Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование внутривидового полиморфизма штаммов Ganoderma lucidum (W. Curtis: Fr.) P. Karst.

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Исследование внутривидового полиморфизма штаммов Ganoderma lucidum (W. Curtis: Fr.) P. Karst."

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

ПОСТНОВА uud4B7598

Евгения Леонидовна

ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРИВИДОВОГО ПОЛИМОРФИЗМА ШТАММОВ Ganoderma lucidum (W. Curtis:Fr.) P. Karst.

Специальность 03.00.24 - микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

2 з ДП Р 2GG3

003467598

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель

кандидат биологических наук Инсарова Ирина Давидовна

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Краснопольская Лариса Михайловна доктор биологических наук Терехова Вера Александровна

Ведущая организация

ФГОУ ВПО Пензенская государственная сельскохозяйственная академия

Зашита диссертации состоится 15 мая 2009 года в 15:30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 при Биологическом факультете МГУ имени. М.ВЛомоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет (аудитория М-1). Т/факс: (495) 939-39-70

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан 15 апреля 2009 года

Ученый секретарь

диссертационного совета,

М.А. Гусаковская

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Комплексный вид Ganoderma lucidum (W. Curtis:Fr.) P. Karst, объединяет внутривидовые группы, филогенетическая концепция которых до сих пор не разработана (Moncalvo, 2000; Wasser et al., 2006).

Значительные трудности при описании штаммов данного вида гриба по морфологии и культуральным свойствам вызваны их высокой степенью вариабельности в зависимости от условий культивирования (Seo, Kirk, 2000). Представители данной группы грибов являются объектом пристального внимания многих исследователей. Прежде всего это связано с поиском биологически активных веществ, нашедших широкое применение в медицине и фармакологии. Ganoderma lucidum - безусловный лидер среди целебных грибов Востока. В Китае уже в течение двух тысяч лет этот гриб эффективно используют для лечения различных заболеваний (Stamets, 1993; Chang, Miles, 2004; Wasser et al., 2006). В нашей стране также предпринимаются попытки создания биологически активных добавок на основе базидиом и мицелия, полученного методом погруженного культивирования (Краснопольская с соавт., 2003; Автономова, 2006). Использование афиллофороидных базидиомицетов в масштабах промышленного культивирования подразумевает строгий биологический контроль материала. Однако многие авторы отмечают, что большой процент штаммов, применяемых в народной медицине стран Азии и Востока и описанных как G. lucidum, ошибочно относят к данному виду, а характеристика изолятов, ограниченная лишь описанием морфологии базидиом и вегетативной стадии, недостаточна и часто не может быть удовлетворительной (Hseu et al., 1996; Buchanan, 2001). Высокая гетерогенность комплексного вида G. lucidum была подтверждена и современными молекулярными методами (Moncalvo et al., 1995; Hseu et al., 1996; Buchanan, 2001). Молекулярно-филогенетический анализ американских, азиатских и европейских коллекций G. lucidum с использованием маркеров рДНК позволил выделить несколько внутривидовых групп (Moncalvo, 2000). Однако отсутствие корреляции между филогенией по рДНК и разделением комплекса G. lucidum по морфологическим признакам вынуждает продолжать поиск молекулярных маркеров, способных стать исчерпывающим критерием при описании штаммов.

Цель работы.

Исследовать штаммы комплексного вида Ganoderma lucidum с использованием различных подходов и выявить признаки, значимые для характеристики внутривидовых групп.

Задачи.

1. Изучить морфологию вегетативной стадии штаммов G. lucidum (макро- и микроморфологию мицелия).

2. Исследовать способность штаммов G. lucidum к плодоношению в искусственных условиях.

3. Провести анализ вегетативной несовместимости и репродуктивной изоляции штаммов G. lucidum.

4. Изучить изоферментный и RAPD-полиморфизм штаммов G. lucidum.

5. Оценить значимость использованных методов для характеристики внутривидовых групп G. lucidum.

Научная новизна.

Впервые проведен детальный сравнительный анализ внутривидового разнообразия штаммов G. lucidum различного географического происхождения на основе морфологических, генетических, биохимических и молекулярных признаков.

Показано, что культурально-морфологические признаки штаммов G. lucidum, относящихся к различным интерстерильным группам, несмотря на репродуктивный барьер, четко не дифференцированы.

Использованный в RAPD-анализе набор праймеров подтвердил правомочность выделения интерстерильных групп внутри вида G. lucidum. С помощью RAPD-маркеров впервые был выявлен ДНК-фрагмент, специфичный для вида G. lucidum.

Показано, что модификация субстрата для культивирования G. lucidum путем добавления дрожжевого экстракта оказывает стимулирующее влияние на плодообразование.

Практическая значимость.

Полученные в настоящем исследовании результаты важны для понимания внутривидовой структуры комплексного вида G. lucidum. Поскольку использованные в данной работе штаммы G. lucidum обладают противоопухолевой и антибактериальной активностью (Краснопольская с соавт., 2003; Автономова, 2006), выяснение внутривидового статуса данных штаммов G. lucidum не только обеспечит возможность сравнения с другими

известными штаммами, но и позволит описать новые источники биологически активных веществ.

При поверхностном культивировании на агаризованных средах обнаружена и исследована способность некоторых штаммов к образованию атипичных плодовых тел, формирующих жизнеспособные базидиоспоры. Поскольку культивирование базидиом данного ксилотрофного базидиомицета -длительный и трудоемкий процесс, получение генетического материала непосредственно на чашках Петри имеет немаловажное прикладное значение.

Предложен состав субстрата, позволяющий сократить сроки плодообразования, что важно для разработки методов культивирования базидиом штаммов G. lucidum.

Апробация работы.

Результаты исследований были доложены на конференциях: конференция, посвященная 85-летию кафедры микологии и альгологии МГУ имени М.В.Ломоносова (Москва, 2004); Юбилейная конференция, посвященная 100-летию со дня рождения М.В. Горленко (Москва, 2008); «Современная микология в России» Второй съезд микологов России (Москва, 2008); на заседаниях кафедры микологии и альгологии МГУ имени М.В.Ломоносова.

Публикация результатов работы.

По теме диссертации опубликовано семь работ, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 111 страницах, содержит 19 таблиц и 32 рисунка. Список литературы включает 123 наименования, из них 87 зарубежные.

Благодарности автора

Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю к. б. н. Инсаровой И. Д. за внимание и общее руководство работой. Сотрудникам кафедры микологии и альгологии к. б. н. Сколотневой Е. С. за помощь, оказанную при проведении RAPD-анализа, н. с. Завьяловой Л. А. и д.б.н. Камзолкиной О. В. за помощь и советы в работе, Гололобовой М. А, Ворониной Е. Ю. Глубокая признательность всему коллективу кафедры микологии и альгологии за постоянную поддержку и внимание.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы

В главе приведены сведения об истории изучения и практической значимости вида G. lucidum, проанализированы данные о подходах, используемых в современной систематике видов рода Ganoderma (генетических, биохимических и молекулярных).

Глава 2. Материалы и методы Объекты исследования.

Объектами исследования были 9 дикариотических природных изолятов G. lucidum различного географического происхождения; 3 дикариотических изолята, выделенных тканевым методом из полученных в ходе работы базидиом; 3 дикариотических изолята, полученных при проращивании хламидоспор; 12 монокариотических штаммов, полученных из споровых отпечатков тех же базидиом. В ряде опытов для сравнения исследовали 2 штамма G. applanalum (Pers.) Pat. (табл.1). Все штаммы находятся в коллекции кафедры микологии и альгологии МГУ имени М.В.Ломоносова.

Методы исследования

Выделение чистых культур. 1) Дикариотические мицелиальные культуры

выделяли тканевым методом из базидиом, полученных интенсивным методом

культивирования. 2) Одиночные хламидроспоры, изолированные

С—

микроманипулятором, проращивали на суло-агаре и получали моноспоровые дикариотические культуры. 3) Монокариотические культуры получали из споровых отпечатков путем последовательных разведений споровых суспензий с последующим рассевом на чашки Петри содержащие сусло-агар. Морфология. Морфологию колоний дикариотических и монокариотических штаммов изучали на культурах, выращенных при температуре 25°С на агаризованном сусле (4° по Баллингу). Описание колоний вели с использованием критериев Р. Сталперса (Stalpers, 1978). Определение скорости роста. Изучение скорости роста штаммов проводили на чашках Петри диаметром 9 см на среде сусло-агар 4° по Баллингу. Диаметр колонии измеряли один раз в сутки в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Для установления температурных максимумов и оптимумов, засеянные чашки Петри инкубировали при температуре 20°С, 25°С, 30°С, 40°С.

Таблица 1. Объекты исследования

Штамм Способ выделения (ядерный статус) Год выделения/год поступления в коллекцию Место выделения

ет.2 Культура ткани (п+п) 1998/1999 Кавказ

0,2ге Культура ткани (п+п) 2002 Москва

вьгсы Моноспоровый изолят (п+п) 2002 Москва

бЬЗ Культура ткани (п+п) 1999/1999 Корея

«Л Культура ткани (п+п) —/2000 Франция

вЬ4ге Культура ткани (п+п) 2002 Москва

GL4cЫ Моноспоровый изолят (п+п) 2002 Москва

СЬ4т1 Моноспоровый изолят (п) 2007 Москва

СЬ4т2 Моноспоровый изолят (п) 2007 Москва

СЫтб Моноспоровый изолят (п) 2007 Москва

ОАт7 Моноспоровый изолят (п) 2007 Москва

015 Культура ткани (п+п) —/2001 США

СЬ5ге Культура ткани (п+п) 2002 Москва

ОЬ5сЫ Моноспоровый изолят (п+п) 2002 Москва

вЬб Культура ткани (п+п) 2001/2001 Моск. обл.

Культура ткани (п+п) 1998/1998 Моск. обл.

018 Культура ткани (п+п) 2003/2004 Кавказ

СТ,8т1 Моноспоровый изолят (п) 2007 Москва

ОЬ8тЗ Моноспоровый изолят (п) 2007 Москва

СЬ8т5 Моноспоровый изолят (п) 2007 Москва

СЬ8т9 Моноспоровый изолят (п) 2007 Москва

6Ь9 Культура ткани (п+п) 2003/2004 Кавказ

ОЬ9т1 Моноспоровый изолят (п) 2007 Москва

СЬ9т2 Моноспоровый изолят (п) 2007 Москва

СЬ9т4 Моноспоровый изолят (п) 2007 Москва

СЬ9т7 Моноспоровый изолят (п) 2007 Москва

СЬ927 Культура ткани (п+п) 1961/2008 Австрия

О.АРР926 Культура ткани (п+п) 1930/2008 Великобритания

аАРР632 Культура ткани (п+п) 1991/2008 Моск. обл.

Усювные обозначения: ОЬ- С. 1исШит, ОЬ2сЫ- моноспоровые изоляты, полученные при проращивании хламидоспор, ИЛге- штаммы, изолированные из плодовых тел тканевым методом, СЬ4т1- мноноспоровые монокариотические культуры. в-АРР- С. аррШпашт, «—»- неизвестно

- природные шта\шы

Культивирование. Выгонку плодовых тел проводили согласно методике, разработанной непосредственно для G. lucidum (Stamets, 1993). В качестве субстрата использовали: дубовые опилки, лузгу, смесь дубовых опилок и лузги в соотношении 1:1. Кроме того, была опробована собственная модификация состава субстрата: к дубовым опилкам добавляли дрожжевой экстракт в количестве 0.5-1.0% от сухой массы субстрата.

Тесты на вегетативную несовместимость. Анализ вегетативной несовместимости природных изолятов Ganoderma spp. проводили на чашках Петри с сусло-агаром путем попарного сращивания дикариотических штаммов между собой во всех возможных комбинациях (Штаер, 2006)

Тесты на половую несовместимость. Принадлежность изолятов к интерстерильным группам и определение типов спаривания (факторов половой совместимости) проводили методами мон-мон- и ди-мон-скрещиваний (Egger, 1978).

Сканирующая электронная микроскопия. Мицелий на блоке с агаром фиксировали в парах осмия (Камзолкина, 1996). После высушивания образцы напыляли смесью платина/палладий (IB-3 Coater) и исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) «Hittachi» S-405A.

Окраска ядерного аппарата. Окраску ядерного аппарата производили с использованием раствора ДАПИ по стандартной методике (Камзолкина, 1996).

RAPD-PCR анализ. ДНК выделяли из мицелия, полученного при культивировании на жидком 1,5% сусле на 10-е сутки роста по методике Diatom ™ DNA Prep 100, Биоком. Реакцию амплификации геномной ДНК проводили на программируемом термоциклере марки «Терцик» 1-й модели. Для проведения реакций амплификации использовали готовые наборы для амплификации «PCR-core», Биоком. Для RAPD-PCR анализа образцов были использованы пять олигонуклеотидных праймеров, Синтол: R1 (5'-TGCCGAGCTG-3'), R2 (5'-AGTCAGCCAC-3'), R3 (5 '-AATCGGGCTG-3'), R4 (5 '-GААACGGGTG-3'), R5 (5'-GCGATCCCCA-3') (Hseu et al„ 1996).

Электрофорез. Применяли метод вертикального электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) для пяти изоферментов: полифенолоксидаза (КФ: 1.10.3.2), малатдегидрогеназа (КФ: 1.1.1.37), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (КФ: 1.1.1.4 9), кислая фосфатаза (КФ-.3.1.3.2), неспецифическая эстераза (КФ:3.1.1.2).

Кластерный анализ. Для обработки данных, полученных при анализе изоферментного и RAPD-полиморфизма, использовали метод кластерного анализа с невзвешенным попарным средним (UPGMA). Для расчета генетических дистанций и анализа с последующей оценкой достоверности использовали программу TREECON for Windows (version 1,3b).

Глава 3. Экспериментальная часть

Исследование морфологии и условий роста вегетативной стадии дикариотических природных изолятов G. lucidum и особенностей, связанных с плодообразованием

По макроморфологическим признакам, описанным с использованием критериев Р. Сталперса (Stalpers, 1978), установленным температурным оптимумам и максимумам, а также данным анализа скорости роста, исследованные штаммы относятся к трем морфологическим типам колоний (табл. 2).

1. Для первого типа (I) характерно: белая незональная колония в виде плотной пленки, поверхность колонии порошистая; инверзум белый, мицелий образует на стенках чашки Петри обильные тяжи. Температурный оптимум 30°С, максимум 35-37°С. Колонии быстрорастущие. К этому типу относятся штаммы: GL2 (Кавказ), GL4 (Франция), GL5 (США), GL8 (Кавказ), GL9 (Крым), GL927 (Австрия).

2. Для второго типа (II) характерно: белая зональная колония с желтовато-серым плотным центром; край прижатый, поверхность порошистая; инверзум в центре колонии светло-коричневый. Температурный оптимум 27-28°С, максимум 32-33 °С. Колонии характеризуются средней скоростью роста. К данному типу принадлежит штамм GL3 (Корея).

3. Третий тип колоний (III) характеризовался твердой, плотной коркой, обычно темно-коричневой, иногда кремовой, с белыми секторами. Колонии медленно растущие, зональные, с концентрическими кругами разной структуры, поверхность колонии порошистая. Край колонии прижат, инверзум темно-коричневый. Температурный оптимум 25°С, максимум 31°С. К этому типу колоний принадлежат штаммы GL6 и GL7 из Московской области.

Таблица 2. Сравнительный анализ штаммов по морфологическим и культуральным признакам

Морфологический тип Штамм Внешний вид колоний СкОрОСТЬ роста при 25°С Наличие хламидоспор Температурный максимум/ Температурный оптимум °С

I GL2, GL4, GL5, GL8, GL9, GL927 Г 1 Й1 1- i к Более 11 мм в сутки -V- щк* 34-37/30

II GL3 Т 1 9-11 мм в сутки ' Щ:1 <■;;, 32-33/28

III GL6, GL7 Менее 8 мм в сутки нет 31/25

Общим микроморфологическим признаком для всех изученных штаммов было наличие воздушного коралловидного мицелия с регулярно присутствующими пряжками (рис. 1а). У штаммов, относящихся к первому морфологическому типу (I), были обнаружены постоянно присутствующие многочисленные структуры на однородном мицелии в виде лимоновидных образований с толстыми стенками, сидящие на короткой ножке, в 1,5-2 раза превышающие по толщине мицелий (рис. 16).

Рисунок 1. Микроморфология штаммов G. lucidum. Воздушный коралловидный мицелий с пряжками (а), хламидоспоры (б)

Эти структуры располагались как терминально, так и интеркалярно и полностью подходили под имеющееся в литературе описание хламидоспор афиллофороидных грибов (Решетников, 1991; Гарибова, 2000), в том числе, и непосредственно G. lucidum. Первое упоминание о наличии хламидоспор у G. lucidum приводится в работе Steygaert, 1967 (цитировано по Решетникову, 1991). У штамма из Кореи (GL3) такие структуры наблюдались единично, у штаммов из Московской области (GL6 и GL7) хламидоспоры не встречались (табл. 2).

С помощью микроманипулятора были изолированы одиночные хламидоспоры с мицелия трех штаммов (GL2chl, GL4chI, GL5chl). На сусло-агаре они прорастали на третьи сутки и давали типичный мицелий с пряжками.

Окраска ядерного аппарата хламидоспор раствором ДАПИ показала, что споры двуядерные.

При исследовании морфологии штаммов G. lucidum была выявлена способность чистых культур образовывать коралловидные плодовые тела на агаризованных средах (рис. 2а).

Рисунок 1. Коралловидные плодовые тела (а) и примордии (б)

Базидии и жизнеспособные базидиоспоры формировались в этом случае прямо на поверхности коралловидных плодовых тел (рис. 2а, За, б). Аналогичные структуры отмечены в работе Сео и Шин (Seo, Shin, 1995) при исследовании штаммов G. lucidum из Кореи и Папуа Новой Гвинеи и были названы авторами атипичными плодовыми телами (АПТ). Анализ всей нашей коллекции показал, что базидии и базидиоспоры формировались прямо на поверхности АПТ штаммов из Кореи (GL3) и Крыма (GL9) (рис. 2а, За, 36), а также на апикальных частях примордиев у штаммов с Кавказа (GL8) и из Франции (GL4) (рис. 26).

Примордии штаммов СЬ2, ОЬ5, и СТ.927 базидии и базидиоспоры не образовывали. Изученные штаммы арр1апаШт атипичных плодовых тел не формировали.

Рисунок 3. Базидии (а) и базидиоспоры (б), образованные АПТ штамма G. lucidum из Кореи (GL 3)

Исследование микроморфологии АПТ показало, что они сформированы вегетативными и скелетными гифами, а также кутикулярными клетками. Установлено, что такие абиотические факторы, как освещенность, аэрация, pH и некоторые источники углеродного и азотного питания не влияют на способность к образованию АПТ, а, следовательно, данный признак может считаться штаммовым.

Наиболее надежным способом установления вида в культуре является идентификация нормально развитых типичных базидиом, образующихся при культивировании.

Плодовые тела получали по методике В. Стэйметса разработанной специально для G. lucidum. Были использованы четыре варианта субстрата: 1-лузга, 2- дубовые опилки, 3-смесь лузги и дубовых опилок в соотношении 1:1. Четвертый вариант представлял собой предложенную в данной работе модификацию, к дубовым опилкам был добавлен дрожжевой экстракт в количестве 0.5-1.0 % от сухой массы субстрата (табл. 3).

Для формирования плодовых тел наиболее благоприятным оказался четвертый вариант. Были не только получены базидиомы у штаммов, ранее не плодоносивших, но и сроки получения плодовых тел сократились на 5 - 10 суток. Следует отметить, что примордии были получены для всех штаммов.

Таблица 7. Плодоношение на различных субстратах (сутки)

Штаммы Опилки Лузга Опилки+лузга (1:1) ¡ШРзЩштс^Н

СЬ2 (35-38) (40-45) (40-45) (29-34)

вьз (37-40) (45-50) - (32-36)

С 1,4 (35-40) (37-49) (35-40) (30-33)

в 1.5 (34-45) - - (30-35)

- - - -

СЬ7 - - - -

СЬ8 - - - (30-35)

СЬ9 - - - (30-35)

СЬ927 - - - -

Типичные для вида лакированные веерообразные базидиомы получены у штаммов из Крыма (вЬ2), Кавказа (ОЬ2, ОЬ8) и США (вЬ5) (рис. 4а). Штамм из Франции (вЬ4) формировал консолевидные матовые базидиомы (рис. 46). Штамм СЬЗ из Кореи образовывал базидиомы, именуемые в литературе «Оленьи рога» (81ате1з, 1993) (рис. 4в).

Рисунок 4. Плодовые тела, полученные методом ¿.д,^енсивного культивирования: а) лакированные базидиомы; б) матовые базидиомы; в) «оленьи рога»

Из полученных базидиом штаммов ОЬ2, вЬ4, СЬ5 были реизолированы тканевым методом культуры и названы ОЬ2ге, СЬ4ге, ОЬ5ге, морфология которых при дальнейшем изучении оказалась идентичной морфологии исходных штаммов.

Вегетативная несовместимость и репродуктивная изоляция штаммов

G. lucidum

Достоверное разграничение видов в современной микологии является сложнейшей проблемой, т. к. многие грибные популяции в природе представлены генетически сходными клонами, возникающими в результате бесполого размножения, причем клональную природу имеют и многие высшие базидиальные грибы, регулярно формирующие половые структуры (Шнырева с соавт., 2003).

Для установления генетических границ одной особи используют тест на вегетативную несовместимость, заключающийся в попарном сращивании дикариотических мицелиальных культур на агаризованных средах. Фенотипическим проявлением реакции вегетативной несовместимости считается мицелиальный валик или барраж, образующийся в зоне контакта культур.

Нами был проведен тест на вегетативную несовместимость дикариотических природных изолятов коллекции.

Наиболее сильный антагонистический ответ был отмечен при сращивании штаммов G. lucidum с двумя дикариотическими штаммами G. applanatum (рис. 5а). Менее сильная реакция вегетативной несовместимости отмечалась при сращивании штаммов G. lucidum между собой во всех возможных комбинациях (рис. 56). И лишь в зоне контакта 2-х мицелиев, принадлежащих к одному штамму, активно образовывались анастомозы с последующим слиянием (рис. 5в).

Рисунок 5. Результаты теста на вегетативную несовместимость: антагонистические реакции - сильная (я), умеренная (б); совместимость (в)

Образование барража при сращивании внутри вида G. lucidum позволяет заключить, что исследуемые штаммы не являются клонами, а представляют собой генетически различные индивидуумы.

Показано, что генетическая эволюция многих грибов, приводящая к полной или частичной репродуктивной изоляции (интерстерильности), опережает морфологическую эволюцию, и зачастую некоторые морфологические виды представляют собой ассоциации видов-двойников (Дьяков, 1993). Чтобы внести ясность и избежать недоразумений при разделении видов базидиальных грибов, проводят анализ генетической (репродуктивной) изоляции между особями (Adaskaveg et al., 1986, Шнырева с соавт., 2003).

Вид G. lucidum обладает типичной тетраполярной, или двухфакторной, системой гомогенной несовместимости (Adaskaveg, Gilbertson, 1986). Для проведения фертильных (совместимых) скрещиваний необходимы различия по обоим факторам совместимости, т. е. гибридизация возможна только между монокарионами, гетероаллельными по каждому фактору.

Тетраполярный тип половой несовместимости позволяет выделить для каждой интерстерильной группы по четыре монокариотических штамма-тестера.

Для трех штаммов (GL4, GL8, GL9) было получено по 12-15 моноспоровых монокариотических культур. Были проведены мон-мон скрещивания и выделены три набора тестеров (по четыре монокариотические культуры с различными факторами спаривания).

Таблица 4. Выделение интерстерильиых групп

GL4 GL8 GL9

4ml 4nl2 4m(> 4m7 8ml Snil 8m5 8m9 9m 1 9m2 9m7 9m7

4ml - + - - - - - - - - - -

О 4m2 + - - - - - - - - - - -

•и 4m6 - - - + - - - - - - - -

4ra7 - - + - - - - - - - - -

8ni 1 - - - - - - - + + + + +

О 8m3 - - - - - - + - + + + +

г 00 8m5 - - - - - + - - + + + +

8m9 - - - - + - - - + + + +

9ml - - - - + + + + - - + -

о 9m2 - - - - + + + + - - - +

sO 9m7 - - - - + + + + + - - -

9m7 - - - + + + + - + - -

Условные обозначения: «+»- образование пряжек, т. е. половая совместимость штаммов; «-»-отсутствие пряжек, репродуктивный барьер.

Скрещивания между тестерами показали, что штамм из Франции (6Ь4) относится к одной интерстерильной группе, а штаммы с Кавказа и из Крыма (СЬ8 и ОЬ9, соответственно) к другой (табл. 4).

Уточнение принадлежности к выделенным интерстерильным группам остальных дикариотических штаммов провели с использованием ди-мон-скрещиваний (новый дикарион образуется за счет слияния гиф первичного монокариотического мицелия с гифами дикариотического мицелия) (табл. 5). Из полученных данных видно, что штамм из Австрии (йЬ927) вошел в интерстерильную группу, образованную штаммом из Франции (СТД), а штамм с Кавказа (ОЬ2) - в интерстерильную группу штаммов южных регионов (ОЬ8 -Кавказ и СЬ9 -Крым). Штаммы из Кореи (вЬЗ), США (вЬ5) и Московской области (СТ.6 и вЬ7) не вошли ни в одну из выделенных интерстерильных групп, что позволяет предположить их репродуктивную изоляцию.

В то же время показано, что дикариотизация в ди-мон скрещиваниях может происходить нерегулярно. В литературе это объясняется либо частичной репродуктивной изоляцией, либо погрешностью метода (Шнырева с соавт., 2003).

Таблица 5. Установление принадлежности дикариотических природных изолятов к выделенным интерстерильным группам

ал вЬ8

4ш1 4ш2 4шб 4 т7 8ш1 8шЗ 8ш5 8ш9 9ш1 9ш2 9ш4 9ш7

сьг - - - + + + + + + + +

ви - - - - - - - - - - - -

- - - - - - - - - - - -

С15 - - - - - - - - - - - -

Ы6 - - - - - - - - - - - -

С1Л - - - - - - - - - - - -

- - - - - - - - + + + +

СЬ9 - - - - + + + + - - - -

+ + + + - - - - - - - -

Условные обозначения: «+»- образование пряжек, т. е. половая совместимость штаммов; «-»-отсутствие пряжек, репродуктивный барьер.

Сопоставление результатов анализа репродуктивной изоляции и данных,

полученных при исследовании морфологических признаков, позволило

заключить, что обе интерстерильные группы при над л сжат к одному морфологическому типу.

Молекулярный и биохимический анализ штаммов С. lucidum

При недостатке морфологических характеристик для идентификации изолятов различных видов многие исследователи обращаются к белковым и молекулярным маркерам, способным обеспечить большим количеством значимых для оценки изменчивости признаков. С помощью молекулярных маркеров была показана высокая гетерогенность комплексного вида G. lucidum (Moncalvo, 1995; Hseu et al., 1996; Buchanan, 2001). Молекулярно-филогенетический анализ американских, азиатских и европейских коллекций G. lucidum с использованием маркеров рДНК позволил выделить несколько внутривидовых групп (G. lucidum sensu stricto, G. resinaccum complex sensu lato, G. curtisii complex, G. tropicum complex sensu lato) (Moncalvo, 2000). Однако отсутствие корреляции между филогенией по рДНК и морфологическим разделением комплекса G. lucidum стимулирует поиск новых молекулярных маркеров, способных стать исчерпывающим критерием при описании штаммов.

В нашей работе был использован метод RAPD-PCR, чувствительность которого отвечает требованиям исследований, касающихся изменчивости внутри вида G. lucidum. RAPD-полиморфизм данной выборки был исследован с использованием десятичленных олигонуклеотидных праймеров, уже продемонстрировавших свою эффективность на большой группе штаммов, относящихся к роду Ganoderma (Hseu et al., 1996). В ходе работы была обнаружена высокая степень молекулярного полиморфизма исследуемой выборки.

Наибольшее количество вариабельных полос было получено с праймерами Rl, R3 и R5.

При сравнении молекулярных профилей (паттернов амплификации), полученных с помощью праймера R1, был обнаружен фрагмент размером 620 п.н. (пар нуклеотидов), проявляющийся только у штаммов G. lucidum. В составе RAPD-спектров штаммов G. applanatum данный фрагмент не присутствовал, что позволило предположить видоспецифичность полученного фрагмента (рис. 6).

м GI2 GI3 GI4 GI5 GI6 GI7 GI8 019 G1927 fefffi Ga|¡p02 1,1

Рисунок 6. Электрофореграмма RAPD-полиморфизма штаммов Ganoderma spp., полученная при использовании праймера R1 (стрелкой обозначен фрагмент, видоспецифичный для штаммов G. lucidum; м - маркер GeneRuler™ Ikb DNA Ladder, Fermentas, размеры маркерных фрагментов (п.н.) указаны справа от фотографии). Gl - G. lucidum ; Gapp - G. applanation

Полученные методом RAPD-PCR результаты были обработаны с помощью метода кластерного анализа. Все дендрограммы обладали сходной топологией, а наиболее устойчивой оказалась дендрограмма, построенная на основе анализа суммарной матрицы по всем паттернам амплификации (среднее значение индекса бутстрепа 82%) (рис.7).

0.4 ».3 0.2 0.1

ч-1-1-----

Рисунок 7. UPGMA-дендрограмма генетического сходства RAPD-профилей штаммов

Ganoderma spp

Основной кластер дендрограммы включил все штаммы G. lucidum. Штаммы вида G. applanalum образовали отдельную внешнюю группу, монофилия которой поддерживалась высокими значениями индекса бутстрепа (до 100%). Данные кластерного RAPD-анализа подтвердили высокую гетерогенность вида G. lucidum, объединяя штаммы на протяжении широкого интервала условных единиц генетической дистанции (от 0,1 до 0,42) (рис. 7).

Внутри вида G. lucidum на полученной дендрограмме можно видеть три стабильные группы изолятов: «А» - штаммы с Кавказа (GL2, GL8) и из Крыма (GL9), «В» - штаммы из Франции и Австрии (GL4 и GL927, соответственно) и «С»- штаммы из Московской области (GL6 и GL7) (рис.

7).

Полученные группы штаммов характеризовались высокой степенью гомогенности RAPD-маркеров (индекс бутстрепа для групп «В» и «С» - до 100%, для группы «А» - до 97%). Представленные в данной выборке штаммы из Московской области (GL6 и GL7) (группа «С»), не являясь клонами по результатам тестов на вегетативную несовместимость, в то же время обладали идентичными молекулярными RAPD-профилями. Таким образом, RAPD-полиморфизм вида G. lucidum позволил выделить несколько внутривидовых групп.

Штамм из Кореи (GL3) продемонстрировал по всем RAPD-маркерам наибольшее отличие внутри кластера G. lucidum, занимая обособленную позицию на расстоянии 0,42 условных единиц генетической дистанции. Что касается штамма из США (GL5), то его степень объединения с группой из южных регионов была относительно невысока, до 61% индекса бутстрепа (рис. 7).

Еще одним методом исследования фенотипических проявлений генотипических различий штаммов является белковый электрофорез.

Было использовано пять изоферментных систем, из которых наиболее репрезентативной оказалась малатдегидрогеназа (МДГ).

На дендрограмме сравнения МДГ-спектров видно, что наибольшее отличие проявили штаммы G. applanatum и штамм G. lucidum из США (GL5), объединившись с остальными географическими изолятами G. lucidum только на уровне 1 единицы генетической дистанции (рис. 8).

1 0.9 0.S 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.3 0.1

H-I-1-1-1-1-1-1-1-f-

91%

Рисунок 8. Дендрограмма сходства штаммов G. lucidum и G. applanatum по спектру

изоферментов МДГ

Штаммы из Московской области (GL6 и GL7) объединились в одну группу, поддержанную значением индекса бутстрепа 99% . Остальные штаммы (GL2, GL4, GL8, GL9 и GL927) обнаружили 66% гомологии МДГ-спектров. Штамм из Кореи вновь занял обособленную позицию на уровне 0.34 условных единиц генетической дистанции (рис. 8).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование изменчивости штаммов G. lucidum с использованием различных подходов и методов позволило сопоставить результаты анализов (табл. 6). Была получена индивидуальная характеристика для каждой RAPD-группы, отличавшейся географическим происхождением и высокой степенью гомогенности по выбранным маркерам.

Так, штаммы GL2, GL8 и GL9 из южных регионов страны, объединившиеся по данным RAPD-анализа в группу «А», имели сходные спектры малатдегидрогеназы и составили интерстерильную группу I. Для них была показана способность к образованию в чистой культуре хламидоспор и получены веерообразные «лакированные» плодовые тела с ножкой (табл. 6).

Для европейских штаммов, объединившихся в RAPD-группу «В», было обнаружено: высокая степень гомогенности по изоферментам, принадлежность к интерстерильной группе II, наличие хламидоспор и консолевидные матовые плодовые тела.

2 4

927 8 9 3

9941 '7

G. lucidum

s J

632 G.applanatum

Таблица 6. Сравнение результатов анализа полиморфизма штаммов СЛислйит

Критерии

Характеристика полученных групп штаммов С. 1иа(1ит

Штамм (географ.про-исх.)

2,8 (Кавказ), 9 (Крым)

4 (Франция), 927(Австрия)

6,7 (Моск. обл.)

3(Корея)

5 (США)

ЯАРО группа

В

Изо-ферменты

66%

66%

99%

Генетически й анализ

Интерстерильная группа 1

Интерстерильная группа 2

Что касается ЯАРО-группы «С» - штаммов из Московской области, - то для нее получена наибольшая степень сходства по МДГ-спектрам, показано отсутствие хламидоспор в чистой культуре и неспособность формировать типичные базидиомы в искусственных условиях.

выводы

1. По морфолого-культуральным и микроморфологическим признакам показана гетерогенность изученных штаммов G. lucidum и выделены три морфологические группы.

2. Обнаружена способность некоторых штаммов G. lucidum образовывать базидии с жизнеспособными базидиоспорами в чистой культуре, минуя стадию формирования типичных базидиом.

3. Модифицирована методика получения базидиом путем добавления в субстрат дрожжевого экстракта, что стимулировало процесс плодообразования.

4. Получены группы тестеров и выявлены две интерстерильные группы штаммов G. lucidum.

5. С помощью RAPD-маркеров выявлен ДНК-фрагмент, специфичный для вида G. lucidum.

6. Применение генетических, биохимических и молекулярных методов, наряду с исследованием морфологии, позволило подтвердить правомочность выделения внутривидовых групп штаммов G. lucidum.

7. Исследование с использованием комплекса методов подтвердило сложную структуру вида G. lucidum.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Чистякова Е. JI. Штаммовое разнообразие трутовика лакированного Ganoderma lucidum II Тезисы конференции, посвященной 85-летию кафедры микологии и альгологии МГУ им. М. В. Ломоносова. М. 2004 с. 149

Завьялова Л. А., Чистякова Е. Л.. Инсарова И. Д., Антимонова А. В. Штаммовое разнообразие трутовика лакированного Ganoderma lucidum II Микология и фитопатология. 2005. Т.39. № I.e. 27-34.

Гарибова Л.В., Завьялова Л.А., Инсарова И.Д., Чистякова Е.Л. 2005. Анализ коллекции штаммов Ganoderma lucidum разного географического происхождения. // Материалы 6-ой Международной конференции «Проблемы лесной фитопатологии и микологии». М.-Петрозаводск, 2005, с. 69-72.

Постнова Е. Л. Антибиотическая активность и морфолого-культуральные признаки штаммов Ganoderma lucidum II Тезисы Юбилейной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.В. Горленко. М. 2008. с. 195

Постнова Е. Л. Макро - и микроморфология штаммов Ganoderma lucidum раличного географического происхождения // «Современная микология в России». Второй съезд микологов России. Тезисы докладов. М., 2008. Т. 2. с.42

Постнова Е.Л.. Завьялова Л.А., Инсарова И.Д.. Формирование атипичных плодовых тел и примордиев in vitro у Ganoderma lucidum и влияние на этот процесс абиотических факторов // Микология и фитопатология. 2009. Т.43. № 4 (в печати)

Постнова Е.Л., Сколотнева Е.С. Комплексный вид Ganoderma lucidum: внутривидовые группы штаммов с индивидуальной характеристикой // в печати

Заказ № 61/04/09 Подписано в печать 13.04.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 \ (^)} тпу. с[г. ги; е-таИ: т/о@с/г. т

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Постнова, Евгения Леонидовна

Введение

Обзор литературы;

Вид Gcmoderma lucidum (W. Curtis:Fr.) Р. Karst.

Систематическое положение

Медицинское применение

Методы культивирования G. lucidum

Морфологическое описание

Таксономия и номенклатура

Особенности вегетативной (мицелиальной) стадии штаммов G. lucidum

Генетический анализ внутривидовой структуры высших базидиомицетов

Вегетативная несовместимость

Половая несовместимость

Анализ ДНК-полиморфизма

Анализ изозимных спектров

Материалы и методы

Объкты исследования

Хранение культур

Макро- и микроморфология

Сканирующая электронная микроскопия

Окраска ядерного аппарата

Исследование атипичных плодовых тел G. lucidum in vitro

Определение скорости роста

Культивирование

Получение споровых отпечатков

Анализ вегетативной несовместимости

Анализ половой несовместимости

Выделение монобазидиоспоровых тестерных штаммов и проведение скрещиваний

RAPD-PCR анализ

Выделение ДНК

Условия амплификации

Изоферментный анализ

Кластерный анализ

Результаты и обсуждение

Исследование морфологии, условий роста вегетативной стадии дикариотических природных изолятов G. lucidum и особенностей, связанных с плодообразованием

Получение моноспоровых изолятов из хламидоспор

Анализ скорости роста и установление температурных оптимумов и максимумов

Исследование атипичных плодовых тел

Культивирование

Вегетативная несовместимость изолятов G. lucidum

Репродуктивная изоляция

Молекулярный и биохимический анализ штаммов G. lucidum

Заключение Диссертация по теме "Микология", Постнова, Евгения Леонидовна

выводы

1. По морфолого-культуральным и микроморфологическим признакам показана гетерогенность изученных штаммов G. lucidum и выделены три морфологические группы.

2. Обнаружена способность некоторых штаммов G. lucidum образовывать базидии с жизнеспособными базидиоспорами в чистой культуре минуя стадию формирования типичных базидиом.

3. Модифицирована методика получения базидиом путем добавления в субстрат дрожжевого экстракта, что стимулировало процесс плодообразования.

4. Получены группы тестеров и выявлены две интерстерильные группы штаммов G. lucidum.

5. С помощью RAPD-маркеров выявлен ДНК-фрагмент, специфичный для вида G. lucidum.

6. Применение генетических, биохимических и молекулярных методов, наряду с исследованием морфологии, позволило подтвердить правомочность выделения внутривидовых групп штаммов G. lucidum.

Заключение

Исследование изменчивости штаммов G. lucidum с помощью разных методов позволило сопоставить результаты анализов (табл. 18). Была получена индивидуальная характеристика для каждой RAPD-группы, отличавшейся географическим происхождением и высокой степенью гомогенности по выбранным маркерам.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Постнова, Евгения Леонидовна, Москва

1. Автономова А. В. Ganoderma lucidum (Curt.:Fr) Р. Karst., трутовик лакированный: штаммовое разнообразие, антибиотические свойства и противоопухолевое действие // Дис. канд. биол. наук. М. 2006. 120 с.

2. Бабаянц О. В., Маслий Е. В. Рей си (Ganoderma lucidum) перспективы производства в украине // «Современная микология в России». Второй съезд микологов России. Тезисы докладов. М. 2008. Т. 2. с. 39

3. Бабицкая3 В. Г., Бисъко Н. А., Щерба В. В., Осадчая о. В., Смирнов Д. А. Глубинный мицелий Ganoderma lucidum (Curt.: Fr.) P. Karst. основа биологической добавки // Успехи медицинской микологии. М. 2004. Т. 3. с. 202-204

4. Белова Н. В., Псурцева Н. В., Мнухина А. Я., Алехина И. А. Современные направления экспериментального исследования базидиомицетов // Микология и фитопатология. 1997. Т. 31. № 6. с. 64-75

5. Бисъко Н. А., Билай В. Т., Митрополъская Н. Ю., Гулич М. П., Ольшевская О. Д. Изучение цитогенетического действия Lentinus edodes (Berk.) Sing, и Ganoderma lucidum (Curt.: Fr.) P. Karst. // Успехи медицинской микологии. М. Т 3. 2004. с. 245-246

6. Бухало А. С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. К.: Наукова думка. 1988. 390 с.

7. Гарибова Л. В. Биология ксилотрофных базидиомицетов: структура и функции // Грибные сообщества лесных экосистем. Москва-Петрозаводск. 2000. с.134-154

8. Горовой Л. Ф. Шляпочные грибы перспективный источник лечебных препаратов и биологически активных добавок // Успехи медицинской микологии. М. 2004. Т. 3. с. 212-215

9. Дьяков Ю. Т. Критерии биологического вида у грибов (с обзором таксономической структуры ризоктониеподобных грибов) // Микология и фитопатология. 1993. Т. 27. № 6. с. 68-82.

10. Дьяков Ю. Т. Популяционная биология фитопатогенных грибов. М. 1998. 382 с.

11. Дьяков Ю. Т. Вегетативная несовместимость у грибов-простейшая форма ответа. // «Современная микология в России». Второй съезд микологов России. Тезисы докладов. М. 2008. с. 34

12. Завьялова Л. А., Чистякова Е. Л., Инсарова И. Д., Антимонова А. В. Штаммовое разнообразие трутовика лакированного Ganoderma lucidum II Микология и фитопатология. 2005. Т.39. № I.e. 27-34

13. Камзолкина О. В. Цитологические исследования гомокариотических и гетерокариотических штаммов Agaricus bisporus (J. Lange) Imbach. // Микробиология. Т. 65. № 2. 1996 с. 228-234

14. КимураМ. Молекулярная эволюция: теория нейтральности. М. Мир. 1985. 398 с.

15. Корочкин Л. И. Серов О. Л., Пудовкин А. И. Генетика изоферментов. М. Наука. 1977. с. 278

16. Краснополъская Л. М., Белицкий И. В., Федорова г. Б., Катруха Г. С. Pleurotus djamor. способы культивирования и антимикробные свойства // Микология и фитопатология. 2001. Т 35.- Вып.1. с. 82-67

17. Левонтин Р. Генетические основы эволюции. М. Мир. 1984

18. Мелик-Хачатрян Дж. Г. Взаимоотношения различных экологических групп грибов в эксперименте // Микология и фитопатология. 1985. Т. 19. № 4. с. 286- 289

19. Мюллер Э., Леффлер В. Микология. М. Мир. 1995. с. 135

20. Радзиевская М. Г., Бобко И. Н. Темные зональные линии в древесине. Использование линий в изучении популяционной структуры древоразрушающих гименомицетов // Микология и фитопатология. 1985. Т. 19. с. 394-398

21. Радзиевская М. Г. Проблема определения вида и структура популяций высших базидиальных грибов // Успехи совр. Биол. 1987 . т. 103. с. 271286

22. Решетников С. В. Эволюция бесполого размножения высших базидиомицетов. К.: Наукова думка. 1991. 186 с.

23. Симонян С. А., Мамиконян Т. С. Взаимодействие компонентов микосинузий в эксперименте // Микология и фитопатология. 1982. Т. 16. С. 219-225

24. Шнырева А. В., Дружинина И. С., Дьяков Ю. Т. Генетичекая структура комплекса Pleurotus ostreatus sensu lato на территории московской области //Генетика. Т. 34. №12. 1998. с. 1610-1618

25. Шнырева А. В., Белоконъ Ю. С., Белоконь М. М. Использование молекулярных маркеров для дифференциации культивируемых штаммов вешенки и шампиньона//Генетика. 2003. Т. 39. № 10. с. 1461-1469

26. Шнырева А. В. Популяционная биология грибов с гаплоидным и гаплоиднодикариотическим жизненными циклами // Дисс. докт. биол. наук в виде доклада 2005. 48с.

27. Шнырева А. В., Штаер О. В. Дифференциация близкородственных видов Pleurotus pulmonarius и Pleurotus ostreatus с помощью скрещиваний и молекулярных маркеров // Генетика. 2006.Т. 46. № 5. с. 667-674

28. Штаер О. В., Шнырева А. В. Вегетативная несовместимость в природных популяциях Pleurotus pulmonarius //В сб.: Грибы в природных и антропогенных экосистемах. Санкт-Петербург.2005. с. 323-327

29. Штаер О. В. Сравнительный анализ природных популяций Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quel. // Дис. канд. биол. наук. М. 2006- 116 с.

30. Юрченко Е. О., СинявскаяМ. Г. Основы молекулярного маркирования грибной ДНК. Практическое руководство. Минск: Право и Экономика. 2007. 101 с.

31. Abdullah F. Taxonomic and electrophoretic studies of selected species of Ganoderma (Karst.) // Dissertation, Thesis. Universiti Putra Malaysia. 1996

32. Adams D. H., Roth L. F. Demarcation lines in paired caltures of Fomes cajanderi as abasis for detecting genetically distinct mycelia // Can.J. Bot. 1967. 45. p.1583-1589

33. Adaskaveg J. E., Gilbertson R. L. Cultural studies and genetics of sexuality of Ganoderma lucidum and G. tsugae in relation to the taxonomy of the G. lucidum complex// Mycologia. 1986. V. 78 (5), p. 694-705

34. Adaskaveg J. E., Gilbertson R. L. Basidiospores, pilocystidia, and other basidiocarp characters in several species of the Ganoderma lucidum complex // Mycologia. 1998. V. 80 (4), p. 493-507

35. Anderson J. B., Kohn L. M. Genotyping, gene genealogies and genomics bring fungal population genetics above ground // TREE. 1998. V. 13. № 11. p.444-449

36. Annesi T., Coppola R, Motta H. Characterization of ganoderma isolates from central Italy // JPP. 2002. V. 84. N. 3. p. 9-10

37. Anselmi N., Bragaloni M. A method to identifícate wood decay Basidimycetes by using enzymatic comparisons // Micologia Italiana. 1992. V. 21 (2). p. 15-20

38. Babalyan S. M., Innocenti G., Garibyan G. N. Antagonistic activity of xylotrophic mushroom against pathogenic fungi of cereals in dual culture // Phytopathol. Meditterr. 2002. V. 41 .p. 200-225

39. Bao X.F., Fang J.N., Li X.Y. Structural characterization and immunomodulating activity of a complex glucan from spores of Ganoderma lucidum // Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 2001. v. 65. p. 2384-2391

40. Bao X.F., Zhen Y., Ruan L., Fang J.N. Purification, characterization, and modification of T lymphocyte-stimulating polysaccharide from spores of Ganoderma lucidum // Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 2002. v. 50. p. 623-629

41. Bissegger, M., D. Rigling, and U. Heiniger. Population structure and disease development of Cryphonectria parasitica in European chestnut forests in the presence of natural hypovirulence // Phytopathology. 1997, v. 87. p. 50-59

42. Brown A. N. Wier B. C. Measuring genetic variability in plant populations // Isozymes in Plant Genetic and Breeding. Part A. Elsevier. Amsterdam. 1983. p. 219-239

43. Buchanan P. K. A taxonomic overview of the genus Ganoderma with special reference to species of medicinal and neutriceutical importance // Proc. Int. Symposium Ganoderma SCI, Auckland. 2001. p. 27-29

44. Chang S. T., Miles P. G. Mushrooms. Cultivation, Nutritional Value, Medicinal Effect, and Enviromental Impact. II. 2004. 451 p.

45. Clegg M. T. Detections and measuring of natural selections // Isozymes in Plant Genetics and Breeding. Part A. Elsevier. Amsterdam. 1983. p. 241-255.

46. Davis Y. V. Disk electrophoresis // Method and application to human serum problems. Ann. N. Y. Acad. Ses. 1964. II. 121. p. 404-427

47. Dictionary of the Fungi. 9th edition. Edited by P. M. Kirk, P. F. Cannon, J. C. David and J. A. Stalpers. 2001. p. 655

48. Dong, P. S., J. Ryu Young. The genetic relationship analysis of Ganoderma spp. using the PCR- RFLP and RAPD. RDA // Journal of Agricultural Science Biotechnology. 1996. V. 38 (2). p. 251-260

49. D'Souza T.M., Merrit C.S., Reddy C.A. Lignin-modifying enzymes of the white rot basidiomycete Ganoderma lucidum // Applied and Environmental Microbiology. 1999. V. 65. p. 5307-5313

50. Egger G. Biology and breeding of Pleurotus // In: The Biology and Cultivation of Edible Mashrooms (S. T. Chang & W. A. Hayes, eds). 1978. p. 497-519

51. Eo S.K., Kim Y.S., Lee C.K., Han S.S. Antiviral activities of various water and methanol soluble substances isolated from Ganoderma lucidum // Journal of Ethnopharmacology. 1999. V. 68. p. 139-136

52. Gao J.J., Min B.S., Ahn E.M., Nakamura N, Lee H.K., Hattori M. New triterpene aldehydes, lucialdehydes A-C, from Ganoderma lucidum and their cytotoxicity against murine and human tumor cells // Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 2002. V. 50. p. 837-840

53. Gottlieb A. M., Saidman B. O., Wright J. E. Isoenzymes of Ganoderma species from southern South America // Mycol. Res. 1998. V. 102 (4). p. 415-426

54. Gottlieb A. M., Wright J. E. Taxonomy of Ganoderma from southern South America: subgenus Ganoderma// Mycol. Res. 1999. V. 103 (6). p. 661-673

55. Griffith G. M., Hedger J. N. A novel method for producing basidiocarps of the cocoa pathogen Crinipellis pernicosa using a bran-vermiculite medium // European Journal of Plant Pathology. 1993. V. 99. N. 4. p. 227-230.

56. Habijanic J., Berovic M., Paber B., Hodzar D., Boh B. Immunostimulatory effects of fungal polysaccharides from Ganoderma lucidum submerged biomass cultivation//Food Technology and Biotechnology. 2001. V. 39. p. 327-331

57. Hansen E. M., Stenlid J., Johanson M. Somatic incompatibility and nuclear reassorment in Heterobasidion annosum II Mycol. Res. 1993. V. 97. № 10. p. 1223-1228

58. Hietala A. M., Korhonen K., Sen R. An unknown mechanism promotes somatic incompatibility in Ceratobasidium bicorne II Mycologia. 2003. V. 95. № 2. p. 239-250

59. Hobbs C. Medicinal Mushrooms: an Exploration of Tradition. Healing and Cultures-Interweave Press. 1995. 251 p.

60. Hong S. G., Jung H. S. Phylogenetic analysis of Ganoderma based on nearly complete mitochondrial small-subunit ribosomal DNA sequences I I Mycologia. 2004. V. 96 (4). p. 742-755

61. Amplified Polymorphic DNA-PCR Compared with Grouping on the Basis of Internal Transcribed Spaser Sequences // Applied & Environmental Microbiology. Apr. 1996. p. 1354-1363

62. Kay E., Vilgalys R. Spatial distribution and genetic relationship among individuals in a natural population of the oyster mushroom Pleurotus ostreatus // Mycologia. 1992. V. 84. p. 173-182

63. Kim K.C., Kim LG., Ganoderma lucidum extract protects DNA from strand breakage caused by hydroxyl radical and UV irradiation // International Journal of Molecular Medicine. 1999. V. 4. p. 273-277

64. Mekkawy, S., Meselhy, M. R., Nakamura, N., Tezuka, Y., Hattori, M., Kakiuchi, N. Shimotohno, K., Kawahata, T., and Otake, T. Anti-HIV-1 and anti-HIV-1-protease substances from Ganoderma lucidum. Phytochemistry. 1998. V. 49 (6). p. 1651-1657

65. Miller, Holderness, Bridge, Chang, Zakaria. Genetic diversity of Ganoderma in oil palm plantings // Plant pathology. 1999. V. 48 (5). p. 595

66. Min B.S., Nakamura N., Miyashiro H., Bae K.W., Hattori M. Triterpenes from the spores of Ganoderma lucidum and their inhibitory activity against HIV-1 protease // Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 1998. V. 46. p. 1607-1612

67. Mizuno T. Studies on Bioactive Substances and Medical Effects of REISHI (Ganoderma lucidum). 1995.http://www.reishirescue.com/index.cfm?Fuseaction=ArticleDisplay&ArticleID =358

68. Moncalvo J. M. Systematics of Ganoderma. // Ganoderma Disease of Perennial Crops // CABI Publishing. 2000. p. 23-52

69. Moncalvo J. M., Buchanan P. K. Molecular evidence for long distance dispersal across the southern Hemisphere in the Ganoderma applanatum-australe species complex (Basidiomycota) // Mycological Res. 2008. V. 112. p. 425-436

70. Moore A. J., Challen M. P., Warner P. J., Elliott T. J. RAPD discrimination of Agaricus bisporus mushroom cultivars // Appl. Mycrobiol. Biotechnol. 2001. V. 55. p. 742-749

71. Morigiva A., Kitabatake K., Fujimoto Y. & Ikekawa. Angiotensin converting enzyme inhibiting triterpenes from Ganoderma lucidum // Chem. Phar. Bull. 1986. V. 34. p. 3025-8028

72. Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals // Genetics. 1972. V. 89. p. 583-590

73. Oh K.W., Lee C.K., Kim Y.S., Eo S.K., Han S.S. Antiherpetic activities of acidic protein bound polysacchride isolated from Ganoderma lucidum alone and in combinations with acyclovir and vidarabine // Journal of Ethnopharmacology. 2000. V. 72. p. 221-227

74. Raudaskoki M. and Viitanen H. Effect of aeration and light on fruit body induction in Schizophyllum commune // Trans. Br. Mycol. Soc. 1982. V. 78. p.89-96

75. Ritland K Estimation of mating systems. Isozymes in Plant Genetics and Breeding. Part A. Elsevier. Amsterdam. 1983. p. 289-302

76. Roberts L. M. Australian Ganoderma: Identification, growth and antibacterial properties. 2004. p. 51

77. Ryvarden L., Gilbertson P. L. European Polypores // Synopsis fungorum 6. Oslo. Norway. 1993. 387 p.

78. Saupe S. J. Molecular Genetics of Heterocaryon Incompatibility in Filamentous Ascomycetes // Microbiol. Mol. Biology Reviews. 2000. V. 64. № 3. p. 489-502

79. Seo G. S., Shin G. C. Formation of atypical fruiting structures in Ganoderma lucidum isolates on a nutrient agar medium // Mycoscience. 1995. V. 36. p. 1-7

80. Seo G. S., Kirk P. M. Systematics of Ganoderma. // Ganoderma Disease of Perennial Crops/ CABI Publishing. 2000. p. 3-22

81. Stamets P. Growing gourmet and medicinal mushrooms. 1993. p. 335-337

82. Su H., Wang L., Ge Y., Feng E., Sun J., Liu L. Development of strain specific SCAR markers for authentication of Ganoderma lucidum II World J. Microbiol Biotechnol. 2008. V. 24. p. 1223-1226

83. Sugiyama K., Yamakawa A., Saeki S. Correlation of suppressed linoleic acid metabolism with the hypocholesterolemic action of eritadenine in rats. // Lipids. 1997. V. 32. p. 859-866.

84. Sun S. J., Gao W., Lin S. Q. Analysis of genetic diversity in Ganoderma population with a novel molecular marker SRAPII App. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 72. p. 537-543

85. Szedlay G. Basidiokarp and mycelium morfology of Ganoderma lucidum Karst. Strains isolated in Hungary // Acta Microbiol. IMMUNOL hang. 1999. p.41-52

86. Uchida J. Y., Aragaki M.,Yahata P. S. Basidiospore formation by Ceratobasidium sp. on agar//Mycologia. 1986. V. 78. p. 587-592

87. Utomo C., Werner S., Niepold F., Deising H. B. Identification of Ganoderma, the causal agent of basal stem rot disease in oil palm using a molecular method // Mycopathologia. 2005. V. 159. p. 159-170

88. Vilgalis R., Sun B. L. Ancient and recent patterns of geographic speciation in the oyster mushroom Pleurotus revealed by phylogenetic analysis of rDNA sequences //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. № 5. p. 4599-4603

89. Wasser S. P., Zmitrovich L. V., Didukh M. Ya., Spirin W. A., Malysheva V. F. II Morphological Traits of Ganoderma lucidum Complex. Ruggell. 2006. p. 188220

90. Worrall J. J. Somatic incompatibility in basidiomycetes // Mycologia. 1997. V. 89. 24-36

91. Wu J., Saupe S. J., Glass N. L. Evidence for balancing selection operating at the het-c heterokaryon incompatibility locusin a group of filamentous fungi // Evolution. 1998. V. 95. p. 12398-12403

92. Yamanaka 71, Sagara N. Development of basidia and basidiospores from slide cultured mycelia in Lyophyllum tylicolor (Agaricales) // Mycol. Res. 1990. V. 94. p. 847-850

93. Zakaria L., Kulaveraasingham H., Guan T. S., Abdullach F., Wan H. Y. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) and RAMS of Ganoderma from Infected oil Palm and Coconut Stumps in Malasysia // Biotechnology. 2005. V. 13(1). p. 23-24

94. Zhang L.N., Zhang M., Zhou Q., Chen J.H., Zeng F.B. Solution properties of antitumor sulfated derivative of alpha-(l -> 3)-D-glucan from Ganoderma lucidum // Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 2000. V. 64. p. 21722178

95. Zhu M, Chang Q., Wong L.K., Chong F.S., Li R.C. Triterpene antioxidants from Ganoderma lucidum //Phytotherapy Research. 1999. V. 13. p. 529-531

96. Zhu H.S., Yang X.L., Wang L.B., Zhao D.X., Chen L. Effects of extracts from sporoderm-broken spores of Ganoderma lucidum on HeLa cells // Cell Biology and Toxicology. 2000. V. 16. p. 201-206