrus3818,rus4261 nrusl54.

ч

г rus20637 J^rus5014 L- rusg999

r- bcsg3us

Jl-rfht

L- ci22ci r- mnus _P- laifr -I simi84be L Jh32jp rus154 rus4261

r rus10120 i rus5852 J rusp190 l rus4439 - rus3818 r jrscfus Л sf2us L rus2236 nl4nl thlth rus4035 rus4714 ^ th4th L iniin u brlbr u oyiga caml uk rus4112

rt

1

— ca5cm sivcpz

hiv2cara1

Рисунок 5. Филогенетическое дерево нуклеотидных последовательностей ВИЧ-1 cy&iHiia-B"

4. Анализ аминокислотных последовательностей V3-петли свидетельствует, что"Сшпсг-Петербургские" изоляты относятся к "low/ slow", макрофаготропным вариантам ВИЧ-1, не образующим синцитии.

5. С помощью филогенетического анализа установлено, что в Санкт-Петербурге циркулируют изоляты субтипа "В" ВИЧ-1.

6. Широкое распределение "Санк-Петербургских" последовательностей субтипа "В" ВИЧ-1 по филогенетическому древу изолятов субтипа "В" ВИЧ-1 различного географического происхождения свидетельствует о множественном и независимом проникновении различных вариантов субтипа "В" ВИЧ-1 в Санкт-Петербург. Это позволяет сформулировать гипотезу о различном происхождении вариабельности субтипа ВИЧ-1 на ранней и развитой стадии эпидемии ВИЧ/СПИД.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Выявление первых случаев инфицирования вирусом иммунодефицита человека в Ленинграде U Иммунология, 1990, №5, С.9-11 / Соавторы: А.П.Козлов, А.Г.Малых, В.В.Касаткин,

B.Г.Мессорош, Г.В.Волкова, А.Ю.Колмаков, В.А.Исаков, Н.М.Калииина, А.Г.Рахманова, В.А.Пасечник

2 First cases of HIV-1 infections in Leningrad // Abstract Vl-th International Conference on AIDS, San-Francisco, 1990 / Соавторы: A.P.Kozlov, A.G.Malykh, T.V.Kurbatova, M.N.Traugott, A.V.Glebov, L.Gavrilenkova, P.VKolotvina, G.V.VoIkova

3. Выявление антигена вируса иммунодефицита человека в лимфоидных клетках серопозитивных лиц//Вопросы вирусолопш, 1991, Т.36, №3,

C.219-222 / Соавторы: А.П.Козлов, М.Н.Трауготт, Т.В.Курбатова,

A.Г.Малых, П.В.Колотвина, И.В.Переслени, Т.Д.Смирнова,

B.В.Касаткин, А.С.Симбирцев

4. New features of HIV/AIDS epidemic in Russia // Abstract X-th International Conference on AIDS, Yokohama, Japan, 1994 / Соавторы: Kozlov A.P., Volkova G.V., Verevochkin S.V., Malykh A.G., Reitz M., Farzadegan H.

5. New features of HTV/AIDS epidemic in Russia // AIDS Research and Human Retroviruses V. 10, Supl.1,1994; Abstract Annual Meeting Sponsored by the Laboratory ofI\imor Cell Biology, Bethesda,USA, 1994/Соавгоры: Kozlov AJP., Volkova G,V., Verevochkin S.V., Malykh AG., Reitz M., Farzadegan It

6. Molecular epidemiology of HTV-1 in St.Petersburg, Russia // AIDS Research and Human Retroviruses V. 11, Supl.1,1995; Abstract Annual Meeting Sponsored by the Laboratory of Tumor Cell Biology, Bethesda, USA, 1995 / Соавторы: Kozlov A.P., Barabitskaja О.V., Malykh A.G., Karamov E. V., YaroslavtsevaN., Kurbatova Т. V., Reitz M., Farzadegan H.

7. Molecular epidemiology of HIV-1 in St.Petersburg, Russia // Abstract 3rd International Conference on AIDS, Cancer and Related Problems, StPetersburg, Russia, 1995/Соавторы: KozlovA.P.,BarabitskajaO.V., Malykh A.G., Karamov E.V., Kurbatova T.V., Reitz M., Farzadegan H.

Подписано к печати 11.10.96 г. Заказ 133. Тираж 80 экз. Объем 1 печ.л.

Печ.-множ.лаб. НИИХ СПбГУ. 198904, Санкт-Петербург, Сг. Петергоф, Университетский пр., 2.