Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Грибы рода Pleurotus: генотипирование и анализ локусов половой совместимости

ВАК РФ 03.02.12, Микология

Автореферат диссертации по теме "Грибы рода Pleurotus: генотипирование и анализ локусов половой совместимости"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ШНЫРЕВА Анастасия Андреевна

ГРИБЫ РОДА РЬЕШЮТиБ: ГЕНОТИПИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ЛОКУСОВ ПОЛОВОЙ СОВМЕСТИМОСТИ

03.02.12 - микология

1 АПР 2015

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2015

005566409

005566409

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова», а также в лаборатории молекулярной лесной биотехнологии Университета имени Георга-Августа, г. Геттинген, Германия.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Дьяков Юрий Таричанович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Наумова Елена Сергеевна доктор биологических наук Миропенко Нина Васильевна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии (ВНИИФ)

Защита состоится 15 мая 2015 г. в аудитории М1 в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 в Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, строение 12, Биологический факультет МГУ.

Тел./факс: 8(495) 939-39-70 Интернет-сайт: www.bio.msu.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан 19 марта 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

- ■

......

доктор биологических наук - А.В.Щербаков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Представители базидиальных грибов рода Pleurotus (Fr.) Kumm., вешенка, хорошо известны и встречаются повсеместно. Виды рода Pleurotus широко распространены в лесных биоценозах средней полосы России, а также многие из них культивируются в пищевых целях. Видовой состав рода довольно разнообразен. Большинство видов рода съедобны или условно съедобны. Многие виды представляют биотехнологическую и медицинскую ценность, так как обладают пулом ферментов семейства пероксидаз. Показано также, что спиртовые и водные экстракты полисахаридов многих представителей данного рода обладают антиопухолевой и антиоксидантной активностями (Sanchez, 2010). Данный род характеризуется сложной структурой видов. Зачастую точное определение видов в пределах рода Pleurotus затруднено в связи со схожестью морфологических характеристик, особенно если речь идет о комплексных видах, представленных интерстерильными группами. Морфология плодовых тел при культивировании вешенок также отличается вариабельностью признаков и, как показано, во многом зависит от условий выращивания (Avin et al, 2012). Поэтому классическое определение грибов на основе культурально-морфологических характеристик целесообразно сопровождать молекулярно-генетическими методами анализа. В связи с этим поиск универсальных молекулярных маркеров и генотипирование видов является одной из основополагающих задач современной таксономии, а также необходимо для создания и систематизации коллекции грибов.

Половое размножение и образование фертильного дикариотического мицелия и плодовых тел у базидиальных грибов контролируется генами локусов половой совместимости matA и mat/1. Локус matA обладает вариабельной структурой и кодирует гомеодоменные белки (HD, homeodomain), гетеродимеры которых являются транскрипционными факторами, участвующими в регуляции процессов полового развития. Только гомеодоменные белки, синтезированные с разных аллелей matA локусов половых партнеров, могут сформировать активный гетеродимерный белок. Подобный механизм генетического контроля значительно уменьшает вероятность инбридинга и направлен на поддержание природного внутрипопуляционного полиморфизма. В связи с высокой вариабельностью последовательностей генов гомеодоменных белков (Jul), а также количеством копий этих генов в пределах matA локуса, их изучение затруднено. Тем не менее, расшифровка структуры локусов и содержащихся в них последовательностей важна для понимания механизмов размножения и развития грибов, а также оптимизации процессов направленной селекции.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было изучение генетического разнообразия видов рода Pleurotus, генотипирование и создание системного подхода к их молекулярной идентификации, анализ половой совместимости в пределах комплексных видов, а также молекулярно-генетический и структурный анализ matA локуса половой совместимости на примере вида P. ostreatus.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Провести генотипирование 37 штаммов, относящихся к 10 видам вешенки -Р. ostreatus, P. pulmonarius, P. sajor-caju, P. djamor, P. eryngii, P. cornucopiae, P. citrinopileatus, P. calyptratus, P. cystidiosus, P. dryinus;

2. Провести генотипирование 10 видов вешенки, относящихся к интерстерильным группам, которые не представлены в нашей коллекции - P. abieticola, P. albidus, P. australis, P. euosmus, P. fuscoquamulosus, Р. levis, P. populinus, P. purpureo-olivaceus, P. tuber-regium - на основе последовательностей из ГенБанка;

3. Разработать метод молекулярной идентификации видов (баркодинг) на основе рестрикционного анализа вариабельной ITS последовательности кластера генов рДНК для видов вешенок;

4. Подтвердить таксономический статус спорных видов P. sajor-caju и P. euosmus;

5. Провести in silico структурный анализ matA локуса и закодированных в нем последовательностей генов гомеодоменных белков для вида Р. ostreatus и некоторых представителей рода (Р. djamor и P. eryngii)-,

6. Создать гибридные конструкции генов гомеодоменных белков matA локуса Р. ostreatus на основе эукариотического вектора pYSK.7 для трансформации в геном базидиального гриба Coprinopsis cinerea.

Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе настоящей работы был разработан быстрый и эффективный метод молекулярной идентификации (баркодинг) для видов рода Pleurotus на основе рестрикционного анализа ITS1-5.8S-ITS2 последовательности кластера рибосомальных генов. Был проведен детальный анализ видовой принадлежности штаммов в пределах комплексных видов P. sajor-caju - Р. pulmonarius и Р. euosmus - Р. cornucopiae и разрешен вопрос о таксономическом статусе этих видов, что было предметом дискуссии среди микологов.

В ходе экспериментов был адаптирован метод получения плодовых тел в лабораторных условиях для большинства видов рода Pleurotus. Впервые были получены в лабораторных условиях полноценные плодовые тела для несъедобно-

го вида P. calyptratus. Был также разработан метод получения гимения и стерильных споровых отпечатков непосредственно на чашках Петри.

Был проведен детальный анализ in silico структуры генов matA локуса, кодирующих гомеодоменные транскрипционные факторы, на основе двух совместимых по полу гаплоидных штаммов P. ostreatus. Были созданы рекомбинант-ные конструкции, содержащие гены гомеодоменных белков P. ostreatus, на основе вектора pYSK7 для трансформации в С.cinerea с целью последующей экспрессии этих генов и выяснения механизма функционального взаимодействия белков от гетерологичных хозяев.

Данная работа представляет ценность для исследователей в области микологии и филогенетики, внося вклад в изучение генетического разнообразия и ресурсов таких хозяйственно значимых объектов как грибы рода Pleurotiis. Работа имеет практическую значимость для селекционеров и производителей грибов. Разработанная система молекулярных баркодов имеет несомненную практическую значимость для контроля чистоты мицелиальных культур в коллекциях промышленных микроорганизмов грибного происхождения. Работа также вносит вклад в фундаментальную науку и изучение таких основополагающих вопросов как генетика пола у грибов и регуляция половой совместимости между партнерами и дальнейшего развития организма.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на заседании кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ; на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ло-моносов-2012» (Москва, 2012); Международном конгрессе «18th Congress of the International Society for Mushroom Science» (Пекин, Китай, 2012); 3-м Съезде микологов России (Санкт-Петербург, 2012); Международной конференции «7th International Medicinal Mushroom Conference» (Пекин, Китай, 2013); Международной конференции «12th European Conference on Fungal Genetics» (Севилья, Испания, 2014); 6-м Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2014); Международном конгрессе «10th International Mycological Congress» (Бангкок, Таиланд, 2014).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 - статьи в журналах из списка рекомендованных ВАК, 3 - статьи в сборниках, 9 — тезисы конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 129 страницах, иллюстрирована 19 рисунками и 12 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список

литературы включает 165 источников, из них 148 на английском языке. Приложение содержит 10 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

В обзоре литературы приведены описания морфологии основных представителей рода Р/еигоПи и рассмотрены три основные концепции вида у базидиаль-ных грибов. В обзоре описаны современные подходы к видовой идентификации грибов, которые сопоставлены с классическими морфологическими методами. Описаны механизмы полового размножения у базидиальных грибов и генетического контроля половой совместимости. Представлены имеющиеся в литературе данные о молекулярно-генетической структуре локусов половой совместимости, а также механизмах функционирования генов и взаимодействия гено-продуктов данных локусов у некоторых представителей базидиальных грибов.

Материалы и методы исследования

В работе по генотипированию были использованы 37 штаммов, принадлежащих десяти различным видам рода РкигоШх. Исследовали штаммы из собственной коллекции МГУ и из четырех других европейских коллекций, собранных в разных местообитаниях (Таблица 1). Штаммы культивировали на чашках Петри с сусло-агаром при 25°С.

Таблица 1. Список штаммов, использованных в работе

Вид Штамм Происхождение Коллекция* Номер ITS в

ГенБанкс

а CS-32 Производств, штамм, Northwest МГУ JQ814757

S Mycological Consultants, США

о Н-1 Производств, штамм Amycel 3011 \VLJR JQ837470

S3 Н-2 Производственный штамм Le \VIJR JQ837471

а,' Champion 29, Франция

3 06-1 Дикорастущий изолят, ЗБС МГУ, Мо- МГУ JQ837472

§ сковская обл.

к: о ZBS2012 Дикорастущий изолят, ЗБС МГУ, Мо- МГУ K.F932728

сковская обл.

5. 14d Дикорастущий изолят, ЗБС МГУ, Мо- МГУ JQ837473

а; сковская обл.

М-9 Дикорастущий изолят, г. Москва МГУ JQ837474

М-8 Дикорастущий изолят, г. Москва МГУ JQ837476

3 38d Дикорастущий изолят, ЗБС МГУ, Мо- МГУ JQ837475

2 ^ сковская обл.

3 Н-5 Изолят из экстремал. местообитания \VIJR K.F932726

о: 32GH, Венгрия

Н-8»* Монокарион РС15, полученный из \VIJR JQ837478

производственного штамма N001

H-9 Монокарион EP57, полученный из WUR JQ837479

производственного штамма

#54 Дикорастущий изолят, г. Москва МГУ -

#55 Дикорастущий изолят, г. Москва МГУ -

174 Производственный штамм, г. Львов, МГУ K.F932729

Украина

Sommer Производственный штамм, Германия МГУ -

PC9" Монокарион, полученный из произ- G6U

водственного штамма N001

N001 Производственный штамм, г. Памп- G0U

лона, Испания

о £ H-10 Производственный штамм, Россия МГУ JQ837488

a S? Z1 Производственный штамм, Россия МГУ JQ837487

a,' 1526 Дикорастущий изолят ИБиХ KF932719

H-6 Производственный штамм, Le Lion WUR JQ837481

— РЕ, Франция

1 H-7 Производственный штамм Somycel WUR K.F932727

3065, Sylvan, Франция

a; 1504 Дикорастущий изолят ИБиХ KF932718

H-14 Производственный штамм, Россия МГУ JQ837484

.0 82 Дикорастущий изолят ИБиХ K.F932716

88 Дикорастущий изолят ИБиХ K.F932717

3 с AG 1/463 - CCBAS KF932721

2 AG 1V/675 - CCBAS -

о; AG III/465 - CCBAS

AG 11/464 - CCBAS -

g. a C-l Дикорастущий изолят, г. Москва МГУ JQ837485

"3 a a 1935 Дикорастущий изолят ИБиХ KF932720

a.' Ь 2933 Дикорастущий изолят G0U KF932730

[p. citrino- pileatus AG 30015/691 CCBAS KF932725

& a; diosus AG 55/466 CCBAS FJ608592

3 AG 1/467 - CCBAS K.F932722

С ps AG 11/468 - CCBAS K.F932723

£ a," AG HI/470 - CCBAS K.F932724

Примечание: 'Коллекции: МГУ - Кафедра микологии и альгологии, МГУ имени М.В. Ломоносова; WUR - Plant Research International, University of Wageningen, Нидерланды; ИБиХ - Институт ботаники им. М.Г. Холодного, г. Киев, Украина; CCBAS - Culture Collection of Basidiomycetes, Institute of Microbiology, Academy of Sciences of the Czech Republic, Чехия; G6U - Georg-August-University Gottingen, Германия.

**Штаммы, геномы которых были полностью отсеквенированы: http://genome.igi-psforg/PleosPC15_l/PleosPC15 I.home.html http://genome jgi-psf org/PleosPC9_l/PleosPC9 1 home.html.

Получение плодовых тел и споровых отпечатков проводили как непосредственно на чашках Петри с сусло-агаром, так и методом стандартного культивирования в стеклянных банках (Шнырева и др., 2012).

Получение гаплоидных тестеров половой совместимости (типов спаривания) и определение аллелей факторов половой совместимости осуществляли согласно стандартной методике с использованием базидиоспоровых рассевов (Шнырева и др., 1998).

Выделение геномной ДНК из мицелия проводили по стандартной методике с использованием жидкого азота в лизирующем буфере (50 мМ Tris-HCi, 50 мМ EDTA, 3% SDS, 1% 2-меркаптоэтанол; рН 8.0 - 8.3) (Lee et al., 1988) или с помощью микроволнового метода (Izumitsu et al., 2012).

Амплификацию ITS последовательностей на матрице геномной ДНК проводили с использованием пары стандартных праймеров: прямого ITS1 (5'-TCCGTAG GTG A ACCTGCGG-3 ' ) и обратного ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') (White et al., 1990). Секвенирование ПЦР продуктов проводили с обоих концов с каждым из двух праймеров (ITS1 или ITS4) на базе ЦКП «Геном» ИМБ РАН и Büsgen-Institute (Georg-August-University Gôttingen, Германия). Анализ полученных последовательностей проводили с помощью программ Chromas (Technelysium Pty Ltd.; http://technelysium.com.au) и Mega 5 (Tamura et al., 2011). Множественные выравнивания, построение филогенетического дерева, определение эволюционных дистанций между видами рода Pleurotus проводили в программе Mega 5. Для филогенетического анализа были использованы также референсные ITS последовательности штаммов из ГенБанка (wvvw.ncbi.nlm.nih.gov).

Баркодинг на основе рестрикционного анализа ITS последовательностей проводили в два этапа. На первом этапе был проведен рестрикционный анализ in silico на основе полученных ITS последовательностей для каждого вида Pleurotus в программах WatCut (University of Waterloo, Ontario, Canada; http://watcut.uwaterloo.ca/watcut/watcut/template) и CLC Sequence Viewer (www.clcbio.com). На основе консенсусных последовательностей в программе WatCut для каждого вида были построены рестрикционные карты. Четыре эн-донуклеазы рестрикции AM, BsuRI, Hinñ и EcoRI (Thermo Scientific, Vilnius, Lithuania), а также пары ферментов Alul + EcoR\ и RI + EcoKl были использованы для рестрикционного анализа амплифицированных ITS последовательностей в эксперименте.

Биоинформатический анализ структуры matA локусов половой совместимости у представителей рода Pleurotus проводили на основе взятых из электрон-

ных баз данных последовательностей монокариотических штаммов РС9 и PC 15 P. ostreatus (Joint Genome Institute, http://jgi.doe.gov); последовательностей монокариотических штаммов RV95/134.104 и RV95/957.30 P. djamor (NCBI: AY462112, AY462111); последовательностей монокариотических штаммов CCMSSC00488 и CCMSSC00489 P. etyngii (NCBI: HQ595186, HQ595187). Для проведения множественных выравниваний и поиска гомологии между последовательностями использовали программу Dialign 2.2.1 (BiBiServ, http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/diaiign). Биоинформатический анализ проводили на основе аминокислотных последовательностей гомеодоменных белков matA локуса штаммов РС9 и PC 15 Р. ostreatus. Для предсказания сигнальных последовательностей использовали программу SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP). Для предсказания сайтов локализации аминокислотных последовательностей гомеодоменных белков использовали программу PSORT (http://psort.hgc.jp) и WoLF PSORT (http://wolfpsort.org). Для предсказания вторичной и третичной структур белков использовали программы Kyte Doolittle Hydropathy Plot (http://gcat.davidson.edu/DGPB/kd/kvte-doolittle.htm) и SWISS-MODEL Secondary Structure Prediction and Domain Assignment (http://swissmodel.expasy.org).

Для клонирования генов matA локуса штаммов РС9 и PC 15 P. ostreatus использовали рекомбинантный вектор для эукариотической трансформации pYSK.7 (URA3, Атр\ 2 цт orí, ColEl orí) (Sikorski, Hieter, 1989). Для проведения гомологичной рекомбинации использовали штамм Saccharomyces cerevisiae RH1385 (МАТа, игаЗА). Для увеличения копийности полученных конструкций использовали штамм Е. coli XLl-Blue (Stratagene, Waldbronn, Germany). Процедуру трансформации S. cerevisiae проводили с использованием 1 М ацетата лития и одноцепочечной ДНК (ss DNA) согласно методике Gietz, Schiestl (2007). Селекцию трансформантов дрожжей проводили на специализированной среде SD (Yeast Synthetic Drop-out; 20 г глюкозы, 1.7 г дрожжевого экстракта, 5 г сульфата аммония, 5 г аминокислот казеина, 20 мг аденина, 20 мг триптофана, 20 г агара) по маркеру ауксотрофности ига. Приготовление компетентных клеток Е. coli проводили по стандартной методике с индукцией компетентности раствором 100 мМ СаСЬ на холоде (Mandel, Higa, 1970). Трансформацию подготовленных компетентных бактериальных клеток проводили методом «heat shock» (Dagert, Ehrlich, 1979). Отбор трансформантов проводили на среде LB с добавлением антибиотика ампициллина (0.1 мг/мл).

Амплификацию hd генов matA локуса проводили в два шага с помощью химерных праймеров, сконструированных таким образом, чтобы увеличить на

40-50 п.н. область гомологии с вектором pYSK7, что впоследствии обеспечило бы эффективную интеграцию последовательностей hd генов в вектор (Raymond etal., 1999). В работе использовали 11 пар праймеров.

Клонирование амплифицированных последовательностей генов гомеодомен-ных белков (hd) проводили с помощью метода гомологичной рекомбинации в дрожжах. Для этого 0.5 мкг полученного ПЦР-продукта, включающего исследуемый ген и длинные гомологичные вектору концы для интеграции, смешивали с 0.5 мкг вектора pYSK7, линеаризированного по уникальным сайтам рестрикции ВатШ и Нра\ (в течение 8 ч при 37°С).

Результаты и обсуждение Филогенетический анализ видов рода Pleurotus

В работе было проведено молекулярное генотипирование десяти видов рода Pleurotus: P. ostreatus, P. sajor-caju, P. pulmonarius, P. djamor, P. eryngii, Р. corrtucopiae, P. calyptratus, P. citrinopileatus, в том числе двух видов, образующих анаморфные стадии, - P. cystidiosus и P. dryinus. На основе отсеквениро-ванных ITS последовательностей 31 штамма вешенок из нашей коллекции и 10 референсных ITS последовательностей из ГенБанка было построено филогенетическое дерево родства/сходства между видами рода Pleurotus (Рисунок 1).

Виды, объединенные в один и тот же кластер на филограмме, представляют собой близкородственные виды. Филогенетическое дерево четко структурировано и подразделено на шесть основных кластеров, которые соответствуют видовой принадлежности изученных штаммов вешенок. Так, в один наиболее обширный кластер попали штаммы P. eryngii и P. ostreatus с незначительным подразделением на подкластеры, соответствующие данным видам. Эти результаты соответствуют мнению авторов (Vilgalys et al„ 1996) о существовании комплекса видов P. ostreatus, объединяющего близкородственные виды Р. ostreatus, P. pulmonarius и P. eryngii. Однако, несмотря на незначительную дивергенцию ITS последовательностей между данными видами, эти три вида, как показано, имеют четкие репродуктивные барьеры и не скрещиваются между собой (Шнырева и др., 1998, 2004; Zervakis et al., 1994).

100

64Г 1504 P. eryngii 94 pC1 P. ervnoii fFJ514549)

IH-7 P. eryngii ЭИ971—1+6 P. eryngii i H-8 P. ostreatus H-9 P. 0streatus L4 P. ostreatus 6689 P. osfreatos (AY450345)

99,

90

100

-H-5 P. ostreatus

M-9 P. ostreatus M-8 P. ostreatus 38d P. ostreatus ZBS2012 P. pulmonarius 06-1 P. pulmonarius CS-32 P.sajor-caju H-1 P. sajor<aju H-2 P. sajor-caju 14d P. pulmonarius 4203 P. pulmonarius (AY450349)

i-AG 55/466 P. cystidiosus

100 ' CBS 297.35 P. cystidiosus (AY315766) 7947 P. drvinus (AY450343)

98

88

AG 1/467 P. dryinus AG 111/470 P. dryinus AG 11/468 P. dryinus 98Г AG 30015/691 P. citrinopileatus

' ACCC51261 P. citrinopileatus (EU424285) 88 P. comucopiae 82 P. соmucopiae

ÍH-14 P. cornucopiae CBS 307.29 P. euosmus (EU424298) 8763 P. cornucopiae (AY450341) UJ AG 1/463 P. cornucopiae

59Г Z1 P. djamor 1526 P. d/amor |_i H-10 P. djamor

9CPCBS100134 P. diamor (AY265821) C-1 P. calyptratus

__9065 P. calyptratus (AY450338)

"b 1935 P. calyptratus 93* 2933 P. calyptratus

100

Рисунок 1, Филогенетическое дерево сходства между штаммами видов Pleuroitis, построенное на основе ITS последовательностей, с использованием алгоритма максимального правдоподобия Maximum Likelihood (MEGA 5). Референсные ITS последовательности, взятые из ГенБанка, подчеркнуты, их номера даны в скобках. Цифры на ветвях указывают значения бугстрепа (в %). Длина ветвей соответствует количеству накопленных нуклеотидных замен в анализируемых ДНК последовательностях.

В нашем исследовании интересным является факт неоднородности кластера P. ostreatus, который подразделяется на два подкластера. В первый подкластер попали более близкие виду P. eryngii культивируемые штаммы P. ostreatus (штаммы Н-8, Н-9 и L4), в то время как во втором подкластере, более удален-

ном от вида P. eryngii, объединились природные изоляты вешенки устричной (штаммы М-9, М-8, 38d и изолят из экстремального местообитания Н-5) (Рисунок I). Данный результат может косвенно свидетельствовать в пользу предположения о том, что промышленное культивирование вешенок и связанный с ним селекционный процесс оказывают значительное влияние не только на общее биоразнообразие внедренных в культивирование штаммов, но и на генетическое расхождение и внутривидовую дифференциацию культивируемых штаммов. Еще один близкий виду P. ostreatus подкластер штаммов включает представителей видов P. pulmonarius и P. sajor-caju, чьи ITS последовательности оказались максимально сходными. Детальный анализ видовой принадлежности этих двух близкородственных видов представлен далее.

Некоторое сомнение вызвал видовой статус коммерческого штамма Н-14 Р. cornucopiae; при сравнении с пулом ITS последовательностей в ГенБанке ITS последовательность штамма Н-14 показала 99% сходства с последовательностью штамма CBS 307.29 Pleurotus euosmus (EU424298). Проанализировав наличие последовательностей последнего вида в ГенБанке, оказалось, что вид Р. euosmus представлен только одним штаммом в голландской коллекции типовых культур CBS. Причем этот вид был описан в Великобритании еще в 1893 году в сборнике «British Fungus-Flora» под именем Agarieus (Pleurotus) euosmus (Massee, 1893). Так как точное происхождение культивируемого штамма Н-14 в нашей коллекции не установлено, вполне логично было предположить, что данный штамм, возможно, является представителем вида P. euosmus. Детальный анализ видовой принадлежности штамма Н-14 представлен в следующей главе.

В связи с некоторыми сложностями разграничения комплексных видов на филограмме можно говорить о недостаточной разрешающей способности метода анализа ITS последовательностей. В подобных случаях целесообразно использовать другие (или дополнительные) генные последовательности в филогенетическом анализе или, как предложено в данной работе, прибегать к классическому генетическому анализу репродуктивной изоляции (половой несовместимости) между близкородственными видами.

В данной работе были проанализированы также два вида вешенок - Р. cystidiosus и P. dryinus, - которые способны образовывать анаморфные структуры и размножаться бесполым способом. Эти виды сформировали четко обособленные кластеры на филограмме с максимальным доверительным интервалом (Bs.100%). Филогенетическое родство между двумя видами с анаморфными стадиями - P. cystidiosus и P. dryinus -, отраженное на филограмме, незначи-

тельно (коэффициент расхождения 0.155, Таблица 2). Поэтому можно предположить, что виды Р. су<;11сИо<;ш- и Р. (1гу1пш приобрели способность бесполого размножения конидиями независимо друг от друга в ходе эволюционного процесса как возможный эффективный механизм распространения этих видов в природе.

Параллельно с построением филогенетического дерева была проведена оценка относительных эволюционных расстояний между представителями каждого вида (Таблица 2). Низкие значения эволюционных дистанций указывают на высокое родство между видами, как, например, в случае близкородственных видов Р. ргйтопапш и Р. $а]ог-са)и, эволюционное расстояние между которыми равно 0.000. Наиболее высокие значения эволюционных дистанций наблюдали между образующим коремии видом Р. сухйсИот^ и другими видами, в особенности группами Р. егущи, Р. ох!геа!и.^, Р. ри1топагшз и Р. .чщог-ссуи (дистанции от 0.304 до 0.319). Общий коэффициент генетического разнообразия внутри рода Р1еигоШ$, составил 0.196 при величине стандартного отклонения 0.033 (Таблица 2).

Таблица 2. Эволюционные дистанции между видами рода Pleitrotus

P.eryn* P.ostr P.pulm P.s-c P. cyst P. dry P.citr P.corn P.dj P.caly

Р. егуп 0.007 0010 0.010 0056 0.036 0.039 0.040 0.053 0.049

P.ostr 0.024** 0.006 0.006 0.058 0.035 0.039 0.039 0.054 0.050

P.pulm 0.038 0.021 0.000 0.057 0.034 0.039 0.039 0.053 0.046

P.s-c 0.038 0.021 0.000 0.056 0.034 0.038 0.039 0.053 0.046

P. cyst 0.306 0.319 0.306 0.304 0.030 0.043 0041 0.049 0.048

P. dry 0.198 0.197 0 186 0.184 0.155 0.027 0.026 0.037 0.039

P.citr 0.221 0.219 0.214 0.212 0.235 0.139 0.007 0.039 0.037

P. corn 0.221 0.220 0.214 0.211 0.228 0.134 0.025 0.037 0.037

p.dj 0.292 0.296 0.288 0.285 0.269 0.201 0.216 0.208 0.014

P.caly 0.264 0.267 0.247 0.244 0.260 0.213 0.204 0.201 0.068

Примечание: 'сокращенные названия штаммов, использованных в анализе: Р.егуп — изолят 1504 P. eryngii, P.ostr- изолят М-9 P. ostreatus, P.pulm - изолят 06-1 P. pulmonariits, P.s-c- штамм CS-32 P. sajor-caju, P.cysl - изолят AG 55/466 P. cystidiosas, P.citr— изолят AG 30015/691 P. citrino-pileatus, P. corn - штамм H-14 P. cornucopiae, P. dj - изолят 1526 P. djamor. P. caty - изолят С-1 P. calyptralus.

"Значения эволюционных дистанций указаны под диагональю; значения стандартных отклонений приведены над диагональю. Эволюционные расстояния рассчитаны согласно модели Maximum Composite Likelihood (программа Mega 5), учитывая замены нуклеотидов по каждой позиции в ITS последовательностях для каждого вида.

Анализ половой совместимости в пределах комплексных видов рода

Pleurotus.

Мон-мон скрещивания

Анализ вариабельности ITS последовательностей оказался недостаточным для видовой дифференциации близкородственных видов P. sajor-caju и Р. pulmonarius, а также P. cornucopiae и P. euosmus. Поэтому наряду с дифференциацией видов по молекулярным признакам было предложено провести анализ репродуктивной изоляции мевду видами с применением скрещиваний моноба-зидиоспоровых тестеров половой совместимости.

Детальный анализ половой совместимости на основе мон-мон скрещиваний был проведен между близкородственными видами P. sajor-caju и P. pulmonarius и видами P. euosmus и P. cornucopiae. Филогенетический анализ не позволил достоверно дифференцировать данные виды. Для анализа половой совместимости предварительно для каждого из этих видов было получено по четыре моно-базидиоспоровых тестера (АХВХ, АУВУ, АХВУ, АУВХ) путем проведения мон-мон скрещиваний между базидиоспоровым потомством, полученным из споровых отпечатков. Далее были проведены мон-мон скрещивания между тестерами половой совместимости от разных видов для анализа наличия репродуктивных барьеров (половой несовместимости) между анализируемыми видами. По результатам скрещиваний тестеров «спорных» видов было показано, что, несмотря на сходство морфологии и ITS последовательностей, виды P. sajor-caju и Р. pulmonarius являются репродуктивно изолированными, и, следовательно, отдельными видами (Таблица 3). Во всяком случае, это заключение правомерно для трех штаммов P. sajor-caju, использованных в настоящем анализе. Следует заметить, что видовой статус P. sajor-caju до сих пор обсуждается в литературе.

В результате скрещиваний между тестерами вида Н- ! 4 P. cornucopiae (предположительно P. euosmus) и другими представителями P. cornucopiae из разных коллекций (штаммы 88, AG IV/675, AG 1/463, AG III/465 и AG II/464) не было выявлено репродуктивной изоляции: исследованные штаммы были совместимы по полу в 100% случаев (данные представлены в диссертации). Следовательно, эти виды относятся к одной интерстерильной группе, и, неа наш взгляд, не целесообразно выделять P. euosmus в отдельный вид.

По результатам филогенетического анализа четкую подразделенность на подкластеры (субклады) наблюдали между культивируемыми сортами и природными изолятами P. ostreatus. Для некоторых представителей как культивируемых, так и природных штаммов были получены тестеры половой совместимости. В ходе скрещиваний культивируемых сортов (L/4 и Sommer) P. ostreatus

был обнаружен общий аллель matB локуеа, что свидетельствует об общем происхождении этих сортов европейской селекции: 25 % совместимых по полу комбинаций в скрещиваниях гаплоидных тестеров (4 тестера х 4 тестера = 16 комбинаций) свидетельствуют об общих аллелях по обоим локусам половой совместимости; 75% (12 из 16-ти возможных) совместимых по полу комбинаций свидетельствуют о наличии общего аллеля matB локуса (Таблица 4).

При скрещиваниях культивируемых штаммов (L/4 и Sommer) с природными изолятами (## 54, 55 и Н-5) P. ostreatus репродуктивной изоляции обнаружено не было (данные представлены в диссертации). Следовательно, несмотря на некоторую внутривидовую дифференциацию по молекулярным маркерам, репродуктивных барьеров между культивируемыми сортами и природными изолятами вешенки устричной не выявлено. Можно предположить, что некоторые нук-леотидные последовательности, такие как вариабельные ITS участки кластера генов рРНК, накапливают нуклеотидные замены быстрее, чем возникают репродуктивные барьеры в пределах вида.

Таблица 3. Мон-мон скрещивания между гаплоидными тестерами половой совмес-

тимости видов P. sajor-caju и P.pulmonarius

Гаплоидные тестеры половой совместимости анализируемых штаммов CS-32 H-l Н-2

гт2 т8 ml2 т14 т5 т7 т8 тЮ тб т7 т9 mil

AI Bf А1В2 A2I1I А 2112 АЗВЗ АЗВ4 А4ВЗ А4В4 А5В5 А5ВГ, А6В5 А6В6

а 'S« 'О «L о К CS-32 т2 АНН - - - +

ш8 А1В2 - - + —

ml2 А2В1 - + - -

ш14 А2В2 + - - -

ас т5 A3 ИЗ + + + + - - - +

т7 A HU + + + + - - + -

т8 А4ВЗ + + + + - + - -

тЮ А4В4 + + + + + - - -

Н-2 тб А5В5 + + + + + + + + - - - +

т7 А5В6 + + + + + + + + - - + -

т9 А6В5 + + + + + + + + - + - -

mil АЙВ6 + + + + + + + + + - - -

3 с о s о S ft. 06-1 ml АхВх - - - - - - - - - - - -

тб АуВу

т8 АуВх

mil АуВу

Примечание. «+» - половая совместимость и образование пряжек; «-» - половая несовместимость. *АхВу - аллели локусов половой совместимости.

Таблица 4. Мон-мон скрещивания между гаплоидными тестерами коммерческих культивируемых штаммов (сортов) Р. о$1геа1ш

Гаплоидные тестеры L/4 Sommer

половой совместимости штаммов (сортов) ml 11112 ml4 mil ml m4 m5 m2

AIB1 A1B2 A2BI A2B2 A3B3 A3B1 A4B3 A4B1

ml A1BI - - - + + - + -

ml2 A1B2 _ + + + + +

-J ml 4 A2B1 - - + - + _

mil A2B2 ■ - - - + + + +

ml A3B3 + + + + - - +

и £ m4 A3 В J - + - + - - + -

о 1Л m5 m2 A4B3 A4B1 + + + + + + + + - -

Примечания. «+» - половая совместимость; «-» - половая несовместимость; В] — общий аллель тшВ локуса типа спаривания.

Таким образом, в нашем исследовании были проанализированы дикорастущие и культивируемые штаммы вешенок, относящиеся к восьми интерстерильным группам, или видовым комплексам (Petersen et al.y 2011). Основными критериями при анализе комплексных видов и для разрешения спорных вопросов о видовом статусе некоторых коллекционных штаммов служили молекулярный анализ сходства ITS-последовательностей и генетический анализ половой совместимости между «спорными» видами. Было подтверждено близкое родство между видами P. pulmonarius и P. sajor-caju; причем последний вид, согласно мнению некоторых авторов, недавно был помещен в род Lentinus (Grand et al., 2011). Тем не менее, американские микологи Grand, Hughes и Petersen (2011) показали, что штаммы P. sajor-caju из их коллекции не имели репродуктивных барьеров со штаммами P. pulmonarius (Fr.) Quel. Согласно нашим исследованиям, основанным на схожести морфологии и филогенетическом родстве, вид Р. sajor-caju все-таки следует относить к роду Pleurotus, а не Lentinus. Во всяком случае, данный вывод правомерен для трех коммерческих штаммов, которые были использованы в нашей работе.

В проведенном филогенетическом анализе было также подтверждено близкое родство между культивируемыми видами P. cornucopiae и P. citrinopileatus, причем, несмотря на то, что штаммы вешенки воронковидной, P. cornucopiae

были взяты из разных источников (коллекций), все они продемонстрировали высокую степень сходства как по молекулярным признакам, так и при генетическом анализе половой совместимости, включая штамм Н-14 P. cornucopiae. Однако, этот штамм по ITS последовательности был максимально сходен со штаммом CBS 307.29 P. euosmus, что могло бы свидетельствовать об их общем видовом статусе. Но в виду полной половой совместимости штамма Н-14 с другими представителями вида P. cornucopiae, нет никакого основания относить этот штамм к виду P. euosmus (Таблица 4).

Согласно проведенному филогенетическому анализу, виды рода Pleurotus являются группами монофилетического происхождения и в эволюционном плане располагаются довольно близко друг от друга. Можно предположить, что немаловажную роль в расхождении видов вешенки на данный момент играет селекционный процесс производственных штаммов, что в итоге может привести к формированию новых репродуктивно изолированных биологических видов в пределах рода Pleurotus. Однако, проведенный анализ репродуктивной изоляции между производственными и дикорастущими штаммами P. ostreatus не подтвердил эту гипотезу.

Баркодинг видов рода Pleurotus

При разработке системы баркодов для представителей рода Pleurotus помимо штаммов из нашей коллекции в анализ были взяты ITS1-5.8S-ITS2 последовательности восьми редких видов из ГенБанка, которые не представлены в нашей коллекции: виды P. abieticola, P. albidus, P. australis, P. fuscoquamulosus, Р. levis, P. populinus, P. purpureo-olivaceus, P. tuber-regium. Для молекулярного ге-нотипирования, или баркодинга, было предложено четыре маркера на основе сайтов рестрикции ITS последовательностей. Была разработана схема проведения энзиматического расщепления амплифицированной ITS-последователь-ности эндонуклеазами рестрикции. Поиск уникальных сайтов рестрикции сперва проводили in silico с последующей апробацией в эксперименте. Уникальные сайты рестрикции и размер фрагментов рестрикции служили в качестве молекулярных маркеров (баркодов) для идентификации видов. Из 35 проанализированных in silico рестриктаз только три были способны дифференцировать виды Pleurotus: эндонуклеазы Alu\, BsuR\, Hintt, а также £coRI в качестве вспомогательной при двойной рестрикции. Рестрикционные карты для видов вешенок представлены на Рисунке 2. В результате молекулярного генотипирования на основе баркодов 18-ти видов рода Pleurotus было выявлено 17 генотипов.

Л ovv.Y-.v/.-s LLJ_I_Ш_ \ _I 1

.... Abt+zV&i * *------ >on~-'■ ■ —' > « ¿4»u- >ill -

^ lp £«,.•?.! .....-4- is: tp-++- .4: ¡v-'»-*- i>a ^-

£,v.RJ .....-«- i J : b;--—!CC -140 bp--+M- \ 0Я h>,-

ч- .чм.р-- -—-

£ в s £ ни на

л,ill 1 111 11 =

,-i<:-'Г ■*- 5S»l>|>-k>4-v.-!^ ■

л- Vj-l.p----—-

itfSlp BuiRl .....-«...... 'V-------------*■■* ................................. ■».'•■! !>;>....................................

.....- >f-I-P------

- 'v-sbp - - ......

-

P. mfor-cnj«

ES 3 ZHH

ill I H4-

.»."/-I 4----bp-

A:

+--- bp- » « bp -

•£SVR: -•■-»- u,--- ^ i »—pjtjv -

:::::::г ¡й!*' "--

P. m

«iijj •'';''!if;;if!

w1

¿^•.'.^-¿•v-Pi ......*- }П 1;; -—- » < io. I-*; .»> м ■ — ii-i \i

6$ lip

P ,!j<,w.v.

.».'i.'i -— -ill --140 tw—-bn ■

'1-е, <;F.i .................................................................................»•■«.................................-

s • <- :: f I-,----i'4o -

J-£n>RJ «- Ш tv--^iw-

Лг-.-П *- ¿ISty---■- by-

e з £ и и

•*- i "л It; —h

Н!>лT «- >0- b}.--

£ А E H 3

Р.еопч,соГ1ае 4-H-1-1-

.... AM--..... -

65; bp 5v)?J <-

Ss.'iRI-ic'oRI -:;bi ~

Рисунок 2. Рестрикционные карты на основе ITS последовательностей для видов рода Pleurotus.

Генотипы близкородственных видов P. sajor-caju и P. pulmonarius были идентичны, поэтому дифференциация данных видов на основе предложенных молекулярных маркеров была затруднена. Трудно дифференцируемыми на основе молекулярных баркодов оказались также виды P. cornucopiae и Р. euosmus. Экспериментально была подтверждена эффективность молекулярной идентификации видов рода Pleurotus при помощи рестрикционного анализа ам-плифицированной ITS1-5.8S-ITS2 последовательности с использованием четырех подобранных эндонуклеаз рестрикции Alu\, 5jhRI, Hinfl и ЕсоК\. Предложенный метод баркодинга является хорошей альтернативой рутинному секве-нированию ITS последовательностей, особенно при анализе большого количества образцов, так как является более дешевым и менее затратным по времени.

Анализ генов половой совместимости у представителей рода Pleurotus

Одной из задач исследования было проведение молекулярно-структурного анализа in silico matA локуса половой совместимости. Локус matA кодирует гомео-доменные белки (HD), которые выполняют функцию транскрипционных факторов, участвуя в образовании и морфогенезе дикариотического фертильного мицелия. Проведенный молекулярный структурный анализ in silico аминокислотных последовательностей генов гомеодоменных белков matA локуса половой совместимости для видов P. ostreatus, P. djamor и P. eryngii показал наличие у всех трех видов консервативных мотивов WFXNXR внутри ДНК-связывающих доменов и высоковариабельных доменов димеризации на N-конце белковых молекул. Более детальный анализ был проведен на двух гаплоидных штаммах P. ostreatus - РС9 и PC 15, геномы которых были полностью от-секвенированы, а результаты опубликованы на сайте DOE JGI (Joint Genome Institute, Walnut Creek, CA; http://genome.jgi.doe.gov). Проведенный анализ in silico показал чрезвычайно дивергентную структуру matA локуса у двух этих штаммов: matA локус штамма РС9 представлен одной копией гена hdl (класс HDI белков) и одной копией гена hd2 (класс HD2 белков), в то время как matA локус штамма РС15 имеет две копии hdl.l и hdl.2 (класс HD1 белков) и одну копию hd2 (класс HD2 белков) (Рисунок 3).

В ходе анализа было выявлено, что нуклеотидные последовательности hd генов очень вариабельны, и сравнение их возможно исключительно на аминокислотном уровне. В результате анализа аминокислотных последовательностей in silico в программах Kyte Doolittle Hydropathy Plot, WoLF PSORT и SignalP 4.1 было показано, что все исследуемые HD белки обладают глобулярной структурой и характеризуются ядерной локализацией.

P. ostreatus PC9

: 9 ООО п.н.

imp

P. ostreatus PC 15

пир

15 ООО п.н.

Iitl2

2081 п.н. fS

Рисунок 3. Структура matA локуса половой совместимости и схема аллельных взаимодействий гомеодоменных белков P. ostreatus. Ген mip (mitochondrial intermediate peptidase) кодирует пептидазу; ген fg (beta-flanking protein) кодирует белок с неизвестной функцией; гены hd кодируют соответствующие гомеодоменные белки.

У всех HD последовательностей был обнаружен вариабельный N-конец, участвующий в димеризации HD1-HD2 белков и в образовании гетеродимерного белка - активного транскрипционного фактора, а также более консервативный ДНК-связывающий домен. У обоих классов HD последовательностей при помощи программы SWISS-MODEL (Arnold et al., 2006) была предсказана вторичная структура ДНК-связывающего домена, который расположен между 125-ой и 170-ой аминокислотами у белков HD1 класса и 145-ой и 200-ой аминокислотами у белков HD2 класса. Структурная организация исследуемых белковых молекул оказалась характерной для семейства гомеодоменных белков (Homeodomain, Homeobox): три а-спирали, соединенные небольшими петлями. В третьей спирали находится ДНК-связывающий мотив WFXNXR, первая и вторая спирали участвуют в связывании белковой молекулы (транскрипционного фактора) с ДНК и в стабилизации всего комплекса. Для исследуемых аминокислотных последовательностей класса HD1 при помощи программы SWISS-MODEL были найдены протяженные области гомологий с белками этого класса, которые участвуют в контроле полового размножения у модельного базиди-ального гриба Coprinopsis cinerea. Для всех последовательностей были предложены модели структурной организации ДНК-связывающего домена. Белки класса HD2 обладали более консервативной структурой ДНК-связывающего гомеодомена; при помощи программы SWISS-MODEL были предложены моде-

ли димеризации белковых молекул и связывания с ДНК по аналогии с гомологичными белками расшифрованной структуры.

Было проведено клонирование исследуемых hd генов matA локуса штаммов РС9 и PC 15 (гены hdl, hd2, hdl.l, hdl.2, hd2). Было получено десять рекомби-нантных конструкций для пяти hd генов, поставленных под собственный и конститутивный промоторы в рекомбинантном векторе pYSK7, который пригоден для трансформации в эукариотические клетки (схема вектора pYSK7 показана на Рисунке 4а). Для этого последовательности hd генов были амплифицированы в два этапа на матрице геномной ДНК двух штаммов РС9 и PC 15 с предварительно подобранными химерными праймерами. Клонирование в вектор pYSK7 проводили методом гомологичной рекомбинации в клетках дрожжей. Амплификацию генных последовательностей с химерными праймерами проводили в два этапа, что позволило увеличить область гомологии ампликона с плазмидой и, соответственно, повысить эффективность интеграции амплифицированного фрагмента ДНК в вектор. Схема эксперимента представлена на Рисунке 46. Полученные рекомбинантные конструкции в дальнейшем планируется трансформировать в гаплоидные клетки базидиального гриба С.cinerea с целью анализа взаимной совместимости гомеодоменных белков от гетерологичных хозяев и возможности формирования функциональных гетеродимерных факторов транскрипции, а также анализа совместимости систем размножения различных видов базидиальных грибов.

д 2цт ori

Рисунок 4. Схема эксперимента по интеграции последовательностей hd генов в эука-риотический вектор pYSK7. (а). Вектор pYSK7 для клонирования и экспрессии генов эукариот. (б). Схема пошаговой амплификации hd генов и интеграции полученного ПЦР-продукта в вектор pYSK7 для последующей экспрессии в монокариотических гаплоидных клетках С. cinerea.

б

Iccl T

gpcUI П

выводы

1. Разработан подход для молекулярного генотипирования и молекулярной идентификации видов рода Pteurotus - баркодинг - на основе рестрикционно-го анализа ITS-последовательности; для баркодинга предложено использовать четыре эндонуклеазы рестрикции - Alu\, ÄrwRI, Hintt и ЕсоШ в качестве вспомогательной. Данный метод позволяет быстро определить видовую принадлежность штаммов, не используя процедуру секвенирования.

2. При анализе 18 видов рода Pleurotus было выявлено 17 генотипов. Показано, что генотипирование штаммов Р. pulmonarius, Р. sajor-caju, Р. cornucopiae и Р. euosmus на основе молекулярных маркеров требует дополнительного анализа половой совместимости. Для разграничения близкородственных видов базидиальных грибов необходимо применять комплексный подход, сочетающий молекулярные и классические генетические методы.

3. Показано, что виды Р. sajor-caju и Р. pulmonarius, несмотря на сходство морфологии и идентичность ITS последовательностей рДНК кластера, являются репродуктивно изолированными видами. Виды Р. euosmus и Р. cornucopiae не показали наличия репродуктивного барьера, следовательно, это один биологический вид.

4. Проведенный in silico молекулярный структурный анализ генов гомеодомен-ных белков matA локуса половой совместимости для видов Р. ostreatus, Р. djamor и Р. eryngii показал наличие у этих видов консервативных мотивов WFXNXR в ДНК-связывающих доменах и высоковариабельных димериза-ционных доменов на N-конце.

5. Показана чрезвычайно дивергентная структура matA локуса у двух совместимых по полу гаплоидных штаммов (РС9 и PC 15) вида Р. ostreatus: matA локус штамма РС9 представлен одной копией гена hdl и одной копией гена hd2, в то время как matA локус штамма РС15 имеет две копии hdl. 1 и hdl.2 и одну копию гена hd2 .

6. Были созданы 10 рекомбинантных конструкций на основе pYSK7 вектора для трансформации hd генов Р. ostreatus в клетки С. cinerea с целью анализа их экспрессии.

Благодарности. Я выражаю огромную благодарность своему научному руководителю д.б.н., профессору Дьякову Ю.Т. за чуткое руководство и всестороннюю поддержку на всех этапах выполнения работы. Искренне благодарю д.б.н., профессора Шныреву A.B. за неоценимую помощь во время планирования и проведения экспериментов и научные консультации. Благодарю профес-

сора У. Кыос и коллег из Лаборатории молекулярной лесной биотехнологии за

гостеприимство во время моего визита в университет г. Геттингена, Германия.

Отдельное спасибо всем сотрудникам кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ, а также друзьям и близким.

Работа поддержана грантами РФФИ № 12-04-09403-моб_з, № 13-04-

90607_Арм_а; Erasmus Mundus TRIPLEI2011397.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах из перечня ВАК

1. Шнырева А. А., Сиволапова А. Б., Шнырева А. В. Съедобные культивируемые грибы вешенки Pleurotus sajor-caju и P. pulmonarius сходны по морфологии, но являются самостоятельными репродуктивно изолированными видами // Генетика. - 2012. - Т 48. - N11. - С. 1260-1270.

2. Шнырева А. А., Шнырева А. В. Филогенетический анализ видов рода Pleurotus //Генетика. -2015. -Т 51. - N2. -С. 177-187.

3. Шнырева А. А., Шнырева А. В. Получение плодовых тел некоторых видов вешенок Pleurotus spp. в лабораторных условиях // Вестник Московского университета. Серия 16, Биология. - 2015. -N4. В печати.

Статьи в других изданиях

1. Shnyreva A. A., Sivolapova А. В., Shnyreva А. V. Cultivated edible mushrooms Pleurotus pulmonarius and P. sajor-caju are two separate species as established by molecular and crossing analyses // Mushroom Science XVIII. Proceedings of the 18th Congress of the International Society for Mushroom Science. China Agriculture Press, Bejing China. 2012. - C. 307-314.

2. Shnyreva A. A., Shnyreva A. V., Kues U. The matA mating type locus of Pleurotus ostreatus II Proceedings of the 7th International Medicinal Mushroom Conference. Beijing, China. 2013. - C. 729-739.

3. Шнырева А. А., Шнырева А. В. Регуляция половой совместимости у базиди-альных грибов: генетические программы аллельных взаимодействий гомео-доменных белков // Проблемы микологии и фитопатологии в XXI веке. КопиР Групп Спб. 2013.- С. 295-297.

Материалы и тезисы конференций

1. Shnyreva A. A., Sivolapova А. В., Shnyreva А. V. Cultivated Edible Mushrooms Pleurotus pulmonarius and P. sajor-caju are two separate species as established by

molecular and crossing analyses // Abstracts. 18th Congress of the International Society for Mushroom Science, Beijing, China. 2012. - P. 50-51.

2. Шнырева А. А., Сиволапова А.Б. Съедобные культивируемые грибы рода вешенка, Pleurotus pulmonarius и P. sajor-caju, сходные по морфологии, являются репродуктивно изолированными видами по данным генетического анализа // Материалы Международного молодежного научного форума «Ло-моносов-2012». М.: МАКС Пресс, 2012. - С. 156.

3. Шнырева А.А., Шнырева А.В. Молекулярно-генетический анализ съедобных культивируемых грибов рода Pleurotus II Современная микология в России. Материалы 3-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии. 2012. - Т. 3. - С. 52-53.

4. Шнырева А.А., Шнырева А.В. Регуляция пола у грибов: генетические программы аллельных взаимодействий феромонов и их рецепторов // Современная микология в России. Материалы 3-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии. 2012. - Т. 3. - С. 87-88.

5. Shnyreva А.А., Shnyreva A.V., Kues U. The MatA mating type locus of Pleurotus ostreatus И Abstracts of the 7th International Medicinal Mushroom Conference. Beijing, China. 2013. - C. 64-65.

6. Shnyreva A.A., Shnyreva A.V., Kues U. Species identification and molecular barcodes in the genus Pleurotus И Abstracts of 12th European Conference on Fungal Genetics. Seville, Spain. 2014. - C.3I2.

7. Шнырева A.A., Шнырева А.В. Генотипирование культивируемых штаммов съедобного гриба вешенки Pleurotus II Успехи медицинской микологии. Материалы 6-го Всероссийского конгресса по медицинской микологии. М.: Национальная академия микологии. 2014. - Т. 12. - С. 272-273.

8. Шнырева А.А., Шнырева А.В. Генетические ресурсы древоразрушающих по-липоровых грибов (отдел Basidiomycota) в качестве перспективных продуцентов биотехпродуктов // Успехи медицинской микологии. Материалы 6-го Всероссийского конгресса по медицинской микологии. М.: Национальная академия микологии. 2014. - Т. 12. - С. 274-277.

9. Shnyreva A., Shnyreva A., Kues U. Molecular barcodes for basidiomycete fungi Pleurotus // 10th International Mycological Congress (IMC10) eBook of Abstracts. Bangkok, Thailand. 2014. - C. 649.

Статья, опубликованная не по теме диссертации Кузьмин И.В., Шнырева А.А., Нефедова Л.Н., Ким А.И. Анализ экспрессии гена

Grp, геномного гомолога гена gag ретротранспозона gypsy Drosophila melanogaster, на

уровне трансляции // Генетика. - 2011. - Т. 47,- № 9. - С. 1275-1277.

Подписано в печать: 10.03.2015 Объем: 1,21 пл. Тираж: 110 экз. Заказ № 361 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru