Лакказы базидиальных грибов, лакказа-медиаторные системы и возможности их использования

Морозова, Ольга Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Лакказы базидиальных грибов, лакказа-медиаторные системы и возможности их использования
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Лакказы базидиальных грибов, лакказа-медиаторные системы и возможности их использования"

На правах рукописи

Морозова Ольга Владимировна

ЛАККАЗЫ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ, ЛАККАЗА-МЕДИАТОРНЫЕ СИСТЕМЫ И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2006

Работа выполнена в лаборатории химической энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель

доктор химических наук, профессор А.И.Ярополов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Р. А. Звягильская

доктор химических наук И.Н.Курочкин

Ведущая организация;

Институт физиологически активных веществ РАН Черноголовка, Московская обл.

Защита состоится «£~» ^г^Сьйр^и 2006 г. в ^Ч часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан « Д » ¿¿¿ХД^М 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В связи с ужесточением требований к экологической безопасности химических процессов все большие масштабы приобретает использование биокаталитических технологий в промышленности. Промышленное получение биокатализаторов на основе технических ферментов является экономически выгодным. Об этом свидетельствует возрастающий объем продаж технических препаратов ферментов на мировом рынке, который в 2004 году составил почти 1,5 миллиарда долларов.

В промышленных биокаталитических процессах широко используются различные ферменты. Особый интерес представляет лакказа, которая способна катализировать реакции окисления широкого круга органических веществ молекулярным кислородом. Каталитические и электрокаталитические свойства лакказы дают возможность ее широкого использования в целлюлозно-бумажной промышленности для делигнификации бумажной пульпы, в текстильной промышленности для отбеливания тканей, для детоксикации и обесцвечивания сточных вод, для биодеградации ксенобиотиков, для создания антимикробных композиций, в пищевой и косметической промышленности, при получении древесноволокнистых плит без применения токсичных связующих, при производстве моющих средств, при разработке катодов биотопливных элементов и других областях [Durán et al., 2002; Mayer & Staples, 2002; Cuoto & Herrera, 2006]. Так, например, фирма «Novozymes» (Дания) выпускает на основе лакказы коммерческие препараты для отбеливания и обработки текстильных изделий, делигнификации бумажной пульпы и обработки корковой пробки [http://www.novozymes.com].

Интерес к практическому использованию лакказ возрос после открытия соединений «усиливающих» действия фермента, так называемых медиаторов [Bourbonnais, Paice, 1990]. Это позволило существенно расширить область их

практического применения. Таким образом, создание высокоэффективных лакка-

за-медиаторных систем (JIMC) для использования в биотехнологии является в настоящее время весьма актуальным.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в сравнении свойств лакказ, выделенных из различных базидиальных грибов, для установления сходства и различий их физико-химических характеристик, а также поиск ре-докс-медиаторов этих ферментов с целью создания эффективных ЛМС. Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Провести в одинаковых условиях сравнение основных физико-химических характеристик лакказ базидиальных грибов Trametes hirsuta, Trámeles ochracea, Coriolopsis fulvocinerea и Cerrería maxima с целью выявления наиболее стабильного, высокопотенциального и каталитически активного фермента

3. Разработать схему отбора потенциальных редокс-медиаторов лакказ

4. Найти соединения, которые наиболее полно отвечали бы требованиям, предъявляемым в настоящее время к медиаторам лакказ

5. Провести апробацию лакказа-медиаторных систем на примере делигнификации лигноцеллюлозы.

Научная новизна работы. Проведенные исследования позволили впервые сравнить в одинаковых условиях биохимические и электрокаталитические свойства лакказ, выделенных из культуральных жидкостей различных родов и видов базидиальных грибов.

Предложена схема отбора потенциальных медиаторов лакказ и экспериментальные методы их тестирования, что значительно облегчает поиск новых медиаторов фермента.

Найден новый класс медиаторов с общим названием 1-фенил-З-метил-пира-золоны-5 и показана возможность использования сульфопроизводных 1-фенил-З-метил-пиразолона-5 в процессе делигнификации лигноцеллюлозы. Практическая ценность работы. Впервые в одинаковых условиях проведено комплексное сравнительное изучение лакказ, выделенных из различных источников. Показано, что все исследованные грибные лакказы относятся к высоко редок-спотенциальным ферментам и являются высокоактивными как в гомогенных реакциях окисления субстратов-доноров, так и в гетерогенных электрохимических реакциях восстановления дикислорода. Разработана схема отбора органических соединений с целью выявления новых медиаторов лакказ. Найден новый класс соединений — 1-фенил-3-метил-пиразолоны-5, которые отвечают многим требовани-

ям, предъявляемым в настоящее время к медиаторам (усилителям действия ферментов), а именно низкая стоимость, экологическая чистота и достаточно высокая эффективность. В работе показано, что сульфопроизводные 1-фенил-З-метил-пиразолона-5 могут использоваться в качестве усилителей действия лакказ при ферментативной деградации ксенобиотиков, в частности липшноподобных веществ. Группа соединений класса 1-фенил-3-метил-пиразолон-5 весьма многочисленна, и введением того или иного заместителя можно добиться значительного улучшения медиаторных свойств конкретного соединения. Проведены лабораторные испытания ЛМС для делигнификации бумажной пульпы.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на конференции «Biocatalysis-2002».

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ, в том числе 7 статей в ведущих российских и международных научных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (sf/f наименований). Работа изложена на Й^страницах и содержит 4о рисунков и -/^таблиц.

Сокращения, принятые в тексте. JIMC — лакказа-медиаторная система; ABTS — диаммониевая соль 2,2,-азино-бис(3-этилбензотиазолин-б-сульфоновой) кислоты; ПАВА - 3-амино-(6-гидрокси)-бензойная кислота; НВТ - 1-гидроксибензотриазол; HPI - N-гидроксифталеимид; РР - 1-фенил-3-метилпиразолон-5; РРА - 1-фенил-2,3-диметил-4-аминопиразолон-5; PPA-Na - 1-фенил-3-метил-4-метиламино-пиразолон-5->1(4)-метансульфонат натрия; mSPP - 1-(3'-сульфофенил)-3-метил-пиразолон-5; pSPP — 1-(4'-сульфофенил)-3-метил-пиразолон-5; VA — вератровый спирт.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложена актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования. Первая глава содержит обзор литературы, состоящий из трех частей. В первой части рассматривается строение, свойства и каталитический механизм действия лакказ. Во второй части описаны основные усилители действия лакказ и лакказа-медиаторные системы. В третьей части рассмотрены возможности использования

лакказ и лакказа-медиаторных систем в биотехнологии.

Во второй главе представлены материалы и методы исследования. В работе использовали лакказы, выделенные из культур алы imx жидкостей базиди-альных грибов Т. hirsuta, Т. ochracea, С. fulvocinerea и С. maxima. Определение молекулярной массы лакказ проводили методом градиентного электрофореза в денатурирующих условиях. Содержание ионов меди определяли бихинолиновым методом [Broman et. al., 1962], а также методом лазерной масс-спектрометрии [Maganadze & Shutyaev, 1993]. Спектральные исследования лакказ проводили с использованием спектрофотометра Coulter DU-650 («Beckman», Германия), спек-трофлуофотометра RF-5301 PC («Shimadzu», Япония), ЭПР-спектрометра ESC-106 («Bruker», Германия). Определение потенциала Т1 центра лакказ осуществляли методом окислительно-восстановительного титрования, используя в качестве ме-диаторной пары октоцианомолибдат (IV) и (V) калия [Dutton, 1978; Xu et al., 1996b], Определение pH-оптимума и каталитических констант ферментативных реакций, катализируемых лакказами, проводили на кислородном электроде типа Кларка. Циклические вольтамперограммы записывали на анализаторе CV 50W («BAS», США) работающем в трехэлектродном режиме (рабочие электроды -стеклоуглерод и спектральный графит, электрод сравнения - хлорсеребряный электрод, вспомогательный электрод - платиновая проволока). Спектральные исследования интермедиатов, образующихся при окислении усилителей, проводили на спектрофотометре «Hitachi-557» (Япония). Для анализа продуктов окисления вератрового спирта (VA) лакказа-медиаторньши системами использовали метод гидрофобной обратнофазовой жидкостной хроматографии высокого давления. Идентификацию продуктов окисления VA проводили по времени удерживания на колонке; их количество в элюате рассчитывали интегрированием пика элюции с использованием программы "Мультихром" (Россия). В третьей главе представлены собственные результаты.

Выделение и основные физико-химические свойства лакказ

Trámeles hirsuta, Trametes ochracea, Coriolopsis fulvocinerea и Cerrena maxima

Из культуральных жидкостей базидиальных грибов Т. hirsuta, Т. ochracea, С. fulvocinerea и С. maxima были выделены в гомогенном состоянии лакказы, основные биохимические характеристики которых представлены в Таблице 1. Как видно из таблицы все изученные лакказы являются гликопротеинами, имеют оптимум pH (при использовании в качестве субстрата-донора пирокатехина) в интервале 3.5-5.2, значения их изоэлектрических точек находятся в кислой области

рН. Как и большинство описанных в литературе лакказ, эти ферменты содержат 4 иона меди на 1 молекулу белка. Необходимо отметить, что все изученные лакказы обладают высокой термостабильностью (сохраняют до 50% первоначальной активности через 52-65 часов инкубации при 50°С), что является важным условием для их использования в биотехнологических процессах.

Таблица 1. Некоторые биохимические характеристики лакказ

.Мм, кДа pi рН-оптимум* Углеводы, % -г ** Tl/2 ,4

Т. hirsuta 70 ± 2 4.2 ±0.1 3.5-4.5 12 65

Т. ochracea 64 ±2 4.7 ±0.1 3.7-4.9 10 56

С. maxima 67 ±2 3.5 ±0.1 3.5-4.5 13 52

С. fulvocinerea 65 ±2 3.5 ±0.1 3.9-5.2 32 64

При использовании в качестве субстрата-восстановителя пирокатехина Время полуинактивации при 50°С

Были определены кинетические параметры реакций, катализируемых этими лакказами для некоторых органических субстратов и ферроцианида калия (Табл. 2). Как видно из таблицы, лакказа Т. hirsuta обладала наиболее высокими значениями каталитических констант по отношению к органическим субстратам. В то же время, лакказа С. maxima показала наибольшее значение kKaI при окислении ферроцианида калия.

Таблица 2. Кинетические параметры реакций, катализируемых лакказами*

Субстрат Т. hirsuta Т. ochracea С. maxima С. fulvocinerea

^ k.YI'j с1 км, икМ ^хат^ Км. мкМ"'-с" ккатэ с1 К№ мкМ к«/ Км, mkNT'-C'1 le С1 КМ( мкМ кцат/ mkM"V ^каТ) с"1 мкМ мкМ"1-с"'

пирокатехин 390 142 2.75 80 НО 0.73 320 120 2.67 90 85 1.06

гваякол 430 63 6.83 90 90 1.00 300 160 1.88 95 70 1.36

синаповая кислота 580 24 24.17 170 11 15.45 330 24 13.75 140 21 6.67

K4Fe(CN)6 400 180 2.22 150 96 1.56 450 115 3.91 130 170 0.76

кинетические константы были рассчитаны как средние значения по пяти экспериментам

Оптимум рН для всех изученных лакказ был приблизительно одинаков и находился в интервале рН 3.5-5.0 при использовании в качестве субстрата-донора пирокатехина (Рис. 1А), а кривая зависимости активности от рН раствора имела ко-локолообразную форму. При использовании ферроцианида калия активность ферментов монотонно падала при изменении рН раствора от 2.5 до 5.5 (Рис. 1Б). Та-

ким образом, рН-профили активности всех изученных лакказ, при использовании в качестве субстратов как органического, так и неорганического соединения, не отличались от таковых для других лакказ, описанных в литературе.

Рисунок 1. Зависимость начальной скорости восстановления лакказами молекулярного кислорода от рН реакционной смеси, при использовании в качестве субстрата пирокатехина (А) и K4[Fe(CN)6] (Ь): 1 - Т. hirsuta, 2-Т. ochracea, 3 -С. fulvocinerea, 4 —С. maxima.

Условия: 0.1 М цитратно-фосфатный буфер; концентрация пирокатехина — 2мМ, K4Fe(CN)6] - 10 мМ; концентрация ферментов в реакционной смеси: (Л) 3.3-10"8М (1), 3.2-10"8М (2), 3.8'10"8М (3), 3.4-10"s М (4); (Б) 1.3-10_8М (1,2), 1.5-10"8М (3), 1.4-10"®М (4).

С точки зрения фундаментальных исследований большой интерес представляет структура лакказ и механизма катализа. Активный центр лакказ содержит 4 иона меди, которые подразделяют на три типа по их спектроскопическим характеристикам: Т1 центр — характеризующийся полосой оптического поглощения в области 600 им и слабым сверхтонким расщеплением в спектрах ЭПР; Т2 центр - не видимый на спектрах поглощения, но характеризующийся на спектрах ЭПР сверхтонким расщеплением; ТЗ центр - биядерный диамагнитный медный центр, который может быть идентифицирован на спектрах оптического поглощения по плечу в области 330 нм.

Спектры поглощения всех изученных в настоящей работе ферментов (Рис. 2) оказались типичными для «голубых» лакказ, описанных в литературе и выделенных из других базидиальных грибов. В них присутствовали сигналы меди Т1 центра (пик поглощения на 610 нм) и биядерного комплекса меди ТЗ (плечо в области 330 нм).

Спектры ЭПР, характеризующие ионы меди Т1 и Т2 центров изученных лакказ, имели сходные характеристики (Рис. 3).

s и я s

40 ■ 30 ■ 20 ■ 10 • 0 ■

3.5

5.5

6.5

Рисунок 2. Спектры оптического поглощения лакказ

1 — Т. hirsuta,

2 — Т. ochracea,

3 — С. maxima,

4 —С. fulvocinerea.

Условия-. 0.1 М фосфатный буфер (рН 6.0); длина светового пути 1 см; скорость сканирования 120 нм/мин; t = 20°С; концентрация ферментов ~ 1 мг/мл

Рисунок 3. ЭПР-спектры лакказ 1 — Т. hirsuta,

2-Т. ochracea,

3- С. maxima,

4 —С. falvocinerea.

Условия: 0.1 М фосфатный буфер (рН 6.0); температура 77"К; Х-диапазон, микроволновая мощность 20 мВ; амплитуда модуляции 0.5 мТ; концентрация ферментов ~ 1 мг/мл.

На Рис. 4 представлены спектры возбуждения (I) и излучения (II) флуоресценции исследованных лакказ, записанные при комнатной температуре. Возбуждение в области биядерного медного центра (330 нм) приводит к эмиссии при 432, 438, 436 и 443 нм для лакказ Т. hirsuta, Т. ochracea, С. fulvocinerea и С. maxima, соответственно. Необходимо отметить, что эти спектры не сильно различаются между собой и хорошо согласуются с литературными данными [Shin et al., 2000].

Рисунок 4. Спектры возбуждения (I) и излучения флуоресценции (II) лакказ

1 -Т. hirsuta,

2 -Т. ochracea,

3-С. maxima,

4-С. fulvocinerea.

Условия: 0.1 М фосфатный буфер (рН 6.0); t = 20°С;

концентрация ферментов ~ 1 мг/мл;

350 400

Н-М

Спектральные характеристики Т1, Т2 и ТЗ центров лакказ, полученные на основании данных спектрофотометрии, ЭПР-спектроскопии и флуоресценции представлены в Таблице 3.

Таблица 3. Спектральные характеристики TI, Т2 и ТЗ центров лакказ

TI (спектрофотометрия и ЭПР) Т2 (ЭПР) ТЗ (флуоресценция)

Максимум поглощения (нм) а А| (10~4 см"1) Sil АИ (10"4 см"1) Максимум испускания (нм) Максимум возбуждения (нм)

Т. hirsuta 607 2.19 95 2.26 186 418 344

Т .ochracea 608 2.20 94 2.24 194 422 315

С. maxima 607 2.18 94 2.24 193 425 322

С. fulvocinerea 607 2.18 94 2.23 210 418 303

В результате проведенных исследований были определены основные физико-химические характеристики ферментов и спектральные характеристики ионов меди, входящих в состав активного центра лакказ, выделенных из культуральных фильтратов базидиальных грибов Т. hirsuta, Т. ochracea, С. fulvocinerea и С. maxima. Показано сходство биохимических и спектральных параметров исследованных ферментов.

Определение потенциала Т1 центра лакказ.

Одной из основных характеристик лакказ является стандартный окислительно-восстановительный потенциал Т1 центра ферментов. Значения этого потенциала варьируются у различных лакказ от 430 до 790 мВ отн. НВЭ [Solomon et al., 1996; Shleev et al., 2005b]. TI центр фермента является первичным акцептором электронов, поступающих от субстратов-восстановителей. Непосредственно лакказы окисляют только те соединения, окислительно-восстановительный потенциал которых не превышает или превышает незначительно редокс-потенциал иона меди Т1 центра фермента [Xu, 1997]. Кроме того, от редокс-потенциала Т1 центра зависит эффективность катализа для большинства субстратов лакказ, что делает лакказы с высокими потенциалами Т1 центра весьма перспективными объектами для биотехнологических целей, например, для обесцвечивания бумажной пульпы, биоремедиации и деградации различных ксенобиотиков. Определение редокс потенциалов ионов меди первого типа лакказ было необходимо для выявления наиболее высокопотенциальных ферментов, которые, участвуя в реакциях окисления

субстратов, приводят к образованию высокопотенциальных интермедиатов, что весьма важно при проведении биотехнологических процессов.

В качестве примера на Рис. 5 представлены спектры поглощения растворов лакказы Т. hirsuta, записанные в процессе окислительно-восстановительного титрования. Аналогичные данные были получены при окислительно-восстановительном титровании лакказ Т. ochracea, С. fulvocinerea и С. maxima. Восстановление Т1 медного центра сопровождалось уменьшением пика поглоще-

Рисунок 5. Спектры потенциометрического титрования в анаэробных условиях Т1 центра лакказы Т. hirsuta. Вставка: Кривая титрования в полулогарифмических координатах. Ао и А - поглощение при 610 нм растворов окисленной и частично восстановленной лакказы. Условия: 0.1М фосфатный буфер, рН 6.0; 7-фермент (7 мкМ) и 2 мМ í¿\fo(CN)s 2-6 - добавление к исходному раствору K4Mo(CN)g до юэткчной концентрации 2 мМ.

500 600 700 800

X, нм

Основные электрохимические характеристики Т1 центров изученных лаккказ представлены в Таблице 4. Как видно из таблицы, тангенс угла наклона прямой титрования составляет 49, 56 и 57 мВ для лакказ Т. hirsuta, С. maxima и С. fulvocinerea, соответственно, что позволяет предположить факт одноступенчатого, одноэлектронного процесса восстановления иона меди первого типа. Это хорошо согласуется с литературными данными, полученными для лакказ из других источников.

Таблица 4. Электрохимические характеристики Т1 центра лакказ

Лакказа Потенциал Т1 центра, мВ Тангенс угла наклона кривой титрования, мВ

Т. ochracea 790 ± 10 32 ±2

Т. hirsuta 780 ± 10 49 ±2

С. maxima 750 ±5 56 ±1

С. fulvocinerea 780 ± 10 57 ±2

Примечание: потенциалы приведены относительно нормального водородного электрода

ния в области 610 нм.

В то же время тангенс утла наклона прямой титрования лакказы Т. ochracea составляет 32 мВ, что формально указывает на возможность протекания двухэлек-тронного процесса восстановления фермента. Однако, даже в случае одноэлек-тронного редокс-процесса, уменьшите угла наклона линейного участка кривой титрования может быть связано с наличием в процессе реакции стадии, не относящейся непосредственно к восстановлению иона меди.

Таким образом, все изученные лакказы относятся к высокопотенциальным ферментам и благодаря высокому редокс потенциалу Т1 центра являются высокоактивными в гомогенных реакциях окисления субстратов-доноров. Электрохимические исследования лакказ представляют интерес для понимания механизма катализа и возможности использования этих ферментов в гетерогенных биоэлектро-каталитических системах.

Биоэлектрокаталитические свойства лакказ Методами циклической вольтамперометрии исследованы прямые (безмедиа-торные) электрохимические реакции восстановления дикислорода с участием лакказ Т. hirsuta, Т. ochracea, С. fulvocinerea и С. maxima, адсорбированных на электродах из спектрального графита. В аэробных условиях для всех исследованных лакказ показана возможность прямого электронного переноса с электрода на фермент с последующим восстановлением молекулярного кислорода. На Рис. 6 представлены циклические вольтамперограммы немодифицированных и модифицированных лакказами электродов из спектрального графита в насыщенных кислородом буферных растворах.

При адсорбции на электродах все лакказы сильно уменьшали перенапряжение реакции электровосстановления молекулярного кислорода до воды. Необходимо отметить, что для лакказы С. fulvocinerea наблюдалась более низкая электрокаталитическая активность по сравнению с другими изученными ферментами, в то время как ее активность в гомогенном растворе (Табл. 2) сравнима с активностью других лакказ. Возможно, это объясняется высоким (32%) содержанием углеводов в лакказе С. fulvocinerea, что может оказывать влияние на ориентацию молекул фермента на поверхности электрода, а также затруднять перенос электрона с электрода на Т1 центр фермента.

Как видно из Рис. 6, начало электровосстановления дикислорода на электродах, модифицированных лакказами, находится в области 800 мВ, то есть существует корреляция между потенциалом Т1 центра ферментов (Табл. 4) и началом ре-

акции электровосстановления дикислорода на электроде. Таким образом, все изученные в работе лакказы могут быть использованы в качестве катализаторов для создания катода биотопливного элемента.

Рисунок 6.

Электровосстановление молекулярного кислорода на немодифицированных (1) и модифицированных (2) лакказами электродах из спектрального графита.

Условия: насыщенный кислородом 50 мМ цитратно-фосфатный буфер (рН 3.0); скорость развертки потенциала — 10 мВ/с;

стартовый потенциал — 1100 мВ

-50 150 350

750 950 1150

550 750 950 1150

Е, ыВ (отн.НВЭ)

Е, мВ (отн.НВЭ)

Принципы отбора медиаторов лакказ Первоначально медиаторами называли соединения - субстраты фермента, в результате окисления которых образовывались устойчивые высокопотенциальные продукты, способные вступать в химические неферментативные реакции с другими соединениями. При этом окисленный медиатор восстанавливался до первоначальной формы и таким образом формировался замкнутый цикл. Простейшая схема функционирования лакказа-медиаторных систем представлена на Рис. 7.

о2

н2о

Хлакказа * »

„ А

лакказаок' 4 медиатор субстрат^

Рисунок 7. Принцип функционирования ЛМС

Оптимальный редокс-медиатор должен быть хорошим субстратом лакказы, его окисленная и восстановленная формы должны быть стабильны и не должны инги-бировать ферментативную реакцию или инактивировать фермент, а процесс его редокс-превращения должен быть циклическим. Соединения, которые в литературе называют медиаторами лакказ, на самом деле ими вообще не являются или их можно отнести к медиаторам с большой натяжкой. В первую очередь это связано

с низкой стабильностью образующихся интермедиатов и, как следствие, низким числом редокс-циклов. В связи с этим в литературе появился термин «епЬапсег», то есть усилитель действия фермента.

Принимая во внимание требования к редокс-медиаторам, была предложена схема отбора и экспериментальных методов тестирования органических соединений - потенциальных медиаторов лакказ, включающая 4 стадии:

1. Отбор соединений на основе анализа структурной формулы с учетом необходимости наличия сопряженных связей и гетероциклических атомов, а также -ОН и -ЫНг групп.

2. Определение каталитических характеристик отобранных соединений в гомогенных ферментативных реакциях, катализируемых лакказой.

3. Анализ циклических вольтамперограмм растворов отобранных соединений в отсутствии и в присутствии модельных соединений лигнина.

4. Прямой эксперимент по анализу продуктов окисления модельного соединения лигнина системой медиатор/лакказа.

Первичный отбор соединений на основе их структурных формул Реакционная способность ароматических и гетероциклических соединений часто зависит от природы и положения заместителей. Влияние заместителей на окислите этих соединений определяется как электронными эффектами, так и стериче-скими факторами. Наша задача состояла в том, чтобы выбрать соединения для использования в ЛМС с наилучшими каталитическими параметрами в гомогенной ферментативной реакции и оптимальными характеристиками электрохимической реакции на электроде (значение редокс потенциала, обратимость реакции). При первичном отборе усилителей необходимо учитывать, что введение в структуру соединения тех или иных заместителей должно приводить к увеличению стабильности образующихся в результате реакции радикалов. Окисление соединений, в струюуре которых присутствует гидроксильная группа, приводит к образованию нестабильных фенокси-радикалов, способных к реакции конденсации, а наличие аминогруппы вызывает димеризацию/полимеризацию промежуточных форм соединения. Электрон-донорные заместители (алкильная, фенильная и аминогруппы), увеличивая скорость окисления соединения и обеспечивая при этом стабильность образующихся радикалов, уменьшают окислительно-восстановительный потенциал соединения. Электрон-акцепторные группы (например, карбоксильная или сульфо- группы), увеличивают окислительно-восстановительный потенциал

соединения [Хи й а1., 2001] и улучшают его растворимость в водных растворах. При отборе соединений в качестве усилителей действия лакказ необходимо принимать во внимание, что их редокс-потенциал должен быть выше 450 мВ [ВоигЬошшз е1 а1., 2000], в противном случае они не могут принимать участие в окислении нефенольных подструктур лигнина.

В силу возможного масштабного коммерческого использования медиаторов, эти соединения должны быть доступны и иметь при этом низкую стоимость. Поиск нетоксичных гетероциклических соединений показал, что одним из наиболее перспективных классов органических соединений, которые могли бы использоваться в качестве медиаторов лакказ, являются соединения с общим названием 1-фенил-3-метил-пиразолоны-5, которые производятся в промышленных масштабах и имеют низкую себестоимость. Одним из наиболее известных соединений данного класса является метамизол натрия или анальгин (РРА-Кта), который используется в медицинской практике в качестве обезболивающего средства.

1-Фенил-3-метил-пиразолоны-5 (в дальнейшем именуемые фенилметилпиразо-лоны) относятся к гетероциклическим соединениям, содержащим в своем составе два заместителя электрон-донорной природы - метальную и фенильную группы, и присутствуют в растворе в виде двух таутомерных форм (Рис. 8).

НзС

Было исследовано около двадцати соединений различной структуры, в том числе гетероциклических, >N-OH соединений и производных бензойной кислоты. Исследования гомогенных реакций с участием лакказы Т. hirsuta позволили отобрать соединения, которые могут являться усилителями действия фермента. Среди этих соединений выраженные субстратные свойства по отношению к лакказе обнаружены у 1-фенил-3-метилпиразолона-5 (РР), его сульфо- (mSPP и pSPP) и ами-нопроизводных (РРА и PPA-Na), а также у N-гидроксифталеимида (HPI) и 3-амино-(6-гидрокси)-бензойной кислоты (HABA). Структурные формулы этих соединений представлены на Рис. 9.

Рисунок 8. Таутомерные превращения фенилметилпиразолонов

Субстратная специфичность

Рисунок 9.

Структурные формулы органических веществ — потенциальных -медиаторов лакказ.

HPI HABA

N-гвдроксифталеимвд 3-амино-(6-гидрокси)-бензойная кислота

Исследование зависимостей начальной скорости гомогенных ферментативных реакций от концентрации исследуемых соединений показало, что кинетика реакций описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. Для оценки эффективности взаимодействия лакказы с этими соединениями было проведено сравнение с одним из субстратов лакказ - гидрохиноном. Результаты представлены в Таблице 4.

Как видно из таблицы, производные фенилметилпиразолона с сульфогруппой в фенильном кольце (pSPP и mSPP), либо аминогруппой в гетероцикле (РРА), являются субстратами, сравнимыми по своим каталитическим константам с гидрохиноном. Эффективность процесса ферментативного окисления РР намного ниже, что, возможно, связано с его гидрофобностью.

Введете в гетероцикл фенилметилпиразолона электрон-донорных групп (аминогруппы в положение 4 и метальной группы в положение 2) увеличивает значение ккаж/Км в случае РРА более чем в 18 раз. Однако, это значение в несколько раз меньше, чем для сульфо-производных фенилметилпиразолона. В случае PPA-Na, введение заместителей (метальной и метан-сульфоновой групп) в аминогруппу мало отражается на скорости ферментативной реакции, но значение Км увеличива-

so^

РР pSPP mSPP

1-фешм-З- 1-(4'-сульфофенил)- НЗ'-сульфофешш)-метилпиразолон-5 З-метил-пиразолон-5 З-метил-пиразолон-5

РРА PPA-Na

1-фснил-2,3-диметид- 1-фенил-3-метил-4-метиламино-4-аминошфазолон-5 пиразолон-5-М(4)-метансульфонат натрия

ется более чем в 10 раз. Возможно, более слабое взаимодействие лакказы с РРА-Ыа объясняется проявлением стерического фактора.

Таблица 4. Кинетические и электрохимические параметры субстратов лакказ

Соединение к "с"1 Км, мМ (киж/Ки)-1(Г4,М-1с1 Е1/2, мВ ДМдиф"*

н9 52.0 0.3 17.3 -20 —

рр- 9.7 2.1 0.46 430 0,2

тБРР 51.5 0.22 23.4 660 1.0

рБРР 43.9 0.29 15.0 570 0,8

РРА 35.1 0.41 8.66 410 550 0,7

РРА-Ыа 36.5 5.0 0.73 490 830 —

НРГ 3.6 6.0 0.06 870 2,5

НАВА 43.4 0.28 15.5 390 —

Е1/2 - потенциал полуволны окисления субстрата (скорость развертки потенциала 5 мВ/с); 1диф — анодный ток окисления медиатора;

Д1 - прирост анодного тока при окислении медиатора (0.2 мМ) в присутствии УА (2 мМ). Примечания:

* Рабочие растворы содержали 2% этилового спирта к««« определяли по уменьшению концентрации кислорода без учета стехиометрии реакции Определение Д1 и 1диф проводили при потенциале 1000 мВ

Взаимодействие лакказы с НР1 характеризуется низким сродством этого субстрата к ферменту и низкой скоростью реакции, а ПАВА является субстратом лакказы, сравнимым по своим кинетическим параметрам с гидрохиноном.

Электрохимические исследования промежуточных соединений, образующихся при окислении медиаторов

Были проведены вольтамперометрические исследования отобранных соединений. В качестве примера на Рис. 10 представлены циклические вольтамперограм-мы, записанные в растворах шБРР и НР1.

Рисунок 10. Циклические вольтамперные кривые

шБРР и НР1 Условия: 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, рН 5.0; концентрация медиаторов 0.2мМ; скорость развертки потенциала 5 мВ/с (/), 25 мВ/с (2), 100 мВ/с (.?), 200 мВ/с (4).

Е, мВ (отн. А^/А^Ы)

На вольтамперных кривых фенилмегилпиразолона и его производных наблюдались ярко выраженные токи окисления этих соединений в области потенциалов 450-660 мВ. Для РР, РРА и pSPP реакции окисления были необратимы, что подтверждалось отсутствием реакции электровосстановления на катодной ветви циклических вольтамперограмм. На вольтамперных кривых, записанных в растворах mSPP (Рис. 10) и PPA-Na, проявлялись незначительные катодные токи, которые были в 4-6 раз меньше анодных. По-видимому, необратимость электродных реакций для фенилметилпиразолона и его производных связана с неустойчивостью продуктов окисления и включением их в химические реакции до того, как они успевали восстановиться на электроде.

В отличие от производных фенилметилпиразолона, при высоких скоростях развертки потенциала система с HPI была квази-обраттшой, что подтверждалось наличием на вольтамперограммах катодного пика (Рис.10). Потенциал средней точки между катодным и анодным пиками равен 870 мВ и его условно можно принять за редокс потенциал этой пары. По-видимому, при низких скоростях развертки потенциала продукт, образующийся при окислении, был недостаточно стабилен и не успевал восстановиться на электроде. Таким промежуточным продуктом может быть >NO радикал, как это было показано для таких медиаторов лакказ как НВТ, TEMPO [Fabbrini et al., 2002; Cantarella et al., 2003].

Образование описанных выше интермедиатов исследуемых соединений происходило за счет их неферментативного окисления на электродах. Зависимость максимального анодного тока от квадратного корня из скорости развертки потенциала имела линейный характер, что свидетельствовало о том, что для всех исследованных соединений электродный процесс протекал в диффузионно-контролируемом режиме.

Потенциалы полувысоты анодного пика для всех изученных производных фенилметилпиразолона, а также для HPI и HABA, представлены в Таблице 4. Как и следовало ожидать, потенциал полувысоты анодного пика зависел от природы заместителя в структуре фенилметилпиразолона. Он увеличивался при введении электрон-акцепторной сульфогруппы в фенильное кольцо (mSPP и pSPP) и уменьшался при введении в гетероцикл электрон-донорной аминогруппы (РРА).

Спектральные исследования интермедиатов, образующихся при ферментативном окислении усилителей действия лакказ Были проведены дополнительные спектральные исследования продуктов гомогенного окисления двух соединений класса фенилметилпиразолонов - PPA-Na и mSPP в присутствии лакказы Т. hirsuta.

В случае PPA-Na спектры поглощения интермедиатов, образующихся в результате ферментативного окисления, зависели от соотношения концентраций медиатора и фермента в растворе (Рис. 11), что указывало на возможное образование нескольких промежуточных продуктов окисления медиатора.

Рисунок П. Изменение во времени

спектров поглощения продуктов реакции, образующихся в процессе ферментативного окисления PPA-Na,

с участием лакказы Т. hirsuta при различных концентрациях медиатора и фермента 1- исходный спектр; 2 - 1 мин; 3-10 мин; 4 - 30 мин; 5-60 мин. Условия: 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, pH 5.0.

Основываясь на электрохимических данных по гетерогенному окислению PPA-Na, можно предположить существование как минимум трех основных промежуточных продуктов ферментативного окисления данного субстрата (с потенциалами максимумов анодных пиков 290, 570, и 770 мВ).

При ферментативном окислении mSPP образовывалось, по-видимому, два ин-термедиата (Рис. 12). При этом продукт с полосой поглощения при 340 нм являлся более высоко редокспотенциальным, так как его формирование протекало на более поздней стадии ферментативной реакции. Можно предположить образование двух основных интермедиатов mSPP со значениями потенциалов 660 и 850 мВ, соответствующими максимумам поглощения при 270 и 340 нм, соответственно. При этом образование первого продукта являлось быстрым процессом, в то время как образование второго продукта - процесс более медленный. Похожее двухступенчатое поведете при ферментативном окислении было показано для

350 450 550 650 750 850

НМ

ABTS, что позволяет предположить сходство механизмов ферментативного окисления обоих субстратов лакказы [Bourbonnais & Paice, 1990; Solís-Oba et al., 2005].

/-, HM

Рисунок 12. Изменение во времени

спектров поглощения продуктов реакции, образующихся в процессе ферментативного окисления mSPP с участием лакказы Т. hirsuta: 1 — исходный спектр; 2-10 мин; 3-30 мин. Условия: 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, pH 5.0.

Электрохимическое окисление вератрового спирта в присутствии

медиаторов

Методом циклической вольтамперометрии было изучено взаимодействие отобранных соединений с модельным соединением лигнина — вератровым спиртом (УА). Этот метод позволяет исследовать не только электродные процессы, но и сопряженные с ними химические реакции.

В качестве примера на Рис. 13 представлены циклические вольтамперограммы, записанные в растворах вератрового спирта, медиаторов (т5РР, РРА-Иа, НР1), а также смеси УА-медиатор. Необходимо отметить, что до потенциала 1000 мВ ве-ратровый спирт электрохимически не активен.

Е, мВ (отн. Ag/AgCl)

Рисунок 13. Циклические вольтамперные кривые, записанные в растворах (7) медиатора (0.2 мМ); (2) вератрового спирта (2 мМ) и (3) смеси медиатора

и вератрового спирта в тех же концентрациях Условия: 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, рН 5.0; скорость развертки потенциала 5 ыВ/с

В присутствии т5РР (Рис. 13), а также р8РР и РРА, окисление вератрового спирта происходило с меньшим перенапряжением, чем при прямой электродной

реакции: На анодной ветви кривой наблюдалось увеличение тока окисления в области потенциала 1000 мВ. В то же время, добавление к раствору РРА-Ыа верат-рового спирта не приводило к увеличению токов окисления (Рис. 13).

В присутствии вератрового спирта в растворах гидроксифталеимида наблюдалось значительное увеличение анодного тока в области потенциалов окисления НР1 и полное исчезновение тока восстановления на катодной ветви кривой (Рис. 13). Отсутствие катодного тока можно объяснить включением интермедиата электродного окисления НР1 в процесс химического окисления вератрового спирта вблизи поверхности электрода. Химически восстановленный интермедиат вновь окислялся на электроде, давая увеличение анодного тока. При потенциале 910 мВ и скорости развертки потенциала 5 мВ/с анодный ток в присутствии вератрового спирта увеличивался в 2.5 раза по сравнению с током в отсутствии УА (Рис. 13), что указывало на регенерацию восстановленной формы медиатора в результате каталитического окисления вератрового спирта и на повторное окисление НР1 на электроде.

До потенциала 1000 мВ не наблюдалось ускорения электроокисления вератрового спирта в присутствии низкопотенциального продукта электродного окисления НАВА, редокс потенциал которого равен 390 мВ.

В Таблице 4 представлены соотношения прироста анодного тока в растворе, содержащем вератровый спирт и медиатор, к диффузионному току окисления самого медиатора при потенциале 1000 мВ. Как видно из таблицы, эффективность электрокаталитического окисления вератрового спирта возрастала с увеличением потенциала полуволны окисления усилителя. При взаимодействии с вератровым спиртом эффективными являлись соединения, имеющие потенциал полувысоты волны окисления выше 500 мВ.

Окисление вератрового спирта в системелакказафедокс-усилитель фермента Для выяснения эффективности исследуемых медиаторов при деградации модельного соединения лигнина — вератрового спирта, были проведены прямые эксперименты по окислению УА в гомогенном растворе системой лакказа/медиатор. Продукты окисления разделяли методом ВЭЖХ. Идентификацию продуктов окисления УА проводили по времени их удерживания на колонке. В качестве маркеров использовали вератровый спирт, вератровый альдегид и вератровую кислоту, количество которых в элюате рассчитывали интегрированием пика элюции с использованием программы "Мультихром" (Россия). Для оценки эффективности

аналогичный эксперимент проводили с использованием ABTS в качестве медиатора. Количественные результаты экспериментов по окислению вератрового спирта в системе лакказа/медиатор представлены в Таблице 5.

Таблица 5. Окисление вератрового спирта системами лакказа/медиатор

Состав реакционной смеси Степень конверсии VA после 48 часов инкубации, (%)

mSPP + лакказа + VA 35,0

pSPP + лакказа + VA 30,0

PPA-Na + лакказа + VA 3,5

HPI + лакказа + VA 73,0

ABTS + лакказа + VA 75,7

mSPP + VA 3,5

pSPP + VA 3,0

PPA-Na + VA 0,4

HPI + VA 1,3

ABTS+ VA 1,0

Лакказа + VA 1,4

Примечание: значения были рассчитаны как среднее по трем измерениям

При использовании системы лакказа/HPI была достигнута высокая степень превращения вератрового спирта, сравнимая со степенью окисления VA в присутствии ABTS. Взаимодействие лакказы с гидроксифталеимидом характеризуется низкой скоростью реакции (Табл. 4). Однако, как показали электрохимические исследования, образующийся при окислении катион-радикал способен с довольно высокой скоростью окислять вератровый спирт. Благодаря этому общая эффективность процесса деградации вератрового спирта системой лакказа/HPI высока и составляет 70% превращения VA за 48 часов реакции.

Иначе обстоит дело с системами лакказа/производные фенилметилпиразолона. Как показали кинетические исследования (Табл. 4), лакказа с высокой скоростью катализирует окисление сульфопроизводных данного класса. Электрохимическими экспериментами было показано, что продукты окисления этих соединений нестабильны. Однако потенциал и время жизни продуктов окисления оказываются достаточными для того, чтобы окислить вератровый спирт. Благодаря высокой скорости ферментативного окисления этих производных общая эффективность окисления VA системой лакказа/pSPP или mSPP достаточно высока, в результате

чего процент превращения спирта достигает, соответственно, 30 и 35% за 48 часов

реакции. Более низкий по сравнению с ABTS процент деградации спирта объясняется, по-видимому, слабой обратимостью процесса окисления этих производных фенилметилпиразолона.

Как и следовало ожидать на основании электрохимических исследований, в системе лакказа/РРА-Ка скорость окисления вератрового спирта оказалась значительно ниже, чем при использовании сульфопроизводных фенилметилпиразолона. В то же время, при использовании PPA-Na окисление вератрового спирта идет до соответствующей кислоты, в то время как большинство известных к настоящему времени медиаторов окисляют вератровый спирт до альдегида [Bourbonnais, Paice, 1990]. По-видимому, несмотря на низкую скорость реакции окисления вератрового спирта, высоко потенциальные интермедиаты PPA-Na, образующиеся в присутствии лакказы, способны к дальнейшему окислению вератрового альдегида до вератровой кислоты. Это хорошо согласуется с электрохимическими и спектральными результатами, полученными для PPA-Na.

Контрольные эксперименты показали, что в отсутствии лакказы исследуемые нами медиаторы практически не способны к окислению вератрового спирта, а лак-каза в отсутствии медиаторов окисляет менее 2% VA.

Таким образом, производные 1-фенил-3-метил-пиразолона-5 могут использоваться в качестве усилителей действия лакказы.

Использование лакказа-медиаторных систем для делигнификации

В рамках выполнения гранта ШСО-Сорегшсш совместно с Центральным научно-исследовательским институтом бумаги (ОАО «ЦНИИБ») были проведены прямые эксперименты по делигнификации лигноцеллюлозы лакказа-медиаторными системами. Для этой цели была разработана лабораторная установка, схема которой представлена на Рис. 14.

лигноцеллюлозы

□

Рисунок 14. Пилотная установка для делигнификации

1 - сосуд для делигнификации;

2 - термостатирующий сосуд;

3 — компрессоры; 4 - мешалка.

Для делигнификации использовали сульфатную небеленую хвойную целлюлозу Марийского Целлюлозно-бумажного комбината, в качестве ферментного препарата - фильтрат культуралыгай жидкости базидиального гриба Т. hirsuta, а в качестве медиаторов испытывали PPA-Na, mSPP, HPI и для сравнения НВТ. В образцах определяли содержание остаточного лигнина (число Каппа). Результаты испытаний представлены в Таблице 6.

Таблица 6. Делигнификация лигноцеллюлозы системами лакказа-медиатор

Состав смеси Число Каппа Делигнификация, %

Лигноцеллюлоза 20 -

Лигноцеллюлоза + лакказа 20 0

Лигноцеллюлоза + лакказа + PPA-Na 19.6 2.0

Лигноцеллюлоза + лакказа + mSPP 18.3 8.5

Лигноцеллюлоза + лакказа + HPI 17.9 10.5

Лигноцеллюлоза + лакказа + НВТ 17.6 12.0

Лигноцеллюлоза * Лигноцеллюлоза + лакказа + НВТ* 31 26.1 15.8

* По данным Cheng et al., 2003а

Как видно из таблицы, хотя производные фенилметилпиразолона показали более низкие результаты по сравнению с известным медиатором лакказ НВТ, они могут использоваться в качестве усилителей действия фермента для деградации лигниноподобных веществ. Коммерческая стоимость производных этого класса соединений на два-три порядка ниже стоимости ABTS, НВТ и HPI. Учитывая, что все органические усилители действия лакказ расходуются в процессе ферментативной реакции, коммерческая стоимость препаратов на их основе имеет большое значение при разработке новых биокаталитических технологий. Необходимо отметить, что группа соединений класса 1-фенил-3-метил-пиразолон-5 весьма многочисленна, и включением того или иного заместителя можно добиться значительного улучшения медиаторных свойств конкретного соединения.

выводы

1. Проведено комплексное сравнительное изучение в одинаковых условиях биохимических и спектральных характеристик лакказ, выделенных из культураль-ных жидкостей базидиальных грибов различных родов и видов - Т. hirsuta, Т. ochracea, С. fulvocinerea и С. maxima. Показано, что все изученные лакказы имеют сходные физико-химические характеристики, а также являются термостабильными и высокоактивными ферментами.

2. Определены редокс потенциалы ионов меди Т1 центров изученных лакказ. Показано, что все лакказы относятся к высокопотенциальным ферментам и способны катализировать окисление ряда органических соединений с образованием высокопотенциальных интермедиатов.

3. На графитовых электродах, модифицированных лакказами Т. hirsuta, Т. ochracea, С. fulvocinerea и С. maxima в атмосфере дикислорода устанавливается высокий окислительно-восстановительный потенциал, что позволяет использовать эти ферменты в качестве биокатализаторов при создании катода биотопливного элемента. Показано, что существует корреляция между потенциалом Т1 центра ферментов и началом реакции электровосстановления дикислорода на электроде.

4. Предложена схема отбора органических соединений — потенциальных медиаторов лакказ, которая значительно облегчает поиск новых медиаторов фермента, включающая 4 стадии: отбор соединений на основе их структурной формулы; определение каталитических характеристик этих соединений в гомогенных реакциях, катализируемых лакказой; анализ циклических вольтамперограмм растворов отобранных соединений в отсутствии и в присутствии модельных соединений лигнина; прямой эксперимент по анализу продуктов окисления модельного соединения системой лакказа/медиатор.

5. Найден новый класс медиаторов с общим названием 1-фенил-З-метил-пиразолоны-5. Показано, что сульфо- и аминопроизводные этого класса соединений могут использоваться в качестве усилителей действия лакказ для деградации нефенольных подструктур лигнина. Показана возможность использования этих производных 1 -фенил-З -метил-пиразолона-5 для делигнификации лиг-ноцеллюлозы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. G.P. Shumakovich, S.V. Shleev, O.V. Morozova, P.S. Khohlov, I.G. Gazaryan, A.I. Yaropolov «Electrochemistry and kinetics of fungal laccase mediators» Bioelec-trochemistry (2006) V. 69, № 1, P. 16-24

2. S. Shleev, A. Jarosz-Wilkolazka, A. Khalunina, O. Morozova, A. Yaropolov, T. Ruzgas, L. Gorton «Direct electron transfer reactions of laccases from different origins on carbon electrodes» Bioelectrochemistry (2005) V.67, № 1, P. 115-124.

3. Shleev S.V., Morozova O.V., Nikitina O.V., Gorshina E.S., Rusinova T.V., Serez-henkov V.A., Burbaev D.S., Gazaiyan I.G., Yaropolov A.I. «Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes». Biochimic (2004) V. 86, № 9-10, P. 693-703.

4. C.B. Шлеев, Ир Гвон Хан, О.В. Морозова, Ю.М. Мажуго, А.С. Халунина, А.И. -Ярополов. «Фенил-пиразолоны — новый класс редокс-медиаторов оксидоредук-таз для деградации ксенобиотиков». Прикладная биохимия и микробиология. (2004) Т. 40, № 2, С.165-172.

5. Shleev S.V., Gvon Khan I., Gazaryan I.G., Morozova O.V., Yaropolov A.I. «Novel laccase redox mediators. Spectral, electrochemical, and kinetic properties». Applied Biochemistry and Biotechnology (2003) V. Ill, №3, P. 167-183

6. Шлеев C.B., Газарян И.Г., Горшина E.C., Кузнецов Б.А., Сереженков В.А.. Бур-баев Д.Ш., Морозова О.В., и -Ярополов А.И.. «Спектральное и электрохимическое изучение активных сайтов лакказ базидиомицетов». Вестник Московского Университета (2003), Т. 44, № 1, С. 35-39.

7. О. Koroljova-Skorobogat'ko, Е. Stepanova, V. Gavrilova, О. Morozova, N. Lubi-mova, A. Dzchafarova, A. Yaropolov, A. Makower. «Purification and characterization of the constitutive form of laccase from the basidiomycete Coriolus hirsutus and effect of inducers on laccase synthesis». Biotechnology and Applied Biochemistry (1998) V. 28, № 1, P. 47-54.

8. Shleev S.V., Gazaiyan E.A., Gorshina E.S., Kuznetsov B.A., Serezhenkov V.A., Burbayev D.Sh., Morozova O.V. and Yaropolov A.I. «Spectral and electrochemical study of active sites laccases from basidiomycetes». Abstracts of International Conference «Biocatalysis-2002», June 22-27, 2002, Moscow, Russian Federation, P.133-134.

Подписано в печать 30.10.2006

Формат 60x90/16

Объём 1,5 пл.

Тираж 100 экз.

Заказ № 30100622

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912У772801001

Адрес: 117292, г. Москва, ул. Дмитрия Ульянова, д. 8, кор. 2.

Тел. 740-76-47,125-22-73.

http://www.univerprint.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Морозова, Ольга Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Ctpolhhl, свойства и каталитический механизм действия лакказ.

1.1.2. Локализация в клетке.

1.1.3. Биохимические свойства лакказ.

1.1.4. Строение активного центра лакказ.

1.1.5. Каталитические свойства лакказ и механизм катализа.

1.1.6. Факторы, определяющие окислительно-восстановительный потенциал

Т1-центра лакказ.

1.2. электрокаталитичьскии свойства лакказ.

1.3. усилитьли дьиствия лакказ и лакказа-медиаторные системы.

1.4. возможности использования лакказ и лакказа-медиаторных систем в ьиотгхнологии.

1.4.1. Использование лакказа-медиаторных систем в целлюлозно-бумажной промышленности.

1.4.2.Использование лакказ и лакказа-медиаторных систем в текстильной промышленности.

1.4.3. Возможности использования лакказ в пищевой промышленности.

1.4.4. Использование лакказы в источниках тока.

1.4.5. Лакказа в аналитической химии.

1.4.6. Лакказа и окружающая среда.

1.4.7. Другие области возможного использования лакказ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и объькты исследования.

2.1.1. Штаммы грибов и ферменты.

2.1.2. Реактивы.

2.2. Выделение и очистка ферментов.

2.2.1. Культивирование штаммов.

2.2.2. Получение гомогенных препаратов ферментов.

2.2.3. Определение концентрации белка.

2.3. Опрьделрние биохимических характеристик ферментов.

2.3.1. Определение молекулярной массы и изоэлектрической точки.

2.3.2. Определение содержания ионов меди.

2.3.3. Определение состава углеводной части лакказ.

2.3.4. Спектральные исследования лакказ.

2.3.5. Исследование рН зависимости реакций и кинетические исследования.

2.3.6. Термостабильность ферментов.

2.4. Электрохимические исследования ферментов.

2.4.1. Определение потенциала Т1 центра лакказ.

2.4.2. Циклическая вольтамперометрия.

2.4.3. Подготовка и модификация графитовых электродов.

2.5. Исследования медиаторов лакказ.

2.5.1. Стационарные кинетические измерения.

2.5.2. Вольтамперометрические исследования.

2.5.3. Спектральные исследования.

2.5.4. ВЭЖХ исследования.

2.5.5. Делигнификация лигноцеллюлозы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выделение и основные физико-химические свойства лакказ.

Trametes hirsuta, Trametes ochracea, Coriolopsis fulvocinerea и Cerrena maxima.

3.1.1. Получение гомогенных препаратов лакказ.

3.1.2. Основные биохимические, спектральные и кинетические свойства лакказ.

3.2. Электрохимические исследования лакказ.

3.2.1. Определение редокс потенциала Т1 центра лакказ.

3.2.2. Биоэлектрокаталитические свойства лакказ.

3.3. Медиаторы - усилители действия лакказ.

3.3.1. Принципы отбора медиаторов лакказ.

3.3.2. Первичный отбор соединений на основе их структурных формул.

3.3.3. Субстратная специфичность.

3.3.4. Электрохимические исследования промежуточных соединений, образующихся при окислении медиаторов.

3.3.5. Спектральные исследования интермедиатов, образующихся при ферментативном окислении усилителей действия лакказ.

3.4.1. Электрохимическое окисление вератрового спирта в присутствии медиаторов.

3.4.2. Окисление вератрового спирта в системе лакказа/редокс-усилитель фермента

3.4.3. Использование лакказа-медиаторных систем для делигнификации лигноцеллюлозы.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Лакказы базидиальных грибов, лакказа-медиаторные системы и возможности их использования"

В последнее время все большие масштабы приобретает использование биокаталитических технологий в промышленности, что, возможно, связано с экологической безопасностью производства на их основе [Call and Mucke, 1997; Kruus, 2000; Mayer & Staples, 2002; Couto & Herrera, 2006]. Промышленное получение биокатализаторов на основе технических ферментов является экономически выгодным. Об этом свидетельствует возрастающий объем продаж технических препаратов ферментов на мировом рынке, который в 2004 году составил почти 1,5 миллиарда долларов. Ферментные препараты находят широкое применение в промышленности - в качестве компонентов моющих средств, для обработки текстильных изделий, в производстве первичной и вторичной целлюлозы, в пищевой промышленности, в сельском хозяйстве для предобработки кормов, а также в аналитической химии.

В настоящее время в промышленных биокаталитических процессах широко используются различные ферменты, такие как протеазы, липазы, ксиланазы, гидролазы, оксидоредуктазы и др. Среди оксидоредуктаз особое место занимает лакказа, обладающая широкой субстратной специфичностью и высокой удельной активностью. Каталитические и электрокаталитические свойства лакказы дают возможность ее широкого использования в целлюлозно-бумажной промышленности для делигнификация бумажной пульпы [Cheng et al., 2003а; Peder-sen et al., 2001; Lund & Felby, 2003; Jetten et al., 2004], в текстильной промышленности для отбеливания тканей [Barfoed et al., 2004; Damkhus et al., 2003], в пищевой [Huang et al., 2001; Si, 2001] и косметической промышленностях [Onuki et al., 2000; Aaslyng ye al., 2002; Lang & Cotteret, 2006], для детоксикации и обесцвечивания сточных вод [Jonsson et al., 1998; Michizoe et al., 2005], в органическом синтезе [Echido et al., 2001; Karamyshev et al., 2003], для биодеградация ксенобиотиков [Johannes et al., 1996; Shintaro et al., 2001], для создания антимикробных композиций [Johansen et al., 2003], при получении древесноволокнистых плит, древесных блоков и картона без применения токсичных связующих [Боло-бова и др., 2002; Viikari et al., 2001], при производстве моющих средств [Boutique et al., 2004; Gardner et al., 2006], при разработке катодов биотопливных элементов [Heller et al., 2003, 2006] и других областях. Так, например, фирма «Novozymes» (Дания) выпускает на основе лакказы коммерческие препараты предназначены для отбеливания и обработки текстильных изделий, делигнификации бумажной пульпы и обработки корковой пробки [http://www.novozymes.com].

Помимо использования лакказ в различных биотехнологических процессах этот фермент представляет большой интерес с точки зрения фундаментальных исследований его структуры и механизма катализа. Это обусловлено строением активного центра лакказ, в который входят четыре иона меди трех различных типов, координированное взаимодействие которых в процессе каталитического акта одноэлектронного окисления доноров электронов или водорода, позволяет осуществлять восстановление молекулярного кислорода непосредственно до воды, минуя стадию образования пероксида водорода. Большой интерес как в фундаментальном, так и прикладном плане, представляет субстратная специфичность лакказ, способных окислять широкий круг органических (в первую очередь фенольных) и неорганических соединений. Окисление органических соединений протекает по свободно-радикальному механизму, который в настоящее время до конца не изучен. Кроме того, лакказа является одним из важнейших компонентов лигнолитического комплекса дереворазрушающих грибов белой гнили, осуществляющих разложение (а в некоторых случаях и синтез) одного из наиболее распространенных природных полимеров - лигнина, и роль лакказы в этих процессах до конца неизвестна.

Интерес к практическому использованию лакказ возрос в середине 90-х годов XX века, после открытия медиаторов - соединений, «усиливающих» действия лакказ [Bourbonnais, Paice, 1990], что позволило существенно расширить область их практического применения. Медиаторы лакказ представляют собой субстраты этих ферментов, в процессе окисления которых образуются высоко потенциальные и химически активные продукты. Последние могут вступать в реакцию с соединениями, которые не подвергаются окислению одними лакказа-ми. Кроме того, в процессе окисления органических субстратов образуются свободные радикалы, которые могут модифицировать другие соединения. Это позволяет существенно расширить область использования лакказ.

Таким образом, создание высокоэффективных лакказа-медиаторных систем для использования в биотехнологии является в настоящее время весьма актуальным. Для этого необходимо изучить физико-химические характеристики лакказ из различных базидиальных грибов с целью выбора наиболее высокопотенциальных ферментов для использования в различных биотехнологических процессах, разработать методологию отбора и исследования потенциальных редокс-медиаторов лакказ и провести апробацию лакказа-медиаторных систем на реальных объектах.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Морозова, Ольга Владимировна

выводы

1. Проведено комплексное сравнительное изучение в одинаковых условиях биохимических и спектральных характеристик лакказ, выделенных из куль-туральных жидкостей базидиальных грибов различных родов и видов -Т. hirsuta, Т. ochracea, С. fulvocinerea и С. maxima. Показано, что все изученные лакказы имеют сходные физико-химические характеристики, а также являются термостабильными и высокоактивными ферментами.

4. Предложена схема отбора органических соединений - потенциальных медиаторов лакказ, которая значительно облегчает поиск новых медиаторов фермента, включающая 4 стадии: отбор соединений на основе их структурной формулы; определение каталитических характеристик этих соединений в гомогенных реакциях, катализируемых лакказой; анализ циклических вольтамперограмм растворов отобранных соединений в отсутствии и в присутствии модельных соединений лигнина; прямой эксперимент по анализу продуктов окисления модельного соединения системой лакказа/медиатор.

5. Найден новый класс медиаторов с общим названием 1-фенил-З-метил-пиразолоны-5. Показано, что сульфо- и аминопроизводные этого класса соединений могут использоваться в качестве усилителей действия лакказ для деградации нефенольных подструктур лигнина. Показана возможность использования этих производных 1-фенил-3-метил-пиразолона-5 для делигни-фикации лигноцеллюлозы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Морозова, Ольга Владимировна, Москва

1. Березин И.В., Богдановская В.А., Варфоломеев С.Д., Тарасевич М.Р., Ярополов А.И., «Биоэлектрокатализ. Равновесный кислородный потенциал в присутствии лакказы» Доклады АН СССР 1978. Т. 240, № 3, С. 615617

2. Богдановская В.А., Бурштейн Р.Х., Тарасевич М.Р. «Влияние состоянияповерхности платинового электрода на скорость электровосстановления кислорода» Электрохимия 1972. Т. 8, № 8, С. 1206-1209

3. Болобова А.В., Аскадский А.А., Кондращенко В.И., Рабинович МЛ. «Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Кн. II: Ферменты, модели, процессы» М.: Наука, 2002,343с.

4. Герцог К., Густав К., Штреле И., «Руководство по нерганическому синтезу» М.: Мир, 1985,386с.

5. Карякин А.А., Ярополов А.И., Зорин И.А., Гоготов И.Н., Варфоломеев

6. С.Д. «Кинетика и механизм окисления водорода гидрогеназой Thiocapsa roseosersicina» Биохимия 1984. Т. 49, № 4, С. 611-621

7. Королева О.В., Явметдинов И.С., Шлеев С.В., Степанова Е.В., Гаврилова

8. В.П. «Выделение и изучение некоторых свойств лакказы из базидиаль-ного гриба Cerrena maxima» Биохимия 2001. Т. 66, Вып. 6, С. 762-767

9. Леонтьевский А.А., Мясоедова Н.М., Баскунов Б.П., Позднякова Н.Н., Варес Т., Калккинен Н., Хатакка А.И., Головлева Л.А. «Реакции голубых и желтых лакказ с модельными соединениями лигнина» Биохимия 1999. Т. 64, № 10, С. 1362-1369.

10. Леонтьевский А.А. «Лигниназы базидиомицетов» Дисс.докт. биол. наук,

11. Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН, 2002,266с.

12. Никитина О.В., Шлеев С.В., Горшина Е.С., Русинова Т.В., Сереженков

13. В.А., Бурбаев Д.Ш., Беловолова Л.В., Ярополов А.И. «Выделение и очистка ферментов лигнолитического комплекса базидиального гриба Trametes pubescens (Schumach) Pilat и исследование их свойств» Биохимия 2005а. Т. 70, вып. 11, С. 1548-1555

14. Никитина О.В., Шлеев С.В., Горшина Е.С., Русинова Т.В., Ярополов А.И.

15. Роль ионов двухвалентного марганца в функционировании лигнолити-ческих ферментов базидиального гриба Trametes pubescens». Вестник

16. МГУ, Сер. 2. Химия 2005b. Т. 46, № 4, С. 267-273

17. Остерман J1.A. «Методы исследования белков и нуклеиновых кислот»2002, М.: "МЦНМО" 248с.

18. Позднякова Н.Н., Турковская О.В., Юдина Е.Н., Родакевич-Новак Я.

19. Желтая лакказа гриба Pleurotus ostreatus D1: очистка и характеристика». Прикл. биохимия и микробиология 2006. Т. 42, № 1, С. 63-69.

20. Смирнов С.А., Королева О.В., Гаврилова В.П., Белова А.Б., Клячко H.JI.

21. Лакказы базидоимицетов: физико-химические характеристики и субстратная специфичность по отношению к метоксифенольным соединениям» Биохимия 2001. Т. 66, Вып. 7, С. 952-958.

22. Степанова Е.В., Пегасова Т.В., Гаврилова В.П., Ландесман Е.О., Королева

23. О.В. «Сравнительное изучение внеклеточных лакказ Cerrena unicolor 059, Cerrena unicolor 0784 и Pleurotus oastreatus 0432» Прикл. биохимия и микробиология 2003. Т. 39, № 4, С. 427-434.

24. Тарасевич М.Р. «Электрохимия углеродных потенциалов» М: Наука, 1984,254с.

25. Шлеев С.В., Кузнецов С.В., Топунов А.Ф. «Ячейка для биоэлектрохимических исследований с параллельным спектрофотометрическим контролем исследуемого вещества» Прикл. биохимия и микробиология 2000. Т. 36, № 3, С. 354-358

26. Ярополов А.И., Сухомлин Т.К., Карякин А.А., Варфоломеев С.Д., Березин

27. И.В. «О возможности туннельного переноса электрона при ферментативном катализе электродных процессов» Доклады АН СССР 1981. Т. 260, №5, С. 1192-1195

28. Ярополов А.И., Карякин А.А., Варфоломеев С.Д. «Биоэлектрокатализфеномен ускорения ферментами электродных процессов» Вестник МГУ, Сер. 2 Химия 1983. Т. 24, № 6, С. 523-535

29. Ярополов А.И., Карякин А.А., Гоготов И.Н., Зорин Н.А., Варфоломеев

30. С.Д., Березин И.В. «Биоэлектрокатализ. Механизм окисления молекулярного водорода на электроде с иммобилизованной гидрогеназой» Доклады АН СССР 1984. Т. 274, № 6, С. 1434-1437

31. Ярополов А.И. «Каталитические закономерности действия биокатализаторов в электрохимических системах» Дисс.докт. хим. наук. М.: Химический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова, 1986,357с.

32. Ярополов А.И., Гиндилис А.Л. «Прямой перенос электрона в электроферментативных системах» Биофизика 1990. Т. 35, Вып. 4, С. 689-698

33. Aaslyng D., Tsuchiya R., Gaffar A., Smith S.F. «Tooth bleaching» US Patent6,379,653, April 30, 2002

34. Abadulla E., Tzanov Т., Costa S., Robra K.-H., Cavaco-Paulo A., Giibitz G.M.

35. Alexandre G. and Zhulin I. B. «Laccases are widespread in bacteria» Trends

36. Biotechnol 2000, V. 18, №2, P. 41-42

37. Amitai G., Adani R., Sod-Moriah G., Rabinovitz I., Vincze A., Leader H., Chefetz В., Leibovitz-Persky L., Friesem D., Hadar Y. «Oxidative biodegrada-tion of phosphorothiolates by fungal laccase» FEBS Lett. 1998. V. 438, № 3, P. 195-200

38. Arends I.W.C.E., Li Y.-X., Ausan R., Sheldon R.A. «Comparison of TEMPOand its derivatives as mediators in laccase catalysed oxidation of alcohols» Tetrahedron 2006. V. 62, № 28, P. 6659-6665

39. Astolfi P., Brandi P., Galli C., Gentili P., Gerini M.F., Greci L., Lanzalunga O.

40. New mediators for the enzyme laccase: mechanistic features and selectivity in the oxidation of non-phenolic substrates». New J. Chem. 2005. V. 29, № 10, P. 1308-1317.

41. Bajpai P. «Application of Enzymes in the Pulp and Paper Industry» Biotechnol.

42. Progr. 1999. V. 15, № 2, P. 147-157.

43. Balakshin M.; Chen C.-L.; Gratzl J.S.; Kirkman A.G.; Jakob H. «Biobleachingof pulp with dioxygen in laccase-mediator system-effect of variables on the reaction kinetics» J. Mol. Catal. B: Enzym. 2001a. V. 16, № 3, P. 205-215.

44. Balakshin M.Yu., Evtuguin D.V., Neto C.P., Cavaco-Paulo A. «Polyoxometalates as mediators in the laccase catalyzed delignification» J. Mol. Catal. B: Enzym. 2001b. V. 16, № 3-4 , P. 131-140

45. Baldrian P. «Fungal laccases occurrence and properties» FEMS Microbiol

46. Rev. 2006. V. 30, № 2, P. 215-242

47. Bao W., O'Malley D.M., Whetten R., Sederoff R.R. «А Laccase Associated with1.gnification in Loblolly Pine Xylem» Science 1993. V.260, P.672-674

48. Barfoed M., Kirk 0., Salmon S. «Enzymatic method for textile dyeing» US Patent № 6,805,718, October 19,2004

49. Bar-Nun N. and Mayer A.M. «Cucurbitacins-repressors of induction of laccaseformation» Phytochemistry 1989. V. 28, № 5, P. 1369-1371

50. Bento I., Martins L.O., Lopes G.G., Carrondo M.A., Lindley P.F. «Dioxygen reduction by multi-copper oxidases; a structural perspective» Dalton Trans. 2005. №21, P. 3507-3513

51. Berka R.M., Schneider P., Golightly E.J., Brown S.H., Madden M., Brown

52. Bertrand Т., Jolivalt C., Caminade E., Joly N., Mougin C., Briozzo P. «Purification and preliminary crystallographic study of Trametes versicolor laccase in its native form» Acta Cryst. 2002. D58, Pt. 2, P. 319-321

53. Blaich R. and Esser K. «Function of enzymes in wood destroying fungi II. Multiple forms of laccase in white rot fungi» Arch Microbiol. 1975. V. 103, № 1, P.271 -277

54. Bond A.M. «Chemical and electrochemical approaches to the investigation ofredox reactions of simple electron transfer metalloproteins» Inorg. Chim. Acta 1994. V. 226, № 1-2, P. 293-340

55. Bourbonnais R., Paice M.G. «Oxidation of non-phenolic substrates. An expanded role for laccase in lignin biodegradation» FEBS 1990. V. 267, № 1, P. 99-102.

56. Bourbonnais R., Paice M.G., Freiermuth В., Bodie E., Borneman S. «Reactivities of various mediators and laccases with kraft pulp and lignin model compounds» Appl. Environ. Microbiol. 1997, V. 63, № 12, P. 4627-4632.

57. Bourbonnais R., Leech D., Paice M.G. «Electrochemical analysis of the interactions of laccase mediators with lignin model compounds» Biochim. Biophys. Acta 1998. V. 1379, № 3, P. 381-390

58. Bourbonnais R., Rocherfort D., Paice M.G., Renand S., Leech D. «Transitionmetal complexes: a new class of laccase mediators for pulp bleaching» Tappi J. 2000. V. 83, P. 68-78

59. Bourbonnais R., Rochefort D., Paice M.G., Renaud S., Leech D. «Oxidase process for pulp» US Patent № 6,660,128, December 9,2003

60. Boutique J.-P., Burckett-Saint-Laurent J.C.T.R., Coosemans S.J.L., Goovaerts1., Gualco L.M.P., Johnston J.P. «Pouched cleaning compositions» US Patent Ms 6,815,410, November 9,2004

61. Branchi В., Galli C., Gentili P. «Kinetics of oxidation of benzyl alcohols by thedication and radical cation of ABTS. Comparison with laccase-ABTS oxidation: an apparent paradox» Org. Biomol. Chem. 2005. V. 3, № 14, P. 26042614

62. Broman L., Malmstrom B.G., Aasa R., Vanngard T. «Quantitative electron spinresonance studies on native and denatured ceruloplasmin and laccase» J. Mol. Biol. 1962. V. 5, № 2, P. 301-310

63. Burrows A.L., Hill H.A., Leese T.A., Mcintire W.S., Nakayama H., Sanghera

64. G.S «Direct electrochemistry of the enzyme, methylamine dehydrogenase, from bacterium W3A1» Eur. J. Biochem. 1991. V. 199, № 1, P. 73-78.

65. Call H.P., Miicke I. «History, overview and applications of mediated lignolyticsystems, especially laccase-mediator-systems (Lignozym®-process)» J. Bio-technol., 1997. V. 53, № 2, P. 163-202.

66. Cambria M.T., Cambria A., Ragusa S., Rizzarelli E. «Production, purification,and properties of an extracellular laccase from Rigidoporus lignosus» Protein Expr. Purif. 2000. V. 18, № 2, P. 141-147

67. Campos R.; Kandelbauer A.; Robra K.H.; Cavaco-Paulo A.; Gubitz G.M. «Indigo degradation with purified laccases from Trametes hirsuta and Scle-rotium rolfsii» J. Biotechnol. 2001. V. 89, № 2, P. 131-139.

68. Cantarella G., Galli C., Gentili P. «Free radical versus electron-transfer routesof oxidation of hydrocarbons by laccase/mediator systems. Catalytic or stoichiometric procedures» J. Mol. Catal. B: Enzym. 2003. V. 22, № 3-4, P. 135-144.

69. Cass A.E.G., Davis G., Francis G.D., Hill H.A.O., Aston W. J., Higgins I.J.,

70. Plotkin E.V., Scott L.D.L., Turner A.P.F. «Ferrocene-mediated enzyme electrode for amperometric determination of glucose» Anal. Chem. 1984. V. 56, №4, P. 667-671

71. Chefetz В., Chen Y., and Hadar Y. «Purification and characterization of laccasefrom Chaetomium thermophilium and its role in humification» Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64, № 9, P. 3175-3179.

72. Cheng H.N., Delagrave S., Gu Q.-M., Murphy D. «Bio-bleaching of pulp usinglaccase, mediator, and chain transfer agent» WO 2003023133, March 20, 2003a

73. Cheng H.N., Delagrave S., Gu Q.-M., Michalopoulos D., Murphy D. «Laccaseactivity enhancers » WO 2003023043, March 20,2003b

74. Cheng H.N., Delagrave S., Gu Q.-M., Murphy D. «Enhancing laccase activityusing pro-oxidants and pro-degradants» WO 2003023142, March 20,2003c

75. Cheng H.N., Delagrave S., Gu Q.-M., Michalopoulos D., Murphy D. «Laccaseactivity enhancers for pulp bleaching» WO 2003023134, March 20,2003d

76. Claus H. «Laccases and their occurrence in prokaryotes» Arch. Microbiol. 2003.1. V. 179, №3, P. 145-150

77. Claus H. «Laccases: structure, reactions, distribution» Micron 2004. V. 35, № 12, P. 93-96

78. Colao M.Ch., Garzillo A.M., Buonocore V., Schiesser A., Ruzzi M. «Primarystructure and transcription analysis of a laccase-encoding gene from the basidiomycete Trametes trogu» Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V. 63, № 2, P.153-158

79. Cole J.L., Tan G.O., E. K. Yang, Keith O. Hodgson, Edward I. Solomon «Reactivity of the laccase trinuclear copper active site with dioxygen: an X-ray absorption edge study» J. Am. Chem. Soc. 1990. V. 112, № 6, P. 2243-2249.

80. Coll P.M., Fernandez-Abalos J.M.,.Villanueva J.R, Santamaria R., Perez P. «Purification and characterization of a phenoloxidase (laccase) from the lignin-degrading basidiomycete PM1 (CECT 2971)» Appl. Environ. Microbiol. 1993a. V. 59, № 8, P. 2607-2613

81. Coll P.M., Tabernero C., Santamaria R., Perez P. «Characterization and structural analysis of the laccase I gene from the newly isolated ligninolytic basidiomycete PM1 (CECT 2971)» Appl. Environ. Microbiol. 1993b. V. 59, № 12, P. 4129-4135.

82. Couto S.R. and Herrera J.L.T. «Industrial and biotechnological applications oflaccases» Biotechnol. Adv. 2006. V. 24, № 5, P. 500-513

83. Damkhus Т., Fogt U. «Method of removing excess dye from print or coloredtextiles or yarn» US Patent № 6,409,771 June 25,2002

84. Das N., Sengupta S., Mukherjee M. «Importance of laccase in vegetative growthof Pleurotus florida» Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63 № 10, P. 41204122.

85. Dedeyan В., Klonowska A., Tagger S., Tron Т., Iacazio G., Gil G., Le Petit J.

86. Biochemical and molecular characterization of a laccase from Marasmius quercophilus» Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66, № 3, P. 925-929

87. Diamantidis G., Effosseb A., Potierb P., Ballyb R. «Purification and characterization of the first bacterial laccase in the rhizospheric bacterium Azospirillum lipoferum» Soil Biol. Biochem. 2000. V. 32, № 7, P. 919-927

88. Dittmer J.K., Patel N.J., Dhawale S.W., Dhawale S.S. «Production of multiplelaccase isoforms by Phanerochaete chrysosporium grown under nutrient sufficiency» FEMS Microbiology Letters 1997. V. 149, № 1, P. 65-70

89. Dong J.L. and Zhang Y.Z «Purification and Characterization of Two Laccase1.oenzymes from a Ligninolytic Fungus Trametes gallica» Prep. Biochem. Biotech. 2004. V. 34, № 2, P. 179-194

90. Dutton P.L. «Redox potentiometry: Determination of midpoint potentials of oxidation-reduction components of biological electron-transfer systems» Methods Enzymol. 1978. V. 54, P. 411-435

91. Duran N., Rosa M.A., D'Annibale A., Gianfreda L. «Applications of laccasesand tyrosinases (phenoloxidases) immobilized on different supports: a review» Enzyme Microb. Technol. 2002. V. 31, № 7, P. 907-931.

92. Echigo Т., Ohno R. «Process for producing high-molecular-weight phenoliccompounds with myrothecium» US Patent № 6,190,891 February 20, 2001

93. Ehresmann В., Imbault P., Well J.H. «Spectrophotometric determination of protein concentration in the cell extracts containing tRNA's» Anal. Biochem. 1973. V. 54, № 2, P. 454-463.

94. Edens W.A., Goins T.Q., Dooley D., Hensonl J.M. «Purification and characterization of a secreted laccase of Gaeumannomyces gram in is var. Tritici» Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65, № 7, P. 3071 -3074

95. Eggert С., Temp U., Dean J.F.D., Eriksson K.-E.L. «Laccase-mediated formation of the phenoxazinone derivative, cinnabarinic acid» FEBS Lett. 1995. V. 376, №3, P. 202-206

96. Eggert C., Temp U., and. Eriksson K.E «The ligninolytic system of the white rotfungus Pycnoporus cinnabarinus: purification and characterization of the laccase» Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62, № 4, P. 1151-1158.

97. Eggert C., Temp U., Eriksson K.-E. L. «Laccase is essential for lignin degradation by the white-rot fungus Pycnoporus cinnabarinus». FEBS Letteers 1997. V. 407, № 1,P. 89-92.

98. Eggert C., LaFayette P.R., Temp U., Eriksson K.-E.L., Dean J.F.D. «Molecular

99. Analysis of a Laccase Gene from the White Rot Fungus Pycnoporus cinnabarinus» Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64, № 5, P. 1766-1772.

100. Enguita F.J., Matias P.M., Martins L.O., Placido D., Henriques A.O., Carrondo

101. M.A. «Spore-coat laccase CotA from Bacillus subtilis: crystallization and preliminary X-ray characterization by the MAD method» Acta Cryst. 2002. V. D58, № 21, P. 1490-1493

102. Enguita F.J., Martins L.O., Henriques A.O., Carrondo M.A. «Crystal structure ofa bacterial endospore Coat component: A laccase with enhanced thermostability properties» J Biol. Chem., 2003. V. 278, № 21, P. 19416 19425

103. Enguita F.J., Mar$al D., Martins L.O., Grenha R., Henriques A.O., Lindley P.F.,

104. Carrondo M.A. «Substrate and Dioxygen Binding to the Endospore Coat Laccase from Bacillus subtilis» J. Biol. Chem. 2004. V. 279, № 22, P. 23472-23476

105. Fabbrini M., Galli C., Gentili P. «Comparing the catalytic efficiency of somemediators of laccase» J. Mol. Catal. B: Enzym. 2002. V.16, № 5, p. 231-240.

106. Farneth W.E., Hasty N.M., Damore M.B., Chisholm D.A. «Oxygen scavengingcompositions and methods of use» WO 2005033676, April 14, 2005

107. Ferapontova E.E., Shleev S., Ruzgas Т., Stoica L., Christenson A., Tkac J.,

108. Ferraroni M., Duchi I., Myasoedova N.M., Leontievsky A.A., Golovleva L.A.,

109. Scozzafava A., Briganti F. «Crystallization and preliminary structure analysis of the blue laccase from the ligninolytic fungus Panus tigrinus» Acta Cryst. 2005. V. F61, Pt 2, P. 205-207

110. Freire R.S., Pessoa C.A., Mello L.D., Kubota L.T. «Direct electron transfer: anapproach for electrochemical biosensors with higher selectivity and sensitivity» J. Braz. Chem Soc. 2003. V. 14, № 2, P. 230-243

111. Fukushima Y. and Kirk Т.К. «Laccase component of the Ceriporiopsis subvermispora lignin-degrading system» Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61, №3, P. 872-876

112. Galhaup C. and Haltrich D. «Enhanced formation of laccase activity by thewhite-rot fungus Trametes pubescens in the presence of copper» Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 56, № 1-2, P. 225-232

113. Galhaup C., Goller S., Peterbauer C.K., Strauss J., Haltrich D. «Characterizationof the major laccase isoenzyme from Trametes pubescens and regulation of its synthesis by metal ions» Microbiology 2002, V. 148, № 7, P. 2159-2169

114. Galli C., Gentili P. «Chemical messengers: mediated oxidations with the enzymelaccase» J. Phys. Org Chem. 2004. V. 17, № 11, P. 973-977.

115. Gamelas J.A.F., Tavares A.P.M., Evtuguin D.V., Xavier A.M.B. «Oxygenbleaching of kraft pulp with polyoxometalates and laccase applying a novel multi-stage process» J. Mol. Catal. B: Enzym. 2005a. V. 33, № 3-6, P. 57-64

116. Gamelas J.A.F., Gaspar A.R., Evtuguin D.V., Neto C.P. «Transition metal substituted polyoxotungstates for the oxygen delignification of kraft pulp» Applied Catalysis A: General 2005b.V. 295, № 2, P. 134-141

117. Garavaglia S., Cambria M.T., Miglio M., Ragusa S., Iacobazzi V., Palmieri F.,

118. D'Ambrosio C., Scaloni A., Rizzi M. «The Structure of Rigidoporus lignosus Laccase Containing a Full Complement of Copper Ions, Reveals an Asymmetrical Arrangement for the T3 Copper Pair» J. Mol. Biol. 2004. V. 342, № 5, P. 1519-1531

119. Gardner R.R., Glogowski M.W., Haught J.C., Baeck A.C., Convents A.C.,

120. Smets J., Van Steenwinckel P.C.A., Gray P.G., Cruickshank G.D., Costello A., Duncan M. «Compositions for cleaning with softened water» W02006044952, April 27,2006

121. Garzillo A.M., Colao M.C., Buonocore V., Oliva R., Falcigno L., Saviano M.,

122. Gianfreda L., Xu F., Bollag J.-M. «Laccases: A useful group of oxidoreductiveenzymes» Bioremediation J. 1999. V. 3, № 1, P. 1 26

123. Ghindilis A. L., Gavrilova V. P., Yaropolov A. I. «Laccase-based biosensor fordetermination of polyphenols: determination of catechols in tea» Biosens.

124. Bioelectron 1992. V. 7, № 2, P. 127-131.

125. Ghindilis A. «Direct electron transfer catalysed by enzymes: application for biosensor development» Biochem. Soc. Tran. 2000. V. 28, part 2, P. 84-89

126. Giardina P., Aurilia V., Cannio R., Marzullo L., Amoresano A., Siciliano R.,

127. Pucci P., Sannia G. «The gene, protein and glycan structures of laccase from Pleurotus ostreatus» Eur. J. Biochem 1996. V. 235, № 3, P. 508-515

128. Giardina P., Palmieri G., Scaloni A., Fontanella В., Faraco V., Cennamo G.,

129. Sannia G. «Protein and gene structure of a blue laccase from Pleurotus ostreatus» Biochem. J. 1999. V. 341,655-663

130. Gomes S.A.S.S., Nogueira J.M.F., Rebelo M.J.F. «An amperometric biosensorfor polyphenols compounds in red wine» Biosens. Bioelectron. 2004. V. 20, №6, P. 1211-1216

131. Greco G., Sannino F., Gianfreda L., Toscanoa G., Cioffi M. «Dephenolisation ofolive mill waste-waters by olive husk» Water Res. 1999, V. 33, № 13, P. 2905-3062.

132. Guillen F., Munoz C., Gomez-Toribio V., Martinez A.T., Martinez M.J. «Oxygen activation during oxidation of methoxyhydroquinones by laccase from Pleurotus eryngii» Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66, № 1, P. 170-175.

133. Guo L.H., Hill H.A.O. «Direct electrochemistry of proteins and enzymes» Adv.1.org. Chem. 1991. V. 36, P. 341-375

134. Giinther Th., Perner В., Gramss G. «Activities of phenol oxidizing enzymes ofectomycorrhizal fungi in axenic culture and in symbiosis with Scots pine {Pirns sylvestris L.)» J. Basic Microbiol 1998. V. 38, № 3 , P. 197-206

135. Hage R., Hora J., Swarthoff Т., Twisker R.S. «Method for enhancing the activity of an enzyme» US Patent № 6,225,275, Mayl, 2001

136. Hagen W.R. «Direct electron transfer of redox proteins at the bare glassy carbonelectrode» Eur. J. Biochem. 1989. V. 182, № 3, P. 523-530

137. Hakulinen N., Kiiskinen LL., Kruus K., Saloheimo M., Paananen A., Koivula

138. A., Rouvinen J. «Crystal structure of a laccase from Melanocarpus albomyces with an intact trinuclear copper site» Nat. Struct. Biol. 2002. V. 9, № 8, P. 601-605

139. Heller A., Mano N., Kim H.-H., Zhang Y., Mao F., Chen Т., Barton S.C.

140. Miniature biological fuel cell that is operational under physiological conditions, and associated devices and methods» W003106966, December 20, 2003

141. Heller A. «Biological fuel cell and methods» US Patent 7,018,735, March 28,2006

142. Hofer C. and Schlosser D. «Novel enzymatic oxidation of Mn2+ to Mn3+ catalyzed by a fungal laccase» FEBS Lett. 1999. V. 451, № 2, P. 186-190

143. Huang R., Christenson P., Labuda I.M. «Process for the preparation of nootkatone by laccase catalysis» US Patent № 6,200,786, March 13, 2001

144. Hublik G., Schinner F. «Characterization and immobilization of the laccase from

145. Pleurotus ostreatus and its use for the continuous elimination of phenolic pollutants» Enzyme Microb. Technol. 2000. V. 27, № 3-5, P. 330-336.

146. Hullo M.-F., Moszer I., Danchin A., Martin-Verstraete I. «CotA of Bacillus subtilis is a copper-dependent laccase» J. Bacteriol. 2001. V. 183, № 18, P. 5426-5430

147. Hiittermann A., Majcherczyk A., Mai C., Braun-Lullemann A., Fastenrath M.,

148. Ikeda O. and Sakurai T. «Electron transfer reaction of stellacyanin at a bareglassy carbon electrode» Eur. J.Biochem. 1994. V. 219, № 3, P. 813-819.

149. Jarosz-Wilkolazka A., Ruzgas Т., Gorton L. «Amperometric detection ofmono- and diphenols at Cerrena unicolor laccase-modified graphite electrode: correlation between sensitivity and substrate structure» Talanta 2005. V. 66, №5, P. 1219-1224

150. Jetten J.M., Van Den Dool R., Van Hartingsveldt W., Besemer A.C. «Processfor selective oxidation of cellulose» US Patent № 6,716,976, April 6,2004

151. Johannes C., Majcherczyk A., Hiittermann A. «Degradation of anthracene bylaccase of Trametes versicolor in the presence of different mediator compounds» Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. V. 46, № 3, P. 313-317

152. Johannes C., Majcherczyk A. «Natural mediators in the oxidation of polycyclicaromatic hydrocarbons by laccase mediator systems» Appl. Environ. Microbiol. 2000a. V. 66, № 2, P. 524-528.

153. Johannes C., Majcherczyk A. «Laccase activity tests and laccase inhibitors» J.

154. Biotechnol. 2000b. V. 78, № 2, P. 193-199

155. Johansen C., Deussen H.-J. «Antimicrobial composition containing an oxidoreductase and an enhancer of the N-hydroxyanilide-type» US Patent6,592,867, July 15,2003

156. Jong de E., Field J.A., Bont de J.A.M. «Aryl alcohols in the physiology of ligninolytic fungi» FEMS Microbiol Rev. 1994, V.13, № 2-3, P. 153-187.

157. Jonsson L.J., Palmqvist E., Nilvebrant N.-O., Hahn-Hagerdal B. «Detoxificationof wood hydrolysates with laccase and peroxidase from the white-rot fungus Trametes versicolor» Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. V. 49, № 6, P. 691697

158. Karamyshev A.V., Shleev S.V., Koroleva O.V., Yaropolov A.I., Sakharov I.Yu.1.ccase-catalyzed synthesis of conducting polyaniline» Enzyme Microb. Technol. 2003. V. 33, № 5, P. 556-564

159. Karhunen E., Niku-Paavola M.-L., Viikari L., Haltia Т., van der Meer R.A., Duine J. А. «А novel combination of prosthetic groups in a fungal laccase; PQQ and two copper atoms» FEBS Lett. 1990. V. 267, № 1, P. 6-8

160. Kawai S., Nakagawa M., Ohashi H. «Aromatic ring cleavage of a non-phenolicb-O-4 lignin model dimer by laccase of Trametes versicolor in the presence of 1 -hydroxybenzotriazole» FEBS Lett. 1999. V. 446, № 2-3, P. 355-358

161. Kiefer-Meyer M.C„ Gomord V., O'Connell A., Halpin C., Faye L. «Cloning andsequence analysis of laccase-encoding cDNA clones from tobacco» Gene 1996. V. 178, № 1-2, P. 205-207

162. Kierulff J.V. «Modification of polysaccharides by means of a phenol oxidizingenzyme» US Patent № 6,660,503, December 9,2003

163. Kiiskinen L.-L., Viikari L., Kruus K. «Purification and characterisation of anovel laccase from the ascomycete Melanocarpus albomyces» Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002, V. 59, N 2-3, P. 198-204

164. Kiiskinen L.L., Saloheimo M. «Molecular cloning and expression in Saccharomyces cerevisiae of a laccase gene from the ascomycete Melanocarpus albomyces» Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70, № 1, P. 137-144

165. Klonowska A., Gaudin C., Fournel A., Asso M., Le Petit J., Giorgi M., Tron T.

166. Characterization of a low redox potential laccase from the basidiomycete С30» Eur. J. Biochem. 2002. V. 269, № 24, P. 6119-6125.

167. Ко E.-M., Leem Y.-E., Choi H.T. «Purification and characterization of laccaseisozymes from the white-rot basidiomycete Ganoderma lucidum» Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 57, № 1, P. 98-102

168. KojimaY., TsukudaY., KawaiY., Tsukamoto A., Sugiura J., Sakaino M., Kita Y.

169. Cloning, sequence analysis, and expression of ligninolytic phenoloxidase genes of the white-rot basidiomycete Coriolus hirsutus» J. Biol. Chem. 1990. V. 265, №25, P. 15224-15230

170. Kruus K. «Laccase: a useful enzyme for industrial applications». Kemia Kemi2000. V. 27, №3, P. 184-186.

171. Kumar S.V.S., Phale P.S., Durani S., Wangikar P.P. «Combined sequence andstructure analysis of the fungal laccase family» Biotechnol. Bioeng. 2003. V. 83, № 4, P. 386-394

172. Kumari H. L. and Sirsi M. «Purification and properties of laccase from Ganoderma lucidum» Arch. Microbiol. 1972. V. 84, № 4, P. 350-357

173. LaFayette P.R., Eriksson K.-E.L., Dean J.F.D. «Characterization and heterologous expression of laccase cDNAs from xylem tissues of yellow-poplar (Liriodendron tulipifera)» Plant Molecular Biology 1999. V. 40, № 1, P. 2335

174. Lang G., Cotteret J. «Dyeing composition containing a laccase and method fordyeing keratinous fibres» US Patent Application № 20060021155, February 2, 2006

175. Lante A., Crapisi A., Krastanov A., Spettoli P. «Biodegradation of phenols bylaccase immobilised in a membrane reactor» Process Biochem. 2000. V. 36, № 1-2, P. 51-58.

176. Larrabee J.A. and Spiro T.G. «Cobalt11 substitution in the type 1 site of themulti-copper oxidase Rhus laccase» Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. V. 88, № 3, p. 753-760

177. Lee C.-W., Gray H.B., Anson F.C. «Catalysis of the reduction of dioxygen atgraphite electrodes coated with fungal laccase А» J. Electroanal. Chem. 1984. V. 172, № 1-2, P. 289-300

178. Lee S.-K., George S.D., Antholine W.E., Hedman В., Hodgson K.O., Solomon

179. E.I. «Nature of the intermediate formed in the reduction of 02 to H202 at the trinuclear copper cluster active site in native laccase» J. Am. Chem. Soc.2002. V. 124, №21, P. 6180-6193.

180. Leite O.D., Fatibello-Filno O., de M. Barbosa A. «Determination of catecholamines in pharmaceutical formulations using a biosensor modified with a crude extract of fungi lacase (Pleurotus ostreatus)» J. Braz. Chem. Soc.2003. V. 14, №2, P. 297-303

181. Leonowicz and K. Grzywnowicz «Quantitative estimation of laccase forms insome white-rot fungi using syringaldazine as a substrate» Enzyme Microb.

182. Technol. 1983. V. 3, № 1, P. 55-58

183. Leonowicz A., Cho N.-S., Luterek J., Wilkolazka A., Wojtas-Wasilewska M.,

184. Matuszewska A., Hofrichter M., Wesenberg D., Rogalski J. «Fungal laccase: properties and activity on lignin» J. Basic Microbiol. 2001. V. 41, № 3-4, P. 185-227

185. Leontievsky A.A., Myasoedova N.M., Baskunov B.P., Evans C.S., Golovleva

186. A. «Transformation of 2,4,6-trichlorophenol by the white rot fungi Panus tigrinus and Coriolus versicolor» Biodegradation 2000. V. 11, № 5, P. 331340

187. Leontievsky A., Myasoedova N., Baskunov В., Golovleva L., Виске C., Evans

188. C. «Transformation of 2,4,6-trichlorophenol by free and immobilized fungal laccase» Appl Microbiol Biotechnol. 2001. V. 57, № 1-2, P. 85-91

189. Li J.-B., McMillin D. R. «The electronic spectrum of Co(II) in the type 1 site of

190. Rhus vernicifera laccase» Inorg. Chim. Acta 1990. V. 167, № 1,2 P. 119-122

191. Li K., Xu F., and Eriksson K.-E.L. «Comparison of fungal laccases and redoxmediators in oxidation of a nonphenolic lignin model compound» Appl. Environ. Microbiol. 1999, V. 65, № 6, P. 2654-2660.

192. Lindgren A., Tanaka M., Ruzgas Т., Gorton L., Gazaryan I., Ishimori K., Morishima I. «Direct electron transfer catalysed by recombinant forms of horseradish peroxidase: insight into the mechanism» Electrochem. Commun. 1999. V. 1, № 5, P. 171-175

193. Lindgren A., Gorton L., Ruzgas Т., Baminger U., Haltrich D., Schiilein M. «Direct electron transfer of cellobiose dehydrogenase from various biological origins at gold and graphite electrodes J. Electroanal. Chem. 2001. V. 496, № 1-2, P. 76-81

194. Lund M., Felby C. «Process for treating pulp with laccase and a mediator to increase paper wet strength» US Patent № 6,610,172, August 26,2003

195. Lyashenko A.V., Zhukhlistova N.E., Gabdoulkhakov A.G., Zhukova Y.N.,

196. Ma, X., S. E. Rokita. «Role of oxygen during horseradish peroxidase turnoverand inactivation». Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. V. 157, № 1, P. 160-165

197. Maganadze G.G., Shutyaev T.Yu. In: «Laser Ionization Mass Analysis» (Vertes

198. A., Gijbels R. and Adams F. Eds.) Chemical Analysis Series, 1993, V. 124, P. 505-549, J. Wiley and Sons, New York

199. Malkin R., Malmstrom B.G., Vanngard T. «The reversible removal of one specific copper (II) from fungal laccase» Eur. J. Biochem. 1969. V. 7, № 2, P. 253-259.

200. Malmstrom B.G. «Enzymology of Oxygen» Annu. Rev. Biochem. 1982. V. 51,1. P. 21-59

201. Martins L.O., Soares C.M., Pereira M.M., Teixeira M., Costa Т., Jones G.H.,

202. Henriques A.O. «Molecular and biochemical characterization of a highly stable bacterial laccase that occurs as a structural component of the Bacillus subtilis endospore Coat» J. Biol. Chem. 2002. V. 277, № 21, P. 18849-18859

203. Marzorati M., Danieli В., Haltrich D., Riva S. «Selective laccase-mediated oxidation of sugars derivatives» Green Chem. 2005. V. 7, № 5, P. 310-315.

204. May S.W. «Applications of oxidoreductases» Curr. Opin. Biotechnol. 1999. V.10, №4, P. 370-375.

205. Mayer A.M. and Staples R.C. «Laccase: new functions for an old enzyme» Phytochemistry 2002. V. 60, № 6, P. 551-565

206. Messerschmidt A. and Huber R. «The blue oxidases, ascorbate oxidase, laccaseand ceruloplasmin. Modelling and structural relationships» Eur. J. Biochem. 1990. V. 187, №2, P. 341-352.

207. Messerschmidt A., Ladenstein R., Huber R., Bolognesi M., Avigliano L.,

208. Petruzzelli R., Rossi A., Finazzi-Agro A. «Refined crystal structure of ascorbate oxidase at 1.9 A resolution». J. Mol. Biol. 1992. V. 224, № 1, P. 179205.

209. Michizoe J., Ichinose H., Kamiya N., Maruyama Т., Goto M. «Biodegradation ofphenolic environmental pollutants by a surfactant-laccase complex in organic media» J. Biosci. Bioeng. 2005. V. 99, № 6, P. 642-647

210. Min K.-L.; Kim Y.-H.; Kim Y.W.;Jung H.S.; Hah Y.C. «Characterization of anovel laccase produced by the wood-rotting fungus Phellinus ribis» Arch. Biochem. Biophys. 2001. V. 392, № 2, P. 279-286

211. Minussi R., Pastore G.M., Duran N. «Potential application of laccase in the foodindustry» Trends in Food Science & Technology 2002. V. 13, P. 205-216.

212. Molitoris H.P., Esser K. «Die phenoloxydasen des ascomyceten Podosporaanserina. V. Eigenschaften der laccase I nach weiterer reinigung» Arch. Microbiol. 1970. V. 72, № 3, P. 267 296

213. Morie-Bebel M.M., Morris M.C., Menzie J.L., McMillin D.R. «А mixed-metalderivative of laccase containing mercury (II) in the type 1 binding site» J. Am. Chem. Soc. 1984. V. 106, № 12, P. 3677-3678.

214. Nakamura T. «Purification and physico-chemical properties of laccase» Biochim. Biophys. Acta 1958. V. 30, № 1, P. 44-52

215. Ng T.B., Wang H.X. «А homodimeric laccase with unique characteristics fromthe yellow mushroom Cantharellus cibarius» Biochem. Biophys. Res. Com-mun. 2004. V. 313, № 1, P. 37-41

216. Nicholson R.S., Shain I. «Theory of stationary electrode polarography. Singlescan and cyclic methods applied to reversible, irreversible, and kinetic systems» Anal. Chem. 1984. V. 36, № 4, P. 706-723

217. Nilsson I., Moller A., Mattiasson В., Rubindamayugi M.S.T., Welander U. «Decolorization of synthetic and real textile wastewater by the use of white-rot fungi» Enzyme Microb. Technol. 2006. V. 38, № 1-2, P. 94-100

218. Nitta K., Kataoka K., Sakurai T. «Primary structure of a Japanese lacquer treelaccase as a prototype enzyme of multicopper oxidases» J. Inorg. Biochem. 2002. V. 91, № 1, P. 125-31.

219. Ong E., Pollock W.B., Smith M. «Cloning and sequence analysis of two laccasecomplementary DNAs from the ligninolytic basidiomycete Trametes versicolor» Gene 1991. V. 196, № 1-2, P. 113-119

220. Onuki Т., Noguchi M., Mitamura J. «Hairdye composition comprising indolineand/or an indoline compound and laccase» WO 00078274, Decrmber 28, 2000

221. Palmer A. E., Lee, S. K., Solomon E. I. «Decay of the peroxide intermediate inlaccase: reductive cleavage of the 0-0 bond» J. Am Chem. Soc. 2001, V. 123, №27, P. 6591-6599.

222. Palmeiri G., Giardina P., Marzullo L., Desiderio В., Nittii G., Cannio R., Sannia

223. G. «Stability and activity of a phenol oxidase from the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus» Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. V. 39, № 4-5, P. 632-636

224. Palmieri G., Giardina P., Bianco C., Scaloni A., Capasso A. and Sannia G. «Аnovel white laccase from Pleurotus ostreatus» J. Biol. Chem. 1997. V. 272, №50, P. 31301-31307

225. Palmieri G., Giardina P., Bianco C., Fontanella В., Sannia G. «Copper inductionof laccase isoenzymes in the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus» Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66, № 3, P. 920-924.

226. Palmieri G., Cennamo G., Faraco V., Amoresano A., Sannia G. and Giardina P.

227. Atypical laccase isoenzymes from copper supplemented Pleurotus ostreatus cultures» Enzyme Microb. Technol. 2003.V. 33, № 2-3, P. 135-325

228. Palonen H., Saloheimo M., Viikari L., Kruus K. «Purification, characterizationand sequence analysis of a laccase from the ascomycete Mauginiella sp» Enzyme Microb. Technol. 2003. V. 33, № 6, P. 854-862

229. Pedersen L.S., Felby C. «Process for preparing a lignocellulose-based product,and product obtainable by the process» US Patent № 5,846,788 1998

230. Pedersen L.S., Felby C., Munk N. «Process for increasing the charge on a lignocellulosic material» US Patent № 6,187,136, February 13,2001

231. Pegasova T.V., Zwart P., Koroleva O.V., Stepanova E.V., Rebrikov D.V.,1.mzin V.S. «Crystallization and preliminary X-ray analysis of a four-copper laccase from Coriolus hirsutus» Acta Cryst. 2003. V. D59, Pt 8, P. 1459-1461

232. Perry C.R., Smith M., Britnell C.H., Wood D.A., Thurston C.F. «Identificationof two laccase genes in the cultivated mushroom Agaricm bisporus» J Gen. Microbiol. 1993. V. 139, № 6, P. 1209-1218

233. Piontek K., Antorini M., Choinowski T. «Crystal structure of a laccase from thefungus Trametes versicolor at 1.90-A resolution containing a full complement of coppers» J. Biol. Chem. 2002. V. 277, № 40, P. 37663-37669

234. Pita M., Shleev S., Ruzgas Т., Fernandez V.M., Yaropolov A.I., Gorton L. «Direct heterogeneous electron transfer reactions of fungal laccases at bare and thiol-modified gold electrodes» Electrochem Commun. 2006. V. 8, № 5, P. 747-753

235. Portaccio M., Di Martino S., Maiuri P., Durante D., De Luca P., Lepore M.,

236. Bencivenga U., Rossi S., De Maio A., Mita D.G. «Biosensors for phenolic compounds: The catechol as a substrate model» J. Mol. Catal. B: Enzym. 2006. V. 41, №3-4, P. 97-102

237. Quintanar L., Yoon J., Aznar C.P., Palmer A.E., Andersson K.K., Britt R. D.,

238. Solomon E.I. «Spectroscopic and electronic structure studies of the trinuclear Cu cluster active site of the multicopper oxidase laccase: nature of its coordination unsaturation» J. Am. Chem. Soc 2005. V. 127, № 40, P. 13832-13845

239. Raghukumar C. «Fungi from marine habitats: an application in bioremediation»

240. Mycological Res. 2000. V. 104,№ 10,1222-1226

241. Ranocha P., McDougall G., Hawkins S., Sterjiades R., Borderies G., Stewart D.,

242. Cabanes-Macheteau M.,. Boudet A.-M, Goffner D. «Biochemical characterization, molecular cloning and expression of laccases a divergent gene family - in poplar» Eur. J. Biochem. 1999. V. 259, № 1-2, P. 485-495.

243. Reinhammar B.R., Vanngard T.I. «The electron-accepting sites in Rhus vernicifera laccase as studied by anaerobic oxidation-reduction titrations» Eur. J. Biochem. 1971. V. 18, № 4, P. 463-468

244. Reinhammar B.R.M. «Oxidation-reduction potentials of the electron acceptorsin laccases and stellacyanin» Biochim. Biophys. Acta 1972. V. 275, № 2,1. P. 245-259

245. Reinhammar D., «Laccase» In: Copper Proteins and CopperEnzymes. 1984, V.3, P. 1-35 (Lontie R., Ed.) CRC Press: Boca Raton, Fla

246. Riva S. «Laccases: blue enzymes for green chemistry» Trends Biotechnol. 2006.1. V. 24, №5, P. 219-226

247. Rosconi F., Fraguas L. F., Martmez-Drets G., Castro-Sowinski S. «Purificationand characterization of a periplasmic laccase produced by Sinorhizobium meliloti» Enzyme Microb. Technol. 2005. V. 36, № 5-6, P. 800-807

248. Rulisek L., Solomon E.I., Ryde U. «А combined quantum and molecular mechanical study of the O2 reductive cleavage in the catalytic cycle of multi-copper oxidases» Inorg. Chem. 2005. V. 44, № 16, P. 5612-5628

249. Ryan S., Schnitzhofer W., Tzanov Т., Cavaco-Paulo A., Giibitz G.M. «An acidstable laccase from Sclerotium rolfsii with potential for wool dye decolonization» Enzyme Microb. Technol. 2003. V. 33, № 6, P. 766-774

250. Sakurai T. «Anaerobic reactions of Rhus vernicifera laccase and its type-2 copper-depleted derivatives with hexacyanoferrate (II)» Biochem J. 1992. V. 284, №3, P. 681-685

251. Sato Y., Wuli В., Sederoff R., Whetten R. «Molecular cloning and expression ofeight laccase cDNAs in loblolly pine (Pinus taeda)» J. Plant Res. 2001. V. 114, №2, P. 147-155

252. Schliephake K., Mainwaring D.E., Lonergan G.T., Jones, Baker W.L. «Transformation and degradation of the disazo dye'Chicago Sky Blue by a purified laccase from Pycnoporus cinnabarinus» Enzyme Microb. Technol. 2000. V. 27, № 1-2, P. 100-107

253. Schneider P., Conrad L.S., Ebdrup S., Yde B. «Enhancement of enzyme reactions» US Patent 5,700,769 ,1997

254. Schneider P., Pedersen A. «Enhancement of laccase reactions» US Patent5,885,304, March 23,1999

255. Schneider P., Caspersen M.B., Mondorf K., Halkier Т., Skov L.K., Ostergaard

256. P.R., Brown K.M., Brown S.H., Xu F. «Characterization of a Coprinus cinereus laccase» Enzyme Microb. Technol. 1999. V. 25, № 6, P. 471-545

257. Schlosser D. and Hofer C. «Laccase-catalyzed oxidation of Mn2+ in the presenceof natural Mn3+ chelators as a novel source of extracellular H202 production and its impact on manganese peroxidase» Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68, №7, P. 3514-3521

258. Sheldon R.A., Arends I.W.C.E. «Catalytic oxidations mediated by metal ionsand nitroxyl radicals» J. Mol. Catal. A: Chem. 2006. V. 251, № 1-2, P. 200214

259. Shi С., Clemmons J. «Single bath process for bleaching and dyeing textiles»

260. WO 03016615, December 27,2003

261. Shin W., Sundaram U.M., Cole J.L., Zhang H.H., Hedman В., Hodgson K.O.,

262. Solomon E. I. «Chemical and spectroscopic definition of the peroxide-level intermediate in the multicopper oxidases: Relevance to the catalytic mechanism of dioxygen reduction to water» J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118, № 13, P. 3202-3215.

263. Shin K.-S., Lee Y.-J «Purification and Characterization of a New Member of the1.ccase Family from the White-Rot Basidiomycete Coriolus hirsutus» Arch. Biochem Biophys. 2000. V. 384, № 1, P. 109-115

264. Shintaro F., Masahiro G., Hiroyuki W. «Biodegradation of dioxin using laccase»

265. JP2001037465, February 13, 2001

266. Shleev S., Kasmi A.E., Ruzgas Т., Gorton L. «Direct heterogeneous electrontransfer reactions of bilirubin oxidase at a spectrographic graphite electrode» Electrochem. Commun. 2004, V. 6, № 9, P. 934-939

267. Shleev S., Tkac J., Christenson A., Ruzgas Т., Yaropolov A.I., Whittaker J.W.,

268. Gorton L. «Direct electron transfer between copper-containing proteins and electrodes» Biosens. Bioelectron. 2005b. V. 20, № 12, P. 2517-2554

269. Shleev S., Reimann C.T., Serezhenkov V., Burbaev D., Yaropolov A.I., Gorton1., T.Ruzgas «Autoreduction and aggregation of fungal laccase in solution phase: Possible correlation with a resting form of laccase» Biochimie 2006a. V. 88, №9, P. 1275-1285

270. Shleev S., Persson P., Shumakovich G., Mazhugo Y., Yaropolov A., Ruzgas Т.,

271. Gorton L. «Laccase-based biosensors for monitoring lignin» Enzyme Microb. Technol. 2006b. V. 39, № 4, P. 835-840

272. Si J.Q. «Use of laccase in baking» US Patent № 6,296,883, October 2,2001

273. Slomczynski D., Nakas J.P., and Tanenbaum S.W. «Production and Characterization of Laccase from Botryth cinerea 61-34» Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. V. 61, №3, P. 907-912

274. Soares G.M.B.; Costa-Ferreira M.l; de Amorim M.T.P. «Decolorization of ananthraquinone-type dye using a laccase formulation» Bioresour. Technol. 2001. V. 79, №2, P. 171-177.

275. Solomon E. I., Baldwin M.J., Lowery M.D. «Electronic structures of active sitesin copper proteins: contributions to reactivity» Chem. Rev. 1992. V. 92, № 4, P. 521-542.

276. Solomon E.I., Tuczek F., Root D.E., Brown C.A. «Spectroscopy of binuclear dioxygen complexes» Chem. Rev. 1994. V. 94, № 3, P. 827-856.

277. Solomon E. I., Sundaram U. M., Machonkin Т. E. «Multicopper Oxidases and

278. Oxygenases» Chem. Rev. 1996. V. 96, № 7, P. 2563-2606.

279. Souza de C.G.M., Peralta R.M. «Purification and characterization of the mainlaccase produced by the white-rot fungus Pleurotus pulmonarius on wheat bran solid state medium» J. Basic Microbiol. 2003. V. 43, № 4, P. 278-286

280. Souza de C.G.M., Tychanowicz G. K., De Souza D. F., Peralta R.M. «Production of laccase isoforms by Pleurotus pulmonarius in response to presence of phenolic and aromatic compounds» J. Basic Microbiol. 2004. V. 44, № 2, P. 129-136.

281. Spira-Solomon D.J., Allendorf M.D., Solomon E. I. «Low-temperature magneticcircular dichroism studies of native laccase: confirmation of a trinuclear copper active site» J. Am. Chem. Soc. 1986. V. 108, № 17, P. 5318-5328.

282. Sterjiades R., Dean J.F.D., Eriksson K.-E.L. «Laccase from sycamore maple

283. Acer pseudoplatanm) polymerizes monolignols» Plant Physiol. 1992. V. 99, P. 1162-1168

284. Tang S.-P.W., Coleman J.E., Myer Y.P. «Conformational studies of copper proteins. Pieudomonas blue protein and Polyporus laccase» J. Biol. Chem. 1968. V. 243, № 16, P. 4286-4297.

285. Thakker G.D., Evans C. S. and Rao K.K. «Purification and characterization oflaccase from Monocillium indicum Saxena» Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. V. 37, №3, P. 321-323

286. Thurston C.F. «The structure and function of fungal laccase» Microbiology1994. V. 140, № 1,P. 19-26

287. Toshiaki K., Takashi W. «Decomposition method of polyurethane»

288. JP2004339438, December 2,2004

289. Tomoaki N., Makoto K. «Method for decomposing polyolefin resin»1. JP2003128835, May 8, 2003

290. Varfolomeev S.D., Kurochkin I.N., Yaropolov A.I. «Direct electron transfer effect biosensors» Biosens. Bioelectron. 1996. V. 11, № 9, P. 863-871

291. Viikari L., Hase A., Qvintus-Leino P., Niku-Paavola M.-L. «Intermediate product for preparation of lignin polymers and use thereof for production of wood materials» US Patent № 6,280,855, August 28,2001

292. Wahleithner J.A., Xu F., Brown K.M., Brown S.H., Golightly E.J, Halkier T,

293. Kauppinen S, Pederson A, Schneider P. «The identification and characterization of four laccases from the plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani» Curr. Genet. 1996. V. 29, № 4, P. 395-403

294. Wood D.A. «Inactivation of extracellular laccase during fruiting of Agaricusbisporus» J. Gen. Microbiol. 1980. V. 117, P. 339-345

295. Wynn R.M., Sarkar H.K., Holwerda R.A, Knaff D.B. «Fluorescence associatedwith the type 3 copper center of laccase» FEBS Lett. 1983. V. 156, № 1, P. 23-28

296. Xu F. «Oxidation of phenols, anilines, and benzenethiols by fungal laccases: correlation between activity and redox potentials as well as halide inhibition» Biochemistry 1996a. V. 35, № 23, P. 7608-7614.

297. Xu F. «Effects of redox potential and hydroxide inhibition on the ph activity profile of fungal laccases» J. Biol. Chem. 1997. V. 272, № 2, P. 924-928

298. Xu F, Berka R. M., Wahleithner J. A., Nelson B.A., Shuster J.R., Brown S.H,

299. Palmer A.E, Solomon E.I. «Site-directed mutations in fungal laccase: effect on redox potential, activity and pH profile» Biochemical J. 1998. V. 334, Pt 1,P. 63-70.

300. Xu F., Palmer A.E, Yaver D.S, Berka R.M., Gambetta G.A, Brown S.H., Solomon E.I. «Targeted mutations in a Trametes villosa laccase. Axial perturbations of theTl copper» J. Biol. Chem. 1999. V.274, № 18, P. 12372-12375

301. Xu F., Kulys J.J, Duke K, Li K, Krikstopaitis K, Deussen H.-J.W, Abbate E,

302. Galinyte V, Schneider P. «Redox chemistry in laccase-catalyzed oxidation of N-Hydroxy compounds» Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66, № 5, P. 2052-2056.

303. Xu F, Deussen H.-J.W, Lopez B, Lam L, Li K. «Enzymatic and electrochemical oxidation of N-hydroxy compounds: Redox potential, electron-transfer kinetics, and radical stability» Eur. J. Biochem. 2001. V. 268, № 15, P. 41694176.

304. Xu F, Li K, Elder T.J. «N-hydroxy mediated laccase biocatalysis: recent progress on its mechanism and future prospect of its application». Progress Biotechnol. 2002. V.21,P. 89-104.

305. Xu F. «Application of oxidoreductases: recent progress» Industrial Biotechnol.2005. V. 1, № 1, P. 38-50

306. Yang J. and Hu N. «Direct electron transfer for hemoglobin in biomembrane-likedimyristoyl phosphatidylcholine films on pyrolytic graphite electrodes» Bio-electrochem. Bioenerg. 1999. V. 48, № 1, P. 117-127

307. Yaropolov A.I., Skorobogat'ko O.V., Vartanov S.S., Varfolomeev S.D. «Laccase: properties, catalytic mechanism, and applicability» Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. V. 49, P. 257-280.

308. Yaropolov A.I., Kharybin A.N., Emneus J., Marko-Varga G., Gorton L. «Flowinjection analysis of phenols at a graphite electrode modified with co-immobilised laccase and tyrosinase» Anal. Chim. Acta 1995. V. 308, № 1-3, P. 137-144.

309. Yaropolov A.I., Kharybin A.N., Emneus J., Marko-Varga G., Gorton L. «Electrochemical properties of some copper-containing oxidases» Bioelectrochem. Bioenerg. 1996. V. 40, № 1, P. 49-57

310. Yaver D.S., Xu F., Golightly E.J., Brown K.M., Brown S.H., Rey M.W.,

311. Schneider P., Halkier Т., Mondorf K., Dalboge H. «Purification, characterization, molecular cloning, and expression of two laccase genes from the white rot basidiomycete Trametes villosa» Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62, №3, P. 834-841

312. Yaver D.S., Overjero M.D.C., Xu F., Nelson B.A., Brown K.M., Halkier Т.,

313. Bernauer S., Brown S.H., Kauppinen S. «Molecular Characterization of Laccase Genes from the Basidiomycete Coprinus cinereus and Heterologous Expression of the Laccase Lccl» Appl. Environ Microbiol. 1999. V. 65, № 11, P. 4943-4948.

314. Yoshitake A., Katayama Y., Nakamura M., Iimura Y., Kawai S., Morohoshi N.

315. N-Linked carbohydrate chains protect laccase-III from proteolysis in Corio-lus versicolor» J. Gen. Microbiol. 1993. V. 139, P. 179-185

316. Zhang W. & Li G. «Third-generation biosensors based on the direct electrontransfer of proteins» Analyt. Sci. 2004. V. 20, №. 4, P. 603-609

317. Zhao J. and H. S. Kwan «Characterization, molecular cloning, and differentialexpression analysis of laccase genes from the edible mushroom Lentinula edodes» Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65, № 11, P. 4908-4913.

318. Zherdev A., Bizova N., Yaropolov A., Lyubimova N., Morozova 0., Dzantiev

319. B. «Laccase from Coriolm hirsutus as alternate label for enzyme immunoassay: determination of pesticide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid» Appl. Biochem. Biotechnol. 1999. V. 76, № 3, P. 203-216

320. Zille A., Munteanu F.-D., Giibitz G.M., Cavaco-Paulo A. «Laccase kinetics ofdegradation and coupling reactions» J. Mol. Catal. B: Enzym. 2005. V. 33, № 1-2, P. 23-28

321. Работа выполнена при поддержке Государственного контракта № 02.467.11 3004, а также грантов РФФИ № 03-04-48937 и INCO-Copernicus № 1СА2-СТ-2000-10050

Информация о работе

Морозова, Ольга Владимировна
кандидата химических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Лакказы базидиальных грибов, лакказа-медиаторные системы и возможности их использования - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы