Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Деградация атразина по механизму окислительного связывания, катализируемого грибной лакказой

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Деградация атразина по механизму окислительного связывания, катализируемого грибной лакказой"

ООЗОБ9758

ДАВИДЧИК Валентина Николаевна

ДЕГРАДАЦИЯ АТРАЗИНА ПО МЕХАНИЗМУ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СВЯЗЫВАНИЯ, КАТАЛИЗИРУЕМОГО ГРИБНОЙ ЛАККАЗОЙ

Специальность 03 00 04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 ?.'ДП 2007

Москва - 2007

003059758

Работа выполнена в группе «Ферментативные основы биодеградации» Института биохимии им А Н Баха РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук О.В. Королева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.Б. Градова доктор биологических наук, профессор О.Л. Озерецковская

Ведущая организация:

ГНУ Почвенный институт им В В Докучаева Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится «29» мая 2007 г в «11 00» на заседании Диссертационного совета К 002 247 01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им АН Баха РАН по адресу 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп 2

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп 1

Автореферат разослан <_» апреля 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

А Ф Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы В связи с возрастающим загрязнением окружающей среды в целом и земельных ресурсов в частности, остро стоит вопрос создания эффективных биотехнологий для детоксификации загрязненных почв Одной из доминирующих групп ксенобиотиков в почвах являются гербициды, широко применяемые для контротя численности сорной растительности Однако неправильное использование гербицидов (превышение доз внесения, нарушение схем применения и др) часто приводит к негативным последствиям загрязнению сельскохозяйственной продукции, почв, грунтовых и поверхностных вод

Наиболее опасным с точки зрения функционирования биогеоценозов является загрязнение высокоустойчивыми гербицидами, одним из наиболее распространенных представителей которых является сим-триазиновый гербицид атразин Согласно литературным данным, основным фактором, определяющим накопление атразина в почвенном профиле и уровень проявляемой им токсичности, является его связывание с гуминовыми кислотами (ГК) ГК являются основной компонентой органического вещества почвы, где они представлены как в растворенном, так и иммобилизованном на минералах состоянии

Несмотря на то что сорбционные процессы между атразином и компонентами органического вещества хорошо изучены, единого мнения о механизме связывания ГК с этим гербицидом не существует Одной из наиболее распространенных гипотез является связывание по механизму гидрофобного взаимодействия и образование комплексов с переносом заряда При связывании атразина происходит уменьшение его свободной концентрации в почве и, как следствие, снижение токсичности Однако при изменении условий может происходить десорбция гербицида, что приводит к увеличению его мобильности и токсичности

С другой стороны, для ряда ксенобиотиков фенольной и аминной природы показана возможность их необратимого включения в структуру ГК с образованием ковалентных связей по механизму окислительного связывания Для протекания указанного процесса необходимо наличие катализаторов, в качестве которых в почвах выступают оксидоредуктазы различной природы пероксидазы, лакказы и полифенолоксидазы Для атразина возможность окислительного связывания с ГК практически не изучена, а существующие литературные данные противоречивы В

ряде исследований было показано, что внесение пероксидазы не увеличивало адсорбционную способность почв по отношению к атразину, а в некоторых вариантах приводило к снижению последней Влияние других оксидоредуктаз, таких как лакказа, на связывание атразина почвами не изучено Показано, что высшие и низшие грибы участвуют в процессах трансформации атразина Установлено, что одним из таковых ферментов этих процессов является лакказа (n-дифенол кислород оксидоредуктаза, КФ 1 10 3 2)

Отличительными чертами данного фермента являются высокая активность в почве в течение круглого года, широкая субстратная специфичность и высокая термо-и рН-стабильность Кроме того, лакказа является единственной фенолоксидазой, экстрагируемой из почвы в составе ГК Основными продуцентами лакказы в почвах являются грибы «белой гнили», представителем которых является Coriolus hirsutus В настоящее время лакказы и продуцирующие их базидиальные грибы получили широкое применение в биотехнологии как для утилизации лигнинсодержащих отходов, так и рекультивации почв, загрязненных полихлорированными бифенилами (ПХБ), полиядерными ароматическими углеводородами (ПАУ), синтетическими красителями и пестицидами

Это обусловило актуальность и важность проведения исследований, направленных на изучение влияния лакказы на механизмы адсорбции и десорбции атразина Данные исследования позволят не только установить возможность окислительного связывания этого гербицида с ГК при участии лакказы, но и оценить роль фермента в процессе детоксификации ксенобиотиков сим-триазиновой природы, что даст основу биотехнологическим подходам к рекультивации загрязненных территорий

Цель работы Целью работы являлось исследование влияния лакказы на процессы взаимодействия атразина с гуминовыми кислотами в растворенном и иммобилизованном состоянии для установления механизма деградации гербицида т vivo

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

- выделить и охарактеризовать грибную лакказу базидиомицета Coriolus hirsutus,

- провести отбор и характеристику почвенных образцов из различных почвенно-географических зон,

- исследовать взаимодействия, протекающие в гомогенной системе лакказа-атразин-растворенные ГК, включая изучение процессов взаимодействия фермента с гуминовыми кислотами,

- исследовать взаимодействия, протекающие в гетерогенной системе лакказа - атразин - почвенные частицы, включая изучение процессов адсорбции/десорбции атразина и роли фермента в данном процессе,

- оценить возможность детоксификации почвы, загрязненной атразином, с помощью системы лакказа-ГК

Научная новизна Впервые проведено комплексное исследование трансформации атразина в системе почва-растение-вода и предложен механизм его взаимодействия с компонентами исследованной системы Установлено, что взаимодействие лакказы с основным компонентом органического вещества - ГК -имеет сложный характер и включает процессы стабилизации фермента с образованием комплексов лакказа-ГК, трансформацию ГК и частичную их деградацию Впервые показано, что для ковалентного связывания атразина ГК по механизму окислительного связывания, катализируемого лакказой, необходимо присутствие в системе также редокс-медиаторов лакказы Впервые проведено систематическое исследование адсорбционного поведения гербицида атразина в непрерывном зональном ряду «дерново-подзолистые почвы - серые лесные почвы -черноземы» в присутствии и в отсутствии лакказы, установлено, что внесение лакказы приводит к значительному увеличению константы связывания атразина в изученных почвах Таким образом, внесение лакказы (или присутствие фермента в природных системах) приводит к необратимой адсорбции атразина почвами Установлено, что в модельной системе растения - растворенные ГК - лакказа -атразин - почва процесс детоксификации атразина проходит по механизму окислительного связывания, причем почва является источником редокс-медиаторов фермента

Практическая значимость работы Полученные данные могут быть использованы для разработки систем биоремедиации почв, загрязненных ксенобиотиками Исследование детоксифицирующего потенциала ГК показало

значительную эффективность их использования в качестве адсорбентов Полученные данные о биологической активности ГК и их детоксифицирующей способности позволили разработать подходы к созданию нового типа биоудобрений

Апробация работы. Отдельные части работы были представлены на конференции «XII International Meeting of International Humic Substances Society» (Sao-Pedro, Brazil, 2004), на 2-м Московском международном конгрессе по биотехнологии «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), на 4-м съезде Докучаевского общества почвоведов «Почвы - национальное достояние России» (Новосибирск, 2004), на 10th Nordic IHSS Symposium «Roles of Humic Substances ín Nordic Environment» (Riga, Latvia, 2005), на III Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере» (Санкт-Петербург, 2005), на International conference «Biocatalysis - 2005 fundamentáis and apphcations» (St Petersburg, Russian Federation, 2005)

Публикации По материалам работы опубликовано 2 статьи и 7 тезисов докладов

Структура диссертационной работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на 139 страницах Список цитируемой литературы включает 135 наименований Иллюстративный материал содержит 20 рисунков и 8 таблиц

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика основных компонентов исследованных систем: лакказы, гуминовых кислот и почв различных почвенно-географическнх зон

Выделение и характеристика лакказы из Coriolus hirsutus

Лакказа (КФ 1 10 3 2) была выделена из культуральной жидкости штамма Coriolus hirsutus Выделение и очистку внеклеточной лакказы из культуральной жидкости базидиомицета, выращенного в условиях глубинного культивирования, проводили по разработанной ранее методике, включающей осаждение 90% сульфатом аммония, очистку методом ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl 650М с последующей рехроматографией на том же носителе

Было установлено, что полученный ферментный препарат содержал два изофермента лакказы изоферменты А и В При этом изоформа А была доминирующей и составляла около 90% Так как изоформа В присутствовала в исследуемом ферментном препарате в незначительных количествах, мы проводили дальнейшие исследования на изоформах А Гомогенность полученного препарата изоформы А контролировали с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия Исследование рН оптимума проводили в диапазон рН от 3 0 до 7 0 в универсальной буферной системе с интервалом рН 0 5 В качестве субстратов фермента использовали 2,2-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) (АБТС) рН 3 0, сирингалдазин и 1-гидроксибензотриазол (ГБТ) (в дальнейшей работе данные соединения были использованы в качестве редокс-медиаторов лакказы) Полученные данные показали, что рН-оптимум был в области от 4 4 до 4 6 и не отличался для двух изоформ фермента (разброс рН-оптимума) Поэтому нами значение рН-оптимума было принято равным 4 5

Выделение и характеристика препарата гуминовых кислот В работе использовали препарат ГК угля, полученный из коммерческого препарата гумата угля Ро\у1штиз (НшштесИ ОшЬН, Германия) Перед использованием препарат гумата переводили в Н+-форму путем равновесного диализа с использованием мембран с пределом пропускания 3 кД Полученный препарат ГК угля был охарактеризован методами элементного анализа, эксклюзионной хроматографии и 13С ЯМР спектроскопии (табл 1)

Таблица 1

Элементный состав, молекулярная масса (ММ) и распределение углерода по основным структурным фрагментам в использованном в работе препарате ГК угля Атомные отношения Содержание углерода в основных

(на сухую беззольную навеску) ММ, кД структурных фрагментах, %

Н/С О/С С/М ЯСс-о 2Ссоо 2САг 2Ст

0 87 0 50 53 94 5 7 190 627 125

Полученные характеристики ГК угля были типичными для аналогичных препаратов

Характеристику биологической активности оценивали стандартным биотестом, основанным на стимуляции роста колеоптилей (ауксиноподобная активность) Проведенное исследование ауксиноподобной активности показало, что при низких

концентрациях ГК (<20 мг/л) происходит активация роста колеоптилей, а при дальнейшем повышении концентрации (до 100 мг/л) стимулирующая активность ГК снижалась, и значимого отличия прироста длины колеоптилей от контроля не наблюдали Это свидетельствует о том, что биологическая активность ГК не отличается от таковой у аналогичных препаратов

Отбор и характеристика почвенных образцов

Для проведения исследований использовали почвы, отличающиеся по физико-химическим свойствам и содержанию органического вещества С этой целью отбор почвенных образцов производили в различных почвенно-географических зонах в Московской области были отобраны образцы дерново-подзолистой почвы, в Тульской - серой лесной почвы, в Курской — чернозема Пробоотбор производили из верхнего гумусо-аккумулятивного горизонта в слое 0-5 см Образцы почв характеризовали по следующим химическим и физическим свойствам рНВод, содержание обменных форм Са, Mg и К, общее содержание органического углерода С0рг (табл 2), гранулометрический состав (ГМС) (табл 3)

Таблица 2

Некоторые физико-химические характеристики исследованных почв_

Химические характеристики Дерново-подзолистая Серая лесная Чернозем

рНвод 47 68 68

Сорп % 3 7 20 5 8

Обменный Са, ммоль экв/100г 3 1 107 30 7

Обменный Mg ммоль экв/100 г 1 2 86 69

Обменный К ммоль экв/100 г 03 05 05

Гранулометрический состав (ГМС) исследованных почв Таблица 3

Содержание гранулометрических фракций (мм), %

Почва 1 000 25 0 25 -0 05 0 05 -0 01 0010 005 0 0050 001 <0 001

Дерново-подзолистая 66 26 3 47 5 84 79 33

Серая лесная 02 12 5 51 5 9 1 112 155

Чернозем 09 157 43 4 77 11 1 21 2

Из приведенных данных видно, что из исследованных почв дерново-подзолистая почва характеризуется наибольшим уровнем кислотности почвенного

раствора Для чернозема и серой лесной почвы рН водной вытяжки были приближены к нейтральному значению Для чернозема характерно более высокое содержание С0гг (5 8%), по сравнению с дерново-подзолистой и серой лесной почвами

Наиболее высокое содержание обменных форм Са и Mg было отмечено для чернозема и серой лесной почвы, наименьшее - для дерново-подзолистой почвы, что связано с высоким уровнем кислотности почвенного раствора

Значительный интерес с точки зрения связывания ксенобиотиков представляет содержание илистой фракции (<0 001 мм) в почве, т к она имеет максимальную площадь поверхности и, следовательно, обеспечивает высокую поглотительную способность почвы По уменьшению этого показателя образцы исследованных почв можно расположить в ряд чернозем > серая лесная > дерново-подзолистая (табл 3)

Ферментативной активности в отобранных образцах почв после их пробоподготовки и хранения обнаружено не было, что позволило корректно интерпретировать данные по влиянию лакказы на адсорбционно-десорбционное поведение атразина в гетерогенной модельной системе

Влияние лакказы СопоЫъ ИтМия на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами в гомогенной среде Первым этапом данной работы являлось изучение влияния лакказы С ЬгзШш на процесс взаимодействия атразина с ГК в гомогенной системе Взаимодействие лакказы с гуминовыми кислотами

Взаимодействие лакказы с ГК изучали при двух значениях рН 5 0 (оптимальное значение для проявления активности и стабильности фермента) и 6 5 (неоптимальное значение, которое можно рассматривать как стрессовый фактор для фермента) в течение 72 ч инкубации Эксперименты проводили в 50 мМ калий-фосфатном буфере при концентрации ГК 40 мг/л В процессе проведения периодически отбирали пробы на анализ лакказной активности, содержание белка и гель-хроматографический анализ, что позволило наблюдать за изменениями, происходящими в изучаемых системах

Как видно из графиков, представленных на рис 1, активность лакказы в изучаемой системе в начальный момент инкубации при рН 5 0 была в 1 6 раз больше, чем при рН 6 5 Это согласуется с ранее полученными данными по

изучению рН зависимости лакказы Сопо/ия /гггте/ги в универсальном буфере Так как в предварительных экспериментах при инкубации лакказы в течение 72 ч при 27°С наблюдали снижение активности фермента, обусловленное его микробиологическим разложением, то при проведении дальнейших экспериментов в растворы добавляли толуол (10%) в качестве бактериостатического агента Внесение толуола, однако, приводило к ингибированию лакказной активности на 70 и 50% при рН 5 0 и 6 5, соответственно Описанный факт связан, вероятно, с влиянием органического растворителя толуола на конформацию белковой глобулы лакказы Различия в оптических спектрах растворов нативной лакказы и фермента в присутствии толуола было, тем не менее, незначительным Это может объясняться влиянием толуола только на ближайшее окружение активного центра фермента

Активность фермента в системе толуол-ГК возрастала по сравнению с активностью лакказы при добавлении толуола как при рН 5 0, так и при рН 6 5 При этом указанное действие ПС в стрессовых для фермента условиях (рН 6 5) было более выражено активность лакказы при внесении ГК возрастала до исходных величин Можно предположить, что ГК образуют мицеллоподобные структуры, способствующие повышению активности лакказы

а

б

Активность лакказы, % от исходной

Активность лакказы, % от исходной

90 -

90 -

60 -

60 -

30 -

30 -

о

о

Лакказа Лакказа Лакказа + толуол + толуол + ГК

Лакказа Лакказа Лакказа + толуол + толуол + ГК

Рисунок 1 Активность лакказы в присутствии толуола и ГК при рН 5 0 (а) и рН 6 5 (б) За 100 % принимали активность фермента при рН 5 0

На рис 2 показана динамика лакказной активности в присутствии ГК и толуола Повышение активности фермента в первые часы инкубации характерно практически для всех грибных лакказ Для лакказы активация наблюдалась в течение 1-3 ч при обоих значениях рН Однако в присутствии ГК пик активности был сдвинут, и максимум соответствовал 12 ч инкубации Это позволило нам предположить изменение в структуре лакказы в присутствии ГК, вызванное образованием комплекса с ферментом Следует подчеркнуть, что наблюдаемые эффекты происходили и при рН 5 0, и при рН 6 5 При этом более значительная стабилизация фермента наблюдалась при рН 6 5 83% сохранения активности по сравнению с 55% при рН 5 0 Содержание белка в процессе экспериментов было постоянным Таким образом, эффект стабилизации фермента ГК в присутствии толуола более выражен при неблагоприятных (неоптимальных) условиях для проявления ферментативной активности, в данном случае сдвиг рН Это согласуется с литературными данными о проявлении биологических эффектов ГК именно при стрессовых и неблагоприятных для биоты условиях а б

Активность лакказы, % от начальной 150 •

130 •

110 •

90 -

70 -

50

30

Активность лакказы, % от начальной 150 -

20 40 60 Время инкубации, ч

80

20 40 60 Время инкубации, ч

Рисунок 2 Динамика лакказной активности в процессе инкубации с ГК (•) в присутствии толуола при рН 5 0 (а) и рН 6 5 (б) Контроль - динамика ферментативной активности в отсутствии ГК (0)

Полученные данные свидетельствуют об образовании комплекса лакказы с ГК,

что приводит к стабилизации фермента в течение по крайней мере 72 ч

(продолжительность эксперимента) Высказанное предположение подтверждается также полученными данными по гель-хроматографии исследуемых смесей

На рис 3 представлены хроматограммы гомогенного препарата лакказы (сплошная линия) и ГК (пунктирная линия), на которых четко видны острые симметричные одиночные пики, что свидетельствует об отсутствие неэксклюзионных эффектов сверхэксклюзии и специфической сорбции Элюционный объем для ГК составлял 45 4 мл (ММ= 9 6 кД), а для лакказы 38 4 мл {ММ= 21 9 кД) Заниженное значение ММ лакказы, определенное в условиях данного эксперимента, обусловлено использованием в качестве калибровочных стандартов не глобулярных белков, а полистирол-сульфонатов, наиболее адекватно описывающих хроматографическое поведение ГК При этом изменения элюционных профилей ГК и лакказы через 72 ч не наблюдалось, что демонстрирует стабильность исследуемых веществ в течение всего эксперимента

а б

А254 А254

V, мл V, мл

Рисунок 3 Гель-хроматограммы лакказы (сплошная линия) и ГК (пунктирная линия) при рН 5 0 (а) и рН 6 5 (б)

Гель-хроматограммы системы лакказа-ГК имели более сложный характер

(рис 4) На профиле элюции кроме первого острого пика наблюдали 2-3

дополнительных диффузных пика

Как видно из графиков, представленных на рис 4, эти профили не могут быть

рассмотрены как суперпозиции профилей отдельных компонентов, т е ГК и лакказы

(рис 3) Кроме того, наряду с пиками, соответствующими ГК (45 4 мл) и лакказе

(38 4 мл), было отмечено появление пика, элюировавшегося в объеме 19 7 мл (свободный объем колонки по голубому декстрану в данных экспериментальных условиях составлял 19 2 мл) Так как в условиях эксперимента исключены неэксклюзивные эффекты, данный пик можно интерпретировать как образующееся высокомолекулярное соединение или комплекс фермента с ГК

а б

Рисунок 4 Гель-хроматограммы системы лакказа-ГК при рН 5 0 (а) и рН 6 5 (б), через 0 ч (сплошная линия), 72 ч (пунктирная) совместной инкубации

Кроме пика на 19 7 мл было показано также образование веществ с ММ 18 8 и

40 9 кД (объем элюента 39 6 и 32 3 мл) как при рН 5 0, так и при рН 6 5 Наличие

новых пиков на представленных хроматограммах позволяет предположить не только

формирование комплекса фермента с ГК, но и прямое взаимодействие лакказы с

ними, которое приводит к полимеризации последних (лакказа-инициированная

полимеризация)

Чтобы подтвердить высказанное предположение об образовании комплекса лакказа-ГК, нами была исследована ферментативная активность фракций, полученных при гель-хроматографическом анализе Так как характер гель-хроматограмм по профилю ферментативной активности не изменялся, на рис 5 приведена только типичная хроматограмма после 24 ч инкубирования

Полученные результаты показали, что наибольший пик ферментативной активности совпадал с пиком появившейся высокомолекулярной фракции При этом данная фракция содержала более 80% общей лакказной активности

фракционируемого образа. Это свидетельствует об образовании ферме] 1тативно активного комплекса лакказа-Щ в изучаемых условиях.

О 20 40 60 80

V, мл

Рисунок 5. Ге л ь-хромато граммы системы лакказа-ГК с УФ-детекцией (сплошная линия) и детекцией по активности лакказы (пунктирная линия) при совместной инкубации при pH 5.0 н течение 24 ч.

Для исследования природы образующегося комплекса был использован метод

иЗоэ лексического фокусирования (ИЭФ) в i юл иакри лам идиом геле (ПААГ) с

окрашиванием белка Coomassie Blue R-25Q, Образование комплекса должно было

привести к изменению изоэлектрической точки (pi) лакказы, что должно было

отразиться на поведении фермента в условиях ИЭФ.

а 6

123 4 5 6123 456

Рисунок6. Изоэлектрофореграммы системы лакказа-ГК и ее отдельных компонентов в процессе инкубации при р! I 5.0 (а) и рН 6.5 (б). I - ГК; 2, 3 -лакказа после 0 и 168 ч инкубации; 4, 5, 6 - система лакказа-ГК после 0, 72 и 168 я инкубации.

Как видно из представленных электрофореграмм (рис 6), поведение лакказы не менялось в ходе проведения эксперимента и не зависило от присутствия ГК в растворе Полученные результаты демонстрируют нестабильность образующегося комплекса лакказа-ГК в условиях ИЭФ, что свидетельствует о его нековалентной природе

Таким образом, при изучении системы лакказа-ГК установлена сложная природа их взаимодействия Показано прямое взаимодействие фермента с ГК, приводящее к лакказа-инициированной полимеризации ГК и образованию компонентов более высокой молекулярной массы Кроме того, установлено формирование комплекса лакказа-ГК с нековалентной природой связи На основании полученных данных можно предположить, что в формировании комплекса участвуют силы ван-дер Ваальса, гидрофобные, п-п и СН-я взаимодействия Взаимодействие лакказы Coriolus hirsutus с атразинои

Исследование взаимодействия лакказы С hirsutus с атразином проводили путем их инкубирования в 50 мМ калий-фосфатном буфере при pH 5 в течение 72 ч при 27°С Изменения концентрации атразина в реакционной смеси определяли с использованием метода твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) (ELISA) Начальные концентрации атразина и лакказы в реакционной смеси составляли 5 мг/л и 0 05 мг/мл, соответственно В процессе инкубации изменения концентрации атразина в системе не наблюдалось

Влияние лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами Исследование взаимодействия атразина с ГК проводили при внесении ГК в концентрации 40 мг/л и атразина 5 мг/л

На первом этапе исследования изучали взаимодействия атразина с ГК без внесения лакказы

Как показали эксперименты, в присутствии ГК происходит уменьшение концентрации атразина в растворе через сутки на 10%, а через 7 - на 60 % (рис 7) Очевидно, это отражает процесс адсорбции ксенобиотика на ГК Убыли атразина при инкубации его в системе, содержащей лакказа-ГК, не наблюдалось По-видимому, взаимодействие ГК с ферментом, приводящее к образованию комплекса и модификации ГК, подавляет адсорбцию ксенобиотика Таким образом, проведенные эксперименты свидетельствуют о том, что лакказа не инициирует процесс окислительного связывания атразина ГК, а, наоборот, препятствует адсорбции гербицида Поэтому следующим этапом нашей работы стало исследование процессов,

происходящих в системе лакказа-атразин-ГК с добавлением редокс-медиаторов фермента

Общепринятым считается, что необходимым (однако не всегда достаточным) условием использования химического соединения в качестве редокс-медиатора лакказ является его способность окисляться ферментом в присутствии кислорода воздуха, т е соединение фактически должно быть субстратом фермента Кроме того, одним из ключевых параметров является способность редокс-медиатора существовать в устойчивой высоко реакционно-способной форме значительный временной промежуток В качестве субстратов лакказы для исследования возможности использования их как редокс-медиаторов были выбраны сирингалдазин, ГБТ и АБТС

Ранее было показано, что ГБТ и АБТС могут быть использованы в качестве редокс-медиаторов фермента в различных системах детоксификации и делигнификации Редокс-медиаторные свойства сирингалдазина были исследованы впервые Сирингалдазин, ГБТ и АБТС были исследованы в качестве медиаторов лакказы в системе, содержащей ГК и атразин Существенная убыль атразина наблюдалась только при использовании в качестве редокс-медиатора ГБТ (рис 7) Через сутки в растворе обнаруживали 50%, через 7 — 30% от его начальной концентрации В остальных случаях - при использовании в качестве редокс-медиаторов АБТС и сирингалдазина - концентрация атразина снижалась незначительно

Концентрация атразина, % от начальной

120 и

О А-1-,-1-1-1-,-,-,

012345678 Время инкубации, сут

Рисунок 7 Динамика убыли атразина в присутствии ГК (•), системы лакказа-ГК (х), лакказа-ГК-ГБТ (0)

Наблюдаемый факт можно объяснить тем, что при использовании АБТС и сирингалдазина происходит взаимодействие образующихся высоко реакционно-способных продуктов и самих соединений с ГК, приводящее к адсорбции как данных соединений, так и их высоко реакционно-способных продуктов на ГК

Таким образом, процесс взаимодействия атразина с ГК в присутствии лакказы в значительной степени определяется свойствами используемых редокс-медиаторов Влияние лакказы Сопо1т 1иг.$Ши.ч на взаимодействие атразина с гуминовымн кислотами в гетерогенной среде Для изучения взаимодействия атразина с ГК в гетерогенной среде эксперименты проводили на почвенных образцах (табл 2 и 3) Все отобранные почвы характеризовались относительно высоким содержанием органического углерода (>1%), что свидетельствовало об отсутствии в них открытых минеральных поверхностей Поэтому почвенные образцы в данной работе рассматривали как ГК, иммобилизованные на минеральной подложке Кроме того, проведенные анализы показали отсутствие в образцах ферментативной активности Это позволило нам предполагать, что ферментативная активность в системе обусловлена только вносимой лакказой

Влияние лакказы Сопо1т ЫгвиШ на процессы адсорбции и десорбции атразина на почвах

Влияние лакказы С ЫпиШэ на взаимодействие атразина с различными почвами изучали путем сравнения адсорбции и десорбции гербицида в отсутствии и присутствии фермента

На рис 8 представлены адсорбционно-десорбционные изотермы атразина на различных типах почв в отсутствии и присутствии лакказы С ИтШия Было установлено, что при десорбции атразина в вариантах с начальной концентрацией гербицида 3 мг/л определяемые концентрации были близки к нижнему пределу обнаружения (0 5 мг/л методом ВЭЖХ), что затрудняет интерпретацию получаемых данных Поэтому в работе приведены результаты десорбции атразина только для вариантов с начальными концентрациями 5, 8 и 10 мг/л (табл 4)

Полученные изотермы адсорбции при внесении фермента отличались от изотерм в отсутствии последнего (рис 8) На графиках видно, что в вариантах без внесения лакказы форма изотерм была близка к линейной В присутствии фермента форма изотерм менялась в начале наблюдали резкое увеличение количества

адсорбированного атразина при росте его равновесной концентрации, затем интенсивность адсорбции снижалась Сложный характер адсорбционных изотерм в данном случае свидетельствует, по-видимому, о наличии различных механизмов связывания гербицида почвами

Форма изотерм десорбции (рис 8) указывает на гистерезис процесса адсорбции гербицида почвами и свидетельствует о частичной обратимости адсорбции атразина как в вариантах без внесения лакказы, так и в присутствии фермента Однако количество необратимо адсорбированного гербицида в вариантах с внесением фермента превышало таковое в вариантах без лакказы Это указывает на увеличение силы связывания атразина при внесении лакказы

Для численной характеристики процессов адсорбции и десорбции полученные изотермы аппроксимировали уравнением Фрейндлиха, часто используемым при описании взаимодействий ксенобиотиков с почвой

АтразинЯ1ы)|)Г) = Кг [Атразин]'*>~ (1)

где АтразинадСорб - количество адсорбированного гербицида при его равновесной концентрации [Атразин], А"/ - константа адсорбции Фрейндлиха, Пр ~ показатель степени нелинейности изотермы

Численное описание гистерезиса проводили с использованием коэффициента гистерезиса Н

Н = пРа/пм (2)

где «/-я и пм - степенные коэффициенты изотерм адсорбции и десорбции в уравнении Фрейндлиха, соответственно

Рассчитанные коэффициенты уравнения Фрейндлиха приведены в табл 4 Константы адсорбции Фрейндлиха (Кр) для изученных почв в вариантах без лакказы варьировались в диапазоне 0 81-5 55 (табл 4), что хорошо согласуется с данными других авторов Максимальное значение этого показателя было зафиксировано для чернозема, что связано, по-видимому, с самым высоким содержанием С0рг в этой почве (табл 2)

Внесение лакказы приводило к резкому возрастанию адсорбции атразина (табл 4) Константы адсорбции Фрейндлиха для исследованных почв возрастали до 3 13-6 79, превышая аналогичные значения для адсорбции без лакказы Максимальное увеличение констант было отмечено для серой лесной почвы Для чернозема и дерново-подзолистой почвы увеличение Кг было менее выражено

Дерново-подзолистая почва

Атразинадсорб. мг/кг

50 40 30 ■ 20 • 10 ■ о

Атразинадсорб, мг/кг

50 -1

40 -30 -20 • 100

О 5

1 5

Серая лесная почва

Атразинадсорб, мг/кг 50

Атразинадсорб, мг/кг 50-1

Атразинадсорб, мг/кг

50

[Атразин], мг/л

[Атразин], мг/л

Рисунок 8 Изотермы адсорбции (•) и десорбции (о) атразина при начальной концентрации 10 мг/л на различных типах почв в отсутствии (а) и присутствии (б) лакказы

Было установлено, что в вариантах без внесения лакказы (табл 4) для чернозема и дерново-подзолистой почвы значения пг незначительно отличались от 1, что свидетельствует о близком к линейному характеру изотерм При внесении

лакказы наблюдали снижение значений этого показателя до 0 56-0 66 (табл 4) Это свидетельствует о том, что процесс адсорбции атразина почвами в присутствии фермента носил более сложный характер, чем простое распределение гербицида между двумя фазами Исключение составила серая лесная почва, для которой пр не менялся

Таблица 4

Параметры уравнения Фрейндлиха и коэффициенты гистерезиса адсорбционно-десорбционных изотерм для различных почв в присутствии и отсутствии лакказы

Адсорбция

Десорбция

Почва

Кг

Пг

Сатр, мг/л

Кг

щ

Н

о ш

0

1 а.

и

§ х

о и ч

о а о,

и

В отсутствии лакказы

5 0 24±0 01 0 22±0 01 0 85 3 3±0 2 4 50±0 20 0 72±0 03 0 93 8 0 30±0 02 0 25±0 01 0 90 2 9±0 2

10 0 57±0 03 0 27±0 02 0 88 2 7±0 1

5 0 10±0 01 0 11±0 01 0 90 5 1±0 2 0 81±0 04 0 56±0 03 0 97 8 0 10±0 01 0 13±0 01 0 90 4 3±0 2

10 1 68±0 08 0 52±0 03 0 94 1 1±0 1

5 0 15±0 01 0 17±0 01 0 99 4 9±0 2 5 55±0 30 0 83±0 04 0 98 8 0 29±0 01 0 22±0 01 0 88 3 8±0 2

10 0 3б±0 02 0 23±0 01 0 89 3 6±0 2

о

Си К

сс

§

о.

и О

о я а.

В присутствии лакказы

5 0 23±0 01 0 150±0 007 0 85 4 0±0 2 5 80±0 29 0 60±0 03 0 70 8 0 31±0 02 0 140±0 007 0 98 4 3±0 2

10 0 36±0 02 0 130±0 007 0 92 4 6±0 2

5 0 11±0 01 0 030±0 001 0 85 18 7±0 9 3 13±0 15 0 56±0 03 0 99 8 0 15±0 01 0 029±0 001 0 75 18 7±0 9

10 0 20±0 01 0 029±0 001 0 77 19 3±0 9

5 0 16±0 01 0 064±0 005 0 88 10 3±0 3 6 79±0 34 0 66±0 03 0 86 8 0 19±0 01 0 062±0 004 0 69 10 6±0 4

10 0 22±0 01 0 060±0 003 0 68 11 0±0 5

Расчет коэффициентов гистерезиса для вариантов без внесения лакказы показал, что характер десорбции атразина был сходным для всех исследованных почв С увеличением начальной концентрации атразина наблюдали снижение значений коэффициентов гистерезиса Н при одновременном росте К¡, свидетельствующее об усилении процесса десорбции в вариантах с высокими начальными концентрациями гербицида (табл 4) По-видимому, это связано с неоднородностью мест адсорбции атразина на почвах Можно предположить, что при небольших начальных концентрациях атразин занимает места с наибольшей силой связывания, а при дальнейшем увеличении начальной концентрации происходит связывание гербицида с местами, характеризующимися меньшим сродством по отношению к атразину Поэтому десорбция гербицида в вариантах с максимальными начальными концентрациями более выражена

В вариантах с внесением лакказы для всех почв было установлено, что значения Н значительно превышали 1 во всех исследованных концентрациях атразина Это свидетельствует о частичной обратимости адсорбции и образовании необратимо связанного гербицида Исключение составила серая лесная почва, где при максимальной исследованной начальной концентрации (10 мг/л) наблюдали лишь незначительный гистерезис (Н~ 1 1) Близость величины гистерезиса к 1 указывает на то, что практически весь адсорбированный атразин легко десорбировался с серой лесной почвы при данной концентрации атразина

Аномальное поведение серой лесной почвы объясняется, по-видимому, характером органического вещества в этой почве Образец серой лесной почвы характеризовался значительным количеством малоразложившейся биомассы и гуминовых веществ, обедненных ароматическими структурами по сравнению с другими почвами Принимая во внимание, что гидрофобное взаимодействие является ведущим механизмом связывания атразина гуминовыми веществами, можно предположить, что именно относительная обедненность органического вещества серой лесной почвы ароматическими структурами является причиной практически полной обратимости адсорбции атразина этой почвой при максимальной начальной концентрации атразина

Внесение лакказы способствовало резкому снижению количества десорбированного атразина Увеличение коэффициента гистерезиса наблюдалось для

всех исследованных начальных концентраций атразина (табл 4) Величины гистерезиса для исследованных почв составили 4 0-28 0, что превышало значения Н для адсорбции-десорбции без фермента в 2-27 раз Максимальное влияние на увеличение Н наблюдали на серой лесной почве при вносимой концентрации атразина 10 мг/л

Однако, в отличие от вариантов без фермента, было обнаружено, что начальная концентрация не влияла на величину коэффициента гистерезиса Это свидетельствует, по-видимому, о том, что связывание гербицида происходит не только по механизмам физической адсорбции, а, главным образом, путем включения гербицида в структуру ГК по механизму окислительного связывания Высказанную гипотезу подтверждает также тот факт, что в ходе проведения экспериментов нами не было установлено образования метаболитов атразина, те процесс разложения гербицида отсутствовал Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности ковалентного связывания атразина с ГК почв при участии лакказы в качестве катализатора

Основываясь на проведенных экспериментах, можно сделать вывод, что внесение лакказы способствует увеличению связывающей способности почв по отношению к гербициду атразину При этом в присутствии фермента связывание атразина почвами происходит, вероятно, по механизму окислительного связывания, о чем свидетельствует анализ характера изотерм адсорбции и десорбции, а так же увеличение количества необратимо связанного гербицида Таким образом, взаимодействие атразина с почвами в присутствии лакказы можно рассматривать как механизм детоксификации этого гербицида в окружающей среде

Оценка возможности использования лакказы СогШт ¡игяиыь в биотехнологиях очистки почв, загрязненных атразином Полученные нами результаты экспериментов по адсорбции и десорбции атразина почвами в присутствии и отсутствии лакказы свидетельствуют о возможности окислительного связывания атразина с почвенным органическим веществом по механизму окислительного связывания при участии лакказы, при этом необходимые для протекания этого процесса редокс-медиаторы присутствуют, по-видимому, непосредственно в почве Для подтверждения этих предположений и оценки возможности использования лакказы в биотехнологиях очистки почв,

загрязненных атразином, нами были проведены лабораторные вегетационные эксперименты с использованием в качестве субстрата инертного наполнителя перлита и дерново-подзолистой почвы В первом случае мы моделировали условия деградации атразина в присутствии фермента и ГК, но при отсутствии редокс-медиаторов, а во втором — почвенные условия, где присутствуют многочисленные низкомолекулярные соединения, которые могут выступать в качестве редокс-медиаторов лакказы Атразин вносили в дозе 0 2мг/100мл субстрата (20 и 2 мг/кг субстрата в экспериментах с перлитом и почвой, соответственно) Это вызывало снижение биомассы растений пшеницы до 45 и 64% от контроля Доза внесения ГК угля составила 10 и 100 мг/кг субстрата В качестве тест-организма использовали растения мягкой пшеницы ТгШсит аевШит Ь

Нами было установлено, что внесение ГК угля в дозах 10 и 100 мг/кг в перлит значительно снижало токсичность атразина биомасса растений возрастала с 45 до 77% от контроля (рис 9) Наблюдаемый эффект объясняется связыванием атразина ГК, показанный нами ранее (рис 7) Внесение лакказы приводило к снижению детоксифицирующей способности ГК, что связано, по-видимому, с образованием комплексов лакказа-ГК и изменениями свойств ГК в присутствии фермента, такими как полимеризация или частичный гидролиз, и также подтверждает установленные нами ранее закономерности (рис 7) Таким образом, биотесты с использованием инертного субстрата перлита подтвердили полученные результаты о том, что лакказа непосредственно не инициирует процесс окислительного связывания атразина ГК, а, наоборот, приводит к снижению адсорбции гербицида на ГК

В условиях почвы, напротив, детоксифицирующую способность ГК наблюдали только в дозе 100 мг/кг, тогда как в дозе внесения ГК 10 мг/кг положительного влияния ГК на накопление растениями пшеницы биомассы отмечено не было Однако при внесении лакказы в небольших дозах (0 076 и 0 76 мг/кг) даже на фоне дозы внесения ГК 10 мг/кг наблюдали положительную зависимость детоксифицирующего эффекта ГК при увеличении дозы лакказы Так, при одновременном внесении ГК в дозе 10 мг/кг и лакказы в дозе 0 076 мг/кг биомасса растений возросла до 75% от контроля, а при 7 6 мг/кг - до 81%

Следует отметить, что дальнейшее увеличение дозы внесения лакказы до 7 6 мг/кг на фоне высокой дозы внесения ГК (100 мг/кг) приводило к снижению детоксифицирующего эффекта и не превышало эффекта от внесения ГК угля без фермента, что обусловлено, по-видимому, процессами взаимодействия ГК с лакказой, описанными нами выше

Масса растений, % от контроля 100 -]

- без лакказы

- лакказа, 0 38 мг/кг

- лакказа, 3 8 мг/кг —•—лакказа, 38 мг/кг

О 20 40 60 80 100 Доза внесения ГК угля, мг/кг

Масса растений, % от контроля 100 1

♦ без лакказы 90 Н -о— лакказа, 0 076 мг/кг -О- лакказа, 0 76 мг/кг —•— лакказа, 7 6 мг/кг

О 20 40 60 80 100 Доза внесения ГК угля, мг/кг

Рисунок 9 Влияние лакказы и ГК угля на токсичность атразина в лабораторно-вегетатационных экспериментах на перлите (а) и дерново-подзолистой почве (б)

Таким образом, проведенные лабораторно-вегетационные эксперименты подтверждают полученные нами ранее результаты и свидетельствуют о возможности детоксификации атразина в почвенных условиях путем его связывания с ГК по механизму окислительного связывания при участии лакказы, при этом необходимые для протекания процесса редокс-медиаторы присутствуют, по-видимому, непосредственно в почве

25

ВЫВОДЫ

1 Установлено формирование ферментативно активного комплекса лакказа-ГК нековалентной природы Высказано предположение об определяющей роли ван-дер-Вальсовых, гидрофобных, п-п и СН-я взаимодействий

2 Показано стабилизирующее действие ГК на ферментативную активность лакказы, установлено, что стабилизирующее действие более выражено при стрессовых (рН 6 5), чем при оптимальных (рН 5 0) для фермента условиях

3 Исследование трансформации атразина в гомогенной системе лакказа-атразин-ГК показало, что лакказа снижала уровень адсорбции гербицида ГК, наблюдаемый эффект связан с процессами модификации ГК образованием их комплексов с лакказой

4 Установлено, что процесс трансформации атразина в гомогенной системе лакказа-атразин-ГК-редокс-медиатор в значительной степени определяется используемым редокс-медиатором, эффективным редокс-медиатором, вызывающим 60% трансформацию гербицида в исследованной системе, является 1-гидроксибензотриазол

5 Изучена трансформация атразина в гетерогенной системе лакказа-атразин-иммобилизованные ГК Показано, что в присутствии фермента связывание атразина почвами происходит по механизму окислительного связывания, о чем свидетельствует анализ изотерм адсорбции и десорбции, а так же увеличение количества необратимо связанного гербицида

6 Проведенные лабораторно-вегетационные эксперименты показали возможность детоксификации атразина в почвенных условиях путем его связывания с ГК по механизму окислительного связывания при участии лакказы, при этом необходимые для протекания процесса редокс-медиаторы присутствуют, по-видимому, непосредственно в почве

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи.

1 Davidcvik V.N , Kuhkova N А , Koroieva О V Laccase stabilization in the presence of coal humic acids Proceedings of the XII Intertional Meeting of the International Humic Substances Society (IHSS) "Humic Substances in Soil and Water Environment", Sao-Pedro, Brazil, July 25-30, 2004, pp 545-546

2 Королева О В, НА Куликова, Т H Алексеева, Е В Степанова, В.Н. Давидчнк, Е Ю Беляева, Е А Цветкова Сравнительная характеристика грибного меланина и гуминоподобных веществ, синтезируемых Сеггепа тахта 0275 Прикладная биохимия и микробиология 2007 г , №1

Тезисы.

1 Давидчик В H, Королева О В, Степанова Е В, Куликова H А Исчезновение атразина в растворе в присутствии ГК угля и лакказы, Материалы 2-го Московского международного конгресса по биотехнологии «Биотехнология состояние и перспективы развития», Москва, 10-14 ноября, 2003, сс 59-60

2 Королева О В, Явметдинов И С, Гаврилова В П, Давидчик В.Н, Степанова Е В Биоремедиация ксенобиотиков базидиомицетами и их лигнолитическими ферментами Материалы 2-го Московского международного конгресса по биотехнологии «Биотехнология состояние и перспективы развития», Москва, 10-14 ноября, 2003, сс 13-14

3 Давидчик В H , Куликова H А , Ландесман Е О , Степанова Е В , Королева О В Адсорбция и десорбция атразина некоторыми почвами Материалы 4-го съезда Докучаевского общества почвоведов «Почвы - национальное достояние России», Новосибирск, 9-13 августа, 2004, с 493

4 Kuhkova N А, Valentina N. Davidehik, Elena V Stepanova, Eugenia A Tsvetkova, Elena YU Belyaeva, Olga V Koroieva Association of laccase with humic acids lOth Nordic IHSS Symposium "Rôles of Humic Substances in Nordic Environment", Riga, Latvia, 1-3 June, 2005, p 44

5 В.Н. Давидчик, H A Куликова, E В Степанова, E A Цветкова, E Ю Беляева, О В Королева «Взаимодействие лакказы с гуминовыми кислотами», III Всероссийская конференция «Гуминовые вещества в биосфере», Санкт-Петербург, 13 марта, 2005, сс 57-58

6 Davidchik V.N , Natalia A Kulikova, Elena V Stepanova, Olga V Koroleva Laecase-mediated transformation of atrazine in the environment International conference Biocatalysis - 2005 fundamentals and applications 19-23 June, St Petersburg, Russian Federation, 2005, p 74

7 Королева О В , Степанова Е В , Голубева JI И, Федорова Т В , Давидчик В.Н., Жердев А В, Куликова Н А Базидиальные грибы — продуценты лигнолитических ферментов и их биотехнологическое применение Материалы 4-го Московского международного конгресса по биотехнологии «Биотехнология состояние и перспективы развития», Москва, 12-16 марта, 2007, с 138

Работа была выполнена при финансовой поддержке

• Российского Фонда фундаментальных исследований (проект №04-04-49679),

• Фонда МНТЦ (проект КР-993 2),

• Федерального агентства по науке и инновациям (государственный контракт №02 467 11 3004)

Заказ № 240/04/07 Подписано в печать 26 04 2007 Тираж 100 экз Уел пл 1,5

^ ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 Г^")1 \v\vw с/г ги, е-тай т/о@с/г ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Давидчик, Валентина Николаевна

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Лакказы: распространение и роль в окружающей среде.

1.1.1. Ферментативная активность почв.

1.1.2. Общая характеристика лакказ как представителей оксидоредуктаз.

1.1.3. Физиологические функции лакказ.

1.1.4. Участие лакказы в процессах трансформации ксенобиотиков гуминовыми кислотами.

1.2. Гуминовые кислоты и их функции в биосфере.

1.2.1. Общая характеристика состава и структуры гуминовых кислот.

1.2.2. Взаимодействие гуминовых кислот с ферментами.

1.2.3. Участие гуминовых кислот в деградации ксенобиотиков.

1.3. Атразин: применение и поведение в окружающей среде.

1.3.1. Общая характеристика и применение атразина.

1.3.2. Поведение атразина в окружающей среде.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Выделение и характеристика лакказы Coriolus hirsutus.

2.1.1. Жидкофазное культивирование Coriolus hirsutus.

2.1.2. Выделение и очистка лакказы Coriolus hirsutus.

2.1.3. Определение активности лакказы.

2.2. Выделение, физико-химическая и биологическая характеристика препарата гуминовых кислот.

2.2.1. Выделение гуминовых кислот угля.

2.2.2. Элементный анализ.

2.2.3. Эксклюзионная хроматография.

2.2.4. ЯМР спектроскопия.

2.2.5. Оценка биологической активности (биотест).

2.3. Отбор и характеристика почвенных образцов.

2.3.1. Отбор почвенных образцов.

2.3.2. Определение кислотности.

2.3.3. Определение содержания органического углерода.

2.3.4. Определение содержания обменных катионов.

2.3.5. Определение гранулометрического состава.

2.4. Определение атразина и его основных метаболитов.

2.5. Исследование влияния лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами в гомогенной среде.

2.5.1. Взаимодействие лакказы с атразином.

2.5.2. Взаимодействие лакказы с гуминовыми кислотами.

2.5.3. Влияние лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами.

2.6. Изучение влияния лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами в гетерогенной среде.

2.6.1. Изучение кинетики адсорбции атразина почвами.

2.6.2. Влияние лакказы на взаимодействие атразина с почвами.

2.7 Проведение лабораторно-вегетационных экспериментов.

2.7.1. Проведение лабораторно-вегетационных экспериментов на перлите.

2.7.2. Проведение лабораторно-вегетационных экспериментов на почве.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ.

3.1. Выделение и характеристика лакказы.

3.2. Выделение, физико-химическая и биологическая характеристика препарата гуминовых кислот.

3.2.1. Характеристика физико-химических свойств гуминовых кислот.

3.2.2. Характеристика биологических свойств гуминовых кислот.

3.3. Отбор и характеристика почвенных образцов.

3.4. Исследование влияния лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами в гомогенной среде.

3.4.1. Взаимодействие лакказы с гуминовыми кислотами.

3.4.2. Взаимодействие лакказы Coriolus hirsutus с атразином.

3.4.3. Влияние лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами.

3.5. Исследование влияния лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами в гетерогенной среде.

3.6. Оценка возможности использования лакказы Coriolus hirsutus в биотехнологиях очистки почв, загрязненных атразином.

3.6.1. Исследование влияния лакказы на детоксификацию атразина гуминовыми кислотами на перлите.

3.6.2. Исследование влияния лакказы на детоксификацию атразина гуминовыми кислотами в почвенной среде.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Деградация атразина по механизму окислительного связывания, катализируемого грибной лакказой"

В связи с возрастающим загрязнением окружающей среды в целом и земельных ресурсов в частности, остро стоит вопрос создания эффективных биотехнологий для детоксификации загрязненных почв. Одной из доминирующих групп ксенобиотиков в почвах являются гербициды, широко применяемые для контроля численности сорной растительности. Однако неправильное использование гербицидов (превышение доз внесения, нарушение схем применения и др.) часто приводит к негативным последствиям - загрязнению сельскохозяйственной продукции, почв, грунтовых и поверхностных вод.

Наиболее опасным с точки зрения функционирования биогеоценозов является загрязнение высокоустойчивыми гербицидами, одним из наиболее распространенных представителей которых является сим-триазиновый гербицид атразин (2-хлор-4-этиламино-6-изопропиламино-сим-триазин) [Ralebitso et. al., 2002]. Этот гербицид используется в качестве селективного препарата против двудольных сорняков на ряде сельскохозяйственных культур, а также в качестве гербицида сплошного действия для невозделываемых площадей (газонов и территорий промышленного использования). Время его жизни в почве составляет от нескольких недель до четырех лет и более. Одной из основных особенностей сим-триазиновых гербицидов в целом и атразина в частности является их высокая персистентность, т.е. устойчивость в окружающей среде, и мобильность, т.е. способность перемещаться из почвы в сопредельные среды. Указанные характеристики определяют высокую опасность атразина для окружающей среды: предельно-допустимая концентрация (ПДК) атразина в почве составляет 0.5 мг/кг [Письмо Министерства., 1993], а в воде - 3 мкг/л [Ларина, 2002]. Описан ряд негативных эффектов воздействия триазиновых гербицидов, атразина в частности, на представителей растительного и животного мира. В настоящее время накоплены данные о генотоксичности атразина и его влиянии на организм человека.

Для большинства гербицидов, включая сим-триазины, первичным процессом при попадании в почву является их адсорбция почвенными коллоидами, главным образом минералорганическими. Органическое вещество в составе минералорганических комплексов играет ведущую роль в этом процессе. Согласно литературным данным, гуминовые кислоты (ГК) составляют 85-90% от общего содержания органического вещества почв и являются основным компонентом минералорганических комплексов, поэтому при попадании в почву атразин взаимодействует главным образом с ГК.

Несмотря на то, что сорбционные процессы между атразином и компонентами органического вещества хорошо изучены [Weber et al., 1996], единого мнения о механизме связывания ГК с этим гербицидом не существует. Одной из наиболее распространенных гипотез является связывание по механизму гидрофобного взаимодействия и образование комплексов с переносом заряда [Piccolo et al., 2000]. При связывании атразина происходит уменьшение его свободной концентрации в почве и, как следствие, снижение токсичности [Piccolo et al., 1998]. Однако при изменении условий может происходить десорбция гербицида, что приводит к увеличению его мобильности и, соответственно, токсичности.

В процессах взаимодействия ксенобиотиков с органическим веществом принимают участие ферменты окислительного действия. По литературным данным [Filip et al., 1985] эти ферменты способны катализировать или инициировать реакции деградации, полимеризации, синтеза, связывания и включения ксенобиотиков в гумусовые кислоты почв. Ферментативное связывание некоторых ксенобиотиков является важным природным процессом, который влияет на их поведение (т.е. активность и персистентность) в водной и почвенной средах [Zahir et al., 2001]. В экспериментах [Hatcher, 1993; Nanny, 1996], проводимых in vitro, было показано ковалентное связывание ароматических ксенобиотиков (2,4-дихлорфенолов и пентохлорфенолов) с ГК и фульвокислотами (ФК), катализируемое ферментативными комплексами. Предполагаемый авторами механизм детоксификации ксенобиотиков был назван механизмом окислительного связывания. Для атразина возможность окислительного связывания с ГК практически не изучена, а существующие литературные данные противоречивы. В ряде исследований было показано [Lesan et al., 2000], что внесение пероксидазы не увеличивало адсорбционную способность почв по отношению к атразину, а в некоторых вариантах даже приводило к снижению последней. Влияние других оксидоредуктаз, таких как лакказа, на связывание атразина почвами не изучено. Однако показано, что высшие и низшие грибы участвуют в процессах трансформации атразина, и одним из ключевых ферментов этого процесса является лакказа (n-дифенол: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2).

Отличительными чертами данного фермента являются: высокая активность в почве в течение круглого года [Criquet et al., 2000], широкая субстратная специфичность и высокая термо- и рН-стабильность. Кроме того, лакказа является единственной оксидоредуктазой, экстрагируемой из почвы в составе ГК [Ruggiero, 1984]. Основными продуцентами лакказы в почвах являются грибы «белой гнили», представителем которых является Coriolus hirsutus. Именно эта группа базидиомицетов наиболее распространена в почвенном гумусово-аккумулятивном горизонте. Следовательно, базидиальные грибы и продуцируюемые ими ферменты, в частности лакказа, несомненно, являются активными участниками трансформации ксенобиотиков в почвах, хотя и механизм данного процесса не изучен.

Это обусловило актуальность и важность проведения исследований, направленных на изучение влияния лакказы на механизмы адсорбции и десорбции атразина ГК в растворенном и иммобилизованном состоянии. Данные исследования позволят не только установить возможность окислительного связывания этого гербицида с ГК при участии лакказы, но и оценить роль фермента в процессе детоксификации ксенобиотиков сим-триазиновой природы, что даст основу биотехнологическим подходам к рекультивации загрязненных территорий.

Целью работы являлось исследование влияния лакказы на процессы взаимодействия атразина с гуминовыми кислотами в растворенном и иммобилизованном состоянии для установления механизма деградации гербицида in vivo.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- выделить и охарактеризовать грибную лакказу базидиомицета Coriolus hirsutus;

- провести отбор и характеристику почвенных образцов из различных почвенно-географических зон;

- исследовать взаимодействия, протекающие в гомогенной системе лакказа - атразин - растворенные ГК, в том числе изучение процессов взаимодействия фермента с гуминовыми кислотами;

- исследовать взаимодействия, протекающие в гетерогенной системе лакказа - атразин - почвенные частицы, в том числе изучение процессов адсорбции/десорбции атразина и роли фермента в данном процессе;

- оценить возможность детоксификации почвы, загрязненной атразином, с помощью системы лакказа-ГК.

1. обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Давидчик, Валентина Николаевна

выводы

1. Установлено формирование ферментативно активного комплекса лакказа-ГК нековалентной природы. Высказано предположение об определяющей роли Ван-дер-вальсовых, гидрофобных, п-пи СН- л взаимодействий.

2. Показано стабилизирующее действие ГК на ферментативную активность лакказы; установлено, что стабилизирующее действие более выражено при стрессовых (рН 6.5), чем при оптимальных (рН 5.0) для фермента условиях.

3. Исследование трансформации атразина в гомогенной системе лакказа-атразин-ГК показало, что лакказа снижала уровень адсорбции гербицида ГК; наблюдаемый эффект связан с процессами модификации ГК и образованием их комплексов с лакказой.

4. Установлено, что процесс трансформации атразина в гомогенной системе лакказа-атразин-ГК-редокс-медиатор в значительной степени определяется используемым редокс-медиатором; эффективным редокс-медиатором, вызывающим 60% трансформацию гербицида в исследованной системе, является 1-гидроксибензотриазол.

5. Изучена трансформация атразина в гетерогенной системе лакказа-атразин-иммобилизованные ГК. Показано, что в присутствии фермента связывание атразина почвами происходит по механизму окислительного связывания, о чем свидетельствует анализ изотерм адсорбции и десорбции, а так же увеличение количества необратимо связанного гербицида.

6. Проведенные лабораторно-вегетационные эксперименты показали возможность детоксификации атразина в почвенных условиях путем его связывания с ГК по механизму окислительного связывания при участии лакказы; при этом необходимые для протекания процесса редокс-медиаторы присутствуют, по-видимому, непосредственно в почве.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Давидчик, Валентина Николаевна, Москва

1. Александрова JI.H. Органическое вещество почвы и процессы еготрансформации. JL: Наука, 1980.

2. Аринушкина Е.В. Руководство по химическому анализу почв. М.: Изд-во1. Моск. Ун-та, 1970,488с.

3. Аронов С.Г. Гуминовые кислоты. В.: Химическая энциклопедия. М.:

4. Советская энциклопедия, 1988, т. 1, с. 618.

5. Беленький Б.Г. и Виленчик JI.3. Хроматография полимеров. М., 1978.

6. Белькевич П.И., Чистова JI.P. Торф и проблема защиты окружающей среды.

7. Минск: "Наука и техника", 1979, 64 с.

8. Березовский М.Я., Немова Г.Н. Особенности применения гербицидовпроизводных сим-триазина на торфяных почвах. Агрохимия. 1973, Т. 12, с. 102-110.

9. Вадюнина А. Ф., Корчагина 3. А. Методы исследования физических свойствпочв. 3-е изд., перераб. и доп. М.: Агропромиздат, 1986.416 с.

10. Вайткявичус Р.К., Вельжите В.А.,Ченас Н.К. Выделение и кинетическиепараметры лакказы Polyporus anicoporus. // Биохимия, 1984, Т.49, № 6, с. 1000-1003.

11. Варфоломеев С.Д., Наки А., Побочин А.С., Ярополов А.И. Функциональнаяактивность ферментов и пути ее регулирования// Изд-во МГУ, под ред. Северина С.Е., 1997, с. 97-124.

12. Глебова Г.И. Гиматомелановые кислоты почв. М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1985,740 с.

13. Гольдфельд М.Г, Карапетян Н.В. Физико-химические основы действиягербицидов. Итоги науки и техники ВИНИТИ. Биол. химия, 19896 Т. 30, с. 1-144.

14. Захаренко В.А. Гербициды. М. 1990, 238 с.

15. Зинченко В.А. Природа действия гербицидов производных триазина нарастения. М.: Мин-во с-х. ТСХА, 1971,28с.

16. Келдербенк А. Распространение и роль связанных почвой остатковпестицидов. В кн.: Проблемы загрязнения окружающей среды и токсикологии. М.: Мир, 1986, с. 84-117.

17. Ковалевский Д.В. Исследование структуры гумусовых кислот методамиспектроскопии ЯМР 1Н и 13С. Дисс. на соиск. уч. ст. к.х.н. М.: МГУ, 1998.

18. Ковалевский Д.В, Пермин А.Б, Перминова И.В, Петросян B.C. Выборусловий регистрации количественных 13С ЯМР спектров гумусовых кислот. Вестник Московского университета, серия 2 (Химия), 2000, Т. 41, с. 39-42.

19. Кононова М. М. Органическое вещество почвы. М: Изд-во МГУ, 1963.

20. Королева О. В. «Лакказы базидиомицетов: свойства, структура, механизмдействия и практическое применение». Автореферат на соискание д.б.н. Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН. 2006.

21. Королева О.В, Степанова Е.В, Ландесман Е.О, Васильченко Л.Г,

22. Хромоныгина В.В, Жердев А.В, Рабинович М.Л. Иммуноферментныйанализ разложения гербицида почвенными и древоразрушающими грибами. Прикл. биохим. микробиол. 2002, Т. 38, № 4, с. 413-418.

23. Круглов В.П. Влияние торфяных физиологически активных веществ наинтенсивность течения ростовых процессов. Докл. Всес. Акад. с-х наук им. В.И. Ленина. 1985, Т. 4, с. 16-18.

24. Ларина Г.Е. Комплексная оценка действия гербицидов на компонентыагроценоза. Агрохимия. 2002, № 4, с. 64-74.

25. Лебедева Г.Ф. и др. (Экологические аспекты применения гербицидов). М.:1. Изд-воМГУ, 1990,208 с.

26. Лебедева Г.Ф., Куликова Н.А., Холодов В.А. Загрязнение почв гербицидами.

27. В кн.: Деградация и охрана почв, Изд-во МГУ, Москва, 2002, с. 332-358.

28. Лунев М.И. Пестициды и охрана фитоценозов. М.: Колос, 1992, с. 43-45.

29. Лях С.Н. Микробный меланиногенез и его функции. М.: Наука, 1981,274 с.

30. Майер-Боде Г. Гербициды и их остатки. М.: Мир, 1972, 206 с.

31. Мельников Н.Н., Белан В.Г. Сравнительная опасность загрязнения почвыгербицидами производными сим-триазинов и некоторых других шестичленных гетероциклических соединений. Агрохимия. 1997. Т. 2, с.66-67.

32. Мокроносова А.Т. Малый практикум по физиологии растений. М.: Изд. МГУ.1994,183 с.

33. Овчинникова М.Ф. Химия гербицидов в почве. М.: Изд-во МГУ, 1987, 109 с.

34. Орлов Д.С. Свойства и функции гуминовых веществ. М., 1993. с.

35. Орлов Д.С. Химия почв. М., Изд-во МГУ, 1992,259 с

36. Орлов Д.С., Бирюкова О.Н. и Суханова Н.И. Органическое вещество почв

37. Российской федерации. М.: Наука, 1996.256 с.

38. Перминова, И.В. «Анализ, прогноз и классификация гуминовых веществ».

39. Практикум по агрохимии, под ред. В.Г. Минеева, М., Изд-во Московскогоуниверситета, 1989, 304с.

40. Рабинович M.JL, Болобова А.В., , Кондращенко В.И. Теоретические основыдревесных композитов. Кн. I. Древесина и разрушающие ее грибы. М.: Наука, 2001.264 с.

41. Спиридонов Ю.Я., Сметник А.А. Особенности поведения гербицидов в почве.

42. Материалы II Всероссийского совещания «Состояние и перспективы развития гербологии на пороге XXI столетия». Голицыне, 2000. с. 262266.

43. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению в РФ