Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мицелиальные грибы и возможность их использования для детоксикации ксенобиотиков в почве

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Мицелиальные грибы и возможность их использования для детоксикации ксенобиотиков в почве"

На правах рукописи

Хромоныгина Валерия Викторовна

МИЦЕЛИАЛЬНЫЕ ГРИБЫ И ВОЗМОЖНОСТЬ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ В ПОЧВЕ

Специальность 03.00.16 — экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2004

Работа выполнена в Экобиоцентре экологического факультета Российского университета дружбы народов и Института биохимии им. А. Н. Баха РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ю.П. Козлов Научный консультант:

доктор химических наук, профессор М.Л. Рабинович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Г.И.Эль-Регистан доктор биологических наук, доцент А.В.Кураков Ведущая организации:

Институт биохимии и фитологии микроорганизмов им.Г.К.Скрябина РАН

часов па заседании диссертационного совета Д 212.203.17 в Российском университете дружбы народов но адресу: 115093, Москва, Подольское шоссе 8/5, экологический факультет РУДЫ.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Макпая. д. 6.

Автореферат разослан « _ » ^/СС^ч.^.—_2004 г.

Защита диссертация состоится « 2004

Ученый секретари диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Черных

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В условиях возделывания монокультур невозможно обойтись без агрохимических методов повышения урожайности, в том числе применения гербицидов. Постоянный рост количества вносимых препаратов приводит к накоплению в почвах и грунтовых водах гербицидов в концентрациях, значительно превышающих ПДК. Среди используемых для борьбы с сорняками, болезнями и вредителями сельскохозяйственных культур препаратов особую опасность представляют стойкие и кумулятивные гербициды. К ним относятся производные триазинов (симазин, атразин, третбутилазин и др.), остаточные количества которых обнаруживаются в почве спустя 10 и более лет после применения. По трофическим цепям эти ксенобиотики и их метаболиты (напр., дезэтилатразин) попадают в организм человека. В настоящее время обнаружены их мутагенный, аллергенный канцерогенный эффекты [Лозановская И.Н., 1998]. Поэтому первоочередная задача современной стратегии охраны окружающей среды в области сельского хозяйства состоит в снижении остаточных количеств гербицидов и возвращение в оборот загрязненных сельскохозяйственных угодий. Восстановление таких земель с помощью естественной микрофлоры является наиболее эффективным с экологической точки зрения подходом.

Разложение стойких ксенобиотиков в почвах осуществляется, главным образом, бактериями и мицелиальными грибами. По последним оценкам вклад почвенных бактерий и грибов в разложение гербицидов примерно одинаков [Ostгofsky, 2002]. Механизмы детоксикации гербицидов бактериями изучены весьма подробно [Wacket et a!., 2002, Ralebitso et а1., 2002, Головлева Л.А., 2003], В то же время, разрушению триазиновых гербицидов мицелиальными грибами посвящено относительно мало работ. Известно [Мицевич и др., 2002], что видовое разнообразие микромицетов в загрязненных почвах заметно снижается. Это позволяет говорить об адаптации отдельных видов грибов к повышенному содержанию стойких ксенобиотиков и о возможности поиска среди них перспективных видов деструкторов. Цели и задачи исследования: Целью работы являлось изучение влияния модельного ксенобиотика атразина (2-хлор-4-(К-этил)-6-(К-изопропнл)-1,3,5-триазина), одного из наиболее распространенных триазиновых гербицидов, на мицелиальные грибы различных экологических ниш. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

- выделить чистые культуры термофильных и мезофильных микромицетов, принимающих участие в процессах детоксикации ксенобиотиков в почве и поверхностных почвенных слоях;

- охарактеризовать систематическую принадлежность выделенных штаммов и их физиолого-биохимические особенности;

- оценить способность штаммов к деградации атразина;

- изучить механизм деградации атразина мицелиальными грибами.

Научная новизна

• Впервые показано, что атразин может изменять состав популяции термофильных микромицетов саморазогревающегося растительного компоста, избирательно стимулируя или угнетая не только организмы разных родов, но и разные штаммы одного вида.

• С помощью ПЦР-анализа установлена таксономическая принадлежность одного из иеспорулирующих мицелиальных грибов, выделенных из разлагающего атразин сообщества ИНБИ 2-26.

• Показана толерантность грибов сообщества ИНБИ 2-26 при концентрациях атразина до 500 мг/л и активация роста концентрациями до 50 мг/л, а также их способность разлагать 20 мг/л ксенобиотика за 6 недель.

• Впервые обнаружены синтез целлобиозодегидрогеназы и ряда целлюлолитических ферментов грибом СИа^отшт sp. ИНБИ 2-26- на бесцеллюлозной среде и его промотирование атразином; показано промотирование атразином синтеза лакказы у ИНБИ 2-26+

• Впервые показана способность бесклеточной системы, состоящей из целлюлаз и ЦДГ гриба СИа^отшт sp. ИНБИ 2-26-, совместно адсорбированных на целлюлозе, разлагать атразин в присутствии ионов железа.

Практическая значимость работы

Выделенные культуры и их внеклеточные ферменты представляют интерес для биоремедиации почв в условиях закрытого грунта, очистки сточных вод от остаточных количеств стойких гербицидов триазинового ряда, а также экспресс-детекции низких концентраций ксенобиотиков фенольной и хиноидной природы.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи в рецензируемых журналах, 1 статья в сборнике научных трудов «Актуальные проблемы экологии и природопользования» в 2000г. и 4 тезисах докладов. Основные положения диссертации представлены на I и И Международных Конгрессах «Биотехнология: состояние, перспективы развития» (Москва 2002, 2003), и 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (2003).

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на

страницах, включает рисунков и -?«2-таблиц. Список цитируемой

литературы включает наименовали Ь, том числе а иностранных

языках.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе 1 рассмотрена роль микромицетов - неотъемлемой составляющей почвенного биоценоза - в формировании почв. В главе 2 дана история применения триазинового гербинида атразина и рассмотрено его влияние на живые организмы. Вглаве 3 рассматриваются пути перемещения атразина по

почвенному профилю, физико-химические свойства взаимодействия отразима с почвой и её биотой. Глава 4 посвящена превращению атразина почвенной микрофлорой, рассмотрены возможные способы деградации атразина как бактериями, так и микромицетами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Микроорганизмы: Термофильные грибы из саморазогревающегося травяного компоста выделены нами в чистые культуры и идентифицированы с помощью определителя термофильных грибов [Билай, Захарченко, 1987] на основании типа конидиального спороношения.

Мезофильные неспорулирующие мицелиальные грибы: продуцент лакказы ИНБИ-2-26+ и продуцент ЦДГ ИНБИ 2-26- (Chaetomium sp.) выделены из разлагающего атразин сообщества ИНБИ 2-26 (Васильченко, 2003), и ИНБИ 2-26- идентифицирован как Chaetomium sp. в совместной работе с Гематологическим научным центром РАМН при помощи прямого секвенирования ПЦР-фрагментов, включающих полностью ils) и its2-транскрибируемые спейсеры 5,85-рДНК и часть гена 28Э-рДНК с вариабельными регионами D1 и D2, и последующего филогенетического позиционирования грибов на основе сравнения расшифрованных последовательностей с базой данных нуклеотидных последовательностей гомологичных локусов Genbank/EMBL/DDBJ программой Blast на сайте www.ncbi.nlm.nih.gov.

Выделение чистых культур неспорулнрующих минелиальных грибов из сообщества ИНБИ 2-26 проводили методом протопластирования на селективной среде, содержащей 0,2 г/л гваякола [Васильченко и др., 2002]. Отбирали колонии, образующие на этой среде черно-коричневые зоны наибольшего диаметра, а также колонии, не образующие зон при длительной инкубации.

Культивирование микроорганизмов проводили на плотных средах: сусло-агаре, картофельно-декстрозном агаре, овсяном агаре, крахмально-дрожжевом агаре, а также поверхностным способом на жидких средах Чапека-Докса ( 1 % глюкозы) или Чапека для грибов. Термофильные микроминеты выращивали при 45-58°С, мезофильные микромицеты при 28°С. Жидкофачное культивирование в присутствии атразина проводили на среде Чапека-Докса. Определение активности ферментов

Активность эндоглюканазы в фильтрате КЖ определяли

вискозиметрическим методом [Рабинович и др., 1977] в 0,1 М цитратно-фосфатном буфере (ЦФБ) (рН 5,0), используя 0,5%-ный раствор Na-соли КМ-целлюлозы средней вязкости («Sigma», США) в качестве субстрата. Активность других ферментов определяли с помощью регистрирующего спектрофотометра Спекорд М40 («Karl Zeiss», Германия).

Целлобиозодегидрогеназу (ЦДГ) определяли с помощью целлобиозы (38 мкМ, Merck, ФРГ) и дихлорфенолиндофенола (ДФИ) (86 мкМ, Sigma) в 0,1 M цитратно-фосфатном буфере при рН 5,5 (Cj2ti=6,3 шМ^см'1 ). Лакказу определяли

путем непрерывной регистрации продуктов окисления катехола (0,1%, Sigma) при 410 нм в 50 мМ К-фосфатном буфере, рН 6,5 при комнатной температуре. За 1 усл. ед. принимали прирост Af¡(¡ на 10'3 ед/мин. Целлобиогидролазу I определяли с помощью метилумбеллиферил- (5- D-лактозида (МУФЛ; 0,2 мМ, Merck) в 0,1 М ЦФБ, регистрируя накопление МУФ при 350 нм (рН 5,5) (Asiso = 1,62 mM'W [Мельник и др., 1991]). fi-Глюкозидазу определяли так же с помощью МУФ-р-^-глюкозида (0,2 мМ, Fluka) при рН 5,5.

На плотных средах ЦДГ, лакказу и целлюлазы определяли полуколичественно путем измерения размеров зон, образуемых этими ферментами вокруг колоний или лунок в присутствии специфических субстратов (ДФИ и целлобиозы, катехола, КМ-целлюлозы с окрашиванием Конго красным либо сшитой AZCL-ЫЕ-целлюлозы (MegaZyme, Ирландия), соответственно).

Атразии определяли с помощью офВЭЖХ на колонках с носителем «Luna» C18 ("Phenomenex", USA) или «Ultrasphere» ("Beckman Coulter", USA), либо методом ИФА с помощью специфических антител, полученных в лаборатории иммунобиохимии Института биохимии им. А.Н.Баха.

Разложение атразима бесклеточной системой. Целлюлазы и ЦДГ из КЖ 8-сут культуры продуцента, выращенной на фильтровальной бумаге, адсорбировали на аморфной целлюлозе, далее переносили ее в реакционную среду, содержащую атразин (100 мг/л) и ионы Fe3+ (100 мкМ) в 0ДМ К-ацетатном буфере, рН 4,0. Инкубировали 10 сут при перемешивании и 28"С, ежедневно отбирая пробы для определения атразина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние атразина на термофильные микромицеты, выделенные из саморазогревающегося растительного компоста

Термофильная микрофлора, развивающаяся на начальной стадии разложения растительных остатков, первой испытывает на себе влияние гербицидов, аккумулируемых фитомассой. Поэтому представляло интерес выяснить влияние атразина на термофильные микромицеты компоста.

1.1. Компонентный состав сообщества термофильных микромицетов

Основными компонентами сообщества грибов на термофильной стадии являются нецеллюлолитические организмы, потребляющие легкодоступные углеводы и представленные, в основном, Humicola (Thernwmyces) lanuginosa, a также термофилы-целлюлолитики [Deacon, 1984]. В выделенном нами сообществе доминировали штаммы //. lanutginosa, имеющие в целом более высокий температурный оптимум роста (табл.1). Это можно объяснить тем, что в процессе утилизации легкодоступной части углеводов выделяется много тепла за счет интенсивной респирации. Появление целлюлолитиков, возможно, свидетельствует о частичном исчерпании легкодоступных углеводов и снижении температуры компоста.

7 аблица 1. Компонентный состав термофильного сообщества грибов

Культура Оптимальная Диаметр колонии на полно- Влияние

т-ра. "C ценной среде на 3 сут. мм .прпзпна

Papulas/Mna Ihermophila-1 45 65 И.о.

P. lherinophila-2 45 68 И.о.

Humicola lanuginosa -1, Я lanuginosa -2 52-53 52 Стнм)ляш1я

Humicola insolens -9, H. lanuginosa -15 52-53 54 Стимуляция

H. lanuginosa -3,4, 7, 8 H. imolem-\b 56-58 56 И.о.

H. lanuginosa -5 56-58 57 Стимуляция

H. lanuginosa -12 56-58 54 Супрессия

Pénicillium sp.-l 1 52-53 12 Супрессия

Pénicillium sp.-l2 52-53 11 Супрессия

Pénicillium sp.-l3 56-58 20 Супрессия

Pénicillium sp.-25 52-53 15 Супрессия

Поэтому штаммы Н. lanuginosa, вероятно, более приспособлены к высоким температурам, чем целлюлолитики (табл.2), которые разлагают труднодоступную часть углеводов и выделяют меньше энергии в процессе дыхания. Наличие лаккказной активности у Н. lanuginosa позволяет предполагать, что эти грибы участвуют в гумификации растительных остатков.

Таблица 2. Активности ферментов термофильных микромпцетов.

1.2. Влияние атразина па отдельные штаммы

При концентрациях 0,2-20 мг/л атразин не вызывал гибели термофильных микромицетов, однако по-разному влиял на различные грибы. Так, наблюдали как стимулирование (Humicola lanuginosa 1,2,5,9,15), так и ингибирование роста гербицидом (H. lanuginosa 12, Pénicillium sp. 13) (табл.1). Таким образом, атразин может изменять не только родовой или видовой, но и внутривидовой состав популяции термофильных грибов, развивающихся на первой стадии разложения растительных остатков. При этом за 11-17 сут (времена, сопоставимые с продолжительностью термофильной стадии компостирования) ни один из изученных термофилов (как нецеллюлолитической, так и

целлюлолитической группы) не снижал достоверно концентрации атразина по сравнению с контролем (табл. 3).

Таблица 3. Концентрация атразина в жидкой среде при культивировании термофильных микромицетов_

Культура Концентрация атразина (мг/л)

3 сутки 11 сутки 17 сутки

Pénicillium sp.-!3 25,5±2,4 26,8±2,4 29,0±2,4

Humicoht lanuginosa -5 27±2,7 25,7±2,7 26,5 ±2,7

Hwnicolu lanuginosa -12 28,6±2,3 25,6±2,3 24,3±2,3

Контроль (45"C, без культуры) 25±2,3 26±2,6 29±3

Таким образом, ни спонтанного разложения атразина при 45°С, ни его разложения выделенными термофильными грибами обнаружено не было.

2. Влияние атразина на мезофильные мицелиальные грибы — компоненты

сообщества ИНБИ 2-26 из загрязненных гербицидами тропических почв

Мезофильная стадия разложения растительных остатков более продолжительна, чем термофильная. На. этой стадии в трансформации ксенобиотика могут принимать участие микроорганизмы, длительное время испытывающие воздействие накапливающейся в почве концентрации гербицида. Такие микроорганизмы и пути их адаптации представляют особый интерес для биоремедиации загрязненных территорий. В нашей лаборатории выделено сообщество неспорулирующих мицелиальных грибов ИНБИ 2-26 из почв Южного Вьетнама, подвергавшихся во время войны с США массированной обработке гербицидом Agent Orange (смесь 2,4-Д и 2,4,5-Т с технической примесью диоксинов), разлагающее атразин в жидкой культуре [Васильченко, 2003]. Методом рассева протопластов сообщество разделено на два компонента - продуцент лакказы ИНБИ 2-26+ и продуцент целлобиозодегидрогеназы ИНБИ 2-26-. Таким образом, в природном сообществе ИНБИ 2-26 два мицелиальных гриба 2-26+ и 2-26- способны в присутствии источника целлюлозы осуществлять циклический процесс окисления-восстановления ароматических полифенольных соединений [Васильченко, 2003]. Сходный редокс-цикл обнаружен у лигнинразрушающего базидиомицета Pycnoporus cinnabarinus [Temp and Eggert, 1999]. В ходе сопряженного разложения целлюлозы и лигнина гриб осуществляет таким путем регенерацию натурального аминофенола - 3-оксиантраниловой кислоты. Полагают, что последняя является медиатором, в присутствии которого лакказа данного базидиомицета способна разрушать нефенольные структуры лигнина, а также персистентные ксенобиотики. В этой связи представляло интерес выяснить, возможно ли разложение гербицида отдельными компонентами сообщества ИНБИ 2-26: продуцентом лакказы и продуцентом ЦДГ.

2.1. Идентификация неспорулирующего гриба ИНБИ 2-26-

Отсутствие конидиального спороношения или половой стадии развития затрудняло идентификацию мицелиальных грибов, составляющих сообщество

ИНБИ 2-26. Для молекулярной диагностики грибов из них выделяли хромосомную ДНК, проводили амплификацию и последующий сиквенс фрагментов генов, кодирующих рРНК 5^-, 18S- и 285-субъединиц рибосом. Наиболее близкими к изученным последовательностям гриба 2-26- оказались рРНК грибов СИа^отшт (Лска^отшт) (рис.1 ).

При исследовании аналогичным методом выявлена кладистическая близость штамма ИНБИ 2-26+ к СИа^отшт ¡р. ШВ1 2-26-.

■ 16798573 Aspergillus versicolor • 21623525 Chaetomium sp

13469772 Chaetomium chiversn

■ 20520598 Chaetomium irreguläre 13469787 Thielaviacephalothec

Др469786 Thielavia sp

13469779 Chaetomium murorum _rj »520596 Achaetomium strumanum

LChaelomium sp. INBI 2-26-

-20520399 Achaetomium globosum

4 P1* 20520400 Achaetomium globosum ^$^0520603 Achaetomium luteum 20520597 Achaetomium umbonatum —— 5006390 Aporothielavia leptode П^Д.3469775 Chaetomium dreyfussu Г" 13469768 Chaetomium sd

I n 13469770 Chaetomium brasiliens

13469780 Chaetomium piluliferu

- 20520601 Chaetomium hexagonosp

f- 13469773 Chaetomium cuvabenoen ~~(1^,3469784 Farrowia seminuda ИЗ*- 13469783 Farrowia malaysiensis П.1.3469778 Chaetomium homopilatu 13469771 Chaetomium brevipiliu r— 13469776 Chaetomium floriforme Mf3p469781 Chaetomium sphaerale 13469782 Farrowia longicollea

[Jgp469774 Chaetomium cupreum ■ AY267706 uncult AMF fungus r— 20520602 Chaetomium quadrangul [V^1ji99137 Chaetomium globosum 166 13469777 Chaetomium globosum r— 20520600 Chaetomium robustum 1^0520599 Chaetomium bostrychod 13469769 Chaetomium bostrychod

Рис. 1. Положение штамма ИНБИ 2-26- в филогенетическом дереве аскомицетов р. СИа^отшт согласно данным сиквенса генов рРНК.

2.2. Адаптация грибов к атразину на плотной среде

При культивировании мицелиального гриба ИНБИ 2-26- на плотных средах при оптимальной температуре обнаружено заметная стимуляция роста в присутствии атразина в концентрациях до 50 мкг/мл. Диаметр колоний при этом в 1,3 - 1,2 раза превосходил диаметр одновозрастных колоний на контрольных средах без атразина (рис.2).

Рис. 2. Диаметр колонии (мм) штамма ИНБИ 2-26- в зависимости от концентрации атразина (мкг/мл) на 6 сут роста гриба при 28° С.

При 37° на среде без атразина гриб развивался быстро и уже на 6-е сутки наблюдался его автолиз с уменьшением размера колонии. Присутствие атразина (50 мкг/мл) задерживало автолиз на 11-12 сут (рис.3).

Рис. 3. Развитие штамма ИНБИ 2-26- с атразином (1) и без атразина (2) (50мкг/мл) при 37°С.

При концентрациях гербицида в плотной среде свыше 100 мкг/мл размер колоний гриба ИНБИ 2-26- был меньше чем за то же время в контроле. При концентрации атразина в агаре 500 мкг/мл рост колоний гриба начинался лишь на 6-7 сутки после посева (рис. 4). При этом гербицид не оказывал заметного влияния на внешний вид колонии.

Рис 4 Размер колонии штамма ИНБИ 2-26- в зависимости от концентрации атразина /контроль, 2-20 мкг/мл, 3 - 100 мкг/мл, 4 — 500 мкг/мл

Штамм 2-26+ - продуцент лакказы был более чувствителен к репрессии атразином (рис. 5 кривая 4), который в концентрации 500 мкг/мл задерживал его рост на 3 нед

Рис. 5. Развитие штаммов ИНБИ 2-26- и ИНБИ 2-26+ без атравина (I и 2

соответственно) и с атразином (500 мкг/мл) (3 и 4 соответственно)

Однако при более длительной инкубации этот штамм адаптировался к высоким концентрациям ксенобиотика (рис. 6 )

Рис 6 Штамм ИНБИ 2-26+ на 25 сутки культивирования в присутствии атразина (слева) и в его отсутствие (справа) В обоих случаях гриб занимает всю поверхность чашек.

2.3. Разложение атразина грибами в жидкой культуре Влияние культур 2-26+ и 2-26- на содержание атразина изучали путем поверхностного культивирования на минимальной жидкой среде Чапека-Докса при концентрации атразина 20 мят/мл. Разложение атразина грибом-продуцентом лакказы ИНБИ 2-26+ контролировали с помощью ИФА [Королева, 2002]. Как видно из рис. 7 (кривая 1), за 40 сут гриб разрушает 78% гербицида в этих условиях.

сутки

Рис. 7. Степень деградации атразина грибами ИНБИ 2-26+ и ИНБИ 2-26- (кривые 1 и 2 соответствен но).

За разложением атразина культурой 2-26- наблюдали с помощью офВЭЖХ. На рис. 8 показаны типичные хроматограммы фильтрата культуры в разные периоды развития гриба.

С течением времени пик, соответствующий исходному гербициду, закономерно снижался, составляя на 10-е сут после внесения около 80%, через 4 нед. - около 30%, а к концу культивирования (7 нед.) не более 2% исходной величины. При этом на финальной стадии наблюдался широкий спектр различных соединений, которые не обнаруживались при культивировании гриба на той же среде в отсутствие атразина (рис. 8г). Содержание атразина в мицелии штамма ИНБИ 2-26- в конце культивирования не превышало 1% его исходного количества. Поэтому сорбция атразина мицелием не могла быть основной причиной 50-кратного уменьшения его концентрации в культуральной жидкости к концу процесса.

Таким образом, не только сообщество ИНБИ 2-26, способное осуществлять циклические редокс-процессы в присутствии источника целлюлозы, но и оба составляющих его штамма (продуцент лакказы ИНБИ 2-26+ и продуцент целлобиозодегидрогеназы ИНБИ 2-26- способны в отдельности трансформировать атразин в жидкой среде.

Рис. 8. Изменение концентрации атразина в КЖ сразу после внесения атразина (а) 1-18,8 мкг/мл, 7 сут; (б) II - 14,2 мкг/мл, 28 сут; (в) III - 9,2 мкг/мл, 40 сут; (г) IV - 1 мкг/мл.

3. Секреция ферментов мицелиальными грибами-компонентами сообщества ИНБИ 2-26 и влияние на нее атразина

Основными внеклеточными ферментами, участвующими в элиминации лигнинразрушающими грибами таких токсикантов, как полициклические ароматические соединения, полихлорированные бифенилы, дибензодиоксины, дибензофураны и др., считают лигнин- и марганецпероксидазы, а также лакказы [Рабинович и др., 2003]. Механизм детоксикации триазиновых ксенобиотиков лигнинразрушающими грибами изучен слабо. Известно, что скорость разложения атразнна базидиомицетами Coriolus venicolor, Hypholoma fasciculare и Stereum hirsutum не коррелирует с лигнинпероксидазной активностью [Bending et al., 2002]. В деградации атразина базидиомицетом Pleurotus pulmonarius помимо пероксидаз участвуют липоксигеназа и цитохром Р-450 [Masaphy et al., 1996].

Еще меньше известно об участии внеклеточных ферментов почвенных грибов в детоксикации триазиновых гербицидов. Так, почвенные дрожжи Lipomyces starkeyi потребляют симазин, атразин, цианазин, аметрин и прометрии, однако неясно, какие внеклеточные ферменты для этого необходимы [Nishimura et al., 2002]. В этой связи представлялось важным исследовать внеклеточные ферменты, синтезируемые потребляющими атразин почвенными грибами сообщества ИНБИ 2-26.

3.1. Синтез лакказы грибом ИНБИ 2-26+ и его стимулирование

Согласно гипотезе [Bollag е1. а1., 1992], лакказы почвенных грибов могут трансформировать ксенобиотики путем вовлечения их в процесс свободнорадикальной конденсации с фенольными соединениями и другими предшественниками гуминовых и фульвокислот. В этой связи представляло интерес выяснить, как влияет атразин на синтез лакказы грибом 2-26+.

На плотных средах атразин стимулировал синтез лакказы грибом 2-26+, что выражалось в увеличении радиуса зон окисления гваякола вокруг блоков одновозрастных культур, выращенных при разных концентрациях гербицида (рис. 9). Эффект был заметен как при 28, так и при 37°С.

атразином

Э \ вания при 28 и 37°С и

Рис.9. Лакказная активность штамма на 14 сут культивиро-

концентрациях атра-зина 0 (2 и 3 соотв.), 20 (4 и 5 соотв.),

50 (6 и 7 соотв.) и 100 м кг/мл (1).

Одновременно атразин влиял на интенсивность образование темно-коричневого пигмента культурой. При 37°С интенсивность пигментации коррелировала с лакказной активностью: неокрашенные 14-сут культуры, выращенные при концентрациях атразина 0 (контроль) или 20 мкг/мл, обладали низкой лакказной активностью, тогда как пигментированная культура (100 мкг/мл атразина) - высокой (рис. 9).

При 28°С атразин в концентрации 50 и 100 мкг/мл также заметно стимулировал синтез лакказы на плотной среде, однако корреляции с образованием пигмента не было (ср. рис. 9 и 10). Так, культуры, выращенные при концентрации атразина 0 и 20 мкг/мл, были более пигментированы, чем слабоокрашенная, но наиболее активная по лакказе культура, выращенная при концентрации атразина 100 мкг/мл (рис.10).

Рис.10. Интенсивность образования пигмента штаммом ИНБИ 2-26+ на 6 сутки культивирования при 28°С (слева - контроль, справа концентрация атразина 100 мкг/мл).

Вероятно, образование пигмента и стимулирование его образования при повышенной температуре (37°С) связано с конденсацией под действием лакказы соединения(ий), выделяемого(ых) культурой. Такой процесс гипотетически можно рассматривать как гумификацию или образование меланинов, в ходе которого происходит элиминация атразина по механизму, предложенному в работах [Во1^ Ы а1., 1992].

Для проверки данной гипотезы исследовали элиминацию атразина (20 мкг/мл) культурой ИНБИ 2-26+ в жидкой среде в присутствии ионов меди, индуцирующих синтез лакказы. В опытном эксперименте помимо ионов меди добавляли также гваякол (1 мМ), который интенсивно полимеризуется лакказой с образованием темнокоричневых пигментов. Одновременно гваякол повышает синтез лакказы в 1,5-2 раза (рис. 11).

Помимо вышеупомянутой гипотезы [Во1^ Ы а1., 1992] о сополимеризации ксенобиотиков с предшественниками гуминовых кислот и фульвокислот лакказами почвенных грибов проверяли также гипотезу [Леонтьевский, 2002] об образовании в присутствии гваякола и аналогичных соединений т.н. «желтых» лакказ, способных разлагать нефенольные ароматические структуры по катионрадикальному механизму в отсутствие медиаторов типа АБТС.

Эксперимент, однако, показал, что, несмотря на интенсивное пигментообразование и заметно более высокий уровень синтеза лакказы в присутствии гваякола, элиминация атразина в опытной культуре шла медленнее, чем в контрольной (рис.11, кривые 1 и 2). Более того, в момент достижения максимума активности лакказы после добавления ионов меди (вторая неделя роста) элиминация атразина замедлялась.

Рис. 11. Степень деградации атразина (%) и лакказная активность ИНБИ 2-26+ в присутствии гваякола (кривые 1 и 2 соответственно), и в отсутствие гваякола (кривые 3 и 4).

Таким образом, в процессе потребления атразина культурой 2-26+ нам не удалось обнаружить корреляции между активностью лакказы и полимеризацией гваякола, с одной стороны, и элиминацией атразина, с другой. Вероятно, синтез лакказы является неспецифическим ответом гриба на неблагоприятные условия и не коррелирует напрямую с потреблением данного ксенобиотика.

3.2. Синтез целлобиозодегидрогеназы и целлюлаз на бесцеллюлозных средах грибом Chaetonuiun sp. ИНБИ 2-26- и его стимуляция атразином

Образование ЦДГ обнаружено у ряда лигнинразрушающих грибов-возбудителей белой гнили древесины, у базидиомицета-возбудителя бурой гнили, не разрушающего лигнин (Coniophora puteana), у фитопатогенных базидиальных грибов, а также у ряда почвенных грибов, относящихся к возбудителям «мягкой гнили» древесины [Henriksson et.al., 2000J. Функция этого фермента в процессе разложения лигноцеллюлозы окончательно не выяснена. Полагают, что ЦДГ может генерировать по реакции Фентона высокореакционноспособные ОН-радикалы, разрушающие ксенобиотики [Hyde, Wood, 1997]. Реактив Фентона образуется в результате восстановления ферментом растворенного кислорода до перекиси водорода, а также ионов Fe3+ до при окислении целлобиозы в процессе ферментативного гидролиза

целлюлозы. Поэтому нельзя было исключить аналогичное действие

ЦДГ при деградации атразина грибом-продуцентом.

Для проверки этого предположения исследовали синтез ЦДГ и целлюлолитических ферментов грибом в бесцеллюлозной среде, в процессе разложения атразина, а также в его отсутствие. До последнего времени считалось, что ЦДГ является строго индуцибельным ферментом, синтезируемым только в присутствии целлюлозы либо небольших концентраций целлобиозы [Heшiksson et. а1., 2000]. В диссертационной работе впервые показан синтез ЦДГ грибом СИа^отшт ¡р на минимальной среде в отсутствие целлюлозы или целлобиозы. Активность ЦДГ обнаруживалась у культуры как на плотной (по обесцвечиванию ДФИ вокруг блоков культуры в присутствии целлобиозы, рис. 12), так и в жидкой среде (рис. 13).

В жидкой среде наблюдали также предшествующее появлению ЦДГ образование целлюлаз и глюкозидазы. В жидкой среде обнаружено также стимулирование атразином синтеза ЦДГ. Максимум активности ЦДГ соответствовал 31-сут культуре. При этом более 80% фермента секретировалось в среду, в отличие от Р~глюкозидазы, которая была преимущественно связана с мицелием и выходила в среду только к концу ферментации (вероятно, в результате автолиза).

0 5 10 15 20 25 30 35 40 сут

Рис. 12 Качественное определение Рис. 13. Динамика активности

ЦДГ при культивировании целлобиозодегидрогеназы (ЦДГ) при

СИа^отшт ер. ИНБИ 2-26- с культивировании гриба СИа^отшт

атразином (20, 50, 100 мкг/мл ер. ИНБИ 2-26- в присутствии (/) и в

соответственно). А, Б - 28°С, В - отсутствие (2) атразина, концентрация

37°С. атразина (3).

Так как Р-глюкозидаза и ЦДГ имеют общий субстрат (целлобиозу), можно предположить, что они выполняют в ходе гидролиза целлюлозы противоположные функции: ЦДГ, возможно, генерирует в присутствии целлюлозы активные частицы для разрушения структуры субстрата либо ксенобиотиков, а -глюкозидаза выполняет трофическую функцию и,

возможно, защищает мицелий гриба от действия ЦДГ, лишая последнюю субстрата.

Вместе с тем, отсутствие целлюлозы в среде культивирования гриба ставит вопрос о механизме индукции ЦДГ и происхождении целлобиозы, необходимой для ее действия. Индукция целлюлаз и р-глюкозидазы у мицелиальных грибов, выращенных на глюкозе, - явление известное [11теп е! а1., 1997]. Предполагают, что синтез этих ферментов начинается в голодающем мицелии после истощения глюкозы, причем индуктором выступает образуемый конститутивной -глюкозидазой мицелия продукт трансгликозилирования типа дисахарида софорозы [КиЫсек. е!. а1., 1993]. Возможно, аналогичный механизм запускает и синтез ЦДГ. Однако источник целлобиозы, необходимой для проявления активности ЦДГ, остается пока невыясненным.

4. Возможные пути разложения атразина почвенным мицелиальным

грибом ИНБИ 2-264.1. Синтез грибом- метаболита, аналогичного дехлорированному

гидроксипроизводному атразина Наиболее типичными продуктами деградации атразина в почве и грунтовых водах считают его дегалогенированные (гидроксиатразин) и деалкилированные (дезэтилатразин, дезизопропилатразин) производные. В литературе имеются сведения о том, что атразин разлагается почвенными грибами с образованием деалкилированных производных [Ьеуапоп, 1993]. Бактерии же преимущественно разлагают атразин через дегалогенирование. Поэтому представляло интерес выяснить, какие производные атразина образуют выделенные грибы в процессе его деградации. Дезэтилатразин и гидроксиатразин определяли с помощью офВЭЖХ в линейном градиенте ацетонитрила (рис.14).

Рис.14. Хроматограммы гидроксиатразина (ОЛ), дезэтилатразина (БЛ) и атразина (Л1х).

При этом в культуральной жидкости гриба ИНБИ 2-26-, выращенного в присутствии атразина, наблюдали пик, соответствующий гидроксиатразину. Однако в контрольной культуре гриба, не содержащей атразина, на 7-е сут

также обнаружено вещество, совпадающее по времени удерживания с гидроксиатразином (рис.15). Это не позволяет однозначно утверждать, что продуктом разложения атразина грибом 2-26- является гидроксиатразин.

\ |

Л . 1 5

о г « • • to п и « II at

Ыгмм

Рис. 15. Хроматограмма культуральной жидкости гриба-продуцента ЦДГ на 7 сутки роста в отсутствие атразина.

Вместе с тем, на 14 сут продукция метаболита в контроле отсутствовала, тогда как в опытных ферментациях идентифицировали гидроксиатразин. Возможно, атразин утилизируется грибом ИНБИ 2-26- именно потому, что гидроксиатразин сходен с одним из нормальных метаболитов данного гриба и может встраиваться в его метаболизм [Скрябин, 1976].

4.2. Разложение атразина модельной системой целлюлаз и целлобиозодегидрогеназы гриба Chaetomium sp. ИНБИ 2-26-, адсорбированной на аморфной целлюлозе

Как уже отмечалось, многие авторы рассматривают ЦДГ как источник ОН-радикалов, генерируемых ферментом в ходе ферментативного гидролиза целлюлозы за счет восстановления кислорода до перекиси водорода и ионов Fe3+ до Fe2*. Разложение атразина под действием реактива Фентона, синтезируемого химическим или электрохимическим путем, - достоверно установленный факт [Ventura et al., 2002, Jurva et al., 2002, Chan et al., 2003]. В этой связи представляло интерес исследовать способность внеклеточной ферментной системы, синтезируемой грибом 2-26-, разлагать атразин в присутствии ионов Fe3+ в кислой среде, где реактив Фентона наиболее эффективен. Моделирование данной реакции in vitro проводили путем специфической адсорбции внеклеточных целлюлаз и ЦДГ гриба 2-26-непосредственно из культуральной среды на аморфной целлюлозе. При этом был получен иммобилизованный ферментный комплекс, обладающий выраженной восстановительной способностью по отношению к субстратам ЦДГ в отсутствие экзогенно добавленной целлобиозы (целлобиоза образовывалась в результате действия адсорбированных целлюлаз на подложку - аморфную целлюлозу). На рис. 16 показан состав ферментного комплекса, адсорбированного на целлюлозе, определенный с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Основными компонентами комплекса являются целлобиогидролаза I (мол.масса 66 кДа) и

ЦЦГ (мол. масса 95 кДа), а также, вероятно, ее димер с мол. массой ок. 200 кДа [Карапетян, 2004].

Рис.16. Электрофорез адсорбированного на аморфной целлюлозе целлюлазного комплекса СИа^отшт sp. ИНБИ 2-26-. Слева — маркерные белки.

Инкубация данного комплекса с атразином в присутствии ионов Ре3* при рН 4,0 при перемешивании показала, что за неделю концентрация атразина снижается примерно вдвое (рис. 17).

Рис. 17. Разложение атразина адсорбированной на аморфной целлюлозе внеклеточной ферментной системой гриба Ска^отшт sp. ИНБИ 2-26- в присутствии ионов Ре'* (0,1 мМ в 0,1 М №-ацетатном буфере, рН 4,0) при 20°С.

Этот результат подтверждает возможную роль ЦДГ гриба 2-26- в разрушении атразина через генерацию ОН-радикалов в процессе ферментативного гидролиза целлюлозы в присутствии ионов железа.

Выводы

1. Нецеллюлолитические (Humicola spp.) и целлюлолитические (Penicillium spp., Populaspora sp.) культуры термофильных мицелиальных грибов, выделенные из саморазогревающихся растительных компостов, не разлагают в заметной степени атразина за 3 нед. в жидкой культуре, однако ксенобиотик может изменять не только родовой, но и внутривидовой состав популяции, противоположным образом влияя на разные штаммы одного вида.

2. В разлагающем атразин сообществе мезофильных мицелиальных грибов ИНБИ 2-26, выделенном из загрязненной диоксинами тропической почвы, с помощью ПЦР-анализа фрагментов генов 5S-, 18S- и 28S-pPHK идентифицирован продуцент целлобиозодегидрогеназы Chaetomium sp. ИНБИ 2-26-.

3. В жидкой минимальной среде с содержанием ксенобиотика 20 мг/л оба гриба разлагают 70% атразина за 4 нед. На плотной среде грибы способны развиваться при содержании атразина до 500 мг/л, однако рост ИНБИ 2-26-при этом задерживается на 6 сут., а рост ИНБИ 2-26+ - на 21 сут.

4. Малые концентрации атразина (до 50 мг/л) на 20-30% стимулируют рост Chaetomium sp. ИНБИ 2-26- и оказывают защитное влияние при адаптации гриба к повышенной температуре.

5. Атразин стимулирует лакказную активность штамма ИНБИ 2-26+ на плотной среде, хотя корреляции его разложения с активностью лакказы в жидкой среде не обнаружено.

6. Впервые установлена способность гриба-продуцента ИНБИ 2-26-синтезировать целлобиозодегидрогеназу на бесцеллюлозных средах. Синтез ЦЦГ запаздывает по сравнению с синтезом целлюлаз и р-глюкозидазы на 714 сут, причем, в отличие от преимущественно связанной с мицелием р-глюкозидазы, ЦДГ преимущественно выделяется в среду. Атразин (20 мг/л) стимулирует синтез ЦЦГ, целлюлаз и Р-глюкозидазы продуцентом.

7. Впервые установлена возможность разложения около 50% атразина (100 мг/л) при инкубации в течение 10 сут в жидкой среде с адсорбированной на аморфной целлюлозе пол и ферментной системой целлюлаз и ЦДГ Chaetomium sp. в присутствии ионов железа (0,1 мМ).

8. Обнаружено, что при росте на жидкой среде гриб Chaetomium sp. ИНБИ 226- секретирует соединение, время удерживания которого при офВЭЖХ совпадает со временем удерживания гидроксиатразина.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты 02-04-49033 и 03-04-20002

БНТС_а), Министерства промышленности, науки и технологии РФ

(Международный проект № 43.700.11.20 в рамках межправительственного

соглашения между РФ и СРВ о научно-технологическом сотрудничестве №

0248/01/01), а также Европейского Союза (INCO-Copernicus project № 1С 15-

СТ98-0103).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Khromonygina V.V. // Process of thermophilic composting and its role in sustainable agriculture in Theoretical and Applied Ecological Investigations // Proceedings of First International Conference of Ecological Faculty students and post-graduates. Москва, РУДН, 1999.Р.5.

2. Хромоныгина В.В. // Компостирование и его роль в устойчивом сельском хозяйстве. // сборник научных трудов «Актуальные проблемы экологии и природопользования». Москва, РУДН, 2000.С.18.

3. Koroleva O.V., Stepanova E.V., Landesman E.O., Vasil'chenko L.G., Khromonygina V.V., Zherdev A. V., Rabinovich M.L. // In vitro degradation of the heibicide atrazine by soil and wood decay fungi controlled through ELISA technique. //Toxicological and Environmental Chemistry. V. 80. № 3-4. P. 175188.2001.

4. Королева О.В, Степанова Е.В., Ландесман Е.О., Васильченко Л.Г., Хромоныгина В.В., Жердев А.В., Рабинович М.Л. // Иммуноферментый анализ разложения гербицида почвенными и древоразрушающими грибами. // Прикл. биохим. микробиол., 38, №4. С. 413-418. 2002.

5. Васильченко Л.Г., Хромоныгина В.В., Королева О.В., Ландесман Е.О., Гапоненко В.В., Ковалева ТА., Козлов Ю.П., Рабинович М.Л. // Потребление триазинового гербицида атразина лакказным и безлакказным вариантами почвенного гриба Mycelia stenlia ИНБИ 2-26. // Прикл. биохим. микробиол. 38, № 5. С. 534-539.2002.

6. Хромоныгина В.В., Васильченко Л.Г., Козлов Ю.П., Рабинович М.Л.// Разложение гербицида атразина почвенным грибом, выделенным из тропических почв с высоким остаточным содержанием диоксинов. // Тезисы постерного сообщения на I Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние, перспективы развития»14-18 октября 2002. С.137.

7. Хромоныгина В.В., Васильченко Л.Г., Козлов Ю.П., Рабинович М.Л // Потребление атразина почвенными грибами, выделенными из диоксинсодержащих тропических почв» тезисы сообщения на 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" 14-18 апреля 2003. С. 136.

8. Хромоныгина В.В., Васильченко Л.Г., Рабинович М.Л., Козлов Ю.П. // Разложение триазинового гербицида атразина мицелиальными грибами из тропических почв. // Тезисы постерного сообщения на II Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние, перспективы развития» 10-14 ноября 2003. С.42.

9. Хромоныгина В.В., Васильченко Л.Г., Салтыкова А.И, Козлов Ю.П., Рабинович М.Л. // Разложение гербицида атразина почвенным мицелиальным грибом ИНБИ 2-26- - продуцентом целлобиозодегидрогеназы. // Прикл. биохим. микробиол. Т. 40, № 3, С.337-343. 2004.

Хромоныгина Валерия Викторовна (Россия)

МИЦЕЛИАЛЬНЫЕ ГРИБЫ И ВОЗМОЖНОСТЬ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ В ПОЧВЕ

Показано, что атразин может изменять состав популяции термофильных микромицетов саморазогревающегося растительного компоста, избирательно стимулируя или угнетая не только организмы разных родов, но и разные штаммы одного вида.

С помощью ПЦР-анализа установлена таксономическая принадлежность одного из неспорулирующих мицелиальных грибов, выделенных из разлагающего атразин сообщества ИНБИ 2-26.

Показана толерантность этих грибов при концентрациях атразина до 500 мг/л и активация роста концентрациями до 50 мг/л, а также их способность почти полностью разлагать 20 мг/л ксенобиотика за 6 недель.

Впервые обнаружены синтез целлобиозодегидрогеназы и ряда целлюлолитических ферментов грибом Chaetomium sp. ИНБИ 2-26- на бесцеллюлозной среде и его промотирование атразином; показано промотирование атразином синтеза лакказы у ИНБИ 2-26+. Впервые показана способность бесклеточной системы, состоящей из целлюлаз и ЦДГ гриба Chaetomium sp. ИНБИ 2-26 (-), совместно адсорбированных на целлюлозе, разлагать атразин в присутствии ионов железа.

Filamentous fungi and their applicability for xenobiotic detoxification in soils

Atrazine was shown to be able of altering the composition of thermophilic fungal community isolated from self-heating plant compost by means of selective suppression or stimulation of both different species and different strains within the same species.

One of two non-spore-forming filamentous fungi from atrazine-decomposing soil fungal community INB1 2-26 was identified as Chaetomium sp. INBI 2-26- by means of PCR-analysis oftheir rRNA genes. Both were shown to grow in the presence of up to 500 mg/1 atrazine and to consume 20 mg/1 atrazine almost completely in 6 weeks. Atrazine (up to 50 mg/1) was also observed to stimulate the growth of Chaetomium sp., whereas its higher (100-500 mg/1) concentrations inhibited the development of both strains.

De novo synthesis of cellobiose dehydrogenase and cellulases by Chaetomium sp. INBI 2-26- was first demonstrated during cultivation of the fungus in cellulose-free medium, atrazine stimulating the enzyme formation. Production of laccase by the second fungus INBI 2-26+ was also shown to be stimulated by atrazine. The ability of extracellular enzyme system consisting of Chaetomium cellobiose dehydrogenase and cellulases adsorbed onto cellulose was first established to decompose atrazine at pH 4.0 in the presence ofFe3* ions.

Типография ИМАШ РАН, г. Москва, М Харитоньевский пер , 4

Лиц ПД № 00492 от 12 04 2000

Зак № от,2$, СЦ 20 ¿V тир. экз

• -93.55

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хромоныгина, Валерия Викторовна

Введение.

Обзор литературы.

ГЛАВА 1. Мицелиальные грибы как неотъемлемый компонент биоценоза и фактор почвообразования и плодородия почв.

ГЛАВА 2. Применение триазиновых гербицидов в сельском хозяйстве.

ГЛАВА 3. Триазиновые гербициды в почве.

3.1. Поведение атразина в почве. Абиотическая составляющая.

3.2. Атразин и биота почв.

3.3. Влияние триазинов на почвенные грибы.

ГЛАВА 4. Пути превращения атразина в почве.

4.1 .Фиторемедиация.

4.2. Атразин и почвенные микроорганизмы.

4.3. Деградация атразина грибами.

Экспериментальная часть.

ГЛАВА 5. Материалы и методы.

Объекты исследования.

Выделение и характеристика микроорганизмов.

Идентификация компонентов сообщества неспорулирующих мицелиальных грибов ИНБИ 2-26.

Методы изучения внеклеточных ферментов грибов.

Культивирование грибов в присутствии атразина.

Анализ содержания атразина.

Анализ содержания атразина с помощью ИФА. и его производных с помощью офВЭЖХ.

Адсорбция целлюлаз и ЦДГ на аморфоной целлюлозе.

Разложение атразина бесклеточной системой.

ГЛАВА 6. Результаты и их обсуждение.

6.1. Влияние атразина на термофильные микромицеты, выделенные из саморазогревающегося растительного компоста.

6.1.1. Компонентный состав сообщества термофильных микромицетов.

6.1.2. Влияние атразина на отдельные штаммы термофильных микромицетов.

6.2. Влияние атразина на мезофильные мицелиальные грибы - компоненты сообщества ИНБИ 2-26 и базидиальные грибы.

6.2.1. Влияние атразина на базидиальные грибы - возбудители «белой гнили» древесины.

6.2.1.1. Идентификация компонентов сообщества неспорулирующих мицелиальных грибов ИНБИ 2-26, выделенного из загрязненных ксенобиотиками тропических почв.

6.2.2. Влияние атразина на компоненты сообщества ИНБИ 2-26.

6.2.2.1 .Развитие грибов на плотных средах с атразином.

6.2.3. Разложение атразина грибами в жидкой культуре.

6.3.Секреция ферментов мицелиальными грибами-компонентами сообщества ИНБИ 2-26 и влияние на нее атразина.

6.3.1. Синтез лакказы грибом ИНБИ 2-26+ и его стимулирование атразином.

6.3.2. Синтез целлобиозодегидрогеназы и целлюлаз на бесцеллюлозных средах грибом Chaetomium sp. ИНБИ 2-26-и его стимуляция атразином.

6.4.Возможные пути разложения атразина почвенным грибом Chaetomium sp. ИНБИ 2-26-.

6.4.1.Синтез грибом метаболита, аналогичного дехлорированному гидроксипроизводному атразина.

6.4.2. Разложение атразина модельной системой.

Выводы.

Благодарность.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мицелиальные грибы и возможность их использования для детоксикации ксенобиотиков в почве"

Актуальность проблемы. В условиях возделывания монокультур невозможно обойтись без агрохимических методов повышения урожайности, в том числе применения гербицидов. Постоянный рост вносимого количества препаратов приводит к накоплению в почвах и грунтовых водах гербицидов в количествах, значительно превышающих предельно-допустимые концентрации (ПДК). Среди используемых препаратов для борьбы с сорняками, болезнями и вредителями сельскохозяйственных культур стойкие и кумулятивные гербициды представляют особую опасность. К ним относятся триазиновые гербициды (атразин, его метаболит диэтилатразин, третбутилазин и др.), остаточные количества которых обнаруживаются в почве спустя 10 и более лет после применения. По трофическим цепям эти токсичные ксенобиотики попадают в организм человека. В настоящее время обнаружены такие негативные аспекты их воздействия на биологические объекты, как мутагенный, аллергенный, канцерогенный [Лозановская И.Н., 1998]. Поэтому первоочередная задача современной стратегии охраны окружающей среды в области сельского хозяйства - постоянное снижение остаточных количеств гербицидов и возвращение в оборот загрязненных сельскохозяйственных угодий. С экологической точки зрения восстановление таких земель с помощью естественной микрофлоры является наиболее эффективным подходом.

В почвах разложение стойких ксенобиотиков осуществляется, главным образом, бактериями и почвенными грибами. По последним оценкам вклад в разложение гербицидов почвенными бактериями и грибами примерно одинаков [Ostrofsky, 2002]. Механизмы детоксикации триазиновых гербицидов бактериями изучены весьма подробно [Wacket et al., 2002, Ralebitso et al., 2002, Головлева JI.A., 2003]. В свою очередь, разрушению триазиновых гербицидов мицелиальными грибами посвящено крайне мало работ. Известно [Мицевич и др., 2000], что видовое разнообразие микромицетов в загрязненных почвах заметно снижается. Это позволяет говорить об адаптации отдельных видов грибов к повышенному содержанию стойких ксенобиотиков и о возможности поиска среди них перспективных видов деструкторов.

Цели и задачи исследования: Целью работы являлось изучение влияния модельного ксенобиотика атразина (2-хлор-4-(^-этил)-6-(Ь1-изопропил)-1,3,5-триазина), одного из наиболее распространенных триазиновых гербицидов, на мицелиальные грибы различных экологических ниш. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

- выделить чистые культуры термофильных и мезофильных микромицетов, принимающих участие в процессах детоксикации ксенобиотиков в почве и поверхностных почвенных слоях;

- охарактеризовать систематическую принадлежность выделенных штаммов и их физиолого-биохимические особенности;

- оценить способность штаммов к деградации атразина;

- изучить механизм деградации атразина мицелиальными грибами.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Хромоныгина, Валерия Викторовна

1. Нецеллюлолитические {Humicola spp.) и целлюлолитические {Penicillium spp., Papulaspora sp.) культуры термофильных мицелиальных грибов, выделенные из саморазогревающихся растительных компостов, не разлагают в заметной степени атразина за 3 нед. в жидкой культуре, однако ксенобиотик может изменять не только родовой, но и внутривидовой состав популяции, противоположным образом влияя на разные штаммы одного вида.2. В разлагающем атразин сообществе мезофильных мицелиальных грибов ИНБИ 2-26, выделенном из загрязненной диоксинами тропической почвы, с помощью ПЦР-анализа фрагментов генов 5S-, 18S- и 28S-pPHK идентифицирован продуцент целлобиозодегидрогеназы Chaetomium sp.ИНБИ 2-26-.3. В жидкой минимальной среде с содержанием ксенобиотика 20 мг/л оба гриба разлагают 70% атразина за 4 нед. На плотной среде грибы способны развиваться при содержании атразина до 500 мг/л, однако рост ИНБИ 2-

26- при этом задерживается на 6 сут., а рост ИНБИ 2-26+ - на 21 сут.4. Малые концентрации атразина (до 50 мг/л) на 20-30% стимулируют рост Chaetomium sp. РШБИ 2-26- и оказывают защитное влияние при адаптации гриба к повышенной температуре.5. Атразин стимулирует лакказную активность штамма ИНБИ 2-26+ на плотной среде, хотя корреляции его разложения с активностью лакказы в жидкой среде не обнаружено.6. Впервые установлена способность гриба-продуцента ИНБИ 2-26-

синтезировать целлобиозодегидрогеназу на бесцеллюлозных средах.Синтез иДГ запаздывает по сравнению с синтезом целлюлаз и р глюкозидазы на 7-14 сут, причем, в отличие от преимущественно связанной с мицелием р-глюкозидазы, ЦЦГ преимущественно выделяется в среду. Атразин (20 мг/л) стимулирует синтез ЦДГ, целлюлаз и р глюкозидазы продуцентом.7. Впервые установлена возможность разложения около 50% атразина (100

мг/л) при инкубации в течение 10 сут в жидкой среде с адсорбированной на аморфной целлюлозе полиферментной системой целлюлаз и ЦЦГ Chaetomium sp. в присутствии ионов железа (0,1 мМ).8. Обнаружено, что при росте на жидкой среде гриб Chaetomium sp. ИНБИ 2-

26- секретирует соединение, время удерживания которого при офВЭЖХ совпадает со временем удерживания гидроксиатразина.БЛАГОДАРНОСТЬ АВТОР СЕРДЕЧНО БЛАГОДАРИТ СВОИХ УЧИТЕЛЕЙ: НАУЧНОГО РУКОВОДИТЕЛЯ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК, ПРОФЕССОРА, ЗАВЕДУЮЩЕГО КАФЕДРОЙ СИСТЕМНОЙ ЭКОЛОГИИ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ФАКУЛЬТЕТА РУДН ПРОФЕССОРА Ю.П.КОЗЛОВА, НАУЧНОГО КОНСУЛЬТАНТА ДОКТОРА ХИМИЧЕСКИХ НАУК, ПРОФЕССОРА, ЗАВЕДУЮЩЕГО НАУЧНО УЧЕБНЫМ ОТДЕЛОМ БИОХИМИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ ЭКОЛОГИИ ИНБИ РАН РАБРШОВИЧА М.Л., СФ0РМР1Р0ВАВШР1Х ЕГО НАУЧНОЕ МИРОВОЗЗРЕНИЕ; К.Б.Н. ВАСИЛЬЧЕНКО Л.Г. ЗА ОБУЧЕНИЕ НАВЫКАМ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ РАБОТЫ, ПРЕДОСТАВЛЕНИЕ КУЛЬТУР ГРИБОВ И ЗА ПОМОЩЬ В ВЫПОЛНЕНИИ ОТДЕЛЬНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ОБСУЖДЕНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ; К.Б.Н. КОРОЛЕВУ О.В. ЗА ЦЕННЫЕ СОВЕТЫ И КРИТИЧЕСКИЕ ЗАМЕЧАНИЯ ПРИ ПОДГОТОВКЕ ДИССЕРТАЦИИ; К.Б.Н. ВАСИЛЕНКО О.В. ЗА ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-АНАЛИЗА 28S рДНК ГРИБОВ; К.Х.Н. А.В. ЖЕРДЕВА ЗА ПРЕДОСТАВЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ НА ATPA3PIH; К.Б.Н. ЛАНДЕСМАН О.В. ЗА ПОМОЩЬ В ИФА; Д.Б.Н. ШАПОШНИКОВА Г.Л. И К.Б.Н. ШЛЕЕВА СВ. ЗА ПРОВЕДЕНИЕ ВЭЖХ; ДИПЛОМНИКОВ САЛТЫКОВУ А., НОВИКОВУ Е.; А ТАКЖЕ ВСЕХ СОТРУДНИКОВ НАУЧНО-УЧЕБНОГО ОТДЕЛА БИОХИМИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ ЭКОЛОГИИ ИНСТИТУТА БИОХИМИИ ИМ. А.Н.БАХА РАН И ОСОБЕННО К.Б.Н. КАРАПЕТЯНА К.Н., К.Т.Н. ФЕДОРОВУ Т.В., К.Б.Н. ЗВЕРЕВУ Е.А., Д.Б.Н. КОМОЛОВУ Г.С, РУСТАМЬЯН Ю.Л., К.Т.Н. ПОПОВУ И.И., К.Б.Н. БОЛОБОВУ А.В. ЗА ПОСТОЯННУЮ ПОМОЩЬ И ПОДДЕРЖКУ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хромоныгина, Валерия Викторовна, Москва

1. Аристовская Т.В. 1. Микробиология подзолистых почв. // Москва. МГУ, 1965. 365 С.

2. Аристовская Т.В., Дараган А.Ю. и др. // Изучение микробных пейзажей почвы как средство познания почвенных процессов. // Микробиология. 1967. Т.36. вып.2. С.24-41.

3. Бабьева И.П., Зенова Г.М. II Биология почв. // Москва, МГУ, 1983.

4. Березовский М.Я. Немова Г.Н. // Особенности применения гербицидов производных сим-триазина на торфяных почвах. //Агрохимия, 1973, №12 с.102-110.

5. Билай Т.И., Захарченко В.А. // Определитель термофильных грибов. // Киев, Наукова думка, 1987.

6. Болобова А.В., Аскадский А.А., Кондращенко В.И., Рабинович M.JI. II Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Т. 2. Ферменты, модели, процессы. // М.:Наука, 2002.354 с. 2

7. Под ред. Дмитриева Е.А. II Гербициды и почва (экологические аспектыприменения гербицидов) //Москва, МГУ. 1990.

8. Ковда В.А. // Основы учения о почвах. // Москва, Наука, 1973, кн.1, 447с., кн.2,468 С.

9. Лебедева Г.Ф. //Гербициды и почва (экологические аспекты применения гербицидов). // Москва, МГУ, 1990.

10. Леонтъевский А.А. И Лигниназы базидиомицетов. // Дисс. . докт. биол. наук. Пущино, 2002.266 с.

11. Лозановская И.Н. // Экология и охрана биосферы при химическом загрязнении. //Москва, МГУ, 1998.

12. Лунев М.И., Кретова Л.Г. // Экологические аспекты применения гербицидов в растениеводстве. Обзорная информация. // ВИНИТЭИагропром Москва, 1992. 48 С.

13. Маличенко С.М. II Влияние симм-триазинов на микрофлору почв // Микробиологический журнал, 1971, Т.ЗЗ. №. 6. С. 734-35.

14. Мельников Н.Н., Белан В.Г. II Сравнительная опасность загрязнения почвы гербицидами производными симм-триазинов и некоторых других шестичленных гетероциклических соединений. // Агрохимия 1997. № 2. С.66-67.

15. Мельников Н.Н. II Пестициды и регуляторы роста. // Москва, «Химия» 1995.

16. Подред. акад. А.Ф. Ченкина. И История развития и проблемы защиты растений.//Москва, 1997.350с.

17. Agrow World Crop Protection News Feb. 26 2003, Mar. 28, 2003 www.agrow.crop.com

18. Asma D., Yesilada О. II Effect of paraquat on cellular defense enzymes and glutathione level of Funalia trogii. // Folia Microbiol (Praha) 2002.V.47. № 4. P. 413-6.

19. Armstrong D.E., Chesters G. II Adsorption catalyzed chemical hydrolysis of atrazine. // Environ. Sci. Technol. 1968. V.2 P.683-689.

20. Arnold S.M., Hickey W.J., Harris R.F., Talaat R.E. II Integrating chemical and biological remediation of atrazine and s-triazine-containing pesticide wastes. // Environ. Toxicol.Chem. 1996. V.15. P. 1255-1262.

21. Bariusso E., Feller C.H., Calvet R., Cerri С. II Sorption of atrazine, terbutryn and 2,4-D Herbicides in Two brazilian oxisols.// Geoderma. 1992. V.53. P. 155-167.

22. Basker A., Kirkman J.H., MacGregor A.N. II Changes in potassium availability and other soil properties due to soil ingestion by earthworms. // Biology and Fertility of Soils 1994. V.17. P.154-158.

23. Behki R.M. & Khan S.U. II Degradation by Pseudomonas: N-Dealkylation and dehalogenation of atrazine and its metabolites. // J. Agric. Food Chem. 1986. V.34. P. 746-749.

24. Bollag J.M., Sjoblad R.D. Minard R.D. // Polymerization of phenolic intermediates of pesticides by a fungal enzyme. // Experientia 1977. Dec 15; V.33.P. 1564-6.

25. Bollag J.M., Myers C.J., Minard R.D. II Biological & chemical interactions of pesticides with soil organic matter. // 1992. V. 123-124. P. 205-17.

26. Carder J. P.; Hoagland K. D. И Combined effects of alachlor and atrazine on benthic algalcommunities in artificial streams. // Environ. Toxicol. Chem. 1998. V.17. P.1415-1420.

27. Clark G.M., Goolsby D.A., and W.A. Battaglin. II Seasonal and annual load of herbicides from the Mississippi River basin to the Gulf of Mexico. // 1999. Environ. Sci. Technol. V.33. P.981-986.

28. X.Clay S.A., and W.C. Koskinen. II Adsorption and desorption of atrazine, hydroxyatrazine, and S-glutathiane atrazine on two soils. // Weed Sci. 1990. V.38. P. 262-266.

29. Chan K.H., Chu W. II Modeling the reaction kinetics of Fenton's process on the removal of atrazine. // Chemosphere 2003. V. 51. P. 305-311.

30. Chang Y. И The fungi of wheat straw compost. II. Biochemical and physiological studies. // 1967. Trans. Br. Mycol. Soc. V.50. P.667-677.

31. A.Clark G.M., Goolsby D. A. II Occurrence and load of selected herbicides and metabolites in the lower Mississippi River. // The Science of the Total Environment 2000 V. 248. P. 101-113.

32. Cook A.M., Grossenbacher H., Htitter R. II Bacterial degradation of N-cyclopropylmelamine. // Biochem J 1984. V.222. P.315-320.

33. Cook A.M., Beilstein P., Grossenbacher H., Htitter R. II Ring cleavage and degradative pathway of cyanuric acid in bacteria. // Biochem J 1985. V. 231.P. 25-30.

34. Dorfler U., and Scheunert I. II S-triazine herbicides in rainwater with special reference to the situation in germany. // Chemosphere. 1997. V. 35. P.77-85.

35. Dzantiev B.B., Zherdev A.V., Romanenko O.G., Sapegova L.A. II Development and comparative study of different immunoen2yme techniques for pesticides detection. // Int. J. Environ. Anal. Chem. 1996. V. 38. P. 95-111.

36. Erickson L.E., Lee H.K. // Degradation of atrazine and related s-triazines. // Crit. Rev. Environ. Control. 1989. V.19. P.l-13.

37. Esposito E., Paulillo S.M., Manfio G.P. //Biodegradation of the herbicide Diuron in soil by indigenous actinomycetes.// Chemosphere. 1998. V.37. P. 541-548.

38. Fahr K., Wetzstein H.G., Grey R., Schlosser D. II Degradation of 2,4-dichlorophenol and pentachlorophenol by two brown rot fungi. // FEMS Microbiol Lett. 1999. V.175. P. 127-32.

39. Farenhorst A., Topp E., Bowman B.T., Tomlin A.D. II Earthworms and the dissipation and distribution of atrazine in the soil profile. // Soil Biology & Biochemistry 2000. V.32. P.23-33.

40. Felsenstein J. II Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. //Evolution. 1985. V.39. P. 783-791.

41. Garcinuno R.M., Fernandez-Hernando P., Camara С. И Evaluation of pesticide uptake by Lupinus seeds. I I Water Res. 2003 .V.37. №14. P.3481-3489.

42. Helmeczi В. II The effect of herbicides on soil bacteria belonging to certain physiological groups // Acta phytopatol. Acad. Scient.hung. 1977 vol.12, №112. p. 41-49.

43. Higson F.K. II Degradation of xenobiotics by white rot fungi. // Rev. Environ. Contam. Toxicol. 1991. V. 122. P. 111-152.

44. Ilmen M, Saloheimo A., Onnela M.L., Penttila M.E. II Regulation of cellulase gene expression in the filamentous fungus Trichoderma reesei. II Appl. Environ. Microbiol. 1997. V.63. №4. P. 1298-306.

45. Khadrani A., Seigle-Murandi F., Steiman R., Vroumsia Т. // Degradation of three phenylurea herbicides (chlortoluron, isoproturon and diuron) by micromycetes isolated from soil.// Chemosphere. 1999. V. 38. P. 3041-3050.

46. Kimura M. II A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. // J. Mol. Evol. 1980. V.16. P. 111-120.

47. Kirby M. F.; Sheahan D. A. II Effects of atrazine, isoproturon, and mesoprop on the macrophyte Lemna minor and the alga Scenedesmus subspicatus. //Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1994. V.53. P. 120-126.

48. Kolpin D.W., Kalkhoff S.J., Goolsby D.A., Sneck-Fahrer D.A., Thurman E.M. II Occurrence of selected herbicides and herbicide degradation products in Iowa's ground water. // Ground Water 1997. V.35. P.679-688.

49. Kopriva J. II The toxicity of triazine and diazine based herbicides to fishes.// Agrochemica 1981. V.21. P.344-347.

50. Kreuz K. & Martinoia E. II Herbicide metabolism in pants: integrated pathways of detoxification. // P. 279-287 in Pesticide Chemistry and bioscience the food-environment challenge. 1999

51. Kubicek CP., Messner R., Gruber F., Mach R.L., Kubicek-Pranz E.M. II The Trichoderma cellulase regulatory puzzle: from the interior life of a secretory fungus.// Enzym.Microb.Technol. 1993. V. 15. № 2. P. 90-99.

52. Kullman S.W. and Matsumura F. II Metabolic pathways utilized by Phanerochaete chryosporium for degradation of the cyclodiene pesticide endosulfan. //Appl. Environ. Microbiol. 1996. V.62. P.593-600.

53. Levanon D. II Roles of fungi and bacteria in the mineralization of the pesticides atrazine, alachlor, malathion and carbofiiran in soil. // Soil Biology & Biochemistry. 1993. V.25. № 8. P.1097-1105.

54. Lewis J.A. II Effect of some herbicides on microbial activity in soil //Soil Biol. & Biochem. 1978. V.110. №2 P.137-141.

55. Li G.C., Felbeck G.T. И Atrazine hydrolysis as catalyzed by humic acids. // Soil Sci 1972.V.114. P.201-209.

56. Lytle J. S.; Lytle T. F. II Atrazine effects on estuarine macrophytes Spartina alternijlora and Juncus roemerianus. II Environ. Toxicol. Chem. 1998. V.17. P. 1972-178.

57. Macek K.J., Buxton K.S., Sauter S., Gnilka S., Dean J. W. II Chronic toxicity of atrazine to selected aquatic invertebrates and fishes. // EPA-600/3-76-047. U.S. Environmental Protection Agency. Duluth, NM. 1976.

58. Maheshwari R., and Kamalam P. Т. II Isolation and culture of a thermophilic fungus, Melanocarpus albomyces, and factors influencing the production and activity of xylanase. II J. Gen. Microbiol. 1985. V.131. P.3017-3027.

59. Mandelbaum R.T., Allan D.L., Wackett L.P. II Isolation and characterization of a Pseudomonas sp. that mineralizes the s-triazine herbicide atrazine. // Appl Environ Microbiol 1995. V.61.P.1451-1457.

60. Masaphy S., Henis Y., Levanon D. II Manganese-enhanced biotransformation of atrazine by the white rot fungus Pleurotus pulmonarius and its correlation with oxidation activity. //Appl. Environ. Microbiol. 1996. V.62. P. 3587-93.

61. Masaphy Y., Henis В., Krinfeld and D. Levanon. II In-vitro N-de-ethylation of atrazine by cell-free extract of Pleurotus pulmonariusis induced by Mn2+. // Biotechnology Letters, 1997. V. 19., No 9. P. 861-864.

62. MehargA.A. II Bioavailability of atrazine to soil microbes in the presence of the earthworm Lumbricus terrestris. И Soil Biology & Biochemistry 1996. V. 28. P.555-559.

63. Miller M., Palojarvi A., Rangger A., Reeslev M., and Kjoiler А. И The use of fluorogenic substrates to measure fungal presence and activity in soil // Appl. Envir. Microbiol. 1998. V.64. P. 613-617.

64. Moreau C., Mouvet С. II Sorption and desorption of atrazine,deethylatrazine and hydroxyatrazine by soil and aquifer solids. // Journal of Environmental Quality 1997. V.26. P.416-424.

65. Mulbry W. II Purification and characterization of a inducible s-triazine hydrolase from Rhodococcus corallinus NRRLB-15444R. I I Appl. Environ. Microbiol. 1994. V.60. P.613-618.

66. Nearpass D.C. II Effects of soil acidity on the adsorption, penetration and persistence of simazine. // Weed Science 1965. V.13. P.341-346.

67. Nearpass D.C. II Adsorption of picloram by humic acids and humin. // Soil Science 1976. V.121. P.272-277.

68. Nesketh N., Jones M.N., Tipping E. И The interaction of some pesticides and herbicides with humic substances. // Analitica Chimica Acta. 1996. V.327. P.191-201.

69. Nishimura K., Yamamoto M., Nakagomi Т., Takiguchi Y., Naganuma Т., Uzuka Y. II Biodegradation of triazine herbicides on polyvinylalcohol gel plates by the soil yeast Lipomyces starkeyi. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V.58.№ 6. P.848-852.

70. Ohkawa H., Imaishi H., ShiotaY., Yamada S. II Cytochrome P450s and other xenobiotic metabolizing enzymes in plants, in Pesticide Chemistry And Bioscience The Food-Environment Challenge, Royal Society of Chemistry // 1999. P.259

71. Oris J. 71, Winner R. W., Moore M.V. II A four-day survival and reproduction toxicity test for Ceriodaphnia dublia.// Environ. Toxicol. Chem. 1991. V.10. P.217-224.

72. Pinheiro R., Belo I., Mota M. II Oxidative stress response of Kluyveromyces marxianus to hydrogen peroxide, paraquat and pressure. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V.58. № 6. P.842-847.

73. Pointing S. В. И Feasibility of bioremediation by white-rot fungi. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V.57. P.20-33.

74. Radosevich M., Traina S.J., Yue-Li H., Tuovinen O.H. II Degradation and mineralization of atrazine by a soil bacterial isolate. // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V.61. P.297-302.

75. Ralebitso Т.К., Senior E. & van Verseveld H.W. II Microbial aspects of atrazine degradation in natural environments. // Biodegradation. 2002. V.13. P.ll-19.

76. Roy B. P., Dumonceaux Т., Koukoulas A. A., Archibald F. S. II Purification and characterization of cellobiose dehydrogenase from the white rot fungus Trametes versicolor. II Appl. Environ. Microbiol. 1996. V.62. P. 4417-427.

77. Sahid I.B., Yap M.Y. II Effects of two acetanilide herbicides on microbial populations and their cellulolytic activities. // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1994. V. 52. P. 61-66.

78. Saitou N. and Nei M. И The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. // Mol.Biol.Evol. 1987. V.4. P.406-425.

79. Selim H.M., Zhou L., Zhu H. // Herbicide retention in soil as affected by sugarcane mulch residue. //J Environ Qual. 2003.V.32. No4. P.1445-54.

80. Senesi N., Testini С. II Adsorption of some nitrogenated herbicides by soil humic acids. I I Soil Science 1980. V.10. P. 314-320.

81. Senesi N. II Binding mechanisms of pesticides to soil humic substances. // Science of the Total Environment 1992. V. 123-124. P.63-76.

82. Senesi N., D'Orazio V., Miano T.M. //Adsorption mechanisms of s-triazine and bipyridylium herbicides on humic acids from hop field soils. // Geoderma. 1995. P.273-283.

83. Schober U., Lampert W. II Effects of sublethal concentrations of the herbicide atrazine on growth and reproduction of Daphnia pulex. II Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1977. V.17. P.269-277.

84. Shea P.J. II Role of humified Organic Matter in herbicide adsorption. // Weed Technol. 1989. V.3. P.190-197.

85. Sheets T.J. II Persistence of triazine herbicides in soils. // Residue Rev. 1970. V.32. P.287-310.

86. Shipitalo M.J., Protz R., Tomlin A.D. II Feeding and casting activity of Lumbricus terrestris and L.rubellus in laboratory culture. // Soil Biology & Biochemistry 1988. V. 20. P.233-237.

87. Shimomura M, Nomura Y, Zhang W, Sakino M, Lee KH, Ikebukuro K, Karube II Simple and rapid detection method using surface plasmon resonance for dioxins, polychlorinated biphenylx and atrazine. // Analytica Chimica Acta 2001. V. 434. № 2. P. 223-230.

88. Simon L. Bergerova E. II Influence of selected herbicides on soil microflora and on the activity of certain enzymes // Acta fac. Rerum. Natur. Univ. Comen.Microbiol. 1984 P. 19-27.

89. Stehouwer R.C., Dick W.A., Traina S.J. II Characteristics ofearthworm burrow linings aecting atrazine sorption. // Journal of Environmental Quality 1993. V.22. P. 181-185.

90. Stamper D.M., Radosevich M., Hallberg K.B., Traina S. J., Tuovinen O.H. II Ralstonia basilensis M91-3, a denitrifying soil bacterium capable of using s-triazines as nitrogen sources. // Can. J Microbiol. 2002. V.48. P. 1089-98.

91. Streit В., Peter H. M. II Long term effects of atrazine to selected freshwater invertebrates.//Arch.Hydrobiol. Suppl. 1978. V.55. P.62-77.

92. Strong L.C., McTavish H., Sadowsky M.J. Wackett L.P. И Field-scale remediation of atrazine-contaminated soil using recombinant Escherichia coli expressing atrazine chlorohydrolase. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 2. P. 91-98.

93. Struthers J.K., Jayachandran K., Moorman T.B. // Biodegradation of atrazine by Agrobacterium radiobacter J 14a and use of this strain in bioremediation of contaminated soil. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V.64. P.3368-3375.

94. Strand S. II Degradation of Xenobiotic Nitrogen Compounds, Including Munitions// CEWA. 1993. V.3. P. 46-71.

95. Sullivan J.D., Felbeck G.T. II A study of the interaction of s-triazine herbicides with humic acids from three diferent soils. // Soil Science 1968.V.106. P.42-52.

96. Tang J., Hoaglang K. D., Siegfried В. II Uptake and bioconcentration of atrazine by selected freshwater algae. // Environ. Toxicol. Chem. 1998. V.17. P. 1085-1090.

97. Tasli F. Breyl /., Kredl F. II Toxic effects of atrazine on algae. // 1996. V.22. P. 181-185.

98. Temp U., Eggert С. II Novel Interaction between Laccase and Cellobiose Dehydrogenase during Pigment Synthesis in the White Rot Fungus Pycnoporus cinnabarinus. //Appl. Environ. Microbiol. 1999. V.65. № 2. P.389-395.

99. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F. and Higgins,D.G. II The Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence• alignment aided by quality analysis tools. // Nucleic Acids Research. 1997. V.25. P. 4876-4882.

100. Tomlin A.D., McCabe D., Protz R. II Species composition and seasonal variation of earthworms and their effect on soil properties in southern Ontario, Canada. // Soil Biology &Biochemistiy 1992. V.24. P. 1451-1457.

101. Topp E., Zhu H., Nour S.M., Houot S., Lewis M, Cuppels D. II Characterization of an atrazine-degrading Pseudaminobacter sp. isolated from Canadian and French agricultural soils. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. P. 2773-2782.

102. Topp E. II A comparison of three atrazine-degrading bacteria for soil bioremediation. // Biol. Fertil. Soils 2001. V.33. P.529-534.

103. Tuguela A-M., Sarna L.P., Webster G.R.B. // Solid phase Microextraction (SPME) of the herbicide atrazine in aqueous soil suspensions. // Intern. J. Environ. Anal. Chem. 1998. V.68. P. 137-153.

104. Veber K, Zahradnik J., Breyl I., Kredl F. И Toxic effects of atrazine on algae.// Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1981. V.27. P.872-876.

105. Ventura A., Jacquet G., Bermond A., Camel V. II Electrochemical generation of the Fenton's reagent: application to atrazine degradation. // Water Research 2000. V.36. P. 3517-3522.

106. Wackett L.P., Sadowsky M.J.,Martinez В. II Biodegradation of atrazine and related s-triazine compounds: from enzymes to field studies. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 58. P.39-45.

107. Waddel Т.Е. Bower B.T. II J.Soil Water Conserv. 1988.V.43. № 3 p.241-242.

108. Weber J.В., Weed S.B., Ward T.M. II Adsorption of s-triazines by soil organic matter. // Weed Science 1969. V.17. P.417-421.

109. Weber J.B. II Adsorption of s-triazines and montmorillonite as a function of pH and molecular structure. // Soil Science Society American Proceedings 1970. V. 34. P.401-404.

110. Wetzstein H.-G., Schmeer N., Karl W. II Degradation of the fluoroquinolone enrofloxacin by the brown rot fungus Gloeophyllum striatum: identification of metabolites. //Appl. Environ. Microbiol. 1997. V.63. P.4272-4281.

111. Yanze-Kontchou C. & Gschwind N. II Mineralization of the herbicide atrazine in soil inoculated with a Pseudomonas strain. // J. Agricul. Food Chem. 1995. V. 43. P. 2291-2294.

112. Yeates G.W., Wardle D.A., Watson R.N. И Responses of soil nematode populations, community structure, diversity and temporal variability to agricultural intensification over a seven-year period. // Soil Biology and Biochemistry 1999. V.31. P.1721-1733.