Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Скриннинг и изучение препаратов-ингибиторов вируса иммунодефицита человека

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Скриннинг и изучение препаратов-ингибиторов вируса иммунодефицита человека"

ВИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОМ ФЕДЕРАШ'Ш [М^ЧЕО-ИССЛЩОВАТЕЛЬСШШ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ, НПО «ВЕКТОР»

На ггоаваз: тзукописп

ШЯСУНОВА ОЛЬП МЕКСАНЕРОВНй.

с :: тт™ прешрм-О^ - ТЗГШШРОВ

03.00.08. - вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук в форме научного доклада

Кольцове - 1992

Работа выполнена в лаборатории кулмиБцрования к диагностики рстровирусов Всесошного наушо-ъссладова^едьского йнслктуге молекулярной с&олопш НПО "Езктор"

Каучзнй руководитель:

Кандидат 'Снологкчо&ех наук ¿.Р.ПокрозсШ!

Офшкгльныэ отгонен-хн:

Лектор хншчэскш; наук, профессор Е.Л.П&трзшгс

К£ШШД85 ЕЕуг;г яоцент ¿.Н.Е£35фО302

Ведущая организация: йастатут вцруешоги: ш. Л.И. Кзшозксого ВШН

Вагина дассертаца состоится ^¿/гаЯ^Ье. 1£$2 г е 3

чаеоа на заседгшз. Спеидал^зцрованЕэго совзта К 033.03.01 во 256СО5ЗЗЙОМ Еаучохо-иослодоБагельсх.ом Ензяттуто кодгкуляржй аюлопс: по едрэсу 533159, Еозсокбзрашг сбх. ( . Нзвосшхзрззкг р-он, н. Колыгопэ.

С диссертаций шзао в блбйгэгг-кб БСССОДЗПОГО

кагчнс-гсслодовстольсшго гшетптугв шлзкуляр;:с£: сиохокп:.

Дхзсбртшщя разослана

••//г, идгЗ/Се^

г

Учошз ешгрзтврь

СШИ11£.П:13йрОЕ2НЕОГО С0205С л

кандцдо- гл/акаски: Ещи^//// .// Т.П.

СЗЦ&Я ХЛРЛКТЕИ^СТПКА РАБОТЫ

дктуальность проблемы. 3 связи с появлением и распространением С1ВД начался активный поиск препаратов, обладающих выраженным анти-BiM действием, среди лекарственных средств, шгибируэщая активность которых была ранее установлена э отношении других вирусов, и разработка новых противовирусных, препаратов, способных воздействовать на ВИЧ и приостанавливать или предотвращать развитие инфекции. Так, была выявлена анта-ВИЧ активность сурамина (Mltsuya H., et al., 1984), азидотнзщдина (Hitsuya H., et al.,1985), p- глицирризиновой кислоты (Ito Ы.,1988), рибевирнна (Williams I.G., 1989), еуринтргкарбоноЕой кислоты (Balzarlnl J., et al., 1989) и иногих другвз препаратов.

В настоящее время проводятся эксперименты с более чем 80 химическими субстаншшли-потевцкальныш лекарствеаными ср-эдствгки для лечения СЩЦ. Наиболее эффективные анти-ВИЧ препарата относятся к группе вуклеотидных аналогов, являющихся знпю'г!торши вирусного фэрмента-обратной транскриптазы. Один иг них - ззидотжнщш (AZD- стал первым и пока единственным препаратом, нзщншпи применение в '• --медицинской практике для j:з~енкя CIB-ffi, дазнщй реальную всзмокность продления . яизне больнзх ШШ. Обладая высокой эффективностью иктибирования ВКЧ. з^стз-зшш, тем не кензе, имеет ряд недостатков. агргзтязетя; его прямзнеЕИэ в клинической практике: он (Hicisnan В.В., . et al., 19S7), обладает низкой остью шснбиравзния репродукции ВМЧ в макрсфэгах et al., 1939), не способен препятствовать гибели •oit, д;гательноз нршзненЕв взидотшадина ■ приводку к

появлению ¿ZT-устойчивых штаммов ВИЧ (Marx J.L., 1989., larder В.А., et al., 1989, Larder В.A. and Kemp S.D., 1989). Поэтому актуальным представляется поиск новых ингибиторов размножения ВИЧ. И в этом плане особый интерес представляют препараты с механизмом действия, не связанным с ингибированием обратной транскриптазы вируса, что, вероятно, позволит дополнить действие AZT. Исследователи в поиске эффективных химиотерапевтических агентов против ВИЧ используют разнообразные стратегии, основанные на- разных мшенях в решшкативноМ цикле вируса, с которыми могут взаимодействовать анти-ВМЧ агенты. В добавок к обратной транскриптазе, являщейся мишенью для 2',3'-двдезоксинуклэозидных аналогов, различные другие мишени могут служить местами для химиотерапевтической атаки: адсорбция вирусной частицы на клеточной мембране, раздевание вирусного капсида, интеграция провирусной ДНК в клеточный геном, процессинг вирусных белков-предшественников, сборка и высвобождение (почкование) потомства вирусных - -частиц. Поиск новых эффективных.. ингибиторов размножения ВИЧ, действующих на разных этапах его жизненного цикла, остается актуальным на сегодняшний день.

Так как все описанные вше химиотерадевтическив подходы направлены на подавление вируса на одном или более этапах его цикла репликации, нельзя ожидать, чтобы хоть "один из таких агентов "вырвал" бы вирус из резервуаров (макрофагов/моноцитов). Для достижения этой цели, 'которая актуальна для элиминации провирусной ДНК из персистентно инфицированной клетки, должны быть применены более эффективные агенты, такие как антисмысловые олигонуклеотады, ковалентно

связывающиеся с нуклеиновой кислотой, - разрезающие реагенты. Только такие вмешательства, которые достигают цели элиминирования вирусных последовательностей ДНК из клеток хозяина-, можно предположить, завершат действительный курс лечения болезни. В нескольких лабораториях мира в течение ряда лет ведутся интенсивные исследования в области создания нового поколения эффективных лекарственных препаратов для лечения ВИЧ-инфекции на основе антисмысловых олигонуклэотидов. К настоящему времени в литературе описано ингибированне размножения ВИЧ в культуре клеток олигонуклеотидами, комплементарныеш различным функциональным участкам РНК вируса (2атесп1к ег а1., 1986; ЦагзгДшга е1 а1., 1987, 1989; А^татой еХ а1., 1988, 1989; га1а е1; а1., 1988; 11еппе1зеп ег а1., 1990). Тем не менее поиск новых более эффективных в отношении ВИЧ антисмысловых олигонуклэотидов- и разработка на их основе лекарственных средств остается актуальным.

•Ваяно отметить, что высоко эффективных средств для лечения СПИД еие нет и в целом в настоящее время не существует такого подхода к созданию лекарственных препаратов для лечения СПИД, который мог бы претендовать на монополию. Эффективная терапия этого заболевания может стать результатом системного комплексного"подхода, когда в зависимости от стадии или формы проявления болезни будут использоваться лекарственные средства различной природы с разными-механизмами действия, их различные комбинации.

Принимая это во внимание мы в своей работе проводили поиск новых перспективных для лечения СПИД анти-ВИЧ агентов среди уже известных ингибиторов ВИЧ-инфекции ф-глицирризинозая кислота)

путем получения их различных химических производных,, среда хшических препаратов, для которых показана противовирусная активность в отношении других вирусов (энциклан), -среди препаратов нового поколения - антисмысловых олигонуклеотидов; оценивали возможность совместного применения с AZT некоторых из них.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы был поиск анти-ВИЧ активных препаратов, и изучение анти-ВИЧ действия . наиболее перспективных из них. Работа связана с решением задач, поставленных в рамках Государственной программы по борьбе со СПИД.

На первом этапе исследования была подобрана система вирус-клетка, адекватная для разрешения поставленной задач::, и разработан комплекс методов по оценке.уровня' ингибираваЕия ВИЧ з клетках. В качестве эталонных были использованы известные препараты, обладающие анти-ВИЧ активностью - AZI» гепарин, ауринтрикарбоновая кислота (АТК). Среда: клеточных культур, першссивных для ВИЧ, наше внимание привлекли нэ только Т-хелперы (ЫТ-4, СЕЛ, НЭ), но и макрофагальные линии. (U-937). Использование клеток-макрофагов для тестирования противовирусных препаратов дает возможность провести более полную оценку препаратов и выявить те из них, которые могут дополнить действие AZT.

На втором этапе работы проводили скрининг ' различных химических соединений таких как. компоненты, экстракта корня солодки (Glycyrrhtza radix): р-глицирризиновая кислота, ■■алавоноиды; химические производные З-глишрризиновой кислоты -различные амиды и гликопептиды.); изоборниловые эфиры

(энциклан), антисмысловые олигонуклеотиды и их производные.

На третьем этапе исследования определяли количественные характеристики (1%0, С%о» К) для наиболее перспективных из изученных ант^-ВИЧ'препаратов.

По ходу выполнения работы была рассмотрена возможность использования для ингибирования ВИЧ-инфекции разных комбинаций изученных препаратов с А1Т.

Научная новизна. В процессе скрининга препаратов, относящихся к различным классам химических соединений, выявлены новые ингибиторы репродукции ВИЧ:

а) производные р-глицирризиновой кислоты, эффективно ингибирувдие размножение ВИЧ-1 как в культуре Т-лимфоцитов, так и в моноцитарной клеточной системе:

1. ниглизин (пента-о-никотинат р-глицирризиновой кислоты),

2. амид р-глицирризиновсй кислоты с 6-аминоурацилом,

3. амид р-глицирризиновой кислоты с 6-амино-2-тио-урацилом,

4. гликопептид р-глицирризиновай кислоты с метиловым эфиром Ь-гистидана,

5. гликопептид р-глицирризиновой кислоты с дибутиловым эфиром Ь-глутаминовой кислоты,

6. гликопептид р-глицирризиновой кислоты с днметиловым эфиром Ь-аспарагиновой кислоты,

7. гликопептид р-глицирризиновой кислоты с метиловым эфиром глицил-Ь-валина;

б) впервые была установлена способность изоборнилового эфира 2,Э-диметил-За,4,9,9а-те трагидрофуро-[2,3-Ь 3 - хиноксалин - 3 -карбоновой кислоты (энциклана), относящегося к новому классу химических соединений, эффективно ингибировать репродукцию как

- 6 -

ВИЧ-I так и ВИЧ-2 в культуре клеток;

в) впервые показана высокая противовирусная активность (IS IGQ-5QQ) и специфичность анти-ВИЧ действия олигонуклеотидов последовательности pGCATCAAGCAGCTCCAGGCA (РМ-20), комплементарной области начала трансляции, открытой рамки считывания на (+) цепи ДНЕ ВИЧ-I, и последовательности gTGCCTGGAGCTGCTTGATGC (MP-2Q), комплементарной олигонуклеотиду РМ-20.

г) На примере уже известных антисмысловых олигонуклеотидов -ингибиторов ВИЧ-I и новых, олигонуклеотидов РМ-20 и МР-20 показано, что введение в 5'-положение олигонуклеотидов химических модификаций (алифатических аминов, остатков холестерина) приводит к существенному повышению эффективности дагибирования ими репродукции ВИЧ и обеспечению значительной степени защиты Т-хелгоров от цитопатического действия вируса.

д) Установлено, что глицир'ам-лекарственный препарат на основе p-глицирризиновой кислоты- не является антагонистом AZT.

Теоретическая и практическая ценность. Во всем мире под эгидой ВОЗ осуществляется комплексная программа борьбы, со СПИД, включающая поиск лекарственных средств, способных хотя бы цриостановить течение этой смертельной в большинстве случаев болезни. Бесспорно, что в этой связи выявление новых ингибиторов размножения ВИЧ (ниглизин, амида, и гликопептиды p-глицирризиновой кислоты, энциклан, олигонуклеотида РМ-20 и МР-20, а также их производные, несущие на 5'-конце гидрофобные группировки) имеет как теоретическое, так и практическое значение.

Результаты работы по изучению совместного действия

препаратов р-глщирризивовой.кислоты с азидотимидином позволили сделать вывод о возможности такого применения, что может оказаться полезным при комплексной терапии СПИД.

Определены количественные характеристики для ряда олигонуклеотидов и показана более высокая анти-ВИЧ активность новых олигонуклеотидов ГМ-20 и МР-20 по сравнению с уже известными, а введение химических модификаций позволило существенно повысить их эффективность за счет повышения их стабильности и увеличения проницаемости клеточных мембран для таких препаратов и обеспечить высокую степень защиты клеток от цитопатического действия вируса, что, вероятно, может быть использовано при создании доступных для практического применения эффективных препаратов для лечения заболевания СПИД. -

. Апробация. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции "Химия природных и низкомолекулярных биорегуляторов" (Ереван, 1990), IX Всесоюзном симпозиуме "Целенаправленное изыскание лекарственных средств" (Юрмала, 1991),Международной конференции "International conference on molecular biology aspects or diagnostics and therapy or AIDS" (Новосибирск, Академгородок, 1991), IV Всесоюзном симпозиуме "Изучение и использование солодки в СССР" (Алма-Ата, 1991), I Съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992).

Наличие анти-ВИЧ активности найденных нами новых препаратов (ниглизин, энциклан, олигонуклеотид РМ-20) было подтверждено экспериментально в Кембриджском университете, в Национальном институте биологических стандартов и контроля, в Центре по сотрудничеству при Медицинском Исследовательском Совете.(Лондон).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ СКШШНГ И ИЗУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ - ИНГИБИТОРОВ ВИРУСА 1ШУН0ДЕ®ИЩГГД ЧЕЛОВЕКА

Поск препаратов, обладающих анти-ВИЧ активностью, является, на наш взгляд, одним из наиболее перспективных направлений исследований и проводится в ряде ведущих лабораторий мира.

В нашей лаборатории работы по скринингу анти-ВИЧ препаратов начаты в 1989 году.

Для оценки противовирусной активности исследуемых препаратов' из клеточных культур МТ-4, СШ, Н-9, пермиссивных для ВИЧ, мы выбрали культуру перевиваемых лимфоидных . клеток 4 МТ-4, оказавшуюся наиболее чувствительной к БОТ и удобной в работе, так как позволяет получать стабильные и воспроизводимые результаты. Кроме того, эта клеточная линия получила широкое распространение в мире для оценки противовирусной активности ингибиторов репликации ВИЧ, что дает возможность сравнивать полученные результаты с исследованиями других лабораторий. Среди клеточных культур, пермиссивных для ВИЧ, наше внимание привлекли не только Т-хелперы, но и моноциты/макрофаги, играющие важную роль в патогенезе СПЩ за счет способности накапливать вирус и передавать его Т4-лимфоцитам. В своей работе мы использовали хронически инфицированную ВИЧ-1 линию перевиваемых моноцитов человека и-937 (депонирована в

/ - 9 -

Государственной коллекции вирусов й 4005). Хроническая инфекция, протекзщая в этой культуре, более адекватно отражает картину инфекции на уровне организма, чем модель острой литической инфекции при применении линий клеток МТ-4, СЕМ, Н-9. Использование моноцитов/макрофагов . для тестирования противовирусных препаратов дает возможность провести полную оценку препаратов и выявить те из них, которые могут дополнить действие AZT.

Необходимо отметить, что используемые методы тестирования препаратов с анти-ВИЧ активностью могут в значительной мере влиять или дане изменять результаты теста, делая таким образом сравнительные исследования и оценку эффективности исследуемых препаратов затруднительными. Поэтому при выборе комплекса методов по оценке уровня ингибирования ВИЧ в клетках мы остановились на тех из них, которые позволяют получить наиболее полную -информацию об особенностях действия ингибиторов размножения ВИЧ и используются большинством исследователей для таких целой (Ни J.M. and Hsiung G.D.,-1989):

1) определение степени защиты инфицированных ВИЧ клеток от гибели путем определения их жизнеспособности методом окрашивания клеток трипановым синим (оценка ■ ингибирования вирус-шдуцнрованного цитопатического действия);

2) определение активности уникальной вирусной обратной транскриптазы (измерение специализированных функций и вирусных продуктов);

3). определение уровня накопления вирусных белков (суммарных и р24) нммуноферментным методом (измерение вирусных продуктов).

Определение количества вируспродуцирущих клеток _ методами

непрямой иммунофлюоресценции и электронной микроскопии требует большего количества тестируемого материала, что, к сожалению, не всегда приемлимо, например, при скрининге антисмысловых олигонуклеотидов в силу их высокой стоимости, поэтому эти методы мы использовали лишь в случае необходимости.

В работе использовали штаммы ВИЧ-1/ЭВК (ГКВ 4005) и ВИЧ-2/rod, полученные от доктора Э.В. Карамова (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского, г. Москва), а также штамм ВИЧ-1 £ 1 (ГКВ 4046) , выделенный в нашей лаборатории из мононуклеарных клеток периферической крови ВИЧ-инфицированного пациента. На начальном этапе работа нами были созданы рабочие банки этих штаммов вирусов, а также рабочие банки выбранных для скрининга анти-ВИЧ препаратов культур клеток МТ-4 и хронически инфицированных ВИЧ-1 - U-937, что позволило проводить тестирование противовирусных прпапатов в одинаковых условиях.

Инфицирование клеток МТ-4 разными штаммами ВИЧ проводили путем добавления вируса к клеточной суспензии с концентрацией 2x106 клеток/мл. Множественность заражения - 0,2-0,5. Адсорбцию, вируса проводили в течение одного часа при температуре 37 °С. Инфицированные клетки разводили средой для культивирования до

с

концентрации 5x10 клеток/мл и вносили растворы исследуемых препаратов в клеточную суспензию. В качестве эталонных препаратов использовали известные анти-ВИЧ агенты с разными механизмами действия: AZT - 2',3'-дидезоксинуклеозидный аналог, механизм действия которого связан с ингибированием вирусной обратной транскриптазы и терминированием синтеза вирусной ДНЕ ( Hirsch M.S., 1988, Herdewijn P. and De Clercq E., 1990), ауринтрикарбоновую кислоту (ATK), ингибирующий эффект которой

обусловлен блокированием взаимодействия CD4 рецептора с вирусным gp120 (Balzarlni J., et al., 1989), гепарин сульфатированный полисахарид, препятствующий адсорбции вируса на клеточной мембране (Toshlyukl N.anü Hlroo Н., 1988, De Clercq E., 1988) и p-глицирризиновую кислоту (ГК), относящуюся к груше природных соединений, выделенных из растительных источников", механизм антивирусного действия которой до настоящего времени остается . неустановленым, но для которой показано непосредственное блокирование связывания ВИЧ с клеткой ■(Ito et al., 1988) (табл. I). Контрольные и инфицированные ВИЧ клетки (с анти-ВИЧ препаратом и . без него) культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10-15% фетальной сыворотки (сыворотку предварительно прогревали при 56°С, I час), 300 мкг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл канамицина или 60 мкг/мл линкомицина в 96-луночных культуральных планшетах фирмы "Costar"'при температуре 37 °С во влажной атмосфере 5% COg.

Ингибирующий эффект препаратов оценивали на 4-5 сутки культивирования измерением активности вирус-специфического .фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы, как описано ранее Lee et al. (1987) (за активность обратной транскриптазы принимали включение радиоактивной метки [Н3]-ТТГ в системе poly (А): ollgo (di) in vitro в импульсах на 1 мл культуральной вддкости), вирусного антигена иммуноферментным методом (Жданов и др., 1988), количества вирусного белка р24, а также определяли долю жизнеспособных клеток методом исключения тршановым синим. По такой схеме проводилось тестирование всех исследуемых препаратов.

- 12 -

ИкшЗирование репликации ВйЧ-I в культурах клеток

Таблица I

КОН- _____ МТ-4_______________ГКВ_4005_____

Препараты цент- Ингибирование, %____Ингибирование,; %___.

рация активности накопления активности накопления

обратной вирусного обратной вирусного

мкг/мл транскрип- антигена транскрип- антигена

тазы тазы

Аандотимидии 10 98,1 94,2 57,4 55,7

Гепарин 50 98,8 96,3 47,0 Н/Д

АТК 20 91,2 н/д 11,8 6,7

— П — - 10 85,3 н/1 11,7 3,4

р-гк 1000 99,3 97,2 0 н/д

— W W 500 98,3 97,0 10,0 Н/Д

(З-ГК - p-глицирризиновая кислота АТК - ауринтрикарбоновая кислота

В таблице приведены средние значения 3-6 экспериментов.

Скрининг и изучение анти-БИЧ действия препаратов группыjS-глидирризановой кислоты.

В 1987-88 гг. работами группы японских исследователей установлено, что ГК - соединение, присутствуйте в водном экстракте корня солодки (Glycyrrhiza. radix) эффективно ингибирует репродукции ВИЧ в культуре клеток (Ito et al., 1987). Показано также, что введение ГК в высоких дозах (300-1600 мг/день) больным СПИДом вызывает у них увеличение

содержания Т4 лимфоцитов и снижение количества вирусного антигена.

Механизм антивирусного действия ГК до настоящего времени остается неустановленым. Предполагается, что одним из факторов мояет служить блокирование ГК протеинкиназы (11о ег а!., 1988).фосфзрилирование которой молекулы Т4 рецептора необходимо для связывания вируса с Т4 рецептором (Пе1йз ег а1., 1988). Установлено также, что ГК непосредственно препятствует связыванию ВИЧ с клеткой (Ио ег а1., 1988).

Задачей-нашей работы было сравнительное изучение анти-ВИЧ активности различных производных р-глицирризиновой кислоты (р-ГК) с целью выявления наиболее активных препаратов.

¡3-глицирризшовая кислота (а), ее производные получены в Институте органической химии, г. Уфа:

На первом этапе исследования была проведена проверка анти-ВИЧ активности оффицинального препарата - глицирама (ИйЦ-еоль-р-ГК). Из рисунка I видно, что глицирам эффективно защищает клетки МТ-4 от вирусной инфекции в концентрациях, превышающих 100 мкг/мл. Также был изучен противовирусный эффект глицирама с использованием различных штаммов ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

О 40 60 100 260 600 1000 2000 ■ 1 -*— 2 КЗ

РисЛ Анти-ШЧ активность глидирама.

1 - нешфицированные клетки МТ-4; 2 - содержание вирусного антигена; 3 - шфщированные ВИЧ-1 клеткиМТ-4. По оси абсцисс

концентрация (мкг/мл); по оси ординат (слева) кизнеспособность клеток (% от контроля); по оси ординат (справа) - уровень вирусного антигена {% от контроля).

Препарат применяли в концентрациях, использованных в ранее опубликованных работах - 500 - 1000 мнг/мл. Полученные результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют' о выраженном шгабирующем эффекте глицирама на репродукцию исследованных штаммов ВИЧ в культуре клеток Ш-4.

ИнгабЕрование репродукции разных атамиов БИЧ в культуре клеток ЬТ-4

Таблица 2

Наименование Кон- гкв 4005 ГКВ 4046 ВИЧ-2/го(1

препарата цент- ------- ----- ----- -------

рация Кол-во Инги- Кол-во Инги- Кол-во Инги-

препа- кивых. биро- КИВЫХ биро- К1ТВНХ биро-

рата клеток вание клеток вапие клеток вание

% нако- % нако- % нако-

пления пления пления

вирус- вирус- вирус-

ного ного ного

АГ, % АГ, % АГ, %

1НН4-С0ЛЬ-р-ГК 1000 61,9 95,9 65,9 94,3 75,1 79,7

500 86,7 95,3 67,8 94,0 88,9 42,5

Контроль (НН-

. филированные

клетки) - 50,0 0 42,8 . 0 19,1 и

Контроль (не-

инфзщгоованные

клетки"). - 81,5 - 81,5 - 87,5 -

В таблице приведены средние данные 3-6 эксперименоЕ

Основной характеристикой -противовирусной активности хиниопрепаратов служит хиынотерапевтический индекс - (индекс селективности-35)-отношение концентрации препарата, вызывавшей 50% снижение жизнеспособности клеток (СС50) к концентрации, на 50% ингабиругацей репродукцию ВИЧ (1%0). В таблице 3 приведены результаты экспериментов по определению химиотерапевтяческого индекса для некоторых солей.ГК. Кроме того, использовали для

сравнения Агт, механизм действия которого связан с ингибированиэм вирусной обратной транскриптазы. и терминированием синтеза вирусной ДНК и ауринтрикарбоновую кислоту. (АТК), ингибирувдий эффект которой обусловлен блокированием взаимодействия СБ4 рецептора с вируснш яр120. Как видно из таблицы 3, индекс селективности различен для разных солей ГК. Установлено, что ГК и 89 производные эффективно ингабируют репродукцию ВИЧ-1, причем значение 1Б для глицирама превышает 50, что указывает на перспективность использования этого препарата для лечения ВИЧ-инфекции.

Подавление продукции ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4 и цнтотоксический эффект р-глицирразановой кислоты и её солей

Таблица 3

Наименование т50' |ДМ - CD50, , IS

препарата

по активности обратной трано-криптазы ВИЧ по вирусному антигену pi.í ■

з-гк 170 231 756 4,45

1К-2Ы-соль-р-ГК 178 103 >1193 >6,70

1 Шд-соль-ß-rK 48 <48 2542 53,0

АТК 10 >1180 >118

AZT 0,0025 0,001 3,5 1400

Одним из основных недостатков Агт является его малая эффективность блокирования репродукции. . ВИЧ в клетках моноцитов/макрофагов. Вероятно, причиной этого слунсит низкая активность системы фосфорилирования Агт в макрофагальных клэтках, необходимой для включения препарата в процесс синтеза провирусной ДНК. Исходя из этого, было исследовано.

противовирусное действие некоторых производных ГК на хронически инфицированной ЕКЧ-1 культуре клеток моноцитов (рис.2;. Установлено» что при использовании этой модели противовирусное действие некоторых производных превышает эффект AZT - На-соль .ГК Енгибирует репродукцию ВИЧ-1 более чем на 8055, в то время как эффект AZI не превышает 50S двке в максимально" высокой концентрации 35 ?лкЫ. Таким образом,.в отличие от AZI, препараты ГК в значительной степени эффективно подавляют репродукцию ВИЧ как в культурах Т-хелперов, так и в моноцнтарных клетках.

В дополнительных экспериментах было проведено изучение ингиснрувдего вф^зкта глицирама в сравнении с AZI и АТК ь зависимости от времени добавления препарата к . инфицированным клетка!.! (табл.4). Для АТК ID50 практически не меняется при добавлении препарата на стадии адсорбции или после адсорбции, что. указывает на блокирование этим препаратом этапа связывания вируса с клеткой.

1кта-Е11Ч активность препаратов на различных. этапах

ргпжсгаЕНЯ вируса

_______________Таблица 4

Соединение .Время воздействия препарата на инфицированные ВИЧ-1 клетки, ч . 0* 1. 2 3 ... S5 ID50, Ш

Глицирам ЬЧ i-1 303. c ЛС Г; ■i.-, ^

AZI i—I F---i 0,35 0,0025

АТК i—i ■ |---—--! С г? 10,0

О* - препарат внесен в культуру клеток МТ-4 одновременно с.

Ряс.2 Аети-НИЧ активность содей р-глицирризиновой киолоты в культуре клеток.

а - жизнеспособные" клетки; Ь - активность обратной транскриптазы.

1 - контроль клеток без препарата; 2 - клетки с (10

мкг/щ); 3 - клетки с 0-ГК (I мг/мл);. 4 - клетки с Ша-солью-р-ГК (I мг/мл); 5 - клетки с Ша-солыо-р-ГК (.0,5 мг/мл); б - клетки с 1К-2и-солью-0-ГК (I мг/мл); 7 - клетки с 1К-2Ы-солью-р-ГК (0,5 мг/мл). По оси абсцисс - препарата в различных концентрациях; по оси ординат (слева) - количество жизнеспособных клеток (млн. клеток/мл); по оси ординат (справа) - активность обратной транскриптазы {% от контроля).

- 19 -

В случае Агт различия в Ю50 достигает 2 порядков. Вероятно, ингЕбирукщий эффект Агг при добавлении его на стада», адсорбции и последующей отмывке клеток обусловлен "проникновением за это.время препарата в клетки или остаточными количествами, н&удалэнннш при отшвке клеток.

Глкцирем в этом случае занимает промежуточное положение -при добавлении этого препарата после этапа адсорбции. снижается в 6 раз. Зто позволяет предйолокить, что механизм действия глицирама отличается от АТК и связан не только с блокированием связывания ВИЧ с клетками-мишенями, но к обусловлен другими механизмами. Это косвенно' подтверждается данными работы Ко ег а1. (1988), показавшими, что ГК непосредственно блокирует связывание вируса с клеткой в очень высокой концентрации - 1,2 мМ глицирризина при инкубации б течение 1 часа только на 25-30й сниаавт связывание вируса с клетками Ш-4, в то время как П>Бд составляет 0,1 - 0,3 мМ. В связи с этим следует отметить, что ранее описано противовирусное действие ГК в -'близких концентрациях (0,5-2,4 мУ, 1В50 - 0,71мМ) в отношении представителя семейства герпесвирусов - вируса.ветрянки-опоясываацего лишая (ВаЬа К. апй 3., 1937). Ингибирукций эффект ГК в этом случае

авторы связывают с ранней стадией вирусной репликации проникновением или раздеванием вируса.

Обнаружив, что разные соли ГК имеют различную эффективность ингибирования репродукции ВИЧ в клетках МТ-4, а сама ГК не эффективна как ингибитор репликации ВИЧ при хронической,инфекции, мы попытались исследовать на анти-ВИЧ активность другие производные ГК, полученные путем химических

модификаций р-глицирризиновой кислоты. В Институте органической химии г. Уфа ранее был разработан препарат ниглизин (пента-О-никотинат р-глицирризиновой кислоты) как противовоспалительное средство. Мы исследовали на анти-ВИЧ активность ниглизин, а также вновь синтезированные, : не описанные в литературе, амида и гликопептиды р-глицирризиновой кислоты. Результаты экспериментов приведены в табл.5,6,7.

Анти-ВИЧ активность ниглизина ____________________ Таблица 5___

Яаимено- Кон-вание цент-

U-937 (ВИЧ-1/ЭВК)

препа- радая —-------

рата прела- Ингиби- Ингибиро-рата рова- вание на-pg/ml ниэ ET, коиления % вирусного АГ, %

МТ-4 (ГКВ 4005)

Ингибпро-вание накопления вирусного АГ, Ж

МТ-4 (ВИЧ-2/гой)

Ингибкро-вание накопления вирусного АГ, %

Ниглизин 1000 66,4±3,2 60,1±4,9

- " - 500 65,9±I,9 61,8±6,6

а-гк юоо н/э н/э

- " - 500 н/э -н/э

AZT 10 57,4±2,1 55,7±0,4

96,6±0,4

96,7+0,4

99,3±2,8 98,3±5,1 96,4±0,9

91,8*1,1

8б,8±8,1

н/о н/о

80,1±3,3

н/э - нет эффекта н/о - не определяли

Анти-ВИЧ активность производных р-глщирризиновой кислоты в культура клаток Ш!-4

______;__• _______________;_Таблица 6

Наименование препарата

П350, цМ CD50, |iM IS

Р-ГК 170

ТК + L-гистидин 66

ГК ~ Азр(0Ме)о 133

гйгдизш 26

231 380 422 1479

4,45 5,83 3,17 56,88

Влияние производных р-глицирризннозой кислоты на репродукции БЙЧ-1 в культуре меток

Таблица 7

наименование Кон- Количество Ингибирование. %

препарата центрация препарата, МКГ/МЛ иивых клеток, % активности накопления

вирусной об- вирусного

ратной тран- антигена

скриптазы

Азидотимидан 10 , 6,00±2,00 98,08+0,11 94,17+0,32

р-ГК 1000 11,40±7,60 99,30±0,Ю -

— п — 500 18,20±Э,00 98,30±0,20 98,30+0,82

- " - 250 - 96,90+0,20 93,90+0,86

—. и — 100 26,00±12,10 89,90±5,90 57,70±0,92

ГК+Ь-ОШОВг^ — 4 — 500 250 12,44±5,53 13,82±4,55 99,35+0,19 99,50+0,12 98,82+0,11 58,54+0,08

ГК+1г-Азр(0Це)2 1000 42,28±10,38 95,60+0,77 -

— л — 500 62,91±5,00 97,27±2,68 97,08±0,0о

_ « __ 250 72,53+0,21 95,31+3,49 95,88¿Ю,19

ГК+Ь-гистидин 1000 8,9112,94 99,60+0,06 98,44±0,21

— — 500 8,23±1,17 99,38±0,28 98,21±0,06

ГК+6-аминоурацил 1000 58,92+3,90 99,30+0,17 94,56=0,15

_ « _ 500 .69,93+2,33 98,18±0,29 88,34+0,25

ГК+6-амино-2-3-

урацил 1000 25,11+1,89 99,10+0,28 95,26+0,3'-

_ п — 500 47,52+9,84 85,66+7,18 53 35+^.0-

ГК+Иу-Ь-Уа! (ОМе) 1000 9,83+5,48 98,93+0,10 -

_ « _ 500 11,94±2,17 98,83+0,07 98,21±0,05

_ п _ 250 20,17+5,11 98,89+0,07 98,08+0,07

_ п __ 100 22,96±11,33 98,06+0,23 -

Конроль (неин-фицированные клетки Ш-4) 38", 49+3,68

Контроль (инфицированные ВИЧ клетки МТ-4) 35,49±2,35 0 0

Как показали эксперименты, все исследованные производные ГК обладают анти-ВИЧ активностью. Ниглизин эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в культуре клеток МТ-4 и более эффективен по сравнению с А2Г в культуре хронически инфицированных клеток (табл.5). Среда изученных производных ГК он имеет самый высокий индекс селективности -56,88 (табл.6). ГК +■ СХу-Ь-Уа!(ОМе) высоко эффективен даже в концентрации 100 мкг/мл, а ГК + Азр(0Ме)2, ГК + 6-амивоурацил в исследованных концентрациях предохраняют клетки от гибели вследствии инфекции (табл.7). Таким образом, наш эксперименты показали перспективность дальнейшего поиска эффективных ингибиторов репликации ВИЧ в группе производных р-глицирризиновой кислоты..

Изучение анти-ВИЧ активности сложных зффов изоборнеола.

Нами была изучена анти-ВИЧ активность мембраноактивного препарата -энциклана, обладающего противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа А,В,С, клещевого энцефалита. Энциклан был синтезирован в Уральском' Политехническом Институте, г. Екатеринбуг. В параллельных экспериментах было установлено, что. энциклан в концентрациях до 40 мкМ, добавленный к очищенному препарату ВИЧ, не влияет на активность обратной транскриптазы» Это показывает, что анти-ВИЧ эффект энциклана не связан с блокированием обратной транскриптазы и отличается от механизма действия Агт.

Поскольку энциклан представляет собой соединение, состоящее из гидрофобного остатка изоборнилового эфира ацэтоуксусной кислоты и гидрофильного (гетероциклического)

остатка, были предприняты попытки определить акта-БИЧ активность каздого из компонентов энциклана, в также изоборнеола, являющегося компонентом пихтового масла к служащего исходным сырьем для получения изоборнилового эфире ацетоуксусной кислоты ( Рис.3).

I

- I Знциклан II К -Метилхиноксалиний

йодид

III Изоборниловый эфир IV изоборнеол

ацетоуксусной кислоты

Рве. 3 Структурные формулы исследованных химических соединений.

В таблице 8 приведены полученные результаты по определению количественных характеристик ингибарования активности обратной тражяфиптазы ВИЧ-1 этими соединениями. Установлено, что изоборниловый эфир ацетоуксусной кислоты обладает выраженным ингибирущим эффектом на репродукцию ВИЧ, сравнимым с эффектом энциклана (П>50 - 0,1 цМ, IS - 130). Следует подчеркнуть, что в отличие от этого, подавление размножения ВИЧ изоборнеолом не

превышает 50% даже в концентрации 5 мкг/мл. Гидрофильный фрагмент энциклана также обладает незначительным анти-ВИЧ эффектом (IS - 2,4). Таким образом, полученные данные позволяют сделать предположение о том, что. активным началом энциклана служит изоборниловый эфир. Тем не менее, при сравнении значений IDgQ - концентраций препаратов, вызывающих 90% ингибируюший эффект, выявляются отчетливые различия между энцикланом и изоборниловым эфиром ацетоуксусной кислоты (Табл. 8). В связи с этим необходимо отметить, что введение химических модификаций может определять проявление анти-ВИЧ активности ряда соединений - так, АТК относится к наиболее.активным анти-ВИЧ препаратам (IS - 118, ID5g - 10 мкМ), в то время как аурин не оказывает влияния на размножение ВИЧ (Balzartni J., et al., 1989).

Анти-ВИЧ активность энциклана в исходных компонентов для его синтеза

Таблица 8

Исследуемое Що> ^90- IS

соединение, (IM ЦМ

т 0,16 1,6 21,5 136,7

хт Ü 15,93 21,68 38,94 2,4 ■

III 0,365 33,58 47,45 130,0

IV >65 >65 - >130

Кроме того, нами была изучена анти-ВИЧ-2 активность энциклана. Было показано, что энциклан эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ-2 в концентрациях, превышающих 0,5 мкг/мл. При определении количественных характеристик ингибирования накопления вирусного антигена оказалось, что энциклан более,

чем на порядок эффективнее в отношении ВИЧ-1 (1Б50=0,053 н 1Б=405,7) по сравнению с ВИЧ-2 Ш50=2,09 и 15=10,29).

Таким образом, приведенные нами результаты показывают открытие принципиально нового класса химических соединений, обладающих выраженной анти-ВИЧ активностью и высокой селективностью - изоборниловые эфиры. Перспективным, на нал; взгляд, представляется поиск и изучение анти-ВИЧ эффекта других препаратов этого ряда, что, вероятно, позволит получить данные о механизме их действия.

Изучение анта-ШЧ активности антигаяасловых олигонуклеотидов.

Исследования, выполненные в последние годы, свидетельствуют о чрезвычайной перспективности антисмысловых олигонуклеотидов как потенциальных противовирусных препаратов нового поколения, направленных на определенные уникальные последовательности вирусных нуклеиновых кислот и не оказывавших побочного действия на нормальные, клетки. В настоящее время исследования в области конструирования противовирусных производных олигонуклеотидов направлены в основном еб разработку препаратов для терапии СШД, в связи с исключительной актуальностью создания средств лечения этого заболевания. К настоящему времени в литературе описано ингибирование размножения ВИЧ-1 в культуре клеток олигонуклеотидами, комплементарными . различным функциональным участкам (+)цепи РНК вируса, однако (-)цепь вирусной РНК также может кодировать белки. В этой связи представлялось интересным сравнить эффективность подавления размножения ВИЧ-1 в культуре.

клеток олигонуклеотидаш, комплементарными (+) и (-) цепям РНК вируса.

В качестве антисмысловых олигонуклеотидов были выбраны олигонуклеотиды, комплементарные донорному сайту сплайсинга (нуклеотиды 278-299 (Ratner et al., 1985), структура олигснуклеотида pTGGCGTACTCACCAGTCGCCGC -ДСС-22 и ПОЛИ(А) последовательности мРНК (рТТТТТТТТТТТТТТТГ - ПА-16), ранее показавшие высокую анти-ВИЧ активность (Agrawal et al., 1989), олигонуклеотид pCTCCGCTTCT (REV-10), комплементарный, началу гена rev (рис.4). В качестве олигонуклеотида,. комплементарного (-)цеш РНК, нами была выбрана последовательность pGCATCAAGCAGCTCOAGGCA (РМ-20), комплементарная области начала трансляции предсказанной Роджером Миллером в 1988 году открытой рамки считывания на (+) цепи ДНК ВИЧ-I (нуклеотиды 7516-7535) . Кроме того, была исследована анти-ВИЧ активность олигонуклеотида pCGTAGTTCGTCGAGGTCCGT (МР-20) комплементарного FM-2Q (рис.4). В качестве контрольного олигонуклеотида использовали олигонуклеотид структуры pTTGAAACCC GAGAACATCAT (ios), комплементарный началу мРНК гена с-1оэ мыш.

Олигонуклеотида быт синтезированы в Новосибирском Институте биоорганической химии СО РАН гомогенным фосфотриэфирным методом, как описано Абрамовой с соавторами, 1990. Препараты, использовавшиеся в экспериментах, были гомогенны по данным электрофореза (чистота не менее 95%). Структура олигонуклеотидов подтверждалась результатами секвэнирования по методу Максама-Рилберта.

Полученные экспериментальные данные (табл.9) показывают высокую противовяруснув. активность олигонуклеотида РМ-20,-

tat

S»3

S Ш

■V 5' LTR PIT p24 p(5

!

[vif]

vpr

рСГ(;а;т1СЬЛК7-10

tat Ü] not

env. LTR 3*

pTCCra¡CACOTGCTrCATGC=!iP-20

Tilo

V-

pGCAÎCAAGCAGCTCCAGGCA=RJ-2Q

Рис.4 Cxeua локя.пияяним :ir> renoue ШЧ-I исиользовашшх олнгонуклеотидов.

значительно превышающую эффект олигонуклеотидов, использованных ранее в других лабораториях Учитывая данные о неспецифическом действии антисмысловых олигонуклеотидов на размножение ВИЧ (Moser, Dervan, 1987; Povslc, Derran, 1989), нами для изучения специфичности анти-ВИЧ эффекта были использованы различные штаммы ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Специфичность действия исследованных олигонуклеотидов подтверждается результатами экспериментов с ВИЧ-2: препараты, обладающие выраженным ингибиторным эффектом для ВЙЧ-1, оказывают меньшее действие на репродукцию ВИЧ-2 (табл.Э). При анализе структуры вирусных генов ВИЧ-2 было установлено, что гомология препаратов ДСС-22 и FM-20 с соотвествуйвдаа нуклеотидными последовательностями в ВИЧ-2 составляет мевйе 30%. Что касается олигонуклеотида ПА-16, то его противовирусная активность также значительно ниже для ВИЧ-2. Эти данные позволяют предположить, что эффект этого олигонуклеотида связан не только с его взаимодействием с поли А последовательностями шРНК, как предполагалось ранее (Agrawal, 1988). Пра аналазе первичной структуры ВИЧ-1 было установлено, что в области гена, env -{5740-5753, 7702-7717) локализованы кластера поли А, отсутствующие в геноме ВИЧ-2. Это дает возможность предположить, что анти-ВИЧ активность , этого олйгонувйаотада связана в большей степени с блокированием этапа трансляций mPHK env за счет его взаимодействия с mPHK.

Высокая анти-ВИЧ активность антисмысловых олигонуклеотидов показана в ряде работ. Более высокую эффективность олигонуклеотида МР-20 по сравнению с олигонуклеотидами, ошсанными в этих работах, можно, вероятно, объяснить удачным выбором структуры мишени.

Ингабирование репродукции различных иташов ВИЧ антисшсловыш олигонукле отндаьги

Таблица 9

наименование Концентрация, Ингабирование, %

препарата цМ ГКВ 4005 ГКВ 4046 ВИЧ-2/го4

Ш? АГ ИТ ЙТ АГ

раСАТСААС(ЖСТССАСССА 5 98 97 95" 39 64

(РМ-20 ) 1 9Т 94- 9Т - -

ЙГССССТАСТСАССАСТСССССС 10 94 - ■ _ 39 -

(ДСС-22) 5 68 - - 40 -

1 13 19 - 2 -

рТТТТТТТТТТТТТТТТ 10 63 83 - 40 -

(ПА-1 б) т 6 8 - 22 -

рТТСАААССССАСААСАТСАТ 10 50 - - - -

(103) т 24 13 - - -

лгт 0,35 97 95 97 98 99

без препарата - 0 0 0 0 0

В таблице приведены Средние данные 3-6 экспериментов

Высокая эффективность смыслового олигонуклеотида РМ-20 может быть объяснена его эффективным действием на нескольких этапах развития-вируса: 1) блокирует инициацию трансляции за счет взаимодействия с гаРНК гена тпе, описанного Миллером, если он - функционирующий ген. Эффективность этого процесса может быть особенно высока, поскольку участок, комплементарный этому олигонуклеотиду, соответствует сайту инициации трансляции тРНК гена *те и локализуется в выпетленном районе вторичной структуры шРНК (Предсказание вторичной структуры РНК было

/

выполнено с помощью программы "PCFOLD" (2икег,.Stiegler, 1931; Jacobson et al., 1984). 2; Олигонуклеотид ингиоируе1 транскрипцию с геномной ДНК шРНК env; 3) За счет его взаимодействия с (-)цепыо ДНК возможно блокирование синтеза (•Оцепи ДНК вируса. 4) Олигонуклеотид может ингибировать процесс репликации вирусной (геномной) FHK на этапе ее синтеза с. ДНК матрицы.

Олигонуклеотид РМ-20 оказывает также выраженный ингибирунций -эффект на репродукцию выделенного от' инфицированного человека штамма ВИЧ-1 J& 1. (ГКВ 4046). Компьютерный анализ этого района 47. различных шташов : ВИЧ-1 показал, что участок, к которому комплементарен олигонуклеотид РМ-20,.является.консервативным для.всех.известных.шташов ВИЧ-1 (не более 1-2 замен).

Контрольный олигонуклеотид Tos, хотя и в-меньшей степени, такае оказывал ингибирущее -действие на ..размножение вируса, однако абсолютно, не . защищал клетки от гибели. Но так -как контрольный .олигонуклеотид не имеет совершенных участков связывания с РНК ВИЧ-1, объяснение его противовирусной активности-взаимодействием с генетическим материалом вируса представляется,маловероятным. Анализ-опубликованных .данных по действию олигонуклеотидов и их аналогов на репродукцию ВИЧ-1 приводит к заключению, что, по-видимому, имеется несколько механизмов подавления вирусной инфекции, олигонуклеотидами, и в ряде случаев ведущим из них оказывается механизм, не связанный с образованием совершенных комплементарных комплексов. Так, отмечена относительно высокая противовирусная активность гомоолигонуклеотидов (Agrawal et al., 1988), а в случае

- зг -

фзсфэтаоатных аналогов гомоолигонуклэотид (олигоцитиднлат} оказался самым активным (А5гагса1е1; а1., 1988; Магзийлга ег а!., 1987).- В таблице 10 приведены результаты экспериментов по определении количественных . характеристик ингибирования репродукции: ВИЧ-1 для некоторых антисдасловых ожгонуклэотидоз. Для сравнения.использовали;один из наиболее эффективных для лечения ВИЧ-инфакции препаратов - азидотпшдин. Как видно из таблицы 10 индекс селективности существенно отличается для разных, антисдасловых- олнгонуклеотидсв. Наибольшим 23 характеризуются олигонуклеотиды : РМ-20 и комплементарный ему МР-20 - 13. до 5СЮ.

Эффективность анти-ЕИЧ действия -антксгшзлоЕнх олитоцуклз отадоз

Таблица 10

Ингибитор ID50' <%0' IS

|Ш ЦМ.

pGCATCAAGCAGCTCCAGGCA 0,5 >50 >100

(РМ-20)

pCGTAGTTCGTCGAGGTCCGT. 0,1, >50 >500

(МР-20)

pTGGCGTACTCACCAGTCGCCGC 4,7 >50 >10,6

(ДСС-22)

рТТТТТТТТТТТТТТТТ 8,0 >50 >6,3

(ПА—16)

AZT 0,0025 3,5 1400

Таким-образом, результаты экспериментов с использованием модели инфицированных ВИЧ клеток позволили найти перспективные алигонуклеотиды•..- с высоким^ значением IS, уступашим только препаратам группы AZT.

- лс. - V

Но, как известно, обычные олигонуклеотшш плохо проникают в клетку и подвержены деградации под действием клеточных . нуклеаз, что ограничивает ихИспользование для лечения СШЩ. В настоящее время интенсивно ведутся работы по конструированию аналогов олигонуклеотидов с измененным рибозофосфатным остовом (фосфонаты и фосфоротиоаты), которые легко.проникают в клетки и устойчивы по отношению к гидролизущим нуклеиновые кислоты ферментам (А^татой Б. е1; а1., 1988, 1989; Магви1сига М. ег а!., 1989). Недостатками таких производных как потенциальных ' терапевтических препаратов являются их более высокая, по сравнению с обычными олигонуклеотидами, стоимость и отсутствие на сегодняшний день методов получения их в виде чистых стереоизомерных продуктов, что приводит^к тому, что получаемые препараты содержат лишь небольшое количество активных компонент, образующих прочные комплементарные комплексы. В связи с этим большое значение 'имеет создание противовирусных производных на основе обычных.олигонуклеотидов, синтез которых является более доступным, путем совершенствования структуры олигонуклеотидов. Поэтому мы .изучали возможность увеличения ингибирующей активности исследованных нами олигонуклеотидов путем введения в 5'-положение молекулы химических модификаций, облегчающих попадание олигонуклеотидов в клетку. Нашими коллегами из Института биоорганической химии были синтезированы производные олигонуклеотидов, несущие на 5'-конце алифатические остатки различной длины либо остаток холестерина. Алифатические остатки длиной 18, 16 и 15 атомов углерода присоединяли к 5'-концу олигонуклеотидов через ^офамидную связь либо напрямую, либо используя в качестве спвйсера аминоуксусную

кислоту и пропйлендиамин. (соответственно a.b.с на рис.5). Остаток холестерина (4) присоединяли, используя в качестве сгойсера. аминоуксусную кислоту. Полученные соединения были охарактеризованы с помощью обращеннофазовой хроматографий и электрофореза в полиакриламидном геле.

-WMOW СНа ~ i?

a

-MH-CHa-С-ö-(CHQ)asCHa

а II

-К!Ысня) -нн-с-(сно) cHg

a ~ i»

г

I

HoC^C

СИ®,

Рис.5 Структура алифатических остатковt остатка холестерина.

Как и ожидалось, присоединение гидрофобных остатков существенно увеличивает связывание олигонуклеотидов с клетками (табл.11).(В таблице приведены значения связывания для олигонуклеотида только до 30 минут, так как при более длительной инкубации происходит полная деградация немодифвдированного олигонуклеотида. В то же время до 50% олигонуклеотидов с модифицированными 5'-концами существуют в

клетке и в среде в недеградированном виде -. данные не

приведены).

Связывание производит пли шщуклеожидов с клетками МТ-4

Таблица II

Производные олигонуклеотидов Связывание с клетками (%)

5 мин. 30 мин. 90 мйн. Б ч. 18 ч.

(Р1)»в о.г 0.1 0.1 - -

а-(рТ)1в 0.3 0.4 0.6 1.1 -

Ь-(рТ)1в 0.2 0.3 0.3 0.6 -

0.3. 0.6 1.5 3.7 -

СНр®>,« - 5.7 9.4 14.9 19.0

Интересно отметить , что прямой корреляции мезду длиной алифатической цепи и связыванием производных с клетками нет. По-видимому, существенным для связывания является .природа спейсврной группы мвкду -гидрофобной группировкой и олигонуклеотидом. Так, соединение с,.имеющее 15 атомов углерода в алифатической цепи, связывается с клетками в 3 - 4 раза лучше, чем соединения а и Ь. амепщив большее количество атомов углерода в алифатической цепи.Возшшо, что ■ на лучшее связывание с клетками соеданения а оказывает влияние сходство амщдаой связи с пептидной.

Полученные экспериментальные данные по ингибировани» размножения ВИЧ-1 в культуре клеток (табл.12) показывают высокую противовирусную активность производных олигонуклеотидов, значительно превышавдую . эффект ^модифицированных олигонуклеотидов. Следует отметить, что

Йнгибирование репродукции ВИЧ-1 производными одягонуклаотадов в культуре клеток Ш!-4

Таблица 12

Олиго-нукле-рткд Кон цэн тра ция ЦМ . ИятжЗирование, %

0 а Ь с й ;

М1 М2 МЗ М4 М1 М2 МЗ М<1 М1 М2 МЗ М4 М1 М2 из М4 т М2 МЗ М4

1МР-20 5' 34 62 31 29 0 95 87 86 0 29 28 21 89 82 70 74 62 91 87 861

г.5 ,6 41 15 16 12 53 24 31 12 32 24 12 14 41 17 25 90 91 89 88

0.5 32 <13 21 0 41 7 15 19 33 0 4 0 23 0 13 16 46 0 33

РМ-20 5 0 47 го 19 0 70 50 59 0 44 21 13 51 59 29 45 0 93 86 8В

2.5 0 52 13 13 0 43 0 12 0 36 20 5 12 68 0 27 68 90 88 87

0.5 0 57 29 9 г 0 27 0 5 0 30 13 3 0 23 0 0 76 63 43 57

ПА-Х6 5. 0 59 24 41 гэ га V 7 9 48 34 7 11 70 60 21 36 81 88 86 81

г.5 0 59 7 23 15 30 15 б 13 39 27 2 39 33 С 0 63 86 79 77!

0.5 0 52 0 11, 0 9 15 г 22 5 17 0 33 13 0 0 0 17 15 о:

±аа 5 0 94 73 67 0 — 58 б 0 .13 0 13 0 17 — — 0 27 24 8

г.5 0 50 23 16 0 28 0 — 0 18 0 10 0 25 — — 0 13 12 г

0.5 0 19 0 5 0 - 0 0 — 0 1 1 — 3 0 21 — — 0 13 16 0

НЕ7-10 0 23 0 6 56 62 34 30 0 81 0 а 62 85 66 67 28 91 85 79

2.5 .0 17 — 5 0 23 19 11 0 17 0 0 -0 36 0 6 59 90 83 79

0.5 0 7 0 2 0 О 0 0 "0 9 0 0 1 1 .0 0 0 7 0 0

М1-М4 - параметры* по которым оценивалась противовирусная активность производных олигонуклеотидов (М1 - увеличение жизнеспособности клеток; М2 - подавление активности обратной транскриптазы; МЗ - уменьшение суммарного вирусного антигена; .44 - уменьшение антигена р24). Использовались производные еледущих олигонуклеотидов: МР-20 - рТСССТССАССТССТТСАТаб; РМ-20 - рССАТСААССАССТССАСССА; РОБ - ртАААССССАСААСАТСАТ; НЕУ-Ю - рСТССССТТСТ; Обозначение производных а,Ь,с,й - как на рис.5; о - нвмодифицированннй олигонуклестйд.

абсолютные значения ингиоирования размножения- вируса могут отличаться в разных сериях экспериментов," что может оыть связано с нуклеазной активность сыворотки и/или неконтролируемыми изменениями в состоянии клеток и вируса. Однако внутри одной серии экспериментов отклонение выбранных параметров от средних не превышает 5 - 10%. Представленные в табл. 12 значения представляют собой среднее из трех повторов в одной серии экспериментов. В качестве параметров, по которым следили за ингибированием размножения вируса, ,мы выбрали I) увеличение жизнеспособности клеток (так, если для незаракенных клеток жизнеспособность составила 90 - 5%, а для зараженных -35 ± 3%, то увеличение жизнеспособности клеток измеряли как '

х-35

у =- * 100,

90-35

где х - жйэнеспособность клеток при данной концентрации производного олнгонуклеотвда; 2) подавление активности обратной транскриптазы; 3) уменыаение . суммарного вкусного антигена; уменьшение-антигена р24. Как видно из таблицы 12, результаты этих измерений для производных олигонуклеотидов достаточно хорошо согласуются мезду собой.

йемодифицированные олигонуклеотида оказывают влияние главным образом на активность обратной транскрштазы, -причем это действие примерно одинаково для контрольного и опытных олетонуклеоТйдов. В то же время подавление суммарного антигена и антигена р24 составляет лишь 5 - 30%%, а небольшое увеличение жизнеспособности; происходит .лишь в случае олигонуклеотида МР-20. Немодифвдированный олигонуклеотид длиной 10 (ШМО) практически не влияет на все четыре показателя (табл.12),

- 37 -

Противовирусная активность производных

контрольного олигонуклеотида значительно ниже, чем у некоднфицированного (табл.12). Во всех остальных случаях противовирусная активность производных антисмысловых олигонуклеотидов коррелирует с их способностью связываться с клетками.: (табл. II и табл.12). Крайний случай этой закономерности проявляется на прюиэре олигонуклеотида REV-1G.. -противовирусную, активность проявляют только холестериновые производные этого короткого олигонуклеотида и лишь при концентрации . 2,5 - 5 мкМ.. Наилучшей противовирусной активностью,, так аэ как и в случае ^модифицированных олигонуклеотидов, обладают произЕодппе олигонуклеотидов FM-20 и МР-20.

Как следует • из табл.12, наибольшее противовирусное действие оказывают произво_дые . холестерина. Эти данные соответствуют исследованиям Letslnger (1939) по увеличению противовирусной активности- холестериновых производных. антисдаоловых олигонуклеотидов,' однако в этих работах использовались другие способы пришивки остатка холестерина к олнгонуклеотиду. Увеличение анти-ВИЧ активности также происходило при; пришивке-остатка холестерина к фосфоротиатному аналогу гдаоолшгонуклеотида ÜC10 Stein (1991). В настоящей работе противовирусный-; эффект производных контрольного олигонуклеотида F0S-20 минимален (табл.12), что расходится 'с данными об увеличении, сиквенс-нестацифического действия фссфоротиатных производных олигонуклеотидов (Stein,1991).

Результаты проведенной работы по изучению анти-ВИЧ эффекта гидрофобных производных олигонуклеотидов показали высокую

избирательность выбранных препаратов. Отсутствие токсического эффекта и низкие концентрации, при которых работают холестериновые производные позволяет отнести sie. препараты к перзспективным анти-ВИЧ соединениям.

Изучение втв-тВИЧ действия различных препаратов в кскбннвцаи с ÄZT

Существенной характеристикой препаратов с анти-ВИЧ активностью служит возможность их использования совместно с AZT. Следует отметить, что AZT и его аналоги являются основой анти-ВИЧ терапии, как препараты с высокими индексам-: селективности - до 2000. Среда других групп препаратов значения IS, как правило, не превышают 100, за исключением TIB0 производных (Pamela'et al., 1950). Учитывая это, ш считали необходимым твкке оценивать исследуемые ■ препарата на возможность их совместного использования с AZU. Более того, . этот подход может быть перспективен для разработки 'комплексной терапии СПРЩ, 'особенно "а использованием комбинации-" препаратов с различными механизмами.действия, которые могут дополнять друг друга, воздействуя на разше этапа репродукции BÎÎ4.

Результаты экспериментов с -использованием модели хронически инфицированных ВИЧ-1 -моноцитов человека , показали, что несмотря на неэффективность ГК.в этой культуре клеток, в комбинации с AZT.PK ингибирует размножение вируса в ней на 39,6% (табл.13). На модели первично инфицированных ВИЧ-1 клеток МТ-4 мы экспериментально показали, что глицирам (препарат на основе ГК) не является антагонистом AZT, так как комбинационный индекс PIC для смеси АйТгглицирам = 1:10000,. определенный

- 3е» -

согласно (Allen et al., 1989) и рассчитываемый по формуле:

IDgQ А в смеси ID5Q В в смеси

А

%ов

равен 1,55. Таким образом, по этому параметру ГК также мояно отнести к перспективным анти-ВИЧ препаратам.

Сочетанкое действие препаратов с различный механизмом действия на репродукция ЕПЧ-1 в хронически хшфищхроваквоа культура клеток

Таблица 13

Препарат

А2Я ~ ГК

А2Т+ГК

Энщклав

AZT+зшщклая

Концентрация препарата, Ингибирование мкг/мл 'обратной

транскриптазы вируса, %

10 1000-IQ+I0QQ

20

10+20

52,Т±Т,7

н/э 89,6±1,4

12,4±4,2

87,3+0,7

Результаты, экспериментов с использованием модели хронически инфицированных ВИЧ-1 . моноцитов человека продемонстрировали низкую эффективность энциклана (табл.13У, однако, в комбинации с Агт энциклан ингибирует репродукцию вируса на 86%.. Этот факт дает возможность предполояать наличие синергетического антя-ВИЧ действия этих соединений. Результаты по изучению ингибирующего действия комбинаций энциклана с кЪ1 в

+

кнфщированных -ВЙЧ-1 клетках.'-ЫТ-4 так ке свидетельствуют о перспективности использования таких комбинаций1' (табл.14).

Что-касается ауринтрикарбоновой кислоты, то в комбинации с А2Т или с гливдрамом ее эффективность в отношении -ВИЧ несколько возрастает (табл.14). При определении комбинационного индекса в смеси А2Т:АТК=1:200 оказалось, что он равен 1,53 е. следовательно, эти препараты не являются антагонистами.

Кнгкбкрование репродукцки БИЧ-1 в культуре клеток Ш-4 кеибянацияки .наиболее аффективных препаратов с А2Т

Таблица 14

Препараты и" их комбинации Концентрация, Ингибирование активности обратной транскриптазы*, %

0.01 26.9+0.9

— * — 0.05 92.0±1.3

ЗнцЕклан 0.06 46.1±0.5

Знцнклгн + AZT 0.05 +0.01 93.5+0.2

ЭяцЕален +• AZT 0.06 + 0.05, 96.4+0.3

¿га: 5.0 84.6+0.7

AÜS+ AST 5.0 + 0.01 91.6±0.3

JLTK+ А2Т 5.0 + 0.05 93.8+0.2

Тхшщрш 50.0 69.4+0.8

Глпщршд + £Ж 50.0 + 5.0. 95.5±0.3

ГлЕцзрш + AZT 50.0 + 0.01 99.1+0.2

- 41 -

шводы-

t. Изучена анти-ВИЧ активность р-глицирризиновой кислоты и различных ее производных. Показана анти-ВИЧ активность гликопептидов и амидов - ¡З-глицирризиновой кислоты, ниглизина (пента-о-никотинат (З-глицирризиновой кислоты). Показано, что производные (З-глшдирризиновой кислоты эффективно ингибируют репродукцию ВИЧ-I в хронически инфицированной ВИЧ-I культуре клеток.моноцитов человека.

2. Установлена, способность нового класса химических соединений - изоборннловые эфиры (энциклан) - ингибировать репродукцию как ВИЧ-I., так и ВИЧ-2 в культуре клеток - (IS - 406 и 10. соответственно).

3. Показана высокая противовирусная активность и специфичность анти-ВИЧ-I действия, олигонуклеотидов FM-20 pGCAICAAGCAGCTCCAGGCA, . .комплементарного области. начала трансляции открытой рамки считывания (+) цепи- ДНК ВИЧ-I, и МР-20 - pTGCCTGGAGCTGCTTGAIGC, комплементарного олигонуклеотиду FM-20, (IBgg - 0,5. мкМ и 0,1 мкМу*соответственно). .

4. На примере уже: известных ' антисшсловых... олигонуклеотидов -ингибиторов. ВИЧ-I и новых, олигонуклеотидов FM-20 и МР-20 показано, что- присоединение к 5'-концевым ' фосфатам олигонуклеотидов алифатических зминов или остатков холестерина, приводит к существенному, повышению эффективности ингибирования шш репродукции ' ВИЧ \ и обеспечивает в значительной степейи защиту Т-хелперов от цитопатического действия Еируса.

5. Изучена анти-ВИЧ эффективность комбинаций AZI с препаратами с другими механизмами действия с использованием хронически инфицированных ВИЧ-I моноцитов человека и Т-хелперсв.

Установлено, что энциклан, глицирам и ауринтрикарбоновая кислота не являются антагонистами AZT.

РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

I. Абрамова Т.В., Блинов В.М., Власов В.В., Горн В.В., Заратова В.Ф., Иванова Е.М., Коневец Д.А., Плясунова O.A., Покровский А.Г., Сандахчиев Л.С., Свинарчук Ф.П., Старостин В.П., Чаплыгина С.Р. Ингибирование репродукции вируса иммунодефицита человека в культуре клеток производными антисмысловых олигонуклеотидов //Докл. АН СССР. 1990. Т.312. )» 5. С. 1259-1262.' ' .

2., Abramova T.V., Bllnov V.K., Vlassov V.V., Gorn V.V., Zarytova V.F., Ivanova E.M., Konevets D.A., Plyasunova O.A., Pokrovsky A.G. Anti-HIV activity ol the antIsense ollgonucleotldes bearlng lipophllic and .alkylattng groups at tlie 5'- termlnus // Nucleosldes & Nucleotldes. 1991. V. 10(1-3). P. 419-422. .

3. Мамаева O.A., Плясунова O.A., Проняева T.P., Покровский А.Г., Ткачев B.K., Карамов З.В.. Руднева .И.А. особенности длительного непрерывного •культивирования линии клеток, хронически инфицированной вирусом .-иммунодефицита человека I типа //Вопросы ВЩ)усоло1Ш. 1991. # 6. С. 447-450.

4. Плясунова O.A., Егоричева И.Н., , .Федюк Н.В., Покровский А.Г., Балтина Л.А., Муринов Толстиков Г.А. Изучение анти-ВИЧ активности ß-глицирризиновой кислоты //Вопросы вирусологии." 1992. J§ 5". С. 255-258.

5. Покровский А.Г., Плясунова O.A., Сандахчиев.Л.С., Киселев О.И., Чупахин О.Н., Чарушн В.Н., Понизовский М.Т., Дубур

Г.Я., Бисениекс Э.А. Анти-ВИЧ активность сложных эфгоов язоборнеола // Докл. РАН. 1992. Т. ¿2.6. лс«2. с. ¿76-379.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ЗАЩИЩЕНЫ АВТОРСНИШ СВИДЕТЕЛЬСТВУЙ!:

6. Покровский: А.Г., Плясунова O.A., Толстиков Г.А., Балтина Л. А., Мурашов D.M. Ингибитор размножения вируса иммунодефицита человека // Заявка на A.c. СССР .!1 489792/14-124380, положительное решение от 09.08.91.

7. Балтина Л.А., Покровский А.Г., Плясунова O.A., Толстиков Г.А. Амид ß-глицирризиновой кислоты с 6-амино-2-тио~ урацилом, проявляющий анти-СГЩД активность // Заявка на A.c. СССР JS 4916058/04, положительное решение от 10.01.92.

8. Балтина Л.А., Покровский'А-Г.,. Плясунова O.A., Толстиков Г.А. Амид p-глицирризиновой кислоты .с метиловым эфиром L-гистидина, проявлящий чнти-СГВД активность // Заявка на A.c. СССР й- 4915764/04, положительное решение от 03.01.92.

9. Толстиков Г.А., Балтина Л.А., Покровский' А.Г., Плясунова O.A., Сандахчиев/Л.С. Гликопестид.ß-глицирризиновой кислоты с дибутшговым эфиром Ir-глутаминовой кислоты, проявляющий анти-СГОЩ активность // Заявка на A.c. СССР И 4916056/04, положительное решение от 03.01.92.

10. Толстиков Г;А., Балтина Л.А., Покровский А.Г.', Плясунова O.A., Муринов Ю.И., Сандахчиев Л.С- Амид 0-глицирризиновсй кислоты с 6-аминоурацилом, проявлящий анти-СШЩ активность //Заявка на A.c. СССР й- 49I6G55/04, положительное решение от 03.01.92.

П. Балтина Л.А.,Покровский. А.Г., Пдясунова O.A., Толстиков

- 44 -

Г.А. Гликопептид ß-глицирризиновой. кислоты с -метиловым эфиром глицил-Ь-валина, проявляющий внти-СЩД активность // Заявка на A.c. СССР * 4915763/04, положительное решение от 03.01.92.

12. Толстиков Г.А., Балтина JI.A., Покровский А.Г., Плясунова O.A., Муринов Ю.И. Гликопвптид ß-глицирризиновойкислоты с диметиловым эфиром Ь-аспарагиновой кислоты, проявляющий анти-СПИД активность У/ Заявка на A.c. СССР * 4915765/04, положительное решение -от 03.01.92.

■ 13. Покровский А.Г., Плясунова O.A., Блинов В.Ы., Киселев 0.И., Петрова Г.М., Чупахин О.Н., Чарушин В.Н., Понизовский Ы.Г., Дубур Г.Я., Бисениекс Э.А., Улдрикис Я.Р. Применение изоборнилового эфира 2,9-димвтил - За,4,9г9а тетрагидрофуро - [2,3-Ь] - хиноксалин- 3-карбоновой кислоты (энциклана) как ингибитора -размножения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ)// Заявка на A.c. СССР J» 4903830/14, положительное решение от.22.06.92.

ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ:

14. РокготаКу A.G..Plyasunova О.ДааггеЬота 0.,Chaplyglna S.Comparison of various drugs ellcct on HIV reproduction on primary and. cftronlcalll infected, cell lines. - Abstracts ol the Sixth International . conlerence on AILS, .San Francisco. 1БА. 1990 (20-24 Зиле).?Л12.

15. Балтина H.A., Зиновьева С.А., Сахаутдинова Г.М., Покровский А.Г., Плясунова O.A., Толстиков Г.А. Гликапептида глицирризиновой кислоты - новый класс иммуномодуляторав и

; анти-ВИЧ агентов. -Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Химия природных низкомолекулярных биорегуляторов", ЕреванЛЭЭО (29 октября-I ноября) .С.84.

16. Pokrovsky A.G., Plyasunova О.A., Blinov V.M., Abramova T.V.,. Svlnarchuk F.P., Vlassov V.V. Specificity of antl-HIV action of antisense oligonucleotides on different HIV strains. - Abstracts of the International Conference on Nucleic. Acid Therapeutics, Florida. USA. 1991 (13-17 January).P.80.

Г7. Плясунова O.A., Покровский А.Г., Блиноз B.M., Власов В.В., Свиаарчук Ф.П., Абрамова Т.В., Горн В.В., Коневец Д.А. Изучение специфичности анти-ВИЧ действия антисглысловых олйгонуклеотидов на разные птамда вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). -Тезисы докладов IX Всесоюзного симпозиума по целенаправленному изысканию лекарственных средств, Рига." 1991 (22-24 января).С.3.

18. Покровский А.Г., Плясукова О.А., Русаков И.А., Балтина Л.А., Муринов ■ Ю.И., Тодртиков Г.А. Ингибирование репродукции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в культуре клеток продуктами экстракции корня;солодки и производными р-глицирризиновой' кислоты. -Тезисы докладов IX Всесоюзного симпозиума по целенаправленному изысканию лекарственных средств, Рига. 1991 (22-24 января).С.54.

19. PoKrovsky A.G., Plyasunoya О.А., Sandahchiev L.S. Perspectives for therapy of HIV infection by drugs with different mechanisms of action. - Abstracts of the International Conference on molecular biology aspects of

- 46 -

diagnostics and therapy of AIDS, Novosibirsk, Academgorodok. 1991 (1-5 July).P.11.

20. Abramova T, Bllnov V., Vlassov V., Corn V., Zarytova V., Ivanova E., Konevets D., Plyasunova 0., Pokrovsky A., Sandahchiev L., Svlnarchuk F., Starostin V., Chapligina S.Specificity or HIV Inhibition by modified antisense olygonucleotldes.- Abstracts of the International Conference on molecular biology aspects of diagnostics and therapy cf AIDS, Novosibirsk, Academgorodok. 1991 (1-5 July);P.8.

21. Plyasunova 0.A., Pokrovsky A.G., Rusakov I.A., Baltina I.A., MurinovY.l., Tolstikov G.A. Inhibition of human immunodeficiency virus (HTV) reproduction in cell cultures by glycyrrhizlc acid. - Abstracts oi the International Conference on molecular biology aspects of diagnostics and therapy of AIDS, Novosibirsk, Academgorodok. 1991 (1-5 July).P.15.

22. Ponizovsky M., Petrova G., Charushin V., Dubur G., Chupakhin 0., Pokrovsky A., Kiselev 0., Plyasunova 0., Egorlcheva I. New heterocyclic compounds with antl-HIV activity. - Abstracts of the International Conference on molecular biology aspects of diagnostics and therapy of AIDS, Novosibirsk, Academgorodok. 1991 (1-5 July).P.5.

23. Vlassov V., Konevets D., Plyasunova 0., Pokrovsky A., Svlnarchuk P. Hydrolysable ollgodeoxynucleotides derivatives as anti-HIV agents. - Abstracts of the International Conference on molecular biology aspects of

diagnostics and therapy of AIDS, Novosibirsk, Academgorodok. 1991 (1-5 July).P.25.

24. Tolstikov G.A., Baltlna L.A., Ryzhova S.A., Murlnov Yu. I., Pokrovsky A.G., Plyasunova O.A., Sandahchlev L.S. Development of new antl-HIV agents based on glycyrrhlzic acid. - Abstracts of the International Conference on molecular biology aspects of diagnostics and therapy of AIDS, Novosibirsk, Academgorodok. 1991 (1-5 July).P.14.

25. Толстяков Т.A., Балтина Л.А., Покровский А.Г., Шшсунова O.A. Разработка новых средств для борьбы с ВИЧ-инфекцией на -основе глицирризиновой кислоты. -Материалы IV Всесоюзного симпозиума "Изучение и использование солодки в СССР", Алма-Ата. 1991 (3-5 октября).С.160-161.

26. Plyasunova 0.A., Pokrovsky. A.G., Rusakov I.A., Baltlna L.A., Murlnov Yu.I., Tolstlkov G.A. Inhibition of HIV reproduction in cell cultures by glycyrrhlzlc acid.-Abstracts of the VIII International Conference on AIDS/III STD World Congress, Amsterdam*. 1992 (July).

27. Pokrovsky A.G., Plyasunova O.A., Bllnov V.M., Abramova T.V., Svlnarchuk F.E., Vlaasov V.V. Antl-HIV action of antlsense and sense ollgodeoxynucleotldes and its derivatives. - Abstracts of the VIII International Conference on AIDS/ITI STD World Congress, Amsterdam. 1992' (July).

28. SvlnarchuK P.P., Konevetz D.A., Vlassov V.V., Pokrovsky A.G., Plyasunova O.A. Antl-HIV action of antlsense and sense oligodeoxynucleotide derivatives. - Abstracts of the

International Conference on Antisense Oligonucleotides and Rlbonucleases H, Arcachon. 1992 (27 september-2 october).

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с сотрудниками ВНИИ МБ НПО "Виктор": Покровским

A.Г., Чаплыгиной С.Р., Егоричевой И.Н., Федюк Н.В., - Власккной

B.В., Мамаевой.0.А., Блиновым В.М.; НИБХ РАН: Власовым В.В., Свинарчуком Ф.П., Коневцом Д.А., Абрамовой Т.В., Горном В.В.; Института органической химии Башкирского научного центра РАН: Толстиковым Г.А., Балтикой Л.А., 'Муриновым Ю И., Русаковым К.А.; Уральского политехнического института: Чупахиным O.K., Чарушиным В.Н., Понизовским М.Г.; Института гриппа: Киселевым О.И. Своим ближайшим коллегам и соавторам проведенных исследований автор приносит искреннюю благодарность.

СПИСОК. ОДТИРУШОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Абрамова Т.-В., Комарова Н.И., Мундус Д.А., Перебоева О.С. Эффективный синтез препаративных количеств 5'-фосфоршшро-ванных олигодезоксирибонуклеотидов // Изв. . Сиб. отд-ния АН СССР. Сер .хим.наук.. 1990. Вып.5. С. 45-51. Нданов В.М., Карамов З.В., Аракелов С.А., Руднева И.А., Кетиладзе Е.С., Стаханова В.М.,'Малышев Н.А., Алексеева ИЛ. Иммуноферментный метод индикации антигена и антител к вирусу иммунодефицита . человека и его использование для серологического обследования различных групп населения // Вопр. вирусол. 1988. М 33. С. 294-298.

Agrawal S., Goodchild J., Civelra li.P., Thornton A.H., Sarin P.S. and Zamecnlk P.C. Oligodeoxynucleoside phosphor&nidates and phosphorothioates as inhibitors or human imnrdnoderi-clency virus // Proc. Natl. Acad. Scl. USA. 1988. 7.35.

P. 7079-7083.

Agrawal S., Goodchild J., Civelra M., Sarin P.S., Zamecnlk P.O. Phosphoroamidate, phosphorothloate, and methilphosphonate analogs of ollgodeoxynucleotlde:' Inhibitors of human Immunodeficiency virus // Nucleosides & Nucleotides. 1988. V.8. P. 819-823.

Agrawal S., Ikeuchi T., Sun D., Sarin P.S., Konopka A., • Maize1 J. and Zamecnlk P.C. Inhibition of human Immunodeficiency virus In early Infected and chronically Infected cells by antlsense ollgodeoxynucleotldes and their phosphorothloate analogues •// Proc. Natl. Acad. Scl. USA. 1989. 7.86.' P.7790-7794. •

Allen I.B., Teepe A.G., Kehoe M.J., Holland C.S., Mc Namara D.J. and Cook P.D. Antiviral and-cytotoxicity evaluation of _ 3-nitro-3-deaz,auridlne // Antiviral Res. 1989. 7.12. P.259-268.

Baba M. and Shlgeta S. Antiviral activity of glycyrrhisin against varicella-zoster virus in vitro // Antiviral Res. 1987. 7.7. ?. 99-107. .

Balsarlnl J., Naesens L., Herdewljn P., Rosenberg I., Holy A., Pauwels R., Baba M., Johns D.G., Be Glercq S. Marked in vivo antiretrovirus activity of 9-(2-phosphonylmethoxyethyllade-nine,. a selective anti-human immunodeficiency virus agent //

- 50 -

Proc. Natl. Acad. Scl. USA. 1989. V.86. P. 332-335. Crowe S.M., McGrath M.S., Elbeik T., Kirliiara J. and Mills J. . Comparative assessment of antiretrovirale in human monocyte-macrophages and lymphoid cell lines acutely - and chronically Infected with the human Immunodeficiency virus // J. Med. Virol. 1989. V.29. P. 176-180. De Clercq E. Chemotherapeutlc approach of AIDS // Verh. K.

Acad. GeneesM. Belg. 1988. V.50. P. 166-216. Fields A.P., Bednarik P.P., Hess A., May Yf.S. Human Immunodeficiency virus Induces phosphorylation of its cell surface receptor //Nature (London). 1988. V.333. P. 278-280. Herdewljn P. and De Clercq E. Dideoxynucleoside analogues as ■ inhibitors of HIV replication // In: Design Antl-AIDS Drugs . edited by E. De Clercq. Pharmacochemistry library. ELSEVIER -Amsterdam - Oxford - New York - Tokyo. 1990. V.14. P. 141-174.

Hirsch M.S. Azldothymldlne // J. Inf. Dis. 1988. V.157. P. 427-431.

Hu J.M. and Hslung G.D. Evaluation of new antiviral agents: I. In vitro perspectives // Antiviral Res. 1989. V.U. P. 217-232.

Ito M., Nakashima H., Pauwels R., De Clercq E., Shlgeta S. and Yamamoto N. Inhibitory effect of glycyrrhizin on the in vitro Infectlvlty and cytopathic activity of the human immunodeficiency vi~us [HIV (HTLV-III/LAV)] // Antiviral Res. 1987. V.7. P. 127-137. Ito M., Sato A., Hlrabayashl K., Tanabe P., Shlgeta S., Baba

ti., De Clercq E., Nakashima H. and Yamamoto N. Mechanism of Inhibitory effect of glycyrrhizin on replication of human Immunodeficiency virus (HIV) // Antiviral Rea. 1988. V.1G. P. 289-298.

Jacobson A.B., Good L., Slmonettl J., Zulcer M. Some simple computational methods to Improve the folding of large RNAs // Nucl. Acids Res. 1984. V.12. P. 45-52. Larder B.A.Darby G._ and Richman D.D. HIV with reduced sensitivity to zidovudine (AZT) Isolated during prolonged therapy // Science. 1989. V.243. P. 1731-1734. larder B.A. and Kemp S.D. Multiple mutations in HIV-1 reverse transcriptase confer high-level resistance to zidovudine (AZT) //Science. 1989. V.246. P. 1155-1158. Lee M.H., Sano. K., Morales F.E. and Imagawa D. Sensitive reverse transcriptase assay to detect and quantltate human immunodeficiency vli*u3.// J- Clin. Microbiol. 1987. V.25. P. 1717-1721.

Letsinger . R.., Zhang G., Stm.D., Ikeuchi T... Sarin P. Cholesteryl-conjugated oligonucleotides: Synthesis, properties, and activity as inhibitors of human Immunodeficiency virus; in cell culture//Procl Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V.86. P. 6553-6556. larx J.L. Drug-resistant strains of AIDS virus found //

Science. 1989. V.243. P. 1551-1552. fatsukura M., Shlnozuka K., Zon G., Mitsuya H., Reits M., Cochen. J., Broder S. Phosphorothioate analogs of oligonucleotides: Inhibitors of replication and cytopathic

effects ol human immunodeficiency virus // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1987. V.84. P. 7706-7710. Matsukura M., Zon G., Shinozuka K., Robert-Guroff M., Shlmada T., Stein C.A., Mitsuza H., Wong-Staal F.., Cohen J.S. -and Broder S. Regulation ol viral expression on HIV (human Immunodeficiency virus) in vitro by an antlsense phosphorothloate ollgodeoxynucleotide against rev (art/trs) in chronically infected cells // Proc. Natl. Acad. Sei.USA. 1989. V.86. P. 4244-4248. Miller R.H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic UNA plus strand // Science. 1988. V.238.P. 1420-1422. Mitsuya H., Popovic M., Yarchoan R., Matsushita S., Gallo R.C. and Broder S. Suramin protection of T cells in vitro against infectivlty and cytopathic effect of HTLV-III // Science. 1984. V.225. P. 172-174. Mitsuya H., Weinhold K.J., .Purman P.A., St. Clair M.M., Nusinoff Lehrman S., Gallo R.C., Bolognesi D., Barry D.W. and Broder S. 3'-azido-3'-deoxythymidine (BW A509U): An antiviral agent that inhibits the infectivlty and cytopathic effect of human T-lymphotroplc virus type III/ lymphadenopathy-associated virus in vitro // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1985. V.82. P. 7096-7100. • Moser H.E. and Dervan P.B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation // Science. 1987. V.238. P. 645-650. Pauwels R., Andrles K., Desmyter J., Kukla M.J., Heykants J.,

Ds Clercq E. and Janssen P.A.J. Potent and selective Inhibitor of HIV-1 replication In vitro by a novel series of tetrahydro-lmldazo [4,5,1-JK] [1,4]-benzodlasepln-2i1H)- one and -thlone (TIBO) derivatives // In: Design Antl-AIDS Drugs edited by S. De Clercq. Pharmacochemistry library. ELSEVIER - Amsterdam' - Oxford - Ne^ York - To'Kyo. 1990. 7.14. ?. 103-122.

Pauwels R., Andries K., Desmyter J., Schols D., Kukla K.J., BresllnH.J., Raeymaeckers A., Gelder J.V., Woestenborghs R., Heykants J., Schelleken3 K., Janssen P.A.C., Be Clercq E. & Jassen P.A.J. Potent and selective Inhibitor of H17-1 replication in vitro by a novel series of TIBO derivatives // Nature. 1990. V.343. P. 470-474.

Povsic T.J.., Dervan P.B. Triple helix formation by oligonucleotides on DNA extended to the physiological pH range //'J. Am. Chera. Soc. 1989. Y.111. P. 3059-3051.

iatner I., Easeltine W., Patarca R., Ilvak K.J., Starcich 3., Josephs S.F., Doran E.R., Hafalskl ' J.A., Whltehorn S.A., Baumeister K., Ivanoit L., Petteway S.R., Pearson M.i.. Lautenberger J.A., Papas T.S., Ghrayeb J., Chang N.T., Gallo R.C., Wong-Staal P. Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTLV-III // Nature. 1985. V.313. P. 277-284.

lennelsen K., leaeraian L., Matthes E.,.Schroder H.C. and Müller ft.E.G. Inhibition of expression of Human Immunodeficiency Virus - 1 in vitro by antibody-targeted liposomes containing antlsense RNA to the env region // J. Biol. Chem. ¡990. 7.265. P. 16337-16342.

RichmBn D.D., Pischl M.A., Grieco M.R., Gottlieb M.S., Volberdlng P.A., Laskln O.L., Leedom J.M., Groopman J.E., Kildvan D., Hirsch M.S., Jackson G.G., Burack D.T., Huslnoff-Lehrman S. and the AZT Collaborative Working Group The toxicity azldothymidlne in the treatment or patients with AIDS and AIDS-related complex. A double-blind placebo-controlled trial // N. Engl. J. Med. 1987. V.317. P. 192-197.

Stein C.A.. Pal R., DeVlco A.I., Hoke G., Mumbauer S., Klnstler 0., Sarngadharan M.G., Letslriger R.L. Mode of action of 5'-llnXeQ cholesteryl phosphorothioate ollgodeoxynucleotides in inhibiting syncytia formation and Infection by HIV-1 and HIV-2 in vitro //Biochemistry. 1991. V.30. P. 2439-2444.

Toshlyukl N. and Hiroo H.. Heparin inhibits infectivlty of human immunodeficiency virus in vitro // Jap. J. Cancer Res. Gann. 1988. V.79. P. 9-11.

Williams I.G. Antl-HIV drugs // Med. Int. (Gr. Brit.) -1988. V.57. P, 2364-2366.

Zaia J.A., Rossi J.J., Muraksffa G.J., Spallone P.A., Stephens B.A., Kaplan B.E., Erltza R.,-Wallace' R.B. & Cantln %£.M. Inhibition of human immunodeficiency virus by using an ollgonucleoslde methylphosphonate targeted to the tat-3 gene // J. Virol. 1988. V.62. P. 3914-3917.

ZamecnlkP., Goodchild J., Taguchl Y., Sarin P. Inhibition of replication and expression of human T-cell lymphotroplc virus type III in cultured cells by exogenous synthetic oligonucleotides complementary to viral EM // Proc. Natl.

- 55 -

Acad. Sel. USA. 1986. V.83. P. 4143-4146. Zuker M., Stlegler P. Optimal computer.folding of large RNAs sequences using thermodynamics and auxiliary Information // Nucl. Acids Res. 1981. 7.9. P. 133-148.

/'-; ^tjctjiif