Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МИЦЕЛИАЛЬНЫЕ ГРИБЫ И ВОЗМОЖНОСТЬ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ В ПОЧВЕ

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "МИЦЕЛИАЛЬНЫЕ ГРИБЫ И ВОЗМОЖНОСТЬ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ В ПОЧВЕ"



На правах рукописи

Хролнптснпа Валерия Викторовна

М И ЦЕЛ И Д ЛЬНЫ Е ГРИБЫ И ВОЗМОЖНОСТЬ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ДЕТОКСИКАЦИН КСЕНОБИОТИКОВ В ПОЧВЕ

Специальность 03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2004

Работа выполнена в Эк ой но центре экологического факультета Российского университета дружбы народов и Института биохимии им. А. Н. Баха РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ю.П. Козлов НиучиыП консультант;

доктор химических наук, профессор МЛ. Рабинович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Г.Н.Эль-Регкстан доктор биологических наук, доцент А.В.Кураков Ведущая организация:

Институт биохимии и ф in но логин микроорганизмов им .Г.К. Скрябина РАН

Защита днссерчацни суетится «» (AJ&LtJL-, 2004 г. в « № » часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.17 а Российском университете дружбы народов по адресу: 115093, Москва, Подольское шос& 8/5, экологический факультет РУДН.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российской университета дружбы народов по адресу; 117198, г. Москва, ул. Миклухо Мяклая, д. 6.

Авторефери! раиклан __2004 Г.

Учении секретарь днссеришнониого совета,

доктор биологических ни; к, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, В условиях возделывания монокультур невозможно обойтись без агрохимических методов повышения урож;\Гнюс1 и. в том числе применения гербицидов. Постоянны» рост количества вносимым препаратов приводит к накоплению в почпах и грунтовых водах гербицидов в концентрациях, значительно превышающих ПДК, Среди используемых для борьбы с сорняками, болезнями и вредителями сельскохозяйственных культур препаратов особую опасность представляют стойкие и кумулятивные гербициды. К ним относятся производные триазинов (спмазпн, отразин, третбутилазин и др.), остаточные количества которых обнаруживаются в поч не спустя 10 н более лет после применения. По трофическим цепям эти ксенобиотики и их метаболиты (напр., деээтнлатразнн) попадают в организм человека. В настоящее время обнаружены их мутагенный, аллергенный канцерогенный эффекты [Лозановская П.Н., 1998]. Поэтому первоочередная задача современной стратегии охраны окружающей среды в области сельского хозяйства состоит в снижении остаточных количеств гербицидов и возвращение в оборот загрязненных сельскохозяйственных угодий. Восстановление таких земель с помощью естественной микрофлоры является наиболее эффективным с экологической точки зрения подходом.

Разложение стойких ксенобиотиков в почвах осуществляется, главным образом, бактериями п мицелиальными грибами. По последним оценкам вклад почвенных бактерий и грибов в разложение гербицидов примерно одинаков [ОзИгоГзку, 2002}, Механизмы детоксикации гербицидов бактериями изучены весьма подробно [\Vacket е[ а[., 2002, ЯакЬкзо е1 а!., 2002, Головлева Л.А., 2003]. В то же время, разрушению триазиновых гербицидов мнцелнальными грибами посвящено относительно мало работ. Известно [Мицевпч н др„ 2002], что видовое разнообразие мпкромицетов в загрязненных ночпах заметно снижается. Это позволяет говорить об адаптации отдельных вил об грибов к повышенному содержанию стойких ксенобиотиков и о возможности поиска среди них перспективных видов деструктор п. Цели и задач» исследовании: Целью рабогы являлось изучение влияния модельного ксенобиотика атразина (2-хлор-4-(М-этнл)-б-(Ы-пчопропплН .3,5-триазнна), одного из наиболее распространенных триазнновых гербицидов, на мнцелнальные грибы различных экологических ниш. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

- выделить чистые культуры термофильных п мезофндьных мпкромицетов, принимающих участие в процессах детокенкации ксенобиотиков в почве и поверхностных почвенных слоях;

- охарактеризовать систематическую принадлежность выделенных штаммов и их фнзнолого-биохимическне особенности;

- оценить способность штаммов к деградации атразина;

- изучить механизм деградации атразина мнцелнальными грибами.

Нлучтчя новизна

• Впервые показано, что атразпн может изменять состав популяции термофильных мнкромииетов саморазогревающегося растительного компоста, избирательно стимулируя или угнетая не только организмы разных родов, но и разные штаммы одного вида.

• С помощью ПЦР-анализа установлена таксономическая принадлежность одного из неспорулирующих мицелмольных грибов, выделенных из разлагающего атразин сообщества ИНБИ 2-26.

• Показана толерантность грибов сообщества ННБИ 2-26 при концентрациях атразин а до 500 мг/л и активация роста концентрациями до 50 мг/л, а также их способность разлагать 20 мг/л ксенобиотика за 6 недель,

• Впервые обнаружены синтез целлобиозодегидрогеназы и ряда цел л ¡аполитических ферментов грибом Оюеготшт зр. ИНБИ 2-26- на бесаеллюлоэнои среде и его промотнрование атразином; показано промотнрование атразином синтеза лакказы у ИНБИ 2-26+

• Впервые показана способность бесклеточной системы, состоящей из цел л юл аз и ЦДГ гриба С/юештит ар. ИНБИ 2-26-, совместно адсорбированных на целлюлозе, разлагать атразин в присутствии ионов железа.

Практическая значимость работы

Выделенные культуры и их внеклеточные ферменты представляют интерес для биоремедиацин почв в условиях закрытого грунта, очистки сточных вод от остаточных количеств стойких гербицидов трпазннового ряда, а также экспресс-детекции низких концентраций ксенобиотиков фенол ьной н хнноиднон природы.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи в рецензируемых журналах, ) статья в сборнике научных трудов «Актуальные проблемы экологии и природопользования» в 2000г. и 4 тезисах докладов. Основные положения диссертации представлены на I и 11 Между но |>одк ы х Конгрессах «Биотехнология: состояние, перспективы развития» (Москва 2002, 2003), н 7-ой Пущи не кой школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (2003).

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на (С~?- страницах, включает рису и ков и ^таблиц. Список цитируемой литературы включает/3^ наименовали , в том числе на иностранных языках,

О ШОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе I рассмотрена роль мпкромицетов - неотъемлемой составляющей почвенного биоценоза - в формировании почв. В главе 2 дана история применения трпазннового гербицида атразкна и рассмотрено его влияние на живые организмы, В главе 3 рассматриваются пути перемещения атразина по

почвенному профилю, физико-химические свойства взаимодействия атралша с почвой н её бнотоЙ. Глава 4 посвящена превращению атразина почвенной микрофлорой, рассмотрены возможные способы деградации атралша как бактериями, так и мнкромицетамн,

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Микроорганизмы: Термофильные грибы из саморазогревающегося травяного компоста выделены нами в чистые культуры и идентифицированы с помощью определителя термофильных грибов [Бнлан, Захарченко, 1987] ни основании типа кониднального спороношеиия.

Мезофпльные кеспорулирующне мицелиальпые грибы: продуцент лакказы ИНБИ-2-26+ и продуцент ЦДГ МНБИ 2-26- {Chaeioinium sp.) выделены из разлагающего атразин сообщества МНБИ 2-26 (Васнльченко, 2003), и ИНЬИ 2-26- идентифицирован как Chaetoiniwii sp. в совместной работе с Гематологическим научным центром РАМН при помощи прямого секвеннровання ПЦР-фрагментов, включающих полностью its! и its2-транскрибнруемые спенсеры 5,85-рДНК и часть гена 2SS-pÄHK с вариабельными регионами Dl и D2, и последующего филогенетического позиционирования грибов на основе сравнения расшифрованных последовательностей с базой данных нуклеотндных последовательностей гомологичных локусов Genbank/EMBL/DDOJ программой Blast на сайте wmv. ncbi.nlm.nih.gov.

Выделение чистых культур неспорулнрутощнх шше.шпльиыу rpiiöou lit сообщества 1ШБП 2-26 проводили методом протопластнровання па селективной среде, содержащей 0,2 г/л гваякола [Васнльченко п др„ 2002]. Огбнрали колонии, образующие на этой среде черно-коричневые зоны наибольшего диаметра, а также колонии, не образующие зон при длительной инкубации.

Культивирование микроорганизмов проводили на плотных средах: сусло-агаре, картофельно-дскстрозном агаре, овсяном агаре, крахмально-дрожжевом агаре, а также поверхностным способом на жидких средах Чапека-Докса (1% глюкозы) или Чапека для грибов. Термофильные микромицеты выращивали при мезофильные микроминеты при 2S"C, Жндкофазное

культивирование в присутствии атразина проводили на среде Чапека-Докса. Определение ¡«ктнвпостн ферментов

Axmtteiwcmb эидоглюмшазы в фильтрате ЮК определяли виекозиметрнческнм методом [Рабинович и др., 1977] в 0,1 М цнтратпо-фосфатном буфере (ЦФБ) (pH 5,0), используя 0,5%-ныГ( раствор Na-еолн КМ-целлюлозы средней вязкости («Sigma», США) в качестве субстрата. Активность других ферментов определяли с помошью регистрирующего спектрофотометра Спекорд М40 («Karl Zeiss», Германия),

Целлоииозодесидрогенап' (ЦДГ) определяли с помощью целлобиозы (38 мкМ. Merck, ФРГ) и днхлорфенол индофенола (ДФИ) (86 мкМ, Sigma) в 0,1 М цитрата о-фос фат ном буфере при рП 5,5 <с?:,,=б,3 тМ''см"Ч Локкшу определяли

путем непрерывной регистрации продуктов окисления катехола (0,1%, Sigma) при 410 нм а 50 мМ К-фосфатном буфере, рН 0,5 при комнатной температуре. За 1 усл. ед. принимал» прирост Aju, на 10'3 ед/мнн. Целюыюгидролазу / определяли с помощью м етн л у м б ел л и фе р н л - |i- D-л а ктоз и да (МУФЛ; 0,2 мМ, Merck) в 0,1 М ЦФБ, регистрируя накопление МУФ при 350 нм (рН 5,5) (Деш = 1,62 тМ"'см"' [Мельник и др., 1991]). [¡-Глюкозидазу определяли так же с помощью М У Ф-р-D-гл ю коз 11 да (0,2 мМ, Fluka) при рН 5,5.

На плотных средах ЦДГ, лакказу и целлюлозы определяли полуколичественно путем измерения размеров зон, образуемых этими ферментами вокруг колоний или лунок в присутствии специфических субстратов (ДФИ н целлобнозы, катехола, КМ-целлюлозы с окрашиванием Конго красным либо сшитой AZCL-HЕ-целлюлозы (MegaZyme, Ирландия), соответственно).

Атразии определяли с помощью офВЭЖХ на колонках с носителем «Luna» CIS ("Plienomenex", USA) или «Ultraspheve» ("Beckinan Coulter", USA), либо методом ИФА с помощью специфических антител, полученных в лаборатории иммунобиохпмни Института биохимии им. А.Н.Баха.

Разложение атразина бесклеточииа системой. Целлюлазы и ЦДГ из ОС 8-сут культуры продуцента, выращенной на фильтровальной бумаге, адсорбировали на аморфной целлюлозе, далее переносили ее в реакционную среду, содержащую атразин (100 мг/л) и ноны Fe)+ (100 мкМ) в 0,1М К-ацетатном буфере, рН 4,0. Инкубировали 10 сут при перемешивании и 281>С, ежедневно отбирая пробы для определенна атразина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние атразина на термофильные мнкромнцсты, выделенные из саморазогревающегося растительного компоста

Термофильная микрофлора, развивающаяся на начальной стадии разложения растительных остатков, первой испытывает на себе влияние гербицидов, аккумулируемых фнтомассой. Поэтому представляло интерес выяснить влияние атразина на термофильные микромицеты компоста.

1.1. Компонентный состав сообщества термофильных мтфомяцетов

Основными компонентами сообщества грибов на термофильной стадии являются нецеллюлолптпчеекпе организмы, потребляющие легкодоступные углеводы н представленные, » основном, Humicota (Themiomwes) lanuginosa, а также термофилы-иеллюлолитнкн [Deacon, 1984]. В выделенном нами сообществе доминировали штаммы //, lanuginosa, имеющие в целом более высокий температурный оптимум роста (табл. I). Это можно объяснить тем, что в процессе утилизации легкодоступной части углеводов выделяется много тепла за счет интенсивной респирации. Появление целлюлолнтиков, возможно, свидетельствует о частичном исчерпания легкодоступных углеводов и снижении температуры компоста.

Таблица 1. Компонентный состав термофильного сообщества грибов

Культура Оптимальная Диаметр колонии на пчлио Влияние

т-ра. "С 1 кипой среде ни 3 сут. мм а граиню

Ра/т/чу чип /1и'пт>р!н'1ч-1 45 65 И.о.

Г. Окгпмр/гНа-2 45 68 И.о.

Иттсчи! Лкмдано.мг -!, 52-53 52 Стимуляция

//. ¡аниц'иика -2

НшнкЫа шлчЛ'га -9, 52-53 54 Стимуляции

И. -15

И. ктиц'тжа -3, 4, 7, 8 N. шда/ет-16 50-55 56 И.о.

N. кат^/пом -5 56-5« 57 Стимуляция

Н. ингнцмоаа -12 56-53 5-1 Супрессия

Рит'сШшт 1 52-53 12 Супрессия

РеЫсШ'тм 52-53 11 Супрессия

РепкНЧит 5р,-13 56-5» 20 Супрессия

РепкШШт Бр-25 52-53 ¡5 Супрессия

Поэтому штаммы Н. ¡атфиош^ вероятно, более приспособлены к высоким температурам, чем целлюлолитики (табл.2), которые разлагают труднодоступную часть углеводов и выделяют меньше энергии в процессе дыхания. Наличие лаккказной активности у Н. 1атдт о$а позволяет предполагать, что эти грнбы участвуют в гумификации растительных остаткоа.

Таблица 2. Активности ферментов термофильных микромнцетов.

Культура Энлиглкжаият (радиус ии по КМЦ, мм; |>И7| |1-ГЛ1ПЬЧ11И-атя, ЛИУл МЕ/,1 ил г, М1У.1

РариЬхрага ¡¡к'гторЬИи 7-9 И.о. И.о. И.о.

РепкИИчт .чрр. 4-9,5 27 <0.1 <0.1

НитШа !чг,1г.чпо\.1 -5 <1 32 <0.1

НиткЫа $рр. (шт. 1.2,9.15) <1 И.о. И.о. И.о.

И. ¡чии^ 'тоя! -12 <1 55 10.3 <0.!

1.2, Влияние атрлзнна на отдельные штаммы

При концентрациях 0,2-20 мг/л атразпн не вызывал гибели термофильных микромицетов, однако по-разному влиял на различные грнбы. Так, наблюдали как стимулирование (Ни>тсо1а ¡апмфпоэв 1,2.5,9,15), так и ингнбирсваиие роста гербицидом (Я. /ат^/мж: 13, РенмШиш ¡р. 13) (табл. 1). Таким образом, атразин может изменять не только родовой или а» до вой, но и внутривидовой состав популяции термофильных грибов, развивающихся на первой стадии разложения растительных остатков. При атом за 11-17 сут (времена, сопоставимые с продолжительностью термофильной стадии компостирования) ни один из изученных термофилов (как нецеллюлолитичеекой, так и

целлюлолитической группы) не снижал достоверно концентрации атразина по сравнению с контролем (табл. 3).

Таблица 3, Концентрация агразнна в жидкой среде прн культивирован!m термофильных микромицетов_

Культура Концентрация агразнна (мг/л)

3 сутки 11 сутки 17 сутки

Pénicillium sp.-!3 25.5±2,4 26,8±2,4 29.0±2,4

Humicola lanuginosa -5 27±2,7 25,7±2,7 26.5±2,7

llimiicolti laimgiiicàu -12 2&.6±2,3 25,6±2,3 24,3±2,3

Контроль (-15"С, без культуры) 2 5 ±2,3 26±2,6 29±3

Таким образом, ни спонтанного разложения атразина при 45"С, ни его разложения выделенными термофильными грибами обнаружено не было.

2. Влияние атразина на мсзофнльные шшелиальиые грибы - компоненты

сообщества ННВН 2-26 из загрязненных гербицидами тропическим почв

Мезофильная стадия разложения растительных остатков более продолжительна, чем термофильная. На этой стадии в трансформации ксенобиотика могут принимать участие микроорганизмы, длительное время испытывающие воздействие накапливающейся в лочве концентрации гербицида. Такие микроорганизмы и пути их адаптации представляют особый интерес для биоремеднацнн загрязненных территорий. В нашей лаборатории выделено сообщество неспорулирующнх мицелиальиых грибов ИНБИ 2-26 из почв Южного Вьетнама, подвергавшихся во время войны с США массированной обработке гербицидом Agent Orange (смесь 2,4-Д и 2,4,5-Т с технической примесью днокснков), разлагающее атразнн в жидкой культуре [Васнльченко, 2003]. Методом рассева протопластов сообщество разделено на два компонента - продуцент лакказы ИНБИ 2-26+ и продуцент целлобмозодегндрогеназы ИНБИ 2-26-. Таким образом, в природном сообществе ИНБИ 2-26 два мицелиальиых гриба 2-26+ и 2-26- способны s присутствии источника целлюлозы осуществлять циклический процесс окисления-восстановления ароматических полифенольных соединении [Васнльченко, 2003]. Сходный редокс-цнкл обнаружен у лиги нн разрушающе го базндиомицета Pycnoponis ciiiitabarimts [Temp and Eggert, 1999]. В ходе сопряженного разложения целлюлозы и лигнина гриб осуществляет таким путем регенерацию натурального аминофенола - 3-октиаитраниловой кислоты. Полагают, что последняя является медиатором, в присутствии которого лакказа данного базлдномицета способна разрушать нефенольные структуры лигнина, а также персистентные ксенобиотики, В этой связи представляло интерес выяснить, возможно ли разложение гербицида отдельными компонентами сообщества ИНШ 2-26: продуцентом лакказы и продуцентом ЦДГ.

2.1. Идентификация н ее л о ру л и ру ш щ его гриба ИНБИ 2-26-

Отсутствие конндцального слороношения или половой стадии развития затрудняло идентификацию мицелиальиых грибов, составляющих сообщество

ИНБИ 2-26. Для молекулярной диагностики грибов из них выделяли хромосомную ДНК, проводили амплификацию и последующий си к вепс фрагментов генов, кодирующих рРНК 5,85-, ¡8Б- и 285-су6ъеднниц рибосом. Наиболее близкими к изученным последовательностям гриба 2-26- оказались рРНК грибов Скаегонишп (Лс!юеи»п1ат) (рис.1 ),

При исследовании аналогичным методом выявлена клади ст и ческа я близость штамма ИНБИ 2-26+ к С1юеитиюп щ 1КВ1 2-26-.

■F %

167 9 3 573 Aspergillus versrcolor 21623525 Chaetomium sp. 13469772 Chaetomium chiversii 20520598 Chaetomium irreguläre 1Э469787 Thietevia cephalothec ^3469786 Thielavia sp.

13469779 Chaelomium murorum ^ 20620596 Achaetomium strumarium .Chaetomium sp, INBI 2-2S-

I- 20520399 Achaelomium gtobosum

—j Vго- 20520400 Achaelomium gtobosum

^1*^0520603 Achaelomium luteum

20520597 Achaetomium umbonatum

-5006390 Apor olhielavia leptode

^r^3469 77 5 Chaelomium d'e-yf'Jssn

Г"*- 13459T6S Chaetomium so, ——I гаа

| г Л 34697 70 Chaetomium brasiliens 13469780 Chaetomium pilutiferu 1 " 20520601 Chaetomium hexagonosp |— 13469773 Chaelomium cuyatenoen Ц*^346Э784 Farroma seminuda iJV" 13469703 Farrowia malaysiensis

_(-^3469778 Chaelomium homopilalu

13469771 Chaetomium brevipiliu 13469776 Chaelomium filiforme У^3469781 Chaelomium sphaerale 13469782 Farrowia iongicollea

469774 Chaetomium cupieum AY267706 uncult AMF iungus (-— 20520602 Chaelomium quadrangut ljft^99137 Chaetomium gtobosum i66 T- 13469777 Chaetomium gtobosum 20520600 Chaetomium robustum ^0520599 Chaetomium bostrychod " 13469769 Chaetomium bostrychod

-Г43'

AV

Рис. I. Положение штамма ИНБИ 2-26- в филогенетическом дереве аскомицетов р, С/шЧапиит согласно данным снквенса генов рРНК,

2.2. Адаптация грибов 1С атразииу па плотной среде

При культивировании мицелнального гриба ИНБИ 2-26- на плотных средах при оптимальной температуре обнаружено заметная стимуляция роста в присутствии атразина в концентрациях до 50 мкг/мл. Диаметр колоний при этом в 1,3 - 1,2 раза превосходил диаметр о дно возрастных колоний на контрольных средам без атралнна (рис,2).

мм 70 60 50 40 30 20 10 0

Рис. 2. Диаметр колонии (мм) штамма ИНБИ 2-26- в зависимости от концентрации атразина (мкг/мл) на б сут роста гриба при 28" С,

О-0™ 100 200 300 400

£00

При 37° на среде без атразина гриб развивался быстро н уже на 6-е сутки наблюдался его автолиз с уменьшением размера колонии. Присутствие атразина (50 мкг/мл) задержииало автолиз на 11-12 сут (рнс.З).

во-.

г 70-| 60-| 50-

•л

Р- 40

V £

I 302010-

Рис. 3. Развитие штамма ИНБИ 2-26- с атразином (1) и без атразина (2) (50мкг/мл) при 37"С.

10 15 20 25 30

35 40

При концентрациях гербицида в плотной среде свыше 100 мкг/мл размер колонии гриба ИНБИ 2-26- был меньше чем за то же время в контроле. При концентрации атразина в агаре 500 мкг/мл рост колоний гриба начинался лишь на 6-7 сутки после посева (рис, 4), При этом гербицид не оказывал заметного влияния на внешний вид колоний.

9080 70 60 50 40 30 20 10

Рис. 4. Размер колошш штамма ИНЬ И 2-26- в зависимости от концентрации атразнна. /контроль, 2 - 20 мкг/мл, 3 - !00 мш'мл, 4 - 500 мкг/мл.

ю 12

14

Штамм 2-26+ - продуцент лакказы был более чувствителен к репрессии атразином (рис. 5 кривая 4), который в концентрации 500 мкг/мл задерживал его рост на 3 нед.

100-

о

О

а.

Рис, 5. Развитие штаммов НИШ 2-26- и ННШ 2-26+ без атразнна (1 и 2

соответственно) и с атразином (500 мкг/мл) (3 и 4 соответственно).

Однако при более длительной инкубации этот штамм также адаптировался к высоким концентрациям ксенобиотика (рис. 6.)

Рис. 6. Штамм 11НБИ 2-26+ на 25 сутки культивирования в присутствии атразнна (слева) и в его отсутствие (справа). В обоих случаях гриб занимает всю поверхность чашек.

2.3. Разложение атразина грибами о жидкой культуре Влияние культур 2-26+ и 2-26- на содержание атразина изучали путем поверхностного культивирования на минимальной жидкой среде Чапека-Докса при концентрации атразина 20 мкг^мл. Разложение атразина грибом-продуцентом лакказы ИНБИ 2-26+ контролировали с помощью ИФА [Королева, 2002). Как видно из рнс. 7 (кривая 1), за 40 сут гриб разрушает 78% гербицида в этих условиях.

Рис. 7. Степень деградации атразина грибами ИНБИ 2-26+ и ИНБИ 2-26- (кривые ] к 2 соответственно).

сутки

За разложением атразина культурой 2-26- наблюдали с помощью офВЭЖХ, Иа рнс. 8 показаны типичные хроматограммы фильтрата культуры в разные периоды развития гриба.

С течением времени пик, соответствующий исходному гербициду, закономерно снижался, составляя на 10-е сут после внесения около 80%, через 4 нед. • около 30%, а к концу культивирования (7 нед.) не более 2% исходной величины. При этом на финальной стадии наблюдался широкий спектр различных соединений, которые не обнаруживались при культивировании гриба на той же среде в отсутствие атразина (рнс. 8г). Содержание атразина в мицелии штамма ИНБИ 2-26- в конце культивирования не превышало 1% его неходкого количества. Поэтому сорбция атразина мицелием не могла быть основной причиной 50-кратного уменьшения его концентрации в культуральной жидкости к концу процесса.

Таким образом, не только сообщество ИНБИ 2-26, способное осуществлять циклические редокс-процессы в присутствии источника целлюлозы, но и оба составляющих его штамма (продуцент лакказы ИНБИ 2-26+ и продуцент целлобиозодегидрогеназы ИНБИ 2-26- способны в отдельности трансформировать атразин а жидкой среде.

Рис. 8,Изменение концентрации атртииа в ЮК срачу после внесения атразипа (а) ( - 18,8 мкг/мл, 7 сут; (б) II - 14,2 мкг/мл, 28 сут: (и) III - 9.2 мкг/мл. 40 сут: (г) IV - 1 мкг/мл.

3. Секреция ферментов мпцелнальиыми грибами-компоцентами сообществ:« ИНБИ 2-26 н влшнше на нее атразин а

Основными внеклеточными ферментам», участвующими в элиминации лигнинразрушающимн грибами таких токсикантов, как пол «циклические ароматические соединении, полихлорированные бифенилы, дибенэодиоксины, днбензофураны и др., считают лигнин- и марганецпероксидазы, а также лакказы [Рабинович и др., 2003]. Механизм детоксикации триазиновых ксенобиотиков лиги ни разрушающим и грибами изучен слабо. Известно, что скорость разложения атразииа базидиомицетами Cnriohts versicolor, Hypholoma fascicular^ и Siereum hhsuittm не коррелирует с лигнинпероксидазноЙ активностью [Bending et al., 2002]. В деградации атразииа базидиомицетом Pleurolus pulmonarius помимо пероксидаз участвуют лппоксигеназа и цитохром Р-450 [Masaphy et al., 1996].

Еще меньше известно об участии внеклеточных ферментов почвенных грибов в детоксикации три аз к новых гербицидов. Так, почвенные дрожжи Ltpomyces starkeyi потребляют симазин, атразин, цианазин, аметрин и прометрии, однако неясно, какие внеклеточные ферменты для этого необходимы [Nisliimura et at., 2002], В этой связи представлялось важным исследовать внеклеточные ферменты, синтезируемые потребляющими атразин почвенными грибами сообщества ИНБИ 2-26.

3.1, Синтез лакказы грибом ИНБИ 2-26+ н его стимулирование атрашмом

Согласно гипотезе [Bollag et. al., 1992], лакказы почвенных грибов могут трансформировать ксенобиотики путем вовлечения их в процесс свободнорадикальной конденсации с фенольнымн соединениями и другими предшественниками гуминовых и фульвокислот, В этоП связи представляло интерес выяснить, как влияет атразин на синтез лакказы грибом 2-26+.

На плотных средах атразин стимулировал синтез лакказы грибом 2-26+, что выражалось в увеличении радиуса зон окисления гваякола вокруг блоков одно возрастных культур, выращенных при разных концентрациях гербицида (рис. 9). Эффект был заметен как при 28, так и при 37"С.

Рис,9. Лакказная активность штамма

О (7\ / на с>'т культпвпро-

V* / L bnui.n ПГМГ 18 >• ~i7ЛГ >.

вання при 28 и 37пС и концентрациях атразииа 0 (2 и 3 соотв.), 20 (4 и 5 соотв.), 50 (6 и 7 соотв.) и 100 мкт/мл (I).

Одновременно атразин влиял на интенсивность образование темно-коричневого пигмента культурой. При 37°С интенсивность пигментации коррелировала с лакказной активностью: неокрашенные 14-сут культуры, выращенные при концентрациях атразина 0 (контроль) или 20 мкг/мл, обладали низкой лакказной активностью, тогда как пигментированная культура (100 мкг/мл атразина) - высокой (рис. 9).

При 28ПС атразин в концентрации 50 и 100 мкг/мл также заметно стимулировал синтез лакказы на плотной среде, однако корреляции с образованием пигмента не было (ср. рис. 9 и 10), Так, культуры, выращенные при концентрация атразнна 0 и 20 мкг/мл, были более пигментированы, чем слабоокрашеииая, но наиболее активная но лакказе культура, выращенная при

' ' .10).

Вероятно, образование пигмента и стимулирование его образования при повышенной температуре связано с конденсацией под действием

лакказы соединен ня(нй), выделяемого(ых) культурой. Такой процесс гипотетически можно рассматривать как гумификацию или образование меланинов, в ходе которого происходит элиминация атразнна по механизму, предложенному в работах [Bollag et al„ 1992).

Для проверки данной гипотезы исследовали элиминацию атразина (20 мкг/мл) культурой ИНБИ 2-26+ в жидкой среде в присутствии ионов меди, индуцирующих синтез лакказы. В опытном эксперименте помимо ионов меди добавляли также гваякол (1 мМ), который интенсивно полнмернзуется лакказой с образованием теми окори чневых пигментов. Одновременно гваякол повышает синтез лакказы в 1,5-2 раза (рис. 11).

Помимо вышеупомянутой гипотезы [Bollag et al., 1992] о сополимеризации ксенобиотиков с предшественниками гумииовых кислот н фульвокпслот лакказами почвенных грибов проверяли также гипотезу [Леонтьевскин, 2002] об образовании в присутствии гваякола и аналогичных соединений т.н. «желтых» лакказ, способных разлагать нефенольные ароматические структуры по кати он радикальному механизму в отсутствие медиаторов типа АБТС.

Эксперимент, однако, показал, что, несмотря на интенсивное пигментообразование и заметно более высокий уровень синтеза лакказы в присутствии гваякола, элиминация атразина в опытной культуре шла медленнее, чем в контрольной (рис. II, кривые 1 н 2). Более того, в момент достижения максимума активности лакказы после добавления нонов меди (вторая неделя роста) элиминация атразина замедлялась.

Рис.10. Интенсивность образования пигмента штаммом ИМБИ 2-26+ на 6 сутки культивирования при 28ПС (слева - контроль, справа концентрация атразнна 100 мкг/мл).

3500

3000 "а

1

2500 + г!

X

2000 rf

г^

1S00 ^

CJ

1000 е;

500

Рис. 11, Степень деградации атразнна (%) и лакказная активность МНБИ 2-26+ в присутствии гваякола (кривые 1 и 2 соответственно), и в отсутствие гваякола (кривые 3 и 4).

Таким образом, в процессе потребления атразнна культурой 2-26+ нам не удалось обнаружить корреляции между активностью лакказы и полимеризацией гваякола, с одной стороны, и э л ими нацией атразина, с другой. Вероятно, синтез лакказы является неспецифнческнм ответом гриба на неблагоприятные условия н не коррелирует напрямую с потреблением данного ксенобиотика.

3.2. Синтез цел л об 11 озо дс гид роге и азы н целлюлаз на бс с целлюлозных средах грибом Clttteionmwi sp. И11БН 2-26- н его стимуляции атразнном

Образование ЦДГ обнаружено у ряда лигнинразрушающпх грибов-возбудителей белой гнили древесины, у базндиомнцета-возбудителя бурой гнили, не разрушающего лигнин (Coniophom puteona), у фптопатогенных базиднальиых грибов, а также у ряда почвенных грибов, относящихся к возбудителям «мягкой гнили» древесины [Henriksson et.al., 2000]. Функция этого фермента в процессе разложения липтоцеллюлозы окончательно не выяснена. Полагают, что ЦДГ может генерировать но реакции Фентона вы со кореа к цио ни »способные ОН-радпкалы, разрушающие ксенобиотики (Hyde, Wood, 1997]. Реактив Фентона образуется в результате восстановления ферментом растворенного кислорода до перекиси водорода, а также ионов Fe]+ до Fe3+ при окисления цел лоб позы в процессе ферментативного гидролиза целлюлозы. Поэтому нельзя было a priori исключить аналогичное действие ЦДГ при деградации атразнна грибом-продуцентом.

Для проверки этого предположения исследовали синтез ЦДГ и целлюлолитических ферментов грибом в бесцеллюлозной среде, в процессе разложения атразина, а также в его отсутствие- До последнего времени считалось, что ЦДГ является строго индуцибельным ферментом, синтезируемым только в присутствии целлюлозы либо небольших концентраций целлобиозы [Henriksson et. al., 2000}. В диссертационной работе впервые показан синтез ЦДГ грибом Chaetomium sp. на минимальной среде в отсутствие целлюлозы или целлобиозы. Активность ЦДГ обнаруживалась у культуры как на плотной (по обесцвечиванию ДФН вокруг блоков культуры в присутствии целлобиозы, рис, 3 2), так и в жидкой среде (рис. 13),

В жидкой среде наблюдали также предшествующее появлению ЦДГ образование цел л юл аз и р-глнжозидазы, В жидкой среде обнаружено также стимулирование атразином синтеза ЦДГ, Максимум активности ЦДГ соответствовал 31-сут культуре. При этом более 80% фермента секретировалось в среду, в отличие от р-глюкозидазы, которая была Преимущественно связана с мицелием и выходила в среду только к концу ферментации (вероятно, в результате автолиза).

100*

-80

-60

■40

-20

10 15 20 25 30 35 40

су г

Рис,12 Качественное определение Рис. 13. Динамика активности

ЦДГ при культивировании целлобнозодегндрогеназы (ЦДГ) при

СЬаеютшт 5р. ИНБИ 2-26- с культивировании гриба Онтюниаш

атразином (20, 50, 100 мкг/мл зр, ИНБИ 2-26- в присутствии (/) и в

соответственно). А, Б — 281>С, В - отсутствие (2) атраэииа, концентрация

37"С, атразина (.-¡).

Так как р-глюкоз и да за и ЦДГ имеют общий субстрат (цел л об позу), можно пред полол; нть, что онн выполняют в ходе гидролиза целлюлозы противоположные функции: ЦДГ, возможно, генерирует в присутствии целлюлозы активные частицы для разрушения структуры субстрата либо ксенобиотиков, а р-глюкозидаза выполняет трофическую функцию н.

IB

возможно, защищает мицелий гриба от действия ЦЦГ, лишая последнюю субстрата.

Вместе с тем, отсутствие целлюлозы в среде культивирования гриба ставит вопрос о механизме индукции ЦЦГ и происхождении целлобиозы, необходимой для ее действия. Индукция целлюлаз и fí-глюкозндазы у мнцелиальных грибов, выращенных на глюкозе, - явление известное [limen et al., 1997). Предполагают, что синтез этих ферментов начинается в голодающем мицелии после истощения глюкозы, причем индуктором выступает образуемый конститутивной (í-глюкоз ид азой мицелия продукт трансгликозплпроаания типа дисахарида софорозы [Kubicek et, al., 1993]. Возможно, аналогичный механизм запускает и синтез ЦЦГ. Однако источник целлобиозы, необходимой для проявления активности ЦЦГ, остается пока невыясненным.

4. Возможные пути разложения атрязния почвенным мицелпальныч

грибом ИПБН 2-264.1. Сшп ез грибом метаболита, аналогичного дехлорирован пому

гид роке и производному атразина Наиболее типичными продуктами деградации атразина □ почве и фунтовых водах считают его дегало ген про ванные (гидроксиатразнн) н деапкилнрованные (дезэтилатразин, дезнзопропнл атразин) производные. В литературе имеются сведения о том, что атразин разлагается почвенными грибами с образованием деалкилированных производных [Levanon, 1993]. Бактерии же преимущественно разлагают атразин через дегалогенировам не. Поэтому представляло интерес выяснить, какие производные атразина образуют выделенные грибы в процессе его деградации, Дезэтил атразин и гидроксиатразнн определяли с помощью офВЭЖХ в линейном градиенте ацетоннтрила (рис. 14).

Рис,И. Хроматограммы гидроксиатразина (ОА), дезэтялатразнна (ЭА) п атразина (А1г).

При этом в культуральной жидкости гриба ИНБИ 2-26-, выращенного в присутствии атразина, наблюдали пик, соответствующий гндроксиатразину. Однако в контрольной культуре гриба, не содержащей атразина, на 7-е сут

также обнаружено вещество, совпадающее но времени удерживания с гндроксиатразином (рнс.15). Это не позволяет однозначно утверждать, что продуктом разложения атразина грибом 2-26- является гндрокснатразин.

0.11

0.10

3

0.«

0.00« £ 4 ■ 0 10 Ii Н 1ft 11 at

Mum

Рис. 15. Хроматограмма культуральной жидкости гриба-продуцента ЦДГ на 7 сутки роста в отсутствие атразина.

Вместе с тем, на 14 сут продукция метаболита в контроле отсутствовала, тогда как в опытных ферментациях идентифицировали гндрокснатразин. Возможно, атразин утилизируется грибом ИНБИ 2-26- именно потому, что гндрокснатразин сходен с одним из нормальных метаболитов данного гриба и может встраиваться в его метаболизм [Скрябин, 1976].

4.2. Разложение атразина модельной системой целлюлаз и целлобнозодегндрогеназы гриба Chaetomium sp. И ИБП 2-26-, адсорбированной на аморфной целлюлозе

Как уже отмечалось, многие авторы рассматривают ЦДГ как источник ОН-раднкалов, генерируемых ферментом в ходе ферментативного гидролиза целлюлозы за счет восстановления кислорода до перекиси водорода и ионов Fe1+ до FeJ\ Разложение атразина под действием реактива Фентона, синтезируемого химическим или электрохимическим путем, - достоверно установленный факт [Ventura et al., 2002, Jiirva et al„ 2002, Chan et a!., 2003]. В этой связи представляло интерес исследовать способность внеклеточной ферментной системы, синтезируемой грибом 2-26-, разлагать атразин в присутствии ионов Fe3+ в кислой среде, где реактив Фентона наиболее эффективен. Моделирование данной реакции in vitro проводили путем специфической адсорбции внеклеточных целлюлаз и ЦДГ гриба 2-26-непосредственно из культуральной среды на аморфной целлюлозе. При этом был получен иммобилизованный ферментный комплекс, обладающий выраженной восстановительной способностью по отношению к субстратам ЦДГ в отсутствие экзогенно добавленной цел л о б] юзы (целлобноза образовывалась в результате действия адсорбированных целлюлаз на подложку - аморфную целлюлозу). На рис. 16 показан состав ферментного комплекса, адсорбированного на целлюлозе, определенный с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Основными компонентами комплекса являются целлобиогидролаза I (мол.масса 66 кДа) и

ЦДГ (мол. масса 95 кДа), а также, вероятно, ее димер с мол. массой ок. 200 кДа [Карапетян, 2004].

'р.

<иЛ ы

«Л ь ~

-и •

.11 т

А

#

Рис. 16. Электрофорез адсорбированного на аморфной целлюлозе целлюлазного комплекса СИаеюпнит яр. ИНБИ 2-26-, Слева - маркерные белки.

Инкубация данного комплекса с атразнном а присутствии ионов Ре * при рН 4,0 при перемешивании показала, что за неделю концентрация атразнна снижается примерно вдвое (рис. 17).

зт

п ев О,

100 906070 60 50

4 6 сутки

10

Рис. 17, Разложение атразнна адсорбированной на аморфной целлюлозе внеклеточной ферментной системой гриба СЬаеютшт яр. ИНБИ 2-26- в присутствии ионов Ре3+ (0,1 мМ в 0,1 М Иа-ацетатном буфере, рН 4,0) при 20"С.

Этот результат подтверждает возможную роль ЦДГ гриба 2-26- в разрушении атразнна через генерацию ОН-раднкалов в процессе ферментативного гидролиза целлюлозы в присутствии ионов железа.

Выводы

h Нецел л неполитические (Himucoh spp.) и целлюлолитические (Pénicillium spp., Papulaspora sp.) культуры термофильных мнцелиальных грибов, выделенные из сам оразогре бающихся растительных к ом л остов, не разлагают а заметкой степени атразина за 3 нед. в жидкой культуре, однако ксенобиотик может изменять не только родовой, но и внутри видовой состав популяции, противоположным образом влияя на разные штаммы одного вида.

2. В разлагающем атразнн сообществе мезофшшшх мицелнальных грибов ИНБИ 2-26, выделенном из загрязненной диоксинам» тропической почвы, с помощью ПЦР-анализа фрагментов генов 5S-, 18S- и 2SS-pPHK идентифицирован продуцент целлобиозодегидрогеназы Chaeiamiitm sp. ИНБИ 2-26-,

3. В жидкой минимальной среде с содержанием ксенобиотика 20 мг/л оба гриба разлагают 70% атразина за 4 нед. На плотной среде грибы способны развиваться при содержании атразина до 500 мг/л, однако рост ИНБИ 2-26-при этом задерживается на 6 сут,, а рост ИНБИ 2-26+- на21 сут.

4. Малые концентрации атразина (до 50 мг/л) на 20-30% стимулируют рост Chaetomiwn sp. ИНБИ 2-26- и оказывают защитное влияние при адаптации гриба к повышенной температуре.

5. Атразнн стимулирует лакказную активность штамма ИНБИ 2-26+ на плотной среде, хотя корреляции его разложения с активностью лакказы в жидкой среде не обнаружено.

6. Впервые установлена способность гриба-продуцента ИНБИ 2-26-синтезировать цел л об иозоде гн дро геназу на бесцеллюлозных средах. Синтез ЦЦГ запаздывает по сравненшо с синтезом целлюлаз и р-глюкозндазы на 714 сут, причем, в отличие от преимущественно связанной с мицелием (3-глюкозидазы, ЦЦГ преимущественно выделяется в среду. Атразнн (20 мг/л) стимулирует синтез ЦЦГ, целлюлаз и Р-глюкозндазы продуцентом.

7. Впервые установлена возможность разложения около 50% атразина (100 мг/л) при инкубации в течение 10 сут в жидкой среде с адсорбирован и oil иа аморфной целлюлозе пол и ферментной системой целлюлаз и ЦЦГ Chaetomiwn sp. в присутствии ионов железа (0,1 мМ).

8. Обнаружено, что при росте на жидкой среде гриб Chaetomiwn sp. 11 НЕМ 226- сегрегирует соеднненне, время удерживания которого при офВЭЖХ совпадает со временем удерживания гидрокснатразина.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (фанты 02-04-49033 и 03-04-20002

БНТС_а), Министерства промышленности, науки и технологии РФ

(Международный проект № 43.700.11.20 в рамках межправительственного

соглашения между РФ и СРВ о научно-технологическом сотрудничестве №

0248/01/01), а также Европейского Союза (INCO-Copemicus project № IC15-

CT98-0I03).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Khromonygina V.V. // Process of thermophilic composting and its role ¡11 sustainable agriculture in Theoretical and Applied Ecological Investigations // Proceedings of Firs! International Conlerence of Ecological Faculty students and post-graduates. Москва, РУДH, 1999.P.5.

2. Хромоныгина В.В, // Компостирование и его роль в устойчивом сельском хозяйстве. // сборник научных трудов «Актуальные проблемы экологии и природопользования», Москва, РУДН, 2000,С.18,

3. Koroleva O.V., Stepanova E.V., Landesman Е.О.. Vasil'chenko L.G., Kltromotiygina V.V., Zherdev A. V., Rabinovicli M.L, // In vitro degradation of the herbicide atrazinc by soil and wood decay fungi controlled through EL1SA technique, // Toxicological and Environmental Chemistry. V. 80, № 3-4. P, 175188. 2001.

4. Королева O.D, Степанова E.B,, Ландесман E.O., Васильченко Л.Г., Хромоныгнна В.В., Жердев А.В., Рабинович М,Л. // Иммуноферментый анализ разложения гербицида почвенными и древораз решающими грибами. //Прнкл. биохим. микробпол., 38, №4. С, 413-413. 2002.

5. Васильченко Л,Г., Хромоныгипа В.В., Королева О.В., Ландесман Е.О,, Гапоненко В.В., Ковалева Т.А,, Козлов Ю.П., Рабинович М.Л. // Потребление трназикового гербицида атразина лакказным н безлакказным вариантами почвенного гриба Myceliasiertlia ИНБИ 2-26. // Прикл. биохим. микробиол. 38, W« 5. С. 534-539. 2002.

6. Хромоныгина В.В., Васильченко Л.Г., Козлов Ю.П., Рабинович М.Л7/ Разложение гербицида атразина почвенным грибом, выделенным из тропических почв с высоким остаточным содержанием диоксинов, // Тезисы постерного сообщения на I Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние, перспективы развития»!4-!8 октября 2002. С,137.

7. Хромоныгина В.В., Васильченко Л.Г., Козлов Ю.П., Рабинович М.Л // Потребление атразина почвенными грибами, выделенными из диоксин содержащих тропических почв» тезисы сообщения на 7-ой Путинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" 14-18 апреля 2003. С, 136.

8. Хромоныпша В.В., Васильченко Л.Г., Рабинович М.Л,, Козлов Ю.П. // Разложение триазинового гербицида атразина мнцелиальными грибами из тропических почв, //Тезисы постерного сообщения на II Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние, перспективы развития»Ю-14 ноября 2003. С.42,

9. Хромоныгнна В.В., Васильченко Д.Г., Салтыкова А.И, Козлов Ю.П., Рабинович М.Л. И Разложение гербицида атразина почвенным мицелиальным грибом ИНБИ 2-26- - продуцентом целлобиозодегидрогеназы, // Прнкл. биохим. мпкробнол, Т, 40, № 3, С.337-343. 2004.

МИЦЕЛИАЛЬНЫЕ ГРИБЫ II ВОЗМОЖНОСТЬ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ В ПОЧВЕ

Показано, что атразин может изменять состав популяции термофильных микромицетов саморазогревающегося растительного компоста, избирательно стимулируя пли угнетая не только организмы разных родов, но и разные штаммы одного вида.

С помощью ПЦР-анализа установлена таксономическая принадлежность одного из неспорулнрующих мицелиальных грибов, выделенных из разлагающего атразин сообщества ИНБИ 2-26.

Показана толерантность этих грибов при концентрациях атразнна до 500 мг/л и активацкя роста концентрациями до 50 мг/л, а также их способность почти полностью разлагать 20 мг/л ксенобиотика за 6 недель.

Впервые обнаружены синтез целлобнозодегидрогеназы и ряда целлюлолитических ферментов грибом Chaetomium sp, ИНБИ 2-26- на бес целлюлоз ной среде и его промотирование атразпном; показано промотирование атразином синтеза лакказы у ИНБИ 2-26+, Впервые показана способность бесклеточной системы, состоящей из целлюлаз и ЦЦГ гриба Chaetomium sp. ИНБИ 2-26 (-), совместно адсорбированных на целлюлозе, разлагать атразин в присутствии ионов железа.

Filamentous fungi and their applicability for xenobiottc detoxification in soils

Atrazine was shown to be able of altering the composition of thermophilic fungaJ community isolated from self-heating plant compost by means of selective suppression or stimulation of both different species and different strains within the same species.

One of two non-spore-form in g filamentous fungi from a trazine-decom posing soil fungal community INBI 2-26 was identified as Chaetomium sp. 1NBI 2-26- by means of PCR-analysis of their rRNA genes. Both were shown to grow in the presence of up to 500 mg/1 atrazine and to consume 20 mg/1 atrazine almost completely in 6 weeks. Atrazine (up to 50 mg/1) was also observed to stimulate the growth of Chaetomium sp., whereas its higher (100-500 mg/1) concentrations inhibited the development of both strains.

De novo synthesis of cellobiose dehydrogenase and cellulases by Chaetomium sp. INBI 2-26- was first demonstrated during cultivation of the fungus in eellulose-free medium, atrazine stimulating the enzyme formation. Production of laccase by the second fungus INBI 2-26+ was also shown to be stimulated by atrazine. The ability of extracellular enzyme system consisting of duietomhim cellobiose dehydrogenase and cellulases adsorbed onto cellulose was first established to decompose atrazine at pH 4,0 in the presence of Fe,+ ions.

Типография 1ШАШ РАН, г Москва, М. Харитоньевский пер , 4

Лиц, ПД № 00492 от 12,04.2000

Зак. № }{к от 01? 20Й/ тир, /00 экз.