Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P. Karst., трутовик лакированный: штаммовое разнообразие, антибиотические свойства и противоопухолевое действие

Автономова, Анастасия Витальевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P. Karst., трутовик лакированный: штаммовое разнообразие, антибиотические свойства и противоопухолевое действие
ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P. Karst., трутовик лакированный: штаммовое разнообразие, антибиотические свойства и противоопухолевое действие"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

АВТОНОМОВА Анастасия Витальевна

Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P.Karst., трутовик лакированный: штаммовое разнообразие, антибиотические свойства и противоопухолевое действие.

Специальность 03.00.24 - микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета Московского государственного университета им M В Ломоносова и в ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им Г Ф Гаузе РАМН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Гарибова Лидия Васильевна

доктор биологических наук Краснопольская Лариса Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Феофилова Елена Петровна

кандидат биологических наук Горшина Елена Сергеевна

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г Саратов

Защита состоится 10 февраля 2006 г в 15 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501 001 46 при Московском государственном университете им MB Ломоносова по адресу

119992, г Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ им M В Ломоносова, Биологический факультет, ауд М-1, тел./факс (495) 939-39-70

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им M В Ломоносова

Автореферат разослан .30 декабря 2005 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

MA Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В последние десятилетия ведутся активные поиски биологически активных веществ природного происхождения Внимание исследователей в первую очередь привлекают к себе природные объекты, которые использовались в качестве лекарственных средств в народной медицине Ganoderma lucidum (Curt Fr ) P Karst -трутовик лакированный, один из известных базидиальных грибов, используемый в лечебных целях с давнего времени Его применяли при разнообразных заболеваниях, в том числе бронхиальной астме, неврастении, гастрите, болезнях печени. Интенсивные исследования G lucidum в течение последних десятилетий привели к выделению биологически активных метаболитов, оказывающих иммуностимулирующее, противоопухолевое, гиполипидемическое, гипогликемическое, гепатопротекторное, противовирусное, противовоспалительное действие (Sone et al, 1985; Hikino&Mizuno, 1989; Jong & Birmingham, 1992; Hobbs, 1995; Mizuno et al, 1995; Stavinoha et al, 1995; Wasser&Weis, 1997, Gao et al, 2004, Lin & Zhang, 2004)

Большинство работ по поиску и выделению биологически активных веществ из G lucidum проведены с использованием плодовых тел, зачастую дикорастущих (Miyazaki&Nishijima, 1981; Hirotani et al, 1985; Hikino et al, 1985; Morigiwa, 1986; Lin&Tome, 1991; Hattorf, 1997; Wang et al, 1998; El-Mekkawy et al, 1998; Cao&Lin, 2004; Berger et al, 2004) В результате разработаны многочисленные запатентованные формулы биологически активных добавок, чаев и тонизирующих напитков на основе плодовых тел гриба Известен один лекарственный препарат китайского происхождения (SunRecome, Green Valley Holding Company, Ltd, Шанхай, Китай), получаемый из выращенных по экстенсивной технологии плодовых тел G. lucidum.

Несмотря на то, что общий объем публикаций, посвященный G lucidum, чрезвычайно велик, в нем очень мало работ по исследованию биологической активности вегетативного мицелия, по изучению закономерностей роста G lucidum в погруженной культуре В то же время, очевидно, что использование погруженного мицелия для получения биологически активных метаболитов может облегчить дальнейшую стандартизацию материала и обеспечить воспроизводимость биологических эффектов Однако, описанные в литературе способы погруженного культивирования не могут служить основой рентабельных производств из-за своей длительности, составляющей 12 - 16 суток (Fang et al., 2002, Fang&Zhong, 2002; Lomberh et al., 2002; Tang&Zhong 2002, 2003) Кроме того, существует огромный разрыв между изучением биологической активности G lucidum и исследованиями штаммового разнообразия Практически не изучены морфологические, физиологические и биохимические особенности штаммов G lucidum, необходимые для выявления наиболее

перспективных для практического использования шгаш

орОЙРЯШВДЩ^следованы БИБЛИОТЕКА

антибиотические свойства G lucidum, которые должны быть обязательно проведены для всех продуктов, рекомендуемых для перорального введения.

В связи с этим важное значение имеет комплексное изучение штаммового разнообразия G lucidum, создание эффективных способов погруженного культивирования и оценка биологической активности получаемого материала штаммов, в том числе противоопухолевых свойств и антибиотического действия

Цели и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении штаммового разнообразия G lucidum на вегетативной (мицелиальной) стадии по морфолого-физиологическим признакам и антибиотическим свойствам, в изучении противоопухолевого действия экстрактов мицелия и их фракций

В работе были поставлены следующие задачи-

1 Изучение морфолого-культуральных характеристик штаммов G lucidum при росте на широком наборе плотных питательных сред и при различных температурных режимах.

2 Изучение пищевых потребностей штаммов G lucidum при выращивании на плотных средах и в погруженной культуре.

3 Изучение процессов погруженного культивирования штаммов G lucidum

4 Изучение антибиотических свойств штаммов G lucidum

5 Отбор перспективного для получения биологически активной биомассы штамма G lucidum

6 Разработка способа погруженного культивирования отобранного штамма, включая оптимизацию состава ферментационной среды методами математического планирования.

7 Получение из мицелия и плодовых тел отобранного штамма G lucidum экстрактов и их фракций с целью оценки их противоопухолевого действия в системе in vivo при различных способах введения

Научная новизна. В результате проведенного исследования описаны морфологические и физиологические характеристики десяти штаммов G lucidum Составлены морфологические описания колоний изученных штаммов при росте на семи плотных средах Выявлены новые типы текстур колоний и предложены названия для них Установлены специфические морфологические черты каждого штамма Среди исследованных штаммов выявлены культуры с высокой и низкой скоростью роста на плотных средах и в погруженной культуре Показано, что медленнорастущие и быстрорастущие штаммы G lucidum обладают различным температурным оптимумом роста.

Выявлены пищевые предпочтения штаммов G lucidum при росте на плотных средах и в погруженной культуре. Изучен процесс погруженного культивирования десяти штаммов G lucidum на отобранных для каждого штамма трех эффективных средах

С применением методов математического планирования эксперимента составлены композиции оригинальных питательных сред для погруженного культивирования G lucidum Показано, что использованные методы позволяют не только увеличить выход биомассы, но и сократить длительность процесса культивирования

В результате исследования обнаружено антибиотическое действие погруженного мицелия и культуральной жидкости штаммов G lucidum в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов Штаммы различаются по спектру антибиотического действия и активности.

Показано противоопухолевое действие фракций G lucidum, обогащенных водорастворимыми полисахаридами-гетерогликанами, при пероральном введении Установлена зависимость противоопухолевого действия от применяемой дозы препарата Полисахаридные фракции мицелия и плодовых тел одного штамма оказывают равный противоопухолевый эффект.

Практическая значимость. В результате изучения морфологических характеристик колоний штаммов на плотных средах рекомендован минимальный набор из трех питательных сред, обеспечивающий проявление специфических морфологических черт отдельных штаммов.

Определен температурный оптимум для культивирования всех исследованных штаммов Выявлены пищевые предпочтения штаммов G.lucidum и предложены составы плотных и жидких питательных сред для каждого штамма

Разработан биотехнологический метод погруженного культивирования одного штамма G lucidum с применением методов математического планирования эксперимента, обеспечивающий двукратное увеличение выхода биомассы по сравнению с исходным уровнем и сокращение длительности культивирования Полученные композиции питательных сред для погруженного культивирования G lucidum обеспечивают выход биомассы до 21 г/л при длительности культивирования не более 4 суток

В результате экспериментов получены экстракты мицелия и плодовых тел штамма G. lucidum и их полисахаридные фракции, обладающие противоопухолевой активностью в отношении Т-лимфомы EL-4, лимфолейкоза Р388, карциномы молочной железы Ca -755 и саркомы 180 в экспериментах m vivo при пероральном введении Наработаны опытные партии препарата полисахаридной фракции мицелия для широких противоопухолевых и химических исследований.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены на заседаниях кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ им. М В. Ломоносова, на конференции молодых ученых ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им Г Ф Гаузе РАМН (Москва, 2004), на международной конференции «Физиология и биохимия культивируемых грибов» (Саратов, 2002 г.), на 7-й Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003), на третьем Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2005) Материалы работы были представлены на Первом съезде микологов России (Москва, 2002), на 5-ой международной конференции «Проблемы лесной фитопатологии и микологии» (Москва, 2002), на первом и втором Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2003,2004)

Публикации. Основные результаты диссертационной работы приведены в 14 публикациях

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на /С^страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, главы «Результаты и обсуждение», выводов, списка литературы, включающего ¿^источников, из них //9- зарубежные, приложения Работа содержит/^ рисунков и »^таблиц

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Объекты исследования Объектами исследования служили 10 штаммов G lucidum коллекций кафедры микологии и альгологии МГУ им MB Ломоносова и ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им Г.Ф Гаузе РАМН

Культивирование на плотных средах Изучение морфологии колоний, пищевых потребностей и скорости роста вегетативного мицелия штаммов G. lucidum проводили при температуре 28"С на семи плотных средах' пшеничном агаре (ПША), картофельно-глюкозном агаре (КГА), сусло-агаре (CA), среде Чапека-Докса с дрожжевым экстрактом (ЧДдэ), пшеничном агаре с кукурузным экстрактом (ПШкэ), среде с глюкозой и пептоном (ГПА) и среде с глюкозой и соевой мукой (ГСА) на чашках Петри При составлении морфологических описаний колоний оценивали текстуру колоний, форму края колоний, интенсивность развития и цвет мицелия, наличие концентрических зон, радиальных тяжей, образование пигмента Изучение скорости роста штаммов G lucidum при различных температурах 20°С, 25°С, 28°С и 30'С проводили на КГА Опыты ставили в трех повторностях Диаметр колонии измеряли раз в сутки в двух взаимно-перпендикулярных направлениях, начиная со вторых суток роста.

Погруженное культивирование осуществляли в колбах 0,5 и 0,75 л на ротационной качалке при 220 об/мин при 26 0 и 28 "С Среды содержали глюкозу, растительное масло,

соевую муку, пшеничную муку, соевый пептон, дрожжевой экстракт, нитрат натрия, дигидрофосфат калия, сульфат магния Для выявления пищевых предпочтений штаммов G luctdum были изучены 6 сред с различным сочетанием двух органических источников углерода' глюкозы и растительного масла и трех источников азота- соевой муки, соевого пептона и дрожжевого экстракта с нитратом натрия Среда Ф1 содержала глюкозу и соевую муку, Ф2 - глюкозу и пептон, ФЗ- глюкозу и дрожжевой экстракт, Ф4 - растительное масло и соевую муку, Ф5 - растительное масло и пептон, Ф6 - растительное масло и дрожжевой экстракт. Длительность процесса культивирования составляла от 1 до 14 суток В процессе культивирования изучали накопление воздушно-сухой биомассы (весовым методом) и значения рН культурального фильтрата (на ионометре ЭВ-74) Опыты ставили в трех повторностях Изменение исходного уровня рН среды до значений 3, 4, 5, 7, 8 было проведено с помощью титрования соляной кислотой и гидроксидом калия Исследование влияния температуры на рост погруженной культуры проводили при 25°С и 28°С

Оптимизация состава среды для погруженного культивирования G.lucidum Оптимизацию количественного и качественного состава ферментационной среды для погруженного культивирования отобранного штамма проводили методами математического планирования. Для создания эффективной среды использовали метод полного факторного эксперимента и метод крутого восхождения (Максимов, 1980). Для обработки результатов применяли программу Statistica 6.0

Получение плодовых тел. Подготовленный стерильный зерновой субстрат на основе ячменя засевали погруженной культурой из расчета 3%. Инкубацию проводили в темноте при температуре 24-25° С в течение 10-19 суток. Выращивание плодовых тел G.lucidum проводили на блоках с дубовыми опилками После предварительной подготовки опилочный субстрат фасовали в полипропиленовые пакеты и стерилизовали в автоклаве, затем инокулировали зерновым мицелием в количестве 3 % Засеянные пакеты инкубировали при температуре 24-25°С в течение 12-18 суток После полного зарастания опилочного субстрата мицелием пакеты выставляли в камеру для плодоношения с температурой 20° С, относительной влажностью воздуха 80-90%, вентиляцией 2 об/час и освещением 500 люкс

Микроморфология мицелия бьиа изучена с помощью светового микроскопа Olympus ВХ41 на временных препаратах (объективы 8,40).

Изучение антибиотического действия штаммов G lucidum. Изучение антибиотического действия экстрактов погруженного мицелия и культурального фильтрата десяти штаммов G. lucidum проводили методом диффузии в агар из бумажных дисков В качестве тест-обьектов использовали стандартный набор ГУ НИИНА РАМН из 10 тест-организмов, включающий грамположительные бактерии: Bacillus subtihs, В. cereus subsp. mycoides, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, грам отрицательные бактерии:

Comamonas terrigena, Escherichia coli, Pseudomonas aeurugenosa, дрожжи' Candida albicans, мицелиальные грибы' Aspergillus mger, Fusarium bulbigenum Показателем антибиотического действия служила величина зоны ингибирования роста тест-организма

Получение водных экстрактов и их фракций из мицелия и плодовых тел Для приготовления водного экстракта мицелия или плодовых тел за основу был взят патент РФ № 2129003 «Средство, обладающее противоопухолевой активностью» Готовый экстракт хранили при - 20 "С Полисахаридные фракции водных экстрактов погруженного мицелия и плодовых тел получали последовательным осаждением этанолом полимеров, различающихся степенью растворимости в воде Полисахаридная фракция 1 (ПСХ1) была получена при введении в экстракт 2х объемов 96% этанола, полисахаридная фракция 2 (ПСХ2) после извлечения ПСХ1 - 4х объемов 96% этанола Объединенную полисахаридную фракцию (ОПСХ) из водного экстракта погруженного мицелия и плодовых тел G lucidum получали добавлением в экстракт 4х объемов 96% этанола.

Определение количественного содержания полисахаридов в водных экстрактах мицелия и плодовых тел G lucidum проводили с использованием фенол-сернокислотного метода (Захарова, Косенко, 1982) Интенсивность получаемой окраски измеряли при длине волны 490 нм на фотоэлектрокалориметре 56М. В качестве контроля использовали дистиллированную воду Количество полисахаридов определяли в соответствии с калибровочной прямой, предварительно построенной для глюкозы, в концентрациях от 20 до 80 мкг/мл, с шагом 10 мкг/мл.

Определение моносахаридного состава полисахаридных фракций проводили в лаборатории растительных полисахаридов Института органической химии им Н Д. Зелинского РАН под руководством профессора, д.х.н А И. Усова. Полисахариды подвергали полному гидролизу 2М трифторуксусной кислотой в присутствии в качестве внутреннего стандарта инозитола в течение 8 часов при 100°С Качественный и количественный состав моносахаридов, полученных в результате гидролиза, определяли с помощью метода газожидкостной хроматографии на хроматографе HP 5790А. Изучение противоопухолевого действия G. lucidum.

Изучение противоопухолевого действия препаратов из G. lucidum проводили в лаборатории фармакологии и химиотерапии ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им Г Ф Гаузе РАМН под руководством д м н В М Бухмана и в лаборатории комплексной терапии опухолей Института экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им Н.Н Блохина РАМН под руководством д м н Е М Трещалиной

Противоопухолевое действие изучали на четырех перевиваемых опухолях- асцитной и солидной Т- лимфоме EL-4, солидных Т- лимфоме Р388, аденокарциноме молочной железы Са755, саркоме 180 Опухоли EL-4, Р388 и Са755 были привиты гибридным мышам

(C57B1/6J x DBA/2)F1 (B6D2Fi), опухоль C180 была привита мышам самкам линии BALB/c Действие изучаемых препаратов при внутрибрюшинном введении оценивали на модели асцитной опухоли, при пероральном введении - на моделях солидных опухолей В течение опытов следили за общим состоянием мышей, изменением массы тела, прививаемостью опухоли, динамикой роста опухоли и выживаемостью мышей Торможение роста опухоли (ТРО) рассчитывали по формуле: TPO=(VK-V0)/(VK)xlOO%, где V, и V, - средний объем опухолей в контроле и опьгге, соответственно.

Результаты и обсуждение

Морфология колоний штаммов G.lucidum при выращивании на плотных средах. Морфология колоний была изучена на 7 натуральных и полусинтетических плотных средах На основании сопоставления всего полученного массива данных было показано, что каждый из штаммов имел один или несколько отличительных признаков, которые можно было обнаружить на нескольких средах Так штаммы 1, 6 и 7 практически на всех средах, кроме ПША и ПШкэ, очень быстро образовывали желтый пигмент в центре колонии Центральная часть колоний штаммов 6 и 7 практически сразу после начала роста превращалась в твердую, пергаментовидную, коричневую корку Колонии штамма 3 на всех средах, за исключением ПША, образовывали неровный, «рваный» или «языковидный» край На всех средах, кроме ПША, штамм 5 образовывал незональную колонию, быстро превращающуюся в очень плотную, кожистую пленку, которую сложно разрезать Все остальные штаммы образовывали аналогичную пленку значительно позже Штаммы 2 и 4 зачастую образовывали сходные колонии' в центре порошистые с прижатым мицелием, в периферической части приподнятые длинно-ворсистые Отличие этих культур заключалось в том, что штамм 2 образовывал зональные колонии на ПША и КГА, тогда как пгтамм 4 образовывал концентрические зоны на средах ГПА, CA, ПШкэ и КГА Штамм 8 практически на всех средах формировал незональные длинно-ворсистые колонии Характерной чертой штамма 9 служило образование на КГА тяжистой колонии Воздушный мицелий колоний штамма 10 на всех средах в центре был плотно прижатым, перифрическая часть в зависимости от среды могла быть спутано-ворсистая или коротко-ворсистая Типы текстур колоний: длинно-ворсистая, коротко-ворсистая и спутано-ворсистая описаны впервые

Результаты исследования позволили выбрать минимальный набор сред, который обеспечивал проявление специфических черт всех изученных штаммов В число этих сред вошли ЧДдэ, CA и КГА.

Микроморфология вегетативного мицелия штаммов G.lucidum. При изучении микроморфологических признаков штаммов G lucidum, выращенных на плотных средах, общим для всех изученных культур было наличие воздушного мицелия с регулярно

присутствующими пряжками (рис 1а) У штаммов 2, 4, 5, 8 и 10 были обнаружены постоянно присутствующие многочисленные структуры на однородном мицелии, хламидоспоры (рис 16) Хламидоспоры были представлены в виде лимоновидных образований с толстыми стенками, сидящих на короткой ножке, в несколько раз превышающие по толщине мицелий У штаммов 1, 3, 6, 7 и 9 G lucidum такие структуры наблюдались единично На гифах всех штаммов, выращенных в погруженной культуре, обнаружены регулярные пряжки Хламидоспоры в погруженной культуре не отмечены.

Рисунок 1. Структуры вегетативного мицелия G lucidum Увеличение х40 а) пряжка, штамм 9 б) хламидоспора, штамм 8

Скорость роста штаммов на плотных средах. На основании данных, полученных при выращивании штаммов G. lucidum на 7 плотных средах были выделены группы быстрорастущих штаммов 2, 4, 5, 8, 10, медленнорастущих штаммов: 1, 6, 7 и штаммов, занимающих промежуточное положение между этими двумя группами. 3 и 9 (рис 2)

Состав групп быстрорастущих и медленнорастущих штаммов не изменялся при росте на всех изученных плотных средах. Относящиеся к промежуточной группе штаммы 3 и 9 при выращивании на ПША вошли в группу быстрорастущих штаммов. Штамм 3 при выращивании на средах ГСА и ЧДдэ вошел в группу медленнорастущих штаммов. На 7 исследованных плотных средах были составлены сравнительные ряды штаммов G. lucidum по скорости роста. Данные показывают, что соотношение скоростей роста штаммов на разных средах незначительно изменялось только в пределах выделенных групп

Рисунок 2. Скорость роста штаммов на средах ) CA б) КГА

Скорость роста штаммов G.lucidum на плотных средах при разных температурных режимах Учитывая, что разные штаммы G lucidum могут иметь различный температурный оптимум, на плотной среде КГА было проведено сравнительное изучение скорости роста штаммов G lucidum в зависимости от температурного режима При всех исследованных температурах штаммы четко делились на 3 группы по скорости роста Были установлены предпочтительные температурные режимы для всех исследованных штаммов G lucidum. Для штаммов 2, 4, 5, 8, 10, относящихся к группе быстрорастущих, и штаммов 3 и 9, относящихся к группе, занимающей промежуточное положение, это была температура 30°С. Наиболее благоприятной температурой для роста штамма 1 была температура 25°С, для штаммов 6 и 7 - 20-25°С (табл. 1).

Таблица 1. Ежесуточный прирост диаметра колоний штаммов G lucidum при различных температурах.

Штаммы Ежесуточный прирост диаметра колонии, мм

20°С 25°С 28° 30°

Штамм 1 5-11 11-17 3-10 3-5

Штамм 2 11-17 11-18 14-22 15-23

Штамм 3 10-13 13-16 13-16 15-22

Штамм 4 15-17 15-29 19-25 29-30

Штамм 5 15-17 17-26 18-29 29-30

Штамм 6 4-9 4,5-11 3-10 0

Штамм 7 4-10 3-12 3-10 0,5-2

Штамм 8 16-18 20-21 17-22 27-29

Штамм 9 10,5-15 13-15 11-16 17-22

Штамм 10 15,5-19 16-17 18-23 18-25

Пищевые потребности G.lucidum Анализируя характер роста штаммов G lucidum на плотных средах с точки зрения пищевых потребностей, можно сказать, что наиболее интенсивный рост всех штаммов был отмечен на натуральных средах CA, КГА, ПШкэ Высокие способности к утилизации различных по химической природе источников питания на плотных средах показали штаммы 4, 8 и 9, росшие на всех предложенных средах приблизительно с одинаковой скоростью Штаммы 2, 9, 10 лучше всего росли на КГА, штаммы 1 и 5 на CA, штаммы 3, б и 7 на ПШкэ Таким образом, корреляции между пищевыми потребностями и принадлежностью к группе по скорости роста не бьло

Пищевые потребности в погруженной культуре были изучены на 6 средах, различающихся сочетанием источников углерода и азота (табл 2). При погруженном культивировании было выявлено, что накопление биомассы штаммов 1, 2, 9 и 10 зависело от источника углерода Определяющим фактором для накопления биомассы штаммов 6 и 8 был источник азота У остальных штаммов накопление биомассы зависело от сочетаний источников углерода и азота.

В результате изучения пищевых потребностей для каждого из штаммов G lucidum было предложено по три наиболее эффективных среды.

Таблица 2. Содержание биомассы G lucidum на средах с разными сочетаниями источников азота и углерода.

Штамм Сутки Воздушно-сухая биомасса г/л

глюкоза растительное масло

соевая соевый дрожжевой соевая соевый дрожжевой

мука пептон экстракт мука пептон экстракт

среда среда среда среда среда среда

Ф1 Ф2 ФЗ Ф4 Ф5 Ф6

1 9 8,70 6,90 6,30 13,15 11,25 12,4

2 6 4,68 2,90 3,58 6,42 8,13 7,60

3 7 9,20 4,50 3,80 10,20 9,45 7,75

4 6 8,20 3,70 4,15 10,55 8,35 5,00

5 6 8,45 4,70 6,30 10,90 8,00 6,05

6 9 7,60 2,40 5,30 7,05 0 5,40

7 10 7,20 4,05 5,90 9,95 5,45 7,55

8 10 9,45 6,90 7,00 11,1 9,20 8,65

9 6 3,90 1,18 2,23 5,40 7,53 7,30

10 7 8,6 7,3 5,7 11,6 10,9 11,1

Накопление биомассы штаммов G. lucidum в процессе погруженного культивирования. На отобранных для каждого штамма средах был детально изучен процесс погруженного культивирования Длительность опытов по изучению динамики накопления биомассы всех штаммов не превышала 14 суток, вне зависимости от того, достигала ли культура стадии идиофазы или нет.

Полученные данные позволили разделить штаммы на быстрорастущие и медленнорастущие Разделение штаммов на медленнорастущие и быстрорастущие по линейной скорости роста на плотных средах коррелировало с данными выращивания в погруженной культуре Все штаммы, которые были отнесены нами в группы медленнорастущих и быстрорастущих по скорости роста на плотных средах, сохраняли свое положение и при выращивании в погруженной культуре Исключение составил пггамм 8, находящийся в группе быстрорастущих штаммов при выращивании на плотных средах, а при погруженном культивировании оказавшийся среди медленнорастущих штаммов Штаммы, занимающие промежуточное положение между быстрорастущими и медленнорастущими при выращивании на плотных средах, в погруженной культуре попали в группу быстрорастущих.

Полученные результаты (табл 3,4) послужили основой для отбора штамма перспективного для разработки способа получения биомассы в условиях погруженной культуры Были предложены следующие исходные условия отбора штамма- выход воздушно-сухой биомассы более 10 г/л при длительности ферментационного процесса не более 6 суток Сравнение количества биомассы всех штаммов, полученной на 6 сутки культивирования, показало, что условиям отбора отвечают три штамма - 4, 5 и 10 (табл 3). Однако, штамм 10 поступил в коллекцию последним, когда была завершена работа по оптимизации состава ферментационной среды для другого штамма Безусловно, штамм 10 является перспективным для продолжения исследований Таким образом, были отобраны два пггамма 4 и 5, максимальный выход биомассы которых более 10 г/л достигался за 5-6 суток (табл 4) Для окончательного выбора объекта для дальнейшей работы необходимо было оценить биологическую активность штаммов

Таблица 3. Выход биомассы штаммов G lucidum на 6 сутки культивирования

Штамм 1 Штамм 2 Штамм 3 Штамм 4 Штамм 5 .

Среды Ф4 Ф5 Ф6 Ф4 Ф5 Ф6 Ф1 Ф4 Ф5 Ф1 Ф4 Ф5 Ф1 Ф4 Ф5

г/л 8,8 9,0 9,5 8,2 8,6 7,2 8,2 8,4 9,4 10,2 9,7 10,0 10,1 10,6 10,7

Штамм 6 Штамм 7 Штамм 8 Штамм 9 Штамм 10

Среды Ф1 Ф4 Ф6 Ф1 Ф4 Ф6 Ф1 Ф4 Ф5 Ф4 Ф5 Ф6 Ф4 Ф5 Ф6

г/л 6,15 <5,9 <5,7 5,5 5,5 5,6 6,1 8,8 8,6 7,4 6,7 7,2 9,2 7,2 10,4

Ряд штаммов накапливал биомассу свыше 13 г/л (табл 4) за более длительный срок-от 8 до 11 суток Однако известно, что увеличение выхода биомассы представляет собой более простую задачу по сравнению с сокращением длительности процесса культивирования.

Таблица 4. Максимальный выход биомассы штаммов G lucidum.

Штаммы Среды Максимальный выход биомассы, г/л Длительность культивирования,сутки

1 Ф4 133 9

Ф5 113 8

Ф6 133 11

2 Ф4 143 8

Ф5 10,0 11

Ф6 7,6 5

3 Ф1 8,2 6

Ф4 103 8

Ф5 14,2 9

4 Ф1 10,25 6

Ф4 10,98 5

Ф5 из 7

5 Ф1 10,1 6

Ф4 10,95 5

Ф5 11,7 7

6 Ф1 7,7 9

Ф4 6,8 9

Ф6 6 8

7 Ф1 8,7 10

Ф4 10,9 14

Ф6 10,2 14

8 Ф1 9,8 10

Ф4 11,05 10

Ф5 103 8

9 Ф4 13,2 9

Ф5 8,8 7

Фб ИЗ 9

10 Ф4 13,1 8

Ф5 юз 7

Ф6 11,1 7

Определение содержания полисахаридов в водных экстрактах мицелия и плодовых тел G. lucidum. Из мицелия десяти штаммов G. lucidum были приготовлены водные экстракты. Количество сухого вещества в экстрактах составило 11-15 мг/мл Методом количественного определения полисахаридов с помощью цветной реакции с фенолом и серной кислотой было показано, что свыше 20% водорастворимых полисахаридов содержал мицелий штаммов 4, 5, 8, 9,10.

Таблица 5. Количество водорастворимых полисахаридов, извлекаемых кипящей

водой из сухого мицелия штаммов G. lucidum, %.

Штамм 1 Штамм 2 Штамм 3 Штамм 4 Штамм 5 Штамм 6 Штамм 7 Штамм 8 Штамм 9 Штамм 10

16 14 17 21 22 10 14 25 20 25

Изучение антибиотического действия штаммов G. lucidum Изучение антибиотического действия всех исследованных штаммов G lucidum, проведенное на 10 тест-объектах, показало наличие антибиотического действия штаммов G lucidum в отношении всех исследованных грамположительных бактерий, Pseudomonas aeruginosa и Comamonas terrigena, относящихся к и грамотрицательных бактериям, дрожжей Candida albicans и мицелиальных грибов Aspergillus niger, Fusarium bulbigenum В отношении Escherichia coli ни один штамм активности не показал. Действующие вещества содержались в мицелии и культуральной жидкости штаммов G. lucidum Штаммы различались по спектру антибиотического действия и активности. В большей степени антибиотические свойства были выражены у штамма 5 (табл. 6).

Таблица 6. Диаметр зоны ингибирования роста микроорганизмов экстрактами

мицелия и культуральной жидкости штаммов G.lucidum (максимальные значения), мм

штаммы

тест-^v. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

объекты

Bacillus 8 7 9 15 21 0 7 8 9 12

subtilis

В. cereus 0 14 11 13 16 10 13 0 0 7

subsp. mycoides

Staphylococcus 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0

aureus

Micrococcus 0 0 0 12 18 0 0 0 0 11

luteus

Pseudomonas 0 0 0' 15 8 0 0 0 0 9

aeruginosa

Escherichia 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

coli

Comamonas 7 7 9 11 10 9 7 7 7 9

terrigena

Candida 0 0 9 0 12 0 0 0 0 0

albicans

Aspergillus 0 0 0 0 17 0 0 0 0 8

niger

Fusarium 0 0 0 12 12 0 0 0 0 10

bulbigenum

Предварительная оценка противоопухолевого действия G. lucidum. Для

предварительной оценки противоопухолевого действия G lucidum был выбран штамм 5 На первом этапе был приготовлен водный экстракт мицелия изучаемого штамма G lucidum Метод экстракции обеспечивал получение водорастворимых полисахаридов. Количество сухого вещества в экстракте составляло 12 мг/мл Действие водного экстракта оценивали в моделях т vivo на перевиваемой асцитной Т-лимфоме EL-4 на мышах-гибридах линии B6D2F1 при внутрибрюшинном введении Внутрибрюшинное введение трех доз 0,2; 0,3 и 0,5 мл/сутки водного экстракта сухого мицелия G lucidum тормозило рост асцитной лимфомы Значительных различий между изученными концентрациями водного экстракта обнаружено не было Было показано, что внутрибрюшинное введение водного экстракта статистически достоверно увеличивало продолжительность жизни опытных мышей по сравнению с контролем

Таким образом, на основании сопоставления результатов погруженного культивирования, изучения антибиотических и противоопухолевых свойств штамм 5 был выбран в качестве объекта дальнейших исследований.

Разработка метода погруженного культивирования. Для установления оптимальных условий роста штамма 5 G lucidum, отобранного в предыдущих опытах, в погруженной культуре была изучена зависимость его развития от ряда факторов, влияющих на рост грибов Было исследовано влияние температуры, концентрации ионов водорода в среде, аэрации, качественного состава питательной среды и количественного соотношения ее ингредиентов на накопление вегетативной биомассы гриба Влияние факторов оценивали по выходу воздушно-сухой биомассы

Уровень pH среды Изучение уровня pH среды при культивировании 5 штамма показало, что искусственное изменение исходного уровня pH среды не приводит к увеличению количества биомассы Оптимальным исходным уровнем pH на этом этапе работы оказался натуральный уровень pH среды, составляющий 6,0-6,1

Температура Сравнение влияния температур 25 и 28°С на накопление мицелия 5 штамма в погруженной культуре показало, что изменение температуры в указанных пределах не приводит к существенным различиям в выходе биомассы

Аэрация Изучение влияния режима аэрации на рост культуры проводили в колбах на качалке, изменяя соотношение объема среды и объема колбы Было показано, что меньший объем среды и, следовательно, усиленный режим аэрации способствует большему выходу биомассы

Оптимизация количественного состава питательной среды методами математического планирования Известно, что при оценке пищевых потребностей следует учитывать не только качественный состав источников питания, который был разработан в

предыдущих опытах, но также их количественное соотношение Методы математического планирования эксперимента относятся к наиболее удобным средствам разработки оптимального количественного состава питательных сред Для создания оптимальной среды были использованы метод полного факторного эксперимента (ПФЭ) и метод крутого восхождения (КВ)

Оптимизация была проведена в 3 этапа (табл 7), опыты ставили в трехкратной повторности Критерием оценки эффективности среды служил выход воздушно-сухой биомассы

Таблица 7. Общая схема экспериментов по оптимизации состава питательной среды

для погруженного культивирования G lucidum

Эксперимент Характеристика I этап II этап III этап

оптимизациии оптимизациии оптимизациии

Варьируемые факторы Глюкоза, Глюкоза, Глюкоза,

соевая мука, фосфат калия, растительное масло растительное масло,

сульфат магния соевая мука

ПФЭ Количество

комбинаций 16 4 8

варьируемых факторов

Значимые факторы Глюкоза, Глюкоза, Растительное

соевая мука, растительное масло, соевая

фосфат калия масло мука

Варьируемые факторы Глюкоза, Глюкоза, Растительное

соевая мука, растительное масло, соевая

по методу фосфат калия масло мука

КВ Количество

комбинаций 5 6 9

варьируемых факторов

Шаг, обеспечивающий

максимальный выход 4 5 7

биомассы

Результат по Увеличение Увеличение Увеличение

сравнению с исходной выхода на 20%, выхода на 94 % выхода на 113 %

средой сокращение сокращение сокращение

длительности на длительности на длительности на

2 суток 2 суток 2 суток

На первом этапе в качестве исходной была взята среда, содержащая глюкозу 20 г/л, соевую муку 10 г/л, фосфат калия 3 г/л, сульфат магния 0,2 г/л (среда Ф1) Указанные концентрации были приняты за средний уровень в матрице планирования ПФЭ1 Длительность процесса культивирования составляла 6 суток.

По результатам ПФЭ1 были оценены коэффициенты регрессии, сравнение которых с величиной доверительного интервала показало, что на 5% уровне значимости концентрация соевой муки находилась в лимитирующей области, глюкозы и фосфата калия - в

ингибирующей Следовательно, для оптимизации соотношения источников питания в среде нужно было повышать уровень соевой муки и понижать концентрации глюкозы и фосфата калия.

На основании полученных данных в ПФЭ1 был поставлен первый опыт по методу крутого восхождения (КВ1), в котором осуществляли одновременное изменение концентраций всех значимых факторов по алгоритму, рассчитанному точно в соответствии с величинами коэффициентов регрессии. Восхождение было начато от исходного состава среды Максимальный показатель содержания биомассы - 11,55 г/л был отмечен на 4 шаге КВ1 (табл 7) На среде, полученной на этом шаге, был поставлен эксперимент по изучению процесса накопления биомассы Результаты проведенного опыта показали, что максимум накопления биомассы G. lucidum штамма 5 сместился с 6 суток на 4 сутки. Таким образом, на данном этапе оптимизации была получена среда, на которой выход биомассы в сравнении с исходной повысился на 20 %, а сроки выращивания культуры сократились на двое суток

Одним из важнейших факторов погруженного культивирования, влияющих на рост базидиомицетов, является уровень pH культуральной среды Согласно данным, полученным в ПФЭ1, выход биомассы G lucidum коррелировал с конечным значением pH культуральной жидкости (рис 3) В этом опыте уровни pH ниже 4,5 сопровождались низким выходом биомассы

Рисунок 3. Выход биомассы G lucidum в зависимости от конечного pH культуральной жидкости.

.»♦ <

6 рн 1

Результаты ПФЭ1 и КВ1 позволили установить корреляцию между содержанием глюкозы, конечным значением pH культуральной жидкости и выходом биомассы. В целом, неблагоприятные условия для развития G. lucidum в погруженной культуре возникают при значениях pH среды ниже 4. Низкий уровень конечного pH среды, как и следовало ожидать, был отмечен в средах с высоким уровнем глюкозы.

Основные пути регуляции значений конечного pH культуральной среды сводятся либо к повышению исходного значения pH питательной среды, либо к введению в среду буфера, либо к снижению концентрации глюкозы. Недостатком первого пути является

создание неблагоприятных условий для объекта на начальных этапах культивирования, что было показано в предыдущих опытах Во втором случае возникает необходимость дополнительного введения в среду фосфатов, что, согласно результатам ПФЭ1, приводит к неизбежному отрицательному влиянию на накопление биомассы гриба Осуществление третьего пути регуляции pH среды за счет снижения содержания глюкозы вызовет снижение выхода биомассы G lucidum за счет недостаточного содержания источника углерода Чтобы избежать этого, целесообразно было включить в состав среды второй источник углерода, утилизация которого не приводила бы к резкому снижению уровня pH культуральной среды в процессе культивирования Это и стало предметом дальнейших работ по оптимизации питательной среды

Исходя из результатов предыдущих опытов, в качестве второго источника углерода было выбрано растительное масло Суммарная исходная концентрация источников углерода равнялась содержанию глюкозы в среде, полученной в KB 1, а их соотношение равнялось 1 1 Все остальные компоненты среды были оставлены без изменения Данная среда была выбрана в качестве среднего уровня для проведения ПФЭ второго этапа оптимизации (ПФЭ2) Оба источника углерода находились в лимитирующей области, что свидетельствовало о необходимости увеличения их концентрации в среде

На основании полученных результатов в ПФЭ2 была составлена матрица для проведения опыта по методу крутого восхождения (КВ2), где одновременно изменяли концентрации источников углерода строго в соответствии с коэффициентами регрессии, полученными в ПФЭ2. В результате опыта, проведенного по методу КВ2, на 5 шаге эксперимента была получена среда, на которой выход биомассы составил 18,4 г/л на 4 сутки культивирования. Так же как и на среде, полученной в КВ1, максимум накопления воздушно-сухой биомассы приходился на 4 сутки культивирования.

Для получения сбалансированной среды для погруженного культивирования G lucidum необходимо было выявить оптимальное соотношение источников углерода и азота. С этой целью бьи поставлен третий блок опытов, состоящий из ПФЭЗ и КВЗ (табл. 7) Среда, отобранная в КВ2, как наиболее продуктивная, была взята за средний уровень ПФЭЗ для изучения трех факторов. На образование биомассы влияние оказывали растительное масло и соевая мука Концентрация растительного масла и соевой муки находилась в лимитирующей области, это значило, что для увеличения выхода биомассы гриба нужно было повышать их содержание в среде. На основании этих данных был поставлен опыт по методу крутого восхождения Наибольшее количество биомассы было получено на 7 шаге эксперимента, составив 20,2 г/л. На полученной среде был изучен процесс накопления биомассы Было показано, что максимум накопления биомассы также как и в предыдущих опытах приходился на 4 сутки.

В результате проведенной оптимизации были получены составы сред для погруженного культивирования G lucidum, обеспечивающие двукратное увеличение выхода биомассы в сравнении с исходным уровнем Последующее ведение процессов погруженного культивирования на оптимизированных средах показало, что максимум содержания биомассы отмечается к 4 суткам и варьирует в пределах 19-21 г/л Следует отметить, что лучшие из приведенных в литературе способов погруженного культивирования G lucidum обеспечивают аналогичные выходы биомассы за 12-16 суток в колбах на качалке или в биореакторе (Fang et al., 2002; Fang&Zhong, 2002; Lomberh et al, 2002; Tang&Zhong 2002, 2003)

Получение плодовых тел штамма 5 G.lucidum. В целях сравнения противоопухолевой активности препаратов мицелия с аналогичной активностью препаратов плодовых тел штамма 5 были получены плодовые тела этого штамма G lucidum по модифицированной интенсивной технологии Модификация включала в себя использование в качестве промежуточной культуры вегетативного мицелия, полученного в погруженных условиях В результате было отмечено сокращение длительности отдельных фаз процесса Описан морфогенез плодовых тел в культуре

Противоопухолевые свойства G.lucldum Как известно, противоопухолевыми свойствами обладают полисахариды и тритерпены G lucidum Основную роль в противоопухолевых свойствах G lucidum играют полисахариды, реализующие свое действие путем стимуляции иммунной системы (Hobbs, 1995; Wasser&Weis, 1999; Lin & Zhang, 2004)

Наиболее функциональным введением лекарственных препаратов является пероральное введение Однако такой метод введения полисахаридных препаратов в большинстве случаев приводит к снижению их активности Задачей следующего этапа нашей работы было создание такого препарата, который бы был эффективен при пероральном введении В этих опытах анализировали методы экстракции, а именно соотношение экстрагируемого материала и экстрагента, температуру и длительность процесса экстракции, методы химической очистки препаратов, зависимость наблюдаемого эффекта от дозы препарата

Оценку противоопухолевой активности водного экстракта мицелия при пероральном введении проводили на солидной Т-лимфоме EL-4 на мышах-гибридах линии B6D2F1 Введение неочищенного водного экстракта G. lucidum per os не дало самостоятельной противоопухолевой активности. Однако при введении этого экстракта совместно с низкой дозой ЦФ, часто используемого в практической онкологии, эффект последнего возрастал

Следующим этапом работы было выделение действующих веществ из водных экстрактов Эта часть работы проводилась совместно с лабораторией растительных

полисахаридов ИОХ им Н Д Зелинского РАН под руководством профессора, д х н А И Усова Из водного экстракта были выделены две фракции биополимеров, различающихся степенью растворимости в воде Полисахариды этих биополимеров были подвергнуты полному гидролизу, и их моносахаридный состав определен с помощью газожидкосгной хроматографии Фракции имели одинаковый качественный состав моносахаридов, однако различались их количественным соотношением (табл. 8)

Таблица 8. Моносахаридный состав полисахаридных фракций 1 и 2

Фракции Арабиноза, % Ксилоза, % Манноза, % Галактоза, % Глюкоза, % Всего полисахаридов, %

ПСХ 1 6,24 3,68 2,46 20,80 18,30 51,48

ПСХ2 2,50 0,77 4,34 8,42 13,23 29,26

Действие этих фракций было испытано на мышах с солидной лимфомой ЕЬ-4 при пероральном введении Эти фракции проявили как самостоятельный противоопухолевый эффект, так и значительное усиление действия ЦФ при совместном введении с этим препаратом Обе фракции продемонстрировали снижение прививаемости опухоли, потенцирование действия ЦФ, фракция 2 проявила значительное самостоятельное ингибирующее действие на рост опухоли (табл. 9).

Таблица 9. Противоопухолевое действие полисахаридных фракций водного экстракта мицелия G. lucidum.

Группы мышей Прививаемость ТРО на 18 день ТРО на 29 день

опухоли, % опыта, % опыта, %

Контроль роста опухоли 50 - -

ЦФ 33 10 17,4

ПСХ1 20 90,5 4,1

ПСХ1 + ЦФ 22 98,1 83,2

ПСХ2 10 99,3 94,5

ПСХ2 + ЦФ 30 81,7 71,5

С учетом того, что обе полисахаридные фракции обладали противоопухолевым действием в дальнейших опытах испытывали объединенную фракцию (ОПСХ), получаемую по разработанной методике экстракции и очистки При сравнении доз ОПСХ 1, 2, 5, 10 и 20 мг/кг лучшие результаты были получены при использовании дозы 2 мг/кг

Для проведения сравнительного изучения противоопухолевого действия препаратов из мицелия и плодовых тел одного штамма были приготовлены полисахаридные фракции водных экстрактов мицелия и плодовых тел штамма 5 G lucidum Содержание

водорастворимых полисахаридов в экстрактах мицелия и плодовых тел не различалось между собой и составляло 21-22% Изучение моносахаридного состава объединенной полисах аридной фракции мицелия и полисахаридной фракции плодовых тел выявило качественные и количественные различия (табл. 10)

Таблица 10. Состав объединенных полисах аридных фракций из водных экстрактов мицелия и плодовых тел.

Полисахаридная фракция мицелия, % Полисахаридная фракция плодовых тел, %

Арабиноза 3,27 - 5,25 3,04

Ксилоза 1,37-1,95 0,69

Манноза 2,08 - 2,33 2,31

Галактоза 11,88- 13,92 7,45

Глюкоза 14,85 - 16,38 27,42

Рамноза 0,67- 1,04 0

Всего полисахаридов 34,12-40,87 40,91

Проведение сравнительного изучения противоопухолевого действия этих фракций на мышах с лимфомой Р388 показало значительный противоопухолевый эффект обеих фракций, практически одинаковый по значению ТРО (таблП) Пероральное введение полисахаридных фракций из мицелия и плодовых тел в дозировке 2 мг/кг достоверно тормозило развитие опухоли после окончания курса лечения.

Таблица II. Торможение роста опухоли, %.

8 сутки 10 сутки 14 сутки 17 сутки

Полисахаридная фракция из мицелия, 2 мг/кг 94 80 62 44

Полисахаридная фракция из плодовых тел, 2 мг/кг 92 87 48 59

Полисахаридная фракция мицелия (ОПСХ) была передана для изучения в лабораторию комплексной терапии опухолей Института экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им Н Н Блохина РАМН под руководством д м.н. Е М. Трещалиной Проведенные эксперименты на трех мышиных опухолях (Т-лимфоме Р-388, карциноме молочной железы Са-755 и саркоме 180) подтвердили противоопухолевую активность ОПСХ На 7 сутки после окончания лечения торможение роста опухоли Са755 составило 88%, торможение роста саркомы 180 на последний день введения препарата было

71% , на 2 сутки после окончания лечения торможение роста Т-лимфомы Р-388 составило 79%

Получены опытные партии полисахаридной фракции мицелия G lucidum для дальнейшего изучения их биологической активности и установления химического строения

Выводы

1 Изучены морфологические характеристики колоний 10 штаммов G lucidum и составлено их морфологическое описание при росте на 7 плотных средах Колонии штаммов различаются по текстуре, форме края, образованию пигмента, наличию концентрических зон, интенсивности развития воздушного мицелия Выявлены специфические морфологические черты отдельных штаммов и рекомендован минимальный набор сред (среда Чапека-Докса с дрожжевым экстрактом, сусло-агар и картофельно-глюкозный агар), обеспечивающий их проявление

2 По скорости линейного роста на плотных средах были выделены группа быстрорастущих штаммов G lucidum 2, 4, 5, 8, 10 и группа медленнорастущих - 1, 6, 7 Штаммы 3 и 9 составили промежуточную группу при росте на всех изученных средах, за исключением пшеничного агара, при росте на котором они вошли в группу быстрорастущих и сред с глюкозой и соевой мукой и Чапека-Докса с дрожжевьм экстрактом, при росте на которых штамм 3 вошел в группу медленнорастущих Быстрорастущие штаммы и штаммы, занимающие промежуточное положение, показали наибольшую скорость роста при температуре 30°С Наиболее благоприятной для роста штамма 1 была температура 25°С, для штаммов 6 и 7 температуры в интервале 20-25°С

3 Выявлены пищевые предпочтения штаммов G lucidum и предложены составы плотных и жидких питательных сред для каждого штамма В целом для выращивания культур данного вида на плотных средах можно рекомендовать картофельно-глюкозный агар, сусло-агар и пшеничный агар с кукурузным экстрактом, в погруженной культуре - среду с соевой мукой и растительным маслом

4 Изучен процесс погруженного культивирования 10 штаммов G lucidum на отобранных для каждого штамма трех эффективных средах Штаммы разделены на группы по скорости и уровню накопления биомассы Скорость накопления биомассы в погруженной культуре коррелировала со скоростью линейного роста штаммов на плотных средах

5 Обнаружены антибиотические свойства штаммов G. lucidum в отношении грамположигельных и грамотрицательных бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов Действующие вещества содержались в мицелии и культуральной жидкости штаммов G lucidum Штаммы различались по спектру антибиотического действия и активности В наибольшей степени антибиотические свойства были выражены у штамма 5

6 На основании результатов определения длительности процесса погруженного культивирования и выхода биомассы, антибиотической активности и противоопухолевого действия отобран пггамм 5 G lucidum для разработки способа получения биологически активной биомассы

7 Разработан метод погруженного культивирования штамма 5 G. lucidum С применением методов математического планирования эксперимента составлены композиции питательных сред для погруженного культивирования G lucidum, обеспечивающие двукратное увеличение выхода биомассы по сравнению с исходным уровнем и сокращение длительности культивирования до 4х суток

8 Получены экстракты мицелия и плодовых тел штамма 5 G lucidum и их полисахаридные фракции, обладающие противоопухолевой активностью Полисахарвдные фракции мицелия и плодовых тел одного штамма оказывают равный противоопухолевый эффект. Установлена зависимость противоопухолевого действия от применяемой дозы препарата

Автор выражает сердечную благодарность д б н J1М Краснопольской и профессору, д б н JIВ Гарибовой за внимательное руководство Глубокую благодарность автор выражает д м н В М Бухману, профессору, дх н А И Усову, д м н ЕМ Трещалиной за возможность проведения комплексных исследований, профессору, д б н В Н Максимову за научные консультации, а также сотрудникам кафедры микологии и альгологии МГУ им М В Ломоносова и лаборатории биосинтеза биологически активных соединений ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им Г Ф Гаузе РАМН, оказавшие поддержку и помощь в проведении работы

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Завьялова Л А , Антимонова А В , Гарибова Л.В, Краснопольская Л М Штаммовые особенности чистых культур трутовика лакированного Ganoderma lucidum (Curt Fr) Karst // Современная микология в России Тезисы докладов Первого съезда микологов Москва, 2002 - с.147

Краснопольская Л М , Антимонова А В , Белицкий И В , Бухман В М, Исакова Е Б, Федорова Г.Б, Гарибова Л В Закономерности накопления биомассы и образования биологически активных метаболитов грибом Ganoderma lucidum (Curt Fr) P Karst в погруженной культуре //Физиология и биохимия культивируемых грибов Материалы международной конференции. Саратов, 2002. - с.28-29

Завьялова Л А, Антимонова А В, Гарибова Л В Биология ксилотрофного базидиомицета трутовика лакированного Ganoderma lucidum (Curt Fr) P Karst II Проблемы лесной фитопатологии и микологии Материалы 5-ой международной конференции. Москва, 2002. - с. 92-94.

Бухман В М , Исакова Е Б , Антимонова А.В , Белицкий И В , Либензон А В , Краснопольская Л.М Изучение противоопухолевых свойств мицелия лекарственного гриба Ganoderma lucidum (Curt Fr) P Karst в опытах in vivo II Успехи медицинской микологии Материалы первого всероссийского конгресса по медицинской микологии. Москва, 2003 - т 1 - с 245-247

Краснопольская Л.М , Антимонова А В., Белицкий И В., Соболева Н Ю., Гарибова Л В Получение биомассы лекарственных грибов трутовика лакированного Ganoderma lucidum (Curt Fr) Р Karst и шиитаке Lentinus edades (Berk) Singe погруженной культуре II Успехи медицинской микологии. Материалы первого всероссийского конгресса по медицинской микологии Москва, 2003 - т 1 - с 281283.

Краснопольская Л М, Антимонова А В , Белицкий И.В , Бухман В М, Исакова Е Б, Либензон А В Завьялова Л А, Гарибова Л В Лекарственный базидиальный гриб трутовик лакированный Ganoderma lucidum (Curt. Fr) Р Karst погруженное культивирование и противоопухолевые свойства // в сб Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты Москва, 2003 -вып 9 - с 46-55 Антимонова А В Биотехнологический способ получения биологически активной биомассы базидиального гриба Ganoderma lucidum И Биология - наука XXI века Тезисы докладов 7-й Пущинской школы-конференции молодых ученых Пущино, 2003 - с 85

8 Гарибова Л.В., Антимонова A.B., Завьялова JI.A., Краснопольская JI.M. Рост и морфологические признаки мицелия трутовика лакированного Ganoderma lucidum в зависимости от условий культивирования // Микология и фитопатология, 2003 -т 37 -выпЗ - с 14-19.

9 Краснопольская Л М , Белицкий И В , Антимонова А В , Соболева Н Ю. Стратегия оптимизации способов культивирования лекарственных грибов // Успехи медицинской микологии Материалы второго всероссийского конгресса по медицинской микологии Москва, 2004 - т 3 - с 222-224

10 Завьялова ЛА, Чистякова ЕЛ, Инсарова ИД, Антимонова AB Штаммовое разнообразие трутовика лакированного Ganoderma lucidum II Микология и фитопатология, 2005. - т 39. -вып 1.-е 27-34.

П.Автономова AB Завьялова Л А, Гарибова Л В., Краснопольская Л.М Изучение физиологических характеристик штаммов Ganoderma lucidum (Curt Fr) Р Karst // Успехи медицинской микологии Материалы третьего всероссийского конгресса по медицинской микологии Москва, 2005. - т 5.-е 164-166

12 Автономова AB, Либензон AB. Изучение морфолого-физиологических характеристик и противоопухолевой активности лекарственного базидиального гриба Ganoderma lucidum (Curt Fr) Р Karst // Окружающая среда и здоровье Материалы всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Суздаль,2005 -с 315-317.

13. Krasnopolskaya L, Belitsky I, Avtonomova A , Soboleva N, Usov A , Isakova E, Libenzon A, Bukhman V Screening system for medicinal basidiomycetes antitumor extracts // International Journal of Medicinal Mushroom, 2005. - vol. 7 - p. 423-425.

14 Автономова А В , Краснопольская Л M , Максимов В Н Оптимизация состава питательной среды для погруженного культивирования Ganoderma lucidum (Curt Fr) P Karst II Микробиология, 2006 - т. 75 - вып 2 (в печати)

Отпечатано в типографии ОАО «КТЗ» 248010 г.Калуга, ул.Московская,241

Формат 60 х 84/16 Уел Печ Листов 1,4 Тираж! 00 экз Заказ 712

ЧЗо

430

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Автономова, Анастасия Витальевна

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1. Историческая справка.

2. Таксономическое положение G.lucidum.

3. Морфологическое описание G.lucidum.

4. Биология G. lucidum.

5. Методы и условия культивирования.

5.1 Выращивание на плотных средах.

5.2 Получение плодовых тел.

5.3 Погруженное культивирование.

6. Химическая природа биологически активных компонентов G.lucidum.

7. Методы выделения и химической очистки биологически активных полисахаридов G.lucidum.

8. Биологическое действие G. lucidum.

8.1 Противоопухолевое и иммуностимулирующее действие.

8.2 Противовирусное действие.

8.3 Антибиотическое действие.

8.4 Противовоспалительное и противоаллергенное действие.

8.5 Гиполипидемическое действие.

8.6 Гипогликемическое действие.

8.7 Действие на сердечно-сосудистую систему.

8.8 Противотромбозное действие.

8.9 Гепатопротекторное действие, стимуляция функции печени.

8.10 Действие на дыхательную систему.

8.11 Регуляция нервной системы.

8.12 Другие эффекты.

9. Препараты из G. lucidum.

Глава II. Материалы и методы.

1. Объекты исследования.

2. Хранение культур G.lucidum.

3. Культивирование на плотных средах.

4. Морфология штаммов G.lucidum.

5. Погруженное культивирование G.lucidum.

6. Оптимизация состава среды для погруженного культивирования G.lucidum.

7. Получение плодовых тел.

8. Изучение антибиотического действия штаммов G.lucidum.

9. Получение водных экстрактов и их фракций из мицелия и плодовых тел

G.lucidum.

10. Определение содержания полисахаридов в водных экстрактах мицелия и плодовых тел.

11. Определение моносахаридного состава полисахаридных фракций.

12. Изучение противоопухолевых свойств G.lucidum.

Глава III. Результаты и обсуждение.

1. Изучение роста штаммов G.lucidum на плотных средах.

1.1 Морфология колоний.

1.2 Пищевые потребности штаммов G.lucidum.

1.3 Скорость роста штаммов на различных плотных средах.

1.4 Скорость роста штаммов на плотных средах при разных температурных режимах.

2. Изучение процесса погруженного культивирования штаммов G.lucidum.

2.1 Пищевые потребности штаммов G.lucidum.

2.2 Накопление биомассы штаммов G.lucidum в процессе погруженного культивирования.

3. Изучение микроморфологии штаммов G.lucidum.

4. Определение содержания водорастворимых полисахаридов в мицелии и плодовых телах G.lucidum.

5. Изучение антибиотического действия штаммов G.lucidum.

6. Разработка метода погруженного культивирования.

6.1 Уровень рН среды.

6.2 Температурный режим.

6.3 Аэрация.

6.4 Оптимизация количественного состава питательной среды методами математического планирования эксперимента.

7. Получение плодовых тел штамма 5 G.lucidum.

8. Изучение противоопухолевых свойств G.lucidum.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P. Karst., трутовик лакированный: штаммовое разнообразие, антибиотические свойства и противоопухолевое действие"

В последние десятилетия ведутся активные поиски биологически активных веществ природного происхождения. Внимание исследователей в первую очередь привлекают к себе природные объекты, которые использовались в качестве лекарственных средств в народной медицине. Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P. Karst. - трутовик лакированный, один из известных базидиальных грибов, используемый в лечебных целях с давнего времени. Его применяли при разнообразных заболеваниях, в том числе бронхиальной астме, неврастении, гастрите, болезнях печени. Интенсивные исследования G. lucidum в течение последних десятилетий привели к выделению биологически активных метаболитов, прежде всего полисахаридов и тритерпенов, оказывающих иммуностимулирующее, противоопухолевое, гиполипидемическое, гипогликемическое, гепатопротекторное, противовирусное, противовоспалительное действие (Sone et al., 1985; Hikino&Mizuno, 1989; Jong&Birmingham, 1992; Mizuno 1993; Hobbs, 1995; Mizuno et al., 1995a,b,c; Stavinoha et al., 1995; Wasser&Weis, 1997; Gao et al., 2002,2004a,b,c; Lin & Zhang, 2004).

Большинство работ по поиску и выделению биологически активных веществ из G. lucidum проведено с использованием плодовых тел, зачастую дикорастущих (Miyazaki&Nishijima, 1981; Hikino et al., 1985,1989; Hirotani et al., 1985; Morigiwa, 1986; Lin&Tome, 1991; Hattori, 1997; Wang et al., 1997; El-Mekkawy et al., 1998; Cao&Lin, 2004; Berger et al., 2004). В результате разработаны многочисленные запатентованные формулы биологически активных добавок, чаев и тонизирующих напитков на основе плодовых тел гриба. Известен один лекарственный препарат китайского происхождения (SunRecome, Green Valley Holding Company, Ltd., Шанхай, Китай), получаемый из выращенных по экстенсивной технологии плодовых тел G. lucidum.

Несмотря на то, что общий объем публикаций, посвященный G. lucidum, чрезвычайно велик, в нем очень мало работ по исследованию биологической активности вегетативного мицелия, по изучению закономерностей роста G. lucidum в погруженной культуре. В то же время, очевидно, что использование погруженного мицелия для получения биологически активных метаболитов может облегчить дальнейшую стандартизацию материала и обеспечить воспроизводимость биологических эффектов. Однако, описанные в литературе способы погруженного культивирования не могут служить основой рентабельных производств из-за своей длительности, составляющей 12 - 16 суток (Fang et al., 2002; Fang&Zhong, 2002a,b,с; Lomberh et al., 2002; Tang&Zhong 2002a,b, 2003). Кроме того, существует огромный разрыв между изучением биологической активности G. lucidum и исследованиями штаммового разнообразия. Практически не изучены морфологические, физиологические и биохимические особенности штаммов G. lucidum, необходимые для выявления наиболее перспективных для практического использования штаммов. Недостаточно исследованы антибиотические свойства G. lucidum, которые должны быть обязательно проведены для всех продуктов, рекомендуемых для перорального введения.

В связи с этим важное значение имеет комплексное изучение штаммового разнообразия G. lucidum, создание эффективных способов погруженного культивирования и оценка биологической активности получаемого материала штаммов, в том числе противоопухолевых свойств и антибиотического действия.

Цели и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении штаммового разнообразия G. lucidum на вегетативной (мицелиальной) стадии по морфолого-физиологическим признакам и антибиотическим свойствам, в изучении противоопухолевого действия экстрактов мицелия и их фракций.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучение морфолого-культуральных характеристик штаммов G. lucidum при росте на широком наборе плотных питательных сред и при различных температурных режимах.

2. Изучение пищевых потребностей штаммов G. lucidum при выращивании на плотных средах и в погруженной культуре.

3. Изучение процессов погруженного культивирования штаммов G. lucidum.

4. Изучение антибиотических свойств штаммов G. lucidum.

5. Отбор перспективного для получения биологически активной биомассы штамма G. lucidum.

6. Разработка способа погруженного культивирования отобранного штамма, включая оптимизацию состава ферментационной среды методами математического планирования.

7. Получение из мицелия и плодовых тел отобранного штамма G. lucidum экстрактов и их фракций с целью оценки их противоопухолевого действия в системе in vivo при различных способах введения.

Заключение Диссертация по теме "Микология", Автономова, Анастасия Витальевна

Результаты исследования позволили выбрать минимальный набор сред, который обеспечивал проявление специфических черт всех изученных штаммов. В число этих сред вошли: A3 - среда Чапека-Докса с дрожжевым экстрактом, А5 - сусло-агар и А7 — картофельно-глюкозный агар.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Автономова, Анастасия Витальевна, Москва

1. Бондарцева М.А. Определитель грибов России. Пор. Афиллофоровые. вып. 2. Санкт-Петербург: Наука, 1998. - 390 с.

2. Бухало А.С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. Киев: Наукова думка, 1988.- 176 с.

3. Денисова Н.П. Лечебные свойства грибов. Этномикологический очерк. Санкт-Петербург: СПГМУ, 1998. - 60 с.

4. Дудка И.А., Бисько Н.А., Бухало А.С., Вассер С.П., Кулиш М.Д., Соломко Э.Ф., Шевченко С.В. Высшие съедобные базидиомицеты в поверхностной и глубинной культуре. Киев: Наукова думка, 1983. - 311 с.

5. Захаров И.А., Касперавичюс М.М. Грибы в мифах и обрядах. Краткий очерк этномикологии // Микологии и фитопатология. 1981. - Т. 15, № 1. - С. 66-72.

6. Захарова И.Я., Косенко JI.B. Методы изучения микробных полисахаридов. — Киев: Наукова думка, 1982.-192 с.

7. Максимов В.Н. Многофакторный эксперимент в биологии.-М.:Из-во МГУ, 1980. 280с.

8. Максимов В.Н., Федоров В.Д. Применение методов математического планирования эксперимента. М.: МГУ, 1969. - 128 с.

9. Методы экспериментальной микологии: Справочник / Под ред. В.И. Билай. Киев: Наукова думка, 1982. - 550 с.

10. Решетников С.В. Эволюция бесполого размножения высших базидиомицетов. Киев: Наукова думка, 1991. - 187 с.

11. Тадаши Г., Мелик-Оганджанян Р.Г., Мнацаканян В.А. Изучение и использование свойств гриба Ganoderma lucidum (Fr.) Karst. в современной медицинской практике. // Альтернативная медицина. 1998, январь-март. - С.29-36.

12. Шиврина А.Н. Биологически активные вещества высших грибов.-Л.:Наука, 1965.-199 с.

13. Шиврина А.Н., Низковская О.П., Фалина Н.Н., Маттисон Н.Л., Ефименко О.М. Биосинтетическая деятельность высших грибов. Л.: Наука, 1969. - 243 с.

14. Adaskaveg J.E., Gilbertson R.L. Cultural studies and genetics of sexuality of Ganoderma lucidum and G. tsugae in relation to the taxonomy of the G. lucidum complex //Mycologia. -1986. Vol. 78, № 5. - P.694-705.

15. Adaskaveg J.E., Gilbertson R.L. Vegetative incompatibility between intraspecific dikaryoticparings of Ganoderma lucidum and G. tsugae. // Mycologia. 1987. - Vol. 79, № 4. - P.603-613.

16. Bao X.F., Zhen Y., Ruan L., Fang J.N. Purification, characterization, and modification of T lymphocyte-stimulating polysaccharide from spores of Ganoderma lucidum // Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 2002. - Vol. 50, № 5. - P.623-629.

17. Bao X.F., Wang X.S., Dong Q., Fang J.N., Li X.Y. Structural features of immunologically active polysaccharides from Ganoderma lucidum// Phytochemistry. 2002. - Vol 59. - P. 175-181.

18. Berovic M., Habijanic J., Zore I., Wraber В., Hodzar D., Boh B. Submerged cultivation of Ganoderma lucidum biomass and immunostimulatory effects of fungal polysaccharides // Journal of Biotechnology. 2003. - Vol. 103. - P. 77-86.

19. Cao L.Z., Lin Z. Regulation on maturation and function of dendric cells Ganoderma lucidum polysaccharides // Immunology Letters. 2002. - Vol. 83, № 3. - P. 163-169.

20. Cao L.Z. Lin Z.B. Regulatory effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on cytotoxic T-lymphocytes induced by dendritic cells in vitro // Acta Pharmacological Sinica. 2003. - Vol. 24,№4.-P. 312-326.

21. Cao Q.Z., Lin Z.B. Antitumor and antiangiogenic activity of Ganoderma lucidum polysaccharides peptide // Acta Pharmacological Sinica. 2004. - Vol. 25, № 6. - P.833-838.

22. Chang H. M . and But P.P.H. Pharmacology and Applications of Chinese Materia Medica. Vol. 1. Singapore: World Scientific Inc., 1986. - 521 p.

23. Chang Y.W., Lu T.J. Molecular characterization of polysaccharides in hot-water extracts ofGanoderma lucidum fruiting bodies // Journal of Food and Drug Analysis. 2004. - Vol. 12, № 1. - P. 59-67.

24. Chen Alice W. Ganoderma lucidum (Reishi): cultivation in North America // Science and cultivation of mushrooms. Nanjing, China, 1998. - p. 175-197.

25. Chen A.W. Cultivation of medicinal mushroom Ganoderma lucidum (Curt.: Fr.) P.Karst ^ (reishi)// International Journal of Medicinal Mushrooms. 1999. - Vol. 1. - P.263-282.

26. El-Mekkawy S., Meselhy M.r., Nakamura H., Tezuka Y., Hattori M., Kakiuchi N., Shomotonho K., Kawahata Т., Otake T. Anti-HIV and anti-HIV-l-protease substances from Ganoderma lucidumll Phytochemistry. 1998. - Vol. 49, № 6. - P. 1651-1657.

27. Eo S.K., Kim Y.S., Lee C.K., Han S.S. Possible mode of antiviral activity of acidic protein bound polysaccharide isolated from Ganoderma lucidum on herpes simplex viruses // Journal of Ethnopharmacology. 2000. - Vol.72, № 3. - P.475-481.

28. Fang Q.H and, Zhong J.J Two-Stage culture process for improved production of ganoderic acid by liquid fermentation of higher fungus Ganoderma lucidumll Biotechnology Progress. -2002a. Vol. 18, № 1. - P. 51 -54.

29. Fang Q.-H. and Zhong J.-J. Effect of initial pH on production of ganoderic acid andpolysaccharide by submerged fermentation of Ganoderma lucidum II Process Biochemistry. -2002b. Vol. 37, № 7. - P. 769-774

30. Fang Q.-H. and Zhong J.-J. Submerged fermentation of higher fungus Ganoderma lucidum for production of valuable bioactive metabolites—ganoderic acid and polysaccharide // Biochemical Engineering Journal. 2002c. -Vol. 10, № 1. - P.61-65.

31. Fang Q.-H., Tang Y.-J. and Zhong J.-J. Significance of inoculation density control in production of polysaccharide and ganoderic acid by submerged culture of Ganoderma lucidum II Process Biochemistry. 2002. - Vol. 37, № 12. - P. 1375-1379.

32. Furusawa E., Chou S.C. Furusawa S., Hirazum A., Dang Y. Antitumor activity of Ganoderma lucidum, an edible mushroom, on intraperitoneally implanted Lewis lung carcinoma in synergeneic mice // Phytotherapy Research. 1992. - Vol.6. - P. 300-304.

33. Gao Y., Zhou S., Huang Min and Xu Anlong. Antibacterial and antiviral value of the genus Ganoderma P.Karst. species (Aphyllophormycetideae): a review // International Journal of Medicinal Mushrooms. 2003. - Vol. 5, № 3. - P.235-246.

34. Habijanic J., Berovic M., Wraber В., Hodzar D. and Boh B. Immunostimulatory Effects of Fungal Polysaccharides from Ganoderma lucidum Submerged Biomass Cultivation // Food Technology and Biotechnology. 2001. - Vol.39, № 4. - P. 327-331.

35. Hikino H. and Mizuno T. Hypoglycemic actions of some heteroglycans of Ganoderma lucidum fruit bodies// Planta Medica. 1989. - Vol. 55. - P.385.

36. Hikino H., Konno C., Mirin Y., Hayashi T. Oriental medicines. Part 91.Antidiabetes drugs. Isolation and hypoglycemic activity of ganoderans A and B: glycan of Ganoderma lucidum fruit bodies // Planta Medica. 1985. - Vol.51. - P.339-340.

37. Hikino H., Ishiyama M., Suizuki Y., Konno C. Mechanisms of hypoglycemic activity of ganoderan B: glycan of Ganoderma lucidum fruit bodies // Planta Medica. -1989. Vol.55. -P. 423-428.

38. Hirotani M., Furuya Т., Shiro M. A ganoderic acid derivative, a highly oxygenated lanostane-type triterpenoid from Ganoderma lucidum// Phytochemistry. 1985. - Vol. 24, № 9. - P. 2055-2061.

39. Hirotani M., Ino C., Furuya Т., Shiro M. Ganoderic T, S and R, new triterpenoids from the cultured mycelium of Ganoderma lucidum // Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 1986. -Vol.34. -P.2282-2285.

40. Hobbs C. Medicinal Mushrooms: an Exploration of Tradition, Healing and Cultures. -Interweave Press, 1995. 251 p.

41. Hsu M.J., Lee S.S., Lin W.W. Signaling mechanism of enhanced neutrophil phagocytosis and chemotaxis by the polysaccharide purified from Ganoderma lucidum II British Journal of Pharmacology. 2003. - Vol. 139. - P. 289-298.

42. Hu Y.H., Lin Z.B. Effects of polysaccharides isolated from mycelia of Ganoderma lucidumon HL-60 cell apoptosis // Acta Pharmacologica Sinica. 1999. - Vol. 34. - P. 268-271.

43. Ito H., Naruse S., Shimura K. Studies on antitumor activity of basidiomycete polysaccharides: VII. Antitumor effect of the polysaccharide preparation from Ganoderma lucidum on mouse Sarcoma 180 // Mie Medical Journal. 1977. - Vol. 26. - P.147-152.

44. Jong S.C., Birmingham J.M. Medicinal Benefits of the Mushrooms Ganoderma II Advances in Applied Microbiology.-1992. -Vol. 37.-P.101-134.

45. Kavagishi H., Mitsunaga S., Yamawaki M., Ido M., Shimada A., Kinoshita Т., Murata Т., Usui Т., Kimura A., Chiba S. A lectin from mycelia of the fungus Ganoderma lucidum // Phytochemistry. 1997. - Vol. 44. - P.7-10.

46. Kim S.W., Hwang H.J., Park J.P., Cho Y.J., Song C.H., Yun J.W. Mycelial growth and exo-biopolymer production by submerged culture of various edible mushrooms under different media // Letters in applied microbiology. -2002. Vol.34, № 1. - P.56-61.

47. Kim H.W. and Kim B.K. Biomedicinal triterpenoids of Ganoderma lucidum (Curt.: Fr.) P. Karst (Aphyllophoromycetidae) // International Journal of Medicinal Mushrooms. 1999. -Vol. l.-P. 121-138.

48. Kim B.K., Kim R.S., and Kim H.W. Effects of Ganoderma lucidum on human leukocytes// Proceedings of the 1st International Symposium on Ganoderma lucidum in Japan. — Tokyo, 1997.-P. 87-89.

49. Kim D.H., Shim S.B., Kim N.J., Jang I.S. Beta-glucuronidase-inhibitory activity and hepatoprotective effect of Ganoderma lucidum // Biological and Pharmaceutical bulletin. — 1999. Vol.22,№2.-P. 162-164.

50. Kimura Y., Okuda H., Arichi S. Effect of the extracts of Ganoderma lucidum on bloodglucose level in rats// Planta Medica. -1988. Vol. 54. - P.290-294.

51. Kimura Y., Taniguchi m., Baba K. Antitumor and antimetastatic effects on liver of triterpenoid fractions of Ganoderma lucidum: mechanism of action and isolation of an active substance // Anticancer Research. 2002. - Vol. 22. - P. 3309-3318.

52. Kino K., Sone Т., Watanabe J., Yamashita A., Tsuboi H., Miyajima H., Tsunoo H. Immunomodulator, LZ-8, prevents antibody production in mice // International Journal of Immunopharmacology. -1991. Vol. 13, №8. - P.l 109-1115.

53. Komoda Y., H. Nakamura S. Ishihara M. Uchida H. Kohda and K. Yamasaki. Structures of new terpenoid constituents of Ganoderma lucidumII Chemical and Pharmaceutical Bulletin-1985. Vol. 33. - P. 4829-2835.

54. Komoda, Y., Shimizy M., Sonoda Y., Sato Y. Ganoderic acid and its derivatives as cholesterol synthesis inhibitors // Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 1989. - Vol.37. -P. 531-533.

55. Lai Т., Gao Y., Zhou S. Global marketing of medicinal Ling Zhi mushroom Ganoderma capense (W. Curt.:Fr.) Lloyd. (Aphyllophoromycetideae) products and safety concerns// Journal of Medicinal Mushrooms. 2004. - Vol. 6. - P. 189-194.

56. Lee К. M., Lee Sh. Y., and Lee H. Y. Bistage control of pH for improving exopolysaccharide production from mycelia of Ganoderma lucidum in an air-lift fermentor // Journal of Bioscience and Bioengineering. 1999. - Vol.88, № 6.- P.646-650.

57. Lee S.Y., Rhee H.M. Cardiovascular effects of mycelium extract of Ganoderma lucidum: inhibition of sympathetic outflow as a mechanism of its hypotensive action // Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 1990. - Vol.38, № 5. - P.1359-1364.

58. Lei LS, and ZB Lin. Effect of Ganoderma polysaccharides on T-cell subpopulations and production of interleukin 2 in mixed lymphocyte response// Acta Pharmacological Sinica. -1992. Vol. 27, № 5. - P.331-335.

59. Lin C.-N., Tome W.-P. Novel cytotoxic principles of Formosan Ganoderma lucidumll Journalof natural Products. 1991. - Vol. 54, № 4. - P. 998-1002.

60. Lin L.J., Shiao M.S. Seven new triterpenes from Ganoderma lucidumll Journal of natural Products. 1988. - Vol. 51, № 5. - P. 918-924.

61. Lin Z.B., Zhang H.N. Antitumor and immunoregulatory activities of Ganoderma lucidum and its possible mechanisms // Acta Pharmacologica Sinica. 2004. - Vol. 25, № 11. -P.1387-1395.

62. Lomberh M.L., Solomko E.F., Buchalo A.S., KirchhoffB. Studies of medicinal mushrooms in submerged cultures.// Mushroom Biology and Mushroom Products. Proceedings of the 4th International Conference. 2002. - P. 367-377.

63. Mau J.-L., Lin H.-C., Chen C.-C. Antioxidant properties of several medicinal mushrooms // Agricultural and Food Chemistry. 2002. - Vol.50. - P. 6072-6077.

64. Maruyama H., Yamazaki K., Murofushi S., Konda C., Ikekawa T. Antitumor activity of Sarcodon aspratus (Berk.) S.Ito and Ganoderma lucidum (Fr.) Karst.// Journal ofPharmacobiodinamic. -1989. Vol. 12. - P. 118-123.

65. Min B.S., Gao J.J., Nakamura N., Hattori M. Triterpenes from the spores of Ganoderma lucidum and their cytotoxicity against meth-A and LLC tumor cells // Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 2000. - Vol. 48. - P. 1026-1033.

66. Miyazaki T. and Nishijima M. Studies on fungal polysaccharides. XXVII. Structural examination of a water-soluble, antitumor polysaccharide of Ganoderma lucidum // Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 1981. - Vol.29. - P. 3611-3616.

67. Miyazaki T. and Nishijima M. Structural examination of an alkali-extracted, water-soluble heteroglycan of the fungus Ganoderma lucidum// Carbohydrate Research. 1982. — Vol.109. - P.290-294.

68. Mizuno T. Food function and medicinal effect of mushroom fongi // Food a. Food IngredientsJournal,Japan.-1993. Vol.158. -P.55-70

69. Mizuno Т., Saito, H., Nishitoba, Т., Kawagasi, H. Antitumor-active substances from mushrooms // Food Reviews International. 1995a. - Vol. 11. - P.23-61.

70. Mizuno Т., Sakai Т., Chihara G. Health foods and medicinal usages of mushrooms // Food Reviews International. -1995b. Vol.11. - P.69-81,

71. Mizuno Т., Wang G., Zhang J., Kawagasi, H. Nishitoba, Т., Li J. Reishi, Ganoderma lucidum and Ganoderma tsugae: bioactive substances and medicinal effects // Food Reviews1.ternational.- 1995c.-Vol.11. P.151-166,

72. Mizuno T. The extraction and development of antitumor-active polysaccharides from medicinal mushrooms in Japan // International Journal of Medicinal Mushrooms 1999-Vol. 1.-P.9-29.

73. Morigiwa A., Kitabatake K., Fujimoto Y., Ikekawa N. Angiotensin converting enzyme-inhibitory triterpenes from Ganoderma lucidumll Chemical and Pharmaceutical Bulletin. -1986.-Vol. 34, №7. -P. 3025-3028.

74. Nishitoba, Т., H. Sato and S. Sakamura. New terpenoids from Ganoderma lucidum and their bitterness // Agricultural and Biological Chemistry. 1985. - Vol. 49. - P. 1547-1549.

75. Nishitoba Т., Sato H., Sakamura S. Triterpenoids from the fungus Ganoderma lucidumll Phytochemistry. 1987. - Vol.26. - P. 1777-1784.

76. Nogami M., Tsuji Y., Kubo M., Takahashi M., Kimura H., Matsuike Y. Studies on Ganoderma lucidum. VI. Anti-allergic effect (1) // Yakugaku Zasshi. 1986. -Vol.106, № 97. -P. 594-599.

77. Nordic Macromycetes Vol.3. Heterobasidioid, aphyllophoroid and gasteromycetoid basidiomycetes. Copenhagen: Nordsvamp, 1997. - 444 p.

78. Patocka Jin. Anti-inflammatory triterpenoids from mysterious mushroom Ganoderma lucidum and their potential possibility in modern medicine // Acta Medica.- 1999 Vol.42. — P.123-125.

79. Saito K., Nishijima M., Miyazaki T. Structural analysis of an acidic polysaccharides from Ganoderma lucidum (studies on fungal polysaccharides. XXXV)// Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 1989.-Vol. 37, № 11.-P. 3134-3136.

80. Sato H. and Iwaguchi T. Antitumor activity of new novel organogermanium compound, Ge-132// Cancer Chemotherapy 1979. - Vol.6. - P. 79-83 .

81. Seo G.-S. and Kirk P.M. Ganodermataceae: nomenclature and classification. / Ganoderma diseases of perennial crops. CABI Publishing, 2001. - P. 3-22.

82. Shimizu A., Yano Т., Saito Y. and Inada Y. Isolation of an inhibitor of platelet aggregation from a fungus Ganoderma lucidum II Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 1985. - Vol. 33. -P.3012-3015.

83. Sliva D. Ganoderma lucidum (Reishi) in cancer treatment // Integrative cancer therapies. — 2003. Vol. 2, № 4. - P. 358-364.

84. Stamets P. Growing Gourmet and Medicinal Mushrooms. — Oxford, 1993. 552 p.

85. Stalpers J. A. Identification of wood-inhabiting Aphyllophorales in pure culture. // Studies in Mycology. 1978. -16. - P. 1-248.

86. Steyaert R. Considerations generates sur le genre Ganoderma et plus specialement sur les especes Europeennes// Bull. Soc. roy. bot. Belg. 1967. - Vol. 100. - P. 189-211.

87. Tanaka S., Ко К., Kino К., Tsuchiya К., Yamashita A., Murasugi A.,Sakuma S., Tsunoo H. Compete amino acid sequence of an immunomodulatory protein, Ling Zhi-8 (LZ-8) // The Journal of Biological Chemistry. 1989. - Vol. 264, № 28. - P. 16372-16377.

88. Tang Y.-J. and Zhong J.-J. Fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid // Enzyme and Microbial Technology.-2002a.-Vol. 31, №2.-P. 20-28.

89. Tang Y-J.; Zhong J-J. Exopolysaccharide biosynthesis and related enzyme activities of the medicinal fungus, Ganoderma lucidum, grown on lactose in a bioreactor// Biotechnology Letters. 2002b. - Vol. 24, № 12. - P. 1023-1026(4)

90. Tang, Y.J., Zhong, J.J. Role of oxygen supply in submerged fermentation of Ganoderma lucidum for production of Ganoderma polysaccharide and ganoderic acid //Enzyme and Microbial Technology. 2003. - Vol. 32, № 3-4. - P. 478-484.

91. Tasaka K., Akagi M., Miosh K., Mio M., Makino T. Anti-allergic constituents in the culture medium of Ganoderma lucidum. (I). Inhibitory effect of oleic acid on histamine release //Agents Actions. 1988. - Vol. 23. - P.153 -156.

92. Thaithatgoon Satit. The pretest of Ganoderma lucidum in humans / Science and Cultivation of Edible Fungi. Rotterdam: Balkema, 1995. - P.433-437.

93. Tomoda M., Gonda R., Kasahara Y., Hikino H. Glycan structures of ganoderans В and C, hypoglycemic glycans of Ganoderma lucidum fruit body.// Phytochemistry. 1986. - Vol.25, № 12.- P.2817-2820.

94. Toth, J.O., B. Luu and G. Ourisson. Ganoderic acids T-Z, cytotoxic triterpenes from Ganoderma lucidumipolyporaceae) 11 Tetrahedron Letters. 1983. - Vol. 24. - P. 1081-1084.

95. Wasser S., Weis A. Medicinal Mushrooms. Reishi Mushroom (Ganoderma lucidum (Curtis: Fr.) P. Karst). Haifa, 1997. - 39 p.

96. Wasser S., Weis A. Medicinal Properties of Substances Occurring in Higher Basidiomycetes Mushrooms: Current Perspectives (Review) //International Journal of Medicinal Mushrooms.- 1999.-Vol. 3.-P. 31-62.

97. Wasser S. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides // Applied Microbiology and Biotechnology. 2002. - Vol. 60. - P. 258-274.

98. Willard T. Reishi mushroom: herb of spiritual potency and medical wonder. Issaquah, Washington: Sylvan Press. 1990. - 167 p.

99. Wu T.S., Shi L.S., Kuo S.C. Cytotoxicity of Ganoderma lucidum triterpenes //Journal of natural products. 2001. - Vol.64. - P. 1121-1122.

100. Yang F.C. and Liau C.B. The influence of environmental conditions on polysaccharides formation by Ganoderma lucidum submerged cultures // Process Biochemistry. 1998a. -Vol. 33.-P. 547-553

101. Yang F.C. and Liau C.B. Effects of cultivating conditions on the mycelial growth of Ganoderma lucidum in submerged flask cultures. // Bioprocess and Biosystems Engineering.- 1998b. Vol. 19, № 3. - P.233-236.

102. Yang F.-C., Kea Y.-F. and Kuo S.-S. Effect of fatty acids on the mycelial growth and polysaccharide formation by Ganoderma lucidum in shake flask cultures// Enzyme and Microbial Technology. 2000. - Vol. 27, № 3. - P. 295-301

103. Yoon S.Y., Eo S.K., Kim Y.S., Lee C.K., Han S.S. Antimicrobial activity of Ganoderma lucidum extract alone and in combination with some antibiotics // Archives of Pharmacological Research. -1994. -Vol.17. P.438-442.

104. Zhang G.-L., Wang Y.-H., Ni W., Teng H.-L., Lin Z.-B. Hepatoprotective role of Ganoderma lucidum polysaccharide against BCG-induced immune liver injury in mice // World Journal of Gastroenterology. 2002. - Vol. 8, № 4. - P. 728-733.

105. Zhang L, Zhang M, Zhou Q, Chen J, Zeng F. Solution properties of antitumor sulfated derivative of alpha-(l~>3)-D-glucan from Ganoderma lucidumll Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 2000. - Vol.64, № 10. - P. 2172-2178.

106. Zhong J.-J., Fang Q.-H., Tang Y.-J. Enhanced production of valuable bioactive metabolites • in submerged cultures of medicinal mushroom Ganoderma lucidum by manipulation ofoxygen supply // Journal Plant Biotechnology. 2002. - Vol.4, № 3. - P. 109-115.

107. Zhou S. and Gao Y. The immunomodulating effects of Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P. Karst. (Ling Zhi, Reishi Mushroom) (Aphyllophoromycetideae) // International Journal of Medicinal Mushroom. 2002. - Vol. 4, № 1. - P. 1-11.

108. Zhu HS, Yang XL, Wang LB, Zhao DX, Chen L. Effects of extracts from sporoderm-broken spores of Ganoderma lucidum on HeLa cells //Cell biology and toxicology-2000 — Vol.l6,№ 3.-P. 201-206.

Информация о работе

Автономова, Анастасия Витальевна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.24

Диссертация

Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P. Karst., трутовик лакированный: штаммовое разнообразие, антибиотические свойства и противоопухолевое действие - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы