Биологические особенности некоторых базидиальных макромицетов (морфология, экология и физиологическая активность)

Бадалян, Сусанна Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биологические особенности некоторых базидиальных макромицетов (морфология, экология и физиологическая активность)
ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Биологические особенности некоторых базидиальных макромицетов (морфология, экология и физиологическая активность)"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ ИНСТИТУТ БОТАНИКИ

1 ............На правах рукописи

БАДАЛЯН СУСАННА МИХАЙЛОВНА

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НЕКОТОРЫХ БАЗИДИАЛЬНЫХ МАКРОМИЦЕТОВ (МОРФОЛОГИЯ, ЭКОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ)

Г. 00.05 - Ботаника

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ЕРЕВАН 1998

Работа выполнена на кафедре ботаники Ереванского государственного университета. Тема утверждена на ученом совете биологического факультета

ЕГУ

Научный консультант профессор Ж. Ж. Серрано

(Университет Монпелье-1, Франция)

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Доктор биологических наук Доктор биологических наук, профессор

Л. М. Краснопольская С. А. Симонян А. М. Барсегян

Ведущая организация:

Московский государственный университет им, М. В. Ломоносова

Защита состоится 18 декабря 1998г. в 14 часов на заседании специализированного совета 035 при Институте Ботаники HAH Республики Армения.

Адрес: 375063, Ереван-63, Институт ботаники HAH Армении. С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института ботаники.

Автореферат разослан 5 ноября 1998г.

Ученый секретарь

специализированного ЛС*7 ' ¡г

совета, канд. биол. наук ^r^O (XjJiM> Барсегян А. X.

СПИСОК СОКРАЩЕННЫХ СЛОВ

АБА - антибактериальная активность

АФА - антифунгальная активность

БА - биотическая активность

БАС - биологически активные соединения

БМ - базидиальные макромицеты

ВН - вегетативная несовместимость

ВРФ - водорастворимая фракция

ВЭ - водный экстракт

ГАР - голоартрические

ГБК - 4-гидроксибензойная кислота

ГГА - гипогликемическая активность

ГКА - гемакоагулирующая активность

ГЛА - гемолитическая активность

ДА - демаркационная линия

ИА - индекс антагонизма

ЗРГ - зона редких гиф

КГА - картофельно-глюкозный агар

КЖ - культуральная жидкость

КМЦ - карбоксиметилцеллюлоза

КР - кислотная резистентность

MA - мальц-агар

МСА - молокосвертывающая активность

МРФ - метанол-растворимая фракция

МЭ - метанольный экстракт

ОК - оксалат кальция

ОР - осмотическая резистентность

ПТ - плодовое тело

РК - ростовый коэфицент

СА - сусло-агар

СЛО - сухой липидный остаток

ТЭГ - тромбоэластограмма

ФЛА - фибриноЛитическая активность

ЭАР - энтероартрические

ЭМ - экстракт мицелия

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Поиск новых природных источников физиологически активных и химически ценных соединений среди биологических организмов является актуальной задачей биотехнологической науки.

Успехи экспериментальной микологии - самостоятельной ветви современной биотехнологии, и применение новейших методов тонкого химического анализа в исследованиях физиолого-биохимических особенностей грибных организмов отнесли их в ряд перспективных биотехнологических объектов. Среди них особое место занимают базидиальные макромицеты (БМ), которые являются продуцентами не только пищевого и кормового белка, но и биологически активных соединений (БАС) с широким спектром действия: антибиотическим, антиопухолевым, иммуномодулирующим, тромболитическим,

гипогликемическим и др.

Первые сведения о терапевтической значимости и возможностей практического использования БАС высших грибов встречаются еще в работах Гиппократа и древних китайских рукописях. Однако систематические и научно обоснованные исследования в этой области начались сравнительно недавно. Сегодня во многих лабораториях мира занимаются исследованием высших лекарственных грибов, в частности БМ, в качестве ценного природного источника БАС.

В Армении комплексные исследования в этом направлении нами проводятся впервые. Накопленные к настоящему времени литературные сведения, а также результаты собственных исследований позволяют по достоинству оценить эти организмы, как источник БАС и открывают широкие перспективы их практического применения в фармакологии, медицине и других областях человеческой деятельности.

Активные метаболиты БМ в основном относятся к полисахаридам, терпеноидам, полипептидам, индольным и фенольным соединениям. В определенных дозах их можно использовать при лечении многих болезней. Грибные полисахариды с помощью активации макрофагов способны усиливать иммунный ответ организма на антигены цитотоксического действия. В больших дозах некоторые тритерпены проявляют нейротоксическое действие. Установлена также гиполипидная, гипогликемическая, антиопухолевая, тромболитическая, фибринолитическая и антибиотическая (антибактериальная, антифунгальная, антивирусная) активность метаболитов высших грибов. Наряду с физиолого-биохимическими исследованиями установление острой токсичности и фармакологической активности БМ представляет также практический интерес для клинической токсикологии в диагностировании грибных отравлений.

Следует отметить, что БМ - продуценты БАС, относятся к различным экологическим группам, а именно ксилотрофам, копротрофам, гумусовым и подстилочным сапротрофам, микоризообразователям. Среди них есть съедобные, несъедобные и ядовитые виды.

Выявление характера межвидовых взаимоотношений и установление биотической активности (БА) мицелия является первоначальным этапом в

процессе скрининга этих организмов по физиологической активности. Исследование внутривидовых взаимоотношений, познание механизмов вегетативной и генетической несовместимости, выявление интерстерильных групп и экотипов внутри таксономического вида имеет большое значение в понимании специфической структуры популяций и сложного эволюционного процесса видообразования у грибов. Разрешение этих проблем является актуальной задачей современной микоценологии и экологии.

Изучение морфологических и био-экологических особенностей БМ в культуре способствует разностороннему познанию жизнедеятельности этих организмов. Эти результаты имеют большое значение в налаживании процесса получения мицелиальной биомассы в производственных масштабах, что является важным этапом биотехнологического внедрения грибного объекта.

Из вышеизложенного становится очевидной актуальность выбранной темы -комплексное и всесторонее изучение морфолого-культуральных, экологических, физиолого-биохимических и фармакологических особенностей некоторых БМ и оценка возможностей их практического внедрения в биотехнологию. Результаты подобных исследований являются актуальными и в хемотаксономических разработках грибов. Комплексный подход в микологических исследованиях будет способствовать выявлению эволюционных путей развития внутри сложной и полиморфной группы грибных организмов и построению новых совершенных филогенетических систем.

Цель и задачи. Целью настоящей работы являлось: уточнение систематической принадлежности, всесторонние исследования биоморфологических и экологических особенностей, биохимии, физиологической и фармакологической активности плодовых теЛ (ПТ) и мицелия 47 видов БМ, относящихся к различным эколого-трофическим группам, в частности ксилотрофам для выявления и оценки возможностей их практического применения в качестве источника биологически активных и химически ценных соединений.

При этом были поставлены следующие задачи:

•уточнить таксономическую принадлежность грибов, потенциально представляющих интерес для наших исследований, установить их систематическое положение в современном понимании;

•выделить чистые культуры, исследовать макро- и микроморфологические особенности мицелия и структурных элементов ПТ с помощью световой и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Выявить новые и дополнить ранее известные признаки телеоморфы и анаморфы, имеющих таксономическое значение на различных систематических уровнях, включая их в диагнозы некоторых исследованных видов;

•установить возможности комплексного применения био-экологических, хемотаксономических и генетических критериев в филогенетическом анализе БМ на примере видов рода №таМота;

•исследовать характер межвидовых взаимоотношений и определить БА видов. Выявить степень и морфологические типы проявления вегетативной

несовместимости (ВН) при внутривидовых скрещиваниях различных групп изолятов, оценить таксономическую значимость этого явления у ксилотрофов;

•выявить биохимический состав ПТ и мицелия некоторых БМ и прогнозировать дальнейшие пути исследования физиологической и фармакологической активности БМ. По возможности оценить хемотаксономическую значимость выявленных групп соединений. Провести анализ липидной фракции, полученной из экстракта ПТ N. fasciculare, с выделением и идентификацией отдельных соединений;

•исследовать антибактериальную и антифунгальную активность в условиях in vitro, а также гемолитическую, гемакоагулирующую, гипогликемическую активность - in vitro и vivo, при в/б, в/в и пероральном введении экстрактов ПТ и мицелия некоторых БМ;

•установить наличие внеклеточных ферментов, выделяемых мицелием N. fasciculare и F. velutipes, а также протеолитическую (молокосвертывающая и фибринолитическая) активность экстрактов ПТ, мицелия и культуральной жидкости (КЖ) у некоторых БМ;

•с помощью специальных тестов исследовать фармакологическую активность и определить острую токсичность (LEbo), а также спазмолитическое, нейротоксическое и аналгетическое действие при в/б и пероральном введении экстрактов некоторых видов БМ и выделенных из них фракций в условиях хронического эксперимента in vivo;

•на основании полученных результатов и имеющихся в литературе данных выделить наиболее перспективную для дальнейших исследований экологическую группу или виды БМ для их дальнейшого внедрения в биотехнологию в качестве природного источника БАС.

Научная новизна результатов. Комплексные и многоаспектные исследования био-морфологических и экологических особенностей, биохимии, физиологической и фармакологической активности ПТ и мицелия некоторых БМ - потенциальных источников БАС в Армении проводятся впервые.

С помощью СЭМ исследовались макро- и микроморфологические характеристики мицелия и ПТ 7 видов, что позволило описать целый ряд новых признаков телеоморфы и анаморфы (диапазон изменчивости морфологии, характера и скорости роста мицелия, морфологические особенности микроструктур мицелия и ПТ, наличие и типы анаморфы, а также строение апикулюса, особенности морфогенеза и типы отбрасывания спор и др.), имеющих таксономическое значение на различных систематических уровнях. Оценена также их эволюционно-филогенетическая значимость. Приводятся диагнозы 27 видов БМ дополненные этими признаками.

Определено количество ядерного ДНК в дикариотических и монокариотических клетках мицелия и ПТ пяти видов рода Nematoloma. На основании полученных данных исследованные виды по уровню плоидии разделились на две группы: моноплоидные - n (N. fasciculare, N. capnoides, N. polytriclu1 и триплоидные - 3n [N. sublateritium, N. radicosum). Комплексное применение генетических, био-экологических и хемотаксономических критериев в филогенетическом анализе исследованных видов и учитывая, что низкий уровень плоидии является филогенетически старым признаком,

выдвинута гипотетическая схема распределения видов в составе рода по степени их эволюционной близости и филогенетической молодости: N. radicosum—tN. subíaterítium~>N. polytrichi->N. capr¡oides->N. fasciculare.

Установлен антагонистический характер межвидовых взаимоотношений у исследованных БМ. Антагонизм с большой силой проявлялся при совместном росте ксилотрофных видов. При межвидовом антагонизме показатель БА, указывающий на степень конкурентоспособности вида в определенном пределе вариабельности является видоспецифическим признаком. Исследованные виды из различных эколого-географических регионов сохраняли свою пренадлежность к условно разделенной по этому показателю группе грибов: очень активные, активные и мало активные. Небольшой разрыв в показателях БА при взаимоотношениях видов одного рода указывает на их возможную филогенетическую близость. Выявление БА видов наряду с другими параметрами рассматривается нами как первичный этап в скрининге БМ по физиологической активности.

Внутривидовое скрещивание различных групп изолятов 6 ксилотрофных видов установило, что фенотипически ВН проявляется разными, но стабильными на уровне вида морфологическими типами реакциий: зоной редких гиф (ЗРГ) и мицелиальным валиком. Первый тип является выражением более слабой или частичной ВН и встречается при скрещивании скорее родственных или близкородственных изолятов одной популяции, нежели второй, который указывает на сильную несовместимость генетически различных индивидуумов. Последний проявляется при скрещивании изолятов из различных географических регионов или популяций, а также между интерстерильными группами и различными экотипами одного вида. Наличие на агаре или мицелии пигментированной демаркационной линии (ДА) с каплями экссудата на месте контакта колоний рассматривается нами как выражение более сильной несовместимости между изолятами одного вида.

Проведен сравнительный качественно-биохимический анализ метанольных и водных экстрактов ПТ и мицелия, а также полученных из них водо- и метанолрастворимых фракций (ВРФ, МРФ) исследованных БМ. Отмечено наличие свободных Сахаров и аминокислот, полиолов, терпеноидов (стероидные соединения, гликозиды, сапонины и др.), алкалоидов и других грибных токсинов, фенольных (фенольные кислоты, полифенолы), индольных и нингидрин-положительных соединений и отсутствие танинов. Сделана попытка оценки хемотаксономической значимости некоторых выявленных групп соединений.

Предварительные результаты исследований гипогликемической активности (ГГА) у БМ на примере N. fasciculare показали, что водный экстракт (ВЭ) этого вида в условиях in vivo при в/б и пероральном введении в дозе 50мг/кг не способствует снижению уровня сахара в крови, проявляя при этом нейротоксический эффект. Однако была установлена антибактериальная, антифунгальная, гемолитическая, гемакоагулирующая и протеолитическая (фибринолитическая и молокосвертывакмцая) активность экстрактов ПТ, мицелия и КЖ этого вида в условиях in vitro и in vivo при в/в, в/б и пероральном введении.

Впервые был описан папавериноподобный спазмолитический эффект у подопытных животных вызванный различными дозами метанольных экстрактов (МЭ) из ПТ видов Agrocybe praecox, F. velutipes, N. fasciculare, Armillaria mellea, P. ostreatus, в частности Paxillus involutus. Результаты опытов показали, что в испытуемых дозах экстракты из ПТ Tricholoma tigrinum, P. involutus, и F. velutipes не обладали стойким аналитическим эффектом. Наоборот, их пероральное введение увеличивало сокращение дорзо-абдоминальных мышц, вызывая алгогенный эффект у подопытных животных. В определенных дозах они обладали и нейротоксическим действием. При этом фармакологический эффект ВРФ экстрактов был сильнее, чем эффект МРФ.

Выявлена антибактериальная и антифунгальная активность (АБА, АФА) исследованных видов БМ в отношении Г+ и Г" патогенных бактерий, микромицетов и дрожжей в условиях in vitro. АБА сильнее проявилась в отношении Г+ кокков (Staphylococcus aureus и др.) и спорулирующего вида Bacillus subtilis.

Высокой АФА обладали P. osrteatus, N. fasciculare, L. edodes, L. tigrinus и другие ксилотрофы. Представители копротрофов, гумусовых и подстилочных сапротрофов во всех вариантах совместного роста с тест-микромицетами в различной степени также проявили АФА. Активностью в отношении штаммов Candida albicans обладали МРФ и ВРФ из экстрактов ПТ трех ядовитых видов: N. fasciculare, Т. tigrinum и Р. involutus.

Впервые проведенный по специальным тестам скрининг растущего мицелия N. fasciculare и F. velutipes установил их способность в различном количестве выделять 16 внеклеточных ферментов. Выраженная молокосвертываящая активность (МСА) была установлена для экстрактов ПТ и КЖ, по сравнению с экстрактами мицелия (ЭМ) у 16 видов БМ. Эти данные свидетельствуют, что изученные грибы можно рассматривать не только в качестве природного источника БАС, но и экономически и биологически важных ферментов.

С помощью 12 тестов впервые определена фармакологическая активность и острая токсичность МРФ и ВРФ из экстрактов ПТ 7 видов БМ при их в/б и пероральном введении белым мышам. Окончательно уточнена степень токсичности и типы отравления этими видами, в частности N. fasciculare, который был отнесен к группе смертельно ядовитых грибов. Он в зависимости от дозы экстракта вызывал гастроэнтеральные, гемолитические и нейротоксические синдромы отравления с различными латентными периодами. Установлены LDW = 243.29мг/кг и LD100 = 250мг/кг для этого вида.

Отклонения от нормы некоторых фармакологических тестов (двигательная активность, групповое поведение, эрекция шерсти и др.) под влиянием экстракта ПТ N. capnoides в дозе 2000мг/кг позволили более осторожно интерпретировать съедобность этого вида и отнести его к группе несъедобных грибов.

Проведенные комплексные исследования позволяют рассматривать БМ как перспективные объекты для биотехнологии, а также в качестве ценного сырья для использования в нетрадиционной медицине и народном хозяйстве. По результатам опытов среди исследованных эколого-трофических групп грибов выделена физиологически наиболее активная группа ксилотрофов,

включающая виды Р1еиго1из ОБ^еаШэ, ЬвпИпи1а ес1оёв5, ЬепИпиз Идгтт, ИетаШота £аваси1аге, Р1аттиНпа увЫПреэ и др. Учитывая также выявленные особенности и характер их мицелиалыюго роста, ксилотрофы были отнесены к группе перспективных и удобных для внедрения в биотехнологоческую промышленность видов в качестве источника БАС. Однако, приоритетность такого выбора не исключает поиск активных соединений и у представителей других эколого-трофических групп.

Практическая значимость работы. Результаты диссертационной работы являются теоретическим и практическим вкладом в области экспериментальной микологии и микоценологии. Они открывают новые перспективы для дальнейших совместных исследований микологов, биохимиков и фармакологов в области изучения БМ в качестве источника биологически активных и химически ценных соединений. Результаты подобных исследований могут найти применение в биотехнологической и фармакологической промышленности, а также других областях человеческой деятельности.

Дополненные выявленными морфологическими, экологическими, биохимическими, физиологическими и генетическими характеристиками мицелия и ПТ диагнозы некоторых видов могут быть использованы при составлении современных определителей базидиальных грибов.

Способность исследованных грибов синтезировать лигно-целлюлолитические ферменты может найти практическое применение в биотехнологической промышленности и биоконверсии вторичного растительного сырья.

Установленная АБА и АФА, а также способность продуцировать протеолитические ферменты исследованными БМ позволяют включить их в список видов, перспективных для получения новых биопрепаратов с антибактериальным, антифунгальным, тромболитическим и

фибринолитическим действием.

Результаты опытов по выявлению острой токсичности, гемолитической, гемакоагулирующей, нейротоксической, алгогенной и спазмолитической активности некоторых БМ могут быть использованы в клинической токсикологии при диагностировании грибных отравлений.

Материалы диссертации использовались при составлении курсов лекций и практических занятий по микологии в Ереванском и Московском государственном университетах, а также Пермском педагогическом Университете.

На кафедре ботаники ЕГУ создана коллекция чистых культур БМ, насчитывающая 44 вида и 122 штамма, относящихся к 19 родам, 11 семействам, 7 порядкам, подклассов АдапсотусеМеае и АрЬу11орЬоготусеис1еае. Некоторые штаммы выделенных нами культур переданы в коллекцию Регенсбургского университета и Института ботаники РАН (Санкт-Петербург). Экземпляры ПТ исследованных видов хранятся в гербарии кафедры ботаники ЕГУ.

На основании полученных результатов скрининга можно создать банк данных о лекарственных грибах Армении, что будет способствовать дальнейшему эффективному использованию грибного биоразнообразия республики.

Апробация работы и публикации. Основные результаты исследования были представлены на международных конгрессах, всесоюзных и региональных конференциях, симпозиумах и научных сессиях: III, IV всесоюзн. симп. Изучение грибов в биогеоценозах (Узбекистан, Ташкент, 1985; Россия, Свердловск, 1988); X научн. симп. микол. и лихенол. прибалт, республ. и Белоруссии (Латвия, Рига, 1985); научн. сессия ЕГУ (Армения, Ереван, 1985); Закавказск. конф. по спор, растениям (Армения, Ереван, 1986); X межд. конгресс европейских микологов (Эстония, Таллин, 1989); IV межд. миколог, конгресс (Германия, Регенсбург, 1990); III межд. конгресс Наука и практика грибоводства (Россия, Кашира, 1996); респ. конф. Загрязнение пищ. прод. биотич. и абиотич. контаминантами (Армения, Ереван, 1996); межд. собрание европейского совета по охране грибов (Италия, Сиена, 1998); I межд. конф. Методолог, основы познания биол. особенн. грибов - продуцентов физиол. актив, соед. и пищев. продуктов (Украина, Донецк, 1998); IV межд. коллокв. Природ, соедин. растит, происхождения (Канада, Оттава, 1998); II межд. симпоз. Биотехнология растений (Украина, Киев, 1996); научн. совещ. посвящен. 75-летию каф. ботаники ЕГУ (Армения, Ереван, 1999); межд. совещ. по микологии (Франция, Лиль, 1999), а также на научных семинарах и заседаниях кафедр ботаники, экологии и охраны природы и ученого совета биологического факультеа ЕГУ.

Диссертационная работа была выполнена в Ереванском государственном университете на кафедрах ботаники, экологии и охраны природы биологического факультета (1980-1998), на кафедре низших растений МГУ им. М.В. Ломоносова (1982-1983), а также в рамках межвузовского сотрудничества на факультете фармации университета Монпелье-1 (Франция, 1993-1997) и по стипендии ДААД в институте ботаники Регенсбургского университета (Германия, 1993). Часть работы, представленная в Международный Научный Фонд им. Дж. Сороса (США) была удостоена премии.

По материалам диссертации в международных и местных научных журналах опубликовано 46 работ, из коих 26 статей, 19 тезисов и материалов и одна монография. На международных конференциях и конгрессах были представлены 3 постера.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 390стр. компьютерного текста (MS Windows'97, Times LatRus, 12/1.5), состоит из введения, шести глав, выводов, а также списков цитированной литературы и сокращенных слов. Работа включает 68 таблиц и иллюстрирована 79 рисунками. Список литературы состоит из 690 названий.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении изложены актуальность темы, основные цели и задачи, научная новизна и практическая ценность полученных результатов.

ГЛАВА I. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работу были включены ПТ 47 видов и мицелия 235 штаммов 36 видов БМ. Исследованный материал относился к 14 семействам, 6 порядкам подклассов Agaricomycetideae и Aphyllophoromycetideae, класса Homobasidiomycetes, подотдела Basidiomycotina: Polyporaceae (Polyporus varius, P. squamosus), Cortinariaceae (Cortinarius armillatus), Crepidotaceae (Gymnopilus spectabilis), Strophariaceae (Nematoloma fasciculare, N. capnoides, N. sublateritium, N. polytrichi, N. radicosum, Kiihneromyces mutabilis, Pholiota squarrosa, Ph. gummosa, Ph. aurivella, Ph. alnicola, Ph. adiposa, Ph. destruens, Stropharia squamosa, S. rugoso-annulata), Coprinaceae (Coprinus cinereus, C. patouillardi, C. lagopus, C. comatus, C. atramentarius), Bolbitiaceae (Agrocybe praecox, A. vervacti, A. dura), Tricholomataceae (Armillaria mellea, Lepista nuda, Tricholoma tigrinuni), Dermolomataceae (Flammulina velutipes), Pleurotaceae (Pleurotus pulmonarius, P. ostreatus, P. cornucopiae, P. eryngii, Lentinus tigrinus), Marasmiaceae (Lentinula edodes), Boletaceae (Suillus luteus, Xerocomus badius), Paxillaceae (Paxillus involutus, P. atrotomentosus), Amanitaceae (Amanita citrina, A. phalloides, A. pantherina), Agaricaceae (Agaricus bisporus, A. campestris, Leucoagaricus naucinus, Macrolepiota rhacodes).

Исследованные виды представляют различные эколого-трофические группы: ксилотрофы (25 вида), гумусовые (19) и подстилочные (3) сапротрофы, копротрофы (5), микоризообразователи (6), герботрофы (2), паразиты (1) и псаммотрофы (1). Среди них 29 съедобных, 8 ядовитых и 13 несъедобных видов.

Культуры выделялись тканевым, многоспоровым и моноспоровым методами на средах 7° сусло-агар (CA), 2% мальц-агар (MA) и картофельно-глюкозный агар (КГА). Особенности их выделения, а также условия экспериментов по изучению мицелия in vitro были описаны ранее (Бадалян, 1993). Наблюдения за ростом мицелия проводились в течение 28 сут. При этом исследовались микро-и макроморфологические признаки мицелия. Показатель ростового коэфицента (PK) вычислялся по A.C. Бухало (1988), а текстура колоний описывалась по шкале Дж. Сталперса (Stalpers, 1978).

Морфологические особенности ПТ, мицелия и мицелиальных структур 7 видов исследовались методами световой микроскопии и СЭМ (DSM-950 Zeiss, W.-Germany; Hitachi S-405A, Japan, Tesla BS-300, Чехия). Препараты для светового микроскопа готовились из зоны роста колоний общепринятым методом [Методы..., 1982). Подготовка препаратов мицелия и ПТ для СЭМ осуществлялась двумя методами (Mims, Thurston, 1979; Quattelbaum, Camer, 1980). После фиксации в парах OsO* они сушились при критической точке С02 (прибор Hitachi CPD-20) и напылялись смесью Au + Pd (60:40) толщиной 1 нм (напылитель Microthechnik England SC 515 Polaron; Eiko iB-3).

Генетический анализ 5 видов рода Nematoloma (N. fasciculare, N. capnoides, N. sublateritium, N. polytrichi и N. radicosum) проводился методом цитофлюорометрии с применением раствора флюоресцентного красителя -ДАПИ (4',6-диамидино-2-фенилиндол, SERVA), который имеет способность связыватся преимущественно с АТ-обогощенными участками ядерной ДНК.

Установлено, что флюоресценция ДАПИ-ДНК комплекса пропорциональна количеству ДНК в ядрах (Meixner, Bresinsky, 1988 и др.).

После консервации материала в смеси этанол:уксусная кислота (3:1) препараты фиксировались в растворе ДАПИ, приготовленном на цитрат-фосфатном буфере МкИлвена из расчета 0.5/лгмл''. Для стабилизации препаратов до и после фиксации, соответственно в течение 15 и 7мин, их выдерживали в буферном растворе (3.712г - С6Н807хН20, 29.33r -Na2HP04x2H20 на 1л дистиллированной воды, рН7.0). Затем препараты сушились на воздухе и готовились на глицерине. Флюоресцентный микроскоп (Zeiss, W.-Germany, 1II-RS 46-6249-9904) был соединен с компьютером со специальной программой для цитологических исследований (CYFLAN-Cytological Fluorescent Analyses, MPC 64). Результаты измерений количества ДНК автоматически получались на принтере и выражались в процентах. Удачными принимались измерения ДАПИ-ДНК комплекса из участков препарата, находящихся на стадии интерфазы. Первое такое измерение с показателем до 100±9 принималось как исходное. Полученные данные с других флюоресцирующих точек препарата сравнивались с ним. Удачные показатели дикариотического ядра (»220) делились на два.

Опыты по меж- и внутривидовому скрещиванию проводились на 2% MA методом совместной культуры, соответственно в 387 и 487 вариантах, в трех повторностях. В качестве контроля описывался характер роста мицелиев в монокультуре. В ходе опытов описывались морфологические типы и интенсивность проявления реакций межвидового антагонизма и ВН после контакта видов или изолятов различного происхождения. Антагонистическую активность или БА видов оценивалась по индексу антагонизма (ИА), который вычислялся по формуле: ИА—А(пх1)+В(пх2) + С(пхЗ); где А, В и С - типы реакций с некоторыми нашими модификациями, а 1, 2, 3 - баллы (Johnson, Curl, 1978). Некоторые серии опытов проводились как на макро-, так и микроскопическом (на целлофановых пластинках) уровнях (Гарибова, Бадалян, 1988).

Межвидовые взаимоотношения дикариотических изолятов 28 видов БМ с различным происхождением и различной трофикой исследовались по трем группам: I - между видами из различных географических регионов (Армения, Россия, Украина, Франция, Германия). При этом 120 скрещиваний из 250 вариантов наблюдались между ксилотрофами; II - между видами в пределах одного географического региона: Франция (11 видов исследовались в 55 вариантах) и Германия (12 видов, в 67 вариантах); III - между видами одного рода. Наблюдался совместный рост 15 видов в пределах родов Pleurotus (3), Pholiota (5), Nematoloma (3) и Coprinus (4).

Внутривидовые скрещивания проводились с дикариотическими изолятами различного происхождения 6 ксилотрофов (N. fasciculare - 71 изолята, Р. ostreatus - 21, F. velutipes - 16, L tigrinus - 10, К. mutabilis - 8 и P. varius - 6), предварительно разделенные на подгруппы: При этом описывалась фенотипическая вариабельность и оценивалась интенсивность реакции ВН.

Выбор ксилотрофных видов для этих опытов обосновывался двумя причинами: 1) они хорошо растут и плодоносят в культуре и могут служить

моделью для исследования половой и соматической несовместимости у БМ; б) они имеют широкий ареал распространения и обитают на различных древесных субстратах. Географическая распространенность и экологическая разнообразность субстратов способствуют образованию экотипов и интерстерильных групп внутри таксономического вида, выявления и наблюдения за которыми имеет большое значение в исследованиях популяционной микологии и процесса видообразования у грибов.

Проанализировано 279 пар совместной культуры изолятов N. fasciculare по двум группам, соответственно в 123 и 156 вариантах. Первая была разделена на следующие подгруппы изолятов: I - из разных географических точек или популяций (Армения, Россия, Украина, Франция, Германия); II - с разных субстратов (бук, граб, ель, береза) из различных популяций (Армения, Россия); III - из разных групп ПТ или семеек и IV - из разных ПТ одной группы ПТ. Изоляты из групп III и IV выделялись с одного пня на территории Армении.

Вторая группа включала дикариотические (тканевые - В, полиспоровые - PS) и монокариотические (MS) изоляты, выделенные из различных ПТ N. fasciculare. Образцы ПТ собирались в окрестностях Регенсбурга в течение одного вегетационного сезона (октябрь, 1993). Скрещивания в пределах одной популяции проводились по трем подгруппам: I - ди-ди (В-В и B-PS), II - ди-мон (B-MS и PS-MS) и III - моно-мон (MS-MS).

Наличие феномена Буллера или образование нового гетерокариона при ди-мон скрещивании изолятов N. fasciculare проверялось начиная с Юсут роста. Препараты готовились из зоны контакта гиф, окрашивались метиленовым синим и просматривались под микроскопом (Mikrosh-Zeiss).

Изоляты P. ostreatrus скрещивались в 52 вариантах по следующим подгруппам: I - из разных географических регионов (Армения, Украина, Россия, Франция) и II - в пределах одного региона (Армения и Украина). Изоляты F. velutipes также распределялись по подгруппам и скрещивались в 75 вариантах: I - из различных географических регионов (Армения, Россия, Германия); II - из различных семеек ПТ с одного пня и III - из разных ПТ одной семейки. Изоляты К. mutabilis скрещивались в 28 вариантах по следующим подгруппам: I - из различных географических регионов (Франция, Россия, Германия) и II - внутри одной популяции (Германия). Изоляты L tigrínus также скрещивались по двум группам в 38 вариантах: I - из различных географических регионов (Армения, Россия, Украина) и II - внутри одной популяции (Армения). Изоляты Р. varíus выделялись в пределах одной популяции (Армения) и скрешивались в 15 возможных вариантах, без предварительного распределения на подгруппы.

В биохимический скрининг включились 26 видов БМ, относящихся к 17 родам, 12 семействам и 5 порядкам с преобладанием ксилотрофов. Использовались: а) МЭ 14 видов и 17 штаммов, б) полученные после фракционирования МЭ МРФ 20 видов, 21 образцов и ВРФ 17 видов, 18 образцов и в) ВЭ из ПТ И видов. Биохимический состав ПТ (ВЭ, МЭ, МРФ и ВРФ) и мицелия (ЭМ) параллельно анализировался только у 8 ксилотрофных видов: А. mellea, F. velutipes, К. mutabilis, N. fasciculare, P. ostreatus, Ph. adiposa и Ph. squarrosa.

Сухие ПТ (20/) 1

Экстракция пудры (СН3ОН, 100мл х5)

| Комбинированный МЭ

| Выпаривание |

Концентрированный экстракт (КЭ)

Осадок

| Надосадочная масса |

| Промывание (СН3ОНхЗ)

] | Добавление МеОН:Н2Р (1:1)

Рис.1. Схема экстракции и фракционирования плодовых тел БМ

Для получения экстрактов грибная пудра экстрагировалась абсолютным метанолом в камере с ультразвуковой мацерацией (20-22°С, 1 час). Полученный после фильтрации концентрированный экстракт (КЭ) отстаивался в течение 2-3 недель, при 4-6°С, в результате чего выпадал обильный кристаллический или карамельный осадок. После естественного разделения проводилось механическое разделение фракций согласно схеме (рис. 1).

Выделенный светло-бежевый осадок в виде кристаллов, карамели или комочков хорошо растворялся в воде и почти не растворялся в метаноле (ВРФ). Оставшийся после отделения осадка вязкий КЭ, лиофилизировался. Полученный порошок (МРФ) хорошо растворялся в метаноле или в смеси метанол:вода (1:1). Для биохимических анализов ВРФ и МРФ соответственно разбавлялись водой и метанолом.

После метанольной экстракции остаток ткани ПТ повторно экстрагировался водой (ЮОл/л хЗ) и лиофилизировался (ВЭ).

Мицелиальная биомасса, выращенная в колбах Эрленмейера (мальц-экстракт, 24 сут, 24°С) трижды промывалась дистиллированной водой, размельчалась и экстрагировалась метанолом (1:10, 24 та е., 35°С). Метанольная фракция после фильтрации сгущалась на роторном испарителе до получения концентрированного экстракта мицелия (КЭМ), который для опытов разбавлялся метанолом, водой или смесью метанол:вода (1:1).

Определение стероидных соединений, выделение и идентификация химической структуры отдельных компонентов проводили в липидной фракции, полученной из экстракта ПТ N. fasciculate по схеме (рис. 2).

I Пудра сухих ПТ (50/) |

_I_

Хлороформ:метанол (ХМ, 2:1, 400дм хЗ)

I Выпаривание |

_i_

I Концентрированный экстракт (КЭ-2.4.Г) |

_I_

I Хлороформ:метанол:вода (200:100:75, 375мл) |

_I_

I Хлороформная фаза |

Выпаривание^

_I_

[ Сухой липидный остаток (СДО - 1.5/) |

Рис 2. Схема выделения CAO из экстракта ПТ N. fasciculare

CAO далее хроматографировался на колонке с силикагелем. Вещества с колонки элюировались бензолом (бООлгл), хлороформом (500мл), смесями ХМ (200:1; 100:1; 100:1.5; 100:2; 40:1; 20:1; 10:1; 5:1; 2:1; 1:1) и метанолом (по 500л/л). Комбинированные фракции (по 20мл) отдельно анализировались на силикагельных пластинках в двух системах растворителей: бензол:ацетон (6:1) и хлороформ:метанол:уксусная кислота:вода (90:8:1:0.8). Пластинки проявлялись 1% раствором ванилина в 15% фосфорной кислоте с последующим их нагреванием (110°С, 5 мин). Химическая структура выделенного кристаллического соединения из наиболее полярной фракции CAO устанавливалась методами УФ-, ИК- и Масс-спектров (Бадалян, Никищенко, 1990).

Качественный и количественный биохимический анализ грибных образцов проводился методами одномерной и двумерной тонкослойной хроматографии (ТСХ, 2М-ТСХ), высокоэффективной жидкостной (ВЭЖХ) и колоночной хроматографии. Для ТСХ использовались целлюлозные (5552; 5577, 5716) и силикагельные пластинки (Art. 818033; 5554; 5715, 5717, 5721, 5735) на алюминевой, пластиковой основе и на стекле, с флюоресцирующим индикатором или без него (Merck, Германия). Для приготовления различных систем растворителей в основном использовались растворы фирмы Carlo Erba (Италия), а для ТСХ и ВЭЖХ анализов - стандартные реактивы и растворители фирм Fluka, Carlo Erba и Era Chemie (Италия), Merck и GmbH (Германия) и Sigma (США). ТСХ анализы свободных Сахаров и аминокислот, полиолов, алкалоидов и других грибных токсинов, фенольных кислот, индольных

соединений проводились со стандартами, а нингидрин-положительных соединений, полисахаридов, терпеноидов, танинов и фенольных соединений -без них. Стероидные соединения, гликозиды и сапонины определялись с помощью химических реакций в пробирках (Методы..., 1967; Stahl, 1969; Andary et al, 1977; 1988; Rapior et al., 1988; 1990; Badalyan etal., 1994 и др.).

Антибактериальная активность (АБА) 13 видов 25 образцов БМ in vitro исследовалась методом диффузии в агар на среде Мюллер-Интона. В качестве тест-бактерий использовались 30 штаммов 12 видов Г и Г+ кокков и бацилл, полученных из зарубежных (Франция, США), россиийских и местных коллекций культур: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Shigella sp., Salmonella sp., Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. megaterium, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Enterococcus hirae и Enterococcus sp. Образцы ВРФ (10) и МРФ (15) из экстрактов ПТ разбавлялись соответственно водой и диметилсульфоксидом. По той же методике определялась АФА 13 видов БМ в отношении 5 штаммов Candida albicans на среде Сабуро.

Отдельно АБА 10 изолятов N. fasciculare различного происхождения определялась в ЭМ и КЖ в отношении 7 видов и 10 штаммов тест-бактерий: Brevibacterium flavum, Micrococcus glutamicus, Bacillus megaterium, B. subtilis, B. mesentericus, E. coli и S. aureus на двухслойном мясо-пептонном агаре методом диффузии в агар (Егоров, 1979).

Антифунгадьную активность (АФА) наиболее активных по нашим оценкам штаммов 22 видов БМ (Pleurotus ostreatus, P. cornucopiae, P. eryngii, Polyporus varius, Lentinus tigrinus, Flammulina velutipes, Lepista nuda, Armillaria mellea, Lentinulla edodes, Agaricus bisporus, Coprinus cinereus, C. comatus, C. atramentarius; Kiihneromyces mutabilis, Pholiota adiposa, Ph. aurivella, Ph. alnicola, Ph. destruens, Nematoloma fasciculare, N. capnoides, Suillus luteus, Amanita pantherina) определялась в отношении 10 видов из 6 родов тест-микромицетов: Aspergillus (A. niger, A, versicolor, A. flavus), Pénicillium (P. simplicissimum, P. jensenii, P. chrysogenum), Fusarium sambucinum, Cladosporium atroseptum, Stemphylium botryosum и Hormiscium sp. Опыты проводились методом совместного роста культур на среде СА в 220 вариантах.

Отдельно АФА 16 изолятов N. fasciculare различного происхождения исследовалась в 320 вариантах в отношении 20 видов микромицетов из 9 родов: Alternaria (A. tenuis,, A. chartarum), Aspergillus (A. niger, A. fumigatus, A. micro-virido-citrinus, A. versicolor), Aureobasidium pullulans, Chrysosporium sp., Cladosporium herbarum, C. sphaerospermum, Fusarium sp., Pénicillium (P. verrucosum, P. raciborskii, P. chrysogenum, P. citrinum, P. lividum, P. funiculosum, P. sp., ser. frequentas), Trichoderma viride и Ulocladium alternavide. С целью уточнения таксономической принадлежности микромицетов они выращивались на среде Чапека. Степень АФА макро- и микромицетов оценивалась по приведенной выше формуле ИА=А(пх1)+В(пх2) + С(пхЗ).

Гемолитическая активность (ГЛА) экстрактов ПТ и мицелия N. fasciculare в условиях in vivo и in vitro исследовалась на кроликах, белых крысах и эритроцитах человека в составе кровяного агара. Сухой ВЭ (Юг на ЮОлгл) разбавлялся раствором 0.9% NaCl (1:3) и вводился подопытным животным в/б

или перорально. Кровь, полученная после декапитации животных стабилизировалась лимоннокислым натрием. В предварительных опытах грибной экстракт вводился кроликам перорально в дозах 150 и ЗООмг/кг.

Для исследования осмотической резистентности (ОР) в условиях in vivo и in vitro крысиные эритроциты инкубировались (30 мин) с различными концентрациями экстракта ПТ: 0.004, 0.006, 0.02, 0.8, 1.5, 2.25 и 4.5% (1:3), а для исследования кислотной резистентности (КР) животным в/б вводились по 0.5мл экстракта в дозах 80 и 120мг/кг. Забой их и последующие анализы проводились через 1, 2, 3, 6, 24, 48 и 120 та с. ОР эритроцитов определялась по модифицированному нами методу Лимбека и Рибьера (Плотичер, 1965) с применением фотоэлектроколориметра, что заключалось в количественном определении процента гемолизированных эритроцитов по изменению оптической плотности раствора эритроцитов под воздействием гемолитика -дисстилированной воды, а КР - по методу кислотных эритрограмм, где гемолитиком послужил 0.004N НС1 (Терсков, Гительзон, 1967). Параллельно исследовались некоторые гематологические показатели: количество эритроцитов и лейкоцитов, цветной показатель, а также объем эритроцитов по гематокриту. ГЛА растущего на кровяном агаре мицелия, ЭМ и КЖ определялась методом диффузии в агар (Егоров, 1979; Методы..., 1982).

Гемакоагулирующая активность (ГКА) in vivo определялась после в/в введения экстракта ПТ N. fasciculare кроликам в дозе 50мг/хг методом тромбоэластограмм (ТЭГ). Исследовались следующие показатели ТЭГ: R - время реакции; t - специфическая константа коагуляции; S - константа уплотнения; К - время тромбообразования; Т - общее время свертывания, (T=R+K + t), mA -максимальная амплитуда кривых; Е - эластичность кровяного сгустка (Е=шАх 100/100-тА) и Ci- индекс коагуляции (Ci =mA/R+K).

Качественное определение 16 внеклеточных ферментов проводилось у хорошо растущих культур N. fasciculare и F. velutipes по выделению в питательную среду специфических соединений (прямой) или добавлением в среду различных реактивов после определенного периода роста мицелия (непрямой тест). Ферментативная активность грибов оценивалась по типу и интенсивности протекания реакции. Экстенсивность роста и синтетическая активность мицелия оценивались соответственно по специальной шкале и баллам (Molitoris, Schaumann, 1986).

Протеолитическая активность БМ исследовалась на двух субстратах: молоко (МСА) и фибриновые пласты (ФЛА). МСА определялась по степени и скорости свертывания или пептонизации обезжиренного молока в пробирках (Методы..., 1982). Тестировались МЭ (6 видов) и ВЭ (4), КЖ (17) ЭМ (16), а также МРФ (16 образцов) и ВРФ (6 образцов) 16 видов БМ. Проводился также посев мицелия 14 видов в молочную среду. После стерилизации молока ЭМ добавлялся по 0.2л/л, КЖ - по Змл, а МЭ из ПТ - по О.Зл/л. ФЛА 6 изолятов N. fasciculare определялась в КЖ, полученной после поверхностного выращивания мицелия на сусле методом гельфибриновых пластин. Степень активности оценивалась по величине зоны лизиса на пластинках под действием КЖ (10лгл*=1ед.) (Методы..., 1982).

Гипогликемическая активность (ГТА) ВЭ из ПТ N. fasciculare определялась in vivo в течение 10сут у диабетических крыс мужского пола штамма Wistar, весом 180-200г. Диабет индуцировался ежесуточным в/в введением раствора стрептозотоцина в дозе бОл/г/кг. В дальнейшем фиксировался уровень гликемии и вес животных. Питание и воду давали ad libidum. В следующей фазе эксперимента в течение 10 дней двум группам животных в/б и перорально ежесуточно вводился грибной экстракт в дозе 50мг/кг, разбавленный смесью 0.9% NaCl и 3% карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ). В ходе опыта измерялись уровень гликемии, количество употребляемой пищи и вес животных.

Для исследования фармакологической активности и острой токсичности выбор грибных объектов проводился исходя из токсичности видов и существующих в литературе сведений о содержании в них БАС, а также их принадлежности к экологической группе ксилотрофов. В опытах использовались белые мыши EOPS линии Swiss, 4-5-недельного возраста, весом 20-25г, мужского и женского полов. После адаптации животных [IQcyij им однократно вводились сухие метанольные экстракты ПТ и полученные из них фракции, разбавленные 3% КМЦ из расчета \0 мл/кг при в/б введении и 20мл/кг при пероральном введении. Дозы выбирались по геометрической прогрессии. Они увеличивались дублированием до получения искомого эффекта или уменьшались до его отсутствия. В опытах использовались следующие дозы: 50-100-150-200-250-500-1000-1500-2000л/г/яг, для каждой - по 3 или 5 животных.

Фармакологическая активность исследованных видов устанавливалась с помощью тестов Афнера, платформы, двигательной активности, каталепсии, а также рефлексов положения тела, растяжения (выкарабкивания и восстанавливания), слухового, роговой оболочки глаза, сгибания конечностей, пилоэрекции, птозиса, слезоточивости и мидриазиса. Результаты регистрировались через 30мин и каждый час в течение 6 последующих часов после введения экстрактов. Проводились ежедневные наблюдения за поведением животных, а в конце опыта - патолого-анатомические исследования внутренних органов. Вес животных измерялся на 1, 5, 10 и 15сут. Процентный расчет для ненормальных животных осуществлялся по четырем возможным вариантам: 0/ = 0%; 1/3 = 33%; 2/3 = 66% и 3/3=100%.

Острая токсичность (LDM) при в/б введении экстрактов определялась по формуле: LDM — LDÍ00- Y.(axb)/m; где LD¡00 - доза, при которой все животные погибли; а - разница последующих, сукцессивных доз; b - средняя сумма смертности между двумя сукцессивными дозами; m - среднее количество животных, использованных в эксперименте (Behrens, Karber, 1935).

Аналгетическое и алгогенное действие грибных экстрактов определялось по методу Костера, согласно которому 1% уксусная кислота в качестве алгогенного фактора при в/б введении животным (0.2мл/20г) вызывает болевые симптомы. За 30мин до введения кислоты животным перорально вводился грибной экстракт из расчета 20мл/кг. Через Ьмин после введения кислоты и в течение последующих 20ыин наблюдалось за аналгетическим (ослабление или исчезновение болевых симптомов) и алгогенным (усиление симптомов) эффектом грибных экстрактов. Использовались белые мыши EOPS линии Swiss,

весом 20-25г, мужского пола. Экстракты вводились в различных дозах соответственно для ВРФ и МРФ: F. velutipes и Р. involutus (по 1000мг/ki), Т. tigrinum (900 и В00мг/кг). Для каждого продукта процент активности вычислялся по количеству колик и сравнивался с контролем по формуле: Р% = 100х(К-Э)/К\ где К - количество судорог в контрольных клетках; Э -количество судорог в клетках после инъекции грибного экстракта.

Нейротоксическое действие грибных экстрактов проверялось тестом Буасье на планшете с 16 дырками, поднятом на определенную высоту, который позволяет наблюдать за изменениями любознательности и динамической активности животных под влиянием введенного экстракта. ВРФ и МРФ из экстрактов ПТ F. velutipes (1000 и 900мг/ki), Р. involutus (1000 и 1200 мг/ki) и Т. tigrinum (1200 и 900jмг/ki) растворялись в 3% КМЦ и вводились перорально (2Омл/ki). Наблюдения проводились в течение последущих 5мин.

Спазмолитический эффект некоторых грибных экстрактов и причины диарреи уточнялись тестом кишечной проходимости, принцип которого заключается в пероральном введении суспензии углерода, которая позволяет наблюдать за передвижением пищевой массы в кишечнике подопытных животных (белые мыши) под влиянием спазмолитического вещества - грибного экстракта, начиная от двенадцатиперстной кишки до дефекации. Грибные экстракты непосредственно перед употреблением растворялись в 3% КМЦ и вводились в/б из расчета 10мл/кг. Подготовка и условия опыта аналогичны вышеописанным. Испытывались 11 образцов МРФ и ВРФ видов А. mellea, Р. ostreatus, N. fasciculare, F. velutipes, A. praecox, Р. involutus в дозах от 350 до 1200мг/кг. Изменение в кишечной проходимости (D) выражалось в процентах согласно следующей формуле: D(%%) =c(k) -c/c(k)xlOO, где c=a/bxl00; а - длина проходимости; b - общая длина кишечника; с - процентное выражение проходимости; с(к) - проходимость для контрольных животных (55.86%); с(к)-с -снижение проходимости; D - процентное выражение снижения проходимости кишечника.

Статистическая обработка данных аналгетической, нейротоксической и спазмолитической активности грибных экстрактов проводилась тестами F Снедекора и t Стюдента (Ойвин, 1959; Поллард, 1982).

ГЛАВА II. СИСТЕМАТИЧЕСКАЯ ПРИНАДЛЕЖНОСТЬ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ БМ

Обзор современных классификационных систем высших грибов и положения в них БМ проведен многими микологами (Гарибова, 1980; Вассер, 1985; Moser, 1978; Hawksworth et al., 1983; Singer, 1986 и др.).

В данной работе исследованные виды БМ представлены по новейшей и принятой нами системе французских микологов (Courtecuisse, Duhem, 1994). На основании анализа микро-, макроморфологических и экологических признаков ПТ, эволюции и филогенетических связей грибов авторы подняли порядки Agaricales и Aphyllophorales до ранга подклассов Agaricomycetideae, Aphyllophoromycetideae, а класс Gasteromycetes низвели до ранга подкласса

Gasteromycetideae, помещая их в класс Homobasidiomycetes подотдела Basidiomycotina. Они отмечают два пути эволюции базидиальных грибов из Aphyllophoromycetideae: от промежуточных порядков Clavariales-Cantharellales через сем. Hygrophoraceae и от видов Polyporales - Polyporaceae через промежуточное сем. Pleurotaceae. В качестве "мостов" между Agaricomycetideae и Gasteromycetideae авторами выделяется группа переходных видов (Groupes des transition) и на основании концепции Секотиодных грибов объясняются филогенетические связи между ними.

Проблема построения филогенетических систем отдельных групп организмов является важнейшей задачей современной систематики. Основными барьерами в таких исследованиях у грибов являются сложность и разнообразность эволюционных путей развития, высокий уровень плеоморфизма и полиморфиза, а также наличие совершенных и несовершенных стадий в цикле их развития. Современная микосисгематика развивается по пути поиска стабильных таксономических признаков или их комплекса (морфологических, физиолого-биохимических, экологических и генетических) для различных систематических групп грибов. Результаты подобных исследований будут способствовать уточнению таксономического положения и оценки эволюционной продвинутое™ отдельных видов или групп видов, пересмотру старых и созданию новых классификационных систем, которые наиболее точно и реально будут отражать филогенетические связи внутри этой сложной группы организмов.

Исследования морфолого-культуральных особенностей мицелия БМ установили, что на различных питательных средах изоляты видов имели различные показатели РК. Большие показатели отмечались на СА с исключением нескольких видов, которые хорошо росли на КГА. Наши многолетние наблюдения показали, что СА, как наиболее оптимальная среда для большинства культур БМ, можно рекомендовать в качестве среды -дифференциатора для изучения этих грибов in vitro.

Установлено, что в одинаковых условиях выращивания скорость роста мицелия является иггаммоспецифичной. Между тем определенный диапазон изменчивости этого показателя у различных видов, что выражается разницей между экстремальными показателями РК его штаммов или изолятов, является видоспецифичным и позволяет сравнивать различные виды по этому признаку.

Изучение скорости роста 86 штаммов 36 видов показало, что в одинаковых условиях (24°С на СА) РК у них колеблется в очень широком диапазоне (от 1.6 до 180). По этому показателю исследованные БМ условно разделялись на три группы: I - быстрорастущие (РК>100); II - растущие со средней скоростью (РК = 40-100) и III - медленнорастущие (РК<40). Первую группу составили ксилотрофы (Pleurotaceae), II - ксилотрофы и копротрофы (виды из сем. Strophariaceae, Dermolomataceae, Marasmiaceae и Coprinaceae), а третья -представлена была экологически более разнообразно. Диапазон изменчивости РК четко выражался у видов P. ostreatus (108 - 180), F. velutipes (22 - 93), N. fasciculare (21.5 - 76.7) и С. comatus (24 - 77).

У исследованных БМ была установлена также видоспецифичность диапазона изменчивости морфолого-культуральных признаков, таких как характер роста

колоний (текстура, форма, пигментация, наличие мицелиальных тяжей, выделение экссудата, образование телеоморфы) и особенности микроструктур (пряжки, кристаллы, гифальные видоизменения, анаморфа и др.).

Работы по исследованию морфологии и особенностей формирования пряжек у БМ единичны (Flegler, Hooper, 1978; Hashioka, 1971). Наиболее полные сведения в этой области, полученные с помощью СЭМ, приводятся А.С. Бухало (1988). Наши исследования подтвердили, что состав питательной среды не влияет на морфологию и частоту встречаемости пряжек у изученных БМ. Эти особенности цряжек не штаммоспецифичны. Они не отмечались у видов А. bisporus, L. naucinus, М. rhacodes и A. mellea. У A. bisporus на перегородках были описаны пряжкоподобные утолщения. У других видов наблюдались частые, одиночные или двусторонние пряжки, иногда мутовчато расположенные. По форме они округлые, кольцеобразные, медальоновидные, шероховатые, гладкие, мелкие, реже крупные, вакуолизированные, с зазором или без него. У Р. varíus они описывались и на анастомозах, а у N. fasciculare удалось наблюдать этапы формирования пряжки. В зрелом состоянии, перед нарастанием или лизисом они набухают, увеличиваются в размерах и приобретают более округлую форму.

Кристаллы оксалата кальция (ОК) у грибов впервые описал А. де Бари в 1887 году. Однако многие вопросы морфологии, биологической и таксономической роли грибного ОК и сегодня освещены неполностью. Сообщается лишь о некоторых функциях грибных кристаллов: гидрофобное покрытие для гиф (Buller, 1934); физический барьер для проникновения грибной и вирусной инфекций (Thompson, 1984) и детоксикация ионов кальция (Frey-Wyssling, 1981). Недавно было опубликовано сообщение о таксономическом значении кристаллов ОК на видовом уровне для сем. Corticiaceae (Larrson, 1995). Автор у различных видов описал некоторые их константные формы и доказал генетический контроль над этим качеством.

У БМ с помощью СЭМ нами описывались кристаллы ОК различной конфигурации, причем форма и частота их встречаемости отличались у различных видов. Они обильнее выделялись молодым мицелием, начиная с 5-бсут роста, а с возрастом принимали аберратную форму. Интенсивными продуцентами ОК являются ксилотрофы. На поверхности гиф исследованных видов встречались мелкие, округлые, квадратные, игольчатые, пирамидальные, звездчатые, бородавчатые или безформенные кристаллы. Крупные, имеющие определенную геометрическую форму (призма, октаэдр, тетраэдр) кристаллы чаще выделялись в питательную среду, нежели накапливались на поверхности гиф. Игольчатые кристаллы были характерны для A. bisporus и С. cinereus, палочковидные, прямоугольные или бесформенные - для F. velutipes, N. fasciculare, P. ostreatus и P. varius. У F. velutipes они иногда имели звездчатое или веерообразное расположение. Квадратные и формы тетраэдра или октаэдра кристаллы встречались у L. edodes и Р. ostreatus как в питательной среде, так и на поверхности гиф, а округлые, бородавчатые - у L nuda.

При идентификации культур БМ большое значение придается различным видоизменениям вегетативных гиф (инкрустированные, аллантоидные, дендроидные и спиралевидные гифы, звездчатые клетки - акантоциты,

ультрамикросколические волоски, мицелиальные тяжи, гифальные петли, анастомозы и др.).

Анастомозы встречаются у всех БМ и не имеют определенного таксономического значения. Они способствуют нормальному и эффективному функционированию грибного организма и особенно интенсивно образуются в процессе морфогенеза мицелиальных тяжей и ризоморф.

Гифальные петли и ультрамикроскопические волоски описывались у БМ недавно благодаря возможностям СЭМ (Бухало, 1988). Функция их пока неясна. Эти структуры нами впервые описывались у А. bisporus (Бадалян, Дараков, 1990), а позднее - у С. cinereus, С. comatus и F. velutipes. Диаметр микроволосков у перечисленных видов не превышал 0.08ллсл/. Закрученные, спиралевидные, перетянутые гифы чаще наблюдались у видов L. edodes, Р. osreatus и Р. eiyngii.

Образование мицелиальных тяжей и ризоморф является характерным признаком для многих ксилотрофов. Известно, что они формируются при неблагоприятных экологических условиях, выполняют транспортную функцию и служат органами вегетативного размножения. Нами установлено, что с ризоморфами N. fasciculare и А. bisporus связано также их конидиальное размножение. На различных стадиях морфогенеза эти структуры обладают различной степенью физиологической активности.

Многие БМ в цикле развития образуют анаморфу, однако данные о ее особенностях весьма скудны. У этих грибов в основном встречаютая 3 типа бесполого спороношения: артрический, бластический и образование хламидоспор. Причем, бласто- и хламидоспоры (апикальные, интеркалярные) отмечаются на дикариотических, а артроконидии - как на дикариотических, так и на гаплоидных гифах. Известны два типа образования артроспор: голоартрический (ГАР) и энтероартрический (ЭАР) (Cole, Sampson, 1979). У БМ преобладают ГАР артроспоры, которые чаще встречаются на гаплоидных, реже на дикариотических гифах, а ЭАР артроспоры - только на дикариотическом мицелии. На гаплоидных гифах процесс образования спор начинается с его акропетальной, затем произвольной фрагментации, а на дикариотических гифах - с конденсации, сжатии и вакуолизации цитоплазмы (Brodie, 1936). Последний пугь встречается редко у БМ (N. fasciculare, F. velutipes, Р. varius, Р. squamosus, Ph. aurivella) (Решетников, Дудка, 1983; Бадалян, 1993). Установлено, что наличие и типы конидиальной стадии у БМ являются существенными критериями на различных уровнях таксономических построений БМ (Kendrick, Watling, 1979; Гарибова я др., 1986; Бухало, 1988).

Наши исследования выявили особенности анаморфы некоторых видов БМ. Детальным изучением N. fasciculare установлено, что наличие в цикле развития конидиальной стадии - не штаммоспецифичный, а видоспецифичный признак. У этого вида выявлены как ЭАР, так и ГАР артроспоры, соответственно на дикариотических и гаплоидных гифах. Разделение ГАР спор происходил путем распада их простых цепочек, а ЭАР - в результате коллапса разъединяющих их участков. ЭАР споры чаще имели выросты - остатки пряжек, однако прорастая они в основном образовывали гаплоидные колонии с порошистой поверхностью, гифы которой были без пряжек. Можно предположить, что

перед прорастанием происходил процесс дедикариотизации ядра. Эволюционная продвинутость анаморфы N. fasciculare оценивалась по шкале ее морфо-онтогенетических признаков. В цикле развития N. fasciculare отмечались также округлые бластические конидии и апикальные, с шероховатой поверхностью хламидоспоры.

У других исследованных БМ в мицелиальнсй стадии также присутствовала анаморфа с преобладанием артрического спороношения. Зрелые артроспоры имели различную форму: округлую, удлиненную, с каплями жира или без него, с остатками пряжек или без них, в виде простых (без разъединительных участков) и сложных (с разъединительными участками) цепочек и др. У Р. squamosus и Р. varius они отмечались как на боковых гаплоидных веточках, так и на дикариотическом мицелии. У Р. squamosus нам удалось наблюдать прорастание конидий с остатками пряжек в дикариотическую колонию, что указывает на отсутствие дедикариотизации ядра перед прорастанием спор. У Р. varius наоборот, не все ЭАР конидии образовывали мицелий с пряжками, что позволяет предположить о дедикариотизации ядра лишь у определенного количества спор.

ЭАР и ГАР артроспоры единично или обильно были отмечены у Р. cornucopiae, Р. ostreatus, Р. pulmonarius, F. velutipes, L nuda и др. У F. velutipes ГАР артроспоры образовывались после распада гаплоидных гиф, расположенных кустиками на дикариотическом мицелии, а ЭАР артроспоры с остатками пряжек - из вакуолизированных дикариотических гиф. У С. comatus и С. cinereus ЭАР конидии были расположены в виде цепочки и кисточки. На зрелых, освобожденных в результате лизиса, коллапса или разрыва разъединительных участков артроспорах по бокам оставались лоскутки в виде "шлейфа" - остатки материнской клеточной оболочки. У Р. pulmonarius ЭАР артроспоры освобождались в результате коллапса разъединительных участков, которые в конце имели форму тяжа.

Бластический тип образования конидий был отмечен у Р. squamosus, М. rhacodes, Р. ostreatus, Р. eryngii, F. velutipes, С. comatus и С. cinereus. У Р. squamosus бластоспоры с шероховатой поверхностью образовывались на ножке. У видов рода Pleurotus они также формировались на расширяющейся у основания ножке.

Интеркалярные или апикальные, таллические, толстостенные, гладкие или шероховатые, иногда лучистые, окрашенные и округлые клетки - хламидоспоры описывались у видов Р. squamosus, Р. ostreatus, L. tigrinus, М. rhacodes, С. comatus, С. cinereus, F. velutipes, N. fasciculare, N. capnoides и L. nuda.

Серия СЭМ-снимков мицелия С. cinereus позволила описать очень интересные апикальные структуры, вероятно хламидоспоры. На дихотомически или симподиально-разветвленных конидиеносцах образовывались округлые головки с кеглевидными спорами с волосисто-лучистой поверхностью. Возможно такие структуры у БМ ранее трактовались как игольчатые лучи (Бухало, 1988).

Исследования с помощью СЭМ позволили выявить наличие гимениальной слизи у молодых экземпляров ПТ N. fasciculare, Р. ostreatus, Р. eryngii, С. comatus, С. cinereus, С. lagopus и А. bisporus, которая после фиксации

препаратов выглядела в виде пленки. Она защищает элементы гимения на ранних стадиях морфогенеза, дальнейший процесс которого, в частности спорообразование происходит вне слизи. На поверхности элементов гимения наблюдались многочисленные кристаллы ОК. В гимении Р. овЬгеаШз описывались удлиненные цистиды, А. ЫярогиБ - хейлоцистиды, а N. (авсюЫате -хризоцистиды, а также базидиоли - начальная стадия базидиогенеза, которые в состоянии выполнять генеративную функцию. Приводятся данные о морфологии эпикутиса и трамы шляпки, а также параплектенхимы ножки ПТ N. ¡азасЫаге. Нам удалось наблюдать также этапы морфогенеза базидиоспор у N. Гаяасикге, который аналогично происходил и у других исследованных видов БМ. Впервые на примере этого вида описывалась структура апикулюса, а также мобильный способ прикрепления споры к стеригме по принципу комплементарности. Обсуждались различные механизмы отбрасывания базидиоспор (баллистоспор), которым сегодня придается важное таксономическое значение в систематике БМ (Гарибова и др., 1991; Бадалян, 1993; СоиПесшББе, ОиЬеш, 1994).

В главе даются краткие описания исследованных видов БМ. Приводятся латинское и русское названия, литературная ссылка, морфологические особенности, экологическая группа, сведения о съедобности и общее распространение. Диагнозы некоторых видов дополнены выявленными новыми признаками мицелия и ПТ.

Сделана попытка использования комплекса био-экологических, хемотаксономических и генетических критериев в исследованиях филогенетических построений отдельных групп грибов на примере рода ЫетаШота. Сравнительный анализ морфолого-культуральных и экологических особенностей 165 штммов видов N. 1азаси1аге, N. сарпо1ёев и N. зиЬШегШит различного происхождения, а также морфологических признаков образцов их ПТ выявил значительную близость между первыми двумя видами. Мицелий трех видов характеризовался выявленным у N. 1аБС1си1аге А типом колоний с некоторыми отклонениями лишь в пигментации (Гарибова, Бадалян, 1986). Микроструктуры колоний также мало отличались. При межвидовом антагонизме степень конкурентоспособности (ИА) N. /аяасикге, N. сарпоМез и N. виЬШегШит выражалась в соотношении 10:2:1, соответственно. Реакция нарастания наступала между N. £аваси1аге и N. виЬШетШит, тогда как с N. сарпо16еэ взаимоотношения N. {азс1си1а1в были сравнительно равными.

Итак, по комплексу микро- и макроморфологических характеристик мицелия и ПТ, а также выявленным экологическим параметрам исследованные виды в составе рода по степени близости представились в следующей последовательности: N. fasciculaтe->N. сарпо1с!БиЬШегШит.

Результаты качественного биохимического скрининга экстрактов мицелия и ПТ по содержанию фенольных кислот, сапонинов, пигментов, алкалоидов и других грибных токсинов, стероидных гликозидов, свободных Сахаров и аминокислот, а также полиолов дополнили выводы био-экологического анализа и внесли определенную ясность в степени эволюционной близости этих видов.

По биохимическому составу ПТ показатель сходства видов (Б) между N. 1,азаси1аге и N. сарпо1ёеэ была выше (3=17), чем между N. /а5с!си1аге и N.

5иЫа1егШит (15) или N. сарпо1'с1ез и N. БиЬШегШит (13). Полученные предварительные результаты в дальнейшем уточнялись данными генетического анализа, которые являются более достоверными в подобных рассуждениях.

Определение количества ядерного ДНК, которое пропорционально отражает количество хромосом в клетках и уровень плоидности видов имеет большое значение на различных уровнях таксономических и филогенетических анализов БМ, в частности для видов, фенотипическая и морфологическая пластичность которых создают определенные трудности в систематике.

Результаты статистической обработки измерений количества ядерного ДНК в монокариотических и дикариотических клетках мицелия и ПТ 5 видов рода №таШота приводятся в таблице. По содержанию ДНК исследованные виды разделились на две группы, которые теоретически соответствовали двум уровням плоидии: моноплоидные (п) и триплоидные (Зп). В среднем количество ДНК в моноплоидных клетках соответственно для каждой группы равнялось 33.7 и 39.1.

Существует предположение, что высокий уровень плоидии указывает на эволюционную продвинутость вида, а низкий - является филогенетически старым признаком (Вгевтяку е1 а!., 1987). В связи с этим исследованные виды рода А!етаШота по эволюционной молодости можно представить в следующем порядке: N. гad¡cosum—>N. suЫateritium-+N. polytnchi->N. capnoides->N. Га5с1си1аге.

Таблица. Количество ядерного ДНК у некоторых видов рода N6111310101113 (в %)

Виды Кол-во ДНК в дикариотических клетках Среднее кол-во ДНК в дикариотических клетках Среднее кол-во ДНК в монокариотических клетках Уровень плоидий

N. 1а5с1си1аге N. сарпо]^ез N. ро1у4пс1и 67.35±13 73.7±5.7 78.2119.9 } 67.4 - 78.2 } 33.7 Моноплоид-ный (п)

N. БиЬШетШит N. тadicosum 92.6±10 103.8±16.8 } 92.6 - 103.8 } 39.1 Триплоид-ный (Зп)

Таким образом, N. гав1совит и N. БиЬШегШит являются эволюционно более продвинутыми и филогенетически молодыми видами внутри рода, по сравнению с N. 1а5с1си1аге, N. capnoides и N. ро1у$псЫ. По предварительным данным можно также судить о близости видов внутри каждой группы в составе рода. Относительно большой разрыв между показателями количества ДНК у N. виЪШегШит и N. ро1у4псЫ (15), а также N. зиЬШепМит и N. гаё^сояит (11) указывает на вероятное наличие другого или других видов, а может быть и внутривидовых форм между ними. Эти данные дополняют также наши выводы об относительной эволюционной близости N. /а$а'си1аге с N. capnoides и отдаленности N. {авс1си1ате от N. БиЬШетШит.

Итак, полученные предварительные результаты указывают на целесообразность продолжения дальнейших исследований с включением новых образцов исследованных и других видов рода ЫетаШота. Завершающим этапом в подобных исследованиях является получение дополнительных подтверждений по био-экологическим и физиолого-биохимическим особенностям исследованных грибов. Применение такого комплексного подхода в исследованиях БМ позволит выявить эволюционные связи не только между видами, но и различными таксономическими категориями грибов, что будет способствовать построению более совершенных филогенетических систем, а также пониманию процесса видообразования внутри этой группы организмов.

ГЛАВА III. ЭКОЛОГИЯ И МИКОЦЕНОТИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА БМ

В обзоре литературы подробно обсуждаются некоторые актуальные направления современной популяционной экологии и микоценологии: место грибных группировок в экосистеме и их функциональная специфика, структура популяций ксилотрофиых макромицетов, особенности меж- и внутривидовых взаимоотношений, явление ВН и механизмы ее контроля, образование экотипов и биологических видов внутри таксономического вида, эволюционный процесс видообразования и др. Приводятся также современные методы микоценологических исследований.

Сложившимся в процессе эволюции межвидовым взаимоотношениям грибов следует придавать особое значение. Их конкурентные взаимоотношения способствуют ограничению диапазона местообитания и используемых популяциями ресурсов, препятствуя этим осваиванию новых местообитаний. Установление межвидового антагонизма, в частности у ксилотрофов, имеет большое значение не только для понимания возникновения грибных сукцессии в процессе разложения древесины, но и поиска новых методов биологической борьбы с грибными заболеваниями и вредителями. Исследование в культуре взаимоотношений между видами с различным географическим происхождением или из различных популяций, относящихся к различным эколого-трофическим группам позволит оценить характер и особенности межвидовых контактов и степень конкурентоспособности (БА) отдельных видов в процессе формирования грибных популяций, а также определить их место в биогеоценозах.

В целом межвидовые взаимоотношения БМ недостаточно изучены. Между тем в определенном пределе они могут иметь и таксономическую значимость, указывающую на границы вида и рода в экологических нишах (Гарибова, Мокеева, 1976), хотя такую интерпретацию следует проводить с осторожностью (Радзиевская, Бобко, 1985).

Исследованные нами межвидовые взаимоотношения 28 видов БМ по вышеописанным группам (Гл. 1) завершались тремя типами реакций антагонизма: А - взаимоторможение роста обоих видов при контакте; В -

дистанционное взаимоторможение • зона отсутствия роста и С - нарастание активного, быстрорастущего вида на пассивнный, медленнорастущий.

Взаимоотношения видов из различных географических регионов. При совместном росте 22 видов БМ с различным происхождением выявились А, В, С типы реакций межвидового антагонизма, которые зависели от биоэкологических особенностей контактирующих организмов (скорость и характер роста колоний в монокультуре, характер природного субстрата, географическая точка сбора ПТ и др.), а также степени их конкурентоспособности или БА. Они имели сложный характер и динамику развития. По показателю БА исследованные виды расположились в следующем порядке: P. ostreatus (189) > L tigrinus (171) > L. edodes (170) > С. comatus (153) > N. fascicuJare (139) > С. dnereus (112) > Р. varíus (97) > P. eryngii (92) > К. mutabilis (89) > P. velutipes (82) > P. cornucopiae (80) > Ph. adiposa (75) > L nuda (64) > A. mellea (57) > Ph. aurivella (49) > N. capnoides (41) -> Ph. destruens (32) > A. bisporus (29) > A. pantherina (28) > S. luteus (17) = C. a tramen tari us (17) > Ph. aJnicoJa (12). Они условно разделились на три группы: очень активные (ИА>100), активные (ИА= 100-50) и менее активные (ИА<50). В I группу входили близкие по трофике ксилотрофы, копротрофы и герботрофы, которые в основном нарастали, а иногда полностью обрастали поверхность пассивной колонии (С тип). Сильный антагонистический характер носили взаимоотношения между ксилотрофами одной условной группы. Среди них по активности особо выделились виды P. ostreatus, L edodes, L tigrinus и N. fasciculare. Вторую группу также составили ксилотрофы с меньшим ИА и сапротроф L nuda. Переходный вид Ph aurivella (ИА=49) следует рассматривать во II, а не III группе. Условно III группа экологически была более разнообразна представлена (ксилотрофы, копротрофы, подстилочные и почвенные сапротрофы). Виды редко проявляли реакцию нарастания. Среди них наименьшую конкурентоспособность в культуре продемонстрировали почвенные сапротрофы (A. bisporus, A. pantherina, S. luteus). В силу своих экологических особенностей они с трудом выделяются и растут в культуре, что соответственно не может способствовать проявлению их БА по сравнению с ксилотрофами и копротрофами, которые, наоборот, легко выделяются, хорошо растут и плодоносят in vitro, проявляя при этом большую биотическую и физиологическую активность.

Установлено, что на месте контакта мицелиев происходит изменение в степени активности ферментов и усиливается процесс меланизации гиф (Ii, 1983). В наших опытах ДА межвидового антагонизма отмечались чаще на месте контакта колоний ксилотрофов или копротрофов с ксилотрофами (P. varius, К. mutabilis с Р. cornucopiae и Ph. adiposa, F. velutipes с К. mutabilis, N. fasciculare и С. comatus). С каплями экссудата ДА образовывал только мицелий Р. ostreatus в контакте с Р. cornucopiae, L edodes, К. mutabilis и N. fasciculare, что является проявлением сильной реакции межвидового антагонизма. Взаимоотношения видов протекали и на дистанционно-метаболическом уровне (Ph. destruens с Р. cornucopiae, F. velutipes, N. fasciculare, A. mellea, N. capnoides и Ph. alnicola).

Таким образом, полученные результаты подтвердили наши предыдущие выводы о высокой био-экологической и физиологической активности

ксилотрофов, которые рассматриваются нами в качестве наиболее перспективной и удобной группы БМ д\я дальнейшего внедрения в биотехнологическую промышленность. Среди них особенно выделились Р. ostreatus, N. fasciculaie, L. edodes и L. tigrinus. Копротрофы, подстилочные и почвенные сапротрофы по активности уступали ксилотрофам. Однако их сравнительно низкие показатели БА не исключают поиск видов - источников БАС среди представителей этих экологических групп.

Взаимоотношения видов в пределах одного географического региона. В эту серию опытов включились две подгруппы видов, собранных и выделенных в культуру на территории Франции и Германии.

По БА виды французской группы условно распределились в следующем порядке: P. ostreatus (90) > L edodes (81) > N. fasciculare (67) > Ph. aurivella (42) > N. sublateritium (38) > A. mellea (26) > Ph. adiposa (24) > N. capnoides (19) > K. mutabilis (15) > Ph. alnicola (12) > C. atramentarius (8). По БА I группу очень активных видов составили P. ostreatus, L. edodes и N. fasciculare (ИА>50). Это подтверждает результаты предыдущей серии опытов, которые также отнесли отмеченные грибы к группе очень активных видов. Во II группу активных видов (ИА=50-20) входили Ph. aurivella, N. sublateritium, A. mellea и Ph. adiposa, a III - N. capnoides, K. mutabilis, Ph. alnicola и С. atramentarius (ИА<20). При совместном росте последние в основном проявляли реакцию взаимоторможения (А). Сильный антагонизм наблюдался между видами одной условной группы с близкими показателями ИА.

Аналогичный анализ взаимоотношений группы видов из Германии показал, что они также закономерно отличались по БА: N. fasciculare (83) > L. edodes (67) > А. praecox (54) > A. dura (52) > N. capnoides (51) > Ph. squarrosa (33) > N. sublateritium (31) > K. mutabilis (30) > F. velutipes (27) > L. nuda (18) > C. patouillardi (15) > P. involutus (0). Группу очень активных видов (ИА>50) также составили ксилотрофы (N. fasciculare, L. edodes, N. capnoides) и почвенные сапротрофы (A. dura, A. praecox). Однако разрыв между показателями ИА последних трех видов с первыми двумя, позволяет их скорее рассматривать во II группе (ИА = 50-20). В группу мало активных видов (ИА<20) входили L. nuda и С. patouillardi. В исследованных вариантах только P. involutus не проявил никакой активности (ИА=0). Наблюдалась корреляция между типами межвидового антагонизма и показателями ИА видов. Обычно высоким показателям ИА соответсвовала реакция нарастания - С, а сравнительно низким - типы В и А.

Анализ показателей ИА видов внутри популяций (Франция, Германия) подтвердил наблюдаемую ранее закономерность принадлежания определенных видов БМ к условно разделенным по БА группам. Так, в этой серии опыта группу очень активных видов независимо от условий произрастания также составили ксилотрофы, а именно P. ostreatus, N. fasciculare и L edodes.

Взаимоотношения видов одного рода. По показателям ИА в пределах одного рода исследованные виды распределились в следующем порядке: род Pholiota: Ph. adiposa (28) > Ph. aurivella (19) > Ph. squarrosa (10) > Ph. destruens (9) > Ph. alnicola (0); род Nematoloma: N. fasciculare (10) > N. capnoides (2) > N. sublateritium (1); род Pleurotus. P. ostreatus (18) > P. eryngii (4) = P. cornucopiae

(4) и род Сорттиз: С. сотаШз (27) > С. стегеиз (18) > С. акатепЬапиз (1) = С. ра1оиЛ1агсН (1).

Таким образом, закономерное различие между показателями БА исследованных видов с различной трофикой и происхождением показывает, что данный признак является относительно стабильным и его можно включить в био-экологическую характеристику вида. БА выражает также физиологические и биохимические особенности грибов, видоспецифичность которых доказано и доказывается для многих таксономических групп грибов.

Итак, среди 28 исследованных видов ксилотрофы, в частности Р. озйгеаШв, N. Iазаси!аге и £. еёоёвз отличались большей БА, что указывает на высокую степень их конкурентоспособности.

Сравнительная оценка антагонистической активности или БА исследованных макромицетов, выявление среди них физиологически наиболее активной экологической группы или отдельных видов и проведение их дальнейшего биохимического анализа, рассматривается нами как важный этап в процессе скрининга высших грибов в качестве биотехнологических объектов. Следовательно, многоэтапный отбор БМ в качестве источника БАС следует проводить комплексно, с учетом био-экологических особенностей этих организмов.

Различная степень конкурентоспособности мицелия БМ соответственно обуславливает различную степень участия того или иного вида или экологической группы в формировании и доминировании их популяций в биогеоценозах. Полученные данные могут иметь также теоретическое и практическое значение в популяционной экологии - в исследованиях сукцессий ксилотрофов в процессе разложения древесины и разработке биологических мер борьбы с патогенными грибами.

Внутривидовое скрещивание дпкариотических азолятов ксилотрофных видов. Во всех вариантах проведенных нами внутривидовых скрещиваний изолятов различного происхождения видов N. Iа5с/сц/агеР. озЬеаШз, К уе1иИрез, К. тМаЬШз, £.. Идттиз и Р. гаг1из наблюдалась реакция ВН, которая препятствовала обмену ядер и цитоплазмы между генетически различными индивидуумами одного вида. ВН указывает также на потенциальное наличие экотипов и интерстерильных групп - биотипов в составе исследованных видов.

В наших опытах реакция ВН проявилась с различной интенсивностью по двум морфологическим типам. Первый - ЗРГ, которая формировалась на месте образовавщейся стерильной зоны между вегетативно несовместимыми колониями. Такая реакция является слабым выражением ВН, т. к. происходит частично, только между воздушными гифами колоний, а субстратные -совместимые по полу гифы сливаются с помощью анастомозов, в результате чего образуются новые гетерокарионы (феномен Буллера). Второй тип -мицелиальный валик образовался как между субстратными, так и воздушными гифами контактирующих колоний и является выражением относительно полной реакций ВН. Наличие ДА и капель экссудата на месте контакта мицелиев указывает на интенсивность этой реакции.

Наблюдаемое явление полной ВН при скрещивании дикариотических изолятов N. Газс1си1аге из различных географических регионов (I), а также

выделенных из различных субстратов (II) может свидетельствовать о потенциальном наличии внутри вида соответственно био- и экотипов. Однако для окончательного подтверждения присутствия таких группировок следует проводить скрещивание моноспоровых изолятов с изолятами-тестерами данного вида. ВН проявлялась с большей силой между географически отдаленными изолятами, в частности из Армении и Украины. Между изолятами, выделенными из различных субстратов ВН проявилась реакцией взаимной "неприязни" или стерильной зоны.

Скрещивания изолятов из различных семеек ПТ (III) и между ПТ одной семейки (IV), выделенные из одного субстрата, рассматривались нами соответственно как скрещивания родственных и близкородственных изолятов. Следует заметить, что результаты взаимоотношений изолятов, выделенных из одного субстрата (пень или ствол) именно дают информацию о ВН, т. к. их мицелии обычно не отличаются по специфическим половым факторам. ВН между изолятами этой группы выражалась умеренной реакцией валика, более того, иногда наблюдалось взаимопроникновение мицелиев с помощью тяжей, что свидетельтвовало об их частичной несовместимости. Однако у некоторых изолятов, в частности из Украины и России (С.-Петербургская обл.) валик формировался только по краям зоны контакта с невыраженной ДА на агаре, а в центре - почти отсутствовал.

На примере N. fasciculare установлено, что фенотипическое проявление ВН зависит также от морфологических типов колоний. Так, несовместимость между быстрорастущими колониями (тип А) проявлялась реакцией валика, а между колониями типа А и В или А и С - стерильной зоной, которая предшествовала образованию ЗРГ. Редкая реакция нарастания между быстрорастущими и медленнорастущими изолятами N. fasciculare не связывается с явлением ВН и объясняется другими био-экологическими особенностями исследованных изолятов, как порода субстрата (лиственная, хвойная), географическая зона роста (южная или северная) и др. Установлено, что южные штаммы N. fasciculare, выделенные из лиственных пород были активнее северных, выделенных из хвойных деревьев (Гарибова, Бадалян, 1986; 1988).

Таким образом, каждая группа ПТ N. fasciculare представляет собой самостоятельную группировку особей, генетическую индивидуальность которых контролируется системой ВН. Она сильнее выражается между географически отдаленными индивидуумами (валик с ДА на агаре или мицелии).

При скрещивании группы изолятов Р. ostreatus ВН стабильно проявлялась одним типом мицелиального валика, по линии которого на агаре в поздние сроки роста гифы субстратного мицелия образовывали крусгозную, плотную, темно-коричневую и выпуклую полоску - ДА, состоящую из вакуолизированных, пигментированных, прижатых друг к другу гиф обоих колоний. Ширина (до 5мм) и высота линии зависали от степени ВН между контактирующими особями. Наиболее сильно, иногда с каплями экссудата она выражалась между географически отдаленными изолятами вида. Можно предположить, что подобные ДА в культуре соответствуют описанным темным линиям на древесине между генетически различными индивидуумами

ксилотрофных видов (Todd, Rayner, 1980). Скрещивание изолятов внутри одной популяции (Армения, Украина) завершались более умеренной реакцией валика с менее выраженной ДЛ на агаре.

Реакция ВН между генетически различными изолятами F. velutipes также стабильно проявлялась одним морфологическим типом - ЗРГ, которая была выраженной между индивидуумами из географически отдаленных регионов (Армения-Россия). ВН между близкородственными изолятами III группы была пределельно слабой. При скрещивании дикариотических изолятов К. mutabilis и L. tigrinus ВН проявилась аналогично этой реакции у F. velutipes. ЗРГ была вырженной между изолятами из различных, нежели одной популяции. Реакция ВН между близкородственными изолятами P. varius была предельно низкой и выражалась очень слабой реакцией ЗРГ.

При скрещивании исследованных видов не отмечались особые отклонения в их морфолого-культуральных признаках. Некоторые изменения наблюдались лишь в пигментации и скорости роста колоний.

Дп-AB-, ди-мон- и моно -моиокарло тпческое скрещивание изолятов N. fasciculare в пределах одной популяции. Дикариотические и монокариотические изоляты N. fasciculare отличались по морфолого-культуральным признакам и скорости роста колоний. Наблюдаемая в различной степени ВН между ними также проявилась в пределах описанных реакций (ЗРГ, валик). При самоскрещивании монокариотических изолятов всегда отмечалась совместимость мицелиев (контроль).

Взаимоотношения дикариотических изолятов (группы В-В и B-PS) завершались умеренной реакцией валика с ДЛ на агаре. Тип и степень выражения ВН при ди-мон скрещивании двух групп изолятов (B-MS и PS-MS) были аналогичны первой группе, однако в некоторых вариантах В-изоляты при контакте с MS-изолятами образовывали узкую стерильную зону, которая в дальнейшем превращалась в ЗРГ, где удалось обнаружить анастомозы и гифы с единичными пряжками - образование новых гетерокарионов. Однако, для окончательного доказательства этого явления следует убедится и в полной несовместимости нового гетерокариона с родительскими парами.

Таким образом, получение нового гетерокариона при реакции ЗРГ, еще раз подтверждает теорию Объединенного мицелия (Buller, 1931), хотя наблюдаемая при этом ВН между генетически различными мицелиями говорит в пользу явления Индивидуальности у грибов (Todd, Rayner, 1980).

Изоляты пятой группы (MS-MS) во всех вариантах скрещивания образовывали реакцию несовместимости - взаимоторможение с зоной отсутствия роста, которая рассматривается нами как половое различие монокариотических изолятов N. fasciculare.

Обобщая вышеизложенный материал можно заключить, что скрещивание дикариотических изолятов исследованных ксилотрофных видов завершались реакцией ВН, которая является механизмом сохранения индивидуальности мицелия в природных популяциях. Морфологический тип и степень ее проявления зависит от био-экологических особенностей контактирующих изолятов. Она сильнее выражалась между географически отдаленными или растущими на различных древесных породах особями. По мере сближения

родства скрещивающихся индивидуумов степень ВН снижается. Результаты опытов показали, что реакция валика с выраженной ДА на агаре и каплями экссудата по линии контакта мицелиев является более сильным выражением ВН, нежели реакция ЗРГ. Последняя указывает на отсутствие полной блокады генетического обмена между несовместимыми изолятами. Доказательством этого явления послужил образование нового зонального гетерокариона, что удалось наблюдать при ди-мон скрещивании изолятов N. /азасШаге. Несовместимость между монокариотическими изолятами оценивалась как выражение их полового различия. Морфологический тип реакции ВН является относительно стабильным для каждого вида, что позволяет предположить о видоспецифичности этого явления у ксиЛотрофных грибов. Выявлена зависимость между типом проявления ВН и морфологическим типом колоний у N. Iазаси]аге.

Полученные результаты подтверждают наши предыдущие данные в пользу концепции индивидуального мицелия (Гарибова, Бадалян, 1988), одновременно способствуя новой интерпретации теории Объединенного мицелия.

Таким образом, результаты дальнейших исследований в области экологической и популяционной генетики являются необходимыми для понимания специфической структуры грибных популяций и выявления новых механизмов контроля совместимости у грибов. Они могут внести определенную ясность в структуре таксономического вида, в процессе видообразования и формирования внутривидовых категорий (экотипы и биологические виды), которые создают сложный комплекс вида с его более динамичной структурой, чем нам ранее представлялась. Подобные комплексные данные могут послужить источником ценной информации для систематических и филогенетических разработок БМ.

ГЛАВА IV. БИОХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ БМ

В главе приводится подробный обзор литературы по исследованию биохимического состава БМ. Из первичных метаболитов обсуждаются белки, аминокислоты, азотистые соединения, липиды, жирные, ароматические и карбоновые кислоты, сахара и полиолы, полисгхариды, целлюлоза, хитин и др. Из вторичных метаболитов - терпеновые и стероидные соединения, азотистые основания, алкалоиды, ядовитые полипептиды, индольные и ароматические соединения, пигменты и др.

Результаты проведенного нами качественного и количественного анализа экстрактов ПТ и полученных из них фракций (МРФ, ВРФ), а также ЭМ показали, что по составу тестированных соединений ПТ и мицелий исследованных грибов мало отличались. Этот факт еще раз подтверждает важность усовершенствования методов биотехнологического культивирования БМ, с целью получения мицелиальной биомассы, как источника пищевого и кормового белка, ферментов и БАС. Такой подход исключает также длительную и трудоемкую стадию получения ПТ в культуре и способствует охране грибных ресурсов в природе.

По результатам общего биохимического анализа, которые подтвердили результаты предыдущего этапа скрининга БМ по био-экологическим критериям, для нас наибольший интерес представили в основном ксилотрофные виды, а именно P. ostreatus, L edodes, N. fasciculare, F. veJutipes, Ph. destruens, Ph. adiposa, G. spectabilis, а также ядовитые гумусовые сапротрофы Т. tigrinum и P. involutus. Они постоянно включались в ТСХ анализы и дальнейшие опыты по исследованию физиологической и фармакологической активности БМ.

Все тестированные группы соединений, кроме таннинов в различных количествах отмечались в грибных образцах.

Свободные сахара относительно редко встречаются в грибах. Они больше находятся в связанном состоянии в молекулах гликозидов, полисахаридов и др. Трегалоза и маннитол были характерны для всех исследованных БМ. Арабитол, фруктоза и глюкоза чаще выявлялись у большинства видов, а галактоза и мальтоза - лишь в ЭМ отдельных видов. В грибных образцах не проявились арабиноза, рамноза и рафиноза. В мицелии сахара содержались больше, чем в ПТ. ВРФ экстрактов из ПТ были сравнительно богаче сахарами, нежели МРФ.

Исследованные образцы ПТ и мицелия были богаты нингидрин-положительными соединениями. Они в большом количестве проявились в МРФ и ЭМ, чем ВРФ. ЭМ исследованных штаммов грибов были богаче свободными аминокислотами, чем экстракты ПТ. Алании и серии отметечались в образцах ПТ 12 видов и были наиболее характерными для исследованных БМ, а валин, пролин, глютаминовая кислота, аспарагин и метионин присутствовали лишь у отдельных видов.

По количественному содержанию фенольных соединений исследованные образцы (МРФ, ВРФ) 15 видов БМ разделились на три группы: I - 0.02-0.07%; II -0.10-0.43% и III ->1%. В I группу входили X. badius, G. spectabilis, N. fasciculare, A. citrina, Т. tigrinum, A. praecox и A. phalloides, во II - С. armillatus, F. velutipes, N. capnoides, P. ostreatus, P. involutus, Ph. destruens, Ph. adiposa и S. squarrosa. Только P. involutus, который содержал 1.6% составил III группу.

Все шесть тестированные фенольные кислоты (4-гидроксибензойная- ГБК, 3,4-дигидроксифенилуксусная - ДГФУК, 3,4-дигидроксибензойная - ДГБК, 4-гидроксифенилуксусная - ГФУК, 4-гидрокси-З-метоксибензойная - ГМБК, 4-гидроксикоричная - ГКК) в отдельности присутствовали у 20 исследованных видов. Только ГБК была обнаружена во всех образцах, кроме G. spectabilis и А phalloides. Сравнительный анализ видов рода Nematoloma и Pholiota показал, что для первых были характерны ГМБК и ГБК, а для вторых - только ГБК.

Терпеноиды обильно присутствовали в ВРФ экстрактов ПТ видов N. fasciculare, N. sublateritium, Т. tigrinum, S. squamosa, Ph. adiposa, Ph. destruens, Ph. gummosa, X. badius, P. involutus, G. spectabilis, A. citrina, A. mellea, A. praecox и С. armillatus. На ТСХ пластинках пятна терпеноидов в МРФ либо отсутствовали, либо были невыраженными.

Стероидные гликозиды выявлялись как в нефракционированном МЭ, так и ВЭ из ПТ 9 исследованных видов. Причем МЭ по сравнению с ВЭ были богаче этими соединениями. При фракционировании экстрактов ПТ 15 других видов стероидные гликозиды переходили в ВРФ и полностью отсутствовали в МРФ.

Исследованные грибные образцы были богаты сапонинами - ядовитыми растительными тритерпеноидными гликозидами. Обильно они отмечались в экстрактах ПТ видов Ph. destruens, Ph. gummosa, N. fasciculare, A. mellea, A. praecox, G. spectabilis, P. involutus, T. tigrinum и F. velutipes. В следовых количествах сапонины присутствовали в образцах A. citrina, С. armillatus и полностью отсутствовали в К. mutabilis.

ТСХ анализ CAO из экстракта ПТ N. fasciculare выявил три фракции, дающие характерное для стеринов окрашивание смесью уксусной и серной кислот. Наименее полярная из них, близкая по своей хроматографической подвижности холестерину и эволюируемая с колонки смесью хлороформ :метанол (200:1) была получена в виде белых кристаллов с т. пл. 168°С и R( 0.7 в системе бензол:ацетон (4:1). На основании данных УФ-, ИК- и Масс-спектров выделенное вещество было идентифицировано как эргоста-5,7,12-триен-Зр-ол (эргостерол).

Из тестированных алкалоидов только холин был отмечен у всех видов. Сумма алкалоидов в ПТ была выше, чем в мицелии. МРФ была сравнительно богаче алкалоидами, чем ВРФ. Они не были обнаружены в образцах мицелия I. tigrinus и Ph. squarrosa. Из других грибных токсинов только кортинарин А присутствовал во всех исследованных видах. Применяемыми методами в исследованных БМ не удалось обнаружить орелланин, ореллинин, ореллин, а также а-аманитин, буфотенин, болдин, бетаин, мускарин и мусцимол. Для уточнения состава алкалоидов в грибах необходимы дальнейшие опыты с применением специальных методик экстракции (Andary, 1975).

Из индольных соединений L-триптофан отмечался в МРФ видов N. capnoides, N. fasciculare, P. involutus, S. squamosa, Ph. squarrosa, Ph. adiposa, A. praecox и др. Пятна ОН-триптофана под УФ-светом проявились в ВРФ видов Ph. adiposa, Ph. destruens, A. citrina и др., а характерный для видов рода Amanita буфотенин - только в ВРФ из A. citrina. Мицелий Р. ostreatus, Ph. adiposa, N. fasciculare, N. capnoides, A. mellea, K. mutabilis и P. eryngii был сравнительно богат индольными соединениями.

Сделана попытка оценки хемотаксономической значимости некоторых выявленных соединений. Наличие холина не имеет такого значения, т. к. встречается у представителей почти всех таксономических групп грибов, а также у растений и животных. ГБК, маннитол, трегалоза, аланин, валин и кортинарин А были характерны для всех исследованных видов и родов БМ. Из фенольных кислот у видов рода Nematoloma отмечались ГМБК и ГБК, а у видов Pholiota - только ГБК. Однако для более детальной оценки таксономической значимости определенных групп соединений у представителей различных таксономических групп БМ необходимы дальнейшие, целенаправленные исследования.

Таким образом, можно заключить, что исследованные БМ являются продуцентами многих активных метаболитов (фенольные соединения, терпеноиды, стероиды, сапонины, алкалоиды, полисахариды, полиолы и др.) с широким спектром действия. Некоторые из них и сегодня имеют практическое применение: маннитол в качестве диуретика используется в нефрологической диагностике, холин - в качестве липотропного фактора, некоторые фенольные

кислоты, в частности ГБК обладают антибиотической и антиоксидантной активностью и входят в состав многих лекарственных препаратов. Соообщается о нейротоксическом действии терпеноидов и иммуномодулирующей активности полисахаридов грибного происхождения, важной физиологической роли стеринов (эргостерола), а также токсическом действии азотсодержащих и индольных соединений грибов и т. д.

Таким образом, результаты биохимических анализов позволили рассматривать БМ в качестве перспективных объектов - источника БАС и соответственно прогнозировать дальнейшие аспекты исследований физиологической и фармакологической активности по установлению антибактериальной, антифунгальной, гемолитической, гемакоагулирующей, фибринолитической, гипогликемической, протеолитической, нейротоксической, спазмолитической и аналгетической активности этих грибов. При этом выявление механизмов действия отдельных групп соединений на организм, а также взаимосвязей их структуры и активности позволит в дальнейшем внедрить определенные виды БМ в фармакологическую промышленность для получения новых биопрепаратов с широким спектром действия: антибактериальным, антифунгальным, антиопухолевым, вазодиляторным, гипотензивным, тромболитическим и др.

ГЛАВА V. ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ БМ

В литературном обзоре этой главы приводятся современные данные о содержании БАС в высших грибах и их терапевтической значимости. В частности обсуждаются антибактериальная, антифунгальная, антивирусная, антиопухолевая, гипогликемическая, иммуномодулирующая,

иммуносупрессорная, аллергическая, антивоспалительная, гемолитическая, протеолитическая, гемакоагулирующая и другие аспекты физиологической активности этих организмов.

Антпбактермальная активность. Проведенные нами исследования показали, что МРФ грибных экстрактов в целом обладали большей активностью, нежели ВРФ. Наиболее эффективными оказались образцы N. iasciculare из Франции и Германии, которые соответственно ингибировали 6 и 7 штаммов бактерий, относящихся к трем и пяти видам (Pseudomonas aeruginosa, Shigela sp., В. subtilis, M. luteus, S. aureus и Enterococcus sp.). Выраженную АБА проявили также МРФ видов P. ostreatus, К velutipes, Ph. destruens, G. spectabilis, a сравнительно умеренную - P. involutus, T. tigrinum, X. badius и др. АБА не проявили ВРФ видов F. velutipes, A. mellea, A. praecox, Ph. squarrosa, A. citrina и G. spectabilis. Лишь ВРФ N. fasciculare была активна в отношении трех штаммов S. aureus, а также В. subtilis, М. luteus, К. pneumoniae, S. epidermidis и штамма Enteiococcus sp. Слабую активность в отношении трех штаммов 5. aureus и штамма В. subtilis проявила ВРФ Ph. destruens, а ВРФ Т. tigrinum и X. badius частично ингибировали рост только В. subtilis.

Таким образом, АБА испытанных экстрактов в основном наблюдалась в отношении Г+ бактерий, частично - спорулирующего вида В. subtilis и трех

штаммов S. aureus. Следует также отметить дикий штамм S. epidermidis, который не был ингибирован со стороны ни одного грибного экстракта. Предельно слабой была активность экстрактов в отношении Г" бактериий.

Зависимость спектра АБА от места и времени сбора различных образцов ПТ установилась на примере N. fasciculare. КЖ этого вида в целом ингибировала рост тест-бактерий, в частности Я coli и 5. aureus. Незначительное стимулирующее действие она оказывала на В. ílavum и M. glutamicus. Рост последнего ингибировался только под действием одного штамма N. fasciculare. Умеренная АБА в отношении В. megaterium, В. subtilis и В. mesentericus проявилась со стороны двух штаммов N. fasciculare. Мицелий гриба обладал большей АБА в отношении тест-бактерий, чем КЖ. Сильнее он действовал на S. aureus, В. flavum и М. glutamicus, а в отношении Е. coli и В. mesentericus активность была невыраженной. Установлена прямая зависимость типа и степени проявления АБА от концентраций испытанных КЖ и ЭМ у N. fasciculare. Южные штаммы оказались активнее северных. Наблюдаемая корреляция между био-экологическими особенностями, географическим происхождением и степенью АБА изолятов следует учитывать при дальнейшем скрининге перспективных штаммов N. fasciculare.

Аитвфувгальная активность. АФА 22 видов БМ в отношении 5 штаммов С. albicans была предельно низкой. Частичную активность проявили только МРФ из экстрактов ПТ трех ядовитых видов: N. fasciculare, P. involutus и T. tigrinum.

При совместном росте исследованных БМ с тест-микромицетами описывались три типа реакций: А - взаимное торможение обоих организмов при контакте; В - дистанционное взаимоторможение или зона отсутствия роста и С - реакция нарастания активного компонента на пассивный. Они имели сложную динамику развития и зависели от био-экологических особенностей грибов (скорость и характер роста колоний, природа субстрата, географическое происхождение ПТ и др.). Результаты показали, что во всех наблюдаемых вариантах исследованные макромицеты были активнее микромицетов. Только два вида - Aspergillus niger и A. flavus с БМ образовывали реакцию взаимонарастания, с дальнейшим нарастанием на них макромицетов.

По АФА исследованные БМ представились в следующем порядке: F. velutipes (38) > P. ostreatus (36) > L. tigrinus (33) > N. fasciculare - L. edodes = К. mutabilis = (32) > P. cornucopiae = P. varius (30) > С. cinereus (29) > Ph. aurivella (28) > Ph. adiposa (26) > L nuda = A. pantherina (22) > S. luteus = P. eryngii (20) > Ph. alnicola (18) > C. atramentarius (17) > A. mellea (15) > N. capnoides (13) > Ph. destruens (11). По ИА они были разделены на 3 условные группы: очень активные (ИА=38-32), активные (ИА=30-25) и менее активные (ИА<25). При значении ИА>13 (N. capnoides) наступала реакция нарастания между контактирующими организмами. Наибольшую АФА проявляли представители ксилотрофов, а именно виды F. velutipes, P. ostreatus, L tigrinus, N. fasciculare, L edodes и К. mutabilis. Это подтверждает наши предыдущие выводы о высокой БА и АБА ксилотрофных видов. Вторую группу составили в основном ксилотрофы и копротрофы, а третью - виды из различных экологических групп: ксилотрофы, копротрофы, гумусовые и подстилочные сапротрофы и герботроф.

По значению ИА тест-микромицеты были распределены в следующем порядке: Aspergillus niger (35) > A. flavus (24) > A. versicolor (20) > Fusarium sambucinum (11) > Pénicillium jensenii = P. simplicissimum (10) > Stemphyllium botryosum (9) > Pénicillium chrysogenum (8) > Hormiscium sp. (7) > Cladosporium atroseptum (1).

АФА мицелия N. fasciculare в отношении 21 вида микромицетов стабильно проявлялась двумя типами реакцией: В и С. Наблюдалась корреляция между био-экологическими особенностями изолятов, морфологическим типом колонии и типом проявления АФА у этого вида. Быстрорастущие южные изоляты, выделенные из лиственных пород оказались более активными (тип С), нежели северные медленнорастущие, выделенные из хвойных деревьев (тип В) (Бадалян, 1986).

Таким образом, исследованные БМ, в особенности ксилотрофы P. ostreatus, L. tigrinus, N. fasciculare, L edodes и F. velutipes обладают высокой АФА в отношении испытанных тест-микромицетов. Вместе с тем, выделение этой экологической группы, как наиболее перспективной для дальнейшего поиска БАС с антифунгальным действием не исключает поиск подобных соединений и у представителей других экологических групп БМ.

Наличие внеклеточных ферментов. Результаты показали, что виды N. fasciculare и F. velutipes по наличию лакказы, пероксидазы, амилазы, нитрат-редуктазы, целлюлазы, уреазы, ß-глюкозидазы и ксиланазы и по отсутствию липазы, полигалактуроназы, хитиназы и ламинариназы не отличаются. Из 16 тест-ферментов у N. fasciculare и F. velutipes выявились соответственно 9 и 10. Следовательно, эти виды можно рассматривать не только как источник физиологически активных метаболитов (антиопухолевые, антифунгальные, антивоспалительные и др.), но и внеклеточных ферментов.

Некоторые виды БМ обладали также выраженной протеолитической активностью (МСА и ФЛА).

Молокосвертывающая активность. Результаты показали, что ВЭ, МЭ, МРФ и ВРФ, а также КЖ всех исследованных видов в разной степени проявили МСА. Однако, выраженную активность продемонстрировали экстракты из ПТ и КЖ видов, а ЭМ и растущий на молочной среде мицелий - более слабую. ВРФ действовали быстрее, чем МРФ.

Таким образом, протеолитические ферменты - протеиназы у исследованных видов накапливаются в ПТ, а при их искусственном выращивании в основном выделяются в КЖ. У видов N. fasciculare, N. capnoides, Ph. adiposa, Ph. alnicola, L. tigrinus и L. edodes они полностью отсутствовали в мицелии.

Фибринолитическая активность. Установлено, что КЖ N. fasciculare обладает выраженной ФЛА, которая находится в зависимости от ее концентрации и био-экологических особенностей изолятов вида. Активность сильнее выражалась у южных, слабее - северных изолятов N. fasciculare.

Гемолитическая, гемакоагулирующая и гииогликемическая активность N. fasciculare. При однократном пероральном введении подопытным кроликам экстракта из ПТ этого вида в дозах 150 и 300мг/кг уже на 2 день наблюдалась адинамическая форма отравления, степень тяжести которой зависела от концентрации введенного экстракта. Симптомы нервного поражения

(учащение сердцебиения, поверхностное дыхание, похолодание и слабость конечностей) отмечались и после в/в введения экстракта животным в дозе 50мг/кг. Нейротоксическое действие N. fasciculare подтвердилось в наших дальнейших опытах (Гл. 6). Состояние животных нормализовалось спустя 3-5сут.

Результаты показали, что экстракты ПТ N. fasciculare (in vitro и in vivo), понижая OP и KP эритроцитов, способствовали ускорению гемолитического процесса у подопытных крыс. Полученные данные подтвердились дополнительными тестами по измерению объема эритроцитов и количества гемоглобина. При этом наблюдался лейкоцитоз. В применяемых концентрациях экстракты не вызывали летального исхода. Опыты in vitro показали, что КЖ и ЭМ N. fasciculare в испытанных количествах не обладали выраженной ГЛА. Высокие концентрации ЭМ и КЖ на кровяном агаре образовывали зоны гемолиза диаметром около 2мм. Установлено, что накопление гемолизинов происходит больше в ПТ, чем мицелии и зависит от экологических условий роста гриба. При искусственном культивировании мицелия они выделяются в КЖ. Таким образом, N. fasciculare может быть отнесен к группе ядовитых грибов с гемолитическим действием.

Под влиянием экстракта ПТ N. fasciculare исследованные ТЭГ-показатели менялись в сторону умеренной гиперкоагуляции, доказательством которой явилось укорочение времени реакции и общего времени свертывания, а также увеличение максимальной амплитуды кривых. Предполагается действие грибного экстракта и на органы системы свертывания крови (печень, селезенка, костный мозг).

Наблюдения показали, что через 1 -Амин после ежедневного в/б или перорального введения ВЭ N. fasciculare в дозе 50мг/кг в течение 30-60мин у подопытных диабетических крыс наблюдался паралич и похолодание конечностей, а также симптомы колик. При этом стойкого снижения гликемии не было зафиксировано. Исследования в этой области планируются продолжить с большими дозами ВЭ, а также МЭ других видов БМ.

Таким образом, результаты многоаспектных исследований физиологической активности некоторых БМ позволили выделить экологическую группу ксилотрофов, как физиологически наиболее активную, а именно виды Р. ostreatus, L. tigrinus, N. fasciculare, L. edodes, К. mutabilis и F. velutipes. Эти данные также подтверждают результаты скрининга БМ по био-экологическим и биохимическим критериям, в результате которого также выделялись эти виды. Однако приоритетный выбор ксилотрофов в качестве перспективных объектов для биотехнологии не ислключает исследования представителей других экологических групп.

ГЛАВА VI. ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ БМ

В этой главе на основании симптомов и продолжительности латентного периода приводится описание девяти основных синдромов грибных

мицетизмов: фаллоидиновый орелланиновый, гиромитриновый, мускариновый, пантериновый, псилоцибиновый, коприновый, паксилловый и гастроэнтеральный. Даются симптомы отравления, химия и фармакология активных соединений, а также методы лечения.

Оценка фармакологической активности и определение острой токсичности некоторых съедобных и ядовитых видов проводились при однократном в/б и пероральном введении МЭ из ПТ, а также полученных из них фракций (МРФ, ВРФ).

Экстракт N. {аБС1си1аге при в/б и пероральном введении в дозе 2000мг/кг вызывал сильный паралич конечностей и дыхательного центра, в результате которого животные погибли в течение 20лиш. После вскрытия изменения во внутренних органах не были обнаружены. Дозы 250-500-1000мг/кг вызывали потерю мышечной координации и активности, похолодание конечностей и птозис. Все животные погибли в течение 5сут. При дозе 1000мг/кг смерть наступала в течение 2сут, при 500л/г/кг - 3-Асут, а при 250мг/кг - 5сут. При более низких дозах процентное соотношение смертности составило: 250мг/кг -100%, 200мг/кг - 20% (в течение \-4cyr); 150мг/кг - 20% (1-всут), 100мг/кг - 10% (1-всут), 50 мг/кг - 0%. При вскрытии животных были обнаружены многочисленные язвы в желудке и внутренее кровотечение в кишечнике. Для N. {а8аси1аге Шшо=250мг/кг, а Шя=2АЗ,29мг/кг.

При дозах 250-500-1000-1500-2000л/гАт у всех животных наблюдалась мышечная релаксация, снижение двигательной активности, ослабление слухового рефлекса, нарушение вегетативной нервной системы, сопровождающиееся ухудшением дыхания и лихорадкой. Отсутствовала также реакция сцепления, наблюдалось ослабление рефлекса роговой оболочки глаза, сгибание конечностей и пертурбация автономной нервной системы: пилеоэрекция, изменения дыхания и др. Тесты на каталепсию и рефлексы положения тела были в норме. Слезоточивость и мидриазис при этом не были отмечены. В/б введение ВЭ N. ГаБС1си1аге в дозах 250-500-1000мг/кг не вызвало симптомов острой токсичности у мышей обоих полов.

Таким образом, сравнительно низкие дозы (250 и 500мг/к1) экстракта N. 1аБ<цси1аге вызывали отравление гастроэнтерального типа а высокие (1000-1500-2000мг/кг) - действовали как нейротоксин, вызывая паралич конечностей и остановку дыхания животных. В обоих случаях отравление приводило к летальному исходу.

Полученные результаты внесли окончательную ясность в степень токсичности N. /'аБаси1аге. Его можно отнести к группе смертельно ядовитых грибов с гастроэнтеральным, гемолитическим и нейротоксическим действием.

Экстракт N. сарпо1'с1еБ при в/б введении в дозе 2000мг/кг вызывал некоторые отклонения в фармакологических тестах (понижение динамической активности, групповое поведение, эрекция волосяного покрова, понижение реакции цепления), которые указывают на необходимость более осторожной интерпретации съедобности этого вида. N. сарпо1йез следует отнести к группе несъедобных грибов.

Однократное в/б введение экстракта С. агтИШиБ до 2000мг/кг не вызывал симптомов острой токсичности у животных. Отмечалось только их временное

групповое поведение. Нетоксичность вида подтвердилась данными динамики веса животных в течение двухнедельного срока эксперимента, а также результатами биохимического скрининга ПТ. Вскрытие не обнаружило патологии внутренних органов.

В/б введение различных доз экстрактов ПТ видов А. praecox, А. mellea, F. velutipes, Р. involutus и Р. ostreatus также не привело к выраженным изменениям в фармакологических тестах. Отмечались некоторые отклонения в двигательной активности животных, а также пилоэрекция, брюшные колики, диаррея, похолодание хвоста и конечностей, в частности под влиянием экстракта Р. involutus. Причем, ВРФ экстрактов вызывали большие сдвиги в тестах, нежели МРФ. С течением времени отмеченные отклонения нормализовались.

Результаты опытов при пероральном введении экстрактов ПТ F. velutipes, Р. involutus и Т tigrinum показали, что этот метод по сравнению с в/б введением вызывает больше отклонений фармакологического профиля. В испытанных дозах у тестированных видов не были отмечены случаи смертности и острой токсичности. Изменение в весе животных было в пределах нормы. Патолого-анатомические исследования не обнаружили макроскопических аномалий во внутренних органах. LD50 экстрактов была выше испытанных максимальных доз (от 250 до 1500мг/кг).

Таким образом, в условиях нашего эксперимента грибные экстракты не проявили стабильной фармакологической активности и острой токсичности, кроме экстракта N. fasciculare. В дальнейшем, наблюдаемое нейротоксическое действие экстрактов уточнялось с помощью теста Буасье, случаи диарреи или спазмолитическое действие - тестом кишечной проходимости, а аналгетическое действие - методом Косгера.

Нейротоксвческое действие экстрактов. Результаты показали, что при пероральном введении экстрактов ПТ F. velutipes, Р. involutus и Т. tigrinum наблюдался нейротоксический эффект, который выражался увеличением любознательности и двигательной активности животных (р>0.05). Изменения в любознательности были сравнительно выраженными под влиянием ВРФ из экстрактов ПТ Р. involutus (1000мг/кг) и Т. tigrinum (1200мг/кг), а изменения динамической активности - только под влиянием ВРФ (\(ХХ)мг/кг) и МРФ (1200мг/кг) Р. involutus.

Аналгетическое действие экстрактов. Статистическая обработка результатов показала, что испытанные дозы (от 800 до 1000мг/кг) экстрактов F. velutipes, Р. involutus и Т. tigrinum при пероральном введении не обладали стабильным аналгетическим эффектом. Наоборот, под влиянием испытанных грибных фракций, в частности ВРФ Р. involutus в течение первых 5мин эксперимента отмечалось усиление алгогенного эффекта, вызванный введением уксусной кислоты в начале опыта. Он выражался увеличением количества колик (р<0.05) по сравнению с контролем. Процентное соотношение данных по сравнению с контролем для ВРФ и МРФ экстрактов соответственно составило: Р. involutus -24.79 и 16.52%; F. velutipes - 4.13 и 0.20% и Т. tigrinum - 6.61 и 0.74%. Результаты показали, что ВРФ экстрактов больше усиливали болевые симптомы, нежели

МРФ. К 10-15л«ш алгогенный эффект исчезал, а к 20мин наблюдалось значительное уменьшение количества колик.

Спазмолитическое действие экстрактов. В/б введение экстрактов (от 350 до 1200мг/ki) видов А. meJJea, Р. ostreatus, N. fasciculare, Р. involutus, F. velutipes и A. praecox вызывало у животных папавериноподобный спазмолитический эффект, который выражался понижением кишечной проходимости и диарреей. Он сильнее проявился под влиянием экстракта Р. involutus, который в сравнительно низкой дозе (350мг/кг) понижал кишечную проходимость на 57.39%, затем у видов N. fasciculare, А. mellea, Р. ostreatus и F. velutipes. ВРФ экстрактов обладали выраженным эффектом по сравнению с МРФ.

Таким образом, исследованные БМ проявляли определенную фармакологическую активность. Причем, действие ВРФ из экстрактов ПТ было сильнее действия МРФ. По нашим данным ВРФ экстрактов были богаче сахарами, полисахаридами и терпеноидами. Для более конкретных выводов о связи между химическим составом фракций, а в дальнейшем и отдельных групп или отдельных соединений и их физиологической активности следует продолжить начатые совместные исследования микологов, химиков и фармакологов. Исследования в этом направлении могут представить определенный практический интерес при клиническом диагностировании грибных отравлений.

ВЫВОДЫ

1. Выявленный комплекс признаков исследованных БМ, включающий макро-(диапазон изменчивости характера и скорости роста, пигментация, образование телеоморфы в культуре и др.) и микроморфологические (наличие, морфология, частота встречаемости пряжек и кристаллов OK, типы и особенности анаморфы, гифальные видообразования и др.) характеристики мицелия и ПТ (особенности морфогенеза, строение апикулюса, способ прикрепления споры к стеригме и др.) имеет важное таксономическое значение на различных уровнях их систематических разработок. При составлении современных определителей базидиальных грибов видовые диагнозы следует дополнить не только выявляемыми признаками генеративной, но и вегетативной стадий развития этих организмов.

2. По количеству ядерного ДНК исследованные виды рода Nematoloma относятся к двум уровням плоидии: моноплоидный (N. fasciculare, N. capnoides, N. polytriclii) и триплоидный (N. sublateritium, N. radicosum). В результате оценки их эволюционной близости и филогенетической молодости в составе рода они гипотетически представлены по схеме: N. radicosum->N. subla teritium —>N. polytrichi—>N. capnoides->N. fasciculare. Относительно большой разрыв между показателями количества ДНК у N. sublateritium и N. polytrichi (15), а также у N. sublateritium и N. radicosum (11) указывает на вероятное существование другого или других видов, а может быть и внутривидовых форм между ними.

3. Предварительные результаты указывают на целесообразность продолжения исследований с включением новых образцов изученных, а также других видов рода ИетаШота. Результаты генетических анализов следует закрепить дополнительными данными био-экологических и физиолого-биохимических исследований этих грибов. Применение такого комплексного подхода позволит выявить эволюционные связи не только между видами, но и различными внутривидовыми категориями, что будет способствовать пониманию процесса видообразования внутри этой полиморфной группы организмов.

4. Межвидовые взаимоотношения исследованных БМ выражались тремя типами реакций антагонизма. Проявляющаяся закономерность в различии между показателями БА, указывающие также на степень конкурентоспособности видов с различной трофикой и происхождением показывает, что БА является относительно стабильной и ее можно включить в био-экологическую характеристику вида. Исследованные БМ сохраняют свою пренадлежность к условно разделенной по этому показателю группе грибов: очень активные, активные и мало активные. Антагонизм сильнее проявляется между ксилотрофами одной условной группы. При взаимоотношениях видов одного рода небольшой разрыв в показателях БА указывает на их возможную филогенетическую близость. Установлена корреляция между морфологическим типом колоний и степенью проявления БА у N. /азаси1аге.

5. Сравнительная оценка БА макромицетов, выявление среди них наиболее активной экологической группы или отдельных видов и проведение их дальнейшего биохимического анализа, рассматривается нами как первоначальный этап в процессе скрининга БМ по физиологической активности. Среди изученных экологических групп наибольшую БА проявляют ксилотрофы, а именно виды Р. озкеаЬиз, N. 1азаси1аге, £. ебойез, К уе1ииреБ и Ь. Идгтиз. Исследованные копротрофы, подстилочные и почвенные сапротрофы по активности уступают ксилотрофам. Однако их сравнительно низкие показатели БА не исключают поиск видов - источников БАС среди представителей этих экологических групп грибов. Выявленные био-экологические особенности мицелиального роста ксилотрофов позволяют рассматривать их в качестве удобных организмов для дальнейшего биотехнологического культивирования.

6. Внутривидовые скрещивания ксилотрофов завершались 2 типами реакцией ВН. Мицелиальный валик с выраженной ДА на агаре и каплями экссудата на месте контакта мицелиев является более сильным выражением ВН, нежели реакция ЗРГ. Последняя указывает на отсутствие полной блокады генетического обмена между вегетативно несовместимыми изолятами, результатом которого является образование зонального гетерокариона. Морфологический тип и степень проявления ВН зависят от биоэкологических особенностей контактирующих изолятов. Несовместимость сильнее выражается между географически отдаленными или растущими на различных древесных субстратах особями. По мере сближения родства скрещивающихся индивидуумов степень ВН снижается. Наблюдаемые нами

явления частичной (ЗРГ - только между воздушными гифами колоний) и полной (валик, как между воздушными, так и субстратными гифами) ВН говорят в пользу теорий как Объединенного, так и Индивидуального мицелия.

7. Результаты доказывают сложность структуры таксономического вида, комплекс которого состоит из эко- и биологических форм. Выявление динамичных и пластичных путей их эволюционного развития может послужить дополнительной информацией в области изучения видообразования у БМ. Дальнейшее установление причин ВН и механизмов ее контроля, в частности генетического будут способствовать более глубокому пониманию специфической структуры грибных популяций. Опыты по внутривидовому скрещиванию указывают на вероятное существование других, неизвестных пока механизмов контроля несовместимости у грибов. Разное, но стабильное фенотипическое проявление реакции ВН в культуре позволяет судить о видоспецифичности этого явления у исследованных ксилотрофов.

8. Биохимический скрининг экстрактов ПТ и мицелия показал, что по составу тестированных соединений они мало отличаются. Этот факт подтверждает важность усовершенствования методов культивирования мицелия, в качестве источника пищевого и кормового белка, ферментов и БАС. Такой подход исключает длительную и трудоемкую стадию получения ПТ в культуре и способствует охране природных ресурсов грибов.

9. Все тестированные группы соединений, кроме танинов в различных количествах выявились в исследованных грибных образцах. ВРФ из экстрактов ПТ были сравнительно богаче сахарами и терпеноидами, а МРФ -алкалоидами, аминокислотами, нингидрин-положительными и индольными соединениями. Для БМ особенно характерны маннитол, арабитол, трегалоза, 4-гидроксибензойная кислота, холин, кортинарин А, аланин и серин.

10. Исследованные БМ синтезируют ряд активных метаболитов (фенольные соединения, терпеноиды, алкалоиды, полисахариды и др.), что позволяет рассматривать их в качестве природного источника БАС. Многие из них в условиях in vivo и in vitro проявляют антибактериальную, антифунгальную, протеолитическую (молокосвертывающая, фибринолитическая,), гемолитическую и гемакоагулирующую активность. Они также обладают спазмолитическим, нейротоксическим, алгогенным действием. Однако перед промышленным внедрением этих организмов необходимо продолжить исследования по выявлению механизмов действия выделяемых активных соединений и их структура-активность взаимосвязей. Уточнение этих параметров позволит целенаправленно включить отобранные виды БМ в процесс получения биопрепаратов с разноаспектным действием, а также использовать их в качестве сырья в нетрадиционной медицине и других областях народного хозяйства.

11.Результаты исследования гематологических показателей и острой токсичности отнесли N. fascicuiare к группе смертельно ядовитых грибов с гастроэнтеральным, гемолитическим и нейротоксическим действием. Низкие дозы МЭ гриба при в/б и пероральном введении вызывают мицетизм с

гастроэнтеральным и гемолитическим синдромами с длинным латентным периодом, а высокие дозы - поражение нервной системы, паралич конечностей и остановку дыхания, с коротким латентным периодом. Для мышей женского пола в условиях нашего эксперимента 1Х>зо = 2А3.29мг/кг. В/б введение ВЭ N. /аБаси1ате в испытанных дозах не вызывает выраженных симптомов токсичности у мышей обоих полов и не проявляет гипогликемической активности в дозе 50мг/кг. Отмеченные некоторые сдвиги в фармакологических показателях под влиянием экстракта N. сарпо1с1е5 в дозе 2000мг/кг позволили отнести его к группе несъедобных грибов. Пероральный метод введения экстрактов БМ по сравнению с в/б вызывает больше отклонений в фармакологических тестах. Результаты биохимического скрининга и фармакологической активности изученных БМ могут найти практическое применение в клинической токсикологии при диагностировании грибных отравлений.

12. В результате многоэтапного и комплексного скрининга БМ по морфологическим, экологическим и физиолого-биохимическим критериям выделена группа ксилотрофов (в частности виды Р. ояЬеаШз, N. 1азаси1ате, Р. увЫПреБ, Ь. еёоёеэ и Ь. ИдппиБ) в качестве наиболее перспективной и удобной для дальнейшего внедрения в биотехнологическую промышленность. Многие представители этой трофической группы - продуценты БАС с разноаспектным терапевтическим действием входят в группу высших лекарственных грибов. Однако их приоритетное выделение не исключает поиск природных источников активных и ценных соединений среди представителей других эколого-трофических групп БМ.

13. Комплексный подход в современных микологических исследованиях будет в целом способствовать не только изучению грибного биоразнообразия на видовом, популяционном и экосистемном уровнях, но и построению более совершенных филогенетических систем, отражающих реальные пути эволюционного развития этих организмов.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бадалян С.М., 1986. Биол. ж. Армении 39(4): 319-322.

2. Бадалян С.М., 1993. Систематика, Био-экология и Физиологическая Активность Серно-желтого опенка. Ереван, 193с.

3. Бадалян С.М, Никнщенко М.Н., 1990. Биол. ж. Армении 44(1): 74-76.

4. Бадалян С.М., Дараков О.Б., 1990. Микол. и фитонатол. 24: 201-206.

5. Бухало A.C., 1988. Высш. съед. базидиом. в чистой культуре. Киев, 144с.

6. Вассер С.П., 1985. Агариковые грибы СССР. Киев: Наук, думка, 184с.

7. Гарибова Л.В., 1980. Микол. и фитонатол. 14(2): 166-175.

8. Гарибова Л.В., Мокеева В.Л., 1976. Микол. и фитонатол. 10(1): 53-56.

9. Гарибова Л.В., Бадалян С.М., 1986. Биолог, науки (11): 64-68.

10.Гарибова Л.В., Бадалян С.М., 1988. Вести. МГУ, Сер. Биол., 16(2): 52-56.

11.Гарибова Л.В. и др., 1991. Биол. науки. 333(9): 92-101.

12.Гарибова Л.В. и др., 1986.Микол. и фитонатол. 20(3): 161-167.

13.Егоров Н.С., 1979. Осн. учения об антибиот. М.: Высшая школа, 445с.

\ А.Методы органической химии, 1967. П/р А. Вейсберга. М.: Химия, 531с. \ 5.Методы эксперимент, микологии. 1982. П/р В.И Билай. Киев, 650с. Ш.Ойвин И.А., 1959. Ж. пат. физиол. и жен. теран. 4(2): 76-85.

17.Плотичер С.М., 1965. Лабор. диагностич. исследования. Киев, 515с.

18.Поллард Дж., 1982. Снравоч. но вычислит, методам статист. М., 344с.

19.Радзиевская М.Г., Бобко И.Н., 1985. Микол. фитонатол. 19(5): 394-398.

20.Решетников C.B., Дудка И.А., 1983. Микол. фитонатол. 17(2): 107-111.

21.Терсков И.А., Гительзон И.И., 1967. Вопр. биоф. биох..., М., 47-48.

22.Andary С., 1975. Thèse d'Etat en Pharmacie, 337p.

23.Andary С., Enjalbert F. et al., 1977. J. Chromat. 132(4): 525-532.

24.Andary C., Bourrier M.J., Hapert R., 1988. Cryptogam., Mycol. 9(3): 277-288.

25.Badalyan S.M., Rapior S .et al., 1994. Cryptogamie, Mycol. 15(4): 223-228.

26.Behrens В., Karber G., 1935. Arch. Exp. Path. Pharm. 177: 379-388.

27.Bresinsky A., Fischer M. et al., 1987. Mycologia 79(2): 234-245.

28.Brodie H.J., 1936. Amer. J. Bot. 23(5): 309-327.

29.Buller A.H.R., 1931. Researches on fungi. IV. London: Longmans, 293p.

30.Buller A.H.R., 1934. Researches on fungi. VI. London: Longmans, 224p.

31.Courtecuisse R., Duhem В., 1994. Guide Champ. France d'Europe, 476p.

32.Cole C.T., Sampson R.A., 1979. Patt. Devel. Conid. Fungi. London, 106-123.

33.Haksworth D.L, Sutton B.C., Ainsworth G.C. (ed.), 1983. Ainsworth and Bisby's dictionary of the Fungi. 7ed. Surrey, Kew, 634p.

34.Hashioka Y., 1971. Rept. Tottori Mycol. Inst. (9): 1-10.

35.Flegler S.L., Hooper G.R., 1978. Ibid. 60(6): 1181-1190.

36.Frey-Wyssling A., 1981. Amer. J. Bot. 68(2): 130-141.

37.Johnson I.F., Curl E.A. 1978. Methots Res. Ecol. Soil. Minnesota, 325p.

38.Kendrick В., Watling R., 1979. The Whole Fungus. Ottawa, 2: 473-545.

39.Larrson K.-H., 1994. Micol. Res. 98: 1153-1172.

40.U C.Y., 1983. Mycologia 75(3): 562-566.

41.Meixner В., Bresinsky A., 1988. Trans. Br. Mycol. Soc. 90(2): 175-180.

42.Mims C.W., Thurston E.L., 1979. Can. J. Bot. 57; 2533-2538.

43.Molitoris H.P., Schaumann К., 1986. In: Biol. Marine Fungi. Cambr., 35-47.

44.Moser M., 1978. Kl. Kryptog. Flora. 11(2): 532.

45.Quattelbaum E.C., Carner G.R., 1980. Can. J. Bot. 58: 1700-1703.

46.Rapior S., Andary C., Privât G., 1988. Mycologia 80(8): 741-747.

47.Rapior S., Vassas A., De la Fuente A.T. et al, 1990. Mycol 82(3): 243-248.

48,Singer R., 1986. The Agaricales in Modern Taxonomy. Koenigstein, 981 p.

49.Stahl E., 1969. Thin-layer chromatography. Berlin, 1041p.

50,Stalpers J.A., 1978. Study in Mycology. 16: 1-248.

51.Todd N.K., Rayner A.D.M., 1980. Fungal individual. Oxford, 56: 331-354.

52.Thompson W., 1984. In: Ecol. Physiol. Fungal Mycelium, 185-214.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ C.M. БАДАЛЯН

1. Мелик-Хачатрян Дж.Г., Аветова С.Г., Бадалян С.М., 1081. Влияние экстракта карпофоров ядовитого шляпочного гриба Hypholoma fasciculare (Fr.) Kumm. на некоторые показатели красной периферической крови. Биол. ж. Армении 34(6): 637-640.

2. Аветова С.Г., Мелик-Хачатрян Дж.Г., Бадалян С.М., 1981 Влияние перорального введения бульона шляпочного гриба Hypholoma fasciculare (Fr.) Kumm. на морфо-функциональные показатели красной крови. Биол. ж. Армении 34(9): 952-955.

3. Мелик-Хачатрян Дж.Г., Захарян А.П., Бадалян С.М., 1982. О гемолитических свойствах Hypholoma fasciculare (Fr.) Kumm. Микол. и фитонатол. 16(3): 230236.

4. Гарибова Л.В., Бадалян С.М., 1985. Влияние температурного режима и кислотности среды на рост штаммов Nematoloma fasciculare (Huds. : Fr.) Karst. Биол. ж. Армении 38(10): 870-875.

5. Бадалян С.М., Мелик-Хачатрян Дж.Г., 1985. Экологическая и физиологическая характеристика Hypholoma fasciculare (Fr.) Kumm произрастающего в разных биогеоценозах. Матер. III Всес. конф. Изучение грибов в биогеоценозах, Ташкент, 13-14.

6. Мелик-Хачатрян Дж.Г., Бадалян С.М., 1985. Бактериостатическая активность культуралыюй жидкости ядовитого гриба Hypholoma fasciculare (Fr.) Kumm. Тез. X научн. симп. микол. и лихенол. прибалт, респ. и Белоруссии Грибы и лишайники в экосистеме, Рига, Латвия, 93-95.

7. Бадалян С.М., 1986. Антифунгальная активность шляпочного гриба Nematoloma fasciculare (Huds. : Fr.) Karst. Биол. ж. Армении 39(4): 319-322.

8. Бадалян С.М., 1986. Таксономическая оценка некоторых признаков вида Nematoloma fasciculare (Huds. : Fr.) Karst. Ученые записки ЕГУ 161(1): 109-114.

9. Бадалян С.М., Мелик-Хачатрян Дж.Г., 1986. Бактериостатическая активность экстракта мицелия ядовитого гриба Nematoloma fasciculare (Huds. : Fr.) Karst. Матер. VII Закавк. конф. по спор. раст. Ереван, Армения, 24-25.

Ю.Гарибова Л.В., Бадалян С.М., 1986. Морфолого-культуральные признаки мицелия чистых культур штаммов вида Nematoloma fasciculare (Huds. : Fr.) Karst. Биол. науки МГУ (II): 64-68,

П.Мелик-Хачатрян Дж.Г., Григорян К.В., Бадалян С.М., 198S. Определение аккумулирующей активности некоторых шляпочных грибов в отношении тяжелых металлов (Cu, Pb). VII Закавк. конф. по спор. раст. Ереван, Армения, 57.

12.Гарибова A.B., Мелик-Хачатрян Дж.Г., Бадалян С.М., Дараков О.Б., 1986.

Анаморфа в цикле развития Nematoloma fasciculaie (Huds. : Fr.) Karst. Микал. фитопатол. 20(3): 161-166.

П.Мелик-Хачатрян Дж.Г., Бадалян С.М., 1987. Материалы по исследованию физиологической активности шляпочного гриба Hypholoma fasciculare (Fr.) Kumm. В сб.: Вопросы биологии. Ереван, 122-134.

14.Бадалян С.М., 1988. Взаимоотношения штаммов Nematoloma fasciculare (Huds. : Fr.) Karst, и агариковых грибов из различных эколого-трофических групп in vitro. Тез. докл. IV Всес. конф. Изучение грибов в биогеоценозах. Перм, Россия, 117.

15.Гарибова AB., Бадалян С.М., 1988. Изучение индивидуализма у грибов на примере ложноопенка серно-желтого - Nematoloma fasciculare (Huds. : Fr.) Karst. Вестник МГУ. Сер. Биология 16(2): 52-56.

16.Badalian S.M., 1989. Nematoloma fasciculare (Huds. : Fr.) Karst, as a perspective object for biotechnology. Abstr. of 10th Congr. of Europ. Mycologists. August 2530, Tallinn, Estonia, 10.

17.Бадалян C.M., 1990. Фитотоксическая активность мицелия ядовитого шляпочного гриба - ложноопенка серно-желтого (Nematoloma fasciculare (Huds. : Fr.) Karst.). Ученые записки ЕГУ 165(1): 118-124.

18.Badalian S.M., 1990. Study of Nematoloma fasciculare (Huds. : Fr.) Karst, with Scanning Electron Microscope. Abstr. 4th Intern. Mycol. Congress. IB-67/1. Regensburg, Germany, 67.

19.Бадалян C.M., Дараков О.Б., 1990. Изучение тяжей и ризоморф Nematoloma fasciculare (Huds. : Fr.) Karst, и Agaricus bisporus (J. Lange) Imbach с помощью сканирующего электронного микроскопа. Микол. фитопатол. 24(3): 201-206.

20.Бадалян С.М., Никищенко М.Н., 1990. Биохимическое исследование плодовых тел ядовитого шляпочного гриба Nematoloma fasciculare (Huds:Fr.) Karst. Виол. ж. Армении44(1): 74-76.

21.Гарибова A.B., Бадалян С.М., Дараков О.Б., 1991. Изучение морфологии структурных элементов плодовых тел Nematoloma fasciculare (Huds. : Fr.) Karst, с помощью сканирующего электронного микроскопа. Биологические науки МГУ333(9): 92-101.

22.Бадалян С.М., 1992. К вопросу о таксономии и номенклатуры серно-желтого опенка (Nematoloma fasciculare (Huds. : Fr.) Karst.). Ученые записки ЕГУ 167(1): 89-95.

23.Бадалян С.М., 1993. Систематика, Био-экология и Физиологическая активность Ложноопенка серно-желтого (Nematoloma fasciculare (Huds. : Fr.) Karst.). Ереван: ЕГУ, 195с.

24.Бадалян С.М., Мелик-Хачатрян Дж.Г., 1994. Исследование съедобных агариковых грибов на нестандартных питательных средах (водоросли-агар, водоросли-гравий). Ученые записки ЕГУ 182(1): 103-108.

25.Badalyan S.M., Rapior S., Doko L., Le Quang J., Jacob M., Serrano J.J., Andary C., 1994. Investigation of primary and secondary metabolites in a chemical study of Cortinarius armillatus (A.-S.:Fr.) Fr. (Cortinariaceae, Telamonia). Cryptogamie, Mycol. 15(4): 223-228.

26.Badalyan S.M., Rapior S., Le Quang J., Doko L, Jacob M., Andary C., Serrano J.J., 1995. Investigation of fungal metabolites and acute toxicity studies from fruit bodies of Hypholoma species (Strophariaceae). Cryptogamie, Mycol. 16(2): 79-84.

27.Badalian S.M., Rapior S., 1996. Investigation of the chemical composition from fruit bodies of eight xylotrophic species (Agaricales s.l.). Proc. Ill Intern. Congr. Science and Cultivation of Edible Fungi. Ed. by Prof. L.V. Garibova. Kaschira, Russia, 21-23.

28.Бадалян C.M., Рапиор С., Доко Л., Ле Куанг Ж., Жакоб М., Андари К., Серрано Ж.Ж., 1996. Химическое и фармакологическое исследование высших грибов. I. Химический состав и фармакологическое изучение плодовых тел Cortinarius armillatus (A.-S. : Fr.) Fr. (Cortinariaceae, Telamonia). Микол. и фитопатол. 30(3): 37-42.

29.Бадалян С.М., Доко Л., Рапиор С., Жакоб М., Андари К., Мнацаканян В.А, Арутюнян Л.С., Гарибова Л.В., 1996. Химическое и фармакологическое исследование высших грибов. И. Сравнительное изучение химического состава плодовых тел и культурально-морфологических признаков некоторых видов рода Nematoloma (Fr.) Karst. Микол. и фитопатол. 30(4): 79-86.

30.Badalian S.M., 1997. Conservation of fungi in Armenia. In: Perini C. (Ed.) Conservation of fungi in Europe. Proc. of the 4th meeting the European Council of Conservation of Fungi. Vipiteno (Sterzing, Italy), University Siena, 131-133.

31.Бадалян C.M., Гарибян Н.Г., 1997. Исследование микобиоты парка "Цицернакаберд" г. Еревана. Ученые записки ЕГУ 185(1): 52-56.

32.Бадалян С.М., Гарибян Н.Г., 1997. Материалы к изучению флоры ядовитых макромицетов Армении. Ученые записки ЕГУ 185(2): 63-65.

33.Бадалян С.М., Гарибян Н.Г., 1997. Новые сведения о ядовитых макроскопических грибах республики Армения. Матер. II респ. научн. конф. Загрязнение пищевых продуктов биотич. и абиотич. контаминантами. П/р Л.А. Осипян. Ереван, 22-23.

34.Бадалян С.М., Ла Косте-Армино AM., Рапиор С., 1997. Антагонистическая активность некоторых базидиальных макромицетов по отношению к патогенным микроорганизмам. Матер. I межд. конф. Матодол. основы познания биолог, особенностей грибов - продуц. физиолог, актив, соедин. и пищевых продуктов. Донецк, Украина, 40-43.

35.Бадалян С.М., Геворкян С.А, Амбарцумян ЛА., 1997. Значение межвидивой конкуренции в популяционной структуре ксилотрофов. Матер. I межд. конф. Матодол. основы познания биолог, особенностей грибов - продуц. физиолог, актив, соедин. и пищевых продуктов. Донецк, Украина, 96-98.

36.Нанагюлян С.Г., Таслахчьян М.Г., Осипян Л.Л., Киракосян Н.Дж., Бадалян С.М., 1997. Ядовитые макроскопические грибы республики Армения и их токсины. Матер. II респ. научн. конф. Загрязнение пищев. продуктов биотич. и абиотич. контаминантами. П/р Л.Л. Осипян. Ереван, 33-35.

37.Бадалян С.М., Серрано Ж.Ж., Ле Куапг Ж., Рапиор С., Доко Л., Жакоб М., 1997. Химическое и фармакологическое исследование высших грибов. Химическое и фармакологическое исследование высших грибов. III. Изучение острой токсичности плодовых тел Nematoloma fasciculare (Huds :Fr.) Karst. и Nematoloma capnoides (Fr.) Karst. (Strophariaceae) Микол. и фитопатол. 31(1): 42-45.

38.Бадалян С.М., Мнацаканяи В.А., Арутюнян Л.С., Рапиор С., Серрано Ж.Ж., Аидари К., 1997. Химическое и фармакологическое исследование высших грибов. IV. Сравнительное изучение химического состава плодовых тел пяти ксилотрофных видов (Agaricales). Микол. и фитопатол. 31(3): 61-66.

ЗЭ.Бадалян С.М., 1998. Биологически активные соединения высших грибов. Биол. ж. Армении 51 (4), (в печати).

40.Badallan S.M., 1998. Extracellulare enzymes content in mycelium of xylotrophic fungi Nematoloma fasciculare (Huds. : Fr.) Karst. and Flammulina velutipes (Curt. : Fr.) Karst. Abstr. II Int. Symp. Plant Biotechnology. 4-8 Oct., Kyiv, Ukraine, 18.

41.BadaIlan S.M., Gevorklan S.A., 1998. Antifungal activity of species from genus Coprinus (Basidiomycotina). Abstr. II Int. Symp. Plant Biotechnology. 4-8 Oct., Kyiv, Ukraine, 17.

42.Бадалян C.M., Абрамян Дж.Г., Геворкян С.А., 1998. Исследование антифунгальной активности некоторых видов базидиальных макромицетов в совместной культуре. Биол. ж. Армении. 51(1-2): 61-67.

43.Badalian S.M., Rapior S.t Andary С. Serrano J.J., 1998. Biological active compounds of Higher fungi. Abstr. of 4th Coll. Natural products from plants, 2529 May, Ottawa, 49-50.

44.Бадалян C.M., 1999. Межвидовой антагонизм и биотическая активность некоторых базидиальных макромицетов. Материалы научной сессии посвященной 75-летию кафедры ботаники ЕГУ. Ереван: ЕГУ, (в печати).

45.Badalian S.M., Rapior S., 1999. Chemical and biological activity of wood-decaying fungi Flammulina velutipes (Curt. : Fr.) Karst. (Tricholomataceae). Материалы научной сессии посвященной 75-летию кафедры ботаники ЕГУ. Ереван: ЕГУ, (в печати).

46.Badalian S.M., Rapior S., Andary С. Serrano J.J., 1999. Higher fungi as a natural source of biological active substances. In: Reunion du Reseau de Mycologie, le 21-22 Janvier, Lille, France, (accepted).

ПОСТЕРЫ

47.Badalian S.M., Darakov O.B., 1989. Study of fruit bodies of cetrain Agarics fungi by SEM. In: 10th Congress of Europ. Mycologists. 25-30 August, Tallinn, Estonia.

48.Badalian S.M., Rapior S., Andary C. Serrano J.J., 1998. Biological active metabolites of Higher fungi. In: 4th Coll. Natural products from plants, 25-29 May, Ottawa, Canada.

49.Badalian S.M., Rapior S., Andary C. Serrano J.J., 1999. Higher fungi as a natural source of biological active substances. In: Reunion du Reseau de Mycologie, le 21-22 Janvier, Lille, France, (accepted).

ШГФПФПМГ

UmbüuilunumpjniGp БфрЦшд t puipApuilpupq uüljbpli düö luiSpJi' puiq]iqliiui duil|pnd|igbuiübpli (PU) IjbGuuipujGuiliuiG umuiGáGiuInuuilinipjniGGbpli, diuuüuii|npuiiqbu GpiuGg dnpîjinpiqliiujli, tlinpiqliuijli, plinplidliuijli, ЗДфпр^пиЦиШ L ÎJ)uipduitin|nq[iujliuiG uil|uilii|nipjmü niunidGuiulipnipjuiGp: PuiqüuipluJ b puiqduipGnijp uiqqbgntpjuidp lluiüuuipiuGuil|uiú uiljuiliiJ Gjnipbp (Ц11Ъ) uJiGpbqbpii GpuiGg hiuuilpiipjniGQ pniji t шшЦш q|iuiuiplibi uiju uGljbpji npiqbu libûuuiinbluûnpiq[iujjli IibniuGlpupuijliG opjblpnûbp: ЪршОд pGuipnipjiuG uiuui|i<íujüuil|iuli Ь ЦпйицЬри ilnuibgnidp ptiiiqplpjlii t dbp libuiuiqnumipjniliübp|i i5)i prnGJi iuuiqlil|uiübpnid:

PlT-|i ujim|mdmpii])GGbp]i L lijigbilinidji diul)pn- b i!]il¿pni!np^n[nq]iujljmú umuiüáüuiliiuuilinipjniüülipli Llblpnpnüuij|iQ ulpuGuijliG üjilipnuliniqli duidiuGuiljuili]ig úlipiiqúLpiiil munidGuiulipmpjniûGbpli uipujniüpnid фр LG I1U1G4I4 шЬшЫщ U mji uiaipunGnülilj Ijiumbqnpliuiübpp pGnipuiqpnq ú|i ¿шрр hiuinlpnûl^Gbp: Ършйр Gbpqpuii|ilbi LG niunidGuiu|ipi|tuà utiljUpli inbuuiljtujliG pGnipuiqpbpntd:

ij|ipmnb[ni| 0-Ъ1с>-|1 puiGiuljJi liiu^iIiuG gliwn.1>uninpndbmp]ilj dbpnijQ Ncmatcloma gbq]i 5 iubuuiljGbp|i dnrn huijmüuipbpi|bi t iqpijiiiliuijli bplpu' n (N. fasciculate, N. capnoides, N. polytrichi) U 3n (N. sublateritium, N. radicosum) duiljiupquiliGbp, npnGp libGuui-tlinpiqliuiljiuG L pbdnuiuipunGndlilj umuiüáüuiliuiuilpiipjniGGbpli hUin dliuiu[iG ртд UG U11II4 quiuiuliuipqbi GpuiGg рил L4n|jntg[inQ qiupqiugdiuü li ^lipiqbGbinliliuiliuiG uiinp[i¡>li uiuui[i6uiü[i. N. fascicularc-ïN. capnoides-ïN. polytrichia N. sublateritium—>N. radicosum:

L'lpiinqliiuljujG U dlilpigbGnpiqliuiljuiQ hliinuiqninnipjniGGbpQ ujuipqbi bü, np dligmbuiuliuijliG uiGinuiqnGliqrili uintjiujnipjujdp uGlibpli p]inin|ilj uilpnln|nipjiuû liuipuipbpuiliiuGnpbG IpujniG gniguiGli2Q niG)i шЬиш^р pünipiuqpnq huiinlinipjniG:

"bbpinUuuilpuj[iG |uiu¿uiubpduiG lupqjniGpnid lnujmGuipbpi|bL t, np iquiiiiuduipdliGGbpli uiuippbp luiSpüpJiG iquiuiljuifinq ri]igb|]iuiiSGbpli lijipb i|bqbwmmju| uiûIiuiiSuiiquiuiiuuIuuiGnipjniÛQ (4U) qpubnpi|niiS t quiüuiquiü шиифйиШт!' duiuûiuliJi Ipud ip|ii|, iipnGj) niGtiG шшррЬр dnp-lininqliuiljuiG uipinuihuijinnipjniG öiunuipüiulj uGtjbpJi dum: M.U-|i qpubnpduiü liuidbduiinuipuip IjiujniG pGiujpp GnijGiqbu pniji t шш||ш qjiiniupljbi tujG npiqbu шЬишЦр pGnpn¿nq ЬшшЦшй)^:

Plii)|)|id|iwliwG niunidGmu|ipnipniüfllipJi gnijg mi¡bg¡iü, np niumtfGuiu]ip(jujfr PlT-p upupinüiulpnd bG d|i ¿шрр lillV иц^шрфг^Ьр b uijl uGlpujliG uinjiuliGQbp, dnGn- b и]П||шш]ишр1щйЬр, uibpujbünlujGbp, qilitjnqliqGbp, uiuiqnGliGGbp, 4>bGn|iuj|iG, liüqn|iujliü, uiqnui iquipniGiul|nq d|iiugnipjniGül¡p U mpl^Gbp, npnGp niGbG tyjiqlinpiqliujljuiG uiqqbgnipjuiG pujG npipin b Ipupnq l*Q lilidp huiGi](iuuiGuiL Gnp ljbGumqbqmdlijngGbp]i imiujgtîuiû limdmp:

J>|iq|ininqlimlimG b ."[¡mpdmljninqlimlimü ml|mlii{nipjmG munidQmulipnipjniGGbpp puiguilimjinbg[iG Риф mnmGóliG wbuuiliGbpli tUumpmljinGbpli b GpmGg .^pmljglimGbpli liuilluipuiliinUpliuq, hmlimuGliiujliG, ^bpübGmmmliil (iqpnuihni]iinlili' Цшрр Ijinpnq b .1)|ipp|i(iniliui]ili), hbdnilimlilj, libümt{nmqntumglinG, шцищйп^шф!), miqnqbG, Gbjpnmnpu]ili шlJш|ll|пфJш(ip Ь uiGuj[qbinlilj ni 11ш1(1иг)|1шрЬш]|(1 wl{№|ii{nipjmG pmgm({mjnipjniGp: Snpulilj unip фпрйЬрр gntjg miJbgliG, np N. fasciculare-Ji Ipumprnlpnli G/n GbpuiplpiuiG qbiqpnid Gpui LD5o=243i/g/^g: ^IbpjGuilimGmiqbu б2Ш11^9. np mju шЬиш1]|1 iqunnliuiGnid t йшИшдш рпШш^пр uGljbpli ¿mppJiG b tpuuipmlimji qnqmjjig Цш^Цшб Ipupnq t шпш^шдйЬ^ uuiuidnpum-uiiilijimjliG, hbún|]iui]ili U Gbjpnuinpulili uGljmjliG pniGmi|npnnIGbp]i uliGqpndGbp: Ujuiqliuji mpqjniGpübpp, ишшд^шд йшЬ nipji2 niunidGmu{ipi]mö inbuml{Gbpli hmdmp

({iiipnq liQ ntGbGuii l|uipUnp qnpdGuiliuiG G2uiGuiljnipjniG pniGuu{npniiIGbp]i lj|liGlil|uiliuiG uiluuinpn^iSuiG diuiSiuGuilj:

liiumuipijuii) puiqiluiljnqiSuiGli hbinuiqninnipjniGGbpli uipiyniGpnuS uinuiGdGuigi]bi t uinuiijbi puipdp ^>liqlininq|il|uiG uiljuiliiJnipjniG gmguipbpuid duinuipGuil] uUljbp|i tl[n[nq|iuiliuiG [untilpp, iiiuuGiui]npiuiqUu P. ostreatus, N. fasciculare, L. edodes, F. velutipes L L. tigrinus inliuuiljCLpp: ilpiqhu pGuiljuiG liU"b-|i uiqpjnip GpuiGp, Ji uiutppbpmpjniG tfjniu UininqliuiljuiG luiIpbpjiG iquiuilpuGnq niunii!Guiulipi]ui(> inbuiuljGbpji, ¿Gnplijiil GuiL lipbGg llbGuiu-l.ljn|nqliuil[uiG uinuiGdGuiliuiuil|nipjniGGbp|i, i]liuiuiplii|niiS UG uinun{bi huipiloip ni huinuiGl{uipiujIiG libGuuiuib|uGn[nq|iiujli iSUg Gbpqpi|b|nt Giquiimulini|: Ujuiqliu|i pGuipnipjniGp, uuiliuijG, ¿]i pujguinniiS oiji Uininq|iuil[iuG |ui5pbp|iG iquiuiljiuGiiii PlT-li, npujbu WUTj-Ii uiijpjmp niuniiiGuiulipnipjniGGlipp:

"IriSiuG l|niiuiibpuuij|iG hbinuiqntnnipjntGGbpli iupi|jntGpGbpp, uiGljiuuljuid, ({tupnq tiG Giquiuinb[ PlT-li uliuinbiIuitn]il{uijniiS iquipqiupuiGnuSGLp dingGbpitG, jiGjiqbu Guib GpuiGg Gnp, liuiinuipjfui 4>liinqbGbinli(]uiliiuG huiiSiuliiupqbp uuibqdbiniG, npnGp uinuiilbi ¿¿uinipjuiilp Ipupnri bG aipuituliuijuib^ uiju puipq, ujni]itlnp3> opquiG]iqt!Gbp|i tt|nymglinG IjuiiqUpp, pGqhiuGmp uinihuilp Giquiuuibpiil quiGuiquiG UuiljuipiiuiliGbpniJ uGIjuijIiG l{bGuuipuiqt!iuquiGnipjuiG niuntiSGuiulipiiuiGp:

SUMMARY

The thesis deals with the study of the biological properties, particularly morphology, ecology, biochemistry, physiological and pharmacological activities of macroscopic basidiomicetes (MB) -one of the biggest groups of Higher fungi. The property of MB to produce biological active substances (BAS) allows these fungi to be considered as perspective objects for biotechnology. Complex and gradual screening of MB was reflected in some aspects of our investigation.

During modern microscopic observations of biological features of fruit bodies and mycelium of MB by SEM, in particular of their macro and micromorphological properties, characteristics indicating species and other taxonomic categories were revealed. They are included in the descriptions of certain species of MB.

Using the cytofluorometric method of measuring the DNA content in the nuclei, two levels of ploidy were found in 5 species from genus Nematoloma: monoploid - n (N. fasciculare, N. capnoides, N. polytrichi) and triploid - 3n (N. sublateritium, N. radicosum). Considering that haploid status of nuclei in monokaryons is phylogenetically older and with already revealed bio-ecological and chemotaxonomic properties of this species, we are able to classify them according to their evolutionary development and the degree of their phylogenetic proximity. N. fasciculare —>N. capnoides->N. polytrichia N. sublateritiumradicosum.

The ecological and micocenological investigations revealed that in the presence of interspecific antagonism the coefficient indicating the biotic activity of fungi is relatively stable and has the property of describing the species.

As a result of intraspecific pairings, the vegetative incompatibility was revealed in different levels, partially or wholly, that have different morphological expressions: gap or zone of sparse hyphae and bands of pigmented tuffed hyphae or convex line, respectively. Its stable expression in xylotrophic fungi again allows to view it as the species describing property.

The results of biochemical investigations revealed that many representatives of MB contain several BAS (alkaloids and other fungal toxins, polysaccharides, terpenoides - glycosides and

saponins, phenolic, indolic, ninhydrin-content compounds and others) with large spectrum of physiological activity and can be sources of many biopreparates.

Investigations of biological and pharmacological activities carry out antibacterial, antifungal, enzymatic (proteolytic - milk coagulating and fibrinolytic), hemolytic, hemacoagulating, spasmolytic, algogen, neurotoxic, and absence of analgesic and antidiabetic activities within different species of investigated MB. Study of the acute toxicity showed that in the case of I/P administration of methanolic extracts from fruit bodies of N. fasciculare we have LD30=243/Mg/itg\ Finally, it was clarified that N. fasciculare belongs to the group of poisonous fungi and depending on the dose of extracts it can provoke gastrointestinal, hemolytic and neurotoxic syndromes with different latent periods. Similar results were gained from other investigated species of MB. This could have important practical significance in clinical diagnosis of fungal intoxication.

During our observations, we have separately considered the species from wood-decaying ecological group of fungi, particularly P. ostreatus, N. fasciculare, L. edodes, F. velutipes and L. tigrinus for their high physiological activity. As a natural source of BAS, these species, contrary to species belonging to other ecological groups, and thanks to their bio-ecological properties, are viewed as more suitable objects for introducing in biotechnology. This selection does not preclude the study of other BMs from different ecological groups as potential sources of BAS.

The results of such complex observations can, no doubt, contribute in clarifying some aspects of the MBs systematic, as well as in improving their phylogenetical systems. These new systems will provide more information and can precisely indicate the evolutionary relationship between polymorphe species of Higher fungi, thus, generally contributing to the investigation on variety levels of fungal biodiversity: ecosystems, populations or species.

Информация о работе

Бадалян, Сусанна Михайловна
доктора биологических наук
Ереван, 1998
ВАК 03.00.05

Автореферат

Похожие работы