Сообщество неспорулирующих мицелиальных грибов ИНБИ 2-26 из диоксинсодержащих тропических почв

Васильченко, Лилия Григорьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сообщество неспорулирующих мицелиальных грибов ИНБИ 2-26 из диоксинсодержащих тропических почв
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Сообщество неспорулирующих мицелиальных грибов ИНБИ 2-26 из диоксинсодержащих тропических почв"

л- ЪШ9

На правах рукописи

ВАСЛЛЬ ЧЕНКО Лилия Григорьевна

СООБЩЕСТВО НЕСПОРУЛИРУЮЩИХ МИЦЕЛНАЛЬНЫХ ГРИБОВ ИНБИ 2-26 113 ДНОКСИНСОДЕРЖАЩИХ ТРОПИЧЕСКИХ ПОЧВ

Специальность 03.00,16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —2003

Работа выполнена в Экобноцентре экологического факультета ГоссиПского университета дружбы народов и Института биохимии им. А. Н. Баха РАН

Научны» руководитель:

доктор биологических наук, профессор ЮЛ. Козлов Консультант:

доктор химических наук, профессор МЛ. Рабинович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор М.С. Крицкий доктор биологичєскіїх наук, профессор B.C. Орлова Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г, К. Скрябина РАН

Российском университет*» .^ужбы народов по адресу: 113093, Москва, Подолі-' шоссе 8/5, экологический факультет РУДН.

( ч

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского V" ^ситета дружбы народов по адресу: 117923, г. Москва, ул. ¿.шклухо-Маклая, д. 6.

Авторефер:" ; дослан «_ S » __2003 г.

Защита диссертации состоится « fty » часов ка заседая); ;

» U КЭи^ 2003 г. в ■иного совета Д 212.203.17 в

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биолег: ■ є-ЗЙлї Н.А.Черных

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Разложение персистентных ксенобиотиков, в том числе наиболее опасных из них - диоксинов, представляет серьезную экологическую проблему, так как они обнаруживаются в почвах и грунтовых »одах через многие годы после завершения применения (James et.al., î 995, During, Hammel, 1999). Деградация ароматических соединений в почве происходит благодаря двум основным компонентам почвенной биоты - мицелиальным грибам I! бактериям. Результатом является частичная минерализация, а также образование гумусовых веществ. У бактерий разложение ксенобиотиков ароматической природы может обеспечиваться, например, системой ферментов, включающей катехол-1,2-диоксигенаэы, муконатшюоизомеразы, дненлактон-гидролазы и муконолактон-изомеразы (Moiseeva, Golovleva et al, 2002). Способность грибов к деградации ксенобиотнков ароматической природы связана с их приспособлеинностыо к трансформации лигнина - сетчатого фенилпропанондного полимера нерегулярного строения, который является основным неуглеводным компонентом растительного опада. Наиболее мощными деструкторами ароматических биополимеров являются баз идиом ицеты-возбудители белой гнили древесины, Этн специфические организмы имеют целый набор внеклеточных ферментов, способных полностью минерализовать трехмерную матрицу лигнина (Леонтьевекий, 2002, Рабинович и др., 2001,).

Наименее изучены механизмы разложения ксенобиотиков ароматической природы почвенными мицелиальными грибами. Между тем, именно они, наряду с бактериями, составляют основную массу обитателей почв и перерабатывают большую часть лигнина, поступающего в почву. У почвенных грибов ключевую роль в разложении ароматических ксенобиотиков отводят внеклеточным полифенол оксид азам (лакказам), способным конденсировать их с шгзкомолекулярнымн предшественниками гуминоаых кислот или фульфокислот (Bollag et al., 1979,2002).

У базндиомнцетов хорошо изучены также ферментативные системы сопряженной трансформации полисахаридов и фенолышх соединений, в которых участвуют целлюлозы, лакказы и целлобиозодегидрогеназы (Eriksson et at., 1974, Eggert et al., 1997). Значительно меньше изучены подобные системы у почвенных грибов. Известны лишь два примера - термофильные штаммы MyceUophihora thermophifa и Humicoía insokns (Schuiein et al, 199S, Schneider et al, 1996), образующие полный набор этих ферментов, однако уровень синтеза пол и фенол оке и даз у них значительно уступает таковому у базндиомнцетов,

В плане изучения механизмов микробного разложения токсичных ароматических соединений большой интерес представляют микробиоты почв, испытывающие продолжительное селекционное давление. Примером подобных ценозов являются обширные территории Южного Вьетнама, подвергшиеся интенсивной обработке дефолиантом Agent Orange (смесь 2,4-ди хлор- и 2,4,5-трихлоргЬенокснуксусной кислот с nF"y"i1" .n.ii"r"nii"n) в годы воПны

с США и сохранивший относитеш^ содержание диоксинов.

Актуальность включением данной

темы в план научных х j м и и им. А.Н.Баха РАН. Работа

поддерживалась также международным Российско-Вьетнамским научным проектом «Имтербпохим» (Разработка биотехнологий получения и применения физиологически активных соединений н ферментных препаратов), финансируемым Мннпромнаукой РФ в 1996-2000 и 2001-2003 гг., проектом 1С15-СТ98-0ЮЗ "Reuse of biomass of agro-indus tri al origin for soil fertilization and sustainable agriculture", финансируемым ЕС в 1998-2001 г.. и грантом РФФИ № 02-04-49033 «Механизм ферментативного разложения высокоупорядоченных нерастворимых биополимеров» в 2002-2003 гг.

Цель » задачи исследований

Цель работы заключалась в изучении механизмов адаптации мицелиальных грибов - важнейших компонентов почвенной б ноты - к стойким ксенобиотикам ароматической природы.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:

- определение обшей численности грибов и актиномицетов в почвах с высоким содержанием перс патентных ксенобиотиков,

- создание коллекции грибов-продуцентов лакказы,

- отбор оптимального продуцента лакназ и первичная характеристика выделяемых им ферментов,

- проверка гипотезы о лакказной активности почвенных грибов как необходимом условии деградации ароматических ксенобиотиков,

- характеристика действия выделенных грибов на натуральный лигноцеллюлозный субстрат и его сопоставление с действием баз иди омицето в-возбудителей белой гнили древесины - эффективных разрушителей лигннна и стойких ароматических ксенобиотиков (Леонтьевский, 2002);

- изучение спектра внеклеточных ферментов грибов из диоксннсодержащих почв.

Научная новизна

Показано, что большинство выделенных почвенных грибов образует полифенолоксидазы, наиболее активные при нейтральных значениях рН, в то время как актиномицеты образуют ферменты с оптимумом активности в более кислой области рН.

Отобрано сообщество иеспорулирующих грибов ИНБИ 2-26, сравнимое но лакказной активности с баз иди ом и цетам п-возбу дител я м 11 белой гнили порядка Polyporales.

Разработан метод анализа состава сообществ неспорулирующих грибов путем получения и селекции протопластов. В составе сообщества ИНБИ 2-26 этим методом обнаружены два организма - продуцент лакказы и продуцент целлобиозодегидрогеназы и ьыделены наиболее активные их штаммы. Для характеристики роста грибов в смешанной культуре предложен метод селективного определения лакказы » целлобиозодегидрогеназы при совместном присутствии.

Показано, что новое сообщество и составляющие его грибы хорошо растут на л игн о целлюлозном субстрате, разрушая как полисахариды, так и лнгиин. Однако отбеливания субстрата не происходит, в отличие от лигнин разрушающих базидномнцетов. Таким образом, реализуется ранее не изученный способ разложения лигнина.

Показано, что основная форма лакказы штамма 2-26(+) отличается от всех ранее описанных лакказ грибов смещенной в щелочную область изоэлектрической точкой.

Установлены способность выделенного сообщества разлагать стойкий гербицид атраэнн в жидкой среде и отсутствие корреляции между разложением атразнна и лакказкой активностью.

Практическая значимость работы

Предложены общие подходы к анализу сообществ грибов, секретирующих взаимодополняющие внеклеточные ферменты.

Выделены новые штаммы-продуценты лакказы и цел лоб 11 озоде ги дро ге наз ы, используемых при создании биосенсоров для анализа фенолов и хинонов в сточных водах, а также биогенных катехоламиноа в физиологических жидкостях (Ярополов и др., 2002), Важным достоинством новых продуцентов является то, что образуемые ими ферменты имеют оптнмумы активности в области рН близкой к нейтральной, а не в кислой области, как у большинства кснлотрофных грибов.

Новые грибы н их ферменты могут быть использованы также для создания новых экологически чистых конструкционных материалов на основе древесного волокна (Болобова и др., 2002) и для бноремедиацин территорий, загрязненных стойкими ароматическими ксенобиотиками.

Публикации п апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах, имеющих им пакт-фактор, 2 статьи в материалах Европейских конференций и 3 тезисов докладов. Основные положения диссертации представлены на 18 Симпозиуме «Biotechnology for Fuels and Chemicals" (Гэтлинбург, 1996), Симпозиуме «Gas, Oil and Environmental Biotechnology» (Денвер, 1996), 9-й Европейской конференции «В iomass for Energy and the Environment» (Копенгаген, 1996), международной конференции «Биокатализ 2000» (Москва, 2000), 10-й Европейской конференции «Biomass for Energy and Industry» (Вюрцбург, 1998), 1-й Международной конференции по биотехнологии (Москва, 2002).

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на ^ЗЪ страницах, включает Л 3 рисунков и & таблиц. Список цитируемой литературы включает ¿¿¿Наименования, в том числена иностранных языках.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе 1 приведены общие сведения о синтезе и структуре липлиюв, механизмах разложения лпгноцеллюлозы грибами-возбудителями белой, бурой и мягкой гнили древесины, а также почвенными грибами, регуляции активности их внеклеточных ферментов, роли окислительного стресса, сопряжении разложения лигнина и углеводов, способах разложения нефенолькых субструктур лигнина без участия лигнинперокендазы под действием лакказы и марганецпероксидазы, роли

неферментативных механизмов с участием с вободн орали кал ьны х частиц, В главе 2 кратко рассмотрена экология грибов, разрушающих лигноцеллюлозу, включая ксилотрофы и почвенные мицелиальные грибы, их взаимоотношения и сукцессии. Глава 3 посвящена деградации ксенобиотиков базидиомицетами и почвенными мицелиальными грибами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Почвенные образцы отобраны в приповерхностном почвенном слое в весенний сезон 1997 г, на территориях провинции Тай Нинь Южного Вьетнама, подвергавшихся интенеявной обработке дефолиантом Agent Orange в период до 1976 г. и предоставлены Институтом тропической биологин НЦНТ СРВ (г, Хошимин).

Подсчет жизнеспособных спор, клеток или обрывков мицелия в образцах почвы проводили в соответствии со стандартной методикой (Красильни ко в и др., 1966), используя агарнзованную среду Чапека-Докса для грибов и среду Чапека для актнномнцетов.

Скрининг культур грибов и актином И цетов по признаку образования полифенолоксидаз проводили на твердых средах Чапека с гваяколом, эугенолом или катехолом при pH 3,5; 5 или 7. В создании коллекции принимала участие к.б.н. О.В.Королева.

Объекты исследования - культуры грибов и актином и цетов, отобранные в результате скрининга по признаку образования полифенолоксидаз. Основная часть работы посвящена изучению сообщества неспору л ирующих грибов ИНБИ 2-26 с высоким уровнем синтеза лакказы, а также чистых культур 2-2б(+) (продуцент лакказы) и 2-2б(-) (продуцент целлобиозодегидрогеназы, CDH), полученных из этого сообщества методом селекции протопластов. Для сравнительных исследований использовали штаммы базидиальных грибов Corîolus hirsutus, Cerrena maxima, Corioius zonalus из коллекции культур Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН, любезно предоставленные к.б.н. О.В.Королевой, к штамм THchoderma reesei 6/16 (Жалсрайн, 1993).

Выделение ми стык культур 2-2б(+) и 2-26(-) путем селекцнц протопластов. Для получения протопластов использовали 20-ч мицелий сообщества ИНБИ 2-26, выращенный на жидкой среде GAE (Benitez, 3975). В качестве лнтического препарата применяли л иофил тированный пищеварительный сок виноградной улитки H. pomatia. Для идентификации лакказных и безлакказных клонов в реге нерацио иную среду вносили гваякол (0,2 мг/мл). Отбирали колонии, образующие черно-коричневые зоны наибольшего диаметра, а также быстрорастущие колонии, не образующие зон при длительной инкубации.

Характеристика штаммов 2-26(+) и 2-2 б(-). Морфологические особенности и скорость роста культур определяли на плотных средах Чапека-Докса, картофельно-глюкозном агаре и сусло-агаре при 20, 28 и 37"С.

Для проверки на совместимость грибы выращивали при 28°С на плотной среде Чапека-Докса с тонко измельченной овсяной соломой (20 г/л) в качестве единственного источника углерода.

Культивирование грибов на средах с овсяной соломой проводили в колбах двумя методами: твердофазным (при влажности 75%) н жидкофазным поверхностным в течение 60-70 суток. На разных стадиях роста определяли количество биомассы грибов, а также периодически отбирали пробы культуральной жидкости. Скорость ферментативного разложения целлюлозы соломы определяли при поверхностном выращивании. После удаления мицелия солому отделяли от культуральной жидкости, промывали, добавляли NaN3 для предотвращения роста микроорганизмов и инкубировали в течение 3-5 сут при 28"С н рН 4,5, ежедневно анализируя концентрацию Сахаров в супернатанте. Определяли среднее количество восстанавливающих Сахаров, образуемых за сутки, с помощью гидразида п-окснбензойной кислоты (Lever, 1973). По окончании ферментации во всех образцах соломы определяли легкошдролизуемые (гем и целлюлозы) и тру д но гидро л изу ем ы е (целлюлоза) полисахариды, массу сухого остатка и содержание лигнина по Комарову, Анализ состава соломы, обработанной грибами-возбудителями белой гнили, выполнен к.б.н. Е.В.Степановой.

Для изучения синтеза внеклеточных поли фенол оке идаз культуру 2-26(+) выращивали при 28"С в колбах на жидкой среде состава (г/л): NaNOj -3, KJ-bPOj - 1, MgS04 - 0.5, КС! - 0.5, CuS04 - 0.125, пептон Difco - 3, дрожжевой экстракт Dtfco -3, глюкоза - 10, гваякол - 0,1 мМ, без перемешивания в течение 10-11 сут. Для изучения синтеза целлюлаз и совместного синтеза целлюлаз, пол и фенол оке ид аз и целлобиозодегидрогеназы штаммы выращивали при 28"С в колбах на качалке в среде со свекловичным жомом (2%), пшеничными отрубями (2%) и солями (г/л): NaN03 - 1.5, (NH,)îS(Xi - 1.5, КН:Р04 - 1.0, MgS04 - 0,5 в течение 8 сут. Биосинтез целлобиозодегидрогеназы изучали при глубинном культивировании штамма 2-2б(-) в среде для образования целлюлаз, в которой свекловичный жом заменяли другими целлюлозным» субстратами.

Активности ферментов. Эндоглюканазную активность качественно оценивали в плотной среде, содержащей в качестве субстратов сшитую окрашенную А ZCL-окснэти л целлюлозу (MegaZyme, Австрия) или КМ-целлюлозу (с проявлением Конго красным). Активность полнфенолокендаз определяли на S peco rd M 40 при 410 им с катехолом (1 мМ) в качестве субстрата. Активность целлобиозодегидрогеназы, как правило, определяли с целлобиозой (0,1 мМ) или лактозой (0,5 мМ) » дихлорфенол индофенол ом (ДФИ) (0,1 мМ) в качестве субстратов (Henriksson et al., 2000) при рН 6 и 520 нм.

Определение лакказы и CDH при совместном присутствии. Активность лакказы определяли с использованием частично восстановленного FeSO* ДФИ, регистрируя увеличение поглощения при 605 нм в кювете на 1 мл. Затем останавливали реакцию внесением 10 мкл NaNj до конечной концентрации 10 мМ, добавляли целлобиозу (0,05 мМ) и по уменьшению поглощения при 605 нм определяли активность CDH, используя коэффициент экстинкцин 17 мМ*'см*'. При этом учитывали, что азид Na в указанной концентрации ннгнбирует CDH на 40%,

Выделение пол и фс поло кс ил аз включало ультрафильтрацию супернатанта культуральной жидкости штамма 2-2б(+), ионообменную хроматографию на DEAE-Toyopearl 650 M (Tosoli, Япония) при рН 6,5 и хроматографию несорбирующейся фракции на CM-Toyopeart (Tosoh, Япония) при рН 6. Изоэлектрофокусирование обессоленного концентрата культуральной жидкости штамма 2-26(+) в градиенте

сахарозы проводили на оборудовании фирмы LKB (Швеция) в диапазоне pH 3-10 с использованием амфолинов фирмы Pharmacia (Швеция) в соответствии с ре коме н даци я ми ф и рм ы -изгото внте л я.

Спектры поглощения ферментов регистрировали при 200-750 им на спектрофотометре Specord М40 (Carl Zeiss, ФРГ).

Культивирование грибов в присутствии атразина проводили без встряхивания в течение 35-45 сут в жидких (минимальных и полноценных) средах, содержащих атразин в концентрации 20 мг/л. Степень разложения атразина определяли с помощью офВЭЖХ (В ас ильченко и др., 2002), а также иммуноферментного анализа (ИФА), ИФА выполнен Е.О. Ландесман с использованием специфических антител, полученных в лаборатории иммунобиохимни Института биохимии км. А.Н.Баха РАН (Жердев и др., 2000, Королева и др., 2002).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика культур, выделяемых из загрязненных почв. Согласно исследованиям (Мицевич и др., 2000), наиболее чувствительными к диоксинам компонентами почвенной мнкробиоты являются грибы и, в меньшей степени, актином ицеты. Повышение концентрации диоксинов в почвах ведет к заметному уменьшению разнообразия этих микроорганизмов при сохранении их общего титра, т.е. к отбору наиболее приспособленных форм. Определенное нами содержание жизнеспособных спор, клеток и обрывков мицелия грибов и зктиномицетов в 1 г загрязненных почв Южного Вьетнама зависело от типа образца и составляло для ила из оврага (образец 1) 5х103 и 4х105, соответственно, а для почвы кукурузного поля (образец 2) - 6х104 и 2х104, соответственно. Таким образом, титр актиномицетов в обоих образцах был примерно одинаков, тогда как титр грибов в почве с поля на порядок превышал таковой в образце ила. Аналогичные показатели получены в работе (Мицевич и др., 2000) при содержании диоксинов в южновьетнамских почвах 100 и 10-13 нг/кг соответственно.

Как отмечалось выше, в настоящее время основной рабочей концепцией, объясняющей резистентность почвенных грибов к. ароматическим ксенобиотикам, является точка зрения J.-M. Bollag (1979, 2002), считающего, что ключевая роль в их детоксикации принадлежит внеклеточным полифенолоксидазам — лакказам, В этой связи нами было изучено распространение полифенолоксидаз у микроорганизмов двух групп - актиномицетов и грибов, выделенных из загрязненных диоксинами почв. Всего из 2-х образцов было выделено 35 чистых культур актиномицетов, различающихся морфологическими признаками, и 65 культур грибов. Из 100 проверенных культур способность окислять фенольные субстраты проявляли 2/3 грибов и лишь 1/4 актиномицетов, причем грибы преимущественно окисляли эти субстраты в нейтральной, а актиномицеты - в кислой среде.

Таблица. Распределение отобранных культур грію о в и актиномицетов по способности окислять катехол при различных рН

Образец 1 Образец 2 3.5 5.0 7.0 Всего

Г Р И Б Ы

10 9 - - - 19

18 15 - - + 33

1 2 - + + 3

3 2 + + + 5

0 5 + + - 5

32 33 Общее число изученных культур 65

АКТИНОМИЦЕТЫ

19 7 - - - 26

3 1 + + - 4

3 2 + + + 5

25 10 Общее число изученных культур 35

О результате многоступенчатого скрининга отобрано сообщество неспорулирующнх мицелнальных грибов ИНБИ 2-26, обладающее наиболее высокой полифенолоксндазной активностью в широком диапазоне рН. В связи с отсутствием спороношеиия разделение его на чистые культуры включало стадию получения и рассева протопластов на ре генерационную среду с 0,2 г/л гваякола. В ходе селекции протопластов было установлено, что от 7 до 10% клонов образуют темные зоны на среде с гваяколом, что свидетельствует о наличии у них активности полифенолоксидаз. Остальные клоны не обладали такой способ і ¡остью, хотя и не подавлялись гваяколом. Более того, онн частично подавляли образование темных зон соседними колоннами продуцента лакказы.

Таким образом из отобранного сообщества удалось выделить в виде чистых культур два штамма неспорулирующнх мнцелналышх грибов, одни из которых обладал лакказной активностью, а второй не проявлял ее (рис. ().

Образование полифенолоксидаз штаммом 2-2б(+). Для выделения полифенолоксидаз штамм выращивали поверхностно на жидкой среде с глюкозой в присутствии гваякола и ионов меди. Культуру при этом можно использовать дважды (рнс. 2).

Полифенол оксидазы (РО) представлены двумя основным» формами, соответствующими белкам с нзоточками 3.5 (форма РОЇ) и 8 (Р02) (рис. 3). Оба фермента не проявляют активности по отношению к тирозину, т.е. не являются тирозиназамн. При изозлектрофокуснроваиии форме РОІ сопутствуют темнокоричневые пигменты, образуемые грибом на среде с гваяколом, а форме Р02 - зеленоватые щелочные пигменты. Грибные полифенолоксидазы с нзоточками при рН 7 или выше сравнительно редки. Единственным известным нам примером является лзкказа фнтопатогенного гриба ЯЬізосіопїа $о!ат (р! 7,5) (Хи, 1997).

2000

1500

л' 1000

500

1 2 Рис. 1. Штаммы 2-26(+)(1)и 2-2б(-) на среде с гваяколом

Рис. 2. Образование полифенол оке ндаз поверхностной культурой 2-2б(+) на среде с глюкозой. 1 - внесение СиЗО^; 2 - стерильная замена культуральной жидкости на свежую среду с Си50„

номер фракции

Рис. 3, Изофокусированне концентрата культуральной жидкости штамма 2-26(+) в градиенте сахарозы

Рис. 4. Зависимости окисления катехола от рН очищенными РОІ (1) и Р02 (2)

Спектр Р02 имеет выраженный максимум при 600 нм, характерный для «голубых» оке ид аз лакказного типа (Ме58ег$с1шнс11, 1992), тогда как РО! имеет нисходящий спектр в ближней УФ- и видимой области. В ферментных системах лигнинразрушающнх грибов, наряду с обычными голубыми обнаружены также "неголубые" лакказы. Наиболее известным примером является "желтая" лакказа тигрового пилолистинка (Рапия /фч'шм), которая предположительно образуется из соответствующей «голубой» лакказы с нзоточкон в кислой области путем присоединения продуктов трансформации лигнина (Леонтьеве кий, 2002). Выделенная нами форма Р01 (р! 3.5) также проявляет типичную для лакказ

субстратную специфичность н при этом не имеет характерного для лакказ спектра в видимой области. Однако ее принадлежность к "неголубым" лак к азам не может считаться твердо установленной из-за возможной примеси пигментов, не определяемых электрофоретическн.

Оба фермента характеризуются рН-оптимумом полифенолоксндазноЙ активности, близким к нейтральному (6 для Р01 и 6,5 для Р02). Этим они отличаются -от лакказ дре ворззру шлю щи х грибов, которые имеют рН-оптимум окисления фенольных субстратов в более кислой области (4-5). Р02 при этом сохраняет до половины максимальной активности в диапазоне рН от 3 до 8 (рис, 4), При рН 9 оба фермента неактивны.

Образование целлобиозодегидрогеназы штаммом 2-2б(-). Как отмечалось выше, при посеве на селективную среду с гваяколом протопластов, полученных из исходного сообщества грибов, безлакказные клоны частично подавляют окисление гваякола соседними лакказнымн клонами. На основании этих данных было сделано предположение о секреции ими фермента, способного восстанавливать продукты окисления гваякола лакказой. Наиболее известным ферментом такого типа у грибов является целлобиозодегидрогеназа - внеклеточный флавогемопротеид, осуществляющий специфическое окисление целлобиозы, образуемой целл юл азами с одновременным восстановлением хнноков и фенокс и ради калов, образуемых лакказами (Henriksson et al„ 2000, Cameron and A list, 2001). Проверка показала, что штамм 2-26(-) действительно проявляет целлобиозодегидрогеназную активность в среду при культивировании в присутствии источников целлюлозы (рис, 5),

Лакказа к целлобиозодегидрогеназа как специфические маркеры штаммов 2-2б(+) и 2-26(-), Наличие целлобиозодегидрогеназы у штамма 2-2б(-) поставило вопрос о возможности ее синтеза также штаммом 2-26(+) и сообществом ИНБИ 226, Однако ее определение в присутствии лакказы представляло самостоятельную задачу, так как лакказа катализирует обратную реакцию окисления фенольных продуктов целлобиозодегидрогеназы. Так как штамм 2-26(+) и исходное сообщество ИНБИ 2-26 являются активными продуцентами лакказы, активность целлобиозодегидрогеназы в этих условиях не может быть измерена непосредственно. В этой связи нами был предложен метод определения целлобиозодегидрогеназы в присутствии высокой лакказной активности, Метод заключается в селективном ингибировании лакказы на 99,9% азидом натрия в концентрации 10 мМ. Активность целлобиозодегидрогеназы при этом снижается не более чем на 40% и может быть легко измерена обычным методом.

Таким путем установлено, что штамм 2-26(+) не образует целлобиозодегидрогеназы в пределах чувствительности метода определения. Поскольку у штамма 2-26(-) не детектируется активность лакказы, эти ферменты являются удобными маркерами их продуцентов в природном сообществе и смешанной культуре.

0,4

с; |

ь ж

< 0,0

Г\

1 »сутки 20

Рис. 5. Динамика образования внеклеточной це п лоб I юзо деги дроге назы штаммом 2-2б(-) при глубинном культивировании в среде с фильтровальной бумагой

Рис. 6. Совместное культивирование грибов на плотной среде с овсяной соломой, а, 1 - Тг1с!юс!еппа геезе1> 2 -штамм 2-2б(+); б, 1 — штамм 2-2б(-), 2 -штамм 2-26(+); в. 1 - штамм 2-2б(+), 2 -СопоНш гопаш, г. 1 - штамм 2-26(-), 2 - С, гопаНа

Рост грибов на лнгноцеллюлошом субстрате. Отсутствие споруляцни затрудняло идентификацию выделенных грибов и их отнесение к определенному типу разрушителей лигноцеллюлозы. Поэтому было изучено их действие на натуральный лнгноцеллюлозный субстрат (овсяную солому) в сравнении с базидиомнцетами-возбудителями белой гнили древесины, а также с наиболее известным почвенным целлюлолитиком — плесневым грибом Trichodcrma reesei. На чашках штаммы 2-26(+) и 2-26(-) росли несколько медленнее большинства изученных в паре с ним грибов {Т. reesei, С. ht'rsutus, С. maxima), но ни в одном случае не обнаружено антагонистических отношений.

В отличие от выделенных нами штаммов, при совместном культи в про ванн и с базидиомицетами гпфомицет Т. reesei полностью доминировал. Поскольку почвенные грибы p. Trichoderma являются известными микопаразитамн базидномицетов и антагонистами многих фнтопатогенных грибов, в частности, возбудителей корневой гнили, устойчивость к нему выделенных нами грибов (рис. 6а) может свидетельствовать о том, что они не относятся ни к тем, ни к другим.

В отличие от типичных возбудителей белой шили, вызывающих интенсивное осветление'соломы (риа 6в,г), штаммы 2-2б(+) и 2-2б(-) такой способностью не. обладали.

При совместном культивировании на плотной среде с соломой штаммы 2-2б(+) и 2-2б(-) растут примерно с одинаковой скоростью, не подавляя друг друга (рис. 66),

культура

О 10 20 ЗО 40 50 60 сутки

Рис. 7. Характеристика остатка овсяной соломы после жидкофазного поверхностного культивирования грибов в течение 55 суток в % от исходного содержания компонентов. А -гем и целлюлоза, В - целлюлоза, С - лигнин, О - сухой остаток. 1 — С. іпахіта, 2 - С, гопаїих, 3 - 2-26(+)

Рис 8, Накопление биомассы (1), скорость образования Сахаров (2) и изменение рН (3) при поверхностном жидкофаэном культивировании штамма 2-26(+) на среде с овсяной соломой

Также обнаружены определенные отличия между ксилотрофными базидиомитами и грибом 2-26(+) на среде с соломой при поверхностном жидкофазном культивировании.

В условиях, когда растущий мицелий и твердый субстрат были разделены слоем жидкости, базидиомицеты потребляли до 40% полисахаридов, а то время как разложение ими лигнина было незначительным (рис. 7). Единственным организмом, достоверно потреблявшим в этих условиях около 25% лигнина между б-й и 9-й неделями роста, был штамм 2-26(+). Он также разрушал до 50% полисахаридов при общей потере массы соломы около 35%, Фактически разложение лигнина начиналось у него лишь после завершения накопления биомассы и снижения скорости образования растворимых Сахаров. Как видно из рис. 8, восходящая часть кривой, характеризующей разложение целлюлозы соломы в условиях жндкофазного культивирования, коррелирует с накоплением биомассы гриба. Некоторое запаздывание объясняется присутствием растворимых Сахаров в экстрактивных веществах соломы, которые, вероятно, утилизируются первыми. После достижения максимального (стационарного) уровня образования биомассы скорость образования Сахаров из соломы снижалась. Это говорит о первичной роли целлюлаз в ходе развития культуры гриба на натуральном растительном субстрате.

При твердофазном культивировании на увлажненной до 70-75% соломе все изученные культуры грибов развивались хорошо (рис, 9). При этом базидиомицеты сильно осветляли солому, а штамм 2-26(+) нет. При совместном посеве штамма 2-26(+) и возбудителей белой гнили осветления субстрата также не наблюдалось.

культура

Рис. 9.'Характеристика остатка овсяной соломы после твердофазного культивирования грибов в течение 10 нед. в % от исходного содержания компонентов. А - гем! г целлюлоз а, В - целлюлоза, С-лигнин, О - сухой остаток. 1 -С. тах^та, 2- С. 20>ю1и$, 3 - 2-2б{+) и Т.геезег.

Сравнение данных рис. 7 и 9 показывает более эффективное разложение лигнина грибными культурами в условиях твердофазной ферментации. Истинные лнгнинразрушнтели разлагали в этом случае около половины лигнина соломы за ]0 нед. При твердофазном культивировании потреблялось также в три раза больше сухих веществ, чем в жидкой поверхностной культуре (более половины).

Значительно более высокая эффективность твердофазного разложения лигнина соломы показывает, что массообмен между субстратом и мицелием является важным моментом в разложении лигнина. Это позволяет предположить, что процесс разложения лигнина in vivo требует участия короткоживущнх активных частиц, не успевающих диффундировать от мицелия к субстрату через толстый слой жидкости.

В то же время, сравнение разных способов культивирования позволяет сделать вывод, что в разложении целлюлозы главенствующую роль играют внеклеточные ферменты. Наличие большого объема жидкости, разделяющего мицелии и субстрат, не является в этом случае препятствием для разложения полисахаридов.

Способность почвенного гриба 2-26(+), не относящегося к возбудителям белой гнили, разлагать лигнин овсяной соломы в сопоставим о Í5 степени с типичными базнднальнымп ксилотрофами позволяет заключить, что в данном случае речь идет об особом способе разложения лигнина в растительном материале. Это подтверждается и изменением рН в процессе ферментации. В то время как у типичных кснлотрофов разложение лигнина происходит в кислой среде, культивирование штамма 2-26(+) на соломе приводит к сдвигу рН в нейтральную область (рнс. 8),

Совместное культивирование штаммов 2-26(+) н 2-2б(-) па натуральных субстратах: образование лакказноіі и целлобнозодегндрогеназлоГі активностей. В связи с возможностью разложения лигнина выделенными мицелпальиымн грибами представляло (інтерес выяснить характер синтеза внеклеточной лакказы и целлобиозодегидрогеназы при культивировании па натуральных субстратах. В качестве субстратов использовали как свекловичный жом (преимущественно полисахаридныи субстрат), так и овсяную солому.

При глубинном культивировании штамма 2-26(+) на среде со свекловичным жомом и пшеничными отрубями, используемой для индукции синтеза целлюлаз у грибов (Родионова и др., 1974), было обнаружено образование эндо-1,4-р-глюканаз. Секретируемые ферменты проявляли максимальную активность в слабокислой и нейтральной области рН, хотя некоторая активность сохранялась даже при рН ] 0,4. Максимум активности достигался на 6-е сутки, когда рН среды культивирования смещался из кислой в нейтральную область.

Одновременно в этих условиях, характеризующих трофофазу развития гриба, обнаружена и лакказная активность (хотя и меньшая, чем при поверхностном культивировании на среде с глюкозой, гваяколом и Си50^ в условиях идиофазы). Вместе с тем, при глубинном культивировании на богатой среде с глюкозой синтез лакказы не наблюдался даже при добавлении индукторов и избытка ионов меди, несмотря на быстрый рост микроорганизма. Таким образом, наблюдается аналогия с возбудителем белой гнили РИапегосЬае(е сЬ>у$о$рогіит (гассЬі еі аі., 2000), который не образует лнгнинпероксидазы при глубинном культивировании на среде с глюкозой, но образует ее при поверхностном культивировании на глюкозе в условиях вторичного метаболизма либо при глубинном культивировании на среде с целлюлозным субстратом.

Как видно из рис, 10, в среде со свекловичным жомом штаммы 2-26(+) и 2-26(-) образуют специфические для них ферменты: лакказу и целлобнозодегидрогеназу. Наиболее важын вывод состоит в том, что при совместном культивировании в среде обнаруживается активность обоих ферментов, причем она сопоставима с активностью у индивидуальных штаммов. Максимумы активности обоих ферментов при совместном культивировании наблюдаются на 7-е сутки, а при культивировании индивидуальных штаммов несколько запаздывают, но достигают примерно в 1,5 раза более высокого уровня.

Качественно сходные результаты получены и при глубинном культивировании индивидуальных штаммов и смешанной культуры в среде с овсяной соломой (рис, 11), однако активности ферментов при этом были на порядок ниже, а максимумы активності! сдвинуты на 14-е сутки для целлобиозодегидрогеназы и 28-е сутки для лакказы.

1000 750

ш 5

. 500 я

S 250

* 0

гГ \

5 10

сутки

1 2

Рис. 10. Образование лакказы (А) и целлобиозодегидрогеназы (В) штаммами 2-26{-) (I), 2-26(+) (3) и смешанной культурой (2) при глубинном культивирования в среде со свекловичным жомом к пшеничными отрубями

20 30 сутки

Рис. 11. Образование лакказы (А) и целлобиозодегидрогеназы (В) штаммами 2-26(-) (I), 2-2б(+) (3) и смешанной культурой (2) при глубинном культивировании в среде

с овсяной соломой

Таким образом, два мицслиальных гриба 2-26(+) и 2-26(-}, выделенные из сообщества ИНБИ 2-26, способны в присутствии источника целлюлозы осуществлять циклический процесс окисления-восстановления ароматических полнфенольных соединений, В настоящее время такой циклический процесс описан у мощного кснлотрофного гриба, возбудителя белой гнили древесины Руаюрогт cmfiabarimis (Eggert at aL, 1999). Считают, что таким образом гриб осуществляет регенерацию натурального редокс-медиатора - циннабарнновой кислоты. Полагают, что в присутствии этого медиатора лакказа данного базидкомицета способна разрушать нефенольные структуры лигнина, а также персистентные ксенобиотики ароматической природы. Для почвенных грибов такой механизм до последнего времени нзвестен не был.

1008060 40 200-

О 5 10 15 20 25 30 сутки

Рис. 12. Изменение концентрации атразина в зависимости от времени его внесеиня в среду при культивировании сообщества ИНБИ 2-26. 1,2,3- внесение атразина при посеве, на 3-й и 10-е сутки роста

сутки сутки

Рис. 13. Изменение концентрации атразина в среде (А) и образование лакказы (В) штаммом 2-26(+) при культивировании с гваяколом (I), сирннгалдазнном (2) и без

индукторов(3)

Разложение перси стентного гербицида атразина выделенными мицелиальнымн грибами. Атразии (2-хлор-4-(Ы-этил)-6-(Ь1-изопропил)-1,3,5-триазин) является стандартным объектом при изучении способности различных ценозов к разложению стойких ароматических гербицидов. Первоначально была продемонстрирована способность к разложению атразина у исходного сообщества

ИНБИ 2-26 при выращивании на минимальной среде в отсутствие индукторов лахказы и ионов меди. В этих условиях лакказная активность не превышала 1-2% от полученной в оптимальных условиях, однако разложение атразина было обнаружено (рис. 12). Отдельно было показано, что заметной адсорбции атразнна мицелием не происходит.

Для выяснения роли лакказы в процессе деградации атразнна штамм 2-26(+) культивировали в трех вариантах полноценных сред: в присутствии индукторов (гваякола или сирингалдазнна) и без них. Индукторы повышали образование лакказы в 1,5 - 2 раза, однако потребление атразина во всех трех ферментацнях было сходным (рис, 12). В первую неделю после внесения разрушалось в среднем около 20% атразина, а во вторую неделю, после добавления ионов меди и достижения максимальной лаккаэной активности, - лишь около 10%. После 14 суток лакказная активность постепенно снижалась, а скорость разложения гербицида, наоборот, возрастала. Процесс потребления атразина практически завершался при потреблении 80% его исходного количества, хотя лакказная активность в среде все еще оставалась высокой {рис, 13).

Эти данные позволяют предположить, что лакказа не является абсолютно необходимой для деградации этого стойкого гербицида. Это было подтверждено экспериментальными данными, полученными в совместной работе с В.В.Гапоненко и В.В. Хромоныгиной, которые показали, что безлаккаэный штамм 2-26(-) обладает способностью потреблять атразин в такой же степени как и штамм-продуцент лакказы (Васнльченко и др., 2002).

В литературе описан механизм биодеградации ксенобиотиков, включающий генерацию ОН-радикала в реакции Фенгона. Такой механизм, как полагают, используют базидиальные грибы - возбудители бурой гнили, например, Comophora puteam (Hyde and Wood, 1992)). Последняя, как и штамм 2-26(-}, выделяет целобиозодегндрогеназу, которая путем окисления целлобиозы может восстанавливать Felll до Fell и 02 до Н>02 для реакции Фентоиа, Однако возможность участия целлобиозодегидрогеназы в разложении атразина штаммом 2-2б(-) требует специальных исследований.

Выводы

1. Из южно вьетнамских почв, подвергавшихся интенсивной обработке дефолиантом Agent Orange (смесь 2,4-Д и 2,4,5-Т с технической примесью диоксинов), выделено 65 культур грибов и 35 культур актиномицетов. Создана коллекция образующих полифенолоксидазы микроорганизмов с целью проверки гипотезы J.-M. Bollag (1979) об определяющей роли этих ферментов в детоксикацин хлорароматн чески х гербицидов путем их конденсации и последующей гумификации.

2. Из 100 проверенных культур способность окислять фенольные субстраты проявляли 46 культур грибов и 9 культур актиномицетов. Пол и фенол оксидазы большинства грибов были наиболее активны при нейтральных значениях pH, а ферменты актиномицетов - а более кислой области pH.

3. Выделено сообщество неспо рулиру ющих мицелиальных грибов ИНБИ 2-26 с высокой лакказной активностью. Путем селекции протопластов из него выделены две чистые культуры. Одна из них (2-2б(+)) проявляет лакказную активность, сопоставимую с активностью базидиомицетов-возбуднтелеЙ белой гнили порядка Polyporales, а другая (2-26(-)) - целлобиозодегидрогеназную активность. Кроме того, обе культуры образуют целлюлолитические ферменты,

4. При глубинном культивировании на натуральных субстратах (овсяная солома, свекловичный жом и пшеничные отруби) штамм 2-2б(+) образует лакказу, а штамм 2-26(-) — целлобшзодегидрогеназу, причем уровни активности этих ферментов при раздельном и совместном культивировании грибов сопоставимы.

5. При росте на соломе оба штамма не отбеливают субстрат, что отличает их от базидиальных грибов-возбудителей белой гнили древесины. При этом штамм 2-26(+) (продуцент лакказы) за 9 недель разлагает до 40% лигнина овсяной соломы в ходе твердофазного культивирования.

6. Штамм 2-2б(+) - продуцент лакказы - в присутствии ионов меди образует два типа полифенолоксидаз, имеющих оптимум активности по отношению к фенольным субстратам в нейтральной области pH (6-6,5), Один из ферментов имеет характерный для лакказ максимум поглощения в области спектра 600 ям и аномально высокую для ферментов грибов нзоэлектрическую точку (8), Второй фермент, имеющий изозлектрическую точку 3,5, соочищается вместе с темноокрашенными пигментами.

7. Показана способность грибов сообщества ИНЬИ 2-26 разлагать гербицид триазинового ряда (атразин) в процессе культивирования. Однако корреляция между степенью разложения гербицида и лакказной активностью отсутствует. Таким образом, внеклеточная лакказа не является абсолютно необходимым ферментом в детоксикации атразина данными почвенными грибами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ariunaa J., Vasilchenko L.G., Tsetseg В., Pristavka A.A., Rabinovich M. L, Comparison of neutral and alkaline cellulase activities of selected fungi and streptomycetes. In: Diomass for Energy and the Environment (Chartier Ph., etc. eds) V.3. P. 1526-1533. Pergamon. 1996

2. Vasiichenko L.G., Skorobogat'ko O.V„ Stepanova E.A., Landesman E.O., Rabinovich M.L. The screening of neutral phenol oxidase producers among fungal and actinomycetes strains isolated from tropical soils. In: Btomass for energy and industry: 10th European Conference and Technology Exhibition: proceedings of the international conference, Wiirzburg, Germany, 8-11 June 1998 (H. Kopetz et al. eds.) Rimpar, Germany: C.A.R.M.E.N. P.3-23. 1998

3. Васнльченко Л. Г., Королева О.В., Степанова Е.В., Ландесман Е.О., Рабинович М.Л. Выделение и характеристика микромицета — продуцента нейтральных фенояоксидаз из тропических почв с высоким содержанием диоксинов, Прикл. биохим. микробиол. Т. 36. №3. С. 412-421. 2000

4. Королева О.В, Степанова Е.В., Ландесман Е.О., Васнльченко Л.Г., Хромоныгина В.В., Жердев А.В., Рабинович М.Л. Иммунофер м е нты Й анализ разложения гербицида почвенными и древо разрушающим и грибами, Прикл. биохим. микробиол., 38, №4, С. 413-418. 2002

5. Васнльченко Л.Г., Хромоныгина В.В., Королева О.В., Ландесман Е.О., Гапоненко В,В., Ковалева Т.А., Козлов 10.П., Рабинович М.Л, Потребление триазинового гербицида атразина лакказным и безлакказным вариантами почвенного гриба Mycetia sterilia ПНБИ 2-26. Прикл, биохим. микробнол. 38, № 5. С. 534-539. 2002

6. Koroleva O.V., Stepanova E.V., Landesman Е.О., Vasil'chenko L.G., Kliromonygina V. V., Zherdev A. V., Rabinovich M.L, In vitro degradation of the herbicide atrazine by soil and wood decay fungi controlled through ELISA technique, Toxicological and Environmental Chemistry. V. 80. № 3-4. P. 175-188. 2001

7. Степанова E.B., Королева O.B., Карапетян K.H., Васнльченко Л.Г., Явметдинов И.С., Козлов Ю.П„ Рабинович М.Л. Разложение овсяной соломы древо разрушаю щи ми н почвенными грибами. Прикл. биохим, микробиол, Т, 39. №1, С. 74-84. 2003

8. Хромоныгина В,В., Васнльченко Л.Г., Козлов 10.П., Рабинович М.Л. Разложение гербицида атразина почвенным грибом, выделенным из тропических почв с высоким остаточным содержанием атразина. Материалы 1-го Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» М.: 14-18 октября 2002 г. С. 297

9. Карапетян К.Н., Ячкова С.Н., Васнльченко Л.Г., Борзых М.Н., Рабинович М.Л. Целлобиозодегпдрогеназа почвенного гриба ИНБИ 2-26. Там же. С. 449

JO.Rabinovich М., Jalsrain A., Vasilclicnko L., Kozlov Ju. Environmentally safe Ыо techno logical utilization of plant biomass from the areas polluted by heavy metals and radionuclides. 18-th Symposium on biotechnology for fuels and chemicals. Program and Abstracts. Gatlinburg. ТЫ. P.56. 1996

В АС И J1ЬЧ Е H КО Лилия Григорьевна (Россия) Сообщество неспорулкрующнх мнцелнальных грибов Ш1БИ 2-26 из

дпоксиисодержащих тропических почв Из южновьетнамскнх почв, подвергавшихся интенсивной обработке дефолиантом Agent Orange, выделено сообщество 1ШЕИ 2-26, состоящее из двух неспорулирующих мицелиальных грибов: продуцента лакказы и продуцента целлобиозодегидрогеназы, Исходное сообщество и составляющие его грибы разлагают л игно целлюлозные субстраты в сопоставимой степени с базнд но м и цета ми-возбудителям и белой гнили древесины, но при этом не отбеливают субстрат. Ферменты выделенных грибов отличаются от аналогичных ферментов базидиомицетов рН-оптимумом активности, смещенным из кислой в нейтральную область. Как* сообщество в целом, так и индивидуальные культуры способны разлагать стойкий гербицид атразнн, причем скорость его разложения не коррелирует с активностью лакказы в среде культивирования.

Vasiklienko Liliya Grigoryevna (Russia) Community of Non-Spore-Forming Filamentous Fungi 1ÏSB! 2-26 from Dioxin-Coiiiaminated Tropical Soil A community of two non-spore-forming filamentous fungi: one producing laccase and the other producing cellobiose dehydrogenase, was isolated from South Vietnamese soil heavily treated with Agent Orange defoliant. Both original community and its constituents decomposed lignocellulosic natural substrate in comparable degree with white rot xylotrophic basidiomycetes, while causing no substrate bleaching, Laccase and celbbiose dehydrogenase of isolated fungi differ from those of basidiomycetes in the optimum of their activity shifted from acid to neutral pH. Both the community and individual cultures were also capable of decomposing the persistent herbicide atrazine, whereas no correlation was observed between decomposition velocity and laccase activity in the culture medium.

Типография ІШАШ РАН, г Москва, М, ХаріггокьевскнЯ пер., 4

Лиц. ПД Кг 00492 от 12,04.2000

Згк. № /YA от JP- pit 20РЗ тир. WO экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Васильченко, Лилия Григорьевна

Введение

Обзор литературы

Глава 1. Трансформация лигноцеллюлозы грибами

1.1. Синтез и структура лигнинов

1.2. Общие сведения о систематике грибов

1.3. Грибы, разлагающие лигнин. Возбудители белой гнили

1.3.1. Внеклеточные ферменты грибов

1.3.2. Регуляция активности лигнинразрушающих ферментов в условиях вторичного метаболизма

1.3.3. Влияние окислительного стресса

1.3.4. Сопряженная деградация компонентов лигноцеллюлозы

1.3.5. Деградация нефенольных структур лигнина без участия лигнинпероксидазы

1.4. Возбудители бурой гнили

1.4.1. Внеклеточные ферменты 3 О

1.4.2. Неферментативные механизмы

1.5. Возбудители мягкой гнили, почвенные мицелиальные грибы

Глава 2. Экология грибов, разрушающих лигноцеллюлозу

2.1. Грибы, колонизирующие древесные субстраты

2.1.1. Сапрофиты, паразиты

2.1.2. Конкуренция

2.1.3. Сукцессии

2.2. Разложение растительного опада

2.3. Почвенные мицелиальные грибы

Глава 3. Деградация ксенобиотиков грибами

3.1. Базидиомицеты

3.2. Почвенные гифомицеты

Экспериментальная часть

Глава 4. Материалы и методы исследования

4.1. Объекты исследования

4.2. Питательные среды

4.3. Выделение и характеристика микроорганизмов

4.4. Культивирование микроорганизмов

4.5. Методы изучения внеклеточных ферментов грибов 64 Результаты и их обсуждение

Глава 5. Характеристика культур, выделяемых из загрязненных почв

5.1. Скрининг культур по признаку образования полифенолоксидаз

5.2. Анализ состава сообщества ИНБИ 2-26 методом протопластирования

Глава 6. Образование ферментов выделенными штаммами

6.1. Образование полифенолоксидаз штаммом 2-26(+-)

6.2. Образование целлобиозодегидрогеназы штаммом 2-26(-)

6.3. Лакказа и целлобиозодегидрогеназа как специфические маркеры штаммов 2-26(+) и 2-26(-)

Глава 7. Рост грибов на натуральных субстратах

7.1. Культивирование грибов на овсяной соломе

7.2. Совместное культивирование штаммов 2-26(+) и 2-26(-): образование лакказной и целлобиозодегидрогеназной активностей

Глава 8. Разложение персистентного гербицида атразина выделенными мицелиальными грибами 97 Выводы 103 Благодарность 105 Список литературы

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

КМЦ, КМ-целлюлоза - натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, растворимая

ДТТ - дитиотреитол

ДФИ - дихлорфенолиндофенол

ЦФБ - цитратно-фосфатный буфер

ABTS - 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота)

AZCL-оксиэтилцеллюлоза - сшитая оксиэтилцеллюлоза, ковалентно модифицированная азурином

CA - циннабариновая кислота

CDH - целлобиозодегидрогеназа

3-НАА - 3-оксиантраниловая кислота

GSH, GS - глутатион

F3VTN - флавинмононуклеотид

LiP - лигнинпероксидаза

МпР - марганецпероксидаза

NADH - никотинамидадениндинуклеотид

SOD - супероксиддисмутаза

VA - вератровый спирт (вератрол)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сообщество неспорулирующих мицелиальных грибов ИНБИ 2-26 из диоксинсодержащих тропических почв"

Актуальность проблемы. Разложение персистентных ксенобиотиков, в том числе суперэкотоксикантов (диоксинов), представляет собой серьезную экологическую проблему, так как они обнаруживаются в почвах и грунтовых водах через многие годы после завершения применения [James et.al., 1995, During, Hummel, 1999]. Деградация ароматических соединений в почве происходит благодаря двум основным компонентам почвенной биоты -мицелиальным грибам и бактериям. Результатом является частичная минерализация, а также образование гумусовых веществ. У бактерий разложение ксенобиотиков ароматической природы может обеспечиваться, например, системой ферментов, включающей катехол-1,2-диоксигеназы, муконатциклоизомеразы, диенлактон-гидролазы и муконолактон-изомеразы [Moiseeva, Golovleva et al. 2002]. Способность грибов к деградации ксенобиотиков ароматической природы связана с их приспособленнностью к трансформации лигнина - сетчатого фенилпропаноидного полимера нерегулярного строения, который является основным неуглеводным компонентом растительного опада. Наиболее мощными деструкторами ароматических биополимеров являются базидиомицеты-возбудители белой гнили древесины. Эти специфические организмы имеют целый набор внеклеточных ферментов, способных полностью минерализовать трехмерную матрицу лигнина [Рабинович и др., 2001, Леонтьевский, 2002].

Считается, что другие грибы, разлагающие древесину, значительно менее эффективно утилизируют лигнин, чем возбудители белой гнили. Вместе с тем, способность к деградации стойких ароматических ксенобиотиков отмечена в последнее время и у возбудителей бурой гнили, для которых глубокое разложение лигнина нехарактерно.

Наименее изучены механизмы разложения ксенобиотиков ароматической природы почвенными мицелиальными грибами. Между тем, именно они, наряду с бактериями, составляют основную массу обитателей почв и перерабатывают большую часть лигнина, поступающего в почву. У почвенных грибов ключевую роль в разложении ароматических ксенобиотиков отводят внеклеточным полифенолоксидазам (лакказам), способным конденсировать их с низкомолекулярными предшественниками гуминовых кислот или фульфокислот [Bollag et al., 2003]. .

У базидиомицетов хорошо изучены также ферментативные системы сопряженной трансформации полисахаридов и фенольных соединений, в которых участвуют целлюлазы, лакказы и целлобиозодегидрогеназы [Eriksson et al., 1974, Eggert, 1997]. Значительно меньше изучены подобные системы у почвенных грибов. Известны лишь два примера - термофильные штаммы Myceliophthora thermophila и Humicola insolens [Schou and Schulein, 1998, Schneider et al. 1999], образующие полный набор этих ферментов, однако уровень синтеза фенолоксидаз у них значительно уступает таковому у базидиомицетов.

В плане изучения механизмов микробного разложения токсичных ароматических соединений большой интерес представляют микробиоты почв, испытывающие продолжительное селекционное давление. Примером подобных ценозов являются обширные территории Южного Вьетнама, подвергшиеся интенсивной обработке дефолиантом Agent Orange (смесь 2,4-дихлор- и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислот с технической примесью диоксинов) в годы войны с США и сохранившие относительно высокое содержание диоксинов.

Цель и задачи исследовании.

Основная цель работы заключалась в изучении механизмов адаптации мицелиальных грибов - важнейших компонентов почвенной биоты - к стойким ксенобиотикам ароматической природы.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:

- установление состава грибной и актиномицетной микрофлоры почв с высоким содержанием персистентных ксенобиотиков, 7 создание коллекции грибов-продуцентов лакказы, отбор оптимального продуцента лакказ и первичная характеристика выделяемых им ферментов, проверка гипотезы о лакказной активности почвенных грибов как необходимом условии деградации ароматических ксенобиотиков, а также поиск в загрязненных образцах почв штаммов грибов, не образующих лакказы, характеристика действия выделенного гриба на натуральный лигноцеллюлозный субстрат и его сопоставление с действием базидиомицетов-возбудителей белой гнили древесины - эффективных разрушителей лигнина и стойких ароматических ксенобиотиков (Леонтьевский, 2002); изучение спектра внеклеточных ферментов грибов из диоксинсодержащих почв, не образующих лакказы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Трансформация лигноцеллюлозы грибами

Заключение Диссертация по теме "Экология", Васильченко, Лилия Григорьевна

1. Из южновьетнамских почв, подвергавшихся интенсивной обработке дефолиантом Agent Orange (смесь 2,4-Д и 2,4,5-Т с технической примесью

диоксинов), выделено 65 культур грибов и 35 культур актиномицетов. Создана коллекция образующих полифенолоксидазы микроорганизмов с целью проверки гипотезы J.-M. BoUag [BoUag et al., 1979] об определяющей роли этих ферментов в детоксикации хлорароматических гербицидов путем их конденсации и последующей гумификации.2. Из 100 проверенных культур способность окислять фенольные субстраты проявляли 46 культур грибов и 9 культур актиномицетов.Полифенолоксидазы большинства грибов были наиболее активны при нейтральных значениях рН, а ферменты актиномицетов - в более кислой области рН.

3. Выделено сообщество неспорулирующих мицелиальных грибов ИНБИ

2-26 с высокой лакказной активностью. Путем селекции протопластов из него выделены две чистые культуры. Одна из них (2-26(+)) проявляет лакказную активность, сопоставимую с активностью базидиомицетов-возбудителей белой гнили порядка Polyporales, а другая (2-26(-)) - целлобиозодегидрогеназную активность. Кроме того, обе культуры образуют целлюлолитические ферменты.4. При глубинном культивировании на натуральных субстратах (овсяная солома, свекловичный жом и пшеничные отруби) штамм 2-26(+) образует лакказу, а штамм 2-26(-) - целлобиозодегидрогеназу, причем уровни активности этих ферментов при раздельном и совместном культивировании грибов сопоставимы.5. При росте на соломе оба штамма не отбеливают субстрат, что отличает их от базидиальных грибов-возбудителей белой гнили древесины. При этом штамм 2-26(н-) (продуцент лакказы) за 9 недель разлагает до 40% лигнина овсяной соломы в ходе твердофазного культивирования.6. Штамм 2-26(+) - продуцент лакказы - в присутствии ионов меди образует два типа полифенолоксидаз, имеющих оптимум активности по отношению к фенольным субстратам в нейтральной области рН (6-6,5). Один из ферментов имеет характерный для лакказ максимум поглощения в области спектра 600 им и аномально высокую для ферментов грибов изоэлектрическую точку (8). Второй фермент, имеющий изоэлектрическую точку 3,5, соочищается вместе с темноокрашенными пигментами.7. Показана способность грибов сообщества ИНБИ 2-26 разлагать гербицид триазинового ряда (атразин) в процессе культивирования. Однако корреляция между степенью разложения гербицида и лакказной активностью отсутствует. Таким образом, внеклеточная лакказа не является абсолютно необходимым ферментом в детоксикации атразина данными почвенными грибами.Благодарность Автор выражает благодарность своему научному руководителю, доктору биологических наук, профессору, заведующему кафедрой системной экологии экологического факультета РУДН Козлову Ю.П., а также консультанту, доктору химических наук, профессору Рабиновичу М.Л. за ценные советы и критические замечания при подготовке диссертации. Автор сердечно благодарит всех сотрудников и аспирантов Экобиоцентра и особенно Карапетяна К.Н., Хромоныгину В.В., Гапоненко В.В., Комолову Г.С., Федорову Т.В., Рустамьян Ю.Л., Ионову И.И., Ячкову Н., Звереву Е.А., Колобову A.B. , а также сотрудников Института биохимии им. А.Н.Баха РАН Гинак H.A., Жердева A.B. , Королеву О.В., Степанову Е.В., Ландесман Е.О. за помощь в выполнении отдельных экспериментов, обсуждении результатов и оформлении диссертационной работы, а также постоянную поддержку в трудные минуты.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васильченко, Лилия Григорьевна, Москва

1. Ахметова З.Р. Лигнинолитические, ксиланолитические ицеллюлолитические ферменты некоторых базидиальных грибов и их взаимосвязь в разложении лигноцеллюлозы. // Автореф. дис. .. докт. биол. наук. Ташкент - 1999. 42 с.

2. Билай В.И., Никольская О.О., Пидопличко М.М. Глюкозооксидаза из

3. Pénicillium vitale Pidopl and Bilai. Микробиологический журнал. 1968. Т.ЗО.№5. 418-424.

4. Болобова A.B. , Аскадский A . A . , Кондращенко В.И., Рабинович М.Л.

5. Теоретические основы, биотехнологии древесных композитов. Т. 2.

6. Ферменты, модели, процессы. // М.:Наука, 2002. 354 с. 2

7. Васильченко Л. Г., Королева О. В., Степанова Е. В., Ландесман Е. О.,

8. Рабинович М.Л. Выделение и характеристика микромицета - продуцентанейтральных фенолоксидаз из тропических почв с высоким содержанием диоксинов. // Прикл. биохимия и микробиология. 2000. Т.36. №4. 412-421.

9. Васильченко Л.Г., Хромоныгина В.В., Королева О.В., Ландесман Е.О.,

10. Гапоненко В.В., Ковалева Т.А., Козлов Ю.П., Рабинович М.Л. Потреблениетриазинового гербицида атразина лакказным и безлакказным вариантами почвенного гриба Mycelia sterilia ИНБИ 2-26. // Прикл. биохимия и микробиология. 2002. Т.38. № 5. 534-539.

11. Ганбаров Х.Г. Эколого-физиологические особенности древоразрушающихвысших базидиальных грибов. // Баку, ЭЛМ, 1990. 197 с.

12. Горленко М.В. Бондарцева М.А., Гарибова М.В. // Грибы СССР. М.: Мысль,1980. 170-190.

13. Денисова Н. П. Протеолитические ферменты базидиальных грибов,таксономические и экологические аспекты их изучения. // Автореф. дисс. .. докт. биол. наук. Ленинград - 1991.

14. Жалсрайн А. Образование целлюлолитических ферментов Trichodermareesei на труднометаболизируемых соединениях углерода. // Дисс. .. канд. биол. наук, М.: МГУ. 1993. 112 с.

15. Зверева Е.А. Использование протопластов для изучения метаболизмадреворазрушающих грибов. // Дисс. .. канд. биол. наук. М.: Институт биохимии РАН. 2002. 125 с.

16. Капич А. Н. Биосинтетическая активность ксилотрофных базидиомицетов:основные особенности и их адаптационная значимость. // Автореф. дисс. .. докт. биол. наук. М.: МГУ. 1993.

17. Капич А.Н., Шишкина Л.Н. Антиоксидантные свойства дереворазрушающихбазидиомицетов. //Микология и фитопатология. 1992. Т.26. №6. 486-492.

18. Карапетян К.Н., Ячкова Н., Васильченко Л.Г., Борзых М.Н., Рабинович

19. М.Л. Целлобиозодегидрогеназа почвенного гриба ИНБИ 2-26. // Материалы1-го Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» М.: 14-18 октября 2002 г. 449.

20. Квеситадзе Г.И., Квачадзе H.H., Сихарулидзе Н.Ш., Нуцубидзе H.H.

21. Микроорганизмы - продуценты целлюлаз. // Итоги науки и техники.

22. Биотехнология, М.: ВИНИТИ, 1988. Т. 11. 153-220.

23. Королева О.В, Степанова Е.В., Ландесман Е.О., Васильченко Л.Г.,

24. Хромоныгина В.В., Жердев A.B. , Рабинович М.Л. Иммуноферментый анализразложения гербицида почвенными и древоразрушающими грибами. //

25. Прикладная биохимия и микробиология. 2002 Т.38. №4. 413-418.

26. Королева О.В., Рабинович М.Л., Буглова Т.Т., Ярополов А.И. Свойствагалактозооксидазы Fusarium graminearum. И Прикладная биохимия и микробиология 1983. Т.19. №5. 632-637.

27. Красильников H.A. Лучистые грибки (высшие формы). // М.: Наука, 1970.535 с.

28. Красильников H.A. Методы изучения почвенных микроорганизмов и ихметаболитов. // М.: МГУ, 1966. 216 с.

29. Леонтьевский A.A. Лигниназы базидиомицетов. // Дисс. .. докт. биол.наук. Пущино, 2002. 266 с.

30. Мицевич Е.В., Мицевич И.П., Перелыгин В.В., До Нгок Лань, Нгуен Тху

31. Хоай. Микроорганизмы как возможные индикаторы интегральнойзагрязненности почв диоксинсодержащими дефолиантами. // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т.36. №6. 672-678.

32. Мухин В.А. Экологические закономерности формирования и структурабиоты ксилотрофных базидиомицетов Западно-Сибирской равнины. //

33. Автореф. дисс. .. докт. биол. наук. М.: 1990. 32 с.

34. Наплекова H.H. Аэробное разложение целлюлозы микроорганизмами впочвах Западной Сибири. // Новосибирск: Наука, 1974. 251 с.

35. Научные основы устойчивости лесов к дереворазрушающим грибам. // М.:1. Наука, 1992.222 с.

36. Рабинович М.Л., Болобова A.B. , Кондращенко В.И. Теоретические основыбиотехнологии древесных композитов. Древесина и разрушающие ее грибы. / /М.: Наука, 2001. 264 с.

37. Рабинович М.Л., Мельник М.С., Болобова A.B. Структура и механизмдействия целлюлолитических ферментов. // Биохимия. 2002. Т.67. № 8. 1026-1050(а).

38. Рабинович М.Л., Мельник М.С., Болобова A . B . Целлюлазымикроорганизмов. // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т.38. № 4. 355-373(6).

39. Решетникова И. А. Деструкция лигнина ксилотрофными макромицетами. //1. М.: МГУ, 1997. 197 с.

40. Рипачек В. Биология дереворазрушающих грибов. // М.: Леснаяпромышленность, 1967. 258 с.

41. Родионова H.A., Тиунова H.A., Фениксова Р.В., Кудряшова Т.Н.,

42. Мартинович Л.И. Целлюлолитические ферменты Geotrichum candidum. II

43. Доклады АН СССР, сер. Биохимия, Т.214. №5. 1206-1209.1974

44. Саловарова В.П., Козлов Ю.П. Эколого-биотехнологические основыконверсии растительных субстратов. // М.: РУДН, 2001. 331 с.

45. Сарканен К.В., Людвиг К.Х. Лигнины. // М.: Лесная промышленность, 1975.1. 18-79.

46. Степанова Е.В., Королева О.В., Карапетян К.Н., Васильченко Л.Г.,

47. Явметдинов И.С., Козлов Ю.П., Рабинович М.Л. Разложение овсянойсоломы древоразрушающими и почвенными грибами. // Прикладная биохимия и микробиология 2003. Т. 39. №1. 74-84.

48. Степанова Н.Т., Мухин В.А. Основы экологии дереворазрушающих грибов./ /М.: Наука, 1979. 100 с.

49. Феофилова Е.П. Царство грибов: гетерогенность физиолого-биохимическихсвойств и близость к растениям, животным и прокариотам (Обзор). //

50. Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т.37. №2. 141-155.

51. Юлдашев Б.Т., Султанов К., МадьярОв Ш.Р., Рахимов М.М., Рабинович М.Л.

52. Новые нерастворимые окрашенные субстраты для определенияцеллюлазной активности и возможности их применения. // Микробиология. 1992. Т. 28. №4. 162-171.

53. Яковенко К.Н., Троицкий Н.А. Протопласты микроорганизмов. // Минск:

54. Наука и техника, 1985. 160 с.

55. Abramowicz D. А. Aerobic and anaerobic РСВ biodégradation in theenvironment. // Crit. Rev. Biotechnol. 1990. V. 10. P. 241 -251.

56. Ander P., Marzullo L. Sugar oxidoreductases and veratryi alcohol oxidase asrelated to lignin degradation. // J. Biotechnol. 1997. V.53. № 2-3. P. 115-31.

57. Asma D., Yesilada O. Effect of paraquat on cellular defense enzymes andglutathione level of Funalia trogii. // Folia Microbiol (Praha) 2002.V.47. № 4. P. 413-6.

58. Aust S. D. Comparative biodégradation of alkyl halide insecticides by thewhite rot fungus, Phanerochaete chrysosporium (BKM-F-1767). Il Microb. Ecol. 1990. V . 20. P. 197-209.

59. Backa S., Gierer J., Reitberger T. Nilsson T. Hydroxyl radical activity in brownrot fungi studied by a new chemiluminescence method // Holzforschung. 1992. 1. V.46. P.61-67.

60. Backa S., Jansbo K. , Reitberger T. Detection of hydroxyl radicals bychemiluminescence method- a critical review. // Holzforschung. 1997. V.51. 1. P.557-564.

61. Balajee S., D'Souza T. M . , Thorn R. G., Reddy C. A. Lignin-modifying enzymesof a soil basidiomycete Irpex lacteus. II In Program and Abstracts of the 8th 1.ternational Symposium on Microbial Ecology. 1998. P. 299.

62. Baminger U. , Nidetzky В., Kulbe K.D. , Haltrich D. A simple assay for measuringcellobiose dehydrogenase activity in the presence of laccase. // Journal Of

63. Microbiological Methods 1999.V.35. № .3. P.253-259.

64. Baminger U , Subramaniam S.S, Renganathan V. , Haltrich D. Purification andcharacterization of cellobiose dehydrogenase from the plant pathogen Sclerotium (Athelia) rolfsii. II Appl. Environ. Microb. 2001. V.67. № .4. P. 1766-1774.

65. Bao W, Fukushima Y , Jensen K.A-Jr., Moen M.A., Hammel K.E . Oxidativedegradation of non-phenolic lignin during lipid peroxidation by fungal manganese peroxidase. // FEBS Lett. 1994. V.354.№ .3. P.297-300.

66. Beaudette L.E. , Davies S., Fedorak P.M., Ward O. P., Pickard M.A. Comparisonof gas chromatography and mineralization experiments for measuring loss of selected polychlorinated biphenyl congeners in cultures of white rot fungi. // Appl.

67. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 2020-2025.

68. Behrendt C. J., Blanchette R. A . Biological processing of pine logs for pulp andpaper production with Phlebiopsis gigantea. II Appl. Environ. Microbiol. 1997. 1. V.63. P.1995-2000. 1.l l

69. Bending GD, Friloux M , Walker A. Degradation of contrasting pesticides bywhite rot fungi and its relationship with ligninolytic potential. // FEMS Microbiol. 1.tt. 2002. V.212.№ . 1. p.59-63.

70. Benitez T., Ramos S., Acha I.G. Protoplasts of Trichoderma viride: formation andregeneration. / /Arch. Microbiol. 1975. V . 10. P. 199-203.

71. Benoit P., Barriuso E., Calvet R. Biosorption characterization of herbicides 2,4-Dand atrazine, and two chlorophenols on fungal mycelium // Chemosphere 1998. 1. V.37.№ 7.P.1271-1282.

72. Bergbauer M . , Newell S. Y . Contribution of lignocellulose degradation and DOCformation from a salt marsh macrophyte by the ascomycete Phaeosphaeria spartinicola. /1 FEMS Microbiol. Ecol. 1992. Y.86. P.341-348.

73. Berger R. G., Neuhauser K., Drawert F. Characterization of the odour principlesof some basidiomycetes: Bjerkandera adusta. Porta aurea, Tyromyces sambuceus. //Flavour Fragrance J. 1986. V . l . P.181-185.

74. Bhattacharjee B, Roy A, Majumder A L . Carboxyraethylcellulase from Lenzitessaepiaria,a brown-rotter. //Biochem. Mol . Biol. Int. 1993. № .6. P . l 143-1152.

75. Boddy L. Interspecific combative interactions between wood-decayingbasidiomycetes. // FEMS Microbiol. Ecol. 2000. V.31 № .3. P.l85-194.

76. Bogan B.W., Lamar R.T., Hammel K . E . Fluorene oxidation in vivo by

77. Phanerochaete chrysosporium and in vitro during Mn-peroxidase dependent lipidoxidation. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V.62. № .5. P. 1788 -1792.

78. Bogan B.W., Lamar R.T. Polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading capabilitiesof Phanerochaete laevis HHB-1625 and its extracellular ligninolytic enzymes. //

79. Appl. Environ. Microbiol. 1996. V.62. № 5. P.1597-1603.

80. Bogan B.W., Lamar R.T. One-electron oxidation in the degradation ofcreosote polycyclic aromatic hydrocarbons by Phanerochaete chrysosporium. II

81. Appl. Environ. Microbiol. 1995. V.61. № 7. P. 2631-2635.

82. Böhmer S., Messner K. , Srebotnik E. Oxidation of phenanthrene by a fungallaccase in the presence of 1-hydroxybenzotriazole and unsaturated lipids. //

83. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V.244. № 1. P.233-238.

84. Bollag J.M., Sjoblad R.D., Liu S.Y. Characterization of an enzyme from

85. Rhizoctonia praticola, which polymerizes phenolic compounds. // Can. J.

86. Microbiol. 1979. V.25. № 2. P.229-233.

87. Bollag J.M., Shuttleworth K.L . , Anderson D.H. Laccase-mediated detoxificationof phenolic compounds. // Appl. Environ. Microbiol. 1988. V.54. № 12. P.30863091.

88. Bollag J.M., Myers C.J., Minard R.D. Biological and chemical interactions of. pesticides with soil organic matter. // Sei. Total. Environ. 1992. V. 123-124. P. 205-217.

89. Bollag J.M, Chu H.L., Rao M . A . , Gianfreda L. Enzymatic oxidativetransformation of chlorophenol mixtures. // J. Environ. Quality. 2003. V.32. № 1. 1. P.63-69.

90. Bonnarme P., Jefris T. W. Mn(II) regulation of lignin peroxidases and manganesedependent peroxidases from lignin-degrading white rot fungi. // Appl. Environ.

91. Microbiol. 1990. V.56. № 1. P.210-217.

92. Boominathan K., Reddy C A . cAMP-mediated differential regulation of ligninperoxidase and manganese-dependent peroxidase production in the white-rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. /I Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1992.V. 89. P.5586-5590.

93. Bordjiba О, Steiman R, Kadri M , Semadi A, Guiraud P. Removal ofherbicides from liquid media by fungi isolated from a contaminated soil. // J.

94. Environ. Qual. 2001. V.30. № 2. P.418-426.

95. Bourbonnais R., Paice M . G. Oxidation of nonphenolic substrates. An expandedrole for laccase in lignin biodégradation. // FEBS Lett. 1990. V.267. P.99-102.

96. Boyle C. D., Kropp В. R., Reid L D. Solubilization and mineralization of ligninby white rot ftingi. // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V.58. P.3217-3224.

97. Bringer S., Sprey В., Sahm H. Purification and properties of alcohol oxidase from

98. Porta contigua. II Eur. J. Biochem. 1979. V. l01. № 2. P.563-570.

99. Brock B.J., Gold M . H . 1,4-Benzoquinone reductase from basidiomycete

100. Phanerochaete chrysosporium: spectral and kinetic analysis. // Arch. Biochem.

101. Biophys. 1996.V.331. № 1. P.31 -40.

102. Brown J. A. , Alio M . , Gold M . H . Manganese Peroxidase Gene-Transcription In

103. Phanerochaete chrysosporium - Activation By Manganese. // J. Bacteriol. 1991.1. V.173. P. 4101-4106.

104. Bumpus J.A., Tien M . , Wright D., Aust S.D. Oxidation of persistentenvironmental pollutants by a white rot fungus. // Science. 1985. V . 228. P. 14341436.

105. Buswell J.A., Cai Y . J., Chang S. T. Effect of nutrient nitrogen and manganese onmanganese peroxidase and laccase production by Lentinula edodes. II FEMS

106. Microbiol. Lett. 1995. V.128. P.81-88.

107. Call H.P., Mücke I. History, overview and applications of mediated ligninolyticsystems, especially laccase-mediator-systems. II I. Biotechnol. 1997. V.53. P.163202.

108. Calvo A .M . , Copa-Patino J.L., Alonso O., Gonzalez A.E. Studies of theproduction and characterization of laccase activity in the basidiomycete

109. Coriolopsis gallica, an efficient decolorizer of alkaline effluents. // Arch.

110. Microbiol. 1998. V. l71. № 1. P. 31-36.

111. Cameron M.D., Aust S.D. Cellobiose dehydrogenase-an extracellular fungalflavocytochrome. //Enzyme Microb. Technol. 2001. V.28. № 2-3. P. 129-138.

112. Canevascini G. Cellobiose dehydrogenase from Sporotrichum thermophile. II

113. Methods Enzymol. 1988. V.160. P.443-448.

114. Chan K.H. , Chu W. Modeling the reaction kinetics of Fenton's process on theremoval of atrazine. //Chemosphere. 2003. V.51. № 4. P. 305-311.

115. Chandhoke V. , Goodell В., Jellison J., Fekete F. A . Oxidation of 2-keto-4thiomethylbutyric acid (ktba) by iron-binding compounds produced by the wooddecaying fungus Gloeophyllum trabeum. II FEMS Microbiol. Lett. 1992. V.90. 1. P.263-266.

116. Chefetz В., Chen Y. , Hadar Y. Purification and characterization of laccase from

117. Chaetomium thermophile and its role in humification. // Appl. Environ. Microbiol.1998. V.64. № 9. P.3175-3179. (a)

118. Chefetz В., Kerem Y. , Chen Y . , Hadar Y . Laccase from composted municipalsolid waste: purification and characterization. // Soil Biol. Biochem. 1998. V.30. 1. P.1091-1098.(6)

119. Cheton P.L.-В., F. S. Archibald. Manganese complexes and the generation andscavenging of hydroxyl free radicals. // Free Rad. Biol. Med. 1988. V.5. P.325333.

120. Chrapkowska K.J. Cellulolytic activity of white, brown and gray wood rot fungi./ /Acta Microbiol. Pol. 1984.V.33. № 2 . P. 137-145.

121. Christen S., Southwell-Keely P., Stocker R. Oxidation of 3-hydroxyanthranilicacid to the phenoxazinone cinnabarinic acid by peroxyl radicals and by compound 1.of peroxidases or catalases. //Biochemistry. 1992. V.31. P.8090-8097.

122. Coassin M . , Ursini P., Bindoli A . Antioxidant effect of manganese. // Arch.

123. Biochem. Biophys. 1992. V.299. P.330-333.

124. Coll P.M., Femandezabalos Jm., Villanueva Jr., Santamaria R., Perez P.

125. Purification And Characterization Of A Phenoloxidase (Laccase) From The1.gnin-Degrading Basidiomycete Pml (Cect-2971). II Appl. Environ. Microb. 1993. V.59. № 8. P.2607-2613.

126. Collins P.J., Kotterman M.J.J., Field J.A., Dobson A.D.W. Oxidation ofanthracene and benzoa.pyrene by laccases from Trametes versicolor II Appl.

127. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. P. 4563-4567.

128. Covert S.F., Bolduc J., Cullen D. Genomic organization of a cellulase gene familym Phanerochaete chrysosporium. II Curr. Genet. 1992. V.22. № 5. P.407-413.

129. Dekker R.F.H. Induction and characterization of a cellobiose dehydrogenaseproduced by a species of Monilia. II J. Gen. Microbiol. 1980. V.l20. P. 309-316.

130. Dorado J., Claassen F.W., van Beek T.A., Lenon G., Wijnberg J.B., Sierra

131. Alvarez R. Elimination and detoxification of softwood extractives by white-rotfungi. // J. Biotechnol. 2000. V.80. No3. P. 231-240.

132. Dosoretz e.G., Rothschild N . , Hadar Y . Overproduction of lignin peroxidase by

133. Phanerochaete chrysosporium (BKM-F-1767) under nonlimiting nutrientconditions. // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V.59. P.1919-1926.

134. D'Souza T.M., Merritt C.S., Reddy C A . Lignin-modifying enzymes from thewhite-rot basidiomycete Ganoderma lucidum. II abstr. Q-267, p. 432. In Abstracts of the 96th General Meeting of the American Society for Microbiology. American

135. Society for Microbiology, Washington, D . C 1996. (a)

136. D'Souza T.M., Merritt CS . , Reddy C A . Lignin-Modifying Enzymes of the whiterot basidiomycete Ganoderma lucidum. II Appl. Environ. Microb. 1999. V. 65. № 12. P. 5307-5313.(6)

137. D'Souza T.M., Boominathan K., Reddy C A . Isolation of laccase gene-specificsequences from white rot and brown rot fungi by PCR. // Appl. Environ.

138. Microbiol. 1996. V.62. № 10. P.3739-3744.

139. During R.-A., Hummel H.E. Herbicide and metabolite movement in differentsoils as studied by computer assisted microlysimeters. // Chemosphere. 1999. V . 39. № 4. P.641-654.

140. Edens W.A., Coins T.Q., Dooley D., Henson J.M. Purification andcharacterisation of a secreted laccase of Gaeumannomyces graminis var. tritici. II

141. Appl. Environ. Microbiol. 1999. V.65. P.3071-3074.

142. Eggert C. Laccase-catalyzed formation of cinnabarinic acid is responsible forantibacterial activity of Pycnoporus cinnabarinus. 11 Microbiol. Res. 1997. V . l 52. № 3 . P.315-318.

143. Eggert C , Temp U. , Dean J. F. D., Eriksson K.-E. L . A fungal metabolitemediates oxidation of non-phenolic lignin model compounds and synthetic lignin by laccase. // FEBS Lett. 1996. V. 391. P. 144-148. (a)

144. Eggert C , Temp U., Eriksson K.-E.L. The ligninolytic system of the white rotfungus Pycnoporus cinnabarinus: Purification and characterization of the laccase. // Appl. Environ. Microb. 1996. V.62. № 4. P . l 151-1158. (6)

145. Eggert C , Temp U. , Dean J.F.D., Eriksson K.-E.L. Laccase-mediated formationof the phenoxazinone derivative, cinnabarinic acid. // FEBS Lett. 1995.V.376. 1. P.202-204.

146. Engler M . , Anke T., Sterner O. Production of antibiotics by Collybia nivalis,

147. Omphalotus olearis, a Favolaschia and a Pterw/a species on natural substrates. //

148. Z. Naturforsch. 1998. V.53.№ 5-6. P.318-324.

149. Enoki A. , Itakura S., Tanaka H. The involvement of extracellular substances forreducing molecular oxygen to hydroxyl radical and ferric iron to ferrous iron in wood degradafion by wood decay fungi. // J. Biotechnol. 1997. V.53. P. 265-272.

150. Entry J.A., Donnelly P.K., Emmingham W.H. Mineralization of atrazine and 2,4

151. D in soils inoculated with Phanerochaete chrysosporium and Trappea darkeri.

152. Appl. Soil. Ecol. 1996.V.3. № 1. P.85-90.

153. Eriksson K.E. , Pettersson B., Westermark U . Oxidation: an important enzymereaction in fungal degradation of cellulose. // FEBS Lett. 1974.V.49.№ 2. P.282285.

154. Eriksson K.-E.L. , Blanchette R. A. , Ander P. Microbial and enzymaticdegradation of wood and wood components. // Springer-Verlag, New York, N .Y . 1990.

155. Fähnrich P., Irrgang K. Conversion of cellulose to sugars and cellobionic acid bythe extracellular enzyme system of Chaetomium cellulolyticum. II Biotechnol. 1.tt. 1982. V.12.P.775-780. ,

156. Fahr K. , Wetzstein H.G., Grey R., Schlosser D. Degradation of 2,4-dichlorophenoland pentachlorophenol by two brown rot fixngi. // FEMS Microbiol. Lett. 1999. 1. V.175. JNo l.P.127-132.

157. Fang J., Liu W., Gao P. J. Cellobiose dehydrogenase from Schizophyllumcommune: purification and study of some catalytic, inactivation and cellulose binding properties. // Arch. Biochem. Biophys. 1998. V . 353. P.37-46.

158. Field J.A., Verhagen F.J.M., De Jong E. Natural organohalogen production bybasidiomycetes. // Trends Biotechnol. 1995. V. 13. P.451 -456.

159. Fischer K. , Akhtar M . , Blanchette R. A.,. Bumes T. A , Messner K., Kirk T. K.

160. Reduction of resin content in wood chips during experimental biological pulpingprocesses. //Holzforschung. 1994. V.48. P.285-290.

161. Forrester I.T., Grabski A.C. , Burgess R.R., Leatham G.F. Manganese, Mndependent peroxidases and the biodégradation of lignin. // Biochim. Biophys. Res.

162. Commun. 1988. V . 157. No 3. P.992-999.

163. Gallois A. , Gross B., Langlois D., Spinnler H.-E., Brunerie P. Influence of cultureconditions on the production of flavour compounds by 29 ligninolytic basidiomycetes. // Mycol. Res. 1990. № 4. P.494-504.

164. Gao Y. , Breuil C , Chen T. Utilization of triglycerides, fatty acids and resin acidsin lodgepole pine wood by a sapstaining fungus Ophiostoma piceae. II Mater. Org. (Berlin) 1994.V.28.R105-118.

165. Giardina P., Palmieri G., Scaloni A. , Fontaneila B., Faraco V., Cennamo G.,

166. Sannia G. Protein and gene structure of a blue laccase from Pleurotus ostreatus. II

167. Biochemical Journal. 1999. V.341. Part 3. P.655-663.

168. Gilbertson R. L. , Ryvarden L . North American Polypores // Fungiflora,1. Oslo.1986.

169. Goodell B., Jellison J., Liu J., Daniel G., Paszczynski A. , Fekete F.,

170. Krishnamurthy S., Jun L. , X u G. Low molecular weight chelators and phenoliccompounds isolated from wood decay fungi and their role in the fungal biodégradation of wood. // J. Biotechnol. 1997. V.53. P.133-162.

171. Gramss G. Influence of soil on wood-degradation and fruit body formation byparasites and saprophytes among wood-destroying basidiomycetous fungi. // Z.

172. Allg Mikrobiol. 1980.V.20. № 10. P.613-617.

173. Greene R.V., Gould J.M. Substrate-induced H2O2 production in mycelia from thelignin-degrading fiingus Phanerochaete chrysosporium. II Biochem. Biophys. Res.

174. Commun. 1983. V . l 17. N o l . P.275-281.

175. Guillen P., Gomez-Toribio V. , Martinez M.J., Martinez A.T. Production ofhydroxyl radical by the synergistic action of fungal laccase and aryl alcohol oxidase. // Arch. Biochem. Biophys. 2000.V.383 J^ o 1 P.142-147.

176. Guillen P., Martinez A. T., Martinez M . J., Evans C. S. Hydrogen-peroxideproducing system of Pleurotus eryngii involving the extracellular enzyme aryialcohol oxidase. / /Appl . Microbiol. Biotechnol. 1994. V.41. P.465-470. (a)

177. Guillen P., Evans C. S. Anisaldehyde and veratraldehyde acting as redox cyclingagents for H2O2 production by Pleurotus eryngii. II Appl. Environ. Microbiol. 1994.V.60.P.2811-2817.(5)

178. Gutiérrez A. , del Rio José C , Martinez Maria Jesús, Martínez Angel T. Fungal

179. Degradation of Lipophilic Extractives in Eucalyptus globulus Wood. // Appl.

180. Environ. Microb. 1999. V . 65. № 4. P.1367-1371.

181. Gutierrez A., Caramelo L., Prieto A. , Martinez M.J., Martinez A . T. Anisaldehydeproduction and aryl-alcohol oxidase and dehydrogenase activities in ligninolytic fungi of the genus Pleurotus. II Appl. Environ. Microbiol. 1994. V.60. P.l 7831788.

182. Hammel K.E. , Green B., Gai W.Z. Ring fission of anthracene by a eukaryote. //

183. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V . 88. P. 10605-10608.

184. Hammel K.E . Mechanisms for polycyclic aromatic hydrocarbon degradationby ligninolytic fungi. // Environ. Health Perspect. 1995. V.103. № 5. P.41-43.

185. Hatakka A. Ligninolytic enzymes from selected white-rot fungi: production androle in hgnin degradation. / /FEMS Microbiol. Rev. 1994.V.r3. P.125-135.

186. Hatcher P.G., Bortiatynski J.M., Minard R.D., Dec J., Bollag J .M. Use of highresolution c-13 nmr to examine the enzymatic co\alent binding of c-13-labeled 2,4-dichlorophenol to humic substances. // Environ. Sci. Technol. 1993. V. 27. P. 2098-2103.

187. Heinzkill M . , Bech L. , Halkier T., Schneider P., Anke T. Characterization oflaccases and peroxidases from wood-rotting fungi (family Coprinaceae). II Appl.

188. Environ. Microbiol. 1998. V.64.№ 5. P. 1601-1606.

189. Henriksson G., Johansson G., Pettersson G. A critical review of cellobiosedehydrogenases. / / J . Biotechnol. 2000. V.78. № 2. P.93-113.

190. Hirano T., Tanaka H., Enoki A . Extracellular substance from the brown-rotbasidiomycete tyromyces-palustris that reduces molecular-oxygen to hydroxyl radicals and ferric iron to ferrous iron. // Mokuzai Gakkaishi 1995. V.41. P.334341.

191. Hirano T., Tanaka H., Enoki A. Relationship between production of hydroxylradicals and degradation of wood by the brown-rot fungus Tyromyces palustris . II

192. Holzforschung 1997. V.51. P.389-395.

193. Hjelm O., Boren H., Asplund G. Analysis of halogenated organic compounds in aconiferous forest soil from a Lepista nuda (wood blewitt) fairy ring. //

194. Chemosphere 1996. V.32. P.1719-1728.

195. Hofrichter M . , Vares T., Kalsi M . et al. Production of Manganese Peroxidase and

196. Organic Acids and Mineralization of '''C-Labelled Lignin ('"^C-DHP) during

197. Solid-State Fermentation of Wheat Straw with the White Rot Fungus Nematolomafrowardii. II Appl. Environ. Microb. 1999. V.65. J^ o 5. P. 1864-1870.

198. Hofrichter M . , Bublitz P., Fritsche W. Unspecific degradation of halogenatedphenols by the soil fungus Penicinium-frequentans-BI-7/2. // J. Basic Microbiol. 1994. V.34.№3.P.163-172.

199. Hofrichter M . , Scheibner К., SchneegaB I., Fritsche W. Enzymatic combustionof aromatic and aliphatic compounds by manganese peroxidase from Nematoloma frowardii. II Appl. Environ. Microbiol. 1998. V.64. P.399-404.

200. Hiittermann A. , Noëlle A . Characterization and regulation of cellobiosedehydrogenase in Fomes annosus. II Holzforschung. 1982. V.36.P.283-286.

201. Hyde S. M . , Wood P. M . A mechanism for production of hydroxyl radicals by thebrown-rot flmgus Coniophora piiteana: Fe(III) reduction by cellobiose dehydrogenase and Fe(II) oxidation at a distance from the hyphae. Microbiology 1997.V.143.P.259-266.

202. James Т.К., Klaffenbach P., Holland P.T., Rahman A. Degradation ofprimisulfuron-methyl and metsulfuron-methyl in soil. // Weed Research. 1995. 1. V.35.№ 2. P . l 13-120.

203. Johannes C , Majcherczyk A. , Huttermann A. Degradation of anthracene bylaccase of Trametes versicolor in the presence of different mediator compounds //

204. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. V.46. №3. P.313-317.

205. Kang K.H. , Dec J., Park H. , Bollag J .M. Transformation of the fungicidecyprodinil by a laccase of Trametes villosa in the presence of phenolic mediators and humic acid. // Water Res. 2002. V.36. № 19. P.4907-4915.

206. Kapich A .N . , Jensen K.A. , Hammel K.E . Peroxyl radicals are potential agents oflignin biodégradation. / /FEBS Lett. 1999. V.461.№ 1-2. P.l 15-119. (6)

207. Khindaria A. , Grover T.A., Aust S.D. Oxalate-dependent reductive activity ofmanganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium. // Arch. Biochem.

208. Biophys. 1994. V.314.№ 2. P.301-306.

209. Kim S.J., Ishikava K., Hirai M . , Shoda M . Characteristics of a newly isolatedfungus Geotrichum candidum Dec 1, which decolorizes various dyes. // J.

210. Ferment. Bioeng. 1995. V.79. № 6. P.601-607.

211. Kim S.J., Shoda M . Purification and characterization of a nowel peroxidasefrom Geotrichum candidum Dec 1 involved in decolorization of dyes. // Appl.

212. Environ. Microbiol. 1999. V.65. № 3. P.1029-1035.

214. Biodégradation of an s-triazine herbicide, simazine. // Journal Of Molecular

215. Catalysis B-Enzymatic. 2001. Sp. Iss. SI JAN22 V . l l . № 4-6. P. 1073-1078.

216. Koenigs J. W. Hydrogen peroxide and iron: a proposed system for decompositionof wood by brown-rot basidiomycetes. // Wood Fiber 1974.V.6. P.66-80.

217. Koroleva O.V., Stepanova E.V., Landesman E.O., Vasil'chenko L.G. ,

218. Khromonygina V.V. , Zherdev A. V. , Rabinovich M.L. In vitro degradation of theherbicide atrazine by soil and wood decay fungi controlled through ELISA technique. // Toxicological and Environmental Chemistry. 2001. V.80. №3-4. P. 175-188.

219. Koroljova-Skorobogat'ko O.V., Stepanova E.V., Gavrilova V.P., Morozova O.V.,1.bimova N.V. , Dzhafarova A.N. , Yaropolov A.I., Makover A. Purification and characterization of the constitutive form of laccase from the basidiomycete

220. Coriolus hirsutus and effect of inducers on laccase synthesis. // J. Biotechnol.

221. Appl. Biochem. 1998. V.28. P.47-54.

222. Dichomitus squalens. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V.47. P.708-714.1.isola M . , Ulmer D., Fiechter A . Problem of oxygen transfer during degradation of lignin by Phanerochaete chrysosporium. II Eur. J. Appl. Microbiol.

223. Biotechnol. 1983. V.17.P.113-116.1.one R., Breuil C. Filamentous fungi can degrade aspen steryl esters and waxes. // Int. Biodeterior. Biodegrad. 1998. V.41. P. 133-137. 1.onowicz A., Matuszewska A., Luterek J., Ziegenhagen D., Wojtas-Wasilewska

225. Hatakka A . Blue and yellow laccases of ligninolytic fungi. // FEMS Microbiol.1.tt. 1997. V.l56.№ 1. P. 9-14. (6) 1.vanon D. Roles Of Fungi And Bacteria In The Mineralization Of The

226. Martens R., Wetzstein H.-G., Zadrazil F., Capelari M. , Hoffmann P., Schmeer N .

227. Degradation of the fluoroquinolone enrofloxacin by wood-rotting fungi. // Appl.

228. Environ. Microbiol. 1996. V.62. P.4206-4209.

229. Martínez M . J., Barrasa J. M . , Gutiérrez A., del Río J. C., A . T. Martínez.

230. Biological depitching of eucalypt wood with ascomycetous and basidiomycetousfungi, sp. B37-B44. II In Proceedings of the 7th International Conference on

231. Biotechnology in the Pulp and Paper Industry. Canadian Pulp and Paper

232. Associations, Quebec, Canada. 1998.

233. Martinez-Inigo M.J., Gutierrez A. , del Rio J.C., Martinez M.J. , Martinez A.T.

234. Time course of fungal removal of lipophilic extractives from Eucalyptus globuluswood.//J. Biotechnol. 2000. V.84.№ 2.119-126.

235. Martin-Laurent P., Piutti S., Hallet S., Wagschal I., Philipot L., Catroux G., Soulas

236. G. Monitoring of atrazine treatment on soil bacterial, fungal and atrazinedegrading communities by quantitative competitive PCR. // Pest. Management Science. 2003. V.59. № 3. P.259-268.

237. Masaphy S., Henis Y. , Levanon D. Manganese-enhanced biotransformation ofatrazine by the white rot fungus Pleurotus pulmonarius and its correlation with oxidation activity. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V.62. №10. P.3587-3593.

238. McFee W. W., Stone E. L., Jokela E.J. Micronutrient deficiency in slash pineresponse and persistence of added manganese. // Soil Sci. Soc. Am. J. 1991. V.55. № 2. P.492-496.

239. Mester T., de Jong E., Field J. A. Manganese regulation of veratryi alcohol inwhite rot fungi and its indirect effect on lignin peroxidase. // Appl. Environ.

241. Mester T., Field J.A. Characterization of a Novel Manganese Peroxidase-Lignin

243. Michel F. C , Grulcke E. A. , C. A . Reddy. Determination of the respirationkinetics for mycelial pellets of Phanerochaete chrysosporium. ¡1 Appl. Environ.

244. Microbiol. 1992. V.58. P. 1740-1745.

245. Moen M . A. , K . E. Hammel. Lipid peroxidation by the manganese peroxidase of

246. Phanerochaete chrysosporium is the basis for phenathrene oxidation by the intactfiingus. // Appl. Environ. Microbiol. 1994. V.60. P.1956-1961.

247. Moiseeva O.V., Solyanikova LP., Kaschabek S.R., Groning J., Thiel M . ,

248. Golovleva L.A. , Schlomann M . A new modified ortho cleavage pathway of 3chlorocatechol degradation by Rhodococcus opacus ICP: Genetic and biochemical evidence. // Journal Of Bacteriology. 2002. V.l84. № 19. P.52825292.

249. Mori T., Kondo R. Degradation of 2,7-dichlorodibenzo-p-dioxin by wood-rottingfungi, screened by dioxin degrading ability. // FEMS Microb. Lett. 2002. V.213. № l.P.127-131. (a)

250. Mori T., Kondo R. Oxidafion of dibenzo-p-dioxin, dibenzofuran, biphenyl, anddiphenyl ether by the white-rot fungus Phlehia lindtneri. II Appl. Microbiol.

251. Biotechnol. 2002. V.60. № 1-2. P.200-205. (6)

252. Morpeth F.F. Intracellular oxygen-metabolizing enzymes of Phanerochaetechrysosporium. II J. Gen. Microbiol. 1987. V. 133. P.3521-3525.

253. Mougin C., Boyer F.D., Caminade E., Rama R. Cleavage of the diketonitrilederivative of the herbicide isoxaflutole by extracellular fungal oxidases. // J.

254. Agric. Food Chem. 2000. V.48. № 10. P.4529-4534.

256. Biotransformation of the herbicide atrazine by the white-rot fiingus

257. Phanerochaete chrysosporium. II Appl. Environ. Microb. 1994. V.60. № 2. P.705708.

258. Muheim A., Waldner R., Leisola M . S. A. , Fiechter A. An extracellular arylalcohol oxidase from the white-rot fungus Bjerkandera adusta. II Enzyme Microb.

260. Muheim A., Waldner R., Sanglard D., Reiser J., Schoemaker H . E., Leisola M .

261. S. A . Purification and properties of an aryl-alcohol dehydrogenase from the whiterot fiingus Phanerochaete chrysosporium. II Eur. J. Biochem. 1991. V.195. P.369375.

262. Murado M . A., Tejedor M . C , Baluja G. Interactions between polychlorinatedbiphenyls (PCBs) and soil microfimgi. Effects of aroclor-1254 and other PCBs on

263. Aspergillus flavus cultures. // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1976. V.15. P.768774.

264. Nishimura K., Yamamoto M . , Nakagomi T., Takiguchi Y . , Naganuma T., Uzuka

265. Y. Biodégradation of triazine herbicides on polyvinylalcohol gel plates by the soilyeast Lipomyces starkeyi. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V.58.№ 6. P.848852.

266. Novotny C , Vyas B.R., ErbanovaP., Kubatova A. , Sasek V. Removal of PCBs byvarious white rot fiangi in liquid cultures. // Folia Microbiol (Praha). 1997. V.42. №2. P. 136-140.

267. Ostrofsky E.B., Robinson J.B., Traina S.J., Tuovinen O.H.

268. Analysis of atrazine-degrading microbial communities in soils using mostprobable-number enumeration, DNA hybridization, and inhibitors.// Soil Biology & Biochemistry. 2002. V.34. № 10. P.1449-1459.

269. Palmieri G., Giardina P., Bianco C , Scaloni A. , Capasso A. , Sannia G. A novelwhite laccase from Pleurotus ostreatus. II Journal Of Biological Chemistry. 1997. 1. V.272. № 50. 31301-31307.

270. Paszczynski A , Crawford R., Funk D., Goodell B. De Novo Synthesis of 4,5

271. Dimethoxycatechol and 2,5-Dimethoxyhydroquinone by the Brown Rot Fungus

272. Gloeophyllum trabeum. / /Appl. Environ. Microb. 1999. V . 65. № 2. P. 674-679.

273. Pavarina B.C., Durrant L.R. Growth of lignocellulosic-fermenting fungi ondifferent substrates under low oxygenation conditions. // Appl. Biochem.

274. Biotechnol. 2002. V.98-100. P.663-77.

275. Perez J., Jeffries T. W. Mineralization of '*C-ring-labeled synthetic lignincorrelates with the production of lignin peroxidase, not of manganese peroxidase or laccase. // Appl. Environ. Microbiol. 1990. V.56. P.1806-1812.

276. Perez J., Jeffries T. W. Roles of manganese and organic acid chelators inregulating lignin degradation and biosynthesis of peroxidases by Phanerochaete chrysosporium. II Appl. Environ. Microbiol. 1992. V.58.

277. Perez J., Jeffries T. W. Role of organic acid chelators in manganese regulation oflignin degradation by Phanerochaete chrysosporium. 11 Appl. Microbiol.

278. Biotechnol. 1993.V. 40. P. 227-238.

279. Périé P. H., Gold M . H. Manganese regulation of manganese peroxidaseexpression and lignin degradation by the white rot fungus Dichomitus squalens. II

280. Appl. Environ. Microbiol. 1991. V.57. P. 2240-2245.

281. Perkins E.J., Gordon M.P., Caceres O., Lurquin P.P. Organization and sequenceanalysis of the 2,4-dichlorophenol hydroxylase and dichlorocatechol oxidative opérons of plasmid pJP4. II}. Bacteriol. 1990. V.172. JVb5. P.2351-2359.

282. Pickard M.A. , Roman R., Tinoco R., Vazquez-Duhalt R. Polycyclic aromatichydrocarbon metabolism by white rot fungi and oxidation by Coriolopsis gallica

283. UAMH8260 laccase. / /Appl. Environ. Microbiol. 1999. V.65. №9. P.3805-3809.

284. Pickard M.A. , Vandertol H., Roman R., Vazquez-Duhalt R. High production ofligninolytic enzymes from white rot fungi in cereal bran liquid medium. // Can. J.

286. Pinheiro R., Belo I., Mota M . Oxidative stress response of Kluyveromycesmarxianus to hydrogen peroxide, paraquat and pressure. // Appl. Microbiol.

287. Biotechnol. 2002. V.58. 6. P.842-847.

288. Qian S.Y., Buettner G.R. Iron and dioxygen chemistry is an important route toinitiation of biological free radical oxidations: an electron paramagnetic resonance spin trapping study. // Free Radie. Biol. Med. 1999. V.26. № 11-12. P.1447-1456.

289. Reddy C A . A n overview of the recent advances on the physiology andmolecular biology of lignin peroxidases of Phanerochaete chrysosporium. II J.

290. Biotechnol 1993. V .3O.N0I . P.91-107.

291. Reddy G.V., Gold M .H . A two-component tetrachlorohydroquinone reductivedehalogenase system from the lignin-degrading basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 257 № 3. P.901905.

292. Reddy G.V., Gold M.H . Degradation of pentachlorophenol by Phanerochaetechrysosporium: intermediates and reactions involved. // Microbiology. 2000. 1. V.146.Pt2.P.405-13.

293. Ricotta A., Unz R.F., Bollag J. Role of a laccase in the degradation ofpentachlorophenol. // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1996. V.57. №4. P.560567.

294. Rigot J., Matsumura F. Assessment of the rhizosphere competency andpentachlorophenol-metabolizing activity of a pesticide-degrading strain of

295. Trichoderma harzianum introduced into the root zone of corn seedlings. // J.

296. Environ. Sci. Health 2002. V.37.№ 3. P.201-210.

297. Rodriguez E., Pickard M.A. , Vazquez-Duhalt R. Industrial dye decolorization bylaccases from ligninolytic fungi. // Curr. Microbiol. 1999. V.38. №1. P.27-32.

298. Rodriguez J, Ferraz A , Nogueira R.F. Lignin biodégradation by the ascomycete

299. Chrysonilia sitophila. II Appl. Biochem. Biotechnol. 1997. V.62. № 2-3. 233-234.

300. Rosecke J, König W.A. Constituents of the fiingi Daedalea quercina and

301. Daedaleopsis confragosa var. tricolor. II Phytochemistry. 2000. V.54.№ 8. P.757762 (a)

302. Rosecke J, König W.A. Constituents of various wood-rotting basidiomycetes. //

303. Phytochemistry. 2000. V.54.№ 6. P.603-610. (6)

304. Roy B. P., Dumonceaux T., Koukoulas A. A. , Archibald F. S. Purification andcharacterization of cellobiose dehydrogenase from the white rot fiingus Trametes versicolor. / /Appl . Environ. Microbiol. 1996. V.62. V.^Ml-^ll.

305. Ruggiero P., Radogna V . M . Properties of laccases in humus-enzyme complexes. //

307. Ruttimann-Johnson C , Lamar R. T. Polymerization of pentachlorophenol andferulic acid by fungal extracellular lignin-degrading enzymes. Appl. Environ.

308. Microbiol. 1996. V . 62. № 10. P. 3890-3893.

309. Sack U. , Hofrichter M . , Fritsche W. Degradation of polycyclic aromatichydrocarbons by manganese peroxidase of Nematoloma frowardii. II FEMS

310. Microbiol. Lett 1997.V.152. № 2. P.227-34.

311. Sakakibara M.A. Chemistry of lignin. Wood and cellulosic chemistry. (Hon

312. D.N.S. and Shiraishi N . eds.). N - Y and Basel. Marcel Dekker, 1991. P.l 11-168.

313. Salas C , Lobos S., Larrain J., Salas L. , Cullen D., Vicuna R. Properties of laccaseisoenzymes produced by the basidiomycete Ceriporiopsis subvermispora. II

314. Biotechnol. Appl. Biochem. 1995. V.21. Pt 3. P.323-333.

315. Saltmiras D., Lemley A.T. Atrazine degradation by anodic Fenton reagent. //

317. Sanyal D., Kulshrestha G. Metabolism of metolachlor by fungal cultures. // J.

318. Agric. Food. Chem. 2002. V.50.No3. P.499-505.

319. Schlosser D., Fahr K., Karl W., Wetzstein H.G. Hydroxylated metabolites of 2,4dichlorophenol imply a Fenton-type reaction in Gloeophyllum striatum. II Appl.

320. Environ. Microbiol. 2000. V.66. № 6. P.2479-83.

321. Schmidhalter D.R., Canevascini G. Isolation and characterization of thecellobiose dehydrogenase from the brown-rot fiingus Coniophora puteana (Schum ex Fr.) Karst. // Arch. Biochem. Biophys. 1993. V.300. JNe 2. P.559-63.

322. Schneider P., Caspersen M.B. , Mondorf K. , Halkier Т., Skov L .K. , Ostergaard

323. P.R., Brown K . M . , Brown S.H., X u F. Characterization of a Coprinus cinereuslaccase // Enzyme Microb. Tech. 1999. V.25. № 6. P.502-508.

324. Schou C , Christensen M . H. , Schulein M . Characterization of a cellobiosedehydrogenase fromHumicola insolens. //Biochem. J. 1998. V.330. P.565-571.

325. Schultz T.P., Nicholas D.D. Naturally durable heartwood: evidence for a proposeddual defensive function of the extractives. // Phytochemistry. 2000. V.54.№ 1. 1. P.47-52.

326. Sethuraman A , Akin D.E., Eriksson K.E . Production of ligninolytic enzymes andsynthetic lignin mineralization by the bird's nest fijngus Cyathus stercoreus. ¡I

327. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V.52. No5. P.689-697.

328. Sethuraman A. , Akin D.E, Eisele J.G., Eriksson K-E.L. Effect of aromaticcompounds on growth and ligninolytic enzyme production of two white rot fiingi

329. Ceriporiopsis subvermispora and Cyathus stercoreus. II Can. J. Microbiol. 2000.1. V.44. P.872-885.

330. Shimada M . , Akamtsu Y. , Tokimatsu Т., M i i K., Hattori T. Possible biochemicalroles of oxalic acid as a low molecular weight compound involved in brown-rot and white-rot wood decays. // J. Biotechnol. 1997. V.53. P.103-113.

331. Slomczynski D., Nakas J.P., Tanenbaum S.W. Production and characterization oflaccase from Botrytis cinérea 61-34. II Appl. Environ. Microbiology. 1995. V.61. № 3 . P.907-912.

332. Sonnenbichler J., Kovacs T. Influence of the Gloeophyllum metabolite oosponoland some synthetic analogues on protein and RNA synthesis in target cells. // Eur.

333. J. Biochem. 1997. V.246. № 1. P.45-49.

334. Sonnenbichler J., Peipp H. , Dietrich J. Secondary fungal metabolites and theirbiological activities. III. Further metabolites from dual cultures of the antagonistic basidiomycetes Heterobasidion annosum and Gloeophyllum abietinum. II

335. Biol. Chem. Hoppe Seyler 1993. V.374. № 7. P.467-73.

336. Spinnler H.-E., De Jong E., Mauvais G. et al. Production of halogenatedcompounds by Bjerkandera adusta. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994.V.42. 1. P.212-221.

337. Srinivasan C , D'Souza T. M . , Boominathan K., Reddy C. A . Demonstration oflaccase in the white-rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. II Appl.

338. Environ. Microbiol. 1995. V.61. P.4274-4277.

339. Stahl J.D., Rasmussen S.J., Aust S.D. Reduction of quiñones and radicals by aplasma membrane redox system of Phanerochaete chrysosporium. 11 Arch.

340. Biochem. Biophys. 1995. V.322 № 1. P.221-227.

341. Staszczak M . , Zdunek E., Leonowicz A. Studies on the role of proteases in thewhite-rot fiingus Trametes versicolor: effect of PMSF and chloroquine on ligninolytic enzymes activity. // J. Basic. Microbiol. 2000. V.40.№ 1. P.51-63.

342. Stevenson F. J. Humus chemistry. // N-Y , John Wiley and Sons, 1994. 293 PP.

343. Suflita J.M,, Bollag J.M. Oxidative coupling activity in soil extracts. Soil Biol.

345. Sugano Y. , Nakano R., Sasaki K., Shoda M . Efficient heterologous expression in

346. Aspergillus oryzae of a unique dye-decolorizing peroxidase, Dy P. of Geotrichumcandidum. II Appl. Environ. Microbiol. 2000.V. 66. № 4. P. 1754-1758.

347. Sutherland J. B,, Rafii P., Khan A.A. , Cerniglia C.E. Microbial transformation anddegradation of toxic organic chemicals. // Young L.Y. , Cerniglia C.E. eds. 1995.

349. Swarts H.J., Verhagen FJ .M . , Field J.A., Wijnberg J.B.P.A. Novelchlorometabolites produced by Bjerkandera species. II Phytochemistry. 1996. V. 42. P.1699-1701.

350. Tampo Y. , Yonaha M . Antioxidant mechanism of Mn(II) in phospholipidperoxidation. // Free Rad. Biol. Med. 1992. V . 13. P. l 15-120.

351. Tatsumi K. , Freyer A. , Minard R. D., Bollag J. M . Enzymatic coupling ofchloroanilines with syringic acid, vanillic acid and protocatechuic acid. // Soil.

352. Biol . Biochem. 1994. V.26. P.735-742.

353. Temp U,., Eggert C. Novel . Interaction between Laccase and Cellobiose

354. Dehydrogenase during Pigment Synthesis in the White Rot Fungus Pycnoporuscinnabarinus. / /Appl . Environ. Microbiol. 1999. V.65. № 2. P.389-395.

355. Teunissen P.J.M, Field J.A. 2-Chloro-l,4-Dimethoxybenzene as a Novel Catalytic

356. Cofactor for Oxidation of Anisyl Alcohol by Lignin Peroxidase. // Appl. Environ.

357. Microbiol. 1998. V . 64. № 3. P. 830-835.

358. Teunissen P.J.M., Swarts H.J., Field J.A. The de novo production of drosophilin A(tetrachloro-4-methoxyphenol) and drosophilin A methylether (tetrachloro-1,4dimethoxybenzene) by ligninolytic basidiomycetes. // Appl. Microbiol.

360. Thorn R.G., Malloch D.W., Ginns J. Leucogyrophana lichenicola sp.nov., and acomparison with basidiomes and cultures of the similar Leucogyrophana romellii.

361. Can. J. Bot. 2000. V.76. P.686-693.

362. Toussaint O., Lerch. K. Catalytic oxidation of 2-aminophenols and orthohydroxylation of aromatic amines by tyrosinase. // Biochemistry. 1987. V.26. 1. P.8568-8571.

363. Valli. K., Gold M . H. Degradation of 2,4-dichlorophenol by the lignin-degradingfungus Phanerochaete chrysosporium. II J. Bacteriol. 1991. V.173. P.345-352.

364. Varadashari C , Ghosh K. On humus formation. // Plant Soil. 1984. V.77.1. P.305-313.

365. Vyas B.R.M. , Vole J., Sasek V. Ligninolytic enzymes of selected white rot fungicultivated on wheat straw. // Folia Microbiol. 1994. V.39. P.235-240.

366. Wahleithner J.A., Xu F., Brown K .M . , Brown S.H., Golightly E.J., Halkier T.,

367. Kauppinen S., Pederson A. , Schneider P. The identification and characterizationof four laccases from the plant pathogenic fiingus Rhizoctonia solani. II Current

368. Genetics. 1996. V.29. №4. P.395-403.

369. Wang Z., Chen T., Gao Y. , Breuil C , Hiratsuka Y . Biological degradation of resinacids in wood chips by wood-inhabiting fungi. // Appl. Environ. Microbiol. 1995. 1. V.61.P.222-225.

370. Wariishi H. , K. Valli, M . H. Gold. In vitro depolymerization of lignin bymanganese peroxidase of Phanerochaete chrysosporium. // Biochem. Biophys.

371. Res. Commun. 1991. V.l76. P.269-275.

372. Wariishi H. , Valli K., Gold M . H . Manganese(II) oxidation by manganeseperoxidase from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Kinetic mechanism and role of chelators. // J. Biol. Chem. 1992. V.267. P.23688-23695.

373. Wetzstein H . G., Stadler M . , Tichy H.-V., Dalhoff A., Karl W. Degradation of

374. Ciprofloxacin by Basidiomycetes and Identification of Metabolites Generated bythe Brown Rot Fungus Gloeophyllum striatum. II Appl. Environ. Microbiol. 1999. 1. V.65 .№4. P. 1556-1563.

375. Wetzstein H.-G., Schmeer N . , Karl W. Degradation of the fluoroquinoloneenrofloxacin by the brown rot fungus Gloeophyllum striatum: identification of metabolites. // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V.63. P.4272-4281.

376. Wittich R .M. Degradation of dioxin-like compounds by microorganisms. // Appl.

377. Microbiol. Biotech. 1998. V.49. №5. P.489-499.

378. Xu F., Bhandari A . Retention and extractability of phenol, cresol, anddichlorophenol exposed to two surface soils in the presence of horseradish peroxidase enzyme. // J. Agric. Food Chem. 2003. V.51. № 1. P. 183-188.

379. Xu P., Shin W., Brown S.H. A study of a series of recombinant fungal laccasesand bilirubin oxidase that exhibit significant differences in redox potential, substrate specificity and stability. // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V.l292. 1. P.303-311.

380. Yaropolov A.I., Skorobogat'ko O.V., Vartanov S.S., Varfolomeyev S.D. Laccase:properties, catalytic mechanism and applicability. // Appl. Biochem Biotechnol. 1994. V.49. P.257-280.

381. Zabel. R. A. , Morell J. J. Wood Microbiology: Decay and Its Prevention. //

383. Zacchi L., Burla G., Zuolong D., Harvey P.J. Metabolism of cellulose by

384. Phanerochaete chrysosporium in continuously agitated culture is associated withenhanced production of lignin peroxidase. // J. Biotechnol. 2000. V.78. № 2. 1. P. 185-92. (a)

385. Zacchi L. , Morris I., Harvey P.J. Disordered ultrastructure in lignin-peroxidasesecreting hyphae of the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium. If

386. Microbiology. 2000. V.l46 (Pt 3). P.759-765. (6)

387. Zacchi L. , Palmer J.M., Harvey P.J. Respiratory pathways and oxygen toxicity in

388. Phanerochaete chrysosporium. / / FEMS Microbiol. Lett. 2000. V.183. № 1. P.l53157. (B)

389. Zhu B.Z., Kitrossky N. , Chevion M . Evidence for production of hydroxyl radicalsby pentachlorophenol metabolites and hydrogen peroxide: A metal-independent organic Fenton reaction. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V.270. № 3. 1. P.942-946.

Информация о работе

Васильченко, Лилия Григорьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.16

Диссертация

Сообщество неспорулирующих мицелиальных грибов ИНБИ 2-26 из диоксинсодержащих тропических почв - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы