Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание исходного материала для селекции гибридных штаммов Pleurotus (Fr.) P. Kumm. на основе метода отбора гаплотипов с повышенной активностью лакказ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Создание исходного материала для селекции гибридных штаммов Pleurotus (Fr.) P. Kumm. на основе метода отбора гаплотипов с повышенной активностью лакказ"

ии^4ЬЭЭ22

На правах рукописи

Копыльцов Сергей Васильевич

СОЗДАНИЕ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ГИБРИДНЫХ ШТАММОВ РЬЕиНОТШ (ЕЯ.) Р. кимм. НА ОСНОВЕ МЕТОДА ОТБОРА ГАПЛОТИПОВ С ПОВЫШЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ ЛАККАЗ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 4 МАП 2009

Саратов - 2009

003469922

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный аграрный университет»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Иванов Геннадий Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Дьячук Таисия Ивановна

кандидат биологических наук, доцент Миронов Александр Давидович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

Защита состоится <с7» июня 2009 г. в /0 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат диссертации разослан «&> апреля 2009 г. и размещен на сайте университета www.sgau.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова», ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Карпунина Л. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На фоне роста стоимости зерновых культур недостаточно полно используется возможность вовлечения лигноцелл го-лозных отходов в производство дополнительной белковой продукции. Одним из эффективных методов переработки растительных отходов является их биоконверсия при выращивании базидиальных грибов. Среди промышленно культивируемых грибов вешенка занимает одно из ведущих мест по производству плодовых тел в России.

Динамичное развитие грибоводства выявило потребность производства в штаммах вешенки, удовлетворяющих современным требованиям интенсивных технологий: сокращение сроков обрастания субстрата и выгонки плодовых тел, устойчивость к конкурентной микрофлоре, отсутствие необходимости в холодовом «шоке», высокая продуктивность и товарные качества плодовых тел. Несмотря на возрастающие объемы культивирования вешенки, промышленное производство в значительной степени сдерживается из-за отсутствия продуктивных отечественных сортов и штаммов (Таксономический анализ..., 2002). На сегодняшний день в государственном реестре селекционных достижений РФ зарегистрированы четыре сорта, относящиеся к вешенке устричной, и один сорт вешенки флоридской. В связи с этим важной задачей современной грибной индустрии является создание новых высокопродуктивных сортов. Выявлению различных факторов, влияющих на продуктивность плодовых тел, посвящен ряд работ (Wang, Anderson, 1972; Eger G., 1974; Lar-raya, 2002), однако системных исследований по их использованию при проведении гибридизации и отборе штаммов выполнено недостаточно.

Цель исследования: создание исходного материала рода Pleurotus (Fr.) Р. Kumm методом отбора гаплотипов по активности лакказ для селекции на продуктивность.

Задачи исследования:

1. Разработать метод отбора монокариотического и дикариотического мицелия по активности лакказ.

2. Выделить из промышленно культивируемых штаммов моноспоровые изоляты, произвести их анализ и отбор по активности лакказ.

3. Провести гибридизацию отобранного монокариотического мицелия разных штаммов и оценить активность лакказ полученных гибридов.

4. Изучить продуктивность и габитус плодовых тел коммерческих и полученных гибридных штаммов Р. о$1геаШ$ в научно-хозяйственных испытаниях.

5. Исследовать местообитания «летних» штаммов рода Р1еигоШ (Иг.) Р. Кишш. на территории Северо-Западного Кавказа, установить вариацию активности лакказ их мицелия и степень генетического внутривидового разнообразия особей в популяции.

Научная новизна. Разработан экспресс-метод определения активности лакказ мицелия вешенки.

Впервые экспериментально подтверждена целесообразность осуществления отбора дикариотических и монокариотических форм мицелия по признаку активности лакказ при проведении селекции вешенки на повышение продуктивности.

Впервые показана взаимосвязь активности лакказ и инициации плодоношения вешенки обыкновенной с рН субстрата при ее твердофазном культивировании.

Впервые проведено изучение популяции «летних» штаммов вешенки лесных биоценозов Северо-Западного Кавказа, установлена вариация активности лакказ их мицелия и степень генетического внутривидового разнообразия особей в популяции.

Практическая значимость. Разработанная методика отбора родительских форм по признаку активности лакказ была применена при про-

ведении селекции на продуктивность и для создания гибридных штаммов (патент РФ на изобретение № 2295728).

Получен гибридный штамм ВКМ ВКМ Р-38890, позволяющий повысить продуктивность плодовых тел вешенки и исключить стадию хо-лодового «шока» и депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ РАН им. Г. К. Скрябина.

Исследовано генетическое разнообразие внутри природных популяций вешенки. Собранные образцы могут быть использованы в селекции при отборе штаммов для промышленного культивирования в условиях летнего сезона.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработан метод отбора гаплоидов вешенки по активности лакказ на плотных питательных средах.

2. Использование гаплотипов вешенки с повышенной активностью лакказ при проведении селекции обеспечивают увеличение продуктивности получаемых гибридов.

3. Получен гибридный штамм Р. оз^еаш (Рг.) Кишш. ВКМ Р-3889Б методом отбора гаплоидов с высокой активностью лакказ, достоверно превышающий по продуктивности родительские формы.

4. Культивирование вешенки на субстрате с повышенным значением рН увеличивает период наступления максимума активности лакказ и инициации плодоношения на десять суток.

5. Штаммы вешенки лесных биогеоценозов Северо-Западного Кавказа обладают значительной вариацией лакказ мицелия и высоким уровнем генетического полиморфизма. Отобранный генетический материал пригоден для селекции штаммов, формирующих базидиомы в летний период при культивировании интенсивным методом.

Работа выполнена на кафедре биотехнологии, биохимии и биофизики Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кубанский государственный аграрный университет» в рамках научно-исследовательской темы кафедры: «Разработка и научное обоснование способов получения и использования экологически безопасных функциональных кормовых и пищевых

концентратов и добавок на основе ресурсосберегающих биотехнологий» (№ гостематнкн 01.2.00606836).

Апробация работы. Основные результаты работы представлены: на VII и VIII Региональных научно-практических конференциях молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2005; 2006); Всероссийской конференции в рамках конкурсного отбора инновационных проектов аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Живые системы» (Киров, 2006); Федеральной школе-конференции по инновационному малому предпринимательству в приоритетных направлениях науки и высоких технологий (Москва, 2006); Заключительном туре Всероссийской конференции смотра-конкурса на лучшую студенческую работу по направлению растениеводство и земледелие (Москва, 2006); конференции «Биотехнология как научно-практический приоритет развития Кировской области» (Киров, 2007); II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2008).

Публикации. Результаты исследования отражены в 10 печатных работах, из них 1 патент и 2 работы опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, предложений производству и списка используемых литературных источников, включающего 144 источника, в том числе 40 зарубежных авторов. Работа изложена на 123 страницах и иллюстрирована 19 рисунками, 11 таблицами, содержит 3 приложения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследований

Лабораторные исследования проводили с грибами Р. ostreatus штаммами Львовский, Флорида, Пенсильвания, Р77, НК35 (мицелий был предоставлен ФГУ «Краснодарский биоцентр», г. Краснодар). Для изучения генетического полиморфизма использовали штаммы Р. pulmonarius ВКМ

F-2006 и Р. cormicopiae ВКМ F-1979, полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН, а также 23 штамма Р. pulmonarius из природных условий обитания.

Выделение чистых культур грибов и размножение мицелия осуществляли на глюкозо-дрожжевой среде (Семенов, 1990). Музейные штаммы хранили на сусло-агаровой среде с использованием сусла 1,52° по Баллингу при температуре + 4°С. Сбор природных штаммов проводили в период с августа по сентябрь 2008 г. на северном макросклоне Главного Кавказского хребта.

Определение активности лакказ экстракта из субстрате при твердофазном культивировании осуществляли на спектрофотометре UNICO 2000 при длине волны 436 нм (Е43б=29,3 мМ^см"1) (Кадималиев, 2003), используя в качестве хромогенного субстрата 10 мМ раствор пирокатехина в 0,1 М Na-ацетатном буфере, рН 4,9 (Степанова, 2003).

Производственные испытания проводили в ООО «Айлант», г. Краснодара. Зерновой субстрат готовили общепринятым методом, включающим внесение 5% углекислого кальция и стерилизацию авто-клавированием (Промышленное культивирование..., 1978). В качестве субстрата для полупроизводственных опытов использовали смесь подсолнечной лузги и пшеничной соломы (1:1). Подготовку проводили методом пастеризации при температуре 75-80°С в течение 8 часов в сочетании с ферментацией в субстратной машине барабанного типа СМ-1 (ООО «Техник», г. Саратов).

Препараты суммарной ДНК получали из плодовых тел общепринятым методом (Kumeda, Asao, 1996). При RAPD-анализе полиморфизма ДНК проводили амплификацию с использованием RAPD-праймера S-13 и в условиях, примененных для выявления полиморфизма у представителей рода Plenrotus (Шнырева и др., 2003). Данные RAPD-маркирования были представлены в виде бинарной матрицы. По матрице состояний была рассчитана матрица различий (Nei, 1978) с последующим построением дендрограммы сходства не-взвешенным парно-групповым методом с арифметическим усреднением (UP-

GMA). Построение филогенетического дерева выполнено с помощью программы STAT1STICA 5.5®.

Для определения видовой принадлежности природных изолятов использовали молекулярные методы видовой идентификации, основанные на применении RFLP (restriction fragment lengh polymorphism) анализа фрагментов рибосомального оперона ITS (internal transcribed spacer). ITS участки рибосомальной ДНК были амплифицированы с использованием праймеров ITS4 и 1TS5 (White etal., 1990). Рестрикцию ПЦР продукта проводили согласно Янгу (Yang и др., 2007) с использованием рестрикта-зы Нае III и поставляемым с ней буфером (ООО «СибЭнзим», Москва).

Оценку оргаиолептических показателей проводили по пятибалльной шкале.

Статистическую обработку результатов исследований осуществляли с помощью критериев Стьюдента (t), Колмогорова-Смирнова (X), Фишера (F) с применением корреляционного, дисперсионного, кластерного анализов (Доспехов, 1985; Рокицкий, 1973), используя компьютерные программы Microsoft Exel и STATISTICA 5.5®.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка метода отбора гаплотипов грибов рода Pleurotus с повышенной активностью лакказ

Основой для отбора штаммов по активности лакказ является то, что в процессе биодеструкции лигноцеллюлозных субстратов ключевую роль, по мнению ряда авторов, играют именно лакказы (Королева, 1998; Степанова, 2003). Предлагаемый метод определения активности лакказ заключается в денситометрической оценке окрашенных продуктов реакции в результате взаимодействия секретируемого мицелием фермента и хро-могенного субстрата. Учитывая сложную систему регуляции продуцирования грибами лигноцеллюлазных ферментов, оценку активности лакказы проводили на средах с добавлением компонентов близких по составу с используемыми при промышленном культивировании субстратами. Каждый вариант содержал а-нафтол в качестве хромогенного субстрата и отличался источником углерода.

Целесообразность использования данного метода в качестве экспресс теста согласовывается с данными ряда авторов о возможности использо-1 зания агаризованных сред в качестве индикатора активности лакказ (Методы экспериментальной микологии, 1973; БпшуаБап, 1995). Однако в ! отличие от работы С. Сринивейсона (БгЫуаБап, 1995), нами была иссле-| дована способность продуцирования данных ферментов непосредственно в процессе роста мицелия.

Мицелиальную культуру инокулировали на питательную среду в центр чашки Петри и инкубировали в темноте при 25°С в течение 4-х | суток. За это время мицелиальная колония разрасталась в радиальном направлении. Вокруг нее образовывались окрашенные зоны в результате I взаимодействия выделяемого фермента и субстрата (рис. 1).

Рис. I. Действие лакказ на питательных средах, содержащих различные источники углерода: а — глюкоза и клетчатка (солома); б - глюкоза и целлюлоза; в - только целлюлоза; г - только клетчатка (солома)

При добавлении в питательные среды с клетчаткой глюкозы формировалось интенсивное равномерное окрашивание поверхности среды по

всей площади зарастания мицелием (рис. 1 а, б). На средах, где в качестве источника углерода использовали лишь целлюлозный субстрат, окрашивание и, следовательно, продуцирование лакказ было периодичным (рис. 1 в, г). Возможно, этот процесс регуляции продуцирования лакказы обусловлен взаимной связью биосинтеза и действия ферментов, разрушающих целлюлозу и лигнин.

Дисперсионный анализ данных активности лакказ дикариотического и монокариотического мицелия позволил сделать вывод, что среди исследованной в работе выборки из 44 штаммов имеются монокарионы как достоверно превышающие по активности лакказ дикариотический штамм, так и достоверно уступающие ему по этому показателю. Непосредственно между монокарионами по величине наименьшей существенной разности так же выявлены явные различия по уровню активности продуцируемых в субстрат лакказ. Использование данного способа определения активности лакказы базидиальных грибов на твердой агаризо-ванной среде, содержащей целлюлозу, позволяет определять активность указанного экзофермента живой мицелиальной культуры гриба в процессе роста и развития на среде с природным источником углерода.

Выявление вариабельности активности лакказ у монокариотического и дикариотического мицелия вешенки

Для общей оценки вариабельности популяции достаточно оценивать вариабельность на уровне генов или их белковых продуктов (Дьяков, 2005). То есть, для успешного ведения селекции важно выявить фенотипический полиморфизм в популяциях и отобрать носителей требуемого признака.

В исследование по оценке активности лакказы были включены 38 моно-кариотических изолятов штамма НК35 и 23 монокариотических изолята штамма Львовский. Значения диаметра окрашенной зоны питательной среды на 4-е сутки культивирования монокариотических изолятов штамма НК35 варьировали от 3,0 до 27,7 мм и от 5,0 до 30,0 мм для монокариотических изолятов штамма Львовский. Средний диаметр окрашенных зон питательной сре-

ды, образуемых дикариотическим мицелием штаммов НК35 и Львовский, составлял 20,7±0,2 мм и 30,0±0,3 мм, соответственно.

Сравнение монокариотических изолятов и дикариотического мицелия штамма НК35 (НСР05 = 3,6 мм; Р = 0,05) по активности лакказы выявило 6 изолятов, достоверно превосходящих исходный штамм НК35: тНК17, тНК24, тНК28, тНК32, шНК35 и тНК36.

Определение корреляционной связи между активностью лакказы и скоростью роста у 36-ти монокариотических изолятов штамма НК35 с использованием критерия г показало сильную достоверную связь между этими признаками (г = 0,7; п = 36; I ф = 4,6 > = 2,76; Р = 0,01).

Сравнение активности лакказы у монокариотического и дикариотического мицелия штамма Львовский (НСР05 = 3,6 мм) не выявило изолятов, достоверно превосходящих по этому признаку исходный штамм. При этом только один изолят (тЛ26) находился на уровне штамма Львовский по уровню активности фермента. Для проведения отбора среди других штаммов, используемых в работе (Флорида, Пенсильвания, Р77 и Дикого), также получали моноспоровый мицелий на плотной агаризован-ной среде. В результате проведенной работы из 300 выделенных моноспо-розых изолятов после оценки было отобрано 14 изолятов с максимальными показателями ферментативной активности, которые использовали в программе скрещиваний.

Таким образом, проведенный по разработанной нами методике отбор гаплотипов, позволяет выделять генотипы с максимальной активностью лакказ для последующей гибридизации.

Определенный интерес вызывает оценка изучаемых выборок моно-карионов по относительному показателю изменчивости - коэффициенту вариации активности лакказ. Наименьшим он был у монокарионов штамма Флорида (18%), максимальным - штамма НК35 (39%). Оба штамма давно используются в производстве. Учитывая, что длительная селекция и отбор приводят к сужению генетической основы и вариации признаков штаммов, можно предположить, что данные штаммы, в особенности НК35, представляют собой гетерозиготы по генам, контроли-

рующим лигноцеллюлазную активность ферментов. Совокупности моно-карионов остальных штаммов имели коэффициент вариации от 25 до 30%, что характеризует их изменчивость как значительную (Доспехов, 1979). Вариабельность признака активности лакказ заслуживает особого внимания, так как это является отражением генетической неоднородности сибсовых изолятов внутри одного штамма, что создает основу для отбора и последующей гибридизации.

Проведенные исследования показывают, что наряду с имеющимися методическими приемами отбора перспективных штаммов, использование признака активности лакказ на ранних этапах селекционной работы может способствовать эффективному отбору потенциально высокопродуктивных штаммов.

Изучение динамики активности лакказ при разных значениях рН субстрата и связь этого фактора с инициацией плодоношения

При промышленном культивировании вешенки одним из основных условий является получение селективного субстрата. Доя этого применяют мягкую термическую обработку, обусловливающую развитие термофильной микрофлоры, а также внесение в субстрат щелочных агентов с целью предотвращения развития конкурентной микофлоры.

Значение водородного показателя с помощью гашенной извести, либо других щелочных реагентов, доводят до рН 8,0-8,5. Однако оптимум действия грибных ферментов, обеспечивающих биодеградацию лигно-целлюлозных субстратов, находится в диапазоне рН 4,7-6,0 и его изменение может сказаться на развитии гриба.

Для выяснения периода времени от инокуляции до инициации плодоношения у выведенного нами штамма Р. оБ1геаШз ВКМ Р-38890 было проведено исследование по выявлению активности лакказ в этот период. Культивирование проводили на лузге семян подсолнечника в двух вариантах. В первом случае субстрат защелачивали гидроокисью натрия. Значение рН после термической обработки составляло 8,5. Субстрат во втором варианте имел естественное значение рН 5,5. В опыте учитывали

интенсивность колонизации мицелием субстрата, динамику изменения рН, активность лакказы и срок инициации плодоношения.

Мицелий, инокулированный при рН 8,5, значительно отставал в скорости колонизации субстрата. Значение рН постепенно снижалось и к 23-м суткам достигло 6,3. В варианте, где защелачивание субстрата не применялось, колонизация субстрата происходила значительно активней и значение рН не изменялось.

Между вариантами была выявлена значительная разница в динамике накопления лакказ (рис. 2). Для обоих вариантов образование фермента возрастало с накоплением мицелиальной биомассы, но максимальное значение достигалось в разное время. Интерес представляет тот факт, что на следующие сутки после достижения максимума активности фермента в обоих вариантах происходила инициация плодоношения - появление примордиев.

7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37

Время культивирования, сут.

Рис. 2. Динамика активности лакказ при разных значениях рН субстрата Примечание: 1- исходный субстрат; 2- субстрат с исходным рН 8,5.

При переходе от вегетативной стадии к регенеративной активность лакказ снижалась. Эти данные подтверждают имеющееся в литературе предположение, что лакказа действительно является фактором-индуктором, так как инициация плодоношения наступает сразу после достижения максимума лакказ-ной активности.

Таким образом, результаты исследований показали, что культивирование мицелия вешенки на субстрате с щелочной реакцией приводит к снижению скорости колонизации мицелием субстрата, растягивает период секреции лак-казы и начала стадии телеоморфы. В связи с этим, при проведении такого технологического приема с целью предотвращения развития микроскопических грибов как защелачивание субстрата рН не должен превышать 8,0.

Получение гибридных штаммов

Для повышения эффективности селекции необходимо использовать методы отбора, основанные на косвенных показателях, коррелирующих с продуктивностью. Активность лакказ, синтезируемых мицелием, была использована как косвенный показатель потенциальной продуктивности по следующим соображениям: во-первых, лакказы играют ключевую роль в биодеструкции лигнина и высвобождении целлюлозы для действия целлюлаз; во-вторых, лак-каза участвует в биосинтезе внеклеточных пигментов, склеивающих клеточные стенки гиф при образовании плодовых тел и ризоморфов; в-третьих, вегетативный рост гриба непосредственно связан с активностью лакказ.

При создании гибридных форм вешенки в качестве критериев отбора исследовали активность лакказ, выделяемых в субстрат. Общая схема получения новых гибридных штаммов включала выделение исходных монокариотиче-ских родительских форм, анализ активности вышеуказанного фермента, отбор лучших изолятов и проведение межштаммовых скрещиваний между ними.

Гибридизацию проводили во всех возможных сочетаниях, кроме сибсо-вых скрещиваний, исключая получение инбредного мицелия. Гибридный мицелий оценивали по активности лакказ. Оценка существенности разности средних значений активности лакказ по /-критерию позволила выделить из совокупности гибридов те, которые достоверно превышали по этому показателю родительские дикариотические штаммы (табл. 1). К таким гибридам относятся Гь Г2, Г4, Г6, и Г12. Остальные гибриды имели достоверное превышение лишь над одним из родительских штаммов, либо их активность находилась в пределах случайных колебаний для принятого уровня значимости.

Таблица 1

Продуктивность гибридных и коммерческих штаммов вешенки (% от массы влажного субстрата)

Штамм Продуктивность, %

Первая волна Вторая волна Суммарная

НК35 3,9 4,3 8,1±0,0

Львовский 11,5 1,6 13,6±0,0

Пенсильвания 4,3 4,5 8,7±0,2

Флорида 6,9 6,0 12,9±0,2

Р77 5,3 3,7 9,0±0,5

Дикий 6,3 3,4 9,7±1,6

г, 7,1 6,8 14,3±0,0

г2 10,9 3,6 14,5±0,1

Г3 8,1 3,7 11,8±0,3

г4 4,4 3 7,5±0,6

г5 6,4 6,5 12,9±0,2

Гб 12,7 5,8 18,6±0,4

г7 6,2 5,2 11,4±0,9

Г8 5,8 3,2 9,0±0,0

Г9 5,3 3,3 8,6±1,2

Г,0 5,3 4,2 9,6±0,2

НСР05 — - 1,1

Полученные гибридные штаммы оценивали по морфологическим показателям и продуктивности плодовых тел. На первом этапе все отобранные гибриды выращивали в пакетах массой по 2,5 кг.

Проведенный дисперсионный анализ позволил отобрать пять гибридных штамма Г), Г2, Г3, Г6, Г7, продуктивность которых достоверно превышала продуктивность составляющих их родительских промышленно культивируемых штаммов на 10,9; 12,4; 21,6; 44,2 и 17,5%, соответственно. Из указанных гибридов три (Гь Г2, Гб) превышали обе родительские дикариотические формы по активности лакказ, а два остальных (Г3 и Г7) - достоверно превышали одного из родителей. Это указывает на то, что проведение отбора гаплотипов на основании активности лакказ является весьма эффективным методом ведения селекционной работы на повышение продуктивности штаммов.

На втором этапе гибриды Гь Г2 и Г6 повторно оценивали на продуктивность, культивируя их на промышленных блоках. Полученные данные сравнивали с коммерческим штаммом Дон, культивируемым в хозяйстве. Продуктивность исследованных штаммов была значительно выше, чем при использовании субстратных блоков массой до 2,5 кг. Полученные результаты согласовываются с данными Д. С. Партина (Партии, 2006), которым было отмечено, что уменьшение размера субстратного блока приводит к значительному снижению продуктивности вешенки. Представленные в таблице 2 данные демонстрируют, что между гибридными штаммами хотя и есть различия по величине продуктивности, тем не менее, они не существенны. Продуктивность коммерческого штамма Дон, который использовали в качестве стандарта, была существенно ниже.

Таблица 2

Динамика плодоношения и продуктивности вешенки разных штаммов (% от массы влажного субстрата)

Штамм Продуктивность, %

Первая волна Вторая волна Суммарная

Дон (й) 14,0 2,0 16,0±2,5

г, 20,8 8,2 29,0±2,4

Г2 21,0 7,0 28,0±1,9

Г6 20,8 11,2 32,0±4,2

НСР05 - — 8,0

Дисперсионный анализ результатов опыта показал, что между вариантами выявлены существенные различия на 5%-м уровне значимости. Сравнение полученных данных по величине наименьшей существенной разности показало, что опытные вариантами Гь Г2 и Г6 не различаются между собой, но достоверно превышают по продуктивности коммерческий штамм Дон. Таким образом, отобранные по признаку активности лакказ гибридные штаммы вешенки при культивировании на полноразмерных грибных блоках сохраняют свое преимущество по уровню продуктивности плодовых тел над коммерческими штаммами.

Проведенные органолептические исследования позволяют заключить, что, не смотря на существенное повышение в процессе селекции уровня продуктивности, гибридные штаммы не уступают коммерческим по изученным органолептическим показателям.

Формирование нового селекционного материала вешенки на основе штаммов лесных биогеоценозов Северо-Западного Кавказа На сегодняшний день большинство промышленно культивируемых штаммов относятся к одному биологическому виду - Р. оз^еашх. Среди множества положительных качеств данного вида имеются и недостатки, основным из которых является необходимость для большинства штаммов изменения температурного режима на всем этапе морфогенеза гриба. В то же время внимание многих исследователей привлекает другой биологический вид - Р1еиго1т ри1топагш. По своим макроморфологическим признакам и общему габитусу плодовых тел этот вид незначительно отличается от Р. озй-еаШз, что часто приводит к ошибкам при их идентификации. При этом, температурный оптимум для роста и плодообразования находится в диапазоне от 25 до 30°С, коэффициент вариации активности лакказ монокариотического мицелия Р. ри1топа пия 25,9%, что делает вид перспективным для селекции и промышленного производства.

Материалом для исследований послужили плодовые тела грибов вешенки из 6 локалитетов Северо-Западного Кавказа. Обнаруженные природные штаммы вешенки представляли собой группу, гетерогенную по комплексу таксономических признаков, характеризующих габитус плодового тела.

Учитывая, что таксономические признаки, основанные на морфологии базидиом, находятся в зависимости от типа субстрата, сроков плодоношения, сопряжены с абиотическими факторами среды обитания, проводить видоЕое определение аборигенных штаммов при отсутствии дискретных фенотипических признаков весьма затруднительно. В связи с этим для идентификации мы использовали ПЦР - ВРЬР-анализ, который показал, что все 23 образца принадлежат к одному биологическому виду Р. риЫопапив (рис. 3). Достоверность отнесения природных штаммов к указанному виду также была подтверждена скрещиваниями с тестерными штаммами.

Рис. 3. ПЦР - RFLP фрагменты, полученные рестрикцией ITS участка рибосо-мальной ДНК с использованием ресгриктазы НаеШ

Примечание: линии 1,3 — P. ostreatus ВКМ F-3889D; 2 - P. cormicopiae ВКМ F-1979; 4 - P. pulmonarius ВКМ F-2006; 5-19 - природные изоляты; М - маркер молекулярной массы ДНК MassRuler™ DNA Ladder Mix.

Для повышения эффективности отбора у штаммов, приблизившихся к селекционному лимиту, необходимо привлекать для скрещивания новые штаммы, имеющие иные аддитивные гены. Одним из параметров, по которому исследователи оценивают уровень изменчивости, является доля полиморфных локусов. Все штаммы имели специфические RAPD-спектры, различающиеся числом фрагментов, их размером и степенью выраженности на электрофоре-грамме. Наряду с наличием общих ампликонов большую часть спектров составляют фрагменты, которые присутствуют в одних и отсутствуют в других геномах. Эти фрагменты являются полиморфными маркерами исследуемой ДНК (рис. 4). Соотношение между общим числом выявленных и полиморфных ампликонов для праймера S-13 составило 14/13.

Генетический полиморфизм в целом для выборки мы оценивали как суммарную долю RAPD-признаков, по которым наблюдается изменчивость от их общего числа. Применительно к объединенной выборке доля полиморфных локусов в общей совокупности составила 92,8%, что создает широкую генетическую базу для отбора изолятов и использования их в селекционном процессе.

Рис. 4. ПЦР профили природных изолятов вешенки с использованием праймера 8-13

Примечание: 1-1Х;2-Х;3-Х1;4-ХП;5- ХШ-1; 6 - ХШ-2; 7 - ХШ-3; 8 - XIV; 9 - XV.

Для исключения вклада индивидуальной изменчивости в полиморфизм ЯАРБ-спектров был проведен анализ семи монокариотических изолятов, полученных из базидиоспор одного природного штамма Р. риЬюпагшз. Результаты свидетельствовали об отсутствии у близкородственных штаммов полиморфизма в ИАРО-спектре с использованием праймера 5-13. Следовательно, используемый праймер позволяет выявлять более значительные генетические различия на уровне биологического вида.

Дендрограмма генетического сходства по результатам ВАРБ-анализа выявляет два основных кластера, однако группировка экземпляров внутри кластера не имеет какой-либо связи с географическим положением точек их отбора, т.е. изоляты сочетались независимо от их географического положения, что указывает на пространственную внутрипопуляционную гетерогенность генетической структуры Р. ри1топапш и свидетельствует о большом генетическом разнообразии этого вида в исследованных лесных биогеоценозах.

Несмотря на существенный внутривидовой генетический полиморфизм представителей вида Р. ргйтопапт, генетическая обособленность данных популяционных групп не является строгой. Эти данные показывают достаточно равномерное распространение особей с разными генотипами по исследованной территории.

| |

Таким образом, полученные нами данные позволяют заключить, что выявленные природные локалитеты Р. ри1топапш представляют собой генетически и фенотипически гетерогенную популяцию с высоким уровнем полиморфизма особей. Выборка из природных изолятов может быть использована в качестве источника нового генетического материала для селекции, а также внедрения в производство штаммов, способных формировать плодовые тела в условиях летних температур.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод оценки лакказной активности мицелия вешенки на плотных питательных средах с хромогенным субстратом, позволяющий вести отбор гаплотипов вешенки с максимальными значениями.

2. Среди трехсот исследованных сибсовых монокарионов выявлена значительная вариабельность по признаку активности лакказ с коэффициентом вариации от 25 до 39%.

3. Установлено, что культивирование мицелия вешенки на субстрате с рН 8,5 замедляет динамику активности лакказ и сдвигает максимум активности на 10 суток. Начало плодоношения совпадает с моментом достижения максимальной активности лакказ при снижении значения рН до 5,5.

4. Отбор гаплотипов с высокой активностью лакказ позволил получить гибридные штаммы, достоверно превышающие по продуктивности родительские формы.

5. Методом рестрикционного анализа установлено, что штаммы, формирующие базидиомы в летний период на территории лесных биогеоценозов Северо-Западного Кавказа, представлены одним биологическим видом Р. риЬпопапиз.

6. Генетический полиморфизм летних штаммов Р. ри1топагп^ лесных биогеоценозов Северо-Западного Кавказа, оцененный с использованием 11АРО-признаков, составил 92,8%.

7. Исследованные природные локалитеты Р. ри1тапагшх представляют собой генетически и фенотипически гетерогенную популяцию с высоким уровнем полиморфизма особей и значительной вариацией активности лакказ мицелия.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. В условиях промышленного производства грибоводческим хозяйствам рекомендуется использовать штамм P. ostreatus ВКМ F-3889D, с продуктивностью плодовых тел на уровне 30-32% от массы влажного субстрата и не требующий снижения температуры воздуха для инициации плодообразования.

2. При подготовке субстрата для культивирования вешенки не рекомендуется доводить рН субстрата выше 8,0 во избежание затягивания инициации плодоношения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Копыльцов, C.B. Зависимость степени деградации соломы от лигнин- и целлюлозодитической активности ферментов гибридных штаммов вешенки / C.B. Копыльцов, Г.И. Иванов // Научное обеспечение агропромышленного комплекса: материалы VII Региональной научно-практической конференции молодых ученых, Краснодар, 8-9 декабря 2005 г. - Краснодар, 2005. - С. 29-30.

2. Копыльцов, C.B. Получение высокопродуктивных гибридных штаммов вешенки обыкновенной, Pleurotus ostreatus / C.B. Копыльцов // Живые системы: сб. докладов Всероссийской конференции в рамках конкурсного отбора инновационных проектов аспирантов и студентов по приоритетному направлению, Киров, 5-6 октября 2006 г., Киров, 2006. - С. 66-69.

3. Копыльцов, C.B. Создание высокопродуктивных гибридных штаммов вешенки / C.B. Копыльцов // Биотехнология будущего: сб. статей Международной школы-конференции молодых ученых, С-Петербург, 6-9 июня 2006 г. - М„ 2006. - С. 40-41.

4. Иванов, Г.И. Урожайность коммерческих штаммов вешенки, предлагаемых к промышленному культивированию / Г.И. Иванов, C.B. Копыльцов // Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2006. - Вып. 4. - С. 128-135.

5. Копылыдов, C.B. Получение высокопродуктивных гибридных штаммов вешенки обыкновенной, Pleurotus ostreatus / C.B. Копыльцов // Научное обеспечение агропромышленного комплекса: материалы VIII Региональной научно-практической конференции молодых ученых, Краснодар, 7-8 декабря 2006. - Краснодар, 2006. - С. 202-203.

6. Иванов, Г.И. Применение показателя активности лакказы мицелия в селекции на урожайность плодовых тел вешенки обыкновенной / Г.И. Иванов, C.B. Копыльцов // Доклады МОИП: сб. статей Всероссийской конференции, Москва, 18-20 ноября 2006 г. - М., 2006 г. - С. 223.

7. Копыльцов, C.B. Изучение активности экзофермента лакказы гриба вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus) на питательных средах с различными источниками углерода / C.B. Копыльцов, Г.И. Иванов // Студенчество и наука: сб. студенческих работ КубГАУ. -Краснодар, 2007. - С. 11-12.

8. Копыльцов, C.B. Изучение активности фермента лакказы среди дикариотических и монокариотических изолятов гриба Pleurotus ostreatus / C.B. Копыльцов, A.C. Звягин // Развитие АПК: сб. материалов Международной конф. «Роль молодых ученых в реализации национального проекта, Москва, 29-30 мая 2007 г. - М., 2007. - С. 46.

9. Иванов, Г.И. Выявление и использование гаплотипов гриба Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm с повышенной активностью лакказы мицелия в селекции на урожайность плодовых тел / Г.И. Иванов, C.B. Копыльцов // Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2008. - Вып. 5. - С. 137-141.

10. Пат. 2295728 Российская Федерация, МПК G01N 33/573, C12Q 1/26. Способ определения активности фермента лакказы базидиальных грибов / Г.И. Иванов, C.B. Копыльцов, заявитель и патентообладатель ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет». - № 2005117598/13 ; заявл. 07.06.2005 ; опубл. 20.03.2007, Бюл. №8. - 4 с.

Подписано в печать 22.04.2009 г. Бумага офсетная Печ. л. 1 Тираж 100 экз.

Формат 60x84 '/16 Офсетная печать Заказ 353

Отпечатано в типографии КубГАУ 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Копыльцов, Сергей Васильевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современное состояние грибоводства в России.

1.2. Эколого-биологическая характеристика. представителей рода Pleurotus.

1.3. Основные принципы и состояние селекции вешенки. на продуктивность плодовых тел.

1.3.1. Современные промышленно культивируемые штаммы и их продуктивность.

1.3.2. Использование молекулярно-генетических методов селекции грибов на продуктивность.

1.4. Лигноцеллюлазный комплекс грибов рода Pleurotus.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

3.1. Разработка селекционного процесса с использованием показателя активности лакказ.

3.1.1. Разработка способа отбора гаплотипов грибов рода Pleurotus с повышенной активностью лакказ.

3.1.2. Выявление вариабельности признака активности лакказ. и целлюлаз у монокариотического и дикариотического. мицелия вешенки.

3.1.3. Влияние рН-субстрата на динамику активности лакказ. и сопряженность этого фактора с инициацией плодоношения.

3.2. Получение гибридных штаммов вешенки.

3.2.1. Оценка гибридов вешенки по показателю активности лакказ.

3.2.2. Оценка продуктивности плодовых тел гибридов вешенки.

3.2.3. Органолептическая оценка плодовых тел вешенки и анализ их химического состава.

3.3. Формирование нового селекционного материала вешенки на основе изолятов лесных биогеоценозов Северо-Западного Кавказа.

3.3.1. Выявление и видовая идентификация «летних» штаммов вешенки лесных биогеоценозов Северо-Западного Кавказа.

3.3.2. Исследование генетического полиморфизма природных. популяций P. pulmonarius.

3.3.3. Активность лакказ мицелия природных. штаммов P. pulmonarius.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание исходного материала для селекции гибридных штаммов Pleurotus (Fr.) P. Kumm. на основе метода отбора гаплотипов с повышенной активностью лакказ"

Промышленное культивирование плодовых тел высших съедобных ба-зидиомицетов по экономической эффективности может успешно конкурировать с традиционными методами получения пищевых продуктов (Бисько, 1996). Рентабельность производства вешенки составляет в среднем 30% (Де-вочкина, Алексеева, 1998). Вешенка обыкновенная Pleiirotus ostreatus (Fr.) Kumm. является одним из перспективных компонентов экологически чистых пищевых продуктов, обладающих высокой биологической ценностью и лечебно-профилактическими свойствами. Интенсивное культивирование вешенки на разнообразных целлюлозо- и лигнинсодержащих отходах сельского и лесного хозяйства, а также перерабатывающей промышленности с последующим использованием субстратов после плодоношения в качестве кормовых добавок в животноводстве или удобрений в тепличном хозяйстве позволяет сделать производство съедобного гриба вешенки безотходным (Поединок, 2004). В производственной практике культивирования вешенки представлен небольшой ассортимент штаммов, большая часть из которых являются штаммами зарубежной селекции. Еще меньшее их количество имеют официальную регистрацию на территории России в качестве объекта изобретения или селекционного достижения. Отсутствуют четкие рекомендации по обеспечению технологических условий, обеспечивающих реализацию биологического потенциала того или иного штамма.

Поэтому важной задачей современного интенсивного грибоводства, является получение и внедрение в производство высокоурожайных штаммов, полученных с использованием научно обоснованных методов, в совокупности с применением технологии производства вешенки, соответствующей ее биологическим требованиям.

Актуальность исследований. Проблема недостаточного обеспечения рациона человека белком от года к году не становится менее острой. На фоне роста стоимости зерновых культур недостаточно полно используется потенциал вовлечения лигноцеллюлозных отходов в производство дополнительной продукции. Одним из эффективных методов переработки растительных отходов является их биоконверсия при выращивании базидиальных грибов. Среди промышленно культивируемых грибов вешенка занимает одно из ведущих мест по объему производства грибной продукции в России.

Динамическое развитие грибоводства в России выявило потребность производства в штаммах вешенки, удовлетворяющих современным требованиям интенсивных технологий: сокращение сроков обрастания субстрата и выгонки плодовых тел, устойчивость к конкурентной микрофлоре, бесшоко-вость, высокая продуктивность и товарные качества плодовых тел. Несмотря на возрастающие объемы культивирования вешенки, промышленное производство в значительной степени сдерживается из-за отсутствия продуктивных отечественных сортов и штаммов (Таксономический анализ., 2002). На сегодняшний день в государственном реестре селекционных достижений РФ зарегистрированы четыре сорта, относящиеся к вешенке устричной, и один сорт вешенки флоридской. В связи с этим важной задачей современной грибной индустрии является создание новых высокопродуктивных сортов. Выявлению различных факторов, влияющих на продуктивность плодовых тел, посвящен ряд работ (Wang, Anderson, 1972; Eger G., 1974; Larraya, 2002), однако системных исследований по их использованию при проведении гибридизации и отборе штаммов выполнено недостаточно.

Цель и задачи исследований создание исходного материала рода Pleurotus (Fr.) P. Kumm методом отбора гаплотипов по активности лакказ для селекции на продуктивность. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Разработать метод отбора монокариотического и дикариотического мицелия по активности лакказ.

2. Выделить из промышленно культивируемых штаммов моноспоровые изоляты, произвести их анализ и отбор по активности лакказ.

3. Провести гибридизацию отобранного монокариотического мицелия разных штаммов и оценить активность лакказ полученных гибридов.

4. Изучить продуктивность и габитус плодовых тел коммерческих и полученных гибридных штаммов P. ostreatus в научно-хозяйственных испытаниях.

5. Исследовать местообитания «летних» штаммов рода Pleurotus (Fr.) P. Kumm. на территории Северо-Западного Кавказа, установить вариацию активности лакказ их мицелия и степень генетического внутривидового разнообразия особей в популяции.

Научная новизна. Разработан экспресс-метод определения активности лакказ мицелия вешенки.

Впервые экспериментально подтверждена целесообразность осуществления отбора дикариотических и монокариотических форм мицелия по признаку активности лакказ при проведении селекции вешенки на повышение продуктивности.

Впервые показана взаимосвязь активности лакказ и инициации плодоношения вешенки обыкновенной с рН субстрата при ее твердофазном культивировании.

Впервые проведено изучение популяции «летних» штаммов вешенки лесных биоценозов Северо-Западного Кавказа, установлена вариация активности лакказ их мицелия и степень генетического внутривидового разнообразия особей в популяции.

По результатам выполненных исследований на защиту выносятся следующие основные положения:

1. Разработан метод отбора гаплоидов вешенки по активности лакказ на плотных питательных средах.

2. Использование гаплотипов вешенки с повышенной активностью лакказ при проведении селекции обеспечивают увеличение продуктивности получаемых гибридов.

3. Получен гибридный штамм P. ostreatus (Fr.) Kumm. ВКМ F-3889D методом отбора гаплоидов с высокой активностью лакказ, достоверно превышающий по продуктивности родительские формы.

4. Культивирование вешенки на субстрате с повышенным значением рН увеличивает период наступления максимума активности лакказ и инициации плодоношения на десять суток.

5. Штаммы вешенки лесных биогеоценозов Северо-Западного Кавказа обладают значительной вариацией лакказ мицелия и высоким уровнем генетического полиморфизма. Отобранный генетический материал пригоден для селекции штаммов, формирующих базидиомы в летний период при культивировании интенсивным методом.

Практическая значимость работы. Разработанная методика отбора родительских форм по признаку активности лакказ была применена при проведении селекции на продуктивность и для создания гибридных штаммов (патент РФ на изобретение № 2295728).

Получен гибридный штамм ВКМ F-3889D, позволяющий повысить продуктивность плодовых тел вешенки и исключить стадию холодового «шока» и депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ РАН им. Г. К. Скрябина.

Исследовано генетическое разнообразие внутри природных популяций вешенки. Собранные образцы могут быть использованы в селекции при отборе штаммов для промышленного культивирования в условиях летнего сезона.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены: на VII и VIII Региональных научно-практических конференциях молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2005; 2006); Всероссийской конференции в рамках конкурсного отбора инновационных проектов аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Живые системы» (Киров, 2006); Федеральной школе-конференции по инновационному малому предпринимательству в приоритетных направлениях науки и высоких технологий (Москва, 2006); Заключительном туре Всероссийской конференции смотра-конкурса на лучшую студенческую работу по направлению растениеводство и земледелие (Москва, 2006); конференции «Биотехнология как научно-практический приоритет развития Кировской области» (Киров, 2007); II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2008).

Публикации. Результаты исследования отражены в 10 печатных работах, из них 1 патент и 2 работы опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, предложений производству и списка используемых литературных источников, включающего 144 источника, в том числе 40 зарубежных авторов. Работа изложена на 123 страницах и иллюстрирована 19 рисунками, 11 таблицами, содержит 3 приложения.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Копыльцов, Сергей Васильевич

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Высшие съедобные базидиомицеты являются предметом интенсивного изучения многих исследователей. Особенности их биохимической активности позволяют использовать данные грибы для получения различных биологически активных веществ и ферментов, а также в качестве продуцентов плодовых тел. При этом в качестве субстрата используют дешевое сырье — отходы сельскохозяйственного производства и лесопереработки. Одним из популярных культивируемых грибов в мире является ксилотрофный базидиомицет P. ostreatus, или вешенка обыкновенная. В настоящее время преобладает интенсивная технология производства этого гриба, не зависящая от климатических условий, но требующая использования высокопродуктивных штаммов с коротким циклом развития. Производству предлагается значительный ассортимент штаммов веш-нки, большинство из которых является штаммами зарубежной селекции, однако их продуктивность в большинстве случаев является неудовлетворительной. При позиционируемой фирмой-производителем продуктивности 30-35% от массы влажного субстрата возможно получить лишь 20-22%, о чем свидетельствуют как данные цитируемых авторов, так и результаты, полученные в ходе выполнения настоящей работы.

Целью работы явилось разработка метода получения гибридов рода Pleuro-tus с повышенной продуктивностью, а также изучение природных популяций вешенки лесных биоценозов Северо-Западного Кавказа для выявления штаммов, устойчивых к летним температурам и потенциально пригодных для промышленного культивирования. Одной из задач работы было определение косвенного признака, пригодного для отбора потенциально высокопродуктивных штаммов. Кроме того, было необходимо разработать метод, позволяющий в условиях массового скрининга выявлять гаплотипы, соответствующие критериям отбора.

В результате проведенных исследований был разработан экспресс-метод для определения активности лакказ мицелия, растущего на плотных питательных средах с хромогенным субстратом. Изучения активности лакказ трехсот монокариотических изолятов пяти коммерческих и одного дикого штаммов позволило отобрать 14 монокарионов, имеющих максимальное значение данного признака. В результате гибридизации отобранных монокарионов были получены гибриды, которые также были подвержены анализу активности лакказ и отбору экземпляров с максимальными значениями данного признака.

Заключительным этапом селекционного отбора является апробация штаммов в промышленных условиях. Это позволяет оценить насколько полно могут быть реализованы генетические возможности штамма, на сколько отбор на лабораторном уровне соответствует задачам производства. Результаты проведенных научно-хозяйственных опытов показали, что подбор для гибридизации совместимых монокарионов, обладающих повышенной активностью лакказ, позволяет получить дикариотический мицелий, обладающий повышенной продуктивностью плодовых тел при твердофазном культивировании. Из полученных гибридов были отобраны три Г1, Г2 и Г6, которые имели продуктивность плодовых тел на уровне 28-32% от массы субстрата, что на 30% больше, чем продуктивность исследованных коммерческих штаммов.

Актуальным и перспективным является изучение и использование природного генетического потенциала аборигенных штаммов вешенки для формирования нового селекционного материала летних штаммов. Проведенные исследования с использованием молекулярно-генетических методов выявили ге-нетическии и фенотипически гетерогенную популяцию с высоким полиморфизмом особей, что позволяет использовать собранный материал для селекции штаммов, формирующих плодовые тела в условиях летних температур.

Таким образом, в процессе выполнения работы были разработаны научные основы направленного селекционного отбора вешенки для повышения продуктивности плодовых тел. Селектирован и защищен патентом на изобретение штамм-продуцент P. ostreatus ВКМ F-3889D. Показана возможность получения плодовых тел селектированного штаммана на основе современного интенсивного производства. Содержание сырого протеина в плодовых телах P. ostreatus ВКМ F-3889D составило 24,8, растворимого - 13,5, сырого жира - 2,8, клетчатки — 35,9, влажность — 90,7%.

105

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Копыльцов, Сергей Васильевич, Краснодар

1. Алексеева, К. Л. Зеленые плесени субстратных блоков при выращивании блоков и способы снижения их вредоносности / К. Л. Алексеева // Гавриш. - 2005. - № 2. - 18-21.

2. Бабицкая, В. Г. Pleurotus ostreatus — продуцент комплекса биологически активных веществ / В. Г. Бабицкая, В. В. Щерба // Прикладная биохимия и микробиология. - 1996. - Т. 3, №2. - 203-210.

3. Барсукова, Т. Н. Pleurotus cornucopiae (Paulet) Rolland - перспективный вид для искусственного культивирования / Т. Н. Барсукова, А. И. Иванов // Микология и фитопатология. - 1987. - Т. 21, Вып. 2. - С . 113-117.

4. Барсукова, Т. Н. Эколого-биологическая характеристика Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quel / Т. И. Барсукова, Л. В. Гарибова, А. И. Иванов // Микология и фитопатология. - 1989. - Т. 23, Вып. 1. - 14-19. •/

5. Беккер, Е. Г. Сравнительный анализ методов исследования действия лигнолитических ферментов на лигнин / Е. Г. Беккер, А. П. Синицын // Прикладная биохимия и микробиология. - 1993. - Т. 29, Вып. 2. -С. 244-252.

6. Бисько, Н. А. Первичный отбор продуктивных штаммов Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. / H. A. Бисько // Микология и фитопатология. - 1985. - Т. 19, Вып. 2. - 89-92.

7. Бисько, Н. А. Наследование скорости роста у дикарионов вешенки обыкновенной Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. / H. A. Бисько, E. Г. Косман // Докл. АН УССР. Сер. Б. Геол., хим. и биол. науки. -1986.-№3. ,

8. Б исько, Н. А. Микрофлора субстрала Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. в частично замкнутой искусственной экосистеме / Н. А. Бисько // Микология и фитопатология. - 1996. - Т. 30, Вып. 5-6. - 7-12.

9. Божков, А. И. Экскреторная активность гидролитических ферментов Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm в глубинной культуре / А. И. Божков, В. И. Облак // Биотехнология. - 2007. - №1. - 41-46.

10. Бондарцев, А. Шкала цветов: пособие для биологов при научных и научно-прикладных исследованиях / А. Бондарцев. — М. - Л.: Изд-во АНСССР, 1954. - 42 с.

11. Бурова, Л. Г. Экология грибов макромицетов / Л. Г. Бурова. - М.: Наука, 1986.-221 с.

12. Бухало, А. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре / А. Бухало - Киев: Наукова думка, 1988.-142 с.

13. Вассер, П. Вопросы таксономии культивируемых грибов / П. Вассер // сб.: Производство высших съедобных грибов в СССР. - Киев, 1978.-С. 33-38.

14. Ващенко, Ф. Методические рекомендации по проведению опытов с овощными культурами в сооружениях защиш;енного грунта / Ф. Ващенко. - М . : Изд-во ВАСХНИЛ, 1976. - 108 с.

15. Вендило, Т. Г. Методические указания по организации агрохимических исследований и проведению анализов в овощеводстве защищенного грунта / Т. Г. Вендило. - М.: 1973. - Ч. 1. - 40 с.

16. Взаимосвязь состава липидов и продуктов их перекисного окисления с секрецией лигнолитических ферментов в процессе роста Len-tinus (Panus) tigrinus I Д. A. Кадималиев и др.. // Микробиология. — 2006. - Т. 75, №5. - 649-653.

17. Виды вешенок, перспективные для промышленного культивирования / Л. В. Гарибова и др.. // Биологические науки. - 1992. - №3. -С. 109-115.

18. Влияние модификации древесины на потребление лигнина и синтез лигнолитических ферментов грибом Panus (Lentinus) tigrinus I Д. A. Кадималиев и др.. // Прикладная биохимия и микробиология. -2003. - Т. 39, №5. - 555-560.

19. Выделение изоферментов лигниназы из Sporotrichum pulverulentum и их некоторые свойства / Е. Г. Беккер и др.. // Биохимия. - 1991. — Т. 56, Вып. 8. - 1413-1419.

20. Выделение, очистка и некоторые физико-химические характеристики лакказы из базидиомицета Coriolus zonatus / О. В. Королева и др.. // Прикладная биохимия и микробиология. - 1998. - Т. 34, №5. -С. 490-494.

21. Выделение и очистка ферментов лигнинолитического комплекса базидиального гриба Trametes pubescens (Schumach.) Pilat и исследование их свойств / О. В. Никитина и др.. // Биохимия. - 2005. - Т. 70, Вып. 1 1 . - С . 1548-1555.

22. Высшие съедобные базидиомицеты в поверхностной и глубинной культуре / Под ред. И. А. Дудка. - К.: Наук, думка, 1983. - 312 с.

23. Ганбаров, X. Г. Эколого-физиологические особенности деревораз- рушающих высших базидиальных грибов / X. Г. Ганбаров. - Баку: Элм, 1989.-197 с.

24. Гарибова, Л. В. Селекция культивируемого шампиньона // сб.: Генетические основы селекции микроорганизмов. - М.: Наука, 1969а. — 239-260.

25. Гарибова, Л. В. Эколого-биологическая характеристика Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. / Л. В. Гарибова, Т. Н. Барсукова, А. И. Иванов // Биологические науки. - 1989. — № 7. - 73-77.

26. Гарибова, Л. В. Грибы. Энциклопедия природы России / Л. В. Гарибова - М., 1999. - 352 с.

27. Горленко, М. Ф. Положение грибов в системе органического мира / В сб.: Эволюция и систематика грибов: Теоретические и прикладные аспекты. - Л.: Наука, 1984. - 5-9.

28. Горовой, Л. Ф. Морфогенез пластинчатых грибов / Л. Ф. Горовой. - Киев: Наук, думка, 1990. - 166 с. по

29. ГОСТ 26657-97. Корма,комбикорма,комбикормовое сырье. Мето- дыопределениясодержания фосфора. — Взамен ГОСТ 26657-85; введ. 1999-01-01. - М.: ИПК Издательство стандартов, 2000.

30. ГОСТ 13979.3-68. Жмыхи и шроты. Метод определения суммарной массовой доли растворимых протеинов. - Взамен ГОСТ 5983-51, 80-62,606-62; введ. 01-01-70. - М . : ИПК Издательство стандартов, 2000.

31. ГОСТ 13496.2-91. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения сырой клетчатки. -Взамен ГОСТ 13496.2-84; введ. 01-01-93. - М . : ИПК Издательство стандартов, 2000.

32. ГОСТ 13496.3-92. Комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения влаги. - Взамен ГОСТ 13496.3-80; введ. 01-01-93. - М.: ИПК Издательство стандартов, 2000.

33. ГОСТ 13496.4-93. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения азота и сырого протеина. - Взамен ГОСТ 13496.4-84; введ. 01-01-95. - М . : ИПК Издательство стандартов, 2000.

34. ГОСТ 13496.15-97. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания сырого жира. - Взамен ГОСТ 13496.15-85; введ. 01-01-99. - М.: ИПК Издательство стандартов, 2000.

35. Девочкина, Н. Л. Промышленная технология выращивания съедобных грибов. Рекомендации / И. Л. Девочкина, К. Л. Алексеева // Минсельхозпрод РФ. - 1998. - 57.

36. Дифференциация видов и сортов вешенки {Pleurotus spp.) с помощью скрещиваний и молекулярных маркеров / А. В. Шныреват и др. . // Микология и фитопатология. - 1996. - Т. 30, Вып. 5-6. - 37-43.

37. Доспехов, Б. А. Методика полевого опыта / Б. А. Доспехов. - М.: Агропромиздат, 1985.-351 с.

38. Дружинина, И. Гомокариотические пеллеты грибов и их использование в генетическом анализе / И. Дружинина // Генетика. -1997. - Т. 33, №5. 628-634. \ I l l

39. Дудка, И. А. Грибы: справочник миколога и грибника / И. А, Дудка, П. Вассер. - Киев: Наукова думка, 1987. - 534 с.

40. Дурова, В. В. Обогащение соломы мицелием съедобных грибов / B. В. Дурова, Е. А. Шиляева // Зоотехния. - 1997. - №9. - 15-16.

41. Дьяков, Ю. Т. Гибридные сорта культивируемых съедобных грибов // Наука и практика грибоводства: материалы IV Международной конференции, Москва, 16-17 июня 1997 г. - М . , 1997. - 1-6.

42. Дьяков, Ю. Т. Введение в генетику грибов / Ю. Т. Дьяков, А. В. Шнырева, А. Ю. Сергеев. - М.: ИЦ Академия, 2005. - 304 с.

43. Дьяков, Ю, Т. Грибы: индивидуумы, популяции, видообразование / Ю. Т. Дьяков // Журнал общей биологии. - 2008. - Т. 69, №1. - 10-18.

44. Жемчужина, Н.' Индуцированный мутагенез протопластов съедобных грибов рода Pleurotus I Н. Жемчужина, В. Г. Джавахия// Микология и фитопатология. - 1992. - Т. 26, Вып. 2. - 98-103.

45. Желтая лакказа гриба Pleurotus ostreatus Dl: очистка и характеристика / Н. Н. Позднякова и др.. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2006. - Т. 39, №1, - 63-69.

46. Жмудь, Е. В. Динамика содержания белка и трипсинингибирующей активности при хранении вешенки обыкновенной / Е. В. Жмудь, Е. В. Макарова, О. В. Дорогина // Хранение и переработка сельхоз-сырья. - 2007. - №3. - 36-40.

47. Заварзина, А. Г. Лакказная и тирозиназная активности у лишайников / А. Г. Заварзина, А. А. Заварзин // Микробиология. - 2006. - Т. 75, № 5 . - С . 630-641.

48. Зернов, А, Флора Северо-Западного Кавказа / Зернов А. - М.: Товарищество научных изданий КМК, 2006. - 664 с.

49. Карманов, А. П. Лигнин. Структурная организация и самоорганизация / А. П. Карманов // Химия растительного сырья. - 1999. - №1. -C. 65-74.

50. Клесова, А. А. Целлюлолитические микроорганизмы и ферменты / А. А. Клесова // Итоги науки и техники, сер. биотехнология. — 1988. — Т. 1 0 . - С . 97-128.

51. Клесов, А. А. Биохимия и энзимология гидролиза целлюлозы / А. А. Клесов // Биохимия. - Т. 55, Вып. 10. - 1731-1762.

52. Колеснеченко, Л. В. Биологические особенности и селекция культивируемого шампиньона / Л. В. Колеснеченко, И. А. Дудка, П. Вассер // В сб.: Производство высших съедобных грибов в СССР. - К.: Наук, думка, 1978. - 63-73.

53. Ксиланазы и фенолоксидазы базидиальных грибов / 3. Р. Ахмедова и др.. // Микология и фитопатология. - 1994. - Т. 28, вып. 1. - 49-53.

54. Литвинов, Проблемы экологизации овощеводства России / Литвинов. - М.: Россельхозакадемия, - 1998. - 346 с.

55. Лобанок, А. Г. Микрометод определения активности целлюлазы / А. Г. Лобанок, Л. Романов // Прикладная биохимия и микробиология. - 1976. - Т. XII, Вып. 3. - 459-461.

56. Мажейка, И. Метод получения препаратов синаптонемных комплексов мейотических хромосом из базидиальных протопластов шампиньона Agaricus bisporus (Lange) Imbach / И. Мажейка, О. Л. Коломиец // Общая генетика. - 2003. - Т. 39, №3. - 357-361.

57. Методы экспериментальной микологии / под общ. ред. Билай В. И. - Киев: Наукова думка, 1973. - 242 с.

58. Микробиология пива / под ред. Фергюса Дж. Приста, Иена Кэм- пбелла. - С-Пб: Профессия, 2005. - 368 с.

59. Михайловский, Л. В. Виды вешенок из родства Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm. в СССР / Л. В. Михайловский // Новости систематики низших растений. - 1974. — 211-219.

60. Модификация лигнина древесины грибом Partus tigrinus / В. В. Ре- вин и др.. // Прикладная биохимия и микробиология. — 2002. — Т. 38, №5,-С. 529-533.

61. Образцова, И. Н. Получение и слияние протопластов грибов- продуцентов лигнолитических и целлюлозолитических ферментов / И. Н. Образцова // автореф. дис... канд. биол. наук / П М., 1991. D 19 с.

62. Олефирова, А. П. Органолептическая оценка пищевых продуктов: Учебно-практическое пособие / Олефирова А. П. - Улан - Удэ: Изд-воВСГТУ,2005.-192с.

63. Партии, Д. Обоснование условий выращивания и системы защиты вешенки обыкновенной {Pleurotus ostreatus) при промышленном производстве : дисс. ... канд. с.-х. наук : 06.01.05, 06.01.11 / Партии Дмитрий Сергеевич. - М., 2006. - 145 с.

64. Пегасова, Т. В. Структура лакказы из Coriolus hirsutus и строение ее активного центра : дис. ... канд. хим. наук: 03.00.04 / Пегасова Татьяна Владимировна. - М. - 2004. - 137 с.

65. Петров, А. П. Мейоз у вешенки флоридской {Pleurotus Florida Fovose) / А. П. Петров // Цитология и генетика. - 1991. - Т. 25, № 2. -С. 56-57.

66. Повышение эффективности промышленного культивирования съедобного гриба вешенки обыкновенной / Н. Л. Поединок и др.. // Биотехнология. - 2004. - №5. - 64-66.

67. Полубояринов П. А. Влияние селеноорганических препаратов на формирование урожая вешенки устричной {Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm.) : дис. ...канд. с.-х. наук: 06.01.09 / Полубояринов Пвел Аркадьевич - Пенза, 2006. - 109 с.

68. Получение и слияние протопластов грибов-продуцентов лигноли- тических и целлюлозолитических ферментов. Биохимические характеристики ферментного комплекса фузанта / И. Н. Образцова и др.. // Биохимия. - 1991. - Т. 56, Вып. 6. - 1018-1025.

69. Получение протопластов базидиомицетов белой гнили и биохимические характеристики секретируемых ферментных комплексов / Н. Н. Нуцубидзе и др.. // Прикладная биохимия и микробиология. — 1992. - Т. 28, Вып. 3. - 409-415.

70. Промышленное культивирование съедобных грибов / - Киев: Наук. думка, 1978.-262 с.

71. Разложение овсяной соломы при жидкофазном и твердофазном культивировании / Е. В. Степанова и др.. //Прикладная биохимия и микробиология. - 2003. - Т. 39, №1, - 74-84.

72. Разложение лигноуглеводного субстрата почвенными грибами - продуцентами лакказы и целлобиозодегидрогеназы / Л. Г. Василь-ченко и др.. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. - Т. 40, № 1 . - С . 51-56.

73. Рипачек, В. Биология дереворазрушающих грибов / В. Рипачек. — М.: Лесная промышленность. - 1967. - 276 с.

74. Ровбель, Н. М. Оценка сорбционной активности глубинной биомассы высших базидиальных грибов по отношению к ионам меди / Н. М. Ровбель, И. А. Гончарова, Д. А. Смирнов // Микология и фитопатология. - 2004. - Т. 38, Вып. 4. - 73-77.

75. Рокицкий, П. Ф. Биологическая статистика / П. Ф. Рокицкий. — Минск: Вышэйшая школа, 1973. — 320 с.

76. Рубцов, А. А. Усовершенствование элементов технологии приготовления субстрата для выраш;ивания вешенки : автореф. дисс... канд. с.-х. наук : 06.01.06 / Рубцов Александр Александрович. - М., 2007. - 27 с.

77. Семенов, М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. Справочник / М. Семенов / П М.: Агропрмиздат, 1990. - 240 с.

78. Семичаевский, В. Д. Высшие базидиальные грибы - продуценты целлюлазных комплексов / В. Д. Семичаевский // Итоги науки и техники, сер. биотехнология. - 1988. - Т. 10. - 97-127.

79. Семичаевский, В. Д. Влияние рН на образование внеклеточных ферментов дереворазрушающ,им базидиомицетом Pleurotus ostreatus / В. Д. Семичаевский, Л. Г. Дудченко, Г. Г. Мельничук // Микробиологический журнал. - 1985. - Т. 47, № 5. - С 72-76.

80. Семичаевский, В, Д. Целлюлазы высших базидиальных грибов / B. Д. Семичаевский // Микология и фитопатология. 1989. Т.23, Вып. 6 . - С . 581-588.

81. Сравнительное изучение внеклеточных лакказ Сеггепа unicolor 059, Cerrena unicolor 0784 и Pleurotus ostreatus 0432 / E. В. Степанова и др.. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2003. - Т. 39, №4. -C. 427-434.

82. Сыткин, К. М. Задачи промышленного культивирования съедобных грибов / К. М. Сыткин // В сб.: Производство высших съедобных грибов в СССР. - К.: Наук, думка, 1978. - 3-6.

83. Терновой, К. Г. Агротехнологическое обоснование культивирования вешенки обыкновенной на костре льна : дис. ...канд. с.-х. наук : 06.01.09 / Терновой Константин Геннадьевич - М., 2006. - 144 с.

84. Тимофеев-Ресовский, Н. В. Микроэволюция: Элемент, явления, материал и факторы эволюц. процесса / Н. В. Тимофеев-Ресовский. -М.: Знание, 1974. - 64 с.

85. Тишенков, А. Д. Технология культивирования вешенки / А. Д. Тишенков, Ф, Ф. Карпов // Школа грибоводства. - 2000. - № 4. - С . 2-12.

86. Тишенков, А. Д. Влияние параметров культивирования на качество плодовых тел вешенки / А. Д. Тишенков, Ф. Ф. Карпов // Школа грибоводства. - 2002. - № 1. - 9-14.

87. Черепанова, Н. П. Морфология и размножение грибов / Н. П. Черепанова, А. В. Тобиас. - М.: ИЦ Академия, 2006. - 160 с.

88. Черных, А. М. Новые приемы повышения выхода лакказы гриба Panus tigrinus I А. М. Черных, А. А. Леонтьевский, Л. А. Головлева // Прикладная биохимия и микробиология. - 2005. - Т. 41, №5. - 578-581.

89. Черняховская, Т. Из леса вестимо... Обзор рынка грибов / Т. Черняховская // Russian food and drinks market magazine. — 2008. - №9 (www.foodmarket.spb.ru).

90. Шепелев, A. Ф. Товароведение и экспертиза продовольственных товаров: учебное пособие / А. Ф. Шепелев. - М.: ИКЦ «МарТ», 2004. - 992 с.

91. Шмальгаузен, И. И. Проблемы дарвинизма / И. И. Шмальгаузен. — Л.: Наука, 1969.-493 с.

92. Шнырева, А. В. Генетическая структура комплекса Pleurotus ostrea- tus sensu lato на территории московской области / А. В. Шнырева, И. Дружинина, Ю. Т. Дьяков // Генетика. - 1998. Т. 34, № 12. - 1610-1618.

93. Шнырева, А. В. Род Pleurotus (JACG.:FR.) KUMM / А. В. Шнырева // В сб.: Новое в систематике и номенклатуре грибов. — М., 2003. — 418-441.

95. Штаер, О. В. Сравнительный анализ природных популяций Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quel : дисс. ... канд. биол. наук : 03.00:24 / Шта-ер Оксана Васильевна. - М., 2006. — 116 с.

96. Pleurotus citrinopileatus Sing. - вид, перспективный для искусственного выращивания / Т. Н. Барсукова и др.. // Микология и фитопатология. - 1991. - Т. 25, Вып. 1. - 22-25.

97. Pleurotus djamor: способы культивирования и антимикробные свойства / Л. М. Краснопольская и др.. // Микология-и фитопатология. -2001. - Т. 35, Вып. 1. - 62-67.

98. Amplification and direct sequencing of fiingal ribosomal lUSfA genes for phylogenetics / T. J. White'et. al... PCR protocols: a guide to methods and applications. Academic press, San Diego, Calif. - 1990. - P. 315-322.

99. Bano, Z. Amino acid composition of the protein from a mushroom {Pleurotus sp.) I X?Ad.2i Bano, K. S. Srinivasan, H. С Srivastava // Appl. Environ. Microbiol. - 1963. - Vol. 11(3). - P. 184-187

100. Biodegradation of lignin by white rot fungi / A. Leonowicz at. al.. // Fungal Genetics and Biology. - 1999. - Vol. 27 (2/3). - P. 175-185

101. Blanchette Robert A. Delignification by wood-decay fungi / Robert A. Blanchette // Annu. Rev. Phytopathol. - 1991. 29:381-98.

102. Coll, P. M. Purification and characterization of a phenoloxidase (lac- case) from the lignin-degrading Basidiomycete PMl (CECT 2971) / Pedro M. Coll et. al.. // Appl. Environ. Microbiol. - 1993. - Vol. 59, № 8. - P. 2607-2613.

103. Das, N. Preparashion and regeneration of mycelial protoplasts of Pleurotus florida and P. ostreatus I N. Das, M. Mukherjee // Folia microbiol. - 1996. -Vol. 41, № 2. - P . 208-210.

104. Das, N. Importance of laccase in vegetative growth of Pleurotus Florida I N. Das, S. Sengupta, M. Mukherjee // Appl. Environ. Microbiol. - 1997. - Vol. 63, №10. - P. 4120-4122.

105. Demonstration of laccase in the white rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium BKM F1761 / C. Srinivasan et. al.. // Appl. Environ. Microbiol. - 1995. - Vol. 61, № 12. - P. 4274-4277.

106. DNA-fingerprinting (AFLP and RFLP) for genotypic identification in species of the Pleurotus eryngii complex / S. Urbanelli et. al.. // Appl. Environ. Microbiol. - 2007. - Vol. 74 - P. 592-600.

107. Ferri, di Floriano. Bacteria on Pleurotus sp. mushrooms / Ferri di Flori- ano // Mushrooms information. - 1985. - № 9. - p. 47-54.

108. Fruiting body formation from regenerated micelium of Pleurotus ostreatus protoplasts / Magae Y. et. al.. // Appl. Environ. Microbiol. - 1985. -Vol. 49, № 2 . - P . 441-442.

109. Eger, G. Rapid method for breeding Pleurotus ostreatus I G. Eger // Mushroom Sci. - 1974. № 9. - P. 575-583.

110. Eger, G. Biology and breeding of Pleurotus // The biology and cultivation of edible mashrooms. New York etc. : Acad, press, 1978. - P. 497— 520.

112. Hibrid production of oyster mushroom Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. / Nikzad Gharehaghaji A. et. al.. // Pakistan journal of biological sciences. - 2007. - V. 10, №14. - P. 2334-2340.

114. Intensification of lipase biosynthesis as a result of electro fusion of Rhizopus cohnii protoplasts / R. Sawicka-Zukowska et. al.. // J. Appl. Genet. - 2004. - Vol. 45, 1. - P. 37-48.

115. Isolation of protoplast from aerial mycelia and fruit-body formation from regenerated mycelia in Pleurotus cornucopiae I M. Mizoguchi et. al.. // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2006. - V. 70, №11. - P. 2751-2753.

116. Lechner, B. E. Presence of Pleurotus ostreatus in Patagonia, Argentina / B. E. Lechner, R. Petersen, M. Rajchenberg // Rev Iberoam Micol. -2002.-Vol. 1 9 . - P . 111-114. • 120

117. Johnston, G. Detection of Phanerochaete chrysosporium in soil by PCR and restriction enzyme analysis / С G. Johnston, S. D. Aust // Appl. Environ. Microbiol. - 1994. -Vol. 60, №7. - P . 2350-2354.

118. Mandeel, Q. A. Cultivation of oyster mushrooms {Pleurotus spp.) on various lignocellulosic wastes / Q. A. Mandeel, A. A. Al-Laith, S. A.Mohamed // World Journal of Microbiology &Biotechnology. - 2005. -Vol. 2 1 . - P . 601-607.

119. Mukherjee, M. Mutagenesis of protoplasts and regeneration of micelium in the mushroom Volvariella volvacea I M. Mukherjee, S. Sengupta // Appl. Environ. Microbiol. - 1986. -Vol. 52, № 6. P. 1412-1414.

120. Natakka, A. Lignin-modifying enzymes from selected white-rot fungi: production and role in lignin degradation / Anelle Natakka // FEMS Microbiology Reviews. - 1994. - №13. - P. 125-135.

122. Pettipher, G. L. Cultivation of the oyster mushroom {Pleurotus ostrea- tus) on lignocellulosic waste / Graham L. Pettipher // Journal of the Science of Food and Agriculture. - 1987. -Vol. 41, №3. - P. 259-265.

123. Protoplast fusion of Trichoderma reesei, using immature conidia / H. Toyama et. al.. // Appl. Environ. Microbiol. - 1984. - Vol. 47, № 2. - P. 363-368.

124. Quantitative trait loci controlling vegetative growsth rate in the edible basidiomycete Pleurotus ostreatus I Luis M. Larraya et. al.. // Appl. Environ. Microbiol. - 2002. - Vol. 68, № 3. P. 1109-1114.

125. Rapid identification of Rhizobia by restriction fragment length polymorphism analysis of PCR-amplified 16S rRNA genes / G. Laguerre et. al.. // Appl. Environ. Microbiol. - 1994. - Vol. 60, №1. - P. 56-63.

126. Relationship between monocaryotic growth rate and mating type in the edible basidiomycete Pleurotus ostreatus I Luis M. Larraya et. al.. // Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - Vol. 67, № 8. P. 3385-3390.

127. Rowlands, R. T. Industrial fungal genetics and strain selection / R. T. Rowlands. The filamentous fungi. - Vol. 4. London: Edward, 1983. - P . 346-372.

128. Simon, L. Specific amplification of IBS fungal ribosomal genes from vesicular-arbuscular mycorrhizal fungal communities / L. Simon, M. Lalonde, T.D. Brans // Appl. Environ. Microbiol. - 1992. - Vol. 58, № 1.-P. 291-295.

129. Tsang, L. J. Delignification of wheat straw by Pleurotus spp. Under mushroom-growing conditions / Linda J.Tsang, Ian D. Reid, Ewen C. Coxworth // Appl. Environ. Microbiol. - 1987. - Vol. 53, № 6. - P. 1304-1306.

130. Turner, E. M. Phenoloxidase activity in relation to substrate and development stage in the mushroom Agaricus bisporus I E. M. Turner // Transact, of the British mycological society. Cambridge Univ. press. - 1974. -Vol. 63, № 3 . - P . 541-547.

132. Wood, D. A. Fruiting of Agaricus bisporus changes in extracellular enzyme activities during growth and fruiting / D. A. Wood, P. W. Goode-nough // Arch, of Microbiol. - 1977. - Vol. 144, №2. - P. 161-165.