Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Популяционная биология грибов с гаплоидным и гапло-дикариотическим жизненными циклами

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Популяционная биология грибов с гаплоидным и гапло-дикариотическим жизненными циклами"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ШНЫРЕВА Алла Викторовна

ПОПУЛЯЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ ГРИБОВ С ГАПЛОИДНЫМ И ГАПЛО-ДИКАРИОТИЧЕСКИМ ЖИЗНЕННЫМИ ЦИКЛАМИ

03.00.24 - микология

Диссертация

в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, академик РАСХН Левитин Марк Михайлович доктор биологических наук, профессор Наумов Геннадий Иванович

доктор биологических наук, профессор Иванов Александр Иванович

Ведущая организация:

Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН, Санкт-Петербург

Защита состоится 11 февраля 2005 года в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

119992, ГСП-2, г. Москва, Ленинские горн, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, ауд. М-1, тел/факс (095) 939 39 70.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Диссертация в виде научного доклада разослана декабря 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

М.А. Гусаковская

¿iSSrtS

Актуальность исследований. Работа посвящена сравнительному изучению структуры популяций видов грибов с преобладанием полового и бесполого размножения. Основные исследования проведены на двух хозяйственно важных видах: 1) фитопатогенном грибе Pyricularia oryzae Cav. (телеоморфа Magnaporthe grísea; класс Ascomycetes) -возбудителе одного из наиболее вредоносных и распространенных заболеваний риса, характеризуется гаплоидным циклом развития; и 2) базидиальном грибе вешенка (Pleurotos pulmonarius (Ft.) Quel, и P. ostreatus (Fr.) Kumm.) с четко выраженным гапло-дикариотическим жизненным циклом. Вешенка является вторым после шампиньона по объему производства культивируемым видом. Изучение популяционной структуры данных видов и анализ протекающих в природе микроэволюционных процессов в значительной степени способны расширить возможности использования природных генетических ресурсов видов съедобных грибов и повысить эффективность борьбы с фитопатогенами.

Грибы образуют популяции, описание которых обычно не подходит под классические модели популяционной генетики. Часто бывает сложно разграничить не только популяции, но и грибные индивидуумы в природе, и это, прежде всего, связано со сложными системами рекомбинаций, характерными для грибов. На популяционную структуру вида оказывают влияние многие факторы, и, в первую очередь, такие как способ размножения и распространения гриба в природе, доля полового и бесполого воспроизведения. Кроме того, многие виды грибов обладают сложной внутривидовой структурой, характеризующейся наличием видов-двойников, что может бьггь следствием как дифференциации вида в целом, так и особенностей паразитизма на различных растениях-хозяевах у фитопатогенов. Особенности жизненного цикла и тетраполярной системы половой совместимости, теоретически обеспечивающей высокую степень панмиксиса, а также наличие системы вегетативной несовместимости, которая позволяет очертить границы отдельных клонов (индивидуумов) в пространстве, определили выбор видов рода Pleurotus в качестве модельного объекта в данном исследовании. Выбор фитопатогенного гриба P. oryzae был обусловлен особенностями бесполого размножения, связанными с формированием клональных популяций с высоким уровнем природного полиморфизма.

Несмотря на многочисленные популяционные исследования грибов, до сих пор не было проведено обобщающего анализа, который позволил бы не только детально охарактеризовать популяционно-генетическую структуру видов с различными системами размножения, но и выдвинуть концепцию о главенствующей роли способа размножения грибов в формировании структуры популяций и биологического разнообразия в целом.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было провести сравнительное исследование особенностей структуры популяций грибов, имеющих различные системы размножения и показать, как системы размножения влияют на формирование популяционной структуры вида, а также применить популяционно-генетические подходы в прикладных исследованиях. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

РОС Н>\С«ПНМЬНАЯ ЕИ£ "!"hTF* А

1. Определить степень генного и генотипического разнообразия в популяциях базидиальных грибов из рода Pleurotus и фитопатогенного аскомицета Magnaporthe grísea (анаморфа Р. oryzaé), утратившего половую стадию;

2. Провести сравнительный анализ уровня изменчивости в популяциях агамных видов и видов с преимущественным половым воспроизведением;

3. Оценить вклад полового и бесполого размножения, инбридинга в структуру панмиксных популяций;

4. Охарактеризовать популяционно-генетическую структуру изучаемых видов, степень генетической дифференциации, а также факторы, влияющие на формирование данной структуры;

5. Использовать гтопуляционно-генетические подходы и параметры в прикладных целях -мониторинг мутагенов в окружающей среде и жизнеобеспечение космических аппаратов, культивирование съедобных грибов.

Научная новизна. Впервые исследована генетическая структура популяций вешенки и пирикулярии на территории России. Установлен вклад рекомбинации, генного дрейфа, миграции и отбора в изменении структуры популяций данных видов. Генетическими методами подтверждено наличие двух видов вешенки, имеющих перекрывающиеся морфологические признаки, и высказана гипотеза о том, что дивергенция популяций, приведшая к аллопатрическому видообразованию, вызвана адаптациями к разным погодным условиям. Впервые в природных условиях обнаружен новый тип рекомбинации между штаммами вешенки - ди-мон скрещивания. Обнаружен высокий процент ауксотрофных штаммов в природных популяциях пирикулярии. Новый оригинальный, разработанный в нашей лаборатории метод пеллетообразоваяия позволил проводить генетический анализ базидиальных грибов без скрещиваний, значительно ускорить и расширить рамки популяционно-генетического анализа. Показана чрезвычайно высокая вариабельность и высокий уровень внутриклональной спонтанной изменчивости возбудителя пирикуляриоза риса Р. oryzae в природе, сопоставимый с внутрипопуляционным. Предложено проводить многократные клонирования штаммов, используемых в работах при дифференциации рас фитопаггогена.

Результаты работы вносят существенный вклад в развитие концепций популяционной биологии грибов и микроэволюции видов. На основе обобщенного анализа результатов предложены подходы к выбору адекватных популяционно-генетических параметров для оценки внутривидового разнообразия и структуры природных популяций грибов с различными жизненными циклами.

Впервые проведенный молекулярно-генетический анализ семейства лакказных генов у культивируемого шампиньона A bisporus показал их тандемную организацию в геноме и дифференцированную экспрессию в зависимости от жизненной фазы гриба.

Практическая значимость и реализация результатов исследований. Впервые подходы, используемые в популяционной биологии, были применены для анализа генотипического разнообразия практически важных видов съедобных грибов, а также доминирующих видов микобиоты орбитального комплекса «Мир». Метод

г

пеллетообразования использован для оценки мутагенного фона среды обитания на орбитальном комплексе «Мир» в рамках программы «Биоконт» и «Полиген» при сотрудничестве с ИОГен РАН. Показано, что анализ генетической вариабельности и полиморфизма видов грибов может быть одним из подходов в оценке критических мест обитания с высоким содержанием поллютантов и способности популяций адаптироваться к кардинальным изменениям условий среды обитания, а использованные в данном исследовании изозимные и полиморфные ДНК признаки могут служить специфическими диагностическими маркерами на обширной пространственной и временной шкале.

Впервые в России был проведен сравнительный анализ коммерческих сортов и штаммов шампиньона и вешенки на основании белковых и ДНК-полиморфизмов, что позволило установить генетическое родство сортов и провести их молекулярную паспортизацию, что важно в практике грибоводства как для мелких хозяйств, так и для крупных производителей съедобных грибов, поддерживающих в своих лабораториях под разными названиями огромные коллекции зачастую генетически идентичных сортов. Сравнительный анализ биодесгрукционной активности природных штаммов и культивируемых сортов вешенки -важного фактора в эффективном освоении субстратов, - позволил рекомендовать некоторые штаммы для внедрения в промышленное культивирование.

Выдвинутые теоретические положения работы используются в курсе лекций и на практических занятиях по генетике грибов на кафедре микологии и альгологии МГУ.

Благодарности автора. Выражаю глубокую признательность зав. каф. микологии и альгологии МГУ проф. Ю.Т. Дьякову за постоянное внимание и поддержку в работе, а также ценные замечания, высказанные в ходе ее обсуждения. Моя искренняя благодарность директору Института общей генетики, академику РАН Ю.П. Алтухову за проявленный интерес к работе и предоставленную возможность проведения ряда экспериментов, а также сотрудникам Института Ю.С. Белоконь и М.М. Белоконь. Особая благодарность моим английским коллегам Кристоферу Сёрстону и Мелвину Смиту за теплоту и неоценимую помощь во время проведения экспериментов в Королевском колледже Лондона. Выражаю благодарность студентам и аспирантам кафедры миколопш и альгологии И.С. Дружининой, А.Э. Бондареву, О.В. Штаер за помощь и участие в сборе природного материала и проведении некоторых экспериментов.

Апробация работы. Результаты работы обсуждались на теоретических и практических семинарах по популяционной биологии грибов на кафедре микологии и альгологии МГУ; были представлены на конф. «Грибы в биогеоценозах» (Ташкент, 1985), «Экологическая генетика растений и животных» (Кишинев, 1987); Конф. молодых ученых МГУ (Москва, 1983, 1984, 1985); Всесоюз. совещаниях по проблемам фитопатологии (Пущино, 1983; Рига, 1986); Междунар. конф., поев. 80-, 85-яетию каф. микологии и альгологии (Москва, 1998, 2004), 90-летию ЗБС МГУ (Москва, 2001); Междунар. конгрессам «Наука и практика грибоводства» (Кашира, 1996; Москва, 1997); V Всерос. популяцион. семинаре (Казань, 2001); Конф. по биоразнообразию (Пенза, 2001); Конф. и съездах генетиков и селекционеров (Москва, 2003, 2004); Междунар. 1У, У1, УП Микологических конгрессах (Регенсбург, 1994; Иерусалим, 1998; Осло, 2002); Европ. конф. по генетике грибов (Люнтерен, 1994; Леон, 1998;

Копенгаген, 2004); XIII и XIV Конгр. европ. микологов (Мадрид, 1999; Кацивели, 2003); Ш и IV конф. по генетике и клет. биологии базидиомицетов (Лондон, 1995; Нижмеген, 1998); IX X Конгр. по прикл. микробиологии и микологии (Сидней, 1999; Париж, 2002); I съезде микологов России (2002); Конгр. по медицинской микологии (Москва, 2004, 2005) и медицинским грибам (Паттая, 2004, Шанхай, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 74 работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Эксперименты проводили на кафедре микологии и альгологии МГУ (1982-1985 гг., 1994-2003 гг.), в Отделе эволюционной биохимии Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, в Институте Общей генетики РАН (1997,2001-2003 гг.), в Королевском колледже Лондона (Life Sciences Division, King's College London) (1994-1996 гг.).

Работа поддержана грантами РФФИ (№> 96-04-48457, 01-04-49447) и ГНТП «Приоритетные направления генетики», а также персональными грантами Федерации европейских биохимических сообществ (FEBS), Королевского общества Великобритании (Royal Society), Европейской организации по защите окружающей среды (EERO).

Методы исследования. Дикариотические и моноспоровые штаммы вешенок Р. pulmonarius и Р ostreatus выделяли из свежесобранных плодовых тел и споровых отпечатков на сусло-агаре с добавлением антибиотиков; моноконидиальные штаммы фитопатогенного гриба Р. огугае получали из пораженных пирикуляриозом листьев риса с последующими моноспоровыми рассевами на картофельно-глюкозном агаре (КГА). Для глубинного культивирования грибов использовали жидкие питательные среды: минеральную глюкозо-аспарагиновую, специально разработанную для получения гомокариотических пеллетов вешенки (Дружинина и др., 1997), глюкозо-дрожжевую (GYM), полную дрожжевую (CYM) и др.. Половые и вегетативные скрещивания штаммов вешенки проводили в чашках Петри на сусло-агаре. Выгонку плодовых тел и получение стерильных споровых отпечатков в лабораторных условиях осуществляли по методике, разработанной Л.В. Гарибовой (1983).

Экстракцию водорастворимых мицелиальиых белков проводили из свежего 7-суточного мицелия, выращенного в погруженной культуре или на чашках Петри. Приготовление клеточных лизатов и разделение белковых фракций проводили или в 7.5%-м полиакриламидном геле в трис-глициновом буфере (Трувеллер, Нефедов, 1974), или в горизонтальном 13%-м крахмальном геле с использованием трех буферных систем (трис-цитратной, трис-ЭДТА-боратной и трис-цитраг-ЬЮН-боратной) по стандартным методикам ИОГен РАН (Дружинина и др., 1997). После проведения электрофореза крахмальный блок разрезали на несколько горизонтальных пластин, каждую из которых подвергали гистохимическому окрашиванию на определенный фермент (Manchenko, 1984).

При манипуляциях с ДНК следовали стандартным методикам (Sambrook et al., 1989). ДНК экстрагировали из мицелия согласно методикам (Lee et al., 1988; Rogers et al., 1989). ПЦР-амплификацию проводили в термоциклере Amply 4L, Биоком. Условия амплификации и температурный режим подбирали для каждого конкретного случая. При построении карт

рестрикции, клонировании и секвенировании ДНК использовали стандартные методики и рекомендации фирм-производителей наборов реактивов.

Для анализа структуры популяций использовали формулы, рекомендованные JI.A. Животовским (1983). Статистические параметры определяли по Г.Ф. Лакину (1980), а также использовали пакет компьютерных программ STATISTIC А 5.5. Генетическое разнообразие популяций характеризовали с помощью общепринятых популяционных показателей; г дендрограммы сходства между природными штаммами строили на основе генетических

расстояний Нея с использованием UPGMA алгоритма, основанного на попарно-групповом сравнении невзвешенных признаков со средним арифметическим (Nei, 1977; 1978). Для анализа данных по изоферментам (аллозимам) использовали пакет компьютерных программ POPGENE version 1.32 (Yeh et al., 1999). Построение неукорененных дендрограмм на основе ДНК-полиморфизмов проводили с использованием пакета компьютерных программ TREECON for Windows, version 1.1 (Van de Peer, De Wächter, 1994).

Все другие методики подробно изложены в публикациях автора, а также в ниже представленном тексте.

1. СТРУКТУРА ПОПУЛЯЦИЙ ГРИБОВ

Изучение популяционной структуры вида фактически сводится к оценке происходящих в природе процессов накопления генетической изменчивости, ее последующей дифференциации и связи с такими процессами как межпопуляционный поток генов, генетический дрейф, рекомбинация и отбор. Общее разнообразие генотипов в популяциях значительно увеличивается за счет свободной рекомбинации, которая обеспечивает гораздо более широкий набор приспособительных возможностей, чем другие процессы. Генетический дрейф проявляется в случайных изменениях генных частот генов в последовательных поколениях в силу ограниченной численности фактически любой реальной популяции. Эффекты случайного дрейфа генов компенсируются процессами миграции некоторой интенсивности, определяемой как поток генов Природные популяции одновременно испытывают воздействие и случайного дрейфа, и миграции генов - процессов, взаимно уравновешивающих друг друга. Миграции могут также оказывать существенную роль на генетическую дифференциацию между популяциями в пределах вида.

В грибных популяциях, в которых половая рекомбинация наблюдается регулярно, происходит пересортировка генов в новые комбинации, что вносит существенный вклад в поддержание общего генотипического разнообразия. В популяциях же со строго бесполым воспроизведением существует ограниченное число комбинаций генов, в результате чего может наблюдаться тенденция доминирования отдельных клонов. Кроме того, популяции агамных видов при более или менее равномерном заселении определенной территории фактически лишены важнейшего интегрирующего фактора - потока генов между индивидуумами. Разобщенность единого генного потока и наличие сложной генетической системы вегетативной несовместимости у грибов приводят к тому, что такие популяции фактически могут быть представлены множеством не смешивающихся друг с другом клонов. Клоны могут достигать огромной численности и занимать огромные территории

вследствие чрезвычайно высоких темпов размножения и миграционных способностей, особенно присущих многим фитопатогенным грибам. Генетическое разнообразие в таких популяциях поддерживается не за счет скрещиваний между особями, а вследствие мутаций и миграции разных клонов.

Очевидным преимуществом для популяционного анализа видов Р1еиго1ш является характерный для гриба гапло-дикариотический жизненный цикл с четко выраженной сменой гаплоидной (гомокариотические базидиоспоры) и дикариотической (плодовое тело) фаз. *

Дикариотические и гомокариотические клоны (родители - потомки) можно размножать на жидких и твердых питательных средах, и при определенных условиях получать в культуре плодовые тела, то есть полный жизненный цикл гриба («от споры до споры») может бьггь воспроизведен в лабораторных условиях.

Возбудитель пирикуляриоза риса Р огугае в природных условиях размножается одноядерными конидиями, и его природные популяции представлены фактически клонами. Гаплоидное состояние вегетативного мицелия и отсутствие половой стадии у Р огугае, несомненно, будут определять действие иных факторов и тенденций в формировании клональных популяций гриба, в которых практически отсутствуют рекомбинантные генотипы.

1.1. СТРУКТУРА ПОПУЛЯЦИЙ РЬЕШОТиЗРШМОШШт И Р ОШЕАТиБ

Морфология штаммов вешенки. Выборки природных штаммов вешенок собирали в лесных фитоценозах средней полосы России (Московская, Воронежская и Тверская области) и в парковых зонах г. Москвы (летом и осенью 1996, 1998, 2000, 2001 и 2002 гг.). Характеристика штаммов представлена в таблице 1.

На территории средней полосы России существует два близкородственных вида Р.ри\топапив и Р.ОЕ^еЫив с частично перекрывающимися морфологическими признаками. Доминирующим в летние месяцы является вид Р риЫопаггш, к которому было отнесено большинство изолятов звенигородской и тверской популяций, собранных летом на протяжении 1996, 1998, 2000 и 2002 гг.. Эти изоляты сформировали вполне гомогенную по морфологии группу с окраской плодовых тел от молочно-белой до желтовато-белой. Споровые отпечатки также были окрашены в белый цвет. Шляпки имели достаточно мягкую консистенцию и небольшие размеры 4-9 см в диаметре. Иным комплексом морфологических признаков характеризовались штаммы, собранные в разных районах осенью и отнесенные к виду Р. озй-еаШ. Это были крупные (до 17 см в диаметре), массивные темно-бурые плодовые тела со шляпками толщиной 3 см и мощными ножками. Споровый порошок имел слабый розоватый оттенок. Воронежские изоляты вешенки, собранные осенью 2001 г., хотя и имели массивные плодовые тела, но характеризовались светло-серой окраской, характерной для Р. риШопаНш. Окраска шляпок полученных в лабораторных условиях плодовых тел для многих изолятов существенно отличалась от природной. Однако «типичные осенние» штаммы и в искусственных условиях давали стабильно темно окрашенные базидиомы.

Таблица 1

Природные изоляты вешенок в коллекции

Выборки Число штамм. Место и время сбора Штаммы Субстрат Тип мофрологии

Московская, 1996 27 9 7 ЗБС МГУ, июль 1996 ## 1, 13, 14, 15, 23, 27, 30, 45 2,3,4, 5,6,8,16,18 7, 17,20,21, 24,28,29, 32 22,25, 26 Осина Липа Береза Рябина Ольха Летний _ М и тит

ЗБС МГУ, сентябрь 1996 ##36,50 33 37,43 34,46 41 39 Липа Береза Рябина Осина Дуб Сосна Летний Осенний м

г. Москва, сентябрь 1996 ##50 42,53, 54,55,56 38 Липа Осина Береза Летний Осенний

Звенигородская, 1998 12 ЗБС МГУ, июль 1998 А1-1, А2-1, А5-12 А6-1, А12-1, А10-2 А9-1, А11-1, А13-1 А8-1, А7-1 Осина Липа Рябина Береза Летний и _<4

г.Москва, сен. А14-2 Рябина Осенний

Звенигородская, 2000 27 15 ЗБС МГУ, июль 2000 03-1,03-2,03-3, 06-1, 06-2,06-3, 06-4, Об-5,06-6, 08-1,08-2,08-3, 09-1,09-2,09-3,09-4 010-1,011-1,011-2 01-1,01-2,02-1,02-2 04-1,05-1,07-1,07-2 Береза Рябина Осина Летний ч и

г. Москва, сентябрь 2000 013-1 М1-1, М2-1, М2-2.М2-3, МЗ-1, МЗ-2, МЗ-З, МЗ-4 М4-1, М4-2, М4-3 М5-1, М5-2, М5-3 Осина Береза Рябина Яблоня Осенний и

Воронежская, 2001 40 г. Воронеж, сентябрь 2001 В1-1, В1-2, В1-3 В1-4, В1-5, В2-1 В2-2, В2-3, В2-4 В2-5, В2-6, В2-7 ВЗ-1, ВЗ-2, ВЗ-З, ВЗ-4.В4-1 В5-1, В5-2, В5-3, В5-4 В6-1, В6-2, В6-3, В6-4 В7-1, В7-2, В7-3, В7-4 В8-1, В8-2, В8-З.В8-4 В8-5, В8-6, В11-1, В11-2 Липа и Береза Осина Летний

г.Воронеж В12, В13, В15 Липа Осенний

Тверской Т1-1, Т1-2, Т1-3 Береза Летний

Тверская, 20 биосферный Т1-4, Т1-5,

2002 заповедник, Т4-1/Г4-2, Т4-3, Т5-1

июль 2002 Т2-1, Т2-2, Т2-3 Ель

ТЗ-1, ТЗ-2, ТЗ-З Осина м

ТЗ-4, Т6-1, Т6-2, Т6-3,Т6-4 _м

Примечание. ЗБС МГУ - Звенигородская биологическая станция МГУ им. М.В. Ломоносова. Первая цифра в названии штамма соответствует субстрату (бревну), вторая цифра - номеру сростка на данном бревне.

Общая схема популяционно-генетического анализа Рpulmonarius представлена на рис. 1.

Плодовое тело (дикарион)

Споровый отпечаток

(гаплоидные базидиоспоры)

Споровая суспензия

Дикариотический мицелий

(гетерокаржш)

Мицелиальная культура

глубинное культивирование

глюкозо-аспарагиновая среда в 800-мл колбах, 200 об/мин, 24°С .

V

агаризированная среда

сусло-агар, 25°С

Ф

сг^г

Генетический анализ

- аллозимы -RAPD

Мон-мон Ди-мон

скрещивания скрещивания

i ^ факторы ти юв спаривания

I / / . I

Вегетативная

/ несовместимость i

грибные индивидуумы

- группы интерстерильности ЯАРй-ПЦР анализ (биологические виды)

Рис 1. Общая схема популяционно-генетического анализа Р. риЬттапш

Вегетативная несовместимость природных дикарионов

При анализе популяций грибов со смешанным типом воспроизводства важно уметь разграничивать вегетативные клоны бесполого происхождения и индивидуумы, воспроизводимые половым путем. Наличие у базидиальных грибов генетически контролируемой мультилокусной системы вегетативной несовместимости позволяет успешно идентифицировать отдельные индивидуумы во взаимных сращиваниях природных дикариотических штаммов. Гены вегетативной (гетерогенной) несовместимости не препятствуют половому процессу, и у вешенки их действие проявляется в дикариотическом мицелии, в то время как слияние гиф гомокарионов (гомогенная совместимость) находится под контролем локусов спаривания.

По степени экспрессии реакций вегетативной несовместимости (VC) все взаимодействия были разделены на 4 типа: S (strong) - сильно выраженный антагонизм: зона контакта широкая до 1,5 см, сильно пигментированная; N (normal) - реакция несовместимости средней силы: в зоне контакта формируется достаточно высокий, четко ограниченный мицелиальный валик, пигментация от умеренной до слабой; W (weak) - слабое антагонистическое взаимодействие: более интенсивный рост воздушного мицелия в зоне

контакта, слабая пигментация; С (compatibility) - совместимость: зона контакта (барраж) отсутствует, гифы свободно переплетаются друг с другом (рис. 2).

Частота встречаемости

Типы антагонистических ответов:

■в сильный

■ М средний

слабый

ОС совместимость

Рис. 2. Распределение УС-групп в популяциях Р. ри1топагШ

Степень антагонизма не зависела от времени и места сбора изолятов, от субстрата (породы древесины). Практически все природные дикарионы были вегетативно несовместимы, т.е. природные популяции вешенки состояли из генетически различных дикариотических индивидуумов. Генетическое разнообразие, оцененное с помощью меры разнообразия по Шеннону, и характер распределения штаммов вешенки в УС-группы были сходными по всем выборкам (рис.2). Индекс разнообразия составил 1,188 с преобладанием антагонистических реакций сильной и средней степени (в и >1). Вегетативно совместимые клоны (или генеты) принадлежали либо одному сростку, либо были выделены из плодовых тел, расположенных в пределах одного субстрата (бревна) на расстоянии не более 0.5-1 м. Однако чаще один и тот же субстрат оказывался заселенным генетически различными грибными индивидуумами, демонстрирующими при вегетативных сращиваниях их мицелиев антагонистические реакции Л- и ЧУ-типа.

Несмотря на некую информативность о распространении клонов в популяциях вешенки, анализ УС-групп не дает ответа на основной вопрос популяционной генетики о преобладающем способе размножения гриба в природе и роли рекомбинаций, т.к. гены, отвечающие за наследование УС фенотипов, пока еще не определены. Поддержание высокого уровня полиморфизма по локусам вегетативной несовместимости у грибов в природе можно объяснить действием отбора, направленного на ограничение обмена между

дефектными цитоплазмами, несущими вирусы, паразитические плазмиды и т.д. (МП^оот, Сойея!, 1999).

Типы рекомбинаций в природных популяциях ветенки. Половая совместимость и

репродуктивные барьеры

Мон-мон скрещивания. Были выделены наборы гаплоидных тестерных штаммов для каждого из двух преобладающих в природных популяциях видов Р. ри1топапиз и Р. озКеаШ. В таблице 2 представлены результаты скрещиваний моноспоровых штаммов 33 природных изолятов (по 4 гаплоидных тестера для каждого изолята) с гаплоидными тестерами штаммов #14 (вид Р. ри1топагшз) и #38 (вид Р. оМгеЛт). В группу, совместимую с тестерами штамма #14, принадлежащего виду Р. рЫтопапия, попали изоляты со светло окрашенными плодовыми телами, собранными на территории Московской и Тверской областей летом и в г. Воронеже осенью, в то время как вид Р. оМгеаШ объединил в основном московские «осенние» штаммы с массивными темно-окрашенными плодовыми телами. Однако, морфологические различия между репродуктивно изолированными видами Р. ояп-еаш и Р. ри1топапш не всегда были четко выражены. Так, в одну группу интерстерильности с «типично летними» тестерами штамма #14 попали как сходные с ним по морфологии изоляты ##2, 3, 27, так и осенние изоляты ## 34 и 39. Базидиомы изолята #34 были очень мелкие, темно-бурые, а не сероватые как у остальных представителей данного вида; плодовые тела штамма #39 были не только темно окрашены, но и выделены с древесины хвойной породы. Вид Р. оз^гаШ в средней полосе России в основном встречается в более холодные месяцы (осенью или холодным летом) на лиственных породах и для плодообразования требует понижения ночных температур (до 10-15°С). Изоляты Р. ри1топапш описаны как на лиственных, так и на хвойных породах.

При взаимных скрещиваниях гомокариотических изолятов между собой в пределах биологического вида (интерстерильной группы) все комбинации были совместимы и сопровождались формированием пряжек, что свидетельствовало о наличии у этих штаммов различных аллелей локусов поповой совместимости. Общие аллели факторов спаривания были обнаружены только для некоторых штаммов, изолированных с одного субстрата (бревна). Гетероаллельность по факторам спаривания, обнаруженная у рядом растущих природных изолятов на ограниченной территории, может служить доказательством случайного распределения факторов половой совместимости в природных популяциях вешенки, что обеспечивается, прежде всего, свободным рассеиванием базидиоспор. Мультиаллельность факторов половой совместимости, несомненно, повышает потенциал аутбридинга в популяциях вешенки.

Ди-мон скрещивания. Видовую принадлежность других природных изолятов в коллекции определяли в ди-мон скрещиваниях с гаплоидными тестерами штаммов #14 и #38 (табл. 3). Была подтверждена распространенность двух близкородственных видов Р ри1топапт и Р. озП-еаШ в лесных биогеоценозах средней полосы России. Единственный осенний изолят #43, не скрещивающийся ни с тестерами штамма #14, ни с тестерами штамма #38, был помещен в отдельную интерстерильную группу 1П. Видовая

Таблица 2

Мон-мон скрещивания природных изолятов вешенки с гаплоидными тестерами видов Р. риЬпопаНиз я Р. озКеаШ

Тестеры

анализируемых

штаммов

Гаплоидные тестеры типов спаривания штаммов

#14 (Р.риЫопагШ)

14т1 14т6 14т10 14т11 38т1

# 38 (Рмяп-еапи)

38т8

38т12

38т15

Вид

(группа

интерстер)

ш2; т8; ш9; т!2

т1;т4;ш6;т8

т5; тб; т!1; т!2

т4;т7;ш11;т12

т2;ш4; т7;ш!0

тЗ; т4; т5; т7

т2;т6;т 7; т!2

т1;т5;тб;т9

тб; т7; т20;т25

т2; тЗ; т5; т!6

т7;т12;т13; т22

т5; т7; т8; тЮ

,т1;тЗ;т5;т14

т1; тб; тЮ; т!1

+ -

■ +

++++

++++

тЗ; т5; шЮ; т!5

++++

++++

++++

ш2; ш5; шб; ш7

++++

++++

++++

++-

++++

++++

++++

++++

++++

++++

т4;тб; т8; т!2

++++

т1; ш2; тЗ; т9

++++

т2;тЗ;т4;т!8

++++

тЗ;т8; т!3;т17

++++

т!;т2;т4;т8

++++

т!;тЗ;т4; т!7

-н-

тЗ;т4;тб;т12

т4; т7; т9; т!1

++++

+++

-н-н-

+++

1М-1

+++

ми

+++

++-Н-

+++

++++

+++

++++

+++

+++

++++

++++

++++

+++

++++

-н-н-

++++

++++

-Н-+

++++

++++

+++

+++

-н-н-

Н-++

++++

■1)11

-н-н-

+++

++++

•н-н-

т!;т8;т12;т15

тЗ; тб; ш7; т9

+++-

++++

т1; т2; тЗ; т4

++++

т4; т5; тб; тЮ

-н-

т1; т5; тб; т!1

н-н-

тЗ;т4;т6;т!0

-++

т5;ш7;т9;т!3

н-

+++

-++

+++

+++

+++

+++

т2; т5; ш8; тЮ

-н-

++++

-н-

М4-2 т6;т9;т!1;т12

++++

4-1-++

++4+

+++

Примечание. + половая совместимость (образование пряжек); - несовместимость

принадлежность четырех изолятов ##34,37,39,41 с неоднородной морфологией оказалась неясной и была интерпретирована как реакция полусовместимости (обозначенная в таблице +/0.5). Вероятно, проявление полусовместимости и нестабильности при дикариотизации монокарионов можно объяснить частичной репродуктивной изоляцией или погрешностью метода. Последующие мон-мон скрещивания данных штаммов позволили точно определить принадлежность штаммов ##34,39 виду Р ри1топагш, а двух других ##37,41 - виду Р. озРеаПя (табл.2).

Таблица 3

Ди-мон скрещивания природных изолятов вешенки

Группа Гаплоидные тестеры типов спаривания штаммов # 14 и # 38

Дикарион интер-стерил 14ml 14m6 14т10 14ml 1 38ml 38т8 38т12 38ml5

#14 -/0 -/0 -/0 -/0

#1,2,3,4,5,6,7,8,13,15 -—• +/1* +/1 +/1 +/1 -/0 -/0 -/0 -/0

#16,17,18,20,21,22,23 +/1 +/1 +/1 +/1 -/0 -/0 -/0 -/0

#24,25,26,27,30,32,33 е- +/1 +/1 +11 +/1 -/0 -/0 -/0 -/0

#36,45,46,50 и 3 "С (в s +/1 +/1 +/1 +/1 -/0 -/0 -/0 -/0

А1,А4Д5,А6Л7,А8 +/1 +/1 +/1 +/1 -/0 -/0 -/0 -/0

А9Д10А11,А12А13 +/1 +/1 +/1 +/1 -/0 -/0 -/0 -/0

01,02,03,04,05,06 .§ +/1 +/1 +/1 +/1 -/0 -/0 -/0 -/0

07,08,09,010,011 3 о. +/1 +/1 +/1 +/1 -/0 -/0 -/0 -/0

В1,В2,ВЗ,В4,В5,В6 CL +/1 +/1 +/1 +/1 -/0 -/0 -/0 -/0

В7,В8,В9,В11 +/1 +/1 +/1 +/1 -/0 -/0 -/0 -/0

: С :-ig/. "Hi ' т* -..«bffj +/Ô.5 * s

' -+/1 i f +Д

m-' ■-•Ш1' m? +/Ô.5 +/0.5 •f/0.5 : -/0

од .....V" ьт ' m , -/0 +/0.5 +/0.5 +/0.5 +А).5 +/0.5 -1-/1

#38 и 3 -/0 -/0 -/0 -/0

#42,53,54,55,56 -/0 -/0 -/0 -/0 +/1 +/1 +/1 +/1

#208,215 СО Р< ф ь* £ а и ~ -/0 -/0 -/0 -/0 +/1 +/1 +/1 +/1

А14,013 -/0 -/0 -/0 -/0 +/1 +/1 +/1 +/1

М1,М2,МЗ,М4 С- 0. -/0 -/0 -/0 -/0 +/1 +/1 +/1 +/1

В12313,В14,В15 -/0 -/0 -/0 -/0 +/1 +/1 +/1 +/1

#43 III -/0 -/0 -/0 -/0 -/0 -/0 -/0 -/0

Примечание. * в числителе - + (-) соответствует наличию или отсутствию пряжек на мицелии; в знаменателе - степень совместимости: 1 - полная совместимость; 0,5 - частичная совместимость, дикарион формируется спорадически, не распространяется; 0 - полная несовместимость, дикарион не формируется (интерстерильные группы).

Пластичность некоторых морфологических характеристик, обусловленная влиянием факторов окружающей среды, недостаток достоверных сведений о внутри- и межвидовых скрещиваниях до недавних пор являлись объективной причиной существующей путаницы при дифференциации следующих близкородственных видовых таксонов: P. ostreatus, Р. pulmonarius, P. columbinus, P. sapidiis и P. sajor-caju. Однако, к настоящему моменту уже не остается сомнений в том, что P. columbinus, P. ostreatus и P. pulmonarius - самостоятельные биологические виды, а P. sajor-caju - азиатская вариация P. pulmonarius. Эти положения подтверждены как нами, так и зарубежными исследователями в опытах по скрещиваниям моноспоровых тестеров, в анализе полиморфизма рДНК-последовательностей и изоферментных спектров, при сравнении морфолого-физиологических признаков (Шнырева и др., 1998; 2004; Шнырева, 2003; Vilgalys, Sun, 1994; Gonzalez, Labarere, 2000).

Клональное воспроизведение в популяциях P. pulmonarius

Чтобы оценить долю клонального воспроизведения в локальных популяциях вешенки и показать, насколько такой важный для формирования популяционной структуры фактор как

поток генов ограничен в пространстве, был проведен детальный анализ дикарионов, полученных из плодовых тел в пределах одного сростка, и сростков, расположенных на одном субстрате (бревне). Предварительно было показано, что эти штаммы были вегетативно совместимы. Кроме того, они имели идентичные аллозимные локусы и RAPD-профили на ПЦР-паттернах (рис. 3), т.е. фактически являлись генетически сходными вегетативными клонами, воспроизведенными на одном и том же гетерокариотическом мицелии. Однако на одном бревне обнаруживали также и генетически различные индивидуумы, демонстрирующие антагонистические реакции при слиянии их вегетативных мицелиев и тем самым формирующие мозаику вегетативно несовместимых клонов на древесине (например, группы штаммов Ш ЗА, ЗВ и 5; А9-...; А10-...) (кластеры клонов четко представлены на дендрограммах, рис.5,6 в следующем разделе). Таким образом, анализ половой и соматической совместимости показал возможность множественного заселения деревьев ксилотрофными грибами наряду с существованием клонов, полностью занимающих жизненное пространство отдельного бревна/субстрата.

Для двух независимых коллекций вегетативно совместимых дикариотических штаммов-клонов All- и 06-...(по четыре дикариона из каждого сростка) были получены моноспоровые тестерные штаммы и проведены мон-мон скрещивания во всех возможных комбинациях с целью оценки распределения факторов половой совместимости (табл. 4). Мон-мон скрещивания между вегетативно совместимыми клонами из группы штаммов All-... показали различие по одному из 2-х локусов типов спаривания, т.е. 50% -ную половую совместимость, вопреки ожидаемой полной идентичности аллелей локусов типов спаривания, характерной для клонов (табл.4). Для генетически идентичных клонов можно было бы ожидать полную идентичность аллелей локусов половой совместимости и соответственно всего лишь 25% совместимых скрещиваний, как в случае между дикарионами Al 1-1 и Al 1-2. Однако, между дикарионами Al 1-1- и Al 1-3 было обнаружено 50% совместимых комбинаций как следствие различий по одному аллелю для каждого из двух локусов типов спаривания. Полная половая совместимость (а именно, 100% совместимых комбинаций) наблюдается у гетероаллельных по А и В факторам штаммов.

Ситуацию же с 1/2 совместимых комбинаций (в скрещиваниях гаплоидных тестеров штаммов Al 1-1 х All- 3) мы объяснили прохождением в природе ди-мон гибридизации (Шнырева и др., 2001; Shnyreva, 2002) Подобные ди-мон скрещивания были описаны для гименомицетов Armillaria gallica (Carvalho et al.,1995), Lacearía bicolor (Gardes et al.,1990). Однако возможность ди-мон гибридизации в природных популяциях вешенки нами была показана впервые. Фактически мы продемонстрировали новый тип рекомбинации генотипов в природе (в строгом смысле немейотический): на распространяющемся по субстрату фертильном дикариотическом мицелии образуются плодовые тела, но при этом может происходить повторная дикариотизация и обмен ядер с другими проросшими базидиоспорами (гомокарионами), приводящая к гетероаллельному состоянию локусов половой совместимости в пределах сростка. Иными словами, дикариотический мицелий сливается с гомокариотическим проростком, что приводит к объединению трех генетически

Таблица 4

Мон-мон скрещивания между вегетативно совместимыми дикарионами вешенки

Гомокариоти-ческие тестер-ные штаммы Дикарион А 11-1 Дикарион А 11-2 Дикарион А 11-3

т 7 т 12 т22 т 13 ш 5 т 8 т 7 т 10 тЗ т 14 т 5 т 1 ш-

уЩ. АЛ АзВ, ш а,в2 агв, ЖА'/. агв3 АзВ2

Дикарион А11-1 т7 - - +

т 12 а,в2 - - + -

т 22 А2В, - + - -

т 13 + - - -

Дикарион А11-2 \ т 5 - - + - - - +

т 8 а,в2 - - + - - - + -

т7 а2в, - + - - - + - -

тЮ + - - - + - - -

| Дикарион А11-3 тЗ ш + - - - + - - - - - - +

т 14 А2В3 + + - - + + - - - - + -

т5 а3в2 + - + - + - + - - + - -

т' п + + + + + + + + - - -

Примечание. Штаммы А11-1 и А11-2 генетически идентичны по обоим А и В локусам половой совместимости. Штаммы А11-1 и А11-3 гетероаллельны по одному аллелю для каждого из двух А и В локусов.

Рис.3. ИАРО-ПЦР паттерны вегетативно совместимых клонов Р. ри1тонапих

Клоны Клоны Клоны А7-(4) А5<2) А13Ч2) 1СтаНЫ °б"(4)

о

■5 ^

„ «КлоныАН-(5)

3000 нп 2000 нп

1000 нп

500 нп -

различных ядер в одном мицелии с последующим их случайным распределением в базидиомы.

Таким образом, данные по скрещиваниям свидетельствуют о преимущественном распространении гриба с помощью базидиоспор полового происхождения, а не клонально (с помощью вегетативного дикариотичного мицелия). В противном случае, в локальных популяциях мы бы обнаружили генетически идентичные индивидуумы на близлежащих субстратах. Половая структура популяции, в свою очередь, обеспечивает возможность непрерывных генетических обменов между вегетативно несовместимыми группами.

Полиморфизм и генное разнообразие P. pulmonarius по совокупности аллозимных генов

Генетическое разнообразие природных популяций вешенки было охарактеризовано по 14 изоферментным локусам, позволившим выявить 49 аллелей (рис. 4), частоты встречаемости которых представлены в таблице 5. Доля полиморфных локусов составила 92.86% (табл. 6). Наиболее вариабельными были локусы лейцинаминопептидазы Lap-2, фосфоглюкомутазы Pgm, и эстераз Est-1 и Est-2. Среднее генетическое разнообразие для всех популяций было выше (/=0.824), чем для каждой отдельно взятой выборки (например, 0.560 и 0.632 - для тверской и звенигородской выборок соответственно) (табл. 6). Эта же тенденция сохранялась для такого показателя как среднее число аллелей на локус (А), которое для всех пяти выборок равнялось 3.5, а в отдельных выборках колебалось от 2.38 до 2.69. Более низкие значения генетического разнообразия в отдельных популяциях по сравнению с суммарной выборкой, т.е. в пределах вида, вероятно, связаны с появлением редких аллелей в локальных популяциях (редким считали аллель, встречавшийся с частотой менее 0.09) (табл. 5).

При сопоставлении фактических и ожидаемых распределений генотипов, оцененных с помощью показателя гетерозиготностъ на локус, во всех локальных популяциях вешенки прослеживается дефицит гетерозигот, особенно ощутимый для звенигородских популяций 1996 и 2000 гг. (табл. 6). Значения наблюдаемой гетерозиготности (flcr0.325) ниже ожидаемой (//£=0.490) свидетельствуют о преобладании гомозигот и, следовательно, о некотором отклонении от равновесия Харди-Вайнберга, подразумевающего случайные скрещивания и отсутствие действия отбора и миграции. Подобный дефицит гетерозигот может быть следствием инбридинга, тем более что собственно тетраполярная система половой совместимости, характерная для Pleurotus, подразумевает 25%-ный инбридинг в природных популяциях. Значения индекса фиксации Райта (Fis) (табл. 7), оценивающего степень инбридинга, по всем локусам во всех популяциях (0.146 для воронежской, 0.209 и 0.219 для тверской и московской соответственно и средним значением по всем выборкам -0.018) не превышали характерный для данной системы размножения 25%-ный рубеж. Приблизительно 20%-ный недостаток гетерозигот наблюдали как в пределах вида, так и в отдельных выборках. Это свидетельствует о том, что природные популяции данного вида приближаются к свободно скрещивающимся во всех изученных регионах. К тому же в наши выборки попадали штаммы, собранные с небольших территорий, и даже субстратов (бревен). В целом же отмеченный высокий уровень генетического разнообразия в популяциях на

ам

ЕЛ-1

ADH

АСР

Аср 1 2 3 4 5 13 2334

mi г 12

EST

I

• - ! "" _ ■

re ;

GDH

_ __I _ _ _

Fe 1 2 3 4 11 12 13 23 14 <ЗЙ 1 2 12

m A

Lep-1 — — — - —— .....

(лр-2 — — • — — ,

i I

LAP |

i i

12 1 4)- 1 1 1 11 12 11 12 11 22 Lap-2 12 3 4 S I l> 1323 35 23 33 33

ЕЛ-1 1 2 3 4 22 11 12 23 Ш I H 4 22 13 24 12

-- M

IDH

W> 12 12

MDH

Mtft-2

l№t 112 11 11 12 12 M№2 1 2 3 22 12 12 22

- - ; ~-ч

PGI ~ ' PGM ■ 1 ;'

I ' SOD______

PUf 1 2 3 22 23 ^ t г 1 4 23 33 34

12 3 11 12 1

Рис 4. Схемы электрофоретических спектров изоферментных систем штаммов вешенки. АСР - кислая фосфатаза, ЮН - изоцитратдегидрогеназа, PGI - фосфоглюкоизо-мераза, PGM - фосфоглюкомутаза, ADH - алкогольдегидрогеназа, GDH - глютаматдегидро-геназа, MDH - малатдегидрогеназа, LAP - лейцинаминопептидаза, SOD - супероксиддис-мутаза, EST - эстераза, FE - флюоресцентная эстераза. Цифры указывают аллели и их комбинации.

Таблица 5

Частоты аллелей изоферментных локусов в выборках Р. pulmonarias

Локусы Аллели Выборки Суммарно □овеем выборкам

Воронежская, 2001 г. Тверская, 2002 г. Московские

Сбор 1996 г. Сбор 1998 г. Сбор 2000 г. Суммарно погодам

1 Аср Acp-l'21 0.625 0.208 0.085

Acp-2m 0.094 0.042 0.292 0.500 0.278 0.148

Acp-3'00 0.672 0.450 0.750 0.083 0.333 0.389 0.505

Аср-/6 0.062 0.300 0.208 0.042 0.083 0.125

Acp-576 0.172 0.250 0.125 0.042 0.137

Adh Adh-l'06 1.00 1.00 0.774 0.490

Adh-2m 1.000 1.00 1.000 0.226 0.510

£ Fe-l'00 0.950 0.611 0.333 0.167 0.233 0.317

Fe-2* 0.050 0.389 0.583 0.389 0.367 0.146

Fe-3» 0.906 0.083 0.444 0.367 0.488

Fe-473 0.094 0.033 0.049

Lapl | Lapl-l'00 0.875 0.850 0.583 0.750 0.917 0.750 0.818

Lapl-f 0.047 0.333 0.083 0.083 0.167 0.085

Lapl-0* 0.078 0.150 0.083 0.167 0.083 0.097

1 Lap2-l'" 0.042 0.014 0.006

Lap2-2m 0.062 0.100 0.083 0.083 0.083 0.084 0.080

Lap2-3m 0.438 0.200 0.667 0.625 0.417 0.569 0.438

IMP2-496 0.141 0.175 0.083 0.167 0.083 0.125

Lap2-5n 0.297 0.150 0.083 0.250 0.291 0.208 0.227

Lap2-tf6 0.275 0.083 0.042 0.042 0.079

Lap2-1f 0.062 0.100 0.045

Idh-lm 0.234 0.944 0.083 0,125 0.333 0.218

ldh-2100 0.641 0.125 0.056 0.750 0.875 0.606 0.506

Idh-3" 0.125 0.875 0.167 0.061 0.276

Mdhl-l100 1.000 1.000 0.875 0.750 1.000 0.875 0.949

Mdhl-f 0.125 0.250 0.125 0.051

i MeOú-l"5 0.083 0.028 0.011

Mdh2-2m 0.969 1.000 0.917 1.000 1.000 0.972 0.977

Mdh2-f9 0.031 0.012

i Pgm-J"6 0.083 0.125 0.069 0.028

Pzm-2m 0.156 0.833 0.667 0.167 0.556 0.284

Pgm-3'00 0.844 0.850 0.083 0.208 0.833 0.375 0.654

Pgm-4" 0.150 0.034

£ Pgi-l"6 0.094 0.333 0.114 0.081

Pgi-2'00 0.734 1.000 1.000 0 875 0.625 0.514 0.707

Pgi-3"1 0.172 0.125 0.042 0.372 0.212

Sod Sod-lm 0.937 0.250 0.750 1.00 0.727 0.829 0.736

Sod-?2 0.227 0 071 0.029

Sod-374 0.063 0.750 0.250 0.046 0.100 0.235

Gdh Gdh-1'00 0.500 — 0.500 _ 0.500 0.500

Gdh-/2 — 0.500 _ 0.500 _ 0.500 0.500

Estl-I103 0.100 0.022

Estl-2100 0.531 0.550 0.125 0.500 0.125 0.250 0.421

¿J Estl-395 0.172 0.250 0.167 0.125 0.667 0.319 0.250

Estl-f 0.297 0.100 0.708 0.375 0.208 0.431 0.307

Est2-l'02 0.219 0.500 0.292 0.042 0.180 0.149

<2 Est2-2'°° 0.500 0.700 0.500 0.292 0.500 0.400 0.520

«SJ Est2-391 0.266 0.175 0.375 0.208 0.280 0.247

Est2-4s" 0.015 0.125 0.041 0.250 0.140 0.084

Примечание. * Данные отсутствуют. Верхний индекс в названии аллеля указывает его относительную подвижность; подвижность наиболее частого аллельного варианта обозначена 100

Таблица 6

Генетическое разнообразие и полиморфизм в популяциях P. pulmonarius

Выборки Число штаммов Р (%) А Ае h Генотипическое разнообразие Индекс ассоциации Nm

Но НЕ I Л h

Воронежская 40 78.57 2.69 1.72 0.22 0216 0.328 0.586 0.18

Тверская 20 64.29 2.42 1.85 0.02 0.245 0.319 0.560 0.16

Московская, 1996 43 78.57 2.38 1.56 0.22 0.282 0.361 0.525 0.279 0.289 0.010 0.11

Звенигород., 1998 31 78.57 2.50 1.81 0.12 0.398 0.395 0.632 0.202 0.221 0.019 0.21

Звенигород. ,2000 42 71.43 2.62 1.85 0.16 0.291 0.374 0.624 0.216 0.221 0.004 0.16

Московская в целом 116 100 3.2 2.23 0.22 0.337 0.483 0.858 0.291 0.324 0.033 0.08

По всем популяциям (в пределах вида) 176 92.86 3.50 2.22 0.20 0.325 0.490 0.824 0.371 0.416 0.046 0.08

Примечание. Р - доля полиморфных локусов; все данные представлены по 14 различным локусам; А - среднее число аллелей на локус; Ае - эффективное число аллелей на локус; h^ -доля редких аллелей (р<0.09); наблюдаемая (Но) и ожидаемая (Не) гетерозиготности; / -индекс генетического разнообразия по Шеннону I =1/Zp,2, где р, - частота /-того мультилокусного генотипа; I/ - индекс ассоциации, рассчитанный как ¿Vff** - 1, где /¿и а2/, - наблюдаемая и ожидаемая вариансы по числу локусов к, по которым пара индивидуумов имеет различные аллели (при уровне значимости 0.05); Nm - поток генов, рассчитанный как Fsr= 0.25(1- Fst)/Fst

довольно ограниченной территории свидетельствует о преобладании полового воспроизведения (табл. 6).

Для звенигородской популяции сбора 1998 года, где было отмечено совпадение значений наблюдаемой (Но) и ожидаемой гетерозиготностей (Не), был показан значительный уровень миграции (поток генов Ми=0.21) и появление новых аллелей по большинству локусов - Аср, Lapl, Lap2, Idh, Mdhl, Pgm, Pgi, Sod (табл. 5, 6) (Шнырева и др., 2004). Между регионами поток генов более ограничен (Мтг=0.08). И, как следствие, мы наблюдали значительные изменения частот генов в популяциях как пространственные, так и временные. Значительные колебания аллельных частот и появление редких аллелей может быть результатом как случайных колебаний (генетического дрейфа), так и инбридинга в

18

популяциях с ограниченной численностью особей. Например, редкий аллель Ре-З** с частотой встречаемости в 1998 году, равной 0.083, преобладал с частотой 0.444 в 2000 году. Подобные тенденции отмечены также для аллелей Аср-3100, Р^-2т, Еп2-1т, Ем2-

4м (табл. 5). Вытеснение одних аллелей другими в процессе размножения у вешенки может быть также связано со значительными колебаниями погодных условий. Так, в звенигородской популяции 1998 года при благоприятных для развития вешенки погодных условиях (влажное, умеренно теплое лето) наблюдали повышение общего уровня генетической изменчивости (/=0.632), снижение уровня гомозиготности, совпадение ожидаемых и наблюдаемых значений гетерозиготности, что, вероятно, можно объяснить увеличением общей численности популяции. В 1996 и 2000 годах в условиях жаркого засушливого лета наблюдали возрастание доли редких аллелей (р=0.22 и 0.16 соответственно) на фоне общего снижения уровня гетерозиготности и повышения доли гомозигот. И это неудивительно, так как большинство вновь возникающих аллелей при снижении численности популяции в неблагоприятных условиях среды (так называемый, эффект «горлышка бутылки») будут редки даже при их селективной нейтральности (ОЫа, 1975). К тому же в зависимости от погодных условий в Московской области летом могут одновременно встречаться близкородственные виды Р. риЬпопапш и Р. о&геаш, как это было отмечено для звенигородской популяции в 1996 году.

Таблица 7

F-статистюеа по Райту для всех популяций P. pulmonarius

Локусы Воронежская Тверская Московская в целом По всем выборкам суммарно

fis fis -, ш Д fis fis

Аср -0.172 -0.162 0.305 %т 0.132 .....

Adh 1.0 г'РФ 1 - 0 i 1.0 '4Л-M 1.0

Fe 1.0 -0.052 0.161 •'«¡¡»"i 0.636

Lap-1 0.723 ктт' 1.0 ívrJ®1. 0.448 0.638 шрф

Lap-2 -0.082 ripr- 0.075 0.369 0.171

Idh 0.157 h'êmm -0.142 0.532 0.487

Mdh-1 - - -0.143 ' 0. 428 -0.054 yqfójt'«

Mdh-2 -0.032 - -0.029 -0.017

Pgm 0.525 **êm J 1.0 0.694 0.768 w

Pgi 0.482 fyfflîy - 0.805 0.718 ЬЩ'У

Sod 0.466 0.733 0.808 ......-Ш* 0.828

Gdh - - 0 -1.0 0.929 - rapé*

Est-1 -0.249 рШ? 0.349 0.059 0.530 0.078

Est-2 0.158 -0.293 0.354 1 Щ*;. 0.054

Среднее* 0.146 rifff' 0.209 '-Ш' 0.219 0.018

Примечание. Fis - суммарный коэффициент инбридинга, оценивающий снижение уровня гетерозиготности в силу неслучайных скрещиваний в пределах популяции; Fst - мера генетической дифференциации между популяциями. * Среднее значение по всем локусам.

Значительная динамика частот и появление редких аллелей отмечены не только для звенигородских популяций, но и для воронежской, характеризующейся относительно высоким уровнем генетического разнообразия (/=0.586, Мя=0.18) на фоне снижения доли гетерозигот (#о=0.276) (табл. 6). Наименее гетерогенной со значительным преобладанием гомозигот оказалась тверская популяция. Интересно то, что обе популяции (воронежская и тверская) представлены штаммами, принадлежащими виду P. pulmonarius, несмотря на то, что воронежская коллекция была собрана в конце сентября, а тверская - в начале июля (см. табл. 1). Только три воронежских штамма В12, В13 и В15, время сбора которых не известно, были отнесены к виду Р .ostreatus. Вид P. pulmonarius был описан в звенигородской популяции как доминирующий летом, а изоляты Р ostreatus преобладали осенью и для нициации плодообразования требовали «холодового шока». Отсутствие колебаний суточных температур, вероятно, и способствовало преобладанию вида Р pulmonarius на территории Воронежской области в осенний период. В целом по всем популяциям из трех регионов наблюдали случайное распределение частот аллозимных генов, что можно объяснить действием генного дрейфа, взаимодействующего с незначительной миграцией - процессами, взаимно уравновешивающими друг друга. Популяции вешенки в каждом отдельном регионе генетически связаны между собой постоянным обменом генами, в то время как между регионами поток генов более ограничен (Nm=0.08). И, как следствие, мы наблюдали значительные изменения частот генов в популяциях как пространственные, так и временные.

Генетическая дифференциация между выборками Fst, оцененная с помощью F-статистики Райта (Wright, 1931), была значительной как для трех московских выборок (0.755), так и для всех выборок суммарно (0.750), т.е. приблизительно 25% генетической изменчивости отмечено в пределах данных выборок, а остальные 75% - между изученными популяциями (табл. 7). FsT-статистика Райта, будучи мерой генетической подразделенности популяции и одновременно эквивалентом инбридинга особей в субпопуляции, несет важный биологический смысл: она отражает баланс процессов дифференциации и интеграции генофондов и, что также принципиально важно, оказывается величиной, авторегулируемой по достижении популяционной системой стационарного режима (Алтухов, 2003). Собственно авторегуляция означает поддержание устойчивого соотношения гомо- и гетерозиготных генотипов, т.е. баланс между инбридингом и аутбридингом.

Генетический дрейф и незначительный инбридинг в популяциях с ограниченной численностью особей, действительно, могут приводить к существенной дифференциации между ними. С другой стороны, наблюдаемый в условиях интенсивно протекающих рекомбинационных процессов поток генов, оцененный как одна или две миграции генотипов за поколение (Nnr= 0.11 - 0.21), считают достаточным для предотвращения подобной генетической дифференциации В грибных популяциях, в том числе и в популяциях вешенки, поток генов сдерживается за счет такого явления как вегетативная несовместимость. Вегетативные клоны у Pleurotus в природе территориально ограничены и малы, и фактически представлены сростками плодовых тел или плодовыми телами, расположенными на одном субстрате (бревне). Поэтому дикариотические штаммы гриба,

полученные из одного и того же сростка и являющиеся вегетативными клонами, были исключены из анализа популяционно-генетической структуры вида Р pulmonarius.

Итак, была отмечена значительная дифференциация между выборками как из разных регионов, так и в пределах отдельного региона в разные годы. Это, вероятно, связано с динамикой аллельных частот и дифференциальным выживанием генотипов в изменяющихся условиях окружающей среды, а также с уникальными возможностями рекомбинационных процессов, характерных для грибов (например, ди-мон скрещивания).

Анализ данных по гаплоидам. Одним из методов тестирования паямиксии и оценки соотношения полового и бесполого воспроизведения является мультилокусная оценка гаметического дисбаланса, или неравновесия по сцеплению, которая для гаплоидных грибов относительно проста, т.к. гаметические частоты можно определять в вегетативной фазе (Brown, Wier, 1983). Для большинства же диплоидных (дикариотических) грибов оценить частоты гаплоидных гамет оказывается затруднительным, и более доступным является сравнение генотипических частот согласно уравнению Харди-Вайнберга. Однако разработанный нами совместно И.С. Дружининой метод пеллетообразования (Дружинина и др., 1997) - получения гомокариотических миделиальных пеллетов (монобазидиоспоровых гаплоидных клонов) из плодового тела (функционального диплоида) в жидкой погруженной культуре - позволил провести оценку гаметического дисбаланса, основанную на сравнении наблюдаемых и ожидаемых частот аллелей аллозимных локусов у гаплоидов. Сегрегация маркеров в гаплоидном потомстве плодовых тел является наиболее простым способом демонстрации происходящих в природе рекомбинаций, при этом метод пеллетообразования позволяет проводить анализ, минуя трудоемкие операции по выделению индивидуальных моноспоровых культур. Анализ по гаплоидам провели для двух звенигородских выборок, для чего из каждого спорового отпечатка, выделенного из природы или после выгонки плодовых тел в лабораторных условиях, было получено по 15-20 моноспоровых пеллетов с последующим анализом наследования их аллозимных локусов. Полученные значения индекса ассоциации (!>=0.019; 0.004 для популяций 1998 и 2000 гг. соответственно) подтвердили преобладание случайных ассоциаций аллелей по множественным локусам (отсутствие гаметического дисбаланса) (табл. 6). Не было обнаружено неравновесия по сцеплению и у диплоидов, оцененного с помощью генотипических частот: индекс ассоциации 1а =0.046 по всем выборкам. В панмиксных популяциях вешенки поддерживается гаметический баланс, и аллели различных локусов сочетаются друг с другом случайным образом, что является следствием активно происходящих в популяциях рекомбинационных процессов. Конечно же, ассоциации аллелей, или гаметический дисбаланс, могут бьггь вызваны и другими факторами, такими как действие отбора или дрейф генов в популяциях малой численности. Но рекомбинации будут неизбежно разрушать любые неслучайные ассоциации аллелей. Это еще раз подтверждает точку зрения, что обнаруженные незначительные отклонения от панмиксии (Н0<Не) не являются следствием присутствия доли клонального воспроизведения в популяциях вешенки, а, вероятно, вызваны миграциями на общем фоне незначительного генного дрейфа.

На основе аллельных частот аллозимов были рассчитаны генетические расстояния (О) по Nei и построена дендрограмма сходства с использованием UPGMA алгоритма. Географически обособленные и репродуктивно изолированные группы штаммов объединились в отдельные кластеры (рис. 5). При этом штаммы Р. ostreatus, независимо от их географического происхождения, сформировали отдельный кластер: это воронежские штаммы В12, В13 и В15, звенигородские 013-1 и А14-2, и московские, собранные осенью (М2-2, МЗ-1, М4-1, М5-2; ## 42,56,55). Два других кластера представлены исключительно изолятами Р. pulmonarius. При этом все тверские штаммы (обозначенные как Tl-1, Т1-5, Т...) объединились в обособленный кластер. Как было отмечено выше, данная популяция характеризовалась наименьшей гетерогенностью и полиморфностыо изоферментных 1

локусов. Штаммы из обеих звенигородских и воронежской выборок сформировали отдельный весьма неоднородный кластер с той или иной степенью дифференциации между отдельными группами штаммов. Воронежские штаммы распались на четыре мелкие подгруппы. Звенигородские штаммы сформировали как обособленные подгруппы (в зависимости от года сбора образцов), так и смешанную подгруппу, объединившую штаммы сборов 1998 и 2000 годов (рис. 5). Генетические расстояния, не превышающие значение 0.08, были характерны для штаммов, собранных с одного субстрата (бревна) или близко расположенных бревен. Причем данные штаммы не являлись вегетативно совместимыми клонами, а представляли собой генетически обособленные индивидуумы.

Таким образом, тверская популяция оказалась наиболее отдаленной как от звенигородской, так и от воронежской популяций Р. pulmonarius (¿>=0.64). Представители Р. ostreatus сформировали кластер, находящийся на значительном расстоянии от всех остальных штаммов (0=0.82), что фактически соответствует уровню межвидовой дифференциации.

ДНК полиморфизм в природных популяциях вешенки

Сходная топология генетического сходства и дифференциации между популяциями вешенки была получена и с применением полиморфных ДНК признаков (RAPD-маркеров) (рис. 6). Однако, в отличие от аллозимов детальный популяционно-генетический анализ по этим признакам, основанный на флуктуациях аллельных частот, не проводили, так как в данном случае невозможно было установить кодоминантность наследования RAPD-признаков. Фингепринты ДНК удобны для идентификации родства и происхождения t

штаммов, подтверждения их клональности, и менее пригодны для изучения межпопуляционных различий в силу того, что затруднительно установить принадлежность многочисленных «аллельных» вариантов к конкретному локусу и определить частоты аллелей.

RAPD-маркеры, как и аллозимы, были способны дифференцировать репродуктивно изолированные близкородственные виды Р. pulmonarius и Р. ostreatus. Однако, в отличие от изоферментных локусов, ПЦР-анализ хотя и объединил штаммы Р. ostreatus в отдельные

0.6 0.5 0.4 0.3 Генетическое расстояние, Э Рис.5. ЦРСМА-дендрограмма генетического сходства между штаммами Р. ри1топапш и Р. о^еаШ, построенная на основе генетических расстояний Нея по 14 аллозимиым локусам.

ОЫапсе 0.05 I-1

8 СП

8

гм о о гм

Р. овЬтеа, г/5

|п| Р.ри/топаЬиэ

о

Я

оо 8

<и

8 X X

г

го

о

0 гм

к

1

X

а 8

Рис. б. иРСМА-дендрограмма сходства между штаммами вешенки, построенная на основе генетических расстояний Нея по КАРО-прюнакам. Цифры на ветвях указывают значения бутстрепа (в %).

подкластеры, но эти подкластеры на дендрограмме находились в пределах «географических» кластеров, объединивших штаммы в зависимости от их географического происхождения (рис. 6). Иными словами, воронежские штаммы Р ostreatus сформировали обособленный подкластер в пределах кластера воронежских штаммов Р. pulmonarius, а все московские штаммы Р. ostreatus независимо от года и места сбора сформировали подкластер в пределах кластера московских штаммов, собранных в 1996 году. При этом обособленные кластеры московских штаммов Р. pulmonarius сборов 1998 и 2000 годов находились гораздо ближе друг к другу и, следовательно, характеризовались большим генетическим сходством, чем московские штаммы 1996 года.

Таким образом, можно проследить две основные тенденции в кластеризации природных штаммов вешешси: одна из них связана с существующей в природе репродуктивной изоляцией, другая - с географическим фактором. Если аллозимные спектры позволили четко дифференцировать близкородственные виды Р. pulmonarius и Р. ostreatus, то RAPD-признаки в большей степени отразили географическую дифференциацию в пределах данных видов. Зависимости кластеризации штаммов от субстратной принадлежности выявлено не было. И это неудивительно, принимая во внимание то, что основным механизмом распространения гриба в природе служат базидиоспоры полового происхождения, способные разлетаться на значительные расстояния и осваивать новые субстраты. Данные по вегетативной несовместимости также свидетельствуют в пользу того, что вклад вегетативного размножения в структуру природных популяций вешеики ограничен в пространстве и практически сведен к минимуму.

1.2. СТРУКТУРА ПОПУЛЯЦИЙ ВОЗБУДИТЕЛЯ ПИРИКУЛЯИОЗА РИСА PYRICULARIA ORYZAECAV.

Фитопагогенный гриб Pyricularia oryzae Cav. - гаплоидный аскомицет, утративший сумчатую стадию и осуществляющий функцию размножения и распространения в бесполой фазе - анаморфе. Сумчатая стадия - Magnaporthe grísea - встречается в основном на диких злахах и не играет существенной роли в увеличении потенциала изменчивости вследствие генетической рекомбинации. Перитеции гриба никогда не были обнаружены на рисовых чеках в природе, но были получены как нами, так и другими исследователями в лабораторных условиях (Дарага, 1984; Kato, 1982). В данном исследовании популяции возбудителя пирикуляриоза риса рассматривали как клональные, размножающиеся исключительно одноядерными галоидными конидиями бесполого происхождения. Немейотическая рекомбинация (парасексуализм) хотя и была продемонстрирована нами в лабораторных условиях, но не было получено прямых доказательств ее существования в природе (Дарага, 1984). В виду гаплоидного состояния вегетативного мицелия, в массе продуцирующего гаплоидные конидии, и отсутствия половой стадии у Р. oryzae, классический популяционно-генетический анализ, основанный на аллельных частотах генов, затруднен. Отсутствие скрещиваемости штаммов фактически не позволяет идентифицировать отдельные белковые фракции на электрофоретических спектрах как аллели одного или разных локусов. Однако, учитывая ограниченность применения

феяотипических маркеров для многих фитопатогенных грибов, белковые спектры все же являются информативными при оценке природного полиморфизма и популяционной структуры.

Штаммы P. oryzae выделяли из пораженных листьев, собранных на рисовых полях в Ханкайском и Черниговском районах Приморского края (1980 и 1982 гт.) и в Красноармейском и Динском районах Краснодарского края (1983 г.). Моноспоровые штаммы получали путем споровых (конидиальных) рассевов выделенных первичных изолятов гриба на картофельно-глюкозном агаре (КГА) с одновременным подсчетом доли выщепляющихся морфолого-культуральных типов (MKT) (процента гетерокариотичности). Общий объем проанализированной коллекции P. oryzae составил: 102 моноспоровых штамма в приморских и 109 штаммов в краснодарских выборках. Популяции гриба характеризовали по культурально-морфологическим, физиологическим и биохимическим признакам.

Анализ культурально-морфологических признаков

В отличие от вешенки, природные изоляты P. oryzae проявили значительное разнообразие по морфологии. Было выделено шесть четко дифференцированных морфолого-культуральных типов (MKT), частоты встречаемости которых значительно колебались в локальных популяциях гриба (рис.7). Несмотря на то, что доля гетерокариотических штаммов, выщепляющих более одного морфотипа при моноконидиальных рассевах, в Приморье была выше и составила 68% по сравнению с краснодарскими выборками (36% гетероркариотических штаммов), приморские популяции продемонстрировали высокую степень сходства по культурально-морфологическим признакам независимо от места и года сбора изолятов (Дарага и др., 1991). Все выборки из Приморья имели сходный фенооблик и состояли из одних и тех же морфотипов с доминирующим С-типом колонии, который дан в типовом описании вида Р oryzae (рис. 7). Вероятно, этот морфотип является наиболее приспособленным к условиям Восточной Азии диким типом. В Краснодарском крае преобладали штаммы с колониями П-типа, характерным только для этого региона и полиостью отсутствующим в Приморье. Причем сравнение двух краснодарских популяций вскрыло более рельефную дифференциацию но MKT между ними. Эти популяции по морфотипам оказались весьма удаленными друг от друга (г=0.629) и в значительной степени дифференцироваными, причем более гетерогенной была красноармейская популяция (табл. 8). В обеих краснодарских популяциях редкие морфотипы встречались с высокой частотой (hp = 0.296 и 0.112 для динской и красноармейской выборок соответственно) (табл.8).

Штаммы из выборок Приморского края, собранных в 1982 году, несмотря на различную сортовую принадлежность их хозяина, оказались по морфологии и частотам встречаемости различных MKT почти идентичными между собой (значения меры сходства г = 0.965) (табл. 8, рис. 8). Приморские выборки 1982 года по своему фенооблику были сходны также со штаммами, собранным в 1980 году (г = 0.965), что делает правомочным вывод о принадлежности всех приморских выборок P. oryzae единой популяции, однородной в пространстве и стабильной во времени. В Краснодарском крае возбудитель пирикуляриоза риса существует в виде локальных изолированных друг от друга популяций, при этом на

о s

8

z &

m

(б T

80 i

I

60 -| 40 20 0

kiiJtiLiJ

Ap & ф

Рис. 7 Частоты встречаемости MKT в популяциях P. oryzae

Таблица 8

Генетическое разнообразие и генетическая дифференциация в популяциях P. oryzae

Выборки Объем выборки Генетическое разнообразие Генетическое сходство Генет. диффере нциация Gsr

Морфотипы Изозимы

Нмкт Р И, Р г I

Ханкайская, 80 32 1.401 4.37 0.126 0.857 0.965 0.870 0.137

Ханкайская, 82 54 1.378 3.98 0.005 0.755

Черниговск., 82 16 1.369 3.95 0.013 0.786

Динская, 83 54 0.787 2.83 0.296 0.628 0.629 0,940 0.062

Красноарм., 83 55 1.366 4.44 0.112 0.830

Приморская коллекция 102 1.426 4.37 0.126 0.881 0.744 0.800 0.219

Краснодарская коллекция 109 1.409 4.49 0.102 0.856

Примечание. Никт - индекс разнообразия по Шеннону (MKT); ц - среднее число морфотипов; /г,,- доля редких морфотипов; Р - доля полиморфных белковых фракций; г - мера сходства; I - генетическая идентичность; Gsr - коэффициент генетической дифференциации между выборками.

дендрограмме красноармейская популяция P. oryzae по MKT находится гораздо ближе к приморской коллекции, чем динская, которая стоит особняком от всех остальных выборок (рис.8).

Значительные различия по культурально-морфологическим признакам двух краснодарских популяций можно объяснить внутрирегиональной дифференциацией в силу различных природных условий. Культурально-морфологические признаки грибов имеют

А. Культурально-морфологические признаки

Ханкайская,1980 Ханкайская,1982 Ильинская,1982 Ханк-ВНИИФ,1982 Черниговская,1982 Красноармейская,1983

Динская,1983

Генетическое расстояние, £>

Б. Изоферментные спектры

Ханкайская,1980 ХанкаВскаяД 982 Хапк-ВНИИФ,1982

Ильинская,1982 Черниговская,1982 Красноармейская,1983 Динская,1983

Генетическое расстояние, И

Рис. 8. Дендрограммы сходства между популяциями Р. огугае, построенные основе генетических дистанций Нея с использованием ТТРСМА алгоритма

адаптивный характер и подвергаются селективному отбору средой. В отличие от Приморья с влажным климатом, где пирикуляриоз на рисе встречается регулярно, в Краснодарском крае рис поражается лишь в отдельные благоприятные для болезни годы, причем в сильной степени на полях, получивших высокие дозы азотных удобрений. В таких условиях происходит уменьшение интенсивности межпопуляционных обменов, в то время как в постоянно функционирующих приморских популяциях распространение редких морф идет быстрее, и это сказывается на повышении общего уровня гетерогенности приморских популяций патогена.

Белковый полиморфизм в популяциях Р. огугае

Ввиду того, что гриб Р oryzae представлен в природе гаплоидными штаммами-клонами, оценку вариабельности электрофоретических спектров белков проводили не по аллельным частотам аллозгшных локусов, как для диплоидного гриба вешенки, а по частотам встречаемости той или иной изоферментной полосы на геле. Как и в случае вешенки, для Р oryzae были выделены спектры, типичные для каждой из популяций гриба, качественные различия которых можно использовать как фенотипические маркеры районов сбора изолятов, например, спектры неспецифических эстераз и лактадегидрогеназы. Дендрограммы сходства между природными популяциями фитопатогенного гриба P. oryzae, построенные на основе морфолого-культуральных признаков и белковых спектров (по шести изоферментам -неспецифическим эстеразам, ЛДГ, СОД, 6-ФДГ, МДГ и водорастворимым белкам) продемонстрировали сходную топологию (рис. 8). Краснодарские популяции гриба находились на значительном расстоянии от приморских, а среди приморских выборок штаммов гриба ханкайская выборка, собранная в 1980 году, в значительной степени отличалась по белковым спектрам от всех остальных из этого региона. Приморские выборки характеризовались более высоким разнообразием по белковым спектрам, чем по морфотипам (табл. 8). Для краснодарских популяций P. oryzae, наоборот, показана высокая степень сходства изоферментных локусов у штаммов, собранных на обширной территории (генетическая дифференциация Gst = 0.062), с четким подразделением на отдельные популяции по MKT (Дарага и др., 1991; Терехова и др., 1991). Значительная дифференциация частот изоферментных локусов между приморской и краснодарской коллекциями в целом (Gsr- 0.219) свидетельствует в пользу генетической разобщенности этих популяций.

По-видимому, на структуру и границы популяций P. oryzae оказывают влияние особенности возделывания культуры риса в разных регионах. Культивирование риса в Приморье имеет длительный исторический период; за это время сформировались штаммы, максимально адаптированные к условиям существования, и многократно происходили межпопуляционные обмены. В результате сформировалась единая популяция, охватившая большую территорию. В Краснодарском крае культура риса молодая, вследствие чего частота фенотипов фитопатогена определяется в большей степени не отбором, а генным дрейфом, характеризующимся разнонаправленными флуктуациями частот генотипов. Кроме того, возможно, не везде прошел отбор наиболее приспособленных штаммов. Вероятно, рисовый патоген распространился из Азиатского региона на Европейскую территорию,

сформировав новые, географически изолированные популяции, а вследствие дрейфа в разных районах Краснодарского края оказались преобладающими различные MKT. Поэтому в Краснодарском крае, в отличие от Приморья, возбудитель пирикуляриоза риса существует в виде локальных изолированных друг от друга популяций, причем их функционирование, очевидно, носит прерывистый характер и в значительной степени зависит от погодных условий. Таким образом, популяции возбудителя пирикуляриоза риса дифференцированы как в пространстве, так и во времени. Даже о двух краснодарских популяциях с индексом генетического сходства по белкам, равным I = 0.940, можно говорить как о географически подразделенных. Генетическая дифференциация между выборками из двух отдаленных регионов - Приморья и Краснодарского края - составила 0.219. Генетическая дифференциация среди субпопуляций патогена в Приморье по годам также оказалась значительной (Gst = 0.137), что подтверждает наличие временных флуктуаций частот встречаемости фенотипов.

Физяолого-биохимические признаки

Природные популяции Р oryzae были охарактеризованы по комплексу физиолого-биохимических признаков: устойчивости к контактному фунгициду цинебу, применявшемуся на полях для защиты урожая от пирикуляриоза, и ауксотрофности. Было показано, что во всех выборках P. oryzae преобладали штаммы со средней устойчивостью к фунгициду цинебу (Шнырева, 1996). Иными словами, природная устойчивость штаммов к данному фунгициду с широким спектром действия носила модификационный (ненаследственный) характер, и во флуктуирующих условиях среды отбор был направлен на фенотипы со средней адаптабельностью. Анализ резистентности грибных популяций к применяемым фунгицидам по частоте устойчивых клонов имеет практическое значение для прогноза развития эпифитотий.

Прерывистый характер функционирования популяций P. oryzae в Краснодарском крае и затрудненные межпопуляциониые обмены, очевидно, явились причиной распространенности в этом регионе природных ауксотрофов с широким спектром питательной недостаточности -почти половина всех штаммов (49%). В Приморье частота встречаемости природных ауксотрофов не превысила 5% (табл. 9). Подавляющее число краснодарских ауксотрофов имели потребности в азотистых основаниях, а приморских - в витаминах (Шнырева, 1996). Поскольку ауксотрофные мутации грибов легко возникают спонтанно и ревертируют, то, по-видимому, столь большая разница в частоте их встречаемости в разных географических районах обусловлена экологическими особенностями этих районов. Кроме того, отсутствие постоянного потока генов в краснодарских популяциях значительно снижает возможность взаимной комплементации между дефектными ядрами. Возможно также, что при определенных, обедненных по питанию условиях ауксотрофы оказываются более жизнеспособными и получают преимущества перед прототрофами в силу замедленного прорастания их конидий, как это было показано для фитопатогена Ustilago violaceae (Garber etal., 1978).

Нестабильность моноспоровых гаплоидных клонов P. oryzae. Спонтанная внутриклональная изменчивость

В ходе исследования была показана чрезвычайно высокая нестабильность моноспоровых изолятов, которые фактически являлись клонами (Дарага, Дьяков, 1989). Моноконидаальные штаммы P. oryzae с гаплоидными ядрами продолжали выщеплять различные MKT при споровых рассевах, а клоновые потомки моноспоровых штаммов, в свою очередь, демонстрировали значительную вариабельность электрофоретических белковых спектров. Все выделенные моноспоровые штаммы P. oryzae были подвергнуты 3-кратному клонированию (рис. 9). Последовательные клонирования привели к некоторой «стабилизации» культур и уменьшению расщепления моноконидиальных штаммов, однако во всех трех лабораторных генерациях присутствовали штаммы с реплицирующейся нестабильностью (18% в приморской коллекции и 5% в краснодарской) (Дарага и др., 1985). Имеющийся у природных изолятов некий фон изменчивости не мог быть разрушен даже многократными клонированиями; при этом доля стабильных штаммов в краснодарской коллекции была выше. Внутриклональная вариабельность патогенности при заражении листьев восприимчивого сорта риса Shao-tiao-tsao у морфологически стабильных штаммов была недостоверной (анализировали по 10 субклонов для каждого штамма). В то же время вариабельность нестабильных штаммов при пассировании их через восприимчивые растения риса возрастала как по морфологии, так и по патогенности (Дарага, 1984; Дарага и др., 1985).

Спонтанная внутриклональная изменчивость множественных форм ферментов у нестабильных штаммов, колеблющаяся от 0.42 для краснодарских штаммов до 0.78 для

4 стабильных изолятов

, -г -

выборки

Рис. 9. Доля стабильных по MKT изолятов P. oryzae в последовательных клонированиях

приморских (табл. 9), приближалась к внутрипопуляционной, составляющей для краснодарской и приморской популяций 0.856 и 0.881 соответственно (табл. 8). Даже морфологически стабильные штаммы Х80Т-6.8 и ДС-1.30 характеризовались спонтанной внутриклональной изменчивостью множественных форм ферментов, доля полиморфных белковых фракций у которых составила 0.37 и 0.42 соответственно (табл. 9). Поскольку гриб Р. огугае воспроизводится бесполым путем, и его природные популяции представлены клонами, вполне правомочным было сравнение лабораторных коллекций субклонов с природными выборками (табл. 9). Оценка генетических расстояний Нея показала, что уровень спонтанной биохимической вариабельности субклонов нестабильных штаммов отражает реальную ситуацию чрезвычайной изменчивости патогена в природе, и может служить косвенным критерием в оценке общего потенциала генетической изменчивости гриба. Нами также был показан полиморфизм длин фрагментов рестрикции ДНК (в ИРЬР анализе) у стабильных и нестабильных штаммов (Дарага и др., 1988). Феноменология внутриклональной изменчивости моноспоровых штаммов возбудителя пирикуляриоза риса представляет практический интерес, так как она является одной из причин быстрой потери устойчивости к болезни сортов риса и снижения эффективности многих применяемых фунгицидов, а также создает трудности при дифференциации физиологических рас гриба. Поэтому, как показано в данном исследовании, для практической работы по дифференциации сортов риса необходимо предпринимать многократные клонирования тестерных штаммов с отбором по изначальному материнскому фенотипу.

Явление чрезвычайной нестабильности и вариабельности природных изолятов возбудителя пирикуляриоза, вероятно, можно объяснить наличием в геноме гриба

Таблица 9

Нестабильность моноспоровых штаммов Р. огугае

Выборки МКТ Изоферментные спектры

Доля нестаб. штамм. % реп- лицир. нестаб. Нестаб. кцинебу Ауксо-трофы Штаммы из выборки Число субклонов Доля полимо рфных Доля редких (р<0.01)

Ханкайская, 0.53 35 0.47 0 Х80Т-6.8 47 0.37 0

1980 Х80В-4.15 86 0.78 0.22

Ханкайская, 1982 0.70 47 0.39 0.09

Динская, 1983 0.19 30 0.59 0.44 ДС-1.30 46 0.42 0.04

Красноарме йская,1983 0.35 57 0.45 0.53 КВ-1.27 44 0.46 0.04

Лабораторн. Н-5-3 55 0.31 0

Приморская коллекция 0.63 39 0.41 0.05 Генетическое расстояние между природной коллекцией и субклонами штаммов Б = 0.215

Краснодар, коллекция 0.27 49 0.52 0.49 Генетическое расстояние между природной коллекцией и субклонами штаммов 0 = 0.114

траяспозонподобных мобильных элементов. Геном P. oryzae буквально «нашпигован» мобильными элементами различного типа, многие из которых, как показали исследования зарубежных авторов, являются активными (например, Рой, MGR586, Mg-SINE, MAGGY и др.) и связаны с изменчивостью патогенных свойств гриба (Hammer et al., 1989; Kachroo et al.,1995; Nakayashiki et al.,1999; Ikeda et al., 2001). При этом многие мультикопийные мобильные элементы, например, MGR586 последовательности, диспергированые по геному, встречаются только у изолятов гриба, поражающих рис, и отсутствуют у штаммов на дикорастущих злаках. Частые транспозиции мобильных генетических элементов могут быть причиной спонтанной внутриклональной изменчивости природных штаммов гриба. Вероятно, можно предположить позитивную роль транспозонов в адаптации гриба к изменяющимся природным условиям (Шнырева, 2002).

2. ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПОПУЛЯЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. P.OSTREATUS КАК ТЕСТ-ОБЪЕКТ В ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

Помимо оценки гаметического дисбаланса метод пеплетообразования был применен для выявления генотипяческих особенностей гриба и возможности его использования в тестировании индивидуальных особенностей устойчивости биологических объектов к факторам длительного космического полета, а также для оценки мутагенности среды (прямое воздействие тяжелых частиц) в экстремальных условиях ОК «Мир».

В условиях загрязнения среды различным мутагенами химической природы и радионуклидами проблема мониторинга мутационного груза становится важнейшей. В эксперименте использовали стерильные споровые отпечатки, полученные путал выгонки плодовых тел, и монокариотичные мицелиальные пеллеты, помещенные в 1.0 мл жидкой ячменно-дрожжевой среды (MYG) в пробирках Эппендорф. Параметры обработки биологического материала на станции «Мир» были следующими: поглощенная доза радиации - 15-25 Rad; ударные и вибрационные ускорения с перегрузками в 40-100 ед. и 202000 Гц соответственно; температура - от -5 до +35°С; продолжительность полета - 2 недели. Большинство (64.3% из 42 проанализированных) мицелиальных культур (клонов), полученных из спорового отпечатка штамма #38, после полета характеризовались однородным мицелием, не отличающимся по скорости роста и морфологии от контрольных образцов. 35.7% клонов давали неоднородные колонии с секторами. Не было обнаружено отклонений от Менделевского расщепления 1:1, характерного для моногенно наследуемых аллозимиых локусов - Mdh, Adh, Idh, Acp, Gdh и др. Следовательно, мутагенный эффект по расщеплению аллелей аллозимных локусов не наблюдали. Однако все монокариотичные мицелиальные штаммы были способны образовывать зачатки плодовых тел («узелки») в чашках Петри. Фактически мы наблюдали спонтанную самофертильность гаплоидов. Возможно, самофертильность гаплоидных штаммов и может служить индикатором

повышенного мутагенного фона среды обитания, однако данный факт требует дальнейшего тщательного анализа.

2.2. АНАЛИЗ МИКРОМИЦЕТОВ ОРБИТАЛЬНОГО КОМПЛЕКСА «МИР» Целью данного исследования было выяснить, представляют ли обнаруженные на OK «Мир» несовершенные грибы родов Pénicillium и Aspergillus резидентную микрофлору, или являются транзитными, т.е. занесенными с экспедициями. Возможность применения традиционных популяционно-генетических параметров для решения данной задачи обусловлено тем, что замкнутое пространство орбитальной станции можно рассматривать как заселенное ограниченной в пространстве популяцией микроорганизмов. Ввиду характерного для данных видов бесполого размножения гаплоидными конидиями, анализ генотипического сходства между штаммами позволяет сделать вывод о распространении в данной замкнутой популяции генетически сходных клонов, а, следовательно, и о резидентном заселении OK «Мир». Практическая важность данного исследования заключалась в том, что виды Pénicillium и Aspergillus вызывали серьезные биоповреждения конструкционных материалов интерьера и оборудования обитаемых отсеков станции «Мир» (Викторов и др., 1998). Сходство между 21 штаммом из коллекции Института Медико-биологических проблем определяли в RAPD-ПЦР анализе со случайно подобранными праймерами (Шнырева и др., 2001). На дендрограмме сходства изученные штаммы были четко разделены два кластера, соответствующие родам Pénicillium и Aspergillus, с подразделением последних на подкластеры, соответствующие видам P. chrysogenum, Р. expansum и A versicolor, A flavus соответственно (рис.Ю). Генетически сходные штаммы, расстояние D (по Nei) между которыми на дендрограмме менее 0.05, в силу бесполого размножения данных видов можно считать клонами, происходящими от общего родителя. Штаммы ##2-2 и 2-3, выделенные на OK в июле и сентябре 1995 г. (с интервалом времени в 37 суток), как и штаммы ##2-6 и 2-7, изолированные с различных субстратов в сентябре1996 г., оценили как резидентные. Штаммы Р chrysogenum ##1-2,1-3 и 1-6, изолированные на OK с 8-годовым интервалом времени (в 1988, 1995 и 1996 гт. соответственно), фактически являются типичным резидентным заселением искусственной среды OK «Мир». Такие штаммы как #1-5 в кластере Р. chrysogenum и #2-5 Р. expansum можно считать случайно занесенными во время экспедиций. Вид Р. chrysogenum доминировал в среде обитания OK «Мир». Уже в 1987 году, всего лишь год спустя с момента эксплуатации станции, уровень биоконтаминации Р. chrysogenum составил приблизительно 105 КОЕ на 100 см2 (Викторов и др., Î998). Частота обнаружения данного вида доминировала (29%) по сравнению с другими видами грибной микрофлоры, которая включала более 100 видов. Анализ спектра вторичных метаболитов, синтезируемых резидентными штаммами Р. expansum и Р chrysogenum, показал, что наряду с типичными для данных видов вторичными метаболитами (алкалоидами виридикатином, мелеагрином, рокефортином и др.) происходил синтез новых метаболитов - пуберулина и фруктигена -, не характерных для данных видов (Козловский и др., 2002). Большинство изученных штаммов продуцировали метаболиты, содержащие

триптофан, причем все идентифицированные метаболиты резидентных штаммов рода Pénicillium характеризовались высокой токсичностью.

Pf <N| ^ со tNj"^- ^ Sä

5 5 5

A. versicolor

A. fia vus P.expensum

P.chrysogenum

Рис. 10. Дендрограима сходства между штаммами родов Pénicillium и Aspergillus, выделенных на OK «Мир»

2.3. СОРТОИЗУЧЕНИЕ И СЕЛЕКЦИЯ СЪЕДОБНЫХ ГРИБОВ - ВЕШЕНКИ И

ШАМПИНЬОНА

2.3.1. Молекулярная диагностика культивируемых штаммов вешенки устричной, Р1еигоШ тЬгеМш, и шампиньона двуспорового, Лдопсш Ыхрогия

Описанные выше молекулярно-генетические признаки (аллозимные локусы, КАРЭ и ППЛ? маркеры) были успешно использованы для характеристики и дифференциации

культивируемых сортов вешенки (11 ппаммов) и шампиньона П8 штаммов) из коллекции ЗАО «Заречье» им. С.А Кушнарева (Шнырева и др, 2002, 2003). Для идентификации межвидовых гибридов и сортов идеальными являются мопоморфные белки, дающие идентичные спектры для каждого конкретного вида Мономорфные белки можно иепользовагь также как диагностические генетические маркеры для видов-двойников, морфологические отличия которых слабо выражены.

Если культивирование шампиньона имеет длительную историю, то вешенка введена в культуру всего несколько десятилетий назад, и интенсивная селекционная работа в России с ней не проводилась Большинство сортов вешенки, культивируемых в нашей сгране, являются сортами европейской селекции, либо представляют собой несколько улучшенные дикие штаммы В отличие от шампиньона, который выращивается в основном на крупных предприятиях, производство вешенки благодаря относительно простой и гибкой технологии успешно развивается в небольших хозяйствах. Однако значительное количество мелких

35

лабораторий, производящих посевной мицелий гриба, разрозненность коллекций производственных штаммов и, самое главное, отсутствие унифицированных характеристик штаммов вешенки значительно затрудняют оптимальный выбор культур для производителей. Поэтому необходимость проведения сравнительного анализа (паспортизации) культивируемых в России штаммов грибов с применением молекулярно-генетических методов очевидна. Помимо аллозимных локусов и RAPD-патгернов ДНК для молекулярной дифференциации видов и сортов вешенки был использован применяемый в филогении высших растений и млекопитающих метод таксонопринта, основанный на анализе полиморфизма фрагментов рестрикции повторяющихся последовательностей ДНК (RFLP) с концевым мечением продуктов гидролиза (Шнырева и др., 1996). Преимущество использования повторов ДНК заключается в том, что, во-первых, данные последовательности рассеяны по геному и локализованы в основном в некодирующих участках и, во-вторых, для этих последовательностей характерна более быстрая дивергенция. Данный подход продемонстрировал значительный полиморфизм по повторяющимся последовательностям ДНК и совместно с традиционными скрещиваниями исследуемых сортов со штаммами-тестерами (полученными из сорта Sommer) показал частичную репродуктивную изоляцию между исследованными сортами вешенки, полученными из независимых селекционных источников и различных географических зон. Однако, несмотря на информативность, метод таксонопринта является трудоемким по сравнению с аллозимным и RAPD анализом, совместное применение которых показало высокий уровень генетического разнообразия среди культивируемых штаммов вешенки и значительно более скудное для шампиньона (Шнырева и др., 2002,2003).

Дендрограммы сходства, построенные на основе изоферментных локусов и RAPD-ПЦР анализа, дали сходные топологии (рис. 11). Коммерческие штаммы вешенки были распределены в три группы (кластера), согласно которым можно выделить три генетические линии селекции: первая, вероятно, связана с венгерским сортом 27 и немецким гибридом Sommer, вторая связана с гибридизацией штаммов с разновидностью florida; третья независимая линия связана с внедрением природных штаммов в промышленное культивирование и представлена сортом БП/8.

Кластеризация штаммов шампиньона A bisporus была менее выраженной: на дендрограмме можно четко выделить лишь две обособленные группы белых и коричневых сортов (рис. 11). Изоферментньгй анализ показал относительную генетическую гомогенность ?

белых сортов и гибридов шампиньона, что фактически отражает отсутствие генетического разнообразия и служит подтверждением мнения зарубежных и отечественных авторов об узкой генетической базе культивируемых штаммов шампиньона (Можина и др., 1993; Khush 1

et al., 1995; Moore et al., 2001). Более высокий уровень полиморфизма и генетического разнообразия, отмеченный среди сортов Р ostreatus, свидетельствует о более широкой генетической базе, используемой в селекции этого гриба. Для улучшения желаемых сортовых характеристик шампиньона необходимо значительно расширять генетическую базу селекции, т.е. внедрять в процесс селекции и гибридизации дикие штаммы, выделенные из природных источников. Нами было показано, что такие аллозимные локусы, как

*

Рис. 11. Дендрограммы сходства между культивируемыми штаммами вешенки и шампиньона А. Изоферментные локусы (генетические дистанции по №!, РОКЗЕМЕ у.1.32)

Р. овЬевЫ

Г

Г

-ш

+ т

' Р77Й

Р-3725/4

- Эош/З

- Щ

- Д103/10

- №»112/10

- БП/8

- И/16

|— У217/7 -i I— 19/2

А. Ыврогиз

П

гт_=

С:

2001Л

- Р-Э71Ш

- ¥-371*а

- 1%-3471ЭЙ

- р-3710/а

- Р-3712/3

- Н-3711/4

- 200в/9

- Р-3709/2

- Г-Э717П

13 и-

- 273^7

- ГДР-2/7

. 12/7 . vi

Б. ДНК-полиморфизмы (ЯДРО-ГИДР анализ, ТЯЕЕСОМ у.1.1)

КЯапсеОЛ

Р.ояЬваШ

А. Ызрогиэ

Шмпсе 0.1

лейцинаминопептидаза, фосфоглюкомутаза, эстераза (Lap, Pgm, Est) являются хорошими маркерами для молекулярной паспортизации штаммов. Изозимные маркеры могут быть также использованы при контроле за мицелиальной биомассой при промышленном глубинном культивировании гриба.

23.2. Изучение биодеструкционной способности культивируемых грибов

Базидиомицеты, обладающие большим набором разнообразных гидролитических и окислительно-восстановительных ферментов с широкой субстратной специфичностью, обеспечивают эффективный гидролиз лигноцеллюлозных субстратов (Baño et al., 1996; Решетникова, 1997).

Сравнительная опенка биодеструкционной активности культивируемых и природных штаммов P. ostreatus.

У вешенки обнаружены целлюлолитические, ксиланолитические и лигнолитиченские ферменты, что позволяет культивировать данный гриб на различных растительных отходах. Скорость освоения субстрата при промышленном культивировании базидиомицетов зависит от уровня биодеструкционной активности штаммов. Поэтому была проведена предварительная оценка лигниназной и целлюлолитической активностей штаммов вешенки.

Сравнение биодеструкционной активности (первичный скрининг пггаммов) осуществляли качественными методами на твердых питательных средах с добавлением специфических субстратов: 0,01% а -нафтола - для оценки лигнолитической (полифенолоксидазной) активности (Дудка и др., 1982); и с йодисто-калиевым реагентом -для определения целлюлолитической активности (Paterson, Bridge, 1994).

Все коммерческие зарубежные сорта продемонстрировали относительно высокую липшнразрушающую активность, но далеко не все природные штаммы, которые были стихийно внедрены в производство, характеризовались высоким биодеструкционным показателем (Шнырева, 2002). Тем не менее, гибридизация и внедрение диких природных изолятов в культивирование необходимо, так как это значительно расширяет генетическую базу культивируемых видов и направлено на поддержание уровня гетерозиготности в отличие от инбридинга, который неизбежно приводит к сортовой депрессии и снижению урожайности. Для внедрения в производство рекомендованы природные штаммы вешенки -А6-1, А5-1, А10-1 и А14-2.

Молекулярно-генетический анализ семейства генов лакказы у шампиньона Asaricus bisporus.

Лакказы (n-Дифенол: О-оксидоредуктаза ЕС 1.10.3.2), обильно секретируемые в среду во время мицелиального роста шампиньона A bisporus и значительно снижающие свою активность при формировании плодовых тел, представляют собой димерный гликопротеин с молекулярной массой 65 kDa. Лакказы, принадлежащие группе голубых оксидоредуктаз, катализируют реакции окисления органических субстратов широкого спектра: moho-, да- и полифенолов, ароматических аминов, метоксифенолов. Лакказы базидиальных грибов (Pleurotus ostreatus, Trametes versicolor, Trametes pubescens, Pycnoporus cinnabarinus)

привлекают особое внимание в связи с тем, что они способны участвовать в процессах биодеградации лигнина и устранять образующиеся в результате этого процесса потенциально токсические фенолы (Smith, Thurston, 1997). Кроме того, лакказы играют роль при морфогенезе, споруляции, в патогенезе фитопатогенных видов (Gianfreda et al., 1999).

Нами было идентифицировано два неаллельных, тандемно расположенных гомолога гена лакказы (led и 1сс2) у культивируемого шампиньона A. bisporus (Smith, Shnyreva et al., 1998). Отсутствие сегрегации признаков в потомстве одноядерных базидиоспор, полученных из четырехспоровых базидий, доказало неаллельность данных гомологов. Из библиотеки генов путем гибридизации с зондом - кДНК последовательностью гена лакказы, полученной на мРНК 1сс2 гена, - был отобран космидный клон LA16E2, содержащий обе копии лакказных генов. Предварительно была построена подробная карта рестрикции данного космидного клона LA16E2. Последующее секвенирование с использованием специфических праймеров, гомологичных 5'- и 3'- последовательностям обоих лакказных генов, подтвердило данные рестрикционного анализа о том, что два гена расположены тандемно друг за другом (led копия слева от 1сс2), ориентированы в одном направлении («голова-к-хвосту»), и межгенная область между стоп-кодоном гена Iccl и старт-кодоном гена 1сс2 составляет 1562 нп (нуклеотидные пары); протяженность ОРС (открытых рамок считывания) генов составляет приблизительно 2.3 тнп (рис. 12).

Различия в нуклеотидных последовательностях кодирующих областей обоих генов составили всего лишь 8.6%, и были характерны в основном для 5'-кодирующих областей обоих генов, а также для 5'-некодирующих областей, что послужило поводом высказать предположение о дифференцированной регуляции экспрессии данных генов. Несколько уникальных и общих сайтов связывания факторов транскрипции было обнаружено у обоих генов (рис. 12). Так, для гена led было обнаружено два 'TATA' бокса и один 'СААТ, причем только второй 'TATA' бокс был характерен для обоих генов. Несколько уникальных 'СААТ' боксов было обнаружено для гена 1сс2, нахождение которых отмечено в положении нуклеотидов 3877-3880,4087-4090 и 4126-4129.

Лакказная активность всегда присутствовала в культуральной среде и была пропорциональна биомассе мицелия (Perry et al., 1993). Однако во время образования плодовых тел уровень секретируемых лакказ в компосте претерпевал значительные изменения. В количественных RT-PCR (обратно-транскриптазных ПЦР) экспериментах со специфическими праймерами, характерными для led и 1сс2 последовательностей, было показано, что уровень секреции продукта гена lee2, определяемой по относительному количеству мРНК во фракции тотальной РНК, в 300 раз превышал таковой для led в жидкой культуральной среде и в 7000 раз был выше в компосте (Smith, Shnyreva et al., 1998). Иными словами, изобилие мРНК 1сс2 наблюдали как при культивировании гриба в жидкой среде, так и на компосте. По-видимому, обе лакказы характеризуются различными функциями, и дифференцированно регулируются при различных условиях. Вероятно, можно ожидать относительно высокий уровень экспрессии гена led при каких-либо других условиях, нами не обнаруженных.

(А)

led ОРС Icc2 ОРС

кодон начала кодон терминацни кодон начала

транскрипции led транскрипции led транскрипции 1сс2

lkb

(Б)

3941 GGGAAACTTGACAAATATCCAGTCGCAAAGCACTGATTTCCAGCATTAGT 3990 71 GTGAGTCG TGACCAACGTCCAGTGGCAAAGCGCTGGTT.......TTAGT ИЗ

3991 GTTAAACTACA.........GCAGACCACCCCGCAAAAATAAGGCGTGGG 4031

114 ATTAAATCACAAACTGAACCACAGTACAACGCCTGCAAGACACGCGCGTG 163

4032 ATGTCCGACA . GTACGTTGTTCATTCATAGGCCCGTATTGGCCA . ACAAG 4079

164 ATGTI®HACAAACGTTGAACATCTATGCGCCTGTAACGGGGAGAGAAA 213 1 1

4080 TCrCGCAMBFrACCTCGGACGGTAAACGCCATCAGCTTCCAA..............4122

214 CCTCGTGAAACTGCCCTGGATGATAAATTTCATCAGCTTCGAATGTCAGT 263

1 2_

4123 . .. АА1 ¿t^ICTTGTCAACTCCCTTGCGААД^^ДШШШШСТСТАТСТ 4169

264 GACATTGAATGTTAT. АААТАСССАССАСАИИИИИЯЯкпДИкУГ 312

1

4170 GAACCCGCGAACrCCTGAAAAAATTTCGGGCCATACATGAATCGTGGTCC 4219

313 GAGCGCGTAAACT.. TTAGAAAATTTC........CGTGGATTGTGGTCT 352

3_

4220 CAAGCATAGCG TCGKK:GTTTCTCATAGCGfflMBH^gAAATAACTTC 4268

353 CAGGCATATCGCTGGTGGTTTCTCCTTGTT^HI^^^BATGTATCTTC 401 4

4296 GCG lÜÜIWAA.. . . GCTCTAGACATTTTGTT TGCTCTCCAGCCAACC 4313

402 AGGCMHMMÍGACGGGGGCAGAGGACCGTGGATTGACTCTCCAGC 446

4314 AGCAAGTGTTACATG 4329

Рис. 12. А). Организация кластера генов лакказы A. bisporus. Расстояние между ОРС обоих генов - 1562 нп. ОРС гена 1сс2 представлена частично, т.к. эта последовательность была проанализирована в основном на кДНК копии. Б). Сравнение (BESTFIT) последовательностей межгенной области, примыкающей к проксимальному концу гена 1сс2 (верхняя последовательность) и 5'ннекодирующей области гена led (нижняя последовательность). Кодирующая область led начинается в положении нуклеотнда 460, а 1сс2 - в положении нуклеотида 4327. Гомологичные последовательности выделены жирным шрифтом. Регуляторные области показаны в заштрихованных темных прямоугольниках: 1 - СААТ боксы; 2 - связывающий сайт "heat shock response" элемента; 3 - сайт, идентичный 5'-области гена лакказы Coriolus hirsutus и связывающему сайту дрожжевого гена GALA дрожжей; 4 - TATA боксы.

Нельзя исключать также и возможный контроль регуляции экспрессии лакказных генов путем частичной деградации мРНК, как это было показано для целлюлазных генов cell и cel2 A. bisporus (Chow et al., 1994).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Природные популяции вешенки характеризовались высокой полиморфностъю, причем генетическое разнообразие внутри популяций было ниже, чем для вида в целом. Высокий уровень вариабельности по всем показателям - доле полиморфных локусов (Р ~ 0.929), генетическому разнообразию (/ = 0.824), среднему числу аллелей на локус (А = 3.5) -свидетельствовал о значительной генетической дифференциации между популяциями, что было подтверждено с помощью Р-статистики (^т = 0.750). Высокая гетерогенность и полиморфизм популяций вешенки, увеличение генетического груза в виде редких аллелей подтверждают способность популяций выживать в варьирующих условиях внешней среды и на различных субстратах, их конкурентоспособность. Для вешенки характерны в той или иной степени дифференцированные локальные популяции, открытые для миграции особей. Однако вклад мигрантов в общий генотипический состав популяции невелик, так как, вероятно, отсутствует эффективная фиксация генов мигрантов в гегерозиготах при скрещиваниях с аборигенами. Несмотря на панмиксис, популяции в неблагоприятных условиях демонстрируют определенную структурированность и внутрипопуляционную дифференциацию, обусловленную колебаниями аллельных частот генов и дифференциальным выживанием генотипов в изменяющихся условиях среды. У всех географически изолированных популяций наблюдали высокий уровень генотипического разнообразия и равновесные мультилокусные частоты аллозимных генов (отсутствие гаметического дисбаланса), что подтверждает преобладание полового воспроизведения и наличие случайных рекомбинаций между особями. Иными словами, в свободно скрещивающихся популяциях вешенки любые возможные ассоциации аллелей быстро разрушаются, а клоны, ограниченные отдельным субстратом, и связанные с ними возможные неслучайные скрещивания не оказывают существенного влияния на генотипическую структуру популяций, определяемую главным образом половым воспроизведением. Отмеченный незначительный уровень инбридинга, присущий грибам с тетраполярной системой половой совместимости, также не противоречит утверждению о том, что природные популяции вешенки являются панмикгическими, а основным способом размножения гриба в природе служат базидиоспоры полового происхождения, способные распространяться на значительные расстояния. Вегетативно совместимые клоны - грибной индивидуум, или генет, - обнаруживали лишь в пределах одного субстрата, хотя чаще наблюдали структуру, характеризующуюся формированием мозаики вегетативно несовместимых клонов в древесине. Вегетативно совместимые группы (генеты) характеризовались равной приспособленностью, а преобладающее в популяциях половое воспроизведение обеспечивало возможность непрерывных генетических обменов между ними. Кластерный анализ, проведенный на основе частот аллелей 14 изоферментных локусов и ЯАРП-маркеров, подтвердил видовую дифференциацию и наличие миграций между географически изолированными популяциями гриба.

Популяционная структура возбудителя пирикуляриорза риса Р. огугае охарактеризована как состоящая из дифференцированных субпопуляций с высоко вариабельными гаплотипами. Агамные популяции Р. огугае при практически полном

ограничении свободной рекомбинации, обладали максимально высоким уровнем генетической изменчивости по всем группам изученных признаков. Такая структура является результатом клонального воспроизведения, сопряженного как с мутациями и миграциями, так и с генным дрейфом и отбором. Популяции возбудителя пирикуляриоза риса имеют высокую численность и миграционную способность на обширных территориях. В таких условиях виды способны накапливать значительное количество генетической изменчивости вследствие постоянного мутационного давления, при этом большая часть изменчивости может оставаться нейтральной по отношению к действию отбора. С другой стороны, одной из причин динамики генотипического состава популяций фитопатогенных грибов может быть циклическая смена ведущей роли генного дрейфа, связанного со значительными колебаниями численности, и отбора. Вероятно, дрейф генов и привел к наблюдаемым резким различиям и дифференциации по MKT между краснодарскими популяциями у полициклического гриба P. oryzae. Не исключено также, что поток генов в агамных популяциях фитопатогенных грибов может приводить к постепенному вытеснению данной популяции ее доминирующими мигрантами (Leung et al., 1993). Из данных по внутриклональной и внутрипопуляционной вариабельности возбудителя пирикуляриоза можно предположить, что имеет место совпадение индивидуальной и популяционной компонент приспособленности. Иными словами, в популяциях гриба наблюдаем достижение оптимального генного разнообразия и адаптационного максимума.

В целом преобладание полового или бесполого воспроизведения в природных популяциях грибов оказывает решающее значение на формирование популяционной структуры данного вида. Мейотические рекомбинации обеспечивают высокий уровень генотипического разнообразия и нивелирование вредных мутаций, в то время как бесполое размножение чаще всего приводит к распространению и доминированию отдельных клонов и гаметическому дисбалансу. Поэтому эволюция многих агамных видов, особенно фитопатогенов, возможно, шла по пути приобретения активных мобильных генетических элементов, способствующих накоплению значительной генетической вариабельности в форме разнообразных мутаций в геномах грибов (Шнырева, 2002). С другой стороны, половой процесс и генный дрейф у высших организмов нивелирует генетические различия между отдельными особями в популяции, поэтому внутрипопуляционное разнообразие обычно значительно ниже межпопуляционного, что показано для популяций P. pulmonarius. Клональное размножение, наоборот, приводит к тому, что внутрипопуляционньге различия становятся сравнимы с межпопуляционными, что мы и наблюдали в популяциях P. oryzae. Генетическое разнообразие популяций P. oryzae по многим признакам значительно превышало значения показателей внутрипопуляционного разнообразия, характерного для «

многих других видов грибов. При этом гетерогенность популяций обеспечивалась не рекомбинационными процессами, а миграцией разных клонов и спонтанными мутационными процессами, возможно, связанными с транспозициями мобильных генетических элементов. Высокий уровень генотипического разнообразия на ограниченной территории (во всех выборках) указывает на то, что функционирование агамных популяций P. oryzae не лимитировано ограниченным числом генотипов на данных территориях. На

примере приморских популяций Р. огухае мы находим подтверждение мнению о том, что чем сложнее внутренняя организация системы, чем значительнее ее внутреннее разнообразие, тем устойчивее она к различного рода внешним воздействиям, выше ее адаптационные способности.

ВЫВОДЫ

1. Впервые исследованы структуры популяций вешенки и возбудителя пирикуляриоза риса с использованием набора генетических, молекулярных, морфологических и физиолого-биохимических маркерных признаков и генов. Подтверждена концепция о ключевом влиянии системы размножения на формирование популяционной структуры вида. Виды вешенки с четко выраженным гапло-дикариотическим жизненным циклом образуют панмиксные популяции (соблюдается равновесие Харди-Вайнберга), в которых поддерживается гаметический баланс (1а =0.046) с преобладанием случайных ассоциаций аллелей по множественным локусам. Возбудитель пирикуляриоза риса Р. огугае, размножающийся в природе исключительно конидиями, формирует тональные популяции.

2. Впервые показано, что сравнимый по показателям высокий уровень полиморфизма и генетического разнообразия в природных популяциях дикариотических видов вешенки и гаплоидного фитопатогена Р. огугае поддерживается действием различных механизмов. Если значительное генотипическое разнообразие (Р=0.929, /„=0.824, Я„с=1.188) в популяциях Р риШопапш обеспечивается активно происходящими рекомбинационными процессами, то в клональных популяциях возбудителя пирикуляриоза риса Р. огугае не менее высокий уровень полиморфизма и вариабельности (#'¿«¡7=1.426, Р=0.881 в Приморье; и Н'мкт =1.409, Р=0.856 в Краснодарском крае) обусловлен спонтанной внутриклональной изменчивостью патогена.

3. Агамные популяции Р. огугае при практически полном ограничении свободной рекомбинации обладали максимально высоким уровнем генетической изменчивости. Внутриклональная спонтанная изменчивость (генетическая нестабильность) по всем изученным признакам была сравнима с внутрипопуляционной.

4. В панмиксных популяциях вешенки основными факторами, влияющими на их структуру, являются рекомбинации и поток генов (миграции), сочетающиеся с дифференциальным выживанием генотипов в изменяющихся условиях среды; в агамных популяциях возбудителя пирикуляриоза риса миграции клонов и спонтанный мутационный процесс обеспечивают значительное генотипическое разнообразие, а дрейф генов приводит к генетической дифференциации, особо отмеченной в локальных популяциях Краснодарского края.

4. Продемонстрирована полная репродуктивная изоляция между близкородственными видами - Р. ри1топапш и Р ояРеагш - с частично перекрывающимися морфологическими признаками. Встречаемость данных видов в биогеоценозах средней полосы России зависит от погодных условий: летом преобладает вид Р. ри1топагш, в то время как осенью при колебаниях суточных температур - Р. оя^еаПа.

5. Межвидовая и внутривидовая дифференциация на географически изолированные популяции в пределах видов P. pulmonarius и P. ostreatus подтверждена впервые проведенным комплексным кластерным анализом по совокупности аллозимных и RAPD -маркеров. Генетическое расстояние между видами составило D = 0.82, что фактически соответствует уровню межвидовой дифференциации у диплоидных видов эукариот.

6. Впервые продемонстрирован новый тип рекомбинации генотипов вешенки P. pulmonarius в природе - ди-мон гибридизация.

7. Впервые обнаружен высокий процент ауксотрофных штаммов в популяциях P. oryzae.

8. Применяемые в популяционных исследованиях молекулярно-генетические маркеры (изозимы и ДНК-полиморфизмы) были впервые использованы для видовой идентификации, установления родословных и молекулярной паспортизации культивируемых штаммов съедобных грибов Agaricus bisporus и Pleurotus ostreatus.

9. Анализ полиморфизма ДНК микромицетов из родов Aspergillus и Pénicillium на ОК «Мир» выявил их резидентное заселение (продолжительные сроки существования) в условиях длительного пилотируемого полета.

10. Молекулярно-генетический анализ семейства лакказных генов у культивируемого гриба Agaricus bisporus выявил наличие дифференцированной экспрессии двух тандемно расположенных генов в зависимости от жизненной фазы гриба. Уровень секреции продукта гена 1сс2 в 300 раз превышал таковой для Iccl в жидкой культуральной среде и в 7000 раз был выше в компосте.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Дарага А.В. Изменчивость гриба Pyricularia oryzae Cav. - возбудителя пирикуляриоза риса - под действием химических мутагенов // В сб.: Материалы YI Закавказской конференции по споровым растениям. Тез. докл. Тбилиси, Грузия. 1983. С. 64-65.

2. Дарага А.В. Специализация возбудителя пирикуляриоза риса на злаках Н Труды 14 конф. мол. уч. Моск. ун-та. Рук. деп. в ВИНИТИ, 4.1,1984. С.13-16.

3. Дарага А.В. Сравнительный анализ агрессивности субклонов двух изолятов возбудителя пирикуляриоза риса // Труды 15 конф. мол. уч. Моск. ун-та. Рук. деп. в ВИНИТИ, 1984. С. 134-136.

4. Дарага А.В., Терехова В.А., Дьяков Ю.Т. Генетическая нестабильность фитопатогенного гриба Pyricularia oryzae Cav. //Матер. Всес. совещ. по мицел. грибам, Пущино, 1984.

5. Дарага А.В. Ауксотрофные мутанты гриба Pyricularia oryzae Cav., изолированные из двух климатических зон культивирования риса // Труды 16 конф. мол. уч. Моск. ун-та. Рук. деп. в ВИНИТИ, 1985. С. 157-162.

6. Дарага А.В., Терехова В.А., Дьяков Ю.Т., Джавахия В.Г. Изменчивость фитопатогенного гриба Pyricularia oryzae Cav. IY. Сравнительное изучение нестабильности моноконидиальных изолятов //Биол. науки, 1985. № 5. С. 84-89.

7. Дьяков Ю.Т., Дарага А.В., Можина И.А., Пантелеймонова Т.И., Супрун Л.М., Терехова В.А. Популяционная экология грибов // В сб.: Грибы в биогеоценозах. Тез. докл. Ш Всес. конф., Ташкент. 1985. С. 48-49.

8. Дарага А.В. Анализ изменчивости белковых спектров в популяциях Pyricularia oryzae Cav.// Ш Всес. сов. по иммунитету с/х растений, Рига, ВИЗР. 1986.

9. Дарага А.В. Популяционное изучение возбудителя пирикуляриоза риса - гриба Pyricularia oryzae Cav. //Автореф.дис. ...канд. биол. наук. М.: МГУ, 1986. 24 С.

10. Дарага А.В., Терехова В.А. Сравнение изоферментных спектров неспецифических эстераз у изолятов Pyricularia oryzae Cav. из двух климатических зон возделывания риса II В сб.: Экологическая генетика растений и животных. Тез. докл. Ш Всес. конф., Кишинев, Штиинца, 1987. С.115.

11. Дарага А.В., Галимова JI.M. Молекулярная организация ДНК грибов (обзор) // Микол. и фитопатол., 1987. Т. 21, вып.2. С. 178-186.

12. Дарага А.В., Галимова JI.M. Исследование фракции быстро реассоциирующей ДНК у несовершенного гриба Pyricularia oryzae Cav. // Биол. науки, 1987, № 2. С. 17-20.

13. Дарага А.В., Горскова В.А., Кулаев И.С., Муромцев Г.С. Влияние микоризации на накопление фосфора в тканях корней кукурузы и его дальнейшее распределение по растению // Бюл. Всес. НИИ с/х микробиологии. Ленинград, 1987, вып. 47. С. 5-8.

14. Дарага А.В., Галимова Л.М., Терехова В.А., Дьяков Ю.Т.. Исследование биохимического полиморфизма природных изолятов Pyricularia oryzae Cav. // Микол. и фитопатол., 1988. Т.22, вып.4. С. 329-334.

15. Дарага А.В., Кулаев И.С. Образование внеклеточных ксиланаз эндомикоризными грибами // В сб.: Биосинтез ферментов микроорганизмами. Тез. докл. IY Всес. конф., Ташкент, 1988. С. 54.

16. Дарага А.В., Кулаев И.С. Динамика поглощения фосфорных удобрений корнями кукурузы, микоризованными грибами рода Glomus // В сб.: Матер. Всес. конф. по михоризе, Грузия, 1988. С. 35-38.

17. Дарага А.В., Дьяков Ю.Т. Внутриклональная изменчивость природных штаммов фитопатогенного гриба Pyricularia oryzae Cav. // В сб.: Молек. и генет. механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями. Пущино, 1989. С. 138-143.

18. Shnyreva A.V., Kulaev I.S. Extracellular xylanases of endomycorrhizal fungi (Glomus spp.) as possible participants of fungal penetration into the host roots // Intern. Conf. on Mechanisms of the Relationship Between Soil-Plant Microorganism in the Rhizosphere. 28-29 Sept. 1989, Montpellier, France. 1989. P. 164-165.

19. Шнырева-Дарага A.B. Взаимоотношения партнеров в симбиозе везикулярно-арбускулярного типа (обзор) // Микол. и фитопатол., 1990. Т. 24, вып. 6. С. 583-590.

20. Шнырева А.В., Кулаев И.С. Внеклеточные ксиланазы эндомикоризных грибов рода Glomus spp. // Вестн. Моск. ун-та, сер. 16, биология, 1990. № 2. С. 48-51.

21. Дьяков Ю.Т., Шнырева А.В. Анализ полиморфизма белков и нуклеиновых кислот в таксономических и популяционных исследованиях грибов // В сб.: Хемотаксон. изуч. криптогамных растений и грибов. Достижения и перспективы развития, 1990. С. 19-22.

22. Дарага А.В. Сравнительное изучение популяций гриба Pyricularia oryzae Cav из двух климатических зон возделывания риса // Матер. IX Респ. науч. конф. мол. уч. «Молодежь и науч.-техн. прогресс», 12-14 октября 1990, Ашхабад. 1990. С. 233-234.

23. Shnyreva A.V. Comparison of Pyricularia oryzae populations from different climatic rice cultivation regions // 4th Intern. Mycological Congress, 28 Aug -3 Sept. 1990, Regensgburg, Germany. 1990. P. 367.

24. Дарага A.B., Терехова B.A., Дьяков Ю.Т. Сравнительное изучение приморских и краснодарских популяций возбудителя пирюсуляриоза риса, гриба Pyricularia oryzae Cav..

I. Культурально-морфологические признаки // Биол. науки, 1991. № 4. С. 54-63.

25. Терехова В.А., Дарага А.В., Дьяков Ю.Т. Сравнительное изучение приморских и краснодарских популяций возбудителя пирикуляриоза риса, гриба Pyricularia oryzae Cav.

II. Белковый полиморфизм // Биол. науки, 1991. № 6. С. 74-82.

26. Shnyreva A.V., Kulaev I.S. Effect of vesicular-arbuscular mycorrhizae on phosphorus metabolism in agricultural plants // Microbiol. Research, 1994, Vol. 149. № 1. P. 139-143.

27 Shnyreva A.V. Sequence comparison of selected regions in Phytophthora mitochondrial genomes // 2nd Europ. Conference on Fungal Genetics, 28 Apr.-l May 1994, Lunteren, Netherlands. 1994. P. 21.

28. Шнырева А.В. Митохондриальные интроны грибов и их роль в эволюции (обзор) // Генетика, 1995. Т. 31. № 7. С. 869-876.

29. Shnyreva A.V., Lomov A.A., Dyakov Y.T. Restriction fragment length polymorphisms in Pleurotus cultivars // III Conference on Genetics and Cellular Biology of Basidiomycetes, 16-19 June, 1995, London, UK. 1995. P. 53.

30. Шнырева A.B. Сравнительное изучение приморских и краснодарских популяций Pyricularia oryzae Cav. - возбудителя пирикуляриоза риса. Ш. Физиолого-биохимические признаки И Микол. и фитопатол., 19%. Т. 30, вып. 4. С. 96-103.

31. Дружинина И.С., Шнырева А.В., Дьяков Ю.Т. Использование гомокариотических пеялетов в популяционном и генетическом анализе вешенки устричной // В сб.: Наука и практика грибоводства. Матер. III Междунар. Конгресса, Кашира. 1996. С. 34-39.

32. Шнырева А.В., Ломов А.А., Медников Б.М., Дьяков Ю.Т. Дифференциация видов и сортов вешенки (Pleurotus spp) с помощью скрещиваний и молекулярных маркеров И Микол. и фитопатол., 1996. Т.30, вып.5-6. С.37-44.

33. Druzhinina I., Shnyreva A., Insarova I., Dyakov Y.T. Using monospore pellets in genetic and population analysis of Pleurotus ostreatus // 3rd Europ. Conference on Fungal Genetics, 27-30 March 1996, Munster, Germany, 1996. P.254.

34. Smith M., Shnyreva A., Wood D.A., Thurston C.F. Organization and expression of two laccase genes in the cultivated mushroom Agaricus bisporus И 3rd Europ. Conference on Fungal Genetics, 27-30 March 1996, Munster, Germany, 1996. P. 232.

35. Багирова С.Ф., Шнырева A.B., Дьяков Ю.Т. Половая гибридизация Phytophthora infestans I/ Микробиология, 1997. Т. 66, № 2. С. 237-241.

36. Дружинина И.С., Инсарова И.Д., Шнырева А.В., Дьяков Ю.Т., Политов Д.В., Алтухов Ю.П. Гомокариотические пеллеты грибов и их использование в генетическом анализе // Генетика, 1997. Т.ЗЗ, № 5. С. 644-650.

37. Дружинина И.С., Шнырева А.В., Дьяков Ю.Т. Структура комплекса Pleurotus ostreatus sensu lata на территории Московской области // В сб.: Наука и практика грибоводства. Межрег. ассоц. грибоводов, Москва, 1997. С. 53-56.

38. Shnyreva A.V. Properties of laccase for use in bioremediation and biopulping // EERO Newsletter, 1997. № 5. P. 4-5.

39. Шнырева A.B., Дружинина И.С.., Дьяков Ю.Т. Генетическая структура комплекса Pleurotus ostreatus sensu lato на территории Московской области // Генетика, 1998. Т. 34, №12. С. 1610-1618.

40. Викторов А.Н., Новикова Н.Д., Дешевая Е.А., Брагина М.П., Шнырева А.В., Сизова Т.П., Дьяков Ю.Т. Резидентное заселение среды ОК «Мир» Pemcillium chrysogenum и проблема экологической безопасности в длительном космическом полете // Авиацион. и экологич. медицина, 1998. № 5. С. 57-62.

41. Shnyreva А. V., Druzhinina I.S., Dyakov Y.T. Genetic analysis of Pleurotus pulmonarius by using pelletizing protocol II IV Conference on Genetics and Cellular Biology of Basidiomycetes, 27-30 March 1998, Nijmegen, the Netherlands. 1998. P. 41.

42. Smith M., Shnyreva A.V., Wood D. A., Thurston C.F. Tandem organisation and highly disparate expression of the two laccase genes Iccl and lcc2 in the cultivated mushroom Agaricus bisporus И Microbiology, 1998. Vol. 144, № 9. P. 1063-1069.

43. Шнырева A.B. Общее и специфическое в подходах к анализу популяций панмиксных и агамных видов грибов // В сб.: Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии. Труды междунар. конф., посвящ. 80-яет. каф. микологии и альгологии МГУ и 90-лет. со дня рожд. М.В. Горленко, апрель 1998 г., Москва 1998. С. 302-304.

44. Шнырева А.В. Микромицеты орбитального комплекса «Мир»: резидентные или транзитные (по данным ПЦР-анализа) // В сб.: Соврем, проблемы микологии, альгологии и фитопатологии. Труды междунар. конф., посвящ. 80-лет. каф. микологии и альгологии МГУ и 90-лет. со дня рожд. М.В. Горленко, апрель 1998 г., Москва. 1998. С. 305-306.

45. Shnyreva A.V., Druzhinina I.S., Dyakov Y. Т. Homokaryotic mycelial pellets of Pleurotus ostreatus: application to genetic analysis // VI Intern. Mycological Congress. 23-28 Aug., 1998, Jerusalem, Israel. 1998. P.355.

46. Shnyreva A.V. Genetic composition of Pleurotus ostreatus populations in the Moscow region // The 4th Europ. Conference on Fungal Genetics. 4-7 April 1998, Leon, Spain. 1998. P. 62.

47. Shnyreva A.V. The taxonomic identity of some commercial oyster mushrooms cultivated in Central Russia // XIII Conference of Europ. Mycologists. 21-25 Sept. 1999, Madrid, Spain. 1999. P. 36.

48. Shnyreva A.V. Micromycetes at the space station "MIR": resident or transient // IX Intern. Congress on Bacteriology& Appl. Microbiology and Mycology. IUMS. 16-20 Aug. 1999, Sydney, Australia. 1999. MP 4.01.

49. Garibova L.V., Shnyreva A.V., Lekomtzeva S.N., Insarova I.D., Chaika M.N. Species and interspecies structure of Pleurotus as a basis for breeding selection // XV Intern. Congress on Science and Cultivation of Edible Fungi. 15-19 May 2000, Maastricht, Netherlands. 2000. P. 97.

50. Шнырева A.B., Штаер O.B. Дьяков Ю.Т. Редкий механизм генетических обменов в природных популяциях вешенки (Pleurotus ostreatus) // В сб.: Популяция, сообщество, эволюция. Тез. докл., Казань: Новое издание. 2001. С. 124-125.

51. Шнырева А.В., Штаер О.В., Дьяков Ю.Т. Внутривидовая структура культивируемого базидиального гриба Pleurotus ostreatus II В сб.: Проблемы изучения и охраны биоразнообразия и природных ландшафтов Европы. Материалы конф. по биоразнообразию, 27-30 мая 2001, Пенза. 2001. С. 155-157.

52. Шнырева А.В., Сизова Т.П., Братина М.П., Викторов А.Н., Дьяков Ю.Т. Микромицеты орбьитального комплекса «Мир»: резидентные или транзитные? // Микол. и фитопатол., 2001. Т. 35, вып. З.С. 37-42.

53. Штаер О.В., Шнырева А.В. Молекулярно-генетический анализ популяций Pleurotus ostreatus на территории Звенигородской биостанции МГУ И Роль биостанций в сохранении биоразнообразия России. Материалы конф., посвящ. 250-летию МГУ им. М.В. Ломоносова и 90-летию ЗБС им. С.Н. Скадовского. Москва, 2001. С.189-191.

54. Шнырева А.В., Штаер О.В. Типы половой рекомбинации в природных популяциях вешенки устричной, Pleurotus ostreatus И В сб.: Современная микология в России. Тез. докл. I съезда микологов России. М.: Национ. акад. микол.. 2002. С. 168-169.

55. Шнырева А.В. Транспозоны в геномах грибов // В сб.: Современная микология в России. Тез. докл. I съезда микологов России. М.: Национ. акад. микол.. 2002. С.169.

56. Шнырева А.В. О критериях отбора дикорастущих изолятов вешенки для культивирования // Микол. и фитопатол., 2002. Т. 36, вып. 4. С. 55-62.

57. Шнырева А.В., Мартыненко Л.И., Романов С.И. Комплексный подход к анализу коммерческих штаммов вешенки и шампиньона из коллекуции ЗАО "Заречье" им. С.А. Кушнарева // Гавриш, 2002. № 2. С. 30-34.

58. Козловский А.Г., Желифаяова В.П., Аданин В.М., Шнырева А.В., Викторов А.Н. Биосинтез низкомолекулярных азотсодержащих вторичных метаболитов-алкалоидов резидентными штаммами Penicillium chrysogenum и Р expansum, изолированными на орбитальной станции "Мир" И Микробиология, 2002. Т.71, № 6. С. 666-672.

59. Шнырева А.В. Транспозоны как факторы различных перестроек и модификаций в геномах грибов (обзор) II Генетика, 2003. Т. 39, № 5. С. 621-636.

60. Шнырева А.В., Белоконь Ю.С., Белоконь М.М. Использование молекулярных маркеров для дифференциации культивируемых штаммов вешенки и шампиньона // Генетика, 2003. Т. 39, № 11. С. 1461-1469.

61. Shnyreva А. V. Rare mechanism of genetic recombination in Pleurotus ostreatus natural populations // 7th International Mycological Congress. 11-17 Aug. 2002, Oslo. 2002. P. 312.

62. A.V. Shnyreva, Bondarev A.E. Isozyme variation within a local population of the oyster mushroom, Pleurotus ostreatus in Moscow region // IUMS Congress. Xth International Congress of Mycology. 27 July-1 Aug. 2002, Paris, France. 2002. P. M-150.

63. Shnyreva A.V. Genetic polymorphism in Pleurotus ostreatus natural populations as determined by isozyme analysis // XIV Congress of European Mycologists. 22-27 Sept. 2003, Katsiveli, Ukraine. 2003. P. 89-90.

64. Шнырева А.В. Репродуктивные барьеры в природных популяциях базидиального гриба Pleurotus ostreatus II В сб.: Актуальные проблемы генетики. Матер. 2-й конф. Моск. общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова, 20-21 февраля 2003, Москва. 2003. Т. 2. С. 99-100.

65. Шнырева А.В Род Pleurotus // В кн.: Новое в систематике и номенклатуре грибов. М.: Нац. академия микологии - Медицина для всех. 2003. С. 418-441.

66. Shnyreva A.V. Differentiation of the oyster mushroom, Pleurotus ostreatus strains cultivated in Central Russia with molecular markers and by mating // 2nd Intern. Conference on Medicinal Mushrooms. InCOMM 17-20 My 2003, Pattaya, Thailand. 2003. P. 123.

67. Штаер O.B., Шнырева А.В. Сравнительный анализ природных штаммов вида Pleurotus ostreatus, проведенный с использованием молекулярно-генетических признаков // В сб.: Микология и альгология -2004. Тез. докл. конф., посвящ. 85-летию кафедры микологии и альгологии МГУ им. М.В. Ломоносова. 2004. С. 154-155.

68. Шнырева А.В. Популяционная биология грибов с гапло-диплоидным жизненным циклом (на примере базидиального гриба Pleurotus ostreatus) // Материалы Ш конгресса генетиков и селекционеров России, Москва. 2004.

69. Шнырева А.В. Иммуномодулирующие свойства полисахаридов высших базидиапьных грибов // Тез. докл. П съезда медицинских микологов России, Москва. 2004.

70. Shnyreva A.V. Mating behaviour and clonality in Pleurotus ostreatus natural population // 7ft Europ. Conference on Fungal Genetics. 17-20 April 2004, Copenhagen. 2004. P. 72.

71. Шнырева A.B., Белоконь Ю.С., Белоконь M.M. Вариабельность изоферментных спектров природных штаммов Pleurotus ostreatus, собранных на территории Московской области // Микология и фитопатология, 2004. Т. 38, вып. 2. С. 59-67.

72. Шнырева А.В., Белоконь Ю.С., Белоконь М.М., Алтухов Ю.П. Внутривидовое генное разнообразие вешенки устричной, Pleurotus ostreatus, изученное по совокупности аллозимных генов // Генетика, 2004. Т. 40, № 8. С. 1068-1080.

73. Штаер О.В., Белоконь Ю.С., Белоконь М.М., Шнырева А.В. Сравнение двух популяций вешенки устричной Pleurotus ostreatus П Микробиология, 2004. Т. 73, в печати.

74. Дьяков Ю.Т., Шпырева А.В., Сергеев А.Ю. Введение в генетику грибов // М.: Изд-во «Академия». 2004,25 п.л.

75. Shnyreva A.V. Differentiation Pleurotus ostreatus and Agaricus bisporus strains cultivated in Central Russia with molecular markers // 5th Int. Conf. on Mushroom Biology and Mushroom Products. 8-12 April 2005, Shanghai, China. 2005.

76. Шнырева А.В. Методы геносистематики в решении практических задач микологии // Тез. докл. Ш съезда медицинских микологов России, 24-25 марта 2005, Москва. 2005.

77. Шнырева А.В., Штаер О.В. Дифференциация двух близкородственных видов Pleurotus pulmonarius и Р ostreatus с помощью скрещиваний и молекулярных маркеров // Микол. и фитопатол., 2005, в печати.

Подписано в печать 08.12.2004 Объем 2.0 усл.п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 214 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 пМосква, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

РНБ Русский фонд

2005-4 45813

-"„.582