Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Промышленная технология производства препаратов на основе экстрактов мицелия Pleurotus ostreatus и оценка их эффективности

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Промышленная технология производства препаратов на основе экстрактов мицелия Pleurotus ostreatus и оценка их эффективности"

На правах рукописи

Захаров Сергей Викторович

ПРОМЫШЛЕННАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКТОВ МИЦЕЛИЯ РЬЕиЯОТШ ОБТЯЕАТиБ И ОЦЕНКА ИХ

ЭФФЕКТИВНОСТИ ?.

Специальность: 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

№ 2015

Щелково-2014

005559119

005559119

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической физики им. Н.Н.Семёнова Российской Академии Наук

Научный консультант:

доктор биологических наук Кирьянов Глеб Иванович

Официальные оппоненты:

Бирюков Валентин Васильевич - доктор технических наук, профессор, заведующий кафедрой «Экологическая и промышленная биотехнология» Московского государственного университета инженерной экологии.

Александрова Мария Анатольевна - доктор биологических наук, профессор, руководитель лаборатории экспериментальной нейробиологии Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН

Волков Михаил Юрьевич - доктор биологических наук, профессор кафедры Биотехнология ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина».

Ведущая организация:

Всероссийский НИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, Москва, Россия.

Защита состоится 27 марта 2015 г., в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности ФАНО России по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ВНИТИБП; e-mail: vnitibp@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности

Автореферат разослан « _ 2014 г. и размещен на сайте ВНИТИБП

www.vnitibp.com и на официальном сайте ВАК http://www.vak.ed.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук ™ Фролов

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы исследования

В настоящее время одним из приоритетных направлений в области отечественной биотехнологии является разработка новых лекарственных средств. Важность исследований, направленных на получение новых перспективных лекарств, подчеркивается в Распоряжении Правительства Российской Федерации от 6 июля 2010г. № 1141-р и в Федеральной целевой программе «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности РФ на период до 2020 года и дальнейшую перспективу», утвержденной Распоряжением Правительства РФ от 1.10.2010 № 1660-р. В этих документах приводится перечень стратегически значимых лекарственных препаратов, производство которых должно быть обеспечено на территории Российской Федерации.

Одна из областей применения препаратов на основе медицинских грибов - это ветеринария, где не менее остро стоит проблема, связанная с побочными эффектами лекарственных препаратов. В ветеринарии она возникла в связи с массовым применением кормовых антибиотиков, что привело к снижению эффективности других антибиотиков при лечении животных и человека. Кроме того, продукты животноводства содержат остаточные количества антибиотиков и их метаболитов, весьма опасных для человека.

Разработка промышленной технологии производства новых препаратов, направленных на снижение побочного действия токсических лекарственных препаратов, является одной из наиболее актуальных проблем современной биотехнологии, медицины, ветеринарии и фармакологии.

1.2 Степень разработанности темы

В связи с тем, что многие современные цитостатики являются ярко выраженными иммунодепрессантами, для нейтрализации их токсического действия применяются препараты, укрепляющие иммунный статус организма (Трещалина Е.М., 2005; Корсун В.Ф., 2010).

Одним из перспективных источников таких препаратов являются так называемые медицинские грибы (Вассер С.П., 2011г). В многочисленных работах показано, что полисахаропептиды (ß-глюканы), выделенные из водных экстрактов некоторых грибов, индуцируют у экспериментальных животных выработку гамма-интерферона, интерлейкина-2 и пролиферацию Т-клеток. На этом основании ß-глюканы рекомендовано применять при химио- и радиотерапии рака и для лечения различных инфекционных заболеваний (Fullerton S.A., 2000).

Другая (но не альтернативная) стратегия, направленная на снижение токсичности лекарственных препаратов - поиск веществ, обладающих синергизмом с цитостатиками и потенцирующих эффективность их действия. Условно, по характеру воздействия на организм больного, такие препараты можно отнести к типу детоксикационных (Трещалина Е.М., 2005).

Возможность потенцирования действия цитостатиков может быть реализована с использованием экстракта мицелия вешенки (ЭМВ) Pleurotus ostreatus, как одного из представителей медицинских грибов (Богуш Т.А., 2001, Поляков В.Ю. и др., 2007). В

работе (Поляков В.Ю. и др., 2007) в качестве модели использовались культивируемые трансформированные клетки HeLa, клетки миелоидного лейкоза человека (линия К-562) и нормальные фибробласты человека. Модель культивируемых клеток исключает многие трудно учитываемые факторы, опосредующие действие экстракта и его отдельных фракций на уровне целого организма и позволяет тестировать ряд функциональных показателей эффективности действия препарата в строго контролируемых и воспроизводимых условиях.

Для количественной оценки эффективности действия цитостатиков и ЭМВ использовались показатели, характеризующие жизнеспособность популяции культивируемых клеток: митотический индекс (доля клеток, находящихся в состоянии деления) и апоптотический индекс (доля клеток с выраженными признаками программируемой гибели). Функциональное состояние плазматических мембран оценивалось по способности клеток к прижизненному окрашиванию трипановым синим.

Поляков В.Ю. и др. (2007) показали, что при индивидуальном действии ЭМВ является слабо выраженным индуктором апоптоза, и вызывает аномальную сегрегацию хромосом на стадии метафазы, появление хромосомных аберраций типа «мост» на стадии анафазы и телофазы. При сочетанном использовании ЭМВ и циклофосфана (ЦФ) проявился их ярко выраженный синергизм, который в зависимости от концентрации реагентов и от способа их инсталляции выражается в частичном подавлении пролиферации и в индукции апоптотической гибели клеток. Принципиально важно, что ЭМВ в синергизме с ЦФ оказывает апоптогенное действие только на трансформированные клетки, тогда как нормальные фибробласты не включают программу апоптоза при тех же дозах экстракта и цитостатиков.

Всестороннее изучение (Богуш Т.А., 2001; Милевич Т.П. и др, 2001; Конопля Е.Ф. и др., 2002; Герасименя В.П. и др. 2009; Смирнова З.С. и др., 2013) действия ЭМВ и ЦФ на гематологические показатели периферической крови здоровых животных (мыши линии С57В1/6) показало, что применение ЭМВ вызывает более раннее и интенсивное восстановление количества лейкоцитов в периферической крови леченых мышей после применения ЦФ и снижает гематотоксичность, в частности выраженность и продолжительность лейкопении, вызванную введением животным цитостатика в дозах от 100 мг/кг до 300 мг/кг веса тела.

Полученные результаты открывают реальную перспективу для создания препарата на основе экстракта мицелия Pleurotus ostreatus, обладающего синергизмом с существующими высокотоксичными лекарствами и снижающего интоксикацию организма при использовании лекарственных средств в онкологии и других областях медицины. Для установления возможных механизмов действия ЭМВ первоочередной задачей в этом направлении является определение активного вещества экстракта и проведение испытаний его биологической активности на моделях культивируемых клеток и различных типах нозологий.

Наиболее реальный методический подход - фракционирование экстракта Pleurotus ostreatus с помощью органических растворителей (Кирьянов Г.И., Захаров C.B. и др., 2013).

Известно, что при использовании различных органических растворителей (этанола, метанола, этилацетата и т. д.) белки и полисахаропептиды в экстракт не переходят. Следовательно, активное вещество в таких экстрактах принадлежит широкому спектру низкомолекулярных соединений, из которых идентифицированы эргостерины, никотиновая кислота, полифенолы, антиоксиданты и некоторые другие. Вопрос о том, какие именно компоненты экстракта Pleurotus ostreatus потенцируют действие цитостатиков, остается открытым.

1.3 Цель и задачи исследований

Цель работы - разработка промышленной технологии глубинного культивирования мицелия, гарантирующей устойчивый количественный выход ЭМВ и постоянство (стабильность) его химического состава, технологии получения из экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 ранее не идентифицированных химически чистых активных веществ (или вещества), потенцирующих действие цитостатиков, установление химической природы и возможных механизмов действия этих веществ и предложение по промышленному производству лекарственного препарата.

Для достижения поставленной цели в качестве продуцента в работе использовался штамм Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819). Критерием отбора послужила наиболее выраженная антимикробная и антитоксическая активность выделенного экстракта из мицелия этого штамма.

Решались следующие задачи исследования:

1. Усовершенствовать технологию глубинного культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 для обеспечения максимально высокого выхода ЭМВ и стабильности его химического состава.

2. Выявить эффекты индивидуального и сочетанного с цитостатиками (циклофосфаном, доксорубицином, метотрексатом, фторурацилом и азацитидином) действия ЭМВ in vitro на трансформированных клетках HeLa и нормальных культивируемых клетках Vero.

3. Провести биоиспытания ЭМВ in vivo на моделях различных нозологических форм.

4. Разработать методы фракционирования ЭМВ и провести испытания полученных фракций для выявления их биологической активности in vitro и in vivo.

5. Разработать технологию выделения активного вещества из ЭМВ и определить его химическую структуру.

6. Провести биоиспытания отдельных фракций ЭМВ на моделях различных нозологических форм in vivo и in vitro. Определить возможные механизмы и клеточные мишени действия ЭМВ, полученных фракций и активного вещества.

7. Разработать композицию лекарственного препарата с детоксицирующим действием на основе экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 и предложения по его промышленному производству.

1.4 Научная новизна

Разработаны и экспериментально обоснованы технологические режимы двухстадийного культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в глубинной

культуре в системе «ротационная качалка (инокулятор) - ферментер (с механическим перемешиванием культуры)».

Проведена валидация технологического процесса производства экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137, являющегося фармакологической субстанцией разработанного лекарственного препарата.

Разработан метод фракционирования биологически активных веществ из экстракта мицелия и алгоритмы испытания экстракта in vitro и in vivo.

Впервые обнаружен феномен стимуляции роста мицелия в присутствии наноструктурных частиц коллоидного серебра.

Доказана эффективность экстракта при лечении рака, выявлены его вирулицидные свойства, установлена нормализация липидного обмена при экспериментальном стеатозе и определено гепатопротекторное действие при применении экстракта и его отдельных фракций.

Предложена гипотеза, согласно которой полифункциональная активность экстракта (фармакологической субстанции) связана с измененными свойствами мембранных рецепторов «патологических» клеток, реагирующих на внешние сигналы.

Впервые показан синергизм экстракта с цитостатиками, проявляющийся в резком усилении апоптотической и митостатической активности при их сочетанном применении.

Разработан оригинальный метод фракционирования экстракта и получена фракция, обладающая апоптогенным действием на трансформированные клетки HeLa.

Из фракции с апоптогенным действием выделено и охарактеризовано вещество, обладающее собственной апоптотической активностью. Это вещество идентифицировано как производное стерола - дезметилинцистерол (ДМИ) 4-hydroxy-17R-methylincisterol (патент РФ № 2422151 от17.03.2010 г., в соавторстве). Принципиально важно, что точно установленная формула ДМИ открывает путь к его химическому синтезу (патент РФ № 2477635 от 14.02.2012 г., в соавторстве).

Разработана композиция инновационного препарата-адаптогена, обладающего детоксицирующим действием (патент РФ № 2487930 от 19.06.2012 г., в соавторстве).

Полученные в работе результаты вносят существенный вклад в решение одной из наиболее актуальных проблем современной биотехнологии, медицины и фармакологии, связанной с преодолением токсичности сильнодействующих лекарственных препаратов, которые используются для лечения тяжелых патологий (патенты РФ № 2422151 от 17.03.2010 г. и № 2435600 от 23.08.2010 г., в соавторстве).

1.5 Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость работы определяется выявленными свойствами впервые обнаруженного в экстракте мицелия Pleurotus ostreatus 1137 вещества группы стеролов, получившего название дезметилинцистерол, IUPAC: (3a5,5a/?,6i?,8ai?)-6-[(2/f,3£',55)-5,6-dimethylhcpt-3-en-2-y]]-3a-hydroxy-5a-mcthyl-3a,4,5,5a,6,7,8,8a-octahydro-2//-indeno[5,4-¿i] furan 2-one) с молекулярной массой 332,2452 дальтон.

На основании проведенных в работе исследований сформулированы следующие теоретические положения:

- экстракт мицелия содержит специфический индуктор (ДМИ), который «узнает» патологически измененные клетки, обладающие общим свойством включать программу апоптотической гибели в ответ на взаимодействие с определенным классом веществ;

- изучение антигиперлипидемического действия активного вещества экстракта (ДМИ) подводит к выводу, что мишенью ДМИ является рецепторный путь транспорта холестерина в организме, включающий в себя как этап образования мицелл холестерина, так и функционирование клеточных рецепторов липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). В обоих случаях ДМИ может обладать антагонистическим эффектом;

- данные по модификации мембран клеток глутаровым альдегидом позволяют заключить, что низкие концентрации глутарового альдегида в клетках СПЭВ и НеЬа блокируют активность клеточных рецепторов, относящихся к группе ионных каналов.

Практическая значимость работы:

- синергизм с цитостатиками позволяет использовать ДМИ для существенного снижения дозы применяемых в химиотерапии опухолей крайне токсичных лекарственных препаратов - циклофосфана, доксорубицина, метотрексата и 5-фторурацила;

- в связи с тем, что ЭМВ, обогащеный ДМИ, блокирует прогрессию экспериментальной дислипидемии у крыс, дезметилинцистерол можно позиционировать как препарат, обладающий гепатопротекторными свойствами;

- на основе активного вещества (ДМИ) и фармацевтической субстанции (экстракта мицелия РкиШм охпеагиз 1137) предложена композиция инновационного препарата-адаптогена, обладающего полифункциональной медико-биологической активностью и относящегося к фармакологической группе лекарственных средств А13А «Общетонизирующие средства и адаптогены», применяемых при химиотерапии ряда тяжелых патологий в качестве препаратов «сопровождения».

- проведенная технико-экономическая оценка подтверждает целесообразность промышленного производства лекарственных средств с разнонаправленными эффектами действия на основе ДМИ.

- экспериментально доказана эффективность усовершенствованной промышленной технологии глубинного культивирования мицелия, которая гарантирует стабильные параметры производимого из него экстракта (фармакологической субстанции). Технология внедрена в производство, и на ее основе ООО «Витапром» выпускает БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН®» в виде сиропа;

- разработаны и внедрены в производство инновационные элементы технических средств (устройств) и обоснования способов их применения для культивирования мицелия: комплекты защиты и активизации роста сельскохозяйственных культур (налажен серийный выпуск, сертификат соответствия № РОСС 1Ш.АГ75.Н07315 от 29.10.2013 г.); дезинфицирующие средства, фильтры для очистки воды и воздуха от токсических примесей и микробиологических загрязнений (патенты РФ № 2069641 от 09.11.1998 г., № 87098 от 02.06.2009 г., № 2394668 от 13.03.2009 г, № 2400268 от 19.12.2008 г. в соавторстве), в том числе на основе наноструктурных частиц серебра.

Организовано опытно-промышленное производство фармакологической субстанции на основе экстракта мицелия вешенки в ОАО «Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ» (ОАО «ГосНИИсинтезбелок»).

Разработаны проекты комплектов нормативной документации (НД) на фармакологическую субстанцию «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН®» и лекарственное средство «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН®» (сироп) для Государственной регистрации и промышленного производства.

Составлено пособие для врачей по применению ЭМВ «ОВОДОРИН» для коррекции лекарственной непереносимости в комплексном лечении больных туберкулезом легких и рекомендовано Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для системы послевузовского профессионального образования врачей № УМО-17-28/6Ю 25.11.10.

1.6 Методология и методы исследования

Избранная методология соответствует общепринятой схеме биотехнологического поиска фармакологически активных веществ среди объектов растительного происхождения, которые рассматриваются как потенциальные продуценты новых лекарственных препаратов.

В работе в качестве такого продуцента использовался базидиомицет Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819), являющийся источником ряда биологически активных веществ (БАВ) с различной направленностью фармакологической активности.

Для оптимизации технологического этапа культивирования использовался метод математического планирования Гаусса-Зейделя. Расчеты и построение технологических графиков осуществлялись с помощью пакета MICROSOFT OFFICE EXCEL 2010, построение технологических и аппаратурных схем - с помощью программы Microsoft Office 2010.

Обработка результатов доклинических исследований (с числом повторов > 3) проводилась статистическим методом анализа и обработки данных - методом определения грубых ошибок («промахов»).

Биологически активные фракции отбирались методом полномасштабного скрининга экстракта мицелия и полученных фракций экстракта. С этой целью в экспериментах на культивируемых клетках (in vitro) и на животных (in vivo) проводилось систематическое изучение спектра фармакологической активности отобранных фракций.

В качестве моделей in vitro использовались трансформированные и нормальные культивируемые клетки, a in vivo - здоровые животные и животные с различными формами нозологий (экспериментальный стеатоз, гипертензия, туберкулез, вирусная инфекция, онкология). Специфическая активность отобранных фракций проверялась путем сравнения с известными (эталонными) соединениями (статины, цитостатики и антивирусные вещества).

Фракции, обладающие высокой специфической активностью, использовались для изучения возможных мишеней и механизмов их действия на клеточном уровне. Оценка токсичности фракций проводилась с использованием культивируемых клеток и экспериментальных животных.

Для изучения действия фракций in vitro и in vivo использовались методы светооптической микроскопии, в том числе методы цитохимии, иммуноцитохимии, а также трансмиссионная и сканирующая электронная микроскопия.

Фиксация и заключение материала для микроскопического, цитохимического и иммуноцитохимического анализа проводились по стандартным методикам, принятым в клеточной биологии.

Подробное описание методов, связанных с пробоподготовкой материала, приводится в соответствующих разделах работы.

1.7 Основные положения, выносимые на защиту

1. Технология получения лекарственных препаратов-адаптогенов на основе ЭМВ, включающая в себя:

- технологию двухстадийного промышленного культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в глубинной культуре в системе «ротационная качалка (инокулятор) -ферментер с механическим перемешиванием среды»;

- оптимизацию методов культивирования и экстракции мицелия с постоянным химическим составом БАВ для направленного фракционирования и поиска компонентов, обладающих терапевтическим действием на различные нозологические формы;

- усовершенствованные методы выделения, очистки и идентификации активного вещества экстракта Pleurotus ostreatus 1137 - ДМИ (4-hydroxy-17R-methylincisterol).

2. Экспериментальные доказательства впервые выявленных фармакологически значимых свойств экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 и ДМИ:

- полифункциональность действия при различных нозологиях;

- эффект синергизма при сочетанном использовании с цитостатиками.

3. Теоретическое и экспериментальное обоснование использования экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 и ДМИ в качестве лекарственного средства прямого действия и средства, снижающего токсичность цитостатиков в условиях химиотерапии.

4. Концепция разработки и экспериментальное обоснование состава и получения инновационного препарата-адаптогена с полифункциональной медико-биологической активностью на основе экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 и предложения по его промышленному производству.

1.8 Степень достоверности и апробация результатов

Работа выполнена с использованием современных методов биотехнологии, препаративной химии, клеточной и молекулярной биологии, в тесном взаимодействии с сотрудниками ведущих научных центров Москвы: МГУ (НИИ физико-химической биологии, Химический и Биологический факультеты), Института химической физики им. Н.Н.Семенова РАН, Института биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России, Центрального научно-исследовательского института туберкулеза РАМН и автономной некоммерческой организации «Институт медико-биологических исследований и технологий».

Полученные результаты подтверждены многочисленными экспериментами и обработаны с использованием современных методов статистического анализа.

Основные результаты проведенных исследований были представлены на 16-ти международных и Российских конференциях, конгрессах, симпозиумах, форумах и съездах.

Разработки удостоены медали лауреата Всероссийского выставочного центра (удостоверение № 1489 по постановлению №44-н от 11.11.1994 года), золотой медали и персонального диплома, а также двух золотых и одной бронзовой медали XIV Московского международного Салона изобретений и инновационных технологий «АРХИМЕД-2011» (2011 г.).

По материалам диссертации получено 16 патентов РФ на изобретения и полезные модели и выработаны рекомендации по применению разработанных форм препарата в лечебной практике.

1.9 Публикации

Основные положения диссертационной работы опубликованы в 82 научных работах, в том числе в 10 статьях и изданиях по перечню, рекомендованному ВАК Минобрнауки России для публикации материалов докторских диссертаций. Остальные работы опубликованы в виде 2 монографий и сборника статей, рекомендованных к изданию по решению ученых советов Научно-исследовательского института физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского МГУ им.М.В.Ломоносова и Института химической физики им.Н.Н.Семенова РАН, 16 патентов, публикаций в нереферируемых изданиях, информационных материалов, пособия для врачей и материалов междунардных и Всероссийских научных конгрессов и конференций.

1.10 Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 510 страницах компьютерного текста и состоит из титульного листа, оглавления, текста диссертации, включающего введение, основную часть, изложенную в 6 главах, и заключение, списка сокращений, списка литературы и приложения. Текст диссертации проиллюстрирован 142 рисунками и 45 таблицами. Список литературы включает 271 источник, из которых 193 отечественных и 78 зарубежных. В приложении представлены таблицы технологических режимов и копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

1.11 Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы, постановке цели и задач исследования, методологическом обосновании путей решения поставленных задач, непосредственном планировании экспериментов и выполнении исследований, анализе, обобщении и интерпретации результатов. Автор принимал личное участие в разработке технологических процессов промышленного производства фармакологической субстанции, разработке и обосновании состава лекарственного препарата и написании научных публикаций и патентов, разработке методической и нормативной документации, в подготовке и проведении ряда серий экспериментальных исследований.

1.12 Благодарности

Автор выражает благодарность научному консультанту, руководителю лаборатории Научно-исследовательского института физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского МГУ им.М.В.Ломоносова, доктору биологических наук Кирьянову Г.И., Заслуженному деятелю науки РФ, академику Академии военных наук РФ, доктору технических наук, профессору Герасимене В.П., сотруднику МГУ имени М.В.Ломоносова, доктору биологических наук, профессору Полякову В.Ю., сотруднику ИХФ РАН, доктору химических наук, профессору Гумаргалиевой К.З., кандидату химических наук Трезвовой A.B., а также господам Соболеву Л.А. и Кундику В.А. за участие в организации и проведения исследований по разработке и созданию Комплекта защиты и активизации растений (КЗАР «Зеленые Волны®»).

2 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1 Промышленное культивирование базидиомицета Pleurotus ostreatus (Fr.) Kuram. Медико-биологические свойства препаратов из базидиальных грибов

Изучение лечебных свойств базидиальных грибов и создание новых лекарственных средств на их основе является одним из активно развивающихся направлений современной биотехнологии, фармакологии и медицины. Результаты этих исследований особенно широко используются в Китае, России, Японии, Корее, США, Норвегии и Канаде.

Как правило, основу фармакологических субстанций составляют различные экстракты плодовых тел или мицелия базидиомицетов. С химической точки зрения экстракты представляют собой сложные системы, содержащие различные биологически активные вещества: полисахариды, белки и их комплексы, фенольные соединения, тритерпеноиды, стероиды, алкалоиды, нуклеотиды, витамины, ганодеровые кислоты, лектины, протеазы и др. Некоторые из этих соединений проявляют активность по снижению уровня холестерина, другие обладают антидиабетической, антиоксидантной, противоопухолевой, иммуномодулирующей, противомикробной и противовирусной активностью. В широко опубликованных результатах экспериментов и испытаний выделенных веществ показана высокая эффективность экстрактов грибов при лечении рака, бактериальных и вирусных инфекций, ВИЧ, диабета, сердечно-сосудистых и целого ряда других заболеваний (Соломко Э.Ф., 2011; Дудка И.Д., 2011; Бисько H.A. и др., 2011; Краснопольская Л.М. и др., 2012; Elisashvili V., 2012). По данным, полученным на модели стеатоза у крыс, индуцированного атерогенной диетой, экстракт из Pleurotus ostreatus блокирует развитие жировой дистрофии печени, тем самым проявляет свойства эффективного гепатопротектора (Поляков В.Ю., Захаров C.B. и др., 2012).

Очевидно, что такое полифункциональное действие экстрактов грибов требует нетривиальных объяснений.

За последние годы в области биотехнологии, связанной с получением лекарственных препаратов из медицинских грибов, наметился существенный прогресс, однако анализ большого массива ранних и современных работ показал наличие ряда причин, препятствующих широкому внедрению этих препаратов в практику (Wasser S. et al., 2000; Заикина H.A. и др., 2007; Бухало A.C. и др., 2011 ; Elisashvili V., 2012).

Так, например, до настоящего времени не освоена технология промышленного культивирования на ферментерах мицелия Pleurotus ostreatus, используемого для получения БАВ, применяемых на практике для создания лекарственных препаратов. Одна из причин заключается в том, что до сих пор не преодолены сложности наиболее перспективного метода выращивания мицелия - промышленного культивирования мицелия в ферментерах в глубинной культуре, которые связаны, прежде всего, с необходимостью строгого соблюдения величин физических и химических факторов, обеспечивающих требуемый выход биомассы мицелия со стандартизованным содержанием в нем биологически активных веществ.

В настоящее время практически отсутствуют данные и о полномасштабном скрининге фармакологической активности экстрактов из низкомолекулярных биологически активных веществ in vitro и in vivo, и о созданных на их основе отдельных лекарственных препаратов. Из нозологий преимущественно анализируются различные формы отдельно исследованных онкологических и ряда других заболеваний без анализа полифункционального действия экстрактов.

Явно недостаточно работ, в которых используются современные методы клеточной и молекулярной биологии, позволяющие определить клеточные мишени и механизмы действия препаратов, полученных из медицинских грибов Pleurotus ostreatus.

В целом, проведенный анализ литературы подводит к двум принципиально важным выводам.

Во-первых, Pleurotus ostreatus перспективно использовать в качестве продуцента новых лекарственных препаратов с широким спектром действия.

Во-вторых, для получения из мицелия базидиомицетов ранее не идентифицированных химически чистых веществ, обладающих выраженной биологической активностью, и создания на их основе новых лекарственных препаратов, определяющее значение имеет стандартизация технологии промышленного культивирования мицелия в глубинной культуре.

Структурно-методологическая схема достижения цели диссертационной работы представлена на рисунке 1.

2.2 Разработка технологии двухстадийного промышленного культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в системе: «ротационная качалка (инокулятор) -ферментер с механическим перемешиванием среды»

2.2.1 Экспериментальные исследования глубинного культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137

Материалы и методы исследования

В качестве продуцента биологически активных веществ использовался штамм Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819). Критерием отбора послужила наиболее выраженная антимикробная и антитоксическая активность этого штамма (Камзолкина О.В., Ефременкова О.В. и др., 2001, 2002, 2003).

Этапы разработки

Алгоритм исследований

Форма завершения

Предмет исследования - высшие базидиомицеты Объест исследования: РкигоШ (>!>1г?а1и*

Рисунок 1 - Структурно-методологическая схема достижения цели диссертационной работы

Оценивалось влияние переменных процессов на рост мицелия и производство БАВ в глубинной культуре. Для получения в промышленных масштабах биомассы мицелия с необходимым соотношением БАВ подбор состава питательных сред и параметров культивирования мицелия для двухстадийного культивирования производился на основе известных исследований (Герасименя В.П., Камзолкина О.В., Ефременкова О.В., 2002, 2004; Elisashvili V., 2012; Couto S.R. et al., 2007; Lin E.-S. et al., 2006; Zhong J.J. et al., 2004; Захаров C.B. и др., 2013).

Во внимание принимались следующие факторы, оказывающие влияние на процесс культивирования:

Физические факторы: температура среды культивирования мицелия (26-28°С); скорость перемешивания культивируемого мицелия на 1-ой стадии в колбах на качалке (200-220 об/мин); скорость перемешивания культивируемого мицелия на 2-ой стадии в ферментерах (50-350 об/мин); скорость аэрации на 2-ой стадии культивирования мицелия в ферментерах с механическим перемешиванием биомассы мицелия (1,0-3,0 л/л/мин).

Химические факторы: рН среды (5,5-6,5); источник углерода (глюкоза, г/л среды) и его начальная концентрация; источник азота (солодовый экстракт «Maltax-10») и его начальная концентрация; источник кислорода (наноструктурные частицы серебра) и его концентрация в культуральной среде (Захаров C.B., 2013).

Для создания в боксах для культивирования и переработки мицелия асептических условий использовались разработанные новые методы обработки оборудования слабым электромагнитным полем (Герасименя В.П., Захаров C.B. и др., 2003, 2012, 2013), а также каталитическая очистка поверхностей стен и воздуха с применением фильтров с наноструктурными частицами серебра (Герасименя В.П., Захаров C.B., Клыков М.А. и др., 2009,2010).

Метод ферментирования - двухстадийное культивирование мицелия в глубинной культуре (Elisashvili V., 2012; Lee B.C. et al., 2004; Kin S.W. et al., 2007) применительно к культивированию мицелия Pleurotus ostreatus .

На рисунке 2 представлена унифицированная аппаратурно-технологическая схема промышленного производства экстракта мицелия вешенки (ЭМВ).

Первая стадия - культивирование посевного мицелия на ротационной качалке (инокуляторе) в колбах Эрленмейера в течение 7 суток. Вторая стадия - культивирование мицелия в 5-, 15-, 50- или 200-литровом ферментере с механическим перемешиванием культуральной среды в течение 7 суток. Соответственно, использовали две среды, различающиеся по составу - «посевную» и «ферментационную».

Первая стадия - культивирование посевного мицелия.

В состав питательной среды для 1-й стадии культивирования посевного мицелия, из расчета на колбу Эрленмейера объемом 750 мл, входят следующие компоненты: соевая мука - 4 г, глюкоза - 2 г, солодовый экстракт «Maltax-10» - 10 мл, вода очищенная -160 мл.

Для выращивания посевного мицелия используется 7-суточная культура мицелия, рассеянная на агаризованную среду и посевная среда для 1-й стадии. Пересев культуры мицелия из пробирки в колбу Эрленмейера с посевной средой 1-й стадии производится

стерильно. Основные характеристики посевного мицелия: рН=5,5-6,5, биомасса 90-100% (по объему).

Ат \2 ПАЙ 13 ёёё Ш 14

Рисунок 2 - Унифицированная аппаратурно-технологическая схема промышленного производства ЭМВ:

1 - пробирка со штаммом РЫигоШБ оэпеыш 1137; 2 - штамм, выращенный на скошенном агаре; 3 - подготовленная жидкая питательная среда для 1-й стадии; 4 -мицелий, перенесенный в колбы Эрленмейера 750 мл с питательной средой; 5 - глубинное культвирование мицелия на ротационной качалке (инокуляторе) в колбах Эрленмейера в термостатируемом помещении (1-я стадия); 6 - ферментер для глубинного культвирования (2-я стадия); 7 - отжим мицелиальной биомассы (пресс); 8 - отжим мицелиальной биомассы (центрифуга); 9 - экстракция низкомолекулярных биологически активных веществ и тонкая фильтрация спиртового раствора; 10 - удаление спирта в вакуумном испарителе; 11 - розлив экстракта и укупорка флаконов; 12 - маркировка флаконов; 13 -упаковка в пачки; 14 - упаковка в групповую гофротару с маркировкой и отправка на склад.

Вторая стадия - культивирование мицелия в ферментере.

В состав питательной среды для второй стадии культивирования мицелия, из расчета на 1000 мл рабочего объема ферментационной питательной среды в ферментере, входят: солодовый экстракт «Маках-10» - 100 мл, вода очищенная - 900 мл.

Засев приготовленной питательной среды осуществляется 7-суточным посевным мицелием 1-й стадии культивирования. Объем посевного материала составляет 5% к объему ферментационной среды. Пересев культуры мицелия из колб с посевной средой 1-й стадии производится в ферментеры со средой 2-ой стадии стерильно. Культивирование осуществляется в течение 7 суток.

К физическим факторам, значениями которых варьировали, относили скорость перемешивания культивируемого мицелия на 2-й стадии в ферментерах (50-350 об/мин) и скорость аэрации на 2-й стадии культивирования мицелия в ферментерах (1,0-3,0 л/л/мин).

Температура среды культивирования мицелия на 1-ой и 2-ой стадиях (27°±1°С) и скорость перемешивания культивируемого мицелия на 1-ой стадии в колбах на качалке (210 + 10 об/мин) были приняты постоянными.

Из состава химических факторов варьировали водородным показателем среды pH (5,5-6,5).

Источник углерода (глюкоза, г/л среды) и его начальная концентрация, так же, как источник азота (солодовый экстракт «Maltax-10») и его начальная концентрация, были приняты постоянными.

Таким образом, из семи указанных факторов изучению были подвергнуты три переменных фактора, изменения значений которых существенно влияют на условия нарастания мицелия в глубинной культуре, его биомассу и морфологическую характеристику.

2.2.2 Результаты культивирования мицелия

В проведенных исследованиях было показано, что для принятого состава питательных сред в условиях двухстадийного культивирования мицелия эффективное нарастание его биомассы с требуемыми морфологическими характеристиками зависит от ряда физических и химических факторов (Герасименя В.П., Захаров C.B. и др., 2013).

В процессе исследований было установлено, что интенсивность перемешивания и аэрации на второй стадии культивирования являются важными факторами для производства биомассы мицелия, способствующими массопереносу внесенных в среду субстратов, продуктов и переносу кислорода.

Известно (Бухало A.C., 1987; Заикина H.A. и др., 2007; Elisashvili V., 2012), что для успешного проведения аэробной ферментации требуется поддержание достаточного уровня растворенного кислорода в окружающей среде во избежание ограничения либо нарушения нормальной дыхательной активности. Аэрация приводит к лучшему смешиванию производственной среды, помогая поддерживать градиент концентрации внутри и снаружи клеток. Оптимальная скорость перемешивания представляет собой баланс между переносом кислорода в среду и напряжением сдвига, которые возрастают с увеличением скорости перемешивания. Поэтому в процессе культивирования мицелия был установлен баланс между положительным и отрицательным влиянием перемешивания.

При культивировании мицелия в 5-, 15-, 50- и 200-литровом ферментерах с механическим перемешиванием в культуральной среде были подобраны величины скоростей перемешивания мицелия со ступенчатым увеличением от 100 до 350 об/мин,

при которых не возникает напряжения сдвига, повреждающего гифы мицелия и отрицательно сказывающегося на росте и формировании продукта.

В ходе исследования было показано, что при механическом перемешивании мицелия в культуральной среде на начальном этапе 2-ой стадии культивирования при низких значениях (от 50 до 100 об/мин) возникает уплотнение культуральной среды и снижение нарастания массы мицелия вследствие слабой аэрации глубинной культуры.

При механическом перемешивании культивируемого мицелия в культуральной среде со скоростью выше 350 об/мин через 4 суток культивирования мицелия возникали напряжения сдвига с повреждением гиф мицелия, что отрицательно сказывалось на росте и формировании пеллет мицелия.

Увеличение перемешивания на последующих этапах культивирования выше критической скорости (300-350 об/мин) приводит к повреждению структуры мицелия. При этом значительно повреждаются агломераты мицелия и снижается рост периферийных гиф. Было обнаружено, что критическая скорость перемешивания мицелия в культуральной среде на последних 4-х сутках его культивирования (включительно до 7 суток) составляет от 200 до 350 об/мин.

Оптимальная интенсивность аэрации культуральной среды во всех ферментерах на второй стадии культивирования мицелия, обеспечивающая формирование пеллет и нарастание биомассы мицелия, составляет -1,0 л/л/мин. Ниже установленной скорости аэрации происходит закисление культуральной среды до значений рН менее 5,0 с последующим резким уменьшением нарастания биомассы мицелия. При скорости аэрации выше 1,0 л/л/мин происходит сдвиг, повреждаются гифы мицелия, что отрицательно сказывается на росте и формировании продукта с последующим расслоением пеллет мицелия и культуральной среды.

Известно (Заикина Н.А. и др., 2007; ЕНвавЬуШ V., 2012), что одним из основных факторов, определяющих биосинтетический потенциал метода производства, является рН среды, поскольку он может сказываться на функционировании клеточной мембраны, поглощении питательных веществ, морфологии и структуре клеток, растворимости солей, ионном состоянии субстратов, активности ферментов и биосинтезе продуктов.

Для поддержания рН среды (5,2-5,6) процесс культивирования мицелия в ферментерах на второй стадии в течение всех 7-ми суток вели с подтитровкой 6% №ОН.

Уменьшение рН до 5,0 и ниже приводит к закислению культуральной среды с резким уменьшением нарастания его биомассы.

Для предотвращения пенообразования в глубинной культуре в процессе культивирования мицелия в ферментерах на 2-ой стадии в среду добавлялся пеногаситель пропинол Б-400 из расчета 0,17 мл на 1,0 л ферментативной среды.

Таким образом, в результате изучения влияния физических и химических факторов на рост мицелия было установлено, что в условиях двухстадийного культивирования максимальная концентрация биомассы сухого мицелия, в зависимости от объема ферментера, составляет 26,7-38,5 г/л без нарушения структуры пеллет, нарастает в случае: культивирования на 1-ой стадии посевного мицелия в колбах Эрленмейера на ротационной качалке (200-220 об/мин) при температуре 27°±ГС, начальном рН среды 5,5 в течение 7

суток, при дальнейшем культивировании посевного мицелия в ферментере с лопастной мешалкой в течение последующих 7 суток со ступенчатым нарастанием скорости перемешивания культивируемого мицелия на 2-ой стадии (100-350 об/мин), скорости аэрации -1,0 л/л/мин.), при температуре 27°±1°С и рН среды (5,2-5,6) в 5-, 15-, 50- и 200-литровом ферментерах с рабочим объемом 3 л, 10 л и 33 л, 130 л соответственно.

Анализ морфологических характеристик мицелия в процессе его культивирования показал, что на 1-ой стадии формирования культуры образуются мелкие гранулы (пеллеты) со средним диаметром не более 1 мм. На 2-ой стадии в течение всего процесса культивирования мицелий в основном находился в форме пеллет со средним диаметром от 1,0 мм до 2,0 мм).

Достоверность полученных данных по выходу биомассы мицелия в условиях двухстадийного культивирования при заданных физических и химических факторах, влияющих на рост и накопление биомассы мицелия в глубинной культуре, подтверждается полученными ранее результатами исследований на других видах медицинских грибов (ЕШавЬуШ V., 2012).

Определены эффективные технологические параметры режимов глубинного двухстадийного культивирования мицелия Ркигошя оьХгеагт 1137 в системе «ротационная качалка (инокулятор) - ферментер с механическим перемешиванием среды».

Основным результатом в технологии экспериментального глубинного культивирования мицелия Р1еигоШ$ онгеаШз 1137 по двухстадийной схеме технологического цикла является существенное сокращение времени наработки мицелия в разных вариантах в 1,5-2,0 раза с увеличением биомассы мицелия в 1,8-2,3 раза в течение 14 суток по сравнению с его получением в колбах Эрленмейера на качалках, что позволяет при промышленной технологии значительно экономить время и средства в производстве товарного мицелия и ЭМВ.

Полученные результаты положены в основу технологического процесса производства экстракта мицелия Р/еигоГия О-Игеаин 1137 как фармакологической субстанции лекарственного препарата.

2,2.3 Культурально-морфологическая характеристика мицелия

Для сканирующей электронной микроскопии фрагменты мицелия размером ~ 1 мм фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида на буфере Зеренсена или какодилатном буфере в течение 60 минут. Образцы обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации, ацетоне и высушивали по методу критической точки. Высушенные образцы помещали на специальные предметные столики, напыляли в вакууме золотом, просматривали и фотографировали в сканирующем электронном микроскопе.

При росте на агаризованной среде водного раствора солодового экстракта «МаИах-10» выращенный мицелий хорошо развит, ватообразный, стелющийся край колонии растущего мицелия войлочный, ровный. Скорость роста за 7 суток после высева мицелия высокая. Цвет мицелия белый. Экзопигмент отсутствует. Гифы септированные, ветвление частое, под острым или прямым углом, тип ветвления моноподиальный. Образуются пряжки. Диаметр большинства гиф от 1 до 2 мкм.

На рисунке 3 приведены фотографии внешнего вида мицелия Р1еигошз о$1геаЫ$ 1137, прошедшего культивирование в 50-литровом ферментере.

а б в

Рисунок 3 - Фотографии мицелия Р1еиюш оэяеашя 1137, прошедшего культивирование в 50-литровом ферментере, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа: а - пеллета мицелия, увеличение в 60 раз, масштаб 200 мкм; б -мицелий, увеличение в 300 раз, масштаб 50 мкм; в - гифы мицелия, увеличение в 3000 раз, масштаб 5 мкм

Сравнение морфологических характеристик мицелия, полученного в результате двухстадийного культивирования (в колбах на качалке на 1-ой стадии в течение 7 суток и в ферментере на 2-ой стадии в течение 7 суток), с морфологическими характеристиками мицелия, полученного в результате его двухстадийного культивирования только на качалках (Герасименя В.П. и др., 2002; Камзолкина О.В., Ефременкова О.В. и др., 2003), показало их практически полное совпадение.

2.2.4 Экстракция мицелия

В работе использован стандартный, хорошо известный прием экстрагирования компонентов клеток биомассы (в данном случае размельченного мицелия) водно-этанольной смесью (Камзолкина О.В. и др., 2002, 2003, 2004). Такой метод экстрагирования позволяет выделить из биомассы как гидрофильные, так и липофильные компоненты.

К отжатому от культуральной жидкости, тщательно размельченному мицелию с влажностью 83,0-87,0% добавляется этанол в соотношении 1,0:1,0-1,5 и соляная кислота для доведения рН мицелия до 3,0-3,5.

Экстракция проводится в течение 18-20 часов при температуре 4-6°С.

После окончания экстракции отделение водно-спиртового раствора экстракта от биомассы мицелия проводится методом фильтрации.

После фильтрации нативный водно-спиртовой раствор экстракта упаривается в вакуумном испарителе на водяной бане при температуре не выше 45°С до получения готовой формы ЭМВ. Готовая форма экстракта содержит до 30 % воды.

В результате проведенных 14-ти серий опытов был получен экстракт в следующих количествах: в 5-литровом ферментере на 3 л среды - 10,2 г/л; в 15-литровом ферментере на

10 л среды - 13,3 г/л; в 50-литровом ферментере на 33 л среды - 13,9 г/л; в 200-литровом ферментере на 130 л среды - 27,2 г/л, что соответственно в 1,4 раза, 1,6 раза, 1,7 раза и в 3,3 раза превышает выход экстракта, полученного из мицелия, культивируемого в колбах на ротационных качалках (из расчета 7,5 г/л среды).

2.2.5 Антимикробная активность

Показано, что экстракты, выделенные из мицелия по методике (Камзолкина О.В. и др., 2002, 2003, 2004), обладают антимикробной активностью в отношении испытываемых тестовых штаммов бактерий (Staphylococcus aureus UHA 00761 (MRSА) и Escherichia coli АТСС 25922) аналогичной, как и у ЭМВ, полученных при двухстадийном культивировании в колбах на качалках (Герасименя В.П. и др., 2003).

2.2.6 Стимулирующий эффект наноструктурных частиц серебра на рост и продуктивность мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в глубинной культуре

В качестве стимулирующего реагента (катализатора), приводящего к деструкции метаболита роста мицелия в глубинной культуре углекислого газа СО2 с конвертацией его в молекулярный кислород Ог и углерод С, использовался «Концентрат коллоидного серебра в водной дисперсии», ТУ 9185-025-87552538-12 (далее ККС).

Физико-химические показатели ККС: плотность 1,01-1,03 г/см3; массовая доля коллоидного серебра 450,0-500,0 мг/л; концентрация водородных ионов рН=7,0-7,5.

Распределение размеров микрочастиц серебра лежит в интервале от 11 нм до 41 нм, причем 80-85% составляют наноструктурные частицы с размером от 11 нм до 20 нм. В разработанных вариантах растворов ККС представляет собой шаровидные мицеллы.

ККС добавлялся в питательную среду с растущим в ней мицелием Pleurotus ostreatus 1137.

Культивирование осуществлялось в две стадии: первая стадия - выращивание посевного материала, вторая стадия - культивирование мицелия в 5-литровом ферментере для получения большого количества биомассы.

Соответственно использовались две среды, различающиеся по составу: «посевная» и «ферментативная». ККС добавлялся в ферментативную среду в концентрациях 0,0033, 0,0050 и 0,0066 мл на 1 мл питательной среды на второй стадии культивирования. В качестве контроля использовался мицелий, культивируемый без добавления ККС.

Анализ мицелия, выращенного в присутствии ККС, в сканирующем электронном микроскопе не выявил существенных различий в структуре гиф и плотности их расположения в контрольных образцах и в образцах, растущих в присутствии ККС.

В то же время интенсивность роста мицелия зависит от дозы препарата. Максимальное увеличение биомассы мицелия (на 34% превышающее контроль) наблюдается при концентрации ККС 0,0050 мл на 1 мл среды культивирования. Соответственно, на 62,5% в сравнении с контролем возрастает выход экстракта (рисунки 4, 5). Повышение концентрации ККС до 0,0066 мл на 1 мл среды приводит к угнетению роста.

1000

К

| 800

400

^ 600 го о о го 2

О 200 ш п

843

918

Контроль

№ 1 (0,0033) № 2 (0,0050) № 3 (0,0066)

Рисунок 4 - Зависимость биомассы мицелия от концентрации ККС в мл на 1 мл среды культивирования

140

Контроль ^а 1 (0,0033) N3 2 (0,0050) N6 3 (0,0066)

Рисунок 5 - Зависимость количества полученного ЭМВ от концентрации ККС в мл на 1 мл среды культивирования

Можно заключить, что наноструктурные частицы серебра, введенные в среду культивирования мицелия РЫигоШя озггеаыз 1137, в достаточно узком интервале концентраций оказывают выраженное стимулирующее действие на рост биомассы и продуктивность мицелия.

Причина этого феномена остается непонятной. Возможно, наночастицы коллоидного серебра являются стрессовым фактором, вызывающим защитный ответ клеток мицелия, что характерно для организмов, находящихся в условиях акклимации к стрессу. В этом случае метаболизм существенно перестраивается, направляя все ресурсы на поддержание жизнеспособности. Косвенно, такую возможность подтверждают данные о непропорционально высоком увеличении выхода ЭМВ после выращивания мицелия в присутствии КСС: количество биомассы увеличивается на 34%, а выход ЭМВ возрастает на 62,5%.

В состав ЭМВ входят углеводы, витамины, органические кислоты, высшие жирные кислоты, аминокислоты и углеводы, т.е. именно те компоненты, которые участвуют в поддержании гомеостаза эукариотических клеток (Захаров C.B. и др., 2013).

Тот факт, что угнетение роста мицелия не приводит к снижению его продуктивности по сравнению с контролем, можно объяснить высокими адаптивными способностями мицелия вешенки.

Специальная проверка, проведенная на культивируемых клетках HeLa и нормальных фибробластах показала, что экстракт мицелия, выращенного в присутствии ККС, нетоксичен для культивируемых клеток человека. Это означает, что обнаруженный феномен стимуляции роста биомассы мицелия может быть использован в практической работе, связанной с получением БАВ из ЭМВ.

2.2.7 Химический состав ЭМВ

Подготовка субстанции ЭМВ для анализа его химического состава проводилась по ГОСТ 28495, ГОСТ 1511.0-77, ГОСТ 20438-75. Для изучения химического состава экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 были использованы образцы, полученные в течение одного года (с начала января по декабрь включительно).

К тщательно размельченному влажному мицелию добавлялись этанол в соотношении 1/1,5 и соляная кислота для доведения рН мицелия до 3,0-3,5. Экстракция проводилась в течение 18-20 часов при температуре 4°С. После окончания экстракции отделение нативного раствора ЭМВ от биомассы мицелия осуществлялось методом фильтрации. После фильтрации раствор ЭМВ упаривался в вакуумном испарителе до получения готовой формы.

Углеводы определяли методом сорбционной хроматографии, на анализаторе Сахаров Biotronic LC 2000 с рефрактометрической детекцией бицинхенинатом и нингидрином соответственно. Выявленный состав: глюкоза, галактоза, манноза, арабиноза, галактоза, ксилоза, глюкозамин - суммарно 47,0-48,0%.

Аминокислоты определяли методом ионообменной хроматографии на сильном катионообменнике (сульфированном сополимере стирола с дивинилбензолом) на аминокислотном анализаторе «Hitachi» модель 835, Япония. Выявленный состав: аспарагин, серин, треонин, глутамин, пролин, глицин, аланин, валин, изолейцин, лейцин, лизин, гистидин, аргинин, цистеин, метионин, тирозин, фенилаланин, орнитин, оксилизин - суммарно 3,5-9,6%.

Высшие жирные кислоты количественно выделяли из сложных многокомпонентных природных смесей с последующим хроматографическим анализом в виде метиловых эфиров. Выявленный состав: каприновая (Сю:о), лауриновая (Ci2:o), миристиновая (Сию), пентадекановая(С15:о), пентадеценовая (С151), пальмитиновая (Ci6:o), пальмитолеиновая (Ci6:i), гептадекановая (Сп о), гептадеценовая (Cn:i), стеариновая (Ci8:o), олеиновая (Ci8:i), линолевая (С18 2), арахиновая (С200), эруковая (Сг2:0 - суммарно 0,6-0,9%.

Органические кислоты определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на цветном хроматографе «Kontron» с УФ-детектором. Выявленный состав: масляная, молочная, уксусная, яблочная, щавелевая - суммарно 1,02-1,26%.

Витамины Е, Bi, В2, Вб, С, D определяли методом жидкостной хроматографии. Выявленный состав: Bi, В2, Вб, Е, D, С, каратиноиды - суммарно 0,6-1,2%.

Витамины Вс, РР определяли микробиологическим методом. Выявленный состав: Вс, РР- суммарно 0,4-1,1%.

Минеральные вещества определяли методом инверсионной вольт-амперометрии. Выявленный состав: натрий (Na), калий (К), кальций (Ca), магний (Mg), фосфор (Р), сера (S), железо (Fe), цинк (Zn), марганец (Мп), медь (Си), алюминий (Al), бор (В), барий (Ва), кремний (Si), стронций (Sr), литий (Li) - суммарно 1,4-1,9%.

Остальное вода - до 30,0%.

2.3 Эффект синергизма ЭМВ (фармакологической субстанции) с цитостатиками при сочетанном действии на трансформированные клетки in vitro

2.3.1 Методы пробоподготовки клеток

В экспериментах использовали клетки линии Vero (эпителий почки африканской зелёной мартышки) и трансформированные клетки HeLa.

Клетки культивировали в культурапьных флаконах емкостью 50 мл на среде DMEM (ПанЭко, Россия) с добавлением 1% по объему смеси антибиотиков и антимикотиков (Sigma) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США), в атмосфере с 5%-ным содержанием СО2 при температуре 37°С. Для проведения экспериментов клетки высаживали на квадратные 12x12 мм или круглые диаметром 24 мм покровные стёкла, а также пластиковые чашки с адгезивным покрытием (Costar Corning, США) диаметром 3,5 см и культивировали до достижения необходимой плотности.

Для изучения действия ЭМВ и цитостатиков клетки инкубировали с соответствующими препаратами в течение 8 или 24 часов, фиксировали параформальдегидом, окрашивали гематоксилином или флуорохромом Хехст и заключали в мовиол по стандартной методике. Подсчет количества делящихся и апоптотических клеток проводили в световом микроскопе. В каждом препарате было проанализировано не менее 3000 клеток.

2.3.2 Определение цитотоксической дозы экстракта

Для определения цитотоксической дозы ЭМВ использовали перевиваемые клетки почки зеленой мартышки (Vero). Клетки этой культуры не является раковыми и их разрешено использовать для приготовления вакцин. ЭМВ в различных концентрациях (5000, 2500, 1000, 500 и 100 мкг/мл) вносили в среду культивирования клеток Vero. Проведенные исследования показали, что в течение 7 дней наблюдений в концентрациях 1000, 500 и 100 мкг/мл ЭМВ не вызывает видимых цитопатических изменений как монослоя, так и обособленных клеток Vero. Четко тестируемые изменения морфологии у 50% клеток происходят при концентрации ЭМВ 2500 мкг/мл. Таким образом, ЦД50 для данной культуры клеток составляет 2500 мкг/мл. Из этого следует, что для экспериментального и практического применения ЭМВ целесообразно использовать концентрации, не превышающие 2000 мкг/мл.

2.3.3 Индивидуальное и сочетанное с цитостатиками действие экстракта на пролиферацию и индукцию апоптоза трансформированных клеток НеЬа

Для анализа сочетанного действия на пролиферацию трансформированных клеток НеЬа использовались цитостатики: доксорубицин и метотрексат, - широко применяемые в онкологической практике. Определение дозы реагентов осуществлялось на основании клинических рекомендаций, в пересчете на 1 мл среды культивирования: доксорубицин -0,01 мкг/мл, метотрексат - 4 мкг/мл.

Клетки инкубировались в присутствии цитостатиков в течение 24 часов. Для количественной оценки действия препарата определялся митотический индекс (количество митозов на 1000 изученных клеток).

Полученные данные показывают, что доксорубицин и метотрексат на 90-95% ингибируют митотическую активность клеток.

При сочетанном действии ЭМВ с доксорубицином и метотрексатом наблюдается полное ингибирование митозов.

Для анализа сочетанного действия на индукцию апоптоза клетки инкубировали в присутствии ЭМВ 1 час, затем вводили цитостатик и инкубировали еще 7 часов.

Апоптотические клетки тестировались по характерной структуре ядер и по наличию в цитоплазме свободного цитохрома С. Для количественной оценки действия препарата определялся «апоптотический индекс» - доля клеток с признаками апоптотической гибели в 1000 изученных клеток. Анализ различных способов инсталляции препаратов показывает, что для индукции апоптоза наиболее эффективна предварительная обработка клеток экстрактом (1 час) с последующим введением цитостатиков (7 часов). При этом эффективность действия ЭМВ сильно зависит от типа цитостатика.

Метотрексат. Доля апоптотических клеток в присутствии метотрексата возрастает в 3,6 раза по сравнению с контролем. При сочетанном действии с ЭМВ метотрексат примерно в 4 раза повышает долю апоптотических клеток в сравнении с его индивидуальным использованием.

Доксорубицин. При использовании концентраций доксорубицина, принятых в клинической практике (0,01 мкг/мл), доля апоптотических клеток возрастает в до 10 раз.

При сочетанном действии с ЭМВ доля апоптотических клеток повышается в 1,5-2 раза по сравнению с индивидуальным использованием доксорубицина. Это означает, что по сравнению с контролем количество клеток, включивших программу апоптоза, возрастает примерно в 25 раз.

На основании перечисленных экспериментов можно предположить что ЭМВ обладает выраженным синергизмом с токсичными цитостатиками, служит своеобразным «модулятором» физиологической активности клеток, способствуя активному включению цитостатиков в клеточный метаболизм, в том числе в каскад событий, связанных с индукцией программы апоптоза.

2.3.4 Клеточные мишени действия экстракта

При индивидуальном действии ЭМВ в части культивируемых трансформированных клеток вызывает аномальную сегрегацию хромосом на стадии метафазы и появление хромосомных аберраций типа «мост» на стадии анафазы.

В серии экспериментов показано, что искусственная модификация структуры хроматина (частичная декомпактизация) делает его более доступным для факторов, индуцирующих апоптоз. В этих случаях ЭМВ действует как проапоптотический агент.

Прижизненное окрашивание клеток HeLa, культивируемых в присутствии ЭМВ, показало, что «первичным» ответом клетки на действие ЭМВ является модификация плазматических мембран. При этом важно, что такую реакцию демонстрирует не все клетки популяции.

Известно два основных пути апоптоза в клетке: митохондриальный путь и путь, включающий рецепторы «клеточной смерти», к которым относятся семейства белков CD95 (Аро-1 или Fas) и TNF-R (фактор опухолевого некроза).

Если апоптоз развивается по митохондриальному пути, то наблюдается выход из митохондрий белка цитохрома С (Skulachev V.I. et al., 2009).

В жизнеспособных клетках HeLa цитохром С локализуется в митохондриях, которые, в основном, представлены нитчатыми формами. Обработка клеток экстрактом или митостатиком циклофосфаном (ЦФ) не приводит к существенному изменению формы митохондрий и к выходу цитохрома С в цитоплазму. При сочетанной обработке (ЭМВ -1 час, затем добавление циклофосфана и последующая инкубация клеток - 8 часов) на препаратах выявляются апоптотические клетки, в которых наблюдается значительные изменения структуры митохондрий (набухание и «ошаривание»), однако выхода цитохрома в цитоплазму также не наблюдается. Этот факт доказывает, что апоптоз, индуцируемый сочетанным воздействием ЭМВ и циклофосфана развивается не по митохондриальному, а, скорее, по рецепторному пути.

2.4 Действие экстракта (фармакологической субстанции) на различные нозологические формы на модели экспериментальных животных (in vivo)

2.4.1 Проверка токсичности фармакологической субстанции

Исследование проведено на мышах-самцах линии Fi (по 8 мышей в каждой группе), массой 26-28 г, полученных из питомника РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Исследования общего токсического действия проводили с ЭМВ в виде геля. Навески ЭМВ растворяли в физиологическом растворе и вводили внутримышечно в дозах 10, 20, 50, 75 и 100 мг/кг ежедневно в течение 10 дней.

Критериями токсического действия экстрактов в опытах на мышах служили: количество павших животных, сроки гибели, клиническая картина интоксикации, изменение в поведении, аутопсия.

Желудочно-кишечную токсичность оценивали по изменению массы тела мышей.

Контроль за указанными показателями животных производился в течение 30 суток наблюдения.

Установлено, что в исследованных дозах ЭМВ не обладает токсичностью.

2.4.2 Противоопухолевая активность фармакологической субстанции

Эксперименты проведены на инбредных мышах ЕШр1 - гибриды первого поколения ^(С57В1/6 х ОВАг). В опытах использовано 100 мышей, самцов с массой тела 18-20 г. В качестве опухолевой тест-системы служила перевиваемая солидная опухоль животных меланома В-16.

Противоопухолевая активность препаратов оценивалась по кинетике роста опухолей и сопоставления средней продолжительности жизни мышей в группах леченных и контрольных животных.

Показателями, характеризующими эффект ингибирования роста опухоли, служили торможение роста опухоли (ТРО,%) и увеличение средней продолжительности жизни животных (Дт,%).

Установлено, что применение препарата ЭМВ на 33% затормаживает рост опухоли меланома В-16, вызывая увеличение средней продолжительности жизни на 7% по сравнению с интактным контролем.

Совместное применение препаратов ЭМВ и циклофосфана (ЦФ) затормаживает рост опухоли, изменяющийся в пределах от 70 до 90%, вызывая увеличение средней продолжительности жизни леченых животных от 30 % до 54 % по сравнению с интактным контролем, в зависимости от применяемых доз препаратов ЭМВ и цитостатика.

2.4.3 Влияние фармакологической субстанции и цитостатика циклофосфана на гематологические показатели периферической крови

Эксперименты проведены на мышах линии С57 В1/6, возраст - 8 недель, вес 23-30 г. В ходе экспериментов измерялось количество лейкоцитов в периферической крови (перед введением ЦФ и на первые, четвертые и седьмые сутки после введения ЦФ). Измерение количества лейкоцитов проводилось по стандартной методике.

В 4-й группе мышей, получавшей ЦФ и ЭМВ (фармакологическую субстанцию), количество лейкоцитов на следующий день после введения ЦФ было выше количества лейкоцитов, чем во 2-ой группе, получавшей только ЦФ (соответственно, 43% и 29% от исходного). На третий день количество лейкоцитов в 4-й группе выросло до 51%, в то время как во 2-ой группе несколько упало, до 27%.

Таким образом, применение ЭМВ ускоряет восстановление количества лейкоцитов в периферической крови леченых мышей после применения ЦФ и снижает гематотоксичность, в частности, выраженность и продолжительность лейкопении, вызванную введением животным ЦФ в дозе 300 мг/кг веса тела.

2.4.4 Гиполипидемическая активность фармакологической субстанции

Эксперимент выполняли на 60 белых беспородных лабораторных половозрелых самцах-крысах с исходной массой тела 300-350 граммов.

Нарушения липидного обмена (гиперлипидемию) вызывали атерогенной диетой. В качестве препарата сравнения использовали Зокор.

Полученные данные показывают, что изучаемый экстракт (фармакологическая субстанция) восстанавливает липидный спектр крови после атерогенной диеты. Так,

например, у группы животных, которым вводили ЭМВ, на 14-е сутки содержание холестерина (ХС) снизилось на 20%, триглицеридов - на 40%, ХС ЛПНП (липопротеинов низкой плотности) - на 19%, ХС ЛПОНП (липопротеинов очень низкой плотности) - на 43%, индекс атерогенности уменьшился на 33%, ХС ЛПВП (липопротеинов высокой плотности) повысилось на 16%, достоверно отличаясь по полученным показателям от группы мышей, которой давалась атерогенная диета.

Таким образом, ЭМВ обладает гиполипидемической активностью и по эффективности превосходит известную лекарственную форму Зокор. Это дает основание рекомендовать его к изучению по расширенной программе исследования в препарате с полифункциональной медико-биологической активностью.

2.4.5 Гепатопротекториое действие фармакологической субстанции

Работу проводили на модели экспериментального неалкогольного стеатогепатита, индуцированного у крыс с помощью высококалорийной (атерогенной) диеты. Препарат вводили перорально одновременно с высококалорийной пищей. Показано, что после двух недель атерогенной диеты печень приобретает выраженные признаки жировой дистрофии (стеатоза).

За развитием патологии следили по биохимическим и гистологическим показателям. На субклеточном уровне ответ печени анализировали методом электронной микроскопии.

Из гистологического и ультраструктурного анализа следует, что при такой постановке эксперимента ЭМВ блокирует развитие деструктивных изменений как на уровне общей организации печени, так и на клеточном уровне. Одновременно с этим ЭМВ оказывает дифференцированное влияние на характер ферментных печеночных показателей после атерогенной диеты.

На фоне действия ЭМВ близко к норме сохраняются показатели аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и щелочной фосфатазы, характеризующие деструктивные процессы в печени.

В целом показано, что испытанная фармакологическая субстанция обладает гепатопротекторной активностью, по эффективности превосходит лекарственный препарат Зокор, и поэтому ее можно рекомендовать к использованию в практике как средство для лечения и профилактики неалкогольного стеатогепатита.

2.4.6 Действие фармакологической субстанции на коррекцию лекарственной непереносимости в комплексном лечении больных туберкулезом легких

Результаты клинических испытаний применения ЭМВ в виде геля и сиропа, как препарата «сопровождения» химиотерапии у больных туберкулезом легких, подтверждают эффективность его применения для коррекции лекарственной непереносимости в комплексной терапии туберкулеза легких.

Анализ переносимости противотуберкулезной терапии по 10-балльной системе у пациентов с впервые выявленным туберкулезом легких показал, что при применении препарата достоверно, в 1,6 раза, улучшается переносимость химиотерапии.

На фоне лечения побочных реакций препаратом переносимость химиотерапии составила 9,1 баллов, против 5,0 баллов исходно.

2.4.7 Перспективы применения экстракта мицелия вешенки в ветеринарии

На основании экспериментальных исследований показана возможность применения ЭМВ в животноводстве и ветеринарии домашних животных. Одним из основных аспектов применения экстракта является устранение токсических нагрузок на организм животных, вызванных некачественными кормами, применением антибиотиков и токсичных лекарственных препаратов. В этом направлении представляет интерес использование как культуральной жидкости, так и сухого мицелия в качестве эффективных энтеросорбентов, делая производство ЭМВ практически безотходным. Кроме того, перспективным является применение ЭМВ в племенном животноводстве и при лечении онкологических заболеваний домашних животных.

2.5 Активное вещество фармакологической субстанции: технология выделения, идентификация и биологическая активность

В разделе 2.3.4 было показано, что при индивидуальном действии на трансформированные клетки ЭМВ является слабым индуктором апоптоза, однако при последовательном введении в среду культивирования низких доз (до 50 мкг/мл) и высоких доз (более 50 мкг/мл) ЭМВ эффективность его апоптогенного действия резко повышается. Эти данные послужили основанием для работы, направленной на фракционирование экстракта и выделение вещества, обладающего апоптогенной активностью.

2.5.1 Фракционирование экстракта мицелия вешенки

Для проведения фракционирования ЭМВ были подобраны органические растворители, образующие двухфазную систему с этанолом и водно-этанольной смесью (Кирьянов Г.И. и др., 2013). Испытано фракционирование с помощью гексана, эфира и других растворителей при двух значениях рН: 1,7 и 11,0. Материал, переходящий из экстракта в растворители, оценивали количественно и определяли его биологическую активность на клетках НеЬа и суспензионной культуры миелоидного лейкоза человека.

Наиболее эффективным оказалось фракционирование экстракта с использованием хлористого метилена (ХМ). Во-первых, фракция материала, перешедшего в ХМ, составляет от 2 до 5% материала экстракта. Во-вторых, материал фракции, полученной с применением ХМ, индуцирует апоптоз в клетках обеих культур без применения цитостатиков. И, наконец, эффект индукции апоптоза дозозависим и стимуляция апоптоза в разы (до 10 раз) выше по сравнению с контролем (Поляков В.Ю. и др., 2013).

Схема обогащения активным веществом приведена ниже:

100 г препарата суспензировали в 500 мл дистиллированной воды, доводили при необходимости рН до 1,7-1,9 с помощью 1н №804. Раствор центрифугировали 30 мин при 3000 об/мин. Осадок и флотирующие компоненты отбрасывали. Раствор переносили в

стеклянную колбу вместимостью 2 л, добавляли 500 мл хлористого метилена и встряхивали на качалке 45 минут при комнатной температуре. Смесь разделяли при помощи центрифугирования (30 мин при 3000 об/мин), отбирали нижнюю (органический растворитель) фазу. Водную фазу экстрагировали повторно: переносили в колбу вместимостью 2 л, добавляли 500 мл хлористого метилена, встряхивали на качалке и центрифугировали. Экстракты объединяли и упаривали на роторном испарителе без нагревания. Сухой остаток в колбе растворяли в 10 мл дистиллированной воды, переносили в стеклянные флаконы вместимостью 10 мл (по 1 мл на флакон), замораживали в жидком азоте и лиофилизировали в течение 12 часов.

Обогащенный с помощью хлористого метилена экстракт мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в виде сухого остатка (100-200 мг) растворяли в 96%-м этаноле до концентрации 100 мг/мл.

В итоге сделано заключение, что оптимальным способом экстракции «апоптотически» активного вещества следует считать экстракцию хлористым метиленом. Этот прием дает наиболее воспроизводимые результаты, выраженную дозовую зависимость, технологичность процедур. При этом концентрацию активного вещества удается повысить в 20-50 раз.

В дальнейшем именно эта фракция была использована для выделения и идентификации активного вещества (ДМИ) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

2.5.2 Идентификация вещества, определяющего биологическую активность фармакологической субстанции

Для выделения из полученной фракции активного вещества органический слой упаривали на роторном испарителе без нагревания и растворяли в 1 мл 96%-го этанола. Полученный раствор (аликвоты по 100 мкл) дополнительно разделяли с помощью аналитической ВЭЖХ на системе Agilent 1100, состоящей из четырехканального насоса с дегазатором, колоночного термостата, автосамплера, диодно-матричного УФ-детектора и управляющей программы ChemStation. Была использована аналитическая колонка 4,6*250мм с сорбентом Luna С 18(2) (5 мкм). Фракцию, содержащую пик материала, обладающего апоптогенной активностью при действии на клетки HeLa, собирали и упаривали на роторном испарителе при температуре 45-55°С на 2/3 по объему до появления опалесценции раствора. К оставшемуся раствору добавляли равный объем хлористого метилена, экстрагировали и органический слой отделяли на делительной воронке. Органический слой упаривали на роторном испарителе без нагревания, растворяли в 1 мл хлористого метилена и сушили в эксикаторе. Для наработки требуемого количества активного вещества технологический процесс многократно повторяли.

Хроматограмма очищенного вещества на аналитической колонке Luna С18(2) (5мкм) 4,6*250 мм (подвижная фаза: ацетонитрил/вода 79:21, скорость потока 1,0 мл/мин при 25°С, детекция при 230 нм) приведена на рисунке 6,а.

Проведенные с помощью программы Эггистге ЕккпсЫог/АСОкЬв (Канада) исследования позволили установить структуру вещества. Наиболее вероятная стереоконфигурация изомера приведена на рисунке 6,6.

Молекулярная масса вещества была оценена методом ИРЬС/Мв с использованием квадрупольного и времяпролетного масс-спектрометров при электроспрей-ионизации и составила 332,2452 дальтон.

Рисунок 6 - Идентификация дезметилинцистерола (активного вещества): а -хроматограмма очищенного вещества на аналитической колонке Luna С18(2) (5мкм) 4,6*250 мм; б - наиболее вероятная стереоконфигурация С21Н32О3. молекулярная масса. 332,25 дальтон

Молекулярная формула С21Н32О3 определена по точной массе методом времяпролетной масс-спектрометрии (ТОР) с электроспрей-ионизацией.

На основании полученных результатов исследований нами было установлено, что выделенное из первичного экстракта вещество с активным началом в виде производного стерола (ДМИ) является новым веществом, ранее не описанным для известных медицинских грибов. В мировой литературе есть сообщение об обнаружении подобного вещества (инцистерола, также являющегося производным стерола) в морских губках.

Содержание ДМИ в экстракте мицелия колеблется в зависимости от сезона культивирования мицелия и составляет 1,0-5,0 мг в 100,0 г экстракта.

2.5.3 Действие дезметилинцистерола на цитокинетические параметры культивируемых клеток

Для оценки индивидуального действия ДМИ в среду культивирования (10 мл среды) добавляли по 100 мкл раствора ДМИ в этаноле в концентрации 10, 25, 50, 100, 200 и 500 мкг/мл. Таким образом, конечная концентрация ДМИ в культуральной среде составляла 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 2,0 и 5,0 мкг на мл среды (рисунок 7).

о: §

СГ

4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

4,13

□ митозы и апоптозы

0,9

0,8

0,9

1,1

0^2

0,23

0,7

--31 | |о,23

0,9

0,26

0,72 0,24

0 0,10 0,25 0,50 1,00 2,00 5,00

Рисунок 7 - Действие ДМИ на пролиферацию и индукцию апоптоза в популяции трансформированных клеток НеЬа

На рисунке 7 цифры по оси абсцисс - концентрация ДМИ в культуральной среде - 0; 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 мкг/мл, соответственно. На оси ординат - доля клеток (митотических и апоптотических) в процентах.

В популяции контрольных клеток НеЬа, наряду с активно пролифелирующими клетками, всегда присутствуют апоптотические клетки, количество которых может незначительно меняться в зависимости от штамма и времени культивирования.

В условиях эксперимента, через 8 часов после инсталляции препарата, доля пролиферирующих и апоптотических клеток существенно не изменяется при концентрациях ДМИ от 0,1 до 1,0 мкг/мл (рисунок 8,а). При концентрации ДМИ 5,0 мкг/мл доля делящихся клеток уменьшается примерно в 4 раза и одновременно резко (примерно в 20 раз) возрастает количество клеток, включивших программу апоптотической гибели (рисунок 8,6).

* •« • * * Г Г* 1

* _ 0 . л т .»•#■'.

ч*

• 1 2

л Л Ад 1

Г*

У«?"

'V

у 4

/ •

♦ I

Рисунок 8 - Фотографии популяции клеток НеЬа после 8 часов инсталляции в присутствии ДМИ: а - концентрация ДМИ 1,0 мкг/мл; б - концентрация ДМИ 5,0 мкг/мл

2.5.4 Действие дезметилинцистерола на цитокинетические параметры культивируемых клеток в условиях модификации клеточных мембран глутаровым альдегидом

Исследование проводилось на трансформированных клетках HeLa.

Экспериментальные и контрольные клетки культивировались в среде без сыворотки, для модификации плазматических мембран в экспериментах использовался глутаровый альдегид в концентрации 0,0001%.

Полученные результаты показали, что в условиях модификации плазматических мембран глутаровым альдегидом фракция, обогащенная ДМИ, проявляет митостатическую активность при концентрации 0,5 мкг/мл, а апоптогенную активность - при концентрации 1,0 мкг/мл. В клетках с ^модифицированными мембранами, обработанных фракцией, обогащенной ДМИ, при аналогичных концентрациях оба эффекта препарата отсутствуют.

В условиях предобработки клеток при последовательном воздействии глутаровым альдегидом фракция, обогащенная ДМИ, в концентрации 2,0 и 5,0 мкг/мл, приводит к массовой гибели популяции, сопровождающейся появлением большого количества некротических клеток.

Одно из возможных объяснений такого концентрационно-зависимого эффекта -наличие двух различных мишеней (клеточных рецепторов) для рекрутирования фракции, обогащенной ДМИ, в частности, рецепторов группы TNF. Проверка этой гипотезы требует проведения дополнительных исследований. В любом случае, наблюдаемые эффекты, по-видимому, опосредованы негеномными механизмами.

2.6 Предложения по созданию и производству лекарственного препарата и оценка его полифункциональной медико-биологической активности

В работе показано, что фармакологическая субстанция (ЭМВ) и ДМИ обладают теоретически и практически значимыми ключевыми свойствами: синергизмом с цитостатиками и полифункциональностью действия на различные формы нозологии.

В практическом плане эти свойства, во-первых, позволяют использовать ДМИ в терапии различных нозологических форм и, во-вторых, дают уникальную возможность значительно понизить дозу крайне токсичных медицинских препаратов, используемых в химиотерапии различных патологий.

Выявленные эффекты действия экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 и выделенного из него активного вещества (ДМИ), вместе с известными данными литературы (Герасименя В.П., Захаров C.B. и др., 2013), позволили предложить композицию инновационного препарата, который предназначен для использования в химиотерапии. В связи с тем, что препарат позволяет существенно снизить дозу цитостатиков, содержит иммуномодуляторы и антиоксиданты, его можно позиционировать как лекарственное средство детоксикационного действия.

2.6.1 Состав лекарственного препарата

1. Активное вещество - производное стерола (ДМИ) IUPAC: (3a5,5aR,6/?,8aÄ)-6-[(2i?,3£,5S)-5,6-dimethylhept-3-en-2-yl]-3a-hydroxy-5a-methyl-3a,4,5,5a,6,7,8,8a-octahydro-2//-indeno[5,4-b]furan-2-one с молекулярной массой 332,2452 дальтон.

2. Фармацевтическая субстанция - экстракт мицелия Pleurotus ostreatus 1137. ЭМВ содержит низкомолекулярные (от 100 до 500 дальтон) БАВ, углеводы, аминокислоты, высшие жирные кислоты, органические кислоты, витамины, минеральные вещества и воду.

3. Вспомогательные вещества:

- ß 1-3 глюкан с молекулярной массой глюкозы 512 дальтон, ди- и трисахарида 674 и 836 дальтон. ß-глюканы стимулируют иммунную систему, используются для профилактики и лечения онкологических заболеваний, снижают уровень холестерина, оказывают положительное влияние на рост пробиотических бактерий в кишечнике;

- дигидрокверцетин (2,3-дигидро-3,5,7-тригидрокси-2-(3,4-дигидроксифенил)-4Н-1-бензопиран-4-он) с молекулярной массой 304,26 дальтон.

2.6.2 Проверка токсичности препарата

В эксперименте были задействованы две группы мышей по 10 особей в каждой группе.

Исследования проводили на мышах обоего пола линии BALB/C с массой - 40 г из питомника РАМН «Столбовая», в остром эксперименте для двух его однократных суточных доз 100 мг/ кг, 200 мг/ кг при однократном внутрижелудочном способе введения препарата. Перед применением препарат растворяли в 0,5 мл дистиллированной воды. Срок наблюдения составил 14 суток.

В состав препарата (100 мг однократной суточной дозы) входит 79,0 мг экстракта (фармацевтической субстанции), 1,0 мг ДМИ, 10,0 мг полисахарида ß 1-3 глюкана и 7,5 мг антиоксиданта дигидрокверцетина.

В составе препарата (200 мг однократной суточной дозы) количество всех ингредиентов соответственно удваивается.

Критериями токсического действия исследуемых доз препарата служили: количество павших животных, сроки гибели животных, клиническая картина интоксикации, изменение массы тела в течение всего срока наблюдения, поведение животных, данные аутопсии.

Показано, что при однократном внутрижелудочном введении препарата в дозах 100 мг/кг, 200 мг/кг в обеих группах мышей внешних клинических проявлений не наблюдалось.

Таким образом, установлено, что препарат в применяемых дозах (100 мг/кг и 200 мг/кг) не проявляет токсических эффектов и, в соответствии с классификацией токсичности веществ, относятся к IV классу токсичности (малотоксичные вещества).

2.63 Противоопухолевая активность препарата на модели солидной опухоли меланома

В16

Противоопухолевая активность разработанного состава препарата изучалась в ходе проведения лабораторных медико-биологических экспериментов на экспериментально перевиваемой мышам меланомы В-16.

Показано, что, спустя 11 суток после окончания курса терапии, на 21-е сутки после перевивки мышам опухоли, препарат в виде геля или сиропа оказывает устойчивое противоопухолевое действие, сохраняющееся на уровне 55-60%.

Средняя продолжительность жизни животных, принимавших препарат, увеличилась по сравнению с группой интактного контроля соответственно на 117% и 109,5%.

В результате совместного применения препарата в виде геля и сиропа и известного цитостатика циклофосфан (ЦФ) показано торможение роста опухоли меланома В-16, изменяющееся в пределах от 70% до 96% по сравнению с нелеченным интактным контролем. Например, при испытании детоксикационного препарата в виде сиропа с ЦФ средний объем опухоли у мышей этой группы по сравнению с интактным контролем уменьшился в 23 раза.

Обобщая результаты изучения эффективности сочетанного применения препарата в виде сиропа в дозе 100 мг/кг в течение первых 10 суток и ЦФ в дозе 50 мг/кг однократно, в первые сутки после перепрививки опухоли, можно заключить, что такая схема практически приводит к полному ингибированию роста опухоли по сравнению с интактным нелеченным контролем, не снижая при этом противоопухолевого действия цитостатика.

Более того, необходимо подчеркнуть, что обладая детоксицирующим действием, разработанный препарат существенным образом улучшает клиническую картину «качества жизни» животных (активность, внешний вид, состояние шерсти, поведенческие реакции, масса тела, отсутствие диареи) по сравнению с животными, получавшими только циклофосфан, а также по сравнению с нелечеными мышами интактного контроля.

2.6.4 Действие препарата и отдельных его фракций на прогрессию днслипидемии, индуцированной атерогенной диетой

У белых беспородных лабораторных половозрелых крыс (самцов) с исходной массой тела 300-350 г индуцировали стеатоз с помощью высококалорийной (атерогенной) диеты (АД). За развитием патологии следили по гистологическим и биохимическим показателям.

На субклеточном уровне ответ печени анализировали методом электронной микроскопии. Для трансмиссионной электронной микроскопии образцы тканей фиксировали 2,5%-м раствором глутарового альдегида на буфере Зеренсена или какодилатном буфере в течение минимум 60 минут. Далее образцы заключали в эпон согласно процедуре, включающей обезвоживание в серии спиртов повышающейся концентрации, в ацетоне, пропитку в трех сменах смеси эпон-ацетон с повышающейся долей эпона и полимеризацию при 60СС в течение как минимум 48 часов.

Ультратонкие срезы толщиной 60-100 нм получали на ультрамикротоме Reichert Jung Ultracut Е с использованием стеклянных ножей. Материал на срезах контрастировали водным 1% р-ром ацетата урана 30 минут и реактивом Рейнольдса 10 минут.

Кровь у контрольных и экспериментальных животных забирали методом декапитации.

Кровь центрифугировали и полученную сыворотку использовали для проведения биохимических анализов. Анализы проводились унифицированными методами на биохимическом фотометре «Стат факс 1904+», с использованием стандартных наборов реагентов.

В качестве субстанций, способных корректировать дислипидемию, индуцированную атерогенной диетой, использовали фракции ЭМВ, полученные при разделении материала с использованием хлористого метилена и последующей ВЭЖХ. Полученные при этом фракции обеднены или обогащены ДМИ.

Примененная методика атерогенной диеты вызывает выраженную дислипидемию у крыс и моделирует ситуацию, при которой возникает риск атеросклеротической патологии сосудов. Важно, что индуцированная дислипидемия обратима: после двух недель реабилитации экспериментальных животных уровень липидного обмена возвращается к норме.

Как показали биохимические анализы крови, в группе животных, находившихся на атерогенной диете, наблюдается достоверное повышение содержания общего холестерина, триглицеридов (ТГ), липопротеинов низкой (ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП) и снижается уровень липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). Показано, что все фракции снижают долю общего холестерина и атерогенных липопротеинов (аЛП). При этом наибольшую эффективность показали фракции, обогащенные ДМИ: фракция ХМ (см. 5.1), фракция ХМ + ß-глюкан, и, наконец, фракция, содержащая хроматографически чистый ДМИ.

Установлено, что в крови животных, получавших этот препарат на фоне применения АД, понижается уровень общего ХС на 23%. При этом уровень ТГ понижается на 53% и опускается ниже контрольных значений на 30%, повышается количество ХС ЛПВП на 16%, снижается уровень ХС ЛПНП на 19%, снижается уровень ХС ЛПОНП на 58%. Убедительным свидетельством гиполипедимического действия препарата является значительное снижение индекса атерогенности (ИА) на 38% у животных, которые вместе с высококалорийной диетой получали детоксикационный препарат в виде сиропа.

Экспериментально доказано, что выявленное нами активное начало в виде производного стерола (ДМИ), по крайней мере, в 100 раз эффективнее широко известного ловастатина.

Полученные данные свидетельствуют о том, что фармакологическая субстанция в суточной дозе 100 мг/кг веса животных, обогащенная ДМИ в дозе 2 мкг на 100 мг экстракта, эффективно блокирует дислипидемию экспериментальных животных, индуцированную атерогенной диетой. Так как испытуемые фракции препарата вводили животным после развившейся дислипидемии, речь может идти о лечении патологии, а не о профилактике.

Сравнительный анализ действия изучаемых фракций препарата и Зокора на метаболизм липопротеинов (ЛП) показывает, что ДМИ не блокирует эндогенный синтез холестерина. В то же время метаболизм ЛП нормализуется.

Можно предположить, что ДМИ препятствует проникновению холестерина внутрь гепатоцитов, блокируя рецепторы ЛПНП. Другая (но не альтернативная) гипотеза - ДМИ блокирует всасывание холестерина в клетках эпителия тонкого кишечника.

Важно отметить, что для практики не принципиально, каков механизм действия ДМИ -прямой или опосредованный. Существенно то, что при некоторых патологиях ДМИ можно использовать как прямое лекарственное средство.

2.6.5 Технологический комплекс, обеспечивающий промышленное производство лекарственного препарата-адаптогена с полифункциональной медико-биологической активностью

Для получения лекарственного препарата-адаптогена созданы два технологических комплекса (ТК) - по производству фармакологической субстанции и по производству лекарственного препарата.

ТК по производству фармацевтической субстанции включает в себя: ротационную качалку-инокулятор (РКИ); ферментер (ФР); систему управления (СУ) и обеспечивает промышленное двухстадийное культивирование и переработку мицелия Р1еигошх ойКеаШ 1137 в экстракт, составляющий фармакологическую субстанцию лекарственного препарата.

Технологический процесс производства субстанции включает в себя стадии подготовки производственного процесса и исходного сырья, культивирования и переработки мицелия в глубинной культуре со следующими стандартизованными технологическими циклами: водоподготовка, санитарная подготовка, контроль стерильности процесса производства, приготовление вспомогательных растворов, выращивание посевного материала штамма гриба на агаризованной среде, глубинное культивирование посевного мицелия гриба в качалочных колбах, глубинное культивирование товарного мицелия гриба в ферментере, отделение мицелия от культуральной жидкости, экстракция этанолом, фильтрация нативного раствора, упаривание экстракта, упаковка, маркировка.

Технико-экономическая оценка промышленного производства фармакологической субстанции подтверждает целесообразность создания ТК для ее производства. Проведенный расчет показывает, что себестоимость цикла производства 1,0 кг экстракта фармацевтической субстанции (экстракта мицелия Р/еиго/ия озггеашя 1137) в системе «ротационная качалка (инокулятор) - ферментер (200 л)» составляет 185,5 тысяч рублей. Указанное количество экстракта позволяет изготовить с учетом технологических потерь, не превышающих 5%, 950 единиц лекарственного препарата-адаптогена.

ТК по производству лекарственного препарата включает в себя оборудование для технологических циклов подготовки и производства готовой формы лекарственного препарата-адаптогена.

Разработанные технологические циклы обеспечивают:

- подготовку сгущенного экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137;

- получение экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в виде сиропа, обогащенного дигидрокверцетином;

получение обогащенных фракций, выделенных из первичного экстракта и переработанного мицелия после экстрагирования, соответственно включающие:

- технологии выделения из состава сгущенного экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 первой обогащенной фракции - активного вещества в виде производного стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol (ДМИ);

- технологии выделения из состава переработанного мицелия Pleurotus ostreatus 1137 второй обогащенной фракции - полисахаридаР 1-3 глюкана - и способ его идентификации.

В итоге впервые был разработан и внедрен в практику биотехнологический комплекс, обеспечивающий промышленное производство лекарственного препарата-адаптогена, включающего активное вещество, фармакологическую субстанцию и вспомогательные вещества.

Новизну в технологических схемах биотехнологического комплекса составляют разработанные способы и средства, внедренные в отдельные технологические циклы производства и переработки мицелия.

К таким средствам и способам их применения относятся фильтры для очистки воды и воздуха, комплекты защиты и активизации роста биологических культур, новый класс дезинфицирующих средств на основе наноразмерных частиц коллоидного серебра (Герасименя В.П., Захаров C.B. и др., 2013).

Новизна разработанных способов и средств подтверждена 8 патентами РФ на изобретения, промышленные образцы и полезные модели.

В настоящее время ООО «Инбиофарм» серийно производит экстракт в виде геля и БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН®» в виде сиропа. В период с 2008 года по июль 2014 года выпущено 11 серий общим количеством 12500 упаковок БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН®» в виде сиропа и 3800 упаковок БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН®» в виде геля.

Полученные результаты положены в основу валидации технологического процесса производства экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 для подготовки нормативных документов с целью государственной регистрации фармакологической субстанции разработанного лекарственного препарата.

3 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рассматривая выявленные в работе биологические эффекты фармакологической субстанции и ДМИ, необходимо сделать несколько обобщающих выводов.

На первый взгляд кажется парадоксальным широта спектра биологических ответов на действие фармакологической субстанции и ДМИ, логически трудно связываемых между собой. Эра фундаментальных открытий в области стероидов и их клеточных рецепторов привела к постулату о тонкой настроенности цепочки лиганд (стероидный гормон) —>

рецептор (ядерный белок) —» (ДНК сайт узнавания) —> транскрипция одного гена. В этой цепочке ДМИ, как чрезвычайно деструктированной форме стероида с разрушенным кольцом В, может в лучшем случае отводиться роль антагониста лиганда.

Однако с середины 70-х годов появились первые данные, породившие новую эру - эру исследования негеномного сигнального пути стероидов и их рецепторов. Был обнаружен феномен быстрого клеточного ответа на стероидный гормон, несопоставимый по времени со скоростью включения экспрессии гена и синтеза конкретного белка. Более того, такой быстрый клеточный ответ наблюдался на клетках с полностью репрессированным геномом и даже в клетках, лишенных ядер.

Можно перечислить некоторые примеры такого быстрого сигнального пути стероидных гормонов:

- стрессовые ответы на глюкокортикоиды;

- быстрое действие тироидных гормонов на сердечную деятельность;

- подвижность (миграция) гладкомышечных клеток и остеоцитов под действием витамина О;

- генерация N0 и быстрое уменьшение давления крови под действием тироидных гормонов и половых стероидов.

Сложившаяся на сегодня концепция состоит, коротко, из следующей цепочки событий: лиганд (стероидный гормон) взаимодействует с рецептором, фиксированным на клеточной оболочке. Это происходит на внеклеточных доменах рецептора, изменение конформации которого приводит к активации цитозольного домена рецептора, функции которого сводятся к синтезу цАМФ (и цГМФ). В дальнейшем при участии в-белков происходит активация семейств протеиновых киназ, модифицирующих (с их активацией) группу ферментов, что и приводит к направленной метаболической перестройке клетки. Таким образом, стероидный гормон в данном случае функционирует как триггер, запускающий или выключающий каскад быстрых реакций и приводящий к быстрому выбору потенциально возможного для данного типа клеток ответа.

Многие детали этого нового для нас механизма еще не понятны. Какой рецептор для гормона - тот же, что и ядерный, или другой? Что обеспечивает селективность клеточного ответа?

Особенно интересны два свойства рецепторов: их множественность (несколько десятков тысяч на клеточную мембрану) и отсутствие выраженной тонкой настройки «лиганд - рецептор». В результате один и тот же рецептор в разных клетках может связываться с разными лигандами, например, с эстрогенами и прогестеронами.

В конечном счете, ДМИ может играть роль лиганда для мембранных рецепторов, выступая в одних случаях в качестве агониста, а в других - антагониста гормона. И тогда вырожденность тонкой специфичности акцептора гормона у мембранных рецепторов и их множественность могут обеспечивать полифункциональность аналога стероидных гормонов - ДМИ.

В дальнейшем можно рассчитывать, что дополнительные модификации ДМИ приведут к созданию линейки фармакологически активных препаратов строго направленного действия.

В целом, проведенные в работе исследования по выявлению эффектов действия ДМИ вместе с известными данными литературы позволяют предложить композицию лекарственного препарата-адаптогена, в состав которого, кроме ДМИ, входят компоненты естественного происхождения грибных экстрактов (антиоксиданты, иммуностимуляторы, пробиотики, витамины и т.д.).

Показано, что такой препарат в рекомендованных для применения дозах не обладает токсичностью. Состав препарата сбалансирован таким образом, что позволяет использовать его для снижения токсического действия цитостатиков и других токсических реагентов при лечении тяжелых патологий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предложены следующие документы.

Нормативная документация:

- ТУ 9317-02-87552538-08, «Биологически активная добавка к пище экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН» (сироп)» и технологическая инструкция по ее производству, Свидетельство о гос. регистрации № 77.99.11.003.Е.001319.02.13 от 21.02.2013 г., свидетельство на товарный знак «ОВОДОРИН» № 411708 от 24.06.2009 г.;

- ТУ 9317-01-87552538-08, «Биологически активная добавка к пище экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН» (гель)» и технологическая инструкция по ее производству, Свидетельство о гос. регистрации № 77.99.11.003.Е.001313.02.13 от 21.02.2013 г.;

- ТУ 6398-027-87552538-13 «Комплект защиты и активации роста сельскохозяйственных культур КЗАР «Зеленые Волны» (положительное решение на товарный знак «Зеленые Волны»), Сертификат соответствия № РОСС Яи.АГ75.Н07315 от 29.10.2013 г. Серийный выпуск; руководство по эксплуатации КЗАР «Зеленые Волны» КЗАР.00.000 РЭ;

- ТУ 6398-028-87552538-13 «Комплект защиты и активации роста сельскохозяйственных культур малогабаритный КЗАРМ «Зеленые Волны» (положительное решение на товарный знак «Зеленые Волны»), Сертификат соответствия № РОСС Яи.МЛ 13.Н11812 от 13.02.2013 г. Серийный выпуск; руководство по эксплуатации КЗАРМ «Зеленые Волны» КЗАР.00.000 РЭ;

- ТУ 2499-021-87552538-10 «Препарат серебра в водной дисперсии марки «Аквивон», ТУ 2499-022-87552538-10 «Препарат серебра в водной дисперсии марки «Аквивон-О», ТУ2499-024-87552538-12 «Добавка модифицирующая многофункциональная марки «Аквивон-ТМ» и технологические инструкции по их производству, Дезинфицирующие средства, фильтры для очистки воды и воздуха от токсических примесей и микробиологических загрязнений (свидетельство на товарный знак «Сюита» № 411707 от 24.06.2009 г.);

- ТУ 9185-025-87552538-12 «Концентрат коллоидного серебра в водной дисперсии» и технологическая инструкция по его производству, свидетельство о гос. регистрации № RU.77.99.! 1.003.Е.001866.03.13 от 13.03.2013 г.;

- Комплект нормативной документации на фармакологическую субстанцию «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН®» для внесения в Государственный реестр субстанций из растительного сырья и промышленного производства;

- Комплект нормативной документация на лекарственное средство «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН®» (сироп) для Государственной регистрации в Минздравсоцразвития и промышленного производства.

Пособия: Пособие для врачей по применению ЭМВ «ОВОДОРИН» для коррекции лекарственной непереносимости в комплексном лечении больных туберкулезом легких. Рекомендовано Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для системы послевузовского профессионального образования врачей № УМО-17-28/6Ю 25.11.10.

ВЫВОДЫ

1. Создана технология получения лекарственного препарата-адаптогена на основе экстракта мицелия вешенки (ЭМВ), которая включает:

- технологию двухстадийного промышленного культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в глубинной культуре в системе «ротационная качалка (инокулятор) -ферментер с механическим перемешиванием среды»;

- оптимизацию методов культивирования и экстракции мицелия с постоянным составом биологически активных веществ для направленного фракционирования компонентов, обладающих терапевтическим действием;

- усовершенствованные методы выделения, очистки и идентификации активного вещества экстракта

2. На модели перевиваемых клеток Vero установлено, что цитотоксичность (ЦД50) ЭМВ проявляется при его концентрации 16,7 мг/мл. В низких дозах (50 и 100 мкг/мл) ЭМВ при его индивидуальном использовании не обладает апоптогенным и выраженным цитотоксическим действием. В экспериментах по сочетанному применению с высокотоксичными лекарственными препаратами впервые обнаружен феномен синергетического действия ЭМВ, приводящий к усилению цитостатического действия на трансформированные клетки.

3. На моделях трансформированных клеток HeLa и нормальных фибробластов при индивидуальном и сочетанном применении с цитостатиками установлено, что «первичной» мишенью действия ЭМВ являются плазматические мембраны трансформированных клеток.

4. На моделях различных форм нозологий (гиперлипидемия, гепатит, экспериментальный стеатоз, перевиваемые опухоли, туберкулез) показано, что ЭМВ нормализует состав крови у животных, получавших цитостатики, вызывает регрессию опухолей у экспериментальных животных, обладает антигиперлипидемическим и гепатопротекторным действием, помогает купировать лекарственную непереносимость при туберкулезе.

5. Анализ биологических свойств ЭМВ позволил определить направления его применения в ветеринарии. Показана эффективность применения экстракта мицелия вешенки в животноводстве при острых и хронических отравлениях животных, для выведения радионуклидов, попадающих в организм из окружающей среды в том числе с пищей и водой, а также при племенной работе для улучшения структурно-функциональных характеристик глубокозамороженной спермы. ЭМВ предложено применять при высоких токсических нагрузках на организм животных и при лечении инфекционных и паразитарных заболеваний.

6. Разработан метод фракционирования ЭМВ - полупрепаративное фракционирование хлористым метиленом. Выявлено два главных компонента, отличающихся по гидрофобности и обладающих апоптотической активностью. Для дальнейшего фракционирования выбран экстракт, обладающий выраженной апоптогенной активностью.

7. Из ЭМВ выделено и идентифицировано активное вещество и определена его молекулярная масса, равная 332,2452 дальтон.

Установлена брутто-формула активного вещества С21Н32О3 и структурная формула с точностью, до стереохимии. Выделенное вещество (4-Иус1гоху-17К-теЛуНпи81его1) получило название - дезметилинцистерол (ДМИ).

8. Проведено изучение фармакологической активности ДМИ в экспериментах на культуре клеток НеЬа. Показано, что ДМИ обладает выраженной апоптогенной активностью в трансформированных культивируемых клетках и синергизмом действия с цитостатиками.

9. На модели перевиваемой мышам меланомы В-16 показано, что фракция, обогащенная ДМИ, блокирует развитие опухоли и снижает смертность в экспериментальной группе.

10. На модели стеатоза, индуцированого атерогенной диетой у подопытных крыс, введение ДМИ блокирует развитие дислипидемии и нормализует морфологические показатели печени.

И. Теоретически и экспериментально обоснован и предложен состав инновационного лекарственного препарата-адаптогена на основе компонентов экстрактов мицелия Р1еигоШ5 о$1геаш$ 1137, обладающего полифункциональной медико-биологической активностью. Предлагаемая область применения - препарат «сопровождения», относящийся к фармакологической группе лекарственных средств «Общетонизирующие средства и адаптогены», применяемых при химиотерапии ряда тяжелых патологий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Список научных публикаций в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ

1. Захаров C.B. Очистка питьевой воды хемосорбционными волокнистыми материалами ВИОН / С.В.Захаров, М.П.Зверев // Экология и промышленность России. - Ноябрь, 1997. - С. 18-20.

2. Абдулхакова 3.3. Хемосорбция токсичных примесей из газовоздушной среды / З.З.Абдулхакова, С.В.Захаров, М.П.Зверев // Экология и промышленность России. -Май, 1998,- С. 11-15.

3. Белобородое В.Л. Хемосорбционные волокна - материал медико-гигиенического назначения / В.Л.Белобородов, Х.З.Гафаров, С.В.Захаров, М.П.Зверев, Ш.С.Каратай, В.Е.Крылов // Экология и промышленность России.- Ноябрь, 1998. - С. 4-7.

4. Жуков A.A. Очистка промстоков гальванических производств / А.А.Жуков, Л.В.Жолобова, Н.П.Кузнецов, С.В.Захаров, М.П.Зверев // Экология и промышленность России, Февраль, 1998.-С. 17-19.

5. Костина Т.Ф. Получение и свойства биоцидных волокнистых материалов / Т.Ф.Костина, М.П.Зверев, В.М.Славянский, С.В.Захаров // Химические волокна. -1999. - №6. - С. 37-38.

6. Абдулхакова 3.3. Биоцидные волокнистые материалы / З.З.Абдулхакова, С.В.Захаров, М.П.Зверев, Т.Ф.Костина, В.М.Славянский // Экология и промышленность России. -Ноябрь, 2000. - С. 11-13.

7. Кукушкина Л.Л. Улавливание оксидов азота волокнистым хемосорбентом / Л.Л.Кукушкина, З.З.Абдулхакова, С.В.Захаров, М.П.Зверев // Экология и промышленность России. - Апрель, 2001. - С. 9-10.

8. Евдокимов В.В. Антиоксидантная терапия при сниженной фертильности у мужчин / В.В.Евдокимов, М.Н.Коршунов, Е.С.Коршунова, Д.Т.Айбятов, Э.З.Рабинович,

B.П.Герасименя, С.В.Захаров // Экспериментальная и клиническая урология. - 2010. -№ 4. - С. 38-42.

9. Поляков В.Ю. Гепатопротекторное действие препарата на основе экстракта мицелия вешенки при развитии экспериментального стеатоза печени / В.Ю.Поляков,

C.А.Голышев, Г.И.Кирьянов, Е.А.Арифулин, В.П. Герасименя, С.В.Захаров, К.З.Гумаргалиева, Ю.Л.Путырский // Биологические мембраны. - 2011, - том 28, -№ 4. - С. 1-7.

10. Герасименя В.П. Кинетический метод оценки микробиологической активности наноструктурных частиц серебра / В.П.Герасименя, К.З.Гумаргалиева, С.В.Захаров, И.Г.Калинина, С.А.Семенов, Д.Р.Хузаханова, Г.Е.Зайков // Вестник Казанского технологического университета. - 2013. -Том 16, - №17. - С. 185-191.

Монографии

11. Герасименя В.П. Инновационные биотехнологии промышленного культивирования грибов Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm, используемых в фармацевтической практике для создания медицинских препаратов: монография / В.П.Герасименя, С.В.Захаров,

B.М.Брусникин, М.А.Клыков, Л.П.Семашева; под ред. В.П.Герасимени, В.Ю.Полякова.

- М.: Институт химической физики им. Н.Н.Семенова РАН, ООО «Инбиофарм»,2013.-212 с.

12. Герасименя В.П. Экстракты базидиальных грибов и их полифункциональная медико-биологическая активность: монография / В.П.Герасименя, К.З.Гумаргалиева,

C.В.Захаров, Т.И.Милевич, А.В.Трезвова; под ред. В.П.Герасимени, В.Ю.Полякова.-М.: Институт химической физики им. Н.Н.Семенова, ООО «Инбиофарм», 2014. - 128 с.

Патенты на изобретения и полезные модели

13. Патент РФ на изобретение № 2069641 от 09.11.93 г. Способ очистки питьевой воды и способ получения бактерицидного средства для очистки воды (варианты). Альтов А.Д., Андрияшин А.И., Захаров C.B., Зверев М.П., Костина Т.Ф., Маслюков А.П., Орлов А.Е., Половихина Л.А., Рахманин Ю.А., Сапрыкин В.В. Опубликован 27.11.1996 г. -Бюл. № 33.

14. Патент РФ на изобретение № 2102544 от 28.06.96 г. Способ получения хемосорбционного карбоксилсодержащего волокна. Абдулхакова 3.3., Андрияшин

A.И., Белобородов В.Л., Захаров C.B., Зверев М.П., Костина Т.Ф., Николотов В.В. Опубликован 20.01.1998. - Бюл. № 2.

15. Патент РФ на изобретение № 2108980 от 15.07.97 г. Устройство для очистки воды с озонированием. Петров В.М., Свитский О.Л., Орлов А.Е., Николотов В.В., Болотовский Ю.И., Хайтин М.З., Копылов В.Н., Ананьев М.В., Захаров C.B., Смирнов А.Д., Писаренко A.B. Опубликован 20.04.1998. - Бюл. № 11.

16. Патент РФ на изобретение № 2163829 от 24.05.2000 г. Бытовой фильтр. Егоров Л.Ф., Захаров C.B., Иванов Ю.М., Карташов В.И., Копылов В.Н., Маслюков А.П., Николотов

B.В., Орлов А.Е., Растегаев А.Г., Сапрыкин В.В., Удалов Ю.В., Федотов В.Н. Опубликован 10.03.2001 г. Бюл. № 7.

17. Патент РФ на изобретение № 2236280 от 20.08.2003 г. Бытовой фильтр. Егоров Л.Ф., Захаров C.B., Иванов Ю.М., Копылов В.Н., Карташов В.И., Маслюков А.П., Николотов В.В., Орлов А.Е., Растегаев А.Г., Сапрыкин В.В., Удалов Ю.В., Федотов В.Н. Опубликован 20.09.2004 г. - Бюл. № 26.

18. Патент РФ на полезную модель № 74822 от 12.02.2007 г. Фильтровальный патрон. Захаров C.B., Маслюков А.П., Николотов В.В., Орлов А.Е., Сапрыкин В.В., Удалов Ю.В., Ганиев К.Ж., Карташов В.И. Опубликован 20.07.2008 г. - Бюл. № 20.

19. Патент РФ на изобретение № 2367500 от 22.02.2008 г. Модульное устройство для очистки воды. Ганиев К.Ж., Захаров C.B., Иванов Ю.М., Маслюков А.П., Николотов В.В., Орлов А.Е., Сапрыкин В.В. Опубликован 20.09.2009 г. - Бюл. № 26.

20. Патент РФ на изобретение № 2394668 от 19.12.2008 г. Способ получения наноструктурных металлических частиц. Герасименя В.П., Захаров C.B., Клыков М.А., Николотов В.В. Опубликован 27.09.2010 г. - Бюл. № 27.

21. Патент РФ на изобретение № 2400286 от 13.03.2009 г. Фильтрующий материал для очистки жидких и газообразных веществ и способ его получения. Герасименя В.П., Захаров C.B., Клыков М.А., Николотов В.В., Брусникин В.М. Опубликован 20.07.2010 г.

- Бюл. № 20.

22. Патент РФ на полезную модель № 87098 от 2.06.2009 г. Фильтр очистки воздуха от токсических примесей и микробиологических загрязнений. Герасименя В.П. Захаров C.B., Клыков М.А. Николотов В.В., Брусникин В.М. Опубликован 27.09.2010 г. - Бюл. №27.

23. Патент РФ на изобретение № 2422151 от 17.03.2010 г. Препарат на основе гриба Pleurotus 1137, влияющий на мужскую репродуктивную функцию. Герасименя В.П., Аполихин О.И., Захаров C.B., Сивков A.B., Евдокимов В.В., Рабинович Э.З., Трезвова A.B. Опубликован 27.06.2011 г. - Бюл. № 18.

24. Патент РФ на изобретение № 2435599 от 21.07.2010 г. Препарат 4-hydroxy-17R-methylincisterol, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма гриба Pleurotus 1137 для его получения. Герасименя В.П., Захаров C.B., Кирьянов Г.И., Поляков В.Ю., Т ашлицкий В.Н. Опубликован 10.12.2011 г. - Бюл. № 34.

25. Патент РФ на изобретение №2435600 от 23.08.2010 г. Препарат на основе гриба Pleurotus 1137 для коррекции лекарственной непереносимости в комплексной терапии туберкулеза легких. Герасименя В.П., Захаров C.B., Карпина H.JL, Ерохина М.В., Григорьева В.Н., Трезвова A.B. Опубликован 10.12.2011 г.- Бюл. № 34.

26. Патент РФ на изобретение № 2472567 от 08.08.2011 г. Фильтровальный патрон бытового фильтра для очистки питьевой воды. Ганиев К.Ж., Захаров C.B., Маслюков А.П., Маслюков В.А., Николотов В.В., Растегаев А.Г., Сапрыкин В.В. Опубликован 20.01.2013 г.-Бюл. №2.

27. Патент РФ на изобретение № 2477635 от 14.02.2012 г. Способ получения инцистерола. Кирьянов Г.И., Герасименя В.П., Захаров C.B., Ташлицкий В.Н., Кинцурашвили JI.H., Поляков В.Ю. Опубликован 20.03.2013 г. - Бюл. № 8.

28. Патент РФ на изобретение № 2487930 от 19.06.2012 г. Препарат с полифункциональной медико-биологической активностью, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма гриба Pleurotus ostreatus ВКПМ F-819 для его получения. Герасименя В.П., Захаров C.B., Кирьянов Г.И., Поляков В.Ю. Опубликован 20.07.2013 г. - Бюл. № 20.

Список научных публикаций в других изданиях

29. Маслюков А.П. Портативные водоочистители нового поколения - биофильтры БИП-1 и Барьер-3 / А.П.Маслюков, Ю.А Рахманин, В.В.Сапрыкин, А.Е.Орлов, С.В.Захаров // Материалы Международного конгресса «Вода. Экология и технология», Москва, 6-9 сентября 1994 года, Том 2, С. 495-497.

30. Захаров C.B. Барьер-3 и БИП-1: суперфильтры для обеззараживания и очистки воды из пресноводных источников / С.В.Захаров, В.В,Николотов, В.В.Сапрыкин, А.Е.Орлов., А.П.Маслюков, Ю.А.Рахманин // Сборник докладов международной научно-технической конференции «Вода, которую мы пьём», 1-4 марта 1995 года, Москва. - С. 119-120.

31. Захаров C.B. Актуальные проблемы электродинамики биообъектов / С.В.Захаров, С.В.Королев // Электродинамика и техника СВЧ, КВЧ и оптических частот.- 2002, т. 10, №3 (35). - С. 84-85.

32. Захаров C.B. Влияние полей формы на развитие биообъектов / С.В.Захаров, С.В.Королев // Электродинамика и техника СВЧ, КВЧ и оптических частот. - 2002, т. 10, №3 (35). - С. 86.

33. Зверев М.П Хемосорбционные волокна - материалы для защиты среды обитания от вредных выбросов / М.П.Зверев, С.В.Захаров // Труды 1-й международной научно-практической конференции «Защита окружающей среды, здоровье, безопасность в сварочном производстве», 11-13 сентября 2002 г.- г. Одесса. - С. 296-304.

34. Герасименя В.П. Гиполипидемические свойства экстракта мицелия вешенки. Экспериментальные и клинические исследования / В.П.Герасименя, З.Ш.Голевцева, С.В.Захаров, А.Е.Орлов, Э.З.Рабинович, А.В.Трезвова, Л.М.Шаповалова: информационные материалы. Выпуск 3. -М.: изд. ООО «Инбиофарм», 2009. - 18 с.

35. Герасименя В.П. Гепатопротекторные свойства экстракта мицелия вешенки. Экспериментальные и клинические исследования / В.П. Герасименя, С.В.Захаров, А.Е.Орлов, Э.З.Рабинович, А.В.Трезвова, Л.М.Шаповалова: информационные материалы. Выпуск 2. М.: изд. ООО «Инбиофарм», 2009. - 22 с.

36. Герасименя В.П. Противоопухолевое действие экстракта мицелия вешенки. Экспериментальные и клинические исследования / В.П.Герасименя, Л.А.Путырский, З.Ш.Голевцева, С.В.Захаров, Г.И.Кирьянов, В.Ю.Поляков, А.Е.Орлов, Э.З.Рабинович,

A.В.Трезвова, Л.М.Шаповалова: информационные материалы. Выпуск 3. М.: изд. ООО «Инбиофарм», 2009. - 42 с.

37. Герасименя В.П. Наноструктурные частицы серебра - основа модернизации существующих, разработки и создания нового поколения средств полевого водообеспечения / В.П.Герасименя, С.В.Захаров, Д.А.Кошель, М.А.Клыков // НТС № 36, ВУНЦ (ОВА) ВС РФ. 2010. - С. 13-17.

38. Герасименя В.П. Новое поколение фильтров комплексной очистки воздуха в замкнутых объемах сооружений на основе катализатора из наноструктурных частиц серебра / В.П.Герасименя, С.В.Захаров, A.A. Настецкий, М.А.Клыков // НТС № 36, ВУНЦ (ОВА) ВС РФ. - 2010. - С. 17-28.

39. Герасименя В.П. О перспективах разработки и создания новых технологий и средств комплексной очистки воздуха в замкнутых объемах сооружений с использованием слабого электромагнитного излучения / В.П.Герасименя, С.В.Захаров, А.А.Настецкий, Н.Н.Костюнин // НТС № 36, ВУНЦ (ОВА) ВС РФ. - 2010. - С. 28-32.

40. Ерохин В.В. Применение БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН» для коррекции лекарственной непереносимости в комплексном лечении больных туберкулезом легких: пособие для врачей / В.В.Ерохин, Н.П.Карпина, И.А.Васильева, Ю.Е.Коссий, М.В.Ерохина, В.П.Герасименя, С.В.Захаров, А.В.Трезвова,

B.Н.Григорьева. - М.: Минздравсоцразвития РФ, ЦНИИ туберкулеза РАМН, ООО «Инбиофарм», 2010. - 21 с.

41. Герасименя В.П. Роль и значение нового полифункционального препарата «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН» в сопровождении комплексной терапии онкологических заболеваний / В.П.Герасименя, Л.А.Путырский, С.В.Захаров, В.Ю.Поляков, Г.И.Кирьянов, К.З.Гумаргалиева, Ю.Л.Путырский, Т.И.Милевич: аналитический обзор. - М.: изд. ООО «Инбиофарм», 2010. - 34 с.

42. Евдокимов В.В. Коррекция патоспермии антиоксидантами in vitro и in vivo: тезисы докладов / В.В.Евдокимов, A.B.Сивков, Е.С.Коршунова, М.Н.Коршунов, В.П.Герасименя, С.В.Захаров, Э.З.Рабинович // Материалы XX ежегодной международной конференции Российской Ассоциации Репродукции Человека

«Репродуктивные технологии сегодня и завтра», Нижний Новгород, 6-8 сентября. -2010.-С. 65-66.

43. Милевич Т.И. Радиозащитный эффект препаратов вешенки после воздействия гамма -излучения: тезисы докладов / Т.И.Милевич, Е.Ф.Конопля, В.П.Герасименя, С.В.Захаров, Л.А.Путырский, Ю.Л.Путырский // Материалы международной научной конференции, Гомель, 14-15 октября. - 2010. - С. 69-70.

44. Милевич Т.И. Влияние препаратов, полученных из мицелия и плодовых тел Pleurotus ostreatus, на пострадиационные нарушения иммунитета у животных: тезисы докладов / Т.И.Милевич, Е.Ф.Конопля, В.П.Герасименя, С.В.Захаров, Л.А.Путырский, Ю.Л.Путырский И Материалы VI съезда по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность). 25 лет с момента аварии на Чернобыльской АЭС, 25-28 октября. - М. - 2010. - С. 233.

45. Герасименя В.П. О новом поколении препарата серебра в водной дисперсии марки «АКВИВОН» и его применении в качестве экологически безопасного дезинфицирующего средства специальной техники и среды обитания человека / В.П.Герасименя, С.В.Захаров, М.А.Клыков // Сборник Научных трудов сотрудников ФБУ «3 ЦНИИ Минобороны России», изд. МО РФ ФБУ «3 ЦНИИ Минобороны России».-2011.-С. 48-53.

46. Герасименя В.П. Каталитическая очистка воздуха в замкнутых объемах сооружений от токсических примесей и микробиологических загрязнений в плазмоподобных средах, формируемых на фильтрующих материалах наноструктурными частицами серебра /

B.П.Герасименя, С.В.Захаров, М.А.Клыков, Н.Н.Костюнин, В.М.Брусникин // Сборник Научных трудов сотрудников ФБУ «3 ЦНИИ Минобороны России», изд. МО РФ ФБУ «3 ЦНИИ Минобороны России». - 2011. - С. 67-76.

47. Герасименя В.П. Каталитическая очистка воды от микробиологических загрязнений в плазмоподобных средах, формируемых на активированных углях наноструктурными частицами серебра / В.П.Герасименя, С.В.Захаров, М.А.Клыков, Н.Н.Костюнин // Сборник Научных трудов сотрудников ФБУ «3 ЦНИИ Минобороны России», изд. МО РФ ФБУ «3 ЦНИИ Минобороны России». - 2011. - С. 111-115.

48. Милевич Т.И. Перспективы использования КЗАР «Аэротон» при хранении овощей: тезисы докладов / Т.И.Милевич, В.П.Герасименя, С.В.Захаров // Материалы XI-й Междунар. науч. конф. «Сахаровские чтения 2011. Экологические проблемы XXI века» (19-20 мая 2011, г. Минск. Беларусь), Минск. МГЭУ им. А.Д.Сахарова. - 2011. -

C. 257.

49. Милевич Т.И. Мицелий вешенки - основа биотехнологических лечебно-профилактических препаратов нового поколения: тезисы докладов / Т.И. Милевич,

A.Д.Наумов, В.П.Герасименя, С.В.Захаров, К.З.Гумаргалиева, Л.А.Путырский, Ю.Л.Путырский // Материалы Международной научно-практической конференции «Инновации как продукт и инструмент предпринимательства. Предложения и технологии коммерциализации», Гомель, 21-22 июня. - 2011. - С. 77-79.

50. Милевич Т.И. Оценка радиозащитных свойств экстракта из мицелия базидиального гриба в условиях внешнего хронического облучения: тезисы докладов / Т.И.Милевич,

B.П.Герасименя, С.В.Захаров, Ю.Л.Путырский // Материалы международной научной конференции «Радиация и Чернобыль, Наука и практика», 13-14 октября. - Минск: Институт радиологии. - 2011. - С. 112-114.

51. Герасименя В.П. «Оводорин» - новый полифункциональный препарат в сопровождении комплексной терапии онкологических заболеваний: тезисы доклада / В.П.Герасименя, Т.И.Милевич, С.В.Захаров, В.Ю.Поляков, Г.И.Кирьянов, Л.А.Путырский, Ю.Л.Путырский, А.Д.Наумов, К.З.Гумаргалиева, М.М.Сачек // Труды IV Съезда онкологов Беларуси. - Минск, 2011. - С. 2.

52. Милевич Т.И. Радиозащитные свойства веществ природного происхождения на основе базидиомицетов / Т.И.Милевич, Е.Ф.Конопля, В.П.Герасименя, С.В.Захаров, Л.А.Путырский, Ю.Л.Путырский // Медико-биологические аспекты аварии на ЧАЭС. -2011.-№1-2.-С. 23-28.

53. Герасименя В.П. Противоопухолевая активность экстракта мицелия гриба «вешенка обыкновенная» / В.П.Герасименя, Т.И.Милевич, А.Д.Наумов, С.В.Захаров, В.Ю.Поляков, Г.И.Кирьянов, К.З.Гумаргалиева, Л.А.Путырский, Ю.Л.Путырский, М.М.Сачек // Журнал Здравоохранение.- Минск. - 2012,- № 10. - С. 64-68.

54. Милевич Т.И. Применение препаратов, полученных из мицелия гриба «вешенка обыкновенная», для выведения радионуклидов: тезисы доклада / Т.И.Милевич, В.П.Герасименя, С.В.Захаров, Е.Ф.Конопля, Ю.Л.Путырский // Сборник материалов конференции «Острые проблемы разработки противолучевых средств: консерватизм или модернизация». Москва 13-14 ноября. - 2012. - С. 51.

55. Милевич Т.И. Эффективность препаратов, полученных из мицелия вешенки, в условиях воздействия внешнего гамма-излучения: тезисы доклада / Т.И.Милевич, В.П.Герасименя, С.В.Захаров, К.З.Гумаргалиева // Сборник материалов конференции «Острые проблемы разработки противолучевых средств: консерватизм или модернизация», Москва, 13-14 ноября. - 2012.- С. 50.

56. Gerasimenia V.P. Application of a New Polyfunctional Preparation "Oyster Mushroom Mycelium Extract 'Ovodorin®'" to the Correction of Drug Intolerance in the Complex Treatment of Oncological Diseases: The Overview of Cytological, Biological and Medical Results / V.P.Gerasimenia, S.V.Zakharov, V.Yu.Polyakov, G.I.Kirianov, K.Z. Gumargalieva, L.A.Putyrskyi, Yu.L.Putyrskyi, and T.I.Milevich // Volume 2 Issue 1. The Overview of Cytological, Biological and Medical Results. 2012. - 48p.

57. Захаров C.B. Разработка технологии глубинного культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819) для получения фармакологической субстанции препарата с полифункциональной медико-биологической активностью / С.В.Захаров // Сборник материалов международной научной конференции и e-симпозиума, Россия, г.Москва, 26-30 июня. -2013. [Электронный ресурс] - С. 6-16. - 1 электрон. Опт. Диск (CD-ROM).

58. Захаров С.В. Инновация в биотехнологии культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в глубинной культуре с наноструктурными частицами серебра / С.В.Захаров // Сборник материалов международной научной конференции и e-симпозиума, Россия, г. Москва, 26-30 июня. -2013. [Электронный ресурс] - С. 17-28. - 1 электрон. Опт. Диск (CD-ROM).

59. Герасименя В.П. Действие экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (фармакологической субстанции) и циклофосфана на гематологические показатели периферической крови здоровых животных / В.П.Герасименя, С.В.Захаров, К.З.Гумаргалиева, Т.И.Милевич // Экстракты мицелия вешенки (Pleurotus ostreatus): медико-биологические эффекты и возможные механизмы действия: сборник статей -М.: Институт химической физики РАН, ООО «Инбиофарм». - 2013. - С. 56-59.

60. Герасименя В.П. Результаты изучения физических параметров и химической структуры наноструктурных частиц коллоидного серебра в водной и органической дисперсиях / В.П.Герасименя, С.В.Захаров, М.А. Клыков // Научно-технический сборник трудов ВУНЦ (ОВА) ВС РФ. 2013. - С. 146-153.

61. Герасименя В.П. Результаты экспериментальных исследований кинетики деструкции токсических примесей в воздушной среде на новом катализаторе из наноструктурных частиц серебра / В.П.Герасименя, С.В.Захаров, М.А.Клыков, В.М.Брусникин // Научно-технический сборник трудов Военно-технического университета - Балашиха: изд. ВТУ. - 2013. -№ 24. - С .93-105.

62. Герасименя В.П. Химический состав экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (фармакологической субстанции) / В.П.Герасименя, С.В.Захаров, Л.П.Семашева, Г.И.Кирьянов // Экстракты мицелия вешенки (Pleurotus ostreatus): медико-биологические эффекты и возможные механизмы действия: сборник статей - М.: Институт химической физики РАН, ООО «Инбиофарм». - 2013. - С. 16-19.

63. Голышев С.А. Действие фракции экстракта мицелия, обогащенной инцистеролом, на цитокинетические параметры культивируемых клеток в условиях модификации клеточных мембран глутаровым альдегидом / С.А.Голышев, Г.И.Кирьянов, Л.Н.Кинцурашвили, С.В.Захаров, В.П.Герасименя, В.Ю.Поляков // Экстракты мицелия вешенки (Pleurotus ostreatus): медико-биологические эффекты и возможные механизмы действия: сборник статей - М.: Институт химической физики РАН, ООО «Инбиофарм». -2013.-С. 146-152.

64. Ерохин В.В. Клиническое изучение действия экстракта мицелия вешенки ОВОДОРИН® сироп на коррекцию лекарственной непереносимости в комплексной терапии туберкулеза легких / В.В.Ерохин, Н.Л.Карпина, И.А.Васильева, Ю.Е.Коссий, М.В.Ерохина, В.П.Герасименя, С.В.Захаров, А.В.Трезвова, В.Н.Григорьева // Экстракты мицелия вешенки (Pleurotus ostreatus): медико-биологические эффекты и возможные механизмы действия: сборник статей - М.: Институт химической физики РАН, ООО «Инбиофарм». - 2013. - С. 93-117.

65. Захаров C.B. Исследование антигипертензивного действия экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (фармакологической субстанции) / С.В.Захаров, В.П.Герасименя // Экстракты мицелия вешенки (Pleurotus ostreatus): медико-биологические эффекты и возможные механизмы действия: сборник статей - М.: Институт химической физики РАН, ООО «Инбиофарм». - 2013. - С. 60-82.

66. Захаров C.B. Действие фракций экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137, обогащенных инцистеролом, на прогрессию дислипидемии, индуцированную атерогенной диетой / С.В.Захаров, Н.В.Перова, В.П.Герасименя, В.Ю.Поляков, Г.И.Кирьянов, Г.А.Духина, Л.П.Семашева, К.З.Гумаргалиева // Экстракты мицелия вешенки (Pleurotus ostreatus): медико-биологические эффекты и возможные механизмы действия: сборник статей - М.: Институт химической физики РАН, ООО «Инбиофарм». -2013.-С. 172-201.

67. Захаров C.B. Изучение противоопухолевой активности экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 у животных на модели солидной опухоли меланома В-16 / С.В.Захаров, В.П.Герасименя, В.Ю.Поляков, Г.И.Кирьянов, Л.П.Семашева, К.З.Гумаргалиева // Экстракты мицелия вешенки (Pleurotus ostreatus)-. медико-биологические эффекты и

возможные механизмы действия: сборник статей - М.: Институт химической физики РАН, ООО «Инбиофарм». - 2013. - С.156-172.

68. Захаров C.B. Полифункциональные свойства экстрактов медицинских грибов / С.В.Захаров // Экстракты мицелия вешенки (Pleurotus ostreatus): медико-биологические эффекты и возможные механизмы действия: сборник статей - М.: Институт химической физики РАН, ООО «Инбиофарм». - 2013. - С. 9-15.

69. Кирьянов Г.И. Определение возможных клеточных мишеней действия экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (фармакологической субстанции) и оптимизация условий его применения в медицинской практике / Г.И.Кирьянов, С.В.Захаров,

B.П.Герасименя, Е.М.Лазарева, М.И.Мурашева, Л.В.Исаева, В.Ю.Поляков // Экстракты мицелия вешенки (Pleurotus ostreatus): медико-биологические эффекты и возможные механизмы действия: сборник статей - М.: Институт химической физики РАН, ООО «Инбиофарм». - 2013. - С. 40-55.

70. Кирьянов Г.И. Фракционирование экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819) / Г.И.Кирьянов, В.Ю.Поляков, В.Н.Ташлицкий, В.А.Носков, Л.Н.Кинцурашвили, С.В.Захаров, В.П.Герасименя // Экстракты мицелия вешенки (Pleurotus ostreatus): медико-биологические эффекты и возможные механизмы действия: сборник статей - М.: Институт химической физики РАН, ООО «Инбиофарм». -2013. - С. 117-129.

71. Кирьянов Г.И. Теоретическое и экспериментальное обоснование композиции полифункционального детоксикационного препарата на основе экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 / Г.И.Кирьянов, В.П.Герасименя, С.В.Захаров, В.Ю.Поляков // Экстракты мицелия вешенки (Pleurotus ostreatus): медико-биологические эффекты и возможные механизмы действия: сборник статей - М.: Институт химической физики РАН, ООО «Инбиофарм». - 2013. - С. 201-212.

72. Климова P.P. Изучение цитотоксического и противовирусного действия экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 на инфекцию, вызванную вирусом простого герпеса, в клеточной системе in vitro / Р.Р.Климова, Е.В.Чичев, С.В.Захаров, В.П.Герасименя, А.А.Кущ // Экстракты мицелия вешенки (Pleurotus ostreatus): медико-биологические эффекты и возможные механизмы действия: сборник статей - М.: Институт химической физики РАН, ООО «Инбиофарм». - 2013. - С. 82-93.

73. Милевич Т.И. Лечебно-профилактические препараты, полученные из Pleurotus ostreatus: тезисы доклада / Т.И.Милевич, А.Д.Наумов, В.П.Герасименя, С.В.Захаров,

C.Н.Сушко // Сборник трудов «Биологически активные вещества растений - изучение и использование: материалы Международной научной конференции», 29-31 мая. -Минск: ГНУ «Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси», 2013. - С. 356.

74. Перова Н.В. Проверка токсичности препарата на основе экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137/ Н.В.Перова, Г.А.Духина, С.В.Захаров, В.П.Герасименя // Экстракты мицелия вешенки (Pleurotus ostreatus): медико-биологические эффекты и возможные механизмы действия: сборник статей - М.: Институт химической физики РАН, ООО «Инбиофарм». - 2013. - С. 153-155.

75. Поляков В.Ю. Действие экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (фармакологической субстанции) на трансформированные и нормальные клетки в системе in vitro / В.Ю.Поляков, С.В.Захаров, В.П.Герасименя, Е.М.Лазарева,

М.И.Мурашева, Л.В.Исаева, Г.И.Кирьянов // Экстракты мицелия вешенки (Р/енгоГи5 медико-биологические эффекты и возможные механизмы действия: сборник статей - М.: Институт химической физики РАН, ООО «Инбиофарм». - 2013. - С. 19-39.

76. Поляков В.Ю. Действие инцистерола на цитокинетические параметры культивируемых клеток / В.Ю.Поляков, Л.Н.Кинцурашвили, М.И.Мурашева, С.В.Захаров,

B.П.Герасименя, Г.И.Кирьянов // Экстракты мицелия вешенки (Р1еигош$ о51геаШ$): медико-биологические эффекты и возможные механизмы действия: сборник статей -М.: Институт химической физики РАН, ООО «Инбиофарм». - 2013. - С. 143-145.

77. Ташлицкий В.Н. Технология выделения из состава экстракта мицелия Р1еигоШ$ оигеаш 1137 действующего вещества и его идентификация / В.Н.Ташлицкий, Г.И.Кирьянов, В.Ю.Поляков, С.В.Захаров, В.П.Герасименя // Экстракты мицелия вешенки (Р1еигоШз о$1геаЫ$у медико-биологические эффекты и возможные механизмы действия: сборник статей - М.: Институт химической физики РАН, ООО «Инбиофарм». -2013.-С. 129-143.

78. Герасименя В.П. Наноструктурные частицы серебра: технология получения, физико-биологические эффекты и возможные механизмы их действия / В.П.Герасименя,

C.В.Захаров, М.А.Клыков, В.М.Брусникин // Все материалы. Энциклопедический справочник,- 2014. - № 8. - С. 24-35.

79. Герасименя В.П. Наноструктурные частицы серебра: технология получения, физико-биологические эффекты и возможные механизмы их действия (продолжение) / В.П.Герасименя, С.В.Захаров, М.А.Клыков, В.М.Брусникин // Все материалы. Энциклопедический справочник.- 2014. - № 9. - С. 32-39.

80. Милевич Т.И. Полифункциональное действие экстракта мицелия Р1еигоШ5 озггеаШз 1137 в условиях радиационного поражения организма животных / Т.И.Милевич, А.Д.Наумов, В.П.Герасименя, С.В.Захаров, А.В.Трезвова // Материалы Международной научной конференции «Радиобиология: антропогенные излучения», г. Гомель, 25-26 сентября 2014 г. - Минск, 2014. - С. 130-132.

81. Милевич Т.И. Результаты применения КЗАР «Зеленые волны» в условиях воздействия ионизирующего излучения на ранней стадии онтогенеза злаковых растений / Т.И.Милевич, А.Д.Наумов, В.П.Герасименя, С.В.Захаров // Тезисы докладов VII съезда по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность). - Москва, 21-24 октября 2014 г. - С. 159.

82. Милевич Т.И. Оценка сорбционных свойств биомассы базидиального гриба «Вешенка обыкновенная» / Т.И.Милевич, А.Д.Наумов, В.П.Герасименя, С.В.Захаров // Тезисы докладов VII съезда по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность). - Москва, 21-24 октября 2014 г. - С. 160.

ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ЭМВ - экстракт мицелия вешенки ДМИ - дезметилинцистерол НД - нормативная документация ЦФ - циклофосфан

ВКПМ - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

БАД - биологически активная добавка

БАВ - биологически активное вещество

ТУ - технические условия

ТИ - технологическая инструкция

ЯМР - ядерно-магнитный резонанс

УФ - ультрафиолетовый

ХС - холестерин

ТГ - триглицериды

ЛП - липопротеины

ЛПНП - липопротеины низкой плотности ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности ЛПВП - липопротеины высокой плотности аЛП - атерогенные липопротеины АД - атерогенная диета ИА - индекс атерогенности СПЭВ - линия клеток почки эмбриона свиньи ККС - концентрат коллоидного серебра

pH - концентрация водородных ионов, «водородный» показатель HeLa - линия трансформированных опухолевых клеток человека Vero - клетки эпителия почки африканской зелёной мартышки DMEM - питательная среда (Dulbecco's modified Eagle's medium) ЦД50 - 50%-я цитотоксическая доза ТРО - торможение роста опухоли Дт - продолжительность жизни животных ХМ - хлористый метилен

ВЭЖХ - высокоэффектиная жидкостная хроматография

UPLC/MS - метод сверхпроизводительной жидкостной хроматографии/ масс-спектрометрии

TOF - время-пролетная масс-спектрометрия

TNF - группа клеточных рецепторов в виде структурно-родственных

трансмембранных белков

ТК - технологический комплекс

РКИ - ротационная качалка-инокулятор

ФР - ферментер

СУ - система управления

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат, производное аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) цГМФ - циклический гуанизинмонофосфат

Подписано в печать 06.01.2015г Усл.п.л. -1.5 Заказ №25220 Тираж 120 экз

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12. (495)542-7389 www.chertez.ru