Генетическое разнообразие и анализ количественных признаков грибов рода Pleurotus

Сиволапова, Анастасия Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетическое разнообразие и анализ количественных признаков грибов рода Pleurotus
ВАК РФ 03.02.12, Микология

Автореферат диссертации по теме "Генетическое разнообразие и анализ количественных признаков грибов рода Pleurotus"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

на правах рукописи

Сиволапова Анастасия Борисовна

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И АНАЛИЗ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ПРИЗНАКОВ ГРИБОВ РОДА РЬЕШОТиЗ

Специальность 03.02.12 - микология, 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 6 МАЙ 2013

Москва, 2013

005057977

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова, а также в лаборатории микологии университета г. Вагенинген, Нидерланды

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Шнырева Алла Викторовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Наумова Елена Сергеевна

доктор биологических наук, профессор Громовых Татьяна Ильинична

Ведущая организация: Ботанический институт

им. В. Л. Комарова РАН

Защита диссертации состоится 17 мая 2013 года в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, тел./факс: 8(495)939-39-70

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан апреля 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

М. А. Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Грибы съедобного культивируемого рода Pleurotus, относящиеся к отделу Basidiomycota, давно привлекли к себе интерес со стороны производителей, благодаря своим прекрасным вкусовым качествам, относительной простоте культивирования, а также благодаря богатому набору биологически активных веществ, перспективных для использования в фармакологии. В настоящее время, в связи с развитием биотехнологических подходов к культивированию грибов, стало возможным создание современной индустриальной отрасли, занимающейся производством лекарственных препаратов на основе базидиомицетов (Краснопольская, 1998).

Кроме того, в последнее время все чаще предлагается использовать грибы рода Pleurotus в процессах биологической переработки отходов сельского хозяйства, а также бумажного и текстильного производств в силу того, что эти грибы обладают комплексом лигнинолитических ферментов. Самым распространенным культивируемым видом является вешенка устричная (обыкновенная) - P. ostreatus, однако в настоящее время производители все чаще стараются ввести в культуру более экзотичные виды вешенок, такие как P. djamor или P. sajor-caju. Эти виды привлекли внимание благодаря своей способности к плодоношению в условиях повышенных температур.

Несмотря на повышенный интерес к грибам рода Pleurotus, в России работа по маркированию, улучшению и введению новых штаммов в культуру практически не ведется. Для успешного промышленного культивирования грибов необходимо также иметь штаммы с хорошей и стабильной урожайностью, поэтому анализ количественных признаков (QTL, quantitative trait loci), ответственных за продуктивность и качество плодовых тел является важной как практической, так и теоретической задачей.

Цель работы - изучение генетического разнообразия различных видов и штаммов рода Pleurotus, оценка их урожайности и сравнительная характеристика скорости вегетативного мицелиального роста, а также поиск генетических маркеров хозяйственно полезных признаков для вида Р. ostreatus.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. оценить урожайность культивируемых штаммов P. sajor-caju, P. djamor и Р. ostreatus и подобрать наиболее перспективные субстраты и условия для плодоношения этих видов;

2. провести генотипирование 17 штаммов, относящихся к 6 видам вешенки -P. ostreatus, P. pulmonarius, P. djamor, P. sajor-caju, P. eryngii и P. calyptratus;

3. подтвердить таксономический статус P. sajor-caju;

4. построить подробную генетическую карту P. ostreatus на основе SNP-маркеров для анализа локусов количественных признаков;

5. провести маркирование и анализ локусов количественных признаков Р. ostreatus, таких как урожайность, скорость мицелиального роста, цвет шляпки плодового тела;

6. определить типы спаривания штаммов экспериментальной гибридной ВКК-популяции P. ostreatus и установить положение локусов типов спаривания P. ostreatus на генетической карте.

Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе настоящей работы была проведена оценка генетического разнообразия культивируемых видов и штаммов рода вешенка, а также разрешен вопрос о таксономическом статусе вида Р. sajor-caju (Fr.) Singer, прежде вызывавший множество споров среди микологов.

Впервые была получена подробная генетическая карта P. ostreatus с плотностью молекулярных маркеров, достаточной для эффективного поиска локусов количественных признаков данного гриба. Впервые были выявлены и проанализированы локусы количественных признаков, ответственных за скорость вегетативного роста дикариотического мицелия вешенки обыкновенной, а также найдены генетические области, контролирующие цвет шляпки плодовых тел Р. ostreatus, и области, оказывающие влияние на продуктивность штаммов.

Результаты данного исследования имеют практическую значимость, прежде всего, для селекционеров, которые занимаются выведением новых коммерческих сортов видов рода вешенка.

(Москва, 2008); 2-ом Съезде микологов России (Москва, 2008); на Международном конгрессе «XVI Congress of European Mycologists» (Халкидики, Греция, 2011), на XII Международной молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2012), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012» (Москва, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 3 — статьи в журналах из списка рекомендованных ВАК, 6 - материалы конференций.

Структура и объем диссертации. Текст диссертации изложен на 102 страницах, состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Список литературы включает 94 источника, из них 84 на английском языке. Приложение содержит 6 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе представлена информация о морфологии, распространению, систематике изучаемых в работе видов рода Pleurotus. Рассмотрены перспективы использования грибов рода вешенка в фармакологии и в переработке производственных отходов биологического происхождения. Представлен краткий обзор методов изучения генетического разнообразия видов, а также методов поиска маркеров количественных признаков.

Объекты и методы исследования

При выполнении работы по изучению генетического разнообразия рода вешенка были исследованы 6 видов, включающие 17 штаммов рода Pleurotus из коллекции кафедры микологии и альгологии МГУ. Для исследования количественных признаков были использованы дополнительно 6 коммерческих монокариотических штаммов вешенки, полученных из коллекции Университета Вагенингена, а также 202 монокариотических штамма P. ostreatus, полученные в ходе работы. Список штаммов приведен в таблице 1.

Культивирование грибов проводили на сусло-агаре и среде Эгер при температуре 25° С.

Вид Штамм Характертистика и происхождение

P. djamor Z1 Выделен из производственного штамма, Россия

H Выделен из производственного штамма, Россия

КОР Коммерческий штамм, фирма Sylvan

P. sajor-caju CS-32 Культивируемый сорт, Northwest Mycological Consultans, USA

P. pulmonarius 06-1 Природный изолят, Моск. обл.

А8ш5 Монокариотический штамм

27.4 Производственный штамм

Р. osíreatus BP Природный изолят, Моск. обл.

PIO Сорт Мичиган

Don Производственный штамм

38-45 Природный изолят, Моск. обл.

Р9 Сорт Флорида

Pli Сорт Мичиган

38d Природный изолят, Моск. обл.

55ml 1 Монокариотический штамм

P001-15* Протоклон коллекционного штамма АТСС58937

EP-25* Протоклон коллекционного штамма АТСС58937

EP-57* Коммерческий монокариотический штамм

G24* Коммерческий монокариотический штамм

P24* Коммерческий монокариотический штамм

P. eryngii P13 Дикариотический штамм

3-1 Дикариотический штамм

P. calyptratus C2 Природный изолят, Моск. обл.

* - данные штаммы были получены из коллекции Университета Вагенингена (Нидерланды). Остальные штаммы были получены из коллекции кафедры микологии и альгологии биологического факльтета МГУ им. М. В. Ломоносова.

В качестве субстратов для получения плодовых тел P. djamor и P. sajor-caju использовали лузгу, отходы хлопкового производства, измельченную древесину фикуса (Ficus triangulis) и бамбука (Bambusa sp.). Для оценки урожайности при получении плодовых тел P. djamor и P. sajor-caju использовали полипропиленовые пакеты с лузгой весом 120 г. Для каждого штамма (P. djamor H, ZI, КОР и P. sajor-caju CS-32) опыт проводили в четырех повторностях. Отмечали время появления примордиев, зрелых плодовых тел и их количество на 1 мешок.

Определение факторов половой совместимости и получение гаплоидных штаммов-тестеров проводили по стандартной методике (Eger, 1978).

Для оценки генетического разнообразия видов и штаммов рода Pleurotus использовали стандартные подходы, основанные на изучении спейсерного участка

кластера рибосомальных генов 1Т81-5,88-1Т82. В работе были использованы следующие комбинации праймеров: 1Т81-1Т84; 1Т81Р-1Т84В; LR20R-5sRNA, 1Т84В-N85. Положение праймеров в кластере рибосомальных генов указано на рис. 1.

5s RNA

ITS1F NSI NS? ITS1

ИНН!

NS4

5.8s RNA

lr:o & i:r

:5s

ITS4 its4b

ITS

5 sRNA Л ? sRNASC

icsi IGS2

Рис.1 Схема расположения геноспецифичных праймеров

Для 12 штаммов, относящихся к 5 видам рода Pleurotus (P. djamor, P. sajor-caju, P. eryngii, P. ostreatus, P. pulmonarius), были секвенированы нуклеотидные последовательности рибосомальной ДНК (рДНК), содержащие участки ITS- и IGS-областей. Для обработки полученных данных и построения дендрограмм были использованы программы BioEdit (Hall, 1999) и Mega 5.10 (Tamura et al., 2011).

Анализ количественных признаков и построение генетической карты Pleurotus ostreatus

Схема анализа локусов количественных признаков P. ostreatus представлена на

рис.2.

Определение цвета шляпки проводили для 123 дикариотических штаммов, полученных путем скрещивания гаплоидных изолятов ВКК-популяции и гаплоидного штамма ЕР25. Цвет шляпок культивируемых грибов определяли с помощью хромометра Minolta Chromameter (СМ500) по трем параметрам (индексам): L - соотношение черного и белого цветов (варьирование от 0 - черный до 100 — белый), а - соотношение красного и зеленого цветов, b - соотношение синего и желтого цветов (рис.3).

Исходный дикариотическин штамм

атсс58937

Монокариотические родительские штаммы в скрещиваниях:

Р001-15

ЕР57

—* ЕР25

Потомство Р1:

Споровый отпечаток

Экспериментальная ВКК-популяция монокариотических штаммов (ВКК1.ВКК2.....ВК.К202)

Монокариотические тестерные х ЕР 2 штаммы в скрещиваниях:

Получение плодовых тел: оценка Получение дикариотических культур:

урожайности, скорости оценка скорости вегетативного роста

мицелиального роста, цвета шляпок дикарионов на субстрате

базидиом

Рис. 2. Общая схема опытов, проведенных для анализа количественных признаков Р. ов^ваНи.

насыщенность С

темно-зеленый

+Ь ярко-желтый Ю 20 30 40

-Ь

светло-синии цветовой тон

насы ще н н о сть

-♦■а

ярко-розовый

цветовой тон

Рис. 3. Параметры (индексы), по которым оценивалися цвет шляпок плодовых тел Р. ов^еа^.

Оценку урожайности проводили для 150 штаммов, полученных путем скрещивания гаплоидных изолятов ВКК-популяции и гаплоидного штамма ЕР25. Полученные от первой волны плодоношения базидиомы взвешивали, а также регистрировали момент появления плодовых тел.

Измерение скорости роста дикарионов на субстрате проводили для 70 произвольно выбранных штаммов ВКК-популяции, каждый из которых был скрещен поочередно с тремя коммерческими тестерными штаммами - ЕР25, Р24 и G24. Таким образом, в эксперименте участвовали 210 дикариотических культур P. ostreatus.

В качестве субстрата в опыте по изучению скорости зарастания мицелием субстрата использовали измельченную ферментированную и стерилизованную солому пшеницы (влажность 70%); стерилизацию проводили в два этапа по 30 минут при 1 атм. Подготовленный субстрат помещали в стеклянные пробирки высотой 16 см и диаметром основания 16 мм. Зерновой инокулюм помещали поверх субстрата и закрывали пробирку бумажной пробкой. Каждый опыт был поставлен в трех повторностях. Кроме того, на каждую пробирку были нанесены по 4 измерительные линии, на которых каждые 2 дня отмечалась граница роста мицелия. Для каждого из 210 полученных в скрещиваниях дикарионов опыт был поставлен в 12-ти повторностях (рис. 4).

Генетическую карту для P. ostreatus составляли на основе данных полногеномного секвенирования штаммов ЕР57 и Р001-15, благодаря чему были найдены около 1500 SNP-маркеров (single nucleotide polymorphism) в пределах геномов этих двух штаммов (данные были получены при сотрудничестве с Объединенным Институтом Генома, Joint Genome Institute, США). Полученные 202 монокариотических штамма экспериментальной ВКК-популяции были генотипированы по обнаруженным SNP-маркерам по технологии Golden Gate, Illumina (ServiceXS, Лейден, Нидерланды). Из 1500 SNP-маркеров были выбраны и

проанализированы 347, на основании которых была построена генетическая карта для P. ostreatus (JoinMap4.0, Kyazma; Van Ooijen, 2006).

При анализе количественных признаков применяли тестирование распределений каждого количественного признака (скорость мицелиального роста, урожайность, цвет шляпок плодовых тел) на основе критерия нормальности Колмогорова-Смирнова, после чего оценивали степень влияния генотипа на проявление признаков с помощью однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Расчеты производили при помощи пакета программ SPSS Statistics (SPSS Inc. Released 2009. PASW Statistics for Windows, Version 18.0. Chicago: SPSS Inc.).

Для картирования количественных признаков использовали два типа анализа: интервальное картирование и непараметрический тест Крускал-Уоллиса (MapQTL 6.0; Van Ooijen, 2004).

Результаты и обсуждение

Получение плодовых тел и оценка урожайности P. djamor, Р eryngii и P. sajor-caju

При подборе субстратов для эффективного плодоношения грибов все четыре апробированных субстрата - лузга, хлопковый очес, древесина фикуса и бамбука -показали хорошую перспективу для дальнейшего использования. На всех субстратах был отмечен хороший мицелиальный рост, а также на 15-18-е сутки после начала вентиляции получены примордии для исследуемых штаммов. На всех субстратах, кроме хлопкового, на 18-21-е сутки были получены плодовые тела для трех штаммов P. djamor - KOR, Н и ZI, а также для штамма P. sajor-caju CS-32; однако плодовые тела исследованных четырех штаммов отличались скоростью образования и степенью сформированности. В виду того, что наилучшие результаты по скорости мицелиального зарастания сусбтрата были получены на лузге, этот субстрат был использован для оценки урожайности исследуемых штаммов. В ходе эксперимента наблюдали 2 волны плодоношения для Р. djamor и P. sajor-caju. Наименьшая урожайность была отмечена у P. sajor-caju (28 г грибов на 100 г субстрата), наибольшая - у Р. djamor Z1 (34 г грибов на 100 г субстрата).

Генотипирование культивируемых штаммов и видов рода Pleurotus

Результаты ПЦР с несколькими наборами специфичных праймеров показали наличие полиморфизма по длине транскрибируемых ITS- и IGS-спейсерных участков

кластера генов рРНК у анализируемых штаммов. Полученные в реакции амплификации ПЦР-продукты варьировали по длине среди исследуемых видов, в то время как длины амплифицированных последовательностей среди штаммов в пределах одного вида почти не отличались. Так, длина ITS-участка рДНК составила 800 н.п. для Р. djamor, 775 н.п. — для Р. sajor-caju, 770 н.п. — для Р. pulmonarius, 780 н.п. для Р. ostreatus и для Р. eryngii, 785 н.п. — для Р. calyptratus. Межвидовые различия длин ITS-участков колебались в пределах 15 н.п.

Длины IGS-участков также варьировали между видами и штаммами. Для Р. djamor длина данного участка составила 1200 н.п., для Р. sajor-caju, Р. pulmonarius и Р. ostreatus — 1100 н.п., для Р. eryngii — 1150 н.п. Межвидовые различия длин IGS-участков колебались в пределах 100 н.п. Однако были отмечены отличия и между штаммами одного вида.

С целью установления степени гомологии ITS-локусов между штаммами были отсеквенированы ITS- последовательности рРНК следующих штаммов: Р. sajor-caju CS-32; Р. ostreatus Р10; Р. ostreatus 27.4; Р. ostreatus BP, Р. ostreatus 38d, Р. ostreatus Don, Р. eryngii Р13, Р. eryngii 3-1. В процессе секвенирования были прочтены последовательности длиной около 500 н.п., которые были сопоставлены с аналогичными последовательностями, имеющимися в базе данных Генбанка (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). При анализе ITS-последовательностей исследуемых видов и штаммов вешенки была показана высокая степень гомологии между видами с колебаниями в пределах от 0.836 (между Р. calyptratus С2 и Р. pulmonarius 27.4) до 1.0, (для Р. sajor-caju CS-32 и Р. pulmonarius 06-1).

Установление таксономического статуса Р. sajor-caju

Видовая принадлежность sensu stricto тех или иных культивируемых штаммов Р. sajor-caju часто вызывает дискуссию, так как данный вид имеет сходство по макро-и микроморфологическим признакам с близкородственным видом Р. pulmonarius. Исходя из описания Стейметса, вид Р. sajor-caju отличается от Р. pulmonarius наличием тонкого кольца на ножке плодового тела, однако коммерческие штаммы, культивируемые в лабораторных условиях, часто не имеют этого признака, что делает их практически неотличимыми от штаммов вида Р. pulmonarius (Stamets,1983). Полученные нами плодовые тела также не имели кольца на ножке. Исследуемый штамм Р. sajor-caju CS-32 формировал мясистые плодовые тела на выраженной

светлой эксцентрической ножке со шляпкой серого цвета; средний вес плодового тела составил 35,9±2,02 г. Длина ножки составила в среднем 4,6±1,5 см, диаметр шляпки - 6,4±2,1 см. Споровые отпечатки от полученных базидиом были светло-лилового цвета. Данное описание плодовых тел совпадает с таковым и для вида Р. pulmonarius. Таким образом, по морфологии плодовых тел и культурально-морфологическим признакам разделение видов P. sajor-caju и P. pulmonarius оказалось затруднительным. Поэтому полученные при секвенировании ITS- и IGS-последовательности штамма P. sajor-caju CS-32 были сопоставлены с аналогичными последовательностями из базы данных ГенБанка. В ГенБанке происходило выравнивание штамма вешенки P. sajor-caju CS-32 в равной степени как с последовательностями P. sajor-caju, так и с последовательностями P. pulmonarius, а также с последовательностями, депонированнывми под видовыми названиями Р. sapidus и P. australis. Не исключено, что подобные результаты могут быть следствием ошибок при определении видов вешенок, чьи сиквенсы депонируются в электронную базу данных ГенБанка. Поэтому идентифицировать виды и, тем более, штаммы грибов, ориентируясь лишь на данные секвенирования ITS-локусов рДНК, не всегда возможно и однозначно. Для решения этой проблемы был проведен филогенетический анализ на основе ITS-последовательностей рибосомальных генов. В анализ, помимо полученных нами в ходе секвенировагия ITS-последовательностей, были включены последовательности из ГенБанка. Результаты представлены в виде кладограммы на рис. 5. Как видно из кладограммы, штаммы видов P. sajor-caju и Р. pulmonarius сформировали общий кластер, не дифференцированный по видовой принадлежности.

Таким образом, в результате проведенного филогенетического анализа нам не удалось четко разграничить виды P. sajor-caju и P. pulmonarius, т.е. провести молекулярно-генетическую дифференциацию между видами. Поэтому на следующем этапе были проведены мон-мон скрещивания (монокарион х монокарион) между полученными нами гаплоидными монобазидиоспоровыми тестерными штаммами Р. sajor-caju с гаплоидными тестерами половой совместимости вида P. pulmonarius с целью анализа присутствия репродуктивных барьеров (репродуктивной изоляции, или нескрещиваемости) между штаммами данных видов (4x4, всего 16 скрещиваний). Ни одна из 16-ти комбинаций в мон-мон скрещиваниях не оказалась

P. pulmcnarius LAU60 P. pulmonarius LAU09 P. pulmonarius NAAS00060 P. sajor-caju MUCL 38076 P. sajor-caju MUCL 31017 P. pulmonarius voucher 226 P. sajor-caju dd08058 - P. sajor-caju dd08047 P. sajor-caju MUCL 28683 P. sajor-caju MUCL 38078 P. sajor-caju MUCL 28685 P. sajor-caju MUCL 38071 P. sajor-caju CS-32

P. pulmonarius 27.4

P. pulmonarius 06-1

531 P. ostreatus Don P. ostreatus 38d 71 [P- ostreatus PC001-15 "I P. ostreatus EP-57

P. ostreatus P. 10

P. ostreatus BP

P. eryngii P13

P. eryngii 3-1

- Agaricus bisporus /AF187270.1/

0.02

- P. djamor Z1

- P. calyptratus C2

Рис. 5. Кладограмма сходства между штаммами видов рода Pleurotus, построенная на основе ITS-последовательностей кластера рибосомальных генов с применением метода максимального правдоподобия (Maximum Likelihood Estimation). Подчеркиванием выделены виды и штаммы, чьи ITS-последовательности были секвенированы во время выполнения данной работы, остальные последовательности были взяты из базы данных ГенБанка. Цифрами на ветвях указаны значения бутстреп (bootstrap).

фертильной: не наблюдали формирование пряжек в месте контакта монокариотических партнеров. Образование пряжек при скрещивании монокарионов (гаплоидов) указывает на формирование фертильного дикариона и, следовательно, на половую совместимость между скрещиваемыми монокарионами. Отсутствие формирования фертильного дикариона свидетельствует о репродуктивной изоляции (половой несовместимости) между штаммами. Таким образом, несмотря на сходство морфологии, P. sajor-caju и P. pulmonarius являются разными видами. Результаты данного эксперимента являются еще одним подтверждением предположения о том, что в пределах рода Pleurotus репродуктивная изоляция, сопровождаемая установлением генетических барьеров, препятствующих скрещиваниям, происходит быстрее морфологической дифференциации, которую можно рассматривать как второй шаг, следующий за генетической изоляцией (Шнырева с соавт., 2004).

Анализ количественных признаков Pleurotus ostreatus Коммерческий монокариотический штамм P. ostreatus Р001-15, который является протоклоном коллекционного штамма АТСС58937 (American Type Culture Collection), и производственный монокариотический штамм P. ostreatus ЕР57 были скрещены между собой на чашке Петри для получения дикариотического штамма ВККО (рис.2). Полученный дикариотический мицелий был высеян на субстрат для получения плодовых тел - ферментированную и стерилизованную солому пшеницы, помещенную в мультиперфорированный полиэтиленовый мешок, рассчитанный на 1 кг субстрата. На 22-е сутки после инокуляции субстрат был полностью колонизирован мицелием вешенки, и мешок с субстратом был перенесен в камеру для выгонки плодовых тел со стандартными условиями культивирования для вешенки обыкновенной. На 4-е сутки после перемещения мешка с колонизированным субстратом в камеру для выгонки плодовых тел на мицелии вешенки появились примордии, а еще через 2 суток они развились в зрелые плодовые тела. Из спорового отпечатка произвольно выбранной базидиомы дикариона ВККО путем высевания суспензии спор на чашки Петри со средой Эгер была получена популяция, состоящая из 202 монобазидиоспоровых изолятов. Эти штаммы были использованы в последующих экспериментах с целью изучения наследования количественных

признаков P. ostreatus. Все полученные штаммы были маркированы порядковыми номерами ВКК1 - ВКХ202 соответственно (рис.2).

Оценка урожайности Для изучения локусов количественных признаков вешенки обыкновенной, ответственных за урожайность и цвет шляпок базидиом, было необходимо получить плодовые тела, поэтому 202 гаплоидных монокариотических штамма экспериментальной ВКК-популяции были поочередно скрещены на чашках Петри со штаммом P. ostreatus ЕР25. Из 202 дикариотических штаммов, полученных в результате скрещивания ВКК-штаммов со штаммом ЕР-25 и инокулированных на растительный субстрат для плодоношения, только 150 образовали базидиомы в течение 21 суток после начала вентиляции. Зрелые плодовые тела вешенок имели типичный для P. ostreatus внешний вид: мясистая шляпка на плотной эксцентрической или боковой ножке, диаметр шляпки до 10 см. Сразу после срезания плодовые тела взвешивали. Общий вес плодовых тел, собранный с 1 мешка в первую волну плодоношения, варьировал от 2,2 до 159 грамм, со средним значением для всей популяции дикарионов равным 58 г/мешок. Диаграмма распределения дикариотических штаммов в зависимости от их урожайности представлена на рис.6. Все исследуемые штаммы были разделены на 8 групп в зависимости от общего веса образовавшихся на мешках базидиом.

—

гп П

1-20 21--ТО 41-60 61-80 81-ЮО 101-120 121-140 141-160

Рис. 6. Распределение штаммов Р. оз1геаН^ в зависимости от их продуктивности

Определение цвета шляпок плодовых тел Р. ойй-еаШ Для оценки генетического разнообразия штаммов вешенки по интенсивности цвета шляпок базидиом, были проанализированы 124 дикариона: по 10 плодовых тел

от каждого штамма. Цвет шляпок характеризовали, используя три параметра (индекса) цветности: по шкале от зеленого до красного (а), от желтого до синего (Ь) и от черного до белого (Ь, рис. 2). Значения индекса Ь (яркость) варьировали от 54,4 -для самых темных до 82,6 - для самых светлых грибов, со статистическим порогом значимости 3,64. Это позволило разделить все исследуемые штаммы на 6 классов в соответствии с интенсивностью цвета. Как показал статистический анализ, и, как видно на рис. 7, распределение штаммов вешенки по цвету шляпки плодовых тел близко к нормальному, что является наиболее благоприятным условием для локализации и анализа генных областей, ответственных за цвет шляпок базидиом Р. оз^еаЫь.

30 -|

О 25 -

го 20 -

о 15 -

ш т 10 -

О 5 -

ас

0 •

Кривая нормального

распределения

(среднее~б9.02,

Стандартное

отклонение=4,65)

57.5

82.5

65 67.5 70 72.5 75 77.5 80 Яркость (значение L)

Рис. 7. Распределение штаммов P. ostreatus в зависимости от цвета итяпки базидиом.

Определение скорости вегетативного роста Для изучения генных локусов, ответственных за скорость вегетативного роста вешенки обыкновенной, из 202 моноспоровых изолятов ВКК-популяции были произвольно отобраны 70 штаммов. Выбранные штаммы были скрещены поочередно с гаплоидными тестерными штаммами ЕР25, Р24 и G24 (I, II и III группы скрещивания соответственно). Два последних штамма являются широко используемыми коммерческими штаммами устричной вешенки и были включены в анализ для расширения генетической базы вариабельности признака.

Усредненные данные по скорости роста трех произвольно выбранных дикариотических культур, полученные в ходе эксперимента, представлены на

рисунке 8. Как видно на этом рисунке, скорость обрастания дикариотическим мицелием субстрата в пробирке имеет линейный характер и может описываться функцией вида у=ах+Ь, что позволило нам использовать значения параметра «а» этих функций в качестве количественного признака при картировании областей, ответственных за скорость мицелиального роста вешенки.

Однофакторный дисперсионный анализ показал, что в нашем эксперименте генотип оказывал существенное и статистически достоверное влияние на скорость мицелиального роста дикариотических штаммов Р. оз^вать.

Рис. 8. Динамика мицелиального роста различных штаммов Р. ostreatus. На оси абсцисс отмечены сутки роста мицелия, на оси ординат - расстояние, пройденное мицелием на субстрате (оценку проводили в пробирках).

Для двухфакторного дисперсионного анализа использовали данные о генотипах исследуемых штаммов ВКК-популяции в качестве первой независимой переменной и данные о генотипах тестерных штаммов ЕР25, G24 или Р24 в качестве второй независимой переменной. Анализ доказал влияние генотипа гаплоидных тестерных штаммов (ЕР25, G24 или Р24) на скорость мицелиального роста дикарионов, а также показал, что штаммы во II группе скрещивания характеризовались более быстрым мицелилальным ростом по сравнению с двумя другими группами скрещивания I и III.

Построение генетической карты P. ostreatus и локализация OTL-локусов Для дальнейшего анализа хозяйственно полезных признаков вешенки обыкновенной требовалось построение подробной генетической карты. Такая карта была построена на основе 384 найденных SNP-маркеров и данных генотипирования 186 ВКК-штаммов P. ostreatus. Все маркеры были распределены между 11 группами сцепления, которые, как мы полагаем, соответствуют 11 хромосомам вешенки обыкновенной (Larraya, 2009). Кроме того, геномы штаммов P. ostreatus Р001-15 и ЕР-57 были полностью секвенированы и частично аннотированы сотрудниками Объединенного Института Генома (Joint Genome Institute, www.jgi.doe.gov/). Длина генома составила 1044 сМ, около 34 МЬр, с плотностью около 319 генов на 1 МЬр. Средняя длина гена составила 1,7 kb, экзона - 218 kb, интрона - 77 kb.

Помимо SNP-маркеров, на карту были также нанесены локусы спаривания Р. ostreatus - matA и mat В, ответственные за половую совместимость. Для выполнения этой задачи было необходимо установить типы спаривания (аллели локусов половой совместимости) для исследуемых штаммов ВКК-популяции. Эта цель была достигнута серией экспериментов по скрещиванию монокариотических ВКК-штаммов P. ostreatus между собой. Установив типы спаривания родительских штаммов (Р001-15 и ЕР57) путем их скрещивания с гаплоидными тестерами из коллекции Университета Вагенингена и проведя ряд скрещиваний во всех возможных комбинациях между 16 произвольно выбранными ВКК-штаммами, были получены 4 гаплоидных тестерных ВКК-штамма с четырьмя возможными сочетаниями аллелей локусов спаривания: А1В2, А5В2, А1В5, А5В5. Эти ВКК-тестеры были использованы для определения типов спаривания у необходимого количества ВКК-штаммов. Таким образом, серией из 376 скрещиваний были установлены типы спаривания 46 штаммов экспериментальной ВКК-популяции.

Полученная генетическая карта P. ostreatus с нанесенными на нее маркерами {matA, matB и SNP-маркеры) представлена на рис. 9. Как видно на рисунке, локус matA попал в III группу сцепления, локус matB - в IX группу сцепления.

Полученные в ходе экспериментов данные о цвете шляпок плодовых тел Р. ostreatus позволили нам локализовать несколько областей генома вешенки, которые оказывают влияние на пигментацию плодовых тел (таблица 2).

- 1 4329157

- 1 4122962„

- 1 3822738

- 1 2624868

1 1022747. 1 920617 1 423148 1 325965

249880 2 448213

2 550124 645585

1001050365 1150052 1353788 1731171 1652431 2042862 1201550321 1981352

ЭСЗМ5 3 4294945

ЭСЗМ4С 3 3890237

-1)3 920467 \lsponeless

1066945 У-З 640496 ^3 4 52076 3 88103 БСЗМ!

П—^А 46126 и /4 2 54487 /—, К-4 349913 V 1

1452868 Ь4 1650152 -4 1851254

3 2880547 «г- А гттаИпд 1уре

4 2850559 80" -4 2950053

5 3449756 5 3050095

5_2949529 5 2650209

-5 2349502 5 2049918 5 1849277 5 1449782 5 1351238 5 12509-19 -5 949122

5 849588 5 750175 5 551554 Лз 5 150107 ^

— 6 2149861 6 1951768

6 1449086 />6 1549414 /1б 1649807 V 6 1846455 46 1749750

6 48907 6 849591 6 958616

6 750169 6 552424 -16 452038

6 251657

VII

VIII

•0 7 2449119 V 7 "2651566 (■

I 25488/0 I 2450719 I 2350854 20Н

I 2249929 I 2152077 Г 1951041 I 1 751146 Л-60" I 164 7713 — .1351225 N

V Я ЯГ^АПО 7

V 8 • я

950087 753270 548832

- 8 250390

9 1448929 •-9 1551053 . - 9 1 649953 ^ 9 1850266

31.6\

33.8^.

35.2^

36.6

37.:

38.1

Л10 /1ю:

53.9^-54.6-56.2-

10 348103 10 265374 10 449586 10 546638 10 750319 10 850901 10 951098

10 1051314

10 1151813

10 1253829

- 10 1450889

-11 1365970

11 1048718 11 950983

11 841770

- 11 650087 11 549865

— 11348640 -11 148658

и11 1454 375

^ Локусы количественных признаков, ответственные за скорость мицелиального роста Локусы количественных признаков, ответственные за цвет шляпок базидиом

Рис. 9. Генетическая карта Р. оэ^еаШБ и ()ТЬ-локусы, ответственные за коммерчески важные признаки вешенки: скорость мицелиального роста и цвет шляпок базидиом.

Наиболее статистически достоверным оказался маркер на I хромосоме, в позиции 920617 н.п. Проверка распределений каждого из двух аллелей этого локуса показала, что смещение в распределении штаммов по окраске плодовых тел вносит аллель Ь этого локуса, происходящий от родительского штамма РС001-15, тогда как аллель а, полученный от штамма ЕР57, напротив, характеризуется более темными плодовыми телами (рис. 10).

Рис.10. Распределение штаммов с разными аллелями а (аллель родительского штамма ЕР-57) и в (аллель родительского штамма Р001-15) по цвету шляпок базидиом. На оси абсцисс отмечены значения параметра ¿, на оси ординат - количество штаммов.

Кроме того, при помощи методов интервального картирования и непараметрического теста Крускал-Уоллиса было также обнаружено 9 локусов (ОТЪ), контролирующих скорость вегетативного мицелиапьного роста Р. овКеМш. Один из них оказался сцеплен с одним из локусов спаривания вешенки - та1А, вследствие чего было принято решение разделить исследуемую популяцию на две группы по типам спаривания - А| и А5 - с целью обнаружения других ОТЬ-локусов, возможно, «замаскированных» влиянием та/Л-локуса. Благодаря выбранной стратегии было обнаружено еще два ОТЬ-локуса, оказывающих влияние на скорость мицелиального роста вешенки. Все найденные ОТЪ-локусы представлены в таблице 2, а также на рисунке 9.

Дополнительно, был проведен сравнительный анализ распределений штаммов, несущих разные аллели генов на участке 226114-230263 нп хромосомы I. Анализ показал присутствие в данном участке генома аплеля с (от штамма ЕР57), который

Таблица 1. Локус ы количественных признаков, ответственные за скорость мицелиального роста и цвет шляпки базидиом Р. оя^еатя

Тестер Группа сцепления Локус Вероятность случайной ошибки

Признак - скорость мицелиального роста

ЕР25 I •124226-325965 1 0,005

Р24 III •2644222-2738759 (matA) 0,05

VIII •1351225-1647713 0,01

•753270-950087 0,01

•1051105-1451125 0,05

Р24/А1 VIII •1351225-1647713 0,01

950087-1051105 0,05

•1751146 0,05

1951041-2249929 0,05

Р24/А5 V ••2548223-3500674 0,05

III 2644222-2738759 (matA) 0,05

IX ••550250-749592 0,05

G24 II •550124-976908 0,01

IV •150853-349913 0,01

•450487-551695 0,01

VI 48907-552424 0,05

VIII •1647713-2249929 0,05

250390-648298 0,05

XI 1365970 0,05

Признак- цвет шляпок базидиом

ЕР25 I •920617 0,01

VII 951269-1648882 0,05

VIII 1051105-950087 0,05

IX 1649953-1750001 0,05

X 1552308 0,05

XI 1454375 0,05

Примечание: цифры указывают позицию в н.п. (нуклеотидных парах) группы сцепления на генетической карте; matA-локус находится в III группе сцепления;

* - данные QTL были подтверждены с помощью метода интервального картирования;

** - данные QTL были обнаружены только после разделения ВКК-популяции по типам спаривания.

статистически достоверно оказывает положительное влияние на скорость мицелиального роста гриба. В соответствии с аннотированным сиквенсом исследуемых нами штаммов, который был составлен при сотрудничестве с Объединенным Институтом Генома (Joint Genome Institute, США), данный участок, находящийся на I хромосоме, кодирует белки, относящиеся к суперсемейству гликозидаз (six-hairpin glycosidases) (DOE Joint Genome Institute, www.jgi.doe.gov, http://supfam.org/SUPERFAMILY/index.html). Для этих белков показана ферментативная активность по отношению к целлюлозе и гемицеллюлозе, что доказывает их участие в процессе зарастания (колонизации) мицелием вешенки растительных субстратов, используемых при культивировании, а, следовательно, и возможность использования данного вида P. ostreatus в процессах переработки (биодеградации) отходов сельскохозяйственного производства. Кроме того, нами был полностью проанализирован участок 124226-325965 н.п. хромосомы I (таблица 2). Этот достаточно протяженный участок кодирует около 30 известных белков, среди которых встречаются белки электронно-транспортной цепи (цитохромы), факторы транскрипции грибов, белки цинковых пальцев, белки цитоскелета и внутриклеточного транспорта (миозин, клатрины и др.), а также белки, участвующие в биосинтезе грибного хитина. Все эти гены, несомненно, оказывают влияние на скорость мицелилального роста, однако на данный момент еще не накоплено достаточного количества данных для более точного маркирования этих признаков и объяснения механизмов их наследования и проявления.

Как уже было отмечено выше, один из QTL-локусов оказался сцепленным с одним из двух локусов спаривания (половой совместимости) базидиомицетов — matA-локусом. Для некоторых видов базидиомицетов прежде уже было показано, что более быстрый вегетативный мицелиальный рост штаммов ассоциирован с конкретным типом спаривания (Larraya, 2000). Однако только теперь это было подтверждено для дикариотических культур вешенки с использованием молекулярно-генетических методов картирования. Таким образом, тип спаривания может служить простым и удобным маркером для проведения селекционных программ, направленных на выведение быстрорастущих штаммов P. ostreatus.

Заключение

Виды рода Р1еигоШ уже давно плотно вошли в культуру и производятся во всем мире в огромных количествах - больше 2000 тонн в год, - уступая в показателях только шампиньону. Несмотря на это, часть вопросов, касающихся культивирования вешенок, до сих пор остается нерешенной, и поэтому постоянно идет поиск новых, более оптимальных субстратов и условий для плодоношения, в культуру вводятся новые виды и штаммы с улучшенными показателями урожайности и качества плодовых тел. Так, результаты данной работы показали, что оптимальным субстратом для относительно новых для российского грибоводства видов - Р. сЦатог и Р. ,ча]ог-ссуи - является подготовленная стандартным способом лузга, на которой наблюдали выход плодовых тел, сопоставимый или превышающий таковой у широко культивируемого вида Р. оз^еШиз (до 34% для Р. ф'атог 21 в условиях лабораторного культивирования).

На сегодняшний день одним из самых прогрессивных путей селекции и получения новых, коммерчески более выгодных штаммов грибов является маркер-направленная селекция - метод, основанный на генотипировании и отборе организмов-носителей генетических маркеров хозяйственно полезных признаков. Эта техника, используемая во многих странах мира в течение последних двадцати лет, уже доказала свою эффективность в растениеводстве, и в последнее время все больше применяется и в животноводстве, однако в селекции съедобных грибов эта методика пока практически не используется. Найденные в процессе выполнения данной работы 12 (ЗТЬ-локусов, ответственных за скорость мицелиального роста Р. ояКваШ, а также 6 рТЬ-локусов, оказывающих влияние на интенсивность цвета шляпок плодовых тел Р. ояКес/Шя могут стать объектами дальнейшего исследования и поиска генов-кандидатов, оказывающих решающее влияние на описанные выше признаки. Так, среди локусов, ответственных за скорость вегетативного роста вешенки была обнаружена область, кодирующая белки из суперсемейства гликозидаз, для которых показана каталитическая активность по отношению к целлюлозе и гемицеллюлозе; данную генетическую область мы считаем наиболее перспективной для дальнейшего более подробного изучения как с теоретической, так и с практической точки зрения. Также интересен (ЗТЬ-локус, сцепленный с локусом половой совместимости вешенки

matA (III, 2644222-2738759), который может быть использован в качестве маркера для отбора более перспективных и быстрорастущих штаммов.

Несмотря на доказанную эффективность методов молекулярно-генетического анализа при отборе интересующих исследователя штаммов, эти методы не всегда могут дать четкий ответ о видовой принадлежности гриба. В данной работе для разрешения дискуссионного вопроса о видовой принадлежности Р. sajor-caju нам потребовалось сочетание методов молекулярно-генетического анализа и серии мон-мон скрещиваний гаплоидных тестерных штаммов Р. sajor-caju и Р. pulmonarius. Таким образом было доказано, что несмотря на близость микро- и макроморфологии, Р. sajor-caju является самостоятельным, репродуктивно изолированным видом.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что из четырех исследованных штаммов Р. sajor-caju и Р. djamor наилучшим плодоношением характеризуется штамм Р. djamor ZI (34 г грибов на 100 г субстрата), тогда как выход плодовых тел у штаммов Р. sajor-caju CS-32 и Р. djamor Н составил 28 и 32 г грибов на 100 г субстрата соответственно. Оптимальным субстратом для культивирования обоих видов является подготовленная стандартным способом лузга.

2. Анализ вариабельности ITS-последовательностей рДНК у 17 штаммов, относящихся к 6 видам рода Pleurotus, показал наличие полиморфизма по длине транскрибируемых спейсерных участков генов рРНК; степень гомологии анализируемых фрагментов варьировала в пределах от 0.836 (между видами Р. calyptratus С2 и Р. pulmonarius 27.4) до 1.0 (между видами Р. sajor-caju CS-32 и Р. pulmonarius 06-1).

3. Проведенный молекулярно-генетический анализ вариабельной ITS-последовательности локуса генов рРНК и мон-мон скрещивания показали, что вид Р. sajor-caju является самостоятельным видом, репродуктивно изолированным от сходного по морфологии близкородственного вида Р. pulmonarius.

4. На основе 384 SNP-маркеров и данных генотипирования 186 штаммов экспериментальной ВКК-популяции построена подробная генетическая карта для Р. ostreatus; все маркеры были распределены по 11 группам сцепления, соответствующим 11 хромосомам.

5. Хозяйственно важные количественные признаки P.ostreatus — цвет шляпки плодового тела и скорость вегетативного мицелиального роста -находятся под генетическим контролем сложной полигенной системы. В ходе анализа количественных признаков обнаружено 6 QTL-локусов, контролирующих цвет шляпки плодовых тел, и 12 QTL-локусов, контролирующих скорость колонизации субстрата мицелием гриба.

6. Были проанализированы аллели локусов половой совместимости (matA и matB) у гибридного потомства ВКК-популяции, что позволило определить положение matA и matB локусов на полученной генетической карте P.ostreatus.

Благодарности. Я выражаю огромную благодарность своему научному руководителю, д. б. н., профессору Шныревой Алле Викторовне за терпение, неоценимую помощь и всестороннюю поддержку на всех этапах выполнения и написания работы. Искренне благодарю всех сотрудников лаборатории микологии Университета Вагенингена, в особенности Йохана Барса, Антона Сонненберга, Патрика Хендрикса и Брайана Лаврайссена за помощь в планировании и проведении большой части работы по анализу количественных признаков вешенки, а также за их гостеприимство и чувство юмора. Хочу поблагодарить д. б. н., профессора Гарибову Лидию Васильевну и Завьялову Людмилу Анатольевну за помощь в работе, ценные советы и рекомендации. Отдельное спасибо всем сотрудникам кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова, а также моим друзьям и близким.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, рекомендуемых ВАК

1. Сиволапова А.Б., Сонненберг А., Барс И., Шнырева A.B. ДНК-маркирование некоторых локусов количественных признаков вешенки обыкновенной Pleurotus ostreatus // Генетика. - 2012. - Т 48. - N4. - С. 465-472.

2. Шнырева A.A., Сиволапова А. Б., Шнырева А. В. Съедобные культивируемые грибы вешенки Pleurotus sajor-caju и Р. pulmonarius сходны по морфологии, но являются самостоятельными репродуктивно изолированными видами // Генетика. -2012. - Т 48.-N11.-С. 1260-1270.

3. Сиволапова А. Б. Грибы рода вешенка как перспективные агенты биодеградации отходов вредных производств и сельского хозяйства // Ветеринарная медицина. -2012-N2.-С. 3-4.

Материалы и тезисы конференций

4. Шнырева А. В., Сиволапова А. Б. Молекулярное генотипирование культивируемых штаммов и видов вешенки Pleurotus spp. // Современная микология в России. Том 2. Материалы 2-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии, 2008.-С. 45.

5. Сиволапова А. Б., Завьялова JI. А. Морфолого-культуральные и некоторые физиолого-биохимические признаки Pleurotus djamor и Pleurotus sajor-caju. // Высшие базидиальные грибы: индивидуумы, популяции, сообщества. Материалы юбилейной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М. В. Горленко. -М.: Изд-во «Восток-Запад», 2008. - С. 196-197.

6. Сиволапова А. Б., Шнырева А. В., Сонненберг А., Барс И. ДНК-маркирование локусов некоторых количественных признаков съедобного культивируемого гриба Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm. // Материалы XII международной молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». - 2012. - С. 59-60.

7. Sivolapova A., Shnyreva A., Sonnenberg A., Baars J. Quantitative trait loci controlling vegetative growth rate of edible mushroom Pleurotus ostreatus // Book of Abstracts of XVI Congress of European Mycologists. - 2011. - p. 189.

8. Snhyreva A.V., Sivolapova A. Reproductive isolation between closely related Pleurotus species is not reflected by morphological and physiological individuality // Book of Abstracts of XVI Congress of European Mycologists. - 2011. - p. 44.

9. Шнырева A.A., Сиволапова А.Б. Съедобные культивируемые грибы вешенки Pleurotus sajor-caju и P. pulmonarius, сходные по морфологии, являются репродуктивно изолированными видами по данным генетического анализа // Материалы Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2012». М.: МАКС Пресс, 2012. — С. 156.

Заказ № 68-А/04/2013 Подписано в печать 11.04.2013 Тираж 75 экз. Усл. п.л. 1,2

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сиволапова, Анастасия Борисовна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Сиволапова Анастасия Борисовна

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И АНАЛИЗ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ПРИЗНАКОВ ГРИБОВ

РОДА РЬЕиКОТШ

Специальности 03.02.12. - микология, 03.02.07. - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.б.н., проф. А. В. Шнырева

04201356648

Москва 2013

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ 5

Глава 1. Обзор литературы 8

1.1. Культивирование высших базидиальных грибов 8

1.2. Грибы рода Pleurotus 12

1.3. Видовая идентификация 19

1.4. Применение молекулярно-генетических подходов в таксономии грибов 22

1.5. Генетика количественных признаков 23 Глава 2. Материалы и методы 28

2.1. Объекты исследования 2 8

2.2. Культивирование штаммов вешенки 29

2.3. Получение плодовых тел P. djamor и P. sajor-caju in vitro 29

2.3.1. Подготовка посевного материала 29

2.3.2. Субстраты 29

2.3.3. Оценка урожайности 30

2.4. Определение факторов половой (гомогенной) несовместимости и отбор гаплоидных тестеров типов

спаривания для видов P. sajor-caju и P. ostreatus 30

2.5. Молекулярно-генетические методы при оценке генетического разнообразия рода вешенка 32

2.5.1. Подбор геноспецифических праймеров 3 2

2.5.2. Экстрагирование ДНК 34

2.5.3. ПЦР со специфичными праймерами 35

2.5.4. Секвенирование ДНК 36

2.5.5. Обработка результатов секвенирования 37

2.6. Анализ количественных признаков Pleurotus ostreatus 38 2.6.1. Получение плодовых тел P. ostreatus 38

2.6.2. Определение цвета шляпки 38

2.6.3. Оценка интенсивности плодоношения (урожайности) 39 2.6.3. Измерение скорости роста дикарионов 39

2.6.5. Составление генетической карты Pleurotus ostreatus 40

2.6.6. Статистическая обработка данных 41 Глава 3. Результаты и обсуждение 42

3.1. Культивирование P. sajor-caju и P. djamor

в лабораторных условиях 42

3.1.1. Получение плодовых тел P. djamor и P. sajor-caju 42

3.1.2. Оценка урожайности штаммов

P. sajor-caju и P. djamor 44

3.1.3. Получение тестерных штаммов

для вида P. sajor-caju 46

3.2. Генотипирование штаммов и видов

рода Pleurotus 48

3.2.1. ПЦР-диагностика 4 8

3.2.2. Секвенирование ITS-последовательностей 50

3.3. Установление таксономического статуса P. sajor-caju 56

3.3.1. Морфология плодовых тел культивируемых видов вешенки Pleurotus pulmonarius

и P. sajor-caju 56

3.3.2. Молекулярная идентификация вида P. sajor-caju

на основе ITS и IGS последовательностей кластера генов рРНК 57

3.3.2. Анализ половой совместимости между штаммами

P. sajor-caju и P. pulmonarius 59

3.4. Анализ количественных признаков Pleurotus ostreatus 62

3.4.1. Получение экспериментальной популяции

Pleurotus ostreatus 62

3.4.2. Оценка урожайности исследуемых штаммов P. ostreatus 65

3.4.3. Определение цвета плодовых тел Р. оБ^еаШБ 66

3.4.4. Определение скорости вегетативного роста 69

3.4.5. Построение генетической карты Р. оьггеМж 72

3.4.6. Изучение локусов количественных признаков (С)ТЬ), ответственных за урожайность, скорость вегетативного роста и цвет шляпок

плодовых тел Р. 081геа1т 78

Глава 4. Заключение 89

ВЫВОДЫ 91

Список литературы 93

ПРИЛОЖЕНИЕ 107

Введение

Кроме того, в последнее время все чаще предлагается использовать грибы рода Pleurotus в процессах биологической переработки отходов сельского хозяйства, а также бумажного и текстильного производств в силу того, что эти грибы обладают комплексом лигнинолитических ферментов. Самым распространенным культивируемым видом является вешенка устричная (обыкновенная) - Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm., однако в настоящее время производители все чаще стараются ввести в культуру более экзотичные виды вешенок, такие как Pleurotus djamor (Rumph.) Boedijn или Pleurotus sajor-caju (Fr.) Singer. Эти виды привлекли внимание благодаря своей способности к плодоношению в условиях повышенных температур.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. оценить урожайность культивируемых штаммов P. sajor-caju, Р. djamor и P. ostreatus и подобрать наиболее перспективные субстраты и условия для плодоношения этих видов;

2. провести генотипирование 17 штаммов, относящихся к 6 видам вешенки - P. ostreatus, P. pulmonarius, P. djamor, P. sajor-caju, P. eryngii и Р. calyptratus;

3. подтвердить таксономический статус P. sajor-caju;

4. построить подробную генетическую карту P. ostreatus на основе SNP-маркеров (single nucleotide polymorphism, однонуклеотидные замены) для анализа локусов количественных признаков;

5. провести маркирование и анализ локусов количественных признаков P. ostreatus таких как урожайность, скорость мицелиального роста, цвет шляпки плодового тела;

Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе настоящей работы была проведена оценка генетического разнообразия культивируемых видов и штаммов рода вешенка, а также разрешен вопрос о таксономическом статусе вида P. sajor-caju (Fr.) Singer, прежде вызывавший множество споров среди микологов.

Впервые была получена подробная генетическая карта P. ostreatus с

плотностью молекулярных маркеров, достаточной для эффективного поиска

локусов количественных признаков данного гриба. Впервые были выявлены и проанализированы локусы количественных признаков, ответственных за скорость вегетативного роста дикариотического мицелия вешенки обыкновенной, а также найдены генетические области, контролирующие цвет шляпки плодовых тел P. ostreatus, и области, оказывающие влияние на продуктивность штаммов.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Юбилейной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М. В. Горленко, «Высшие базидиальные грибы: индивидуумы, популяции, сообщества» (Москва, 2008); 2-ом Съезде микологов России (Москва, 2008); на Международном конгрессе «XVI Congress of European Mycologists» (Халкидики, Греция, 2011), на XII Международной молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2012), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012» (Москва, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 3 - статьи в журналах из списка рекомендованных ВАК, 6 - материалы конференций.

Структура и объем диссертации. Текст диссертации изложен на 106 страницах, состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Список литературы включает 94 источника, из них 84 на английском языке. Приложение содержит 6 таблиц.

Глава 1. Обзор литературы 1.1. Культивирование высших базидиальныех грибов

Высшие базидиомицеты - нетаксономическая группа, насчитывающая около 10 ООО видов из 550 родов и 80 семейств (Hawksworth et al., 1995). Наибольший интерес для человека представляют съедобные грибы этой группы, введенные в культуру по всему миру. Основная масса видов съедобных грибов относится к самой большой по числу видов и наиболее известной среди базидиальных грибов группе гименомицетов, объединяющей более 12 ООО видов. К гименомицетам относятся пока еще немногочисленные виды грибов, которые человек научился выращивать в культуре. В их числе шампиньон двуспоровый Agaricus bisporus, который культивируется в искусственных условиях в старых каменоломнях, шахтах, подвалах и специализированных шампиньонницах уже более 300 лет и более, чем в 80 странах мира. Его годовое производство достигает 2 млн. тонн. Из других видов в последние десятилетия довольно значительное распространение получило искусственное выращивание вешенки устричной (Pleurotus ostreatus) и вешенки легочной (Р. pulmonarius), а также зимнего гриба (Flammulina velutipes) на древесине и некоторых отходах сельскохозяйственного производства и лесной промышленности (солома, подсолнечная лузга, опилки и т.д.). Самый древний из искусственно выращиваемых грибов - это сиитакэ Lentinus edodes, который вот уже две тысячи лет выращивают на древесине в странах Дальнего Востока, особенно в Японии. В общей сложности в промышленном масштабе сейчас выращивают около 10 видов гименомицетов (Гарибова, Лекомцева, 2005).

Кроме того, эти грибы с античных времен использовались в народной

медицине (Lucas et al., 1957). В настоящее время в качестве наиболее

перспективных для промышленного культивирования в фармакологических

и пищевых целях рассматриваются виды базидиомицетов преимущественно

из группы ксилотрофов. Особую значимость этой группе грибов придает тот

факт, что многие представители ксилотрофных базидиомицетов являются перспективными продуцентами биологически активных веществ (Гарибова и др., 2005). Например, грибы с противоопухолевой активностью известны в Китае, России, Японии, Корее, а также в США и Канаде (Wasser, Weis, 1999).

Показано, что грибы рода Pleurotus обладают противоопухолевой активностью, основанной на модулировании иммунных ответов (например, P. pulmonarius и P. ostreatus ). Так, Икекава с соавторами (Ikekawa et al., 1968; 1969) сообщили, что водные экстракты семи исследованных видов базидиомицетов, среди которых были Р. ostreatus и P. spodoleucus, обладали противоопухолевой активностью против в опытах на мышах с привитой Саркомой 180 (Wasser et Weis, 1999). Из плодовых тел P. sajor-caju были выделены полисахариды ксилоглюкан и ксиланпротеин, которые также обладали противоопухолевой активностью (Zhuang et al., 1993).

Кроме того показано, что грибы рода Pleurotus обладают гиполипидемической активностью, то есть способностью снижать содержание холестерина в крови. Механизм снижения содержания холестерина в крови животных связывают, во-первых, со снижением скорости синтеза холестерина, во-вторых, с адсорбцией холестерина на грибных полимерах и, соответственно, с усилением его вывода из организма и, в третьих, с увеличением активности лецитин-холестеролацилтрансферазы, - фермента, ускоряющего дальнейшие превращения холестерина в организме. Так, в плодовых телах Р. ostreatus обнаружен ловастатин - ингибитор З-гидрокси-З-метил-глутарил-СоА-редуктазы, ключевого фермента синтеза холестерина (Краснопольская, 1998). Этот же ингибитор найден и в плодовых телах P.cornucopiae, P. eryngii и Р. sapidus, но наибольшее содержание ловастатина обнаружено в плодовых телах P. ostreatus (Gunde-Cimerman and Cimerman, 1995).

За пищевые качества съедобные базидиомицеты ценятся так же высоко,

как и за их фармакологические свойства. Особенно это относится к

развивающимся странам, где грибы являются одним из основных источников

питания, например, в Колумбии, где женщины выращивают грибы рода вешенка на отходах кофейного производства (Orrego, Jaramillo, 2005; Ruán-Sotoetal, 2006).

Культивирование базидиомицетов - это биотехнологический процесс, сочетающий в себе, с одной стороны, производство богатой белком биомассы, а с другой, - биодеградацию растительных отходов сельского хозяйства. Некоторые ученые считают культивирование съедобных грибов вторым по важности биотехнологическим процессом после культивирования дрожжей (Pathak et al., 2009). Благодаря комплексу лигнинолитических ферментов, эти грибы способны разрушать лигнинсодержащие отходы сельского хозяйства (отходы кофейного, рисового производств, опилки, лузгу, солому и др.), поэтому культивирование вешенок способно решать одновременно две задачи: производство плодовых тел (в пищевых и фармакологических целях) и биодеградация растительных отходов. Эти грибы-ксилотрофы, благодаря большому набору ферментов, способны к деградации даже таких трудно разлагаемых материалов, как целлофан, а в 2011 году мексиканскими учеными было проведено исследование, доказавшее высокую эффективность грибов рода вешенка в качестве агентов биодеградации одноразовых детских подгузников, которые составляют до 15% массы городских свалок (Espinosa-Valdemar et al., 2011).

Ферментный комплекс вешенок богат Mn-пероксидазами и фенол-оксидазами, которые принимают участие в разложении лигнина; с целлюлозой, в свою очередь, справляется комплекс грибных экзо- и эндоглюканаз и (3-глюкозидаз (Sanchez, 2010).

Существенным плюсом является то, что для культивирования Р.

ostreatus достаточно лишь пастеризованного субстрата, тогда как его

стерилизация необязательна, что значительно удешевляет процесс

производства грибов (Royse, Sanchez, 2007). Именно поэтому в последние

несколько десятков лет интерес к этим видам значительно возрос.

Было подсчитано, что если хотя бы четверть от той массы соломы, что ежегодно скапливается после сбора урожая во всем мире (2325 млн тонн), использовалась для выращивания вешенки, то порядка 377,8 млн тонн плодовых тел ежегодно попадали бы на рынок, а это обеспечило бы, в свою очередь, ежедневную добавку 250 г грибов к рациону 4,103 млн (Madan et al., 1987).

На сегодняшний день известны следующие цифры: в 2005 году было произведено 1411 тонн вешенок китайскими производителями, 382 тонны -американскими грибоводами, 245 т - голландскими, 139 т - французскими, 138 т - испанскими, 135 т - польскими, 88 т - итальянскими, 80 т -канадскими, 77 т - ирландскими и 74 т - британскими грибоводами (Sanchez 2010; рис 1).

Кроме того, полученная в результате культивирования вешенок на растительных отходах биомасса обогащена белком, углеводами, минералами (кальций, железо, фосфор) и витаминами (тиамин, рибофлавин, ниацин) (Sánchez, 2004).

Американский исследователь Поуп (Poppe, 2000) подсчитал, что существует около 200 видов растительных отходов, которые могут быть использованы в качестве субстрата для культивирования съедобных грибов. Однако, даже после такой «первичной» обработки остается большое количество непереработанного субстрата, который также может быть причиной загрязнения окружающей среды. Поэтому были разработаны методы многократного использования субстрата, некоторые из которых уже внедрены в промышленность (Sánchez, 2004).

138 139

■ Китай

■ США

■ Голландия

■ Франция

■ Испания

■ Польша

■ Италия

■ Канада Ирландия

■ Великобритания

Рис. 1. Мировые лидеры по производству съедобных базидиомицетов (по Sánchez, 2010). Цифрами указана общая масса произведенных грибов в тоннах в год.

Род вешенка, Pleurotus (Fr.) Kumm. (Pleurotaceae, Agaricales, Agaricomycetidae, Basidiomycetes, Basidiomycota, Fungi) (Index Fungorum) -космополит. Грибы этого рода встречаются повсеместно и являются преимущественно ксилотрофами на мертвой древесине. Род насчитывает до 39 видов, некоторые из которых встречаются на территории России. Стоит более подробно рассмотреть некоторые из них.

Так, одним из наиболее распространенных видов рода Pleurotus на территории России является вешенка обыкновенная, или устричная вешенка - Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm. В природе этот вид широко распространён в лесах умеренной зоны. Растёт группами, реже — одиночно, на пнях, валежнике, сухостойных или живых, но ослабленных, деревьях различных лиственных пород (дуб, берёза, рябина, осина, ива), реже — на хвойных, в лиственных и смешанных лесах, парках и садах. На древесных

1.2. Грибы рода Pleurotus

стволах плодовые тела встречаются довольно высоко над землей. Часто растёт густыми сростками из 30 и более плодовых тел, срастающихся у основания, и образует «многоярусные конструкции». И. А. Дудка и С. П. Вассер дают такое описание данного вида вешенки (Дудка И. А., Вассер С. П., 1987): шляпка 3—30 см в диаметре, раковино-, ухо-, языковидная, широко-воронковидная, гладкая, голая, темноокрашенная, серая, серо-бурая, черновато-бурая, часто с более или менее сизоватым оттенком. Мякоть белая, вначале мягкая, затем жестковатая, особенно в ножке, без особого запаха и вкуса. Пластинки низбегающие, частые, белые, серовато-белые, внизу нередко с анастомозами.

Ножка 1—4 х 1—з см, цилиндрическая, волосисто-опушенная, белая или буроватая, иногда отсутствует.

Гифальная система мономитическая. Генеративные гифы 4—10 мкм в диаметре, тонкостенные в мякоти шля�

Информация о работе

Сиволапова, Анастасия Борисовна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.12

Диссертация

Генетическое разнообразие и анализ количественных признаков грибов рода Pleurotus - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Генетическое разнообразие и анализ количественных признаков грибов рода Pleurotus ВАК РФ 03.02.12, Микология

Автореферат диссертации по теме "Генетическое разнообразие и анализ количественных признаков грибов рода Pleurotus"

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сиволапова, Анастасия Борисовна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетическое разнообразие и анализ количественных признаков грибов рода Pleurotus
ВАК РФ 03.02.12, Микология