Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Целлобиозодегидрогеназа почвенного аскомицета ИНБИ 2-26(-)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Целлобиозодегидрогеназа почвенного аскомицета ИНБИ 2-26(-)"

На правах рукописи

КАРАПЕТЯН Карен Навасардович

ЦЕЛЛОБИОЗОДЕГИДРОГЕНАЗА ПОЧВЕННОГО АСКОМИЦЕТА ИНБИ 2-26(-)

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2004

Работа выполнена в научно-учебном отделе биохимических проблем экологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор М.Л. Рабинович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Г.Л. Шапошников кандидат химических наук А.В. Гусаков

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН

Защита диссертации состоится « & » ^ 2004 г. в » часов на за-

седании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.1.

Автореферат разослан 2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Клеточные стенки древесных растений имеют сложную, высокопрочную структуру, определяющую их устойчивость к микробной деградации. В природе их разложение осуществляется, главным образом, базидиомицетами и почвенными мицелиальными грибами [Рабинович и др, 2001]. Среди базидиомицетов наиболее эффективны возбудители белой гнили, разрушающие как полисахаридные компоненты древесины, так и трехмерную фенилпропаноидную сетку лигнина. Помимо цел-люлаз и гемицеллюлаз они синтезируют оксидоредуктазы: гемсодержащие лигнин- и марганец-пероксидазы и медьсодержащие лакказы [Болобова и др., 2002], которым отводят центральную роль в разложении лигнина в природе. Многие древоразрушающие грибы секретируют также целлобиозодегидрогеназу (ЦДГ; КФ 1.1.99.18). ЦДГ относится к флавогемопротеинам и является единственным внеклеточным представителем этой группы белков. ЦДГ осуществляет процесс сопряженного окисления целлобиозы - продукта ферментативного гидролиза целлюлозы - и восстановления хинонов или катион-радикалов - продуктов действия оксидоредуктаз на лигниновые структуры [Henriksson et al., 2000, Cameron and Aust, 2001].

В настоящее время нет единой точки зрения на то, какие именно оксидоредуктазы наиболее эффективны при деградации нефенольных структур и деполимеризации лигнина [Леонтьевский, 2002]. Известен базидиомицет Pycnoporus cinnabarinus, эффективно разрушающий лигнин в отсутствие лигнин- и марганец-пероксидаз. Его лигнинраз-рушающая система включает только лакказу и целлобиозодегидрогеназу [Temp and Eggert, 1999]. Образование лакказ и целлобиозодегидрогеназ обнаружено и у почвенных грибов-возбудителей мягкой гнили древесины [Васильченко и др., 2000; Рабинович и др., 2001; Henriksson et al., 2000], однако механизм разложения ими лигноцеллюлозы до настоящего времени мало изучен.

Ранее в пашей лаборатории было выделено и охарактеризовано сообщество почвенных мицелиальных грибов ИНБИ 2-26, один из которых (ИНБИ 2-26(+)) образует лакказу, а второй (ИНБИ 2-26(-)) - ЦДГ [Васильченко, 2003]. Это позволило смоделировать in vivo ферментную систему высокоактивного разрушителя лигнина P. cinna-barinus и изучить роль ЦДГ почвенных грибов в разложении липюцеллюлозы.

По сравнению с ЦЦГ базидиомицетов ЦДГ почвенных аскомицетов относительно мало изучены. Наиболее исследованы из них ферменты, образуемые термофильными грибами Н. insolens и М. thermophila. [Henriksson et al., 2000]. Обе эти ЦДГ заметно отличаются от ЦЦГ базидиомицетов рН-оптимумом активности. По одной из гипотез [Ludwig et al., 2004] ЦЦГ аскомицетов образуют отдельную структурную группу в семействе ЦЦГ.

Структура и механизм действия ЦДГ являются в последние годы предметом интенсивного изучения, так как этот фермент представляет серьезный практический интерес для создания биосенсоров с амплификацией сигнала и получения лактобионовой кислоты. Наиболее изучена ЦДГ древоразрушающего базидиомицета Phanerochaete chry-sosporium, состоящая из двух пространственно разделенных доменов. Больший ФАД-содержащий N-концевой домен гомологичен оксидоредуктазам семейства флавиновых оксидаз (глюкозо-метанол-холиноксидаз). Меньший гемсодержащий С-концевой домен имеет уникальную структуру, не найденную у других тем-белков. Роль тема и механизм переноса электрона между ним и ФАД остаются весьма спорными. Роль ЦДГ в разложении целлюлозы также требует отдельного изучения. Полагают, что, специфически адсорбируясь на целлюлозе, ЦДГ не только удаляет ингибитор целлюлаз - целлобиозу, но и разрушает кристаллическую структуру полисахарида путем генерации ОН-радикалов через реакцию Фентона, сопряженную с катализируемым ЦДГ восстановлением Fe3+. Такой механизм, в частности, предложен для базидиомицета-возбудителя бурой гнили Coniofora puteana [Henriksson et al., 2000].

Цель и задачи исследования: Цель настоящей работы заключалась в исследовании роли ЦДГ нового мицелиального гриба в процессе разложения лигноцеллюлозы, а также изучении ее каталитических свойств.

Поставленная цель определила задачи диссертационной работы:

1. Изучить способность компонентов сообщества мицелиальных грибов ИНБИ 2-26: продуцента лакказы (2-26(+)) и продуцента ЦДГ (2-26(-)), а также смешанной культуры разлагать основные биополимеры натурального лигноцеллюлозного субстрата.

2. Выделить индивидуальную ЦДГ и изучить ее физико-химические свойства и субстратную специфичность.

3. Выяснить возможный кинетический механизм действия фермента в реакциях с двух- и одноэлектронным акцептором.

4. Изучить способность ЦДГ к адсорбции на целлюлозе и ее функционирование совместно с целлюлазами в процессе гидролиза целлюлозы.

Научная новизна: Установлена способность разложения продуцентом ЦДГ лигнина в лигноцеллюлозном субстрате. Показано, что выделенная ЦДГ имеет оптимум активности в нейтральной области рН. Спектральные свойства фермента и его способность восстанавливать двух- и одноэлектронные акцепторы указывают на то, что он является флавогемопротеином с цитохромом типа Ь. Изучена стабильность фермента и его кинетические характеристики в реакциях с дихлорфенолиндофенолом (ДФИ) и цитохромом с. Показана избирательность сорбции ЦДГ на аморфной целлюлозе и способность катализировать сопряженную с целлюлазами реакцию гидролиза целлюлозы -восстановления ДФИ.

Практическая значимость: Изученная ЦДГ обладает рядом преимуществ по сравнению с ЦДГ базидиомицетов при создании биосенсоров на фенолы с амплификацией сигнала, в частности с оптимумом активности в нейтральной области рН и высоким сродством к целлобиозе и лактозе. Показана возможность многократного использования системы адсорбированных на аморфной целлюлозе ЦДГ и целлюлаз гриба ИНБИ 2-26(-) для безреагентного восстановления хинонов.

Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе три статьи. Основные положения работы были представлены на 1-ом Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), 7-ой школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003) и 7-ой международной научно-практической конференции «Наука - индустрии сервиса» (Москва, 2002).

Объем работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 1ДЗ;траницах, включает ¿3 рисун-

ков и i О таблиц. Список цитируемой литературы включает 4- наименований, в том числе на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования: Штаммы продуцента лакказы (ИНБИ 2-26(+)) и продуцента ЦДГ (ИНБИ 2-26(-)) выделены из сообщества неспорулирующих почвенных ми-целиальных грибов ИНБИ 2-26 Л.Г. Васильченко [Васильченко, 2003]. По данным сик-венса 28S рДНК штамм 2-26(-) наиболее близок аскомицетам p. Chaetomium (гомология 99%). Культуры поддерживали, как описано ранее [Васильченко, 2003].

Культивирование грибов на лигноцеллюлозном субстрате (овсяной соломе) проводили в твердофазном и жидкофазном вариантах, при 28°С. При твердофазном культивировании использовали солому 75-80%-ной влажности, процесс вели от 2 до 4 мес. Глубинное культивирование проводили в жидкой среде Чапека-Докса с 3% резаной овсяной соломы в качестве единственного источника углерода в колбах на качалке при 220 кол/мин в течение 36 сут. В ходе ферментации в пробах культуральной жидкости определяли активности лакказы и ЦДГ. По окончании каждого процесса ферментации остаток соломы промывали, высушивали и определяли потерю массы, а также содержание гемицеллюлоз, лигнина и целлюлозы [Оболенская и др., 1965].

Выделение ЦДГ из 8-суточной глубинной культуры продуцента, выращенного на фильтровальной бумаге, проводили путем 4-кратного концентрирования супернатанта, ионообменной хроматографией па DEAE-Toyopearl 650 (Tosoh, Япония) и FPLC на колонке monoQ HR 5/5 (Pharmacia, Швеция) [Карапетян и др., 2003]. Активные фракции с Rz >0,4 собирали и хранили в присутствии хлороформа в качестве консерванта.

Определение ферментов. Активность лакказы определяли спектрофотометриче-ски при 410 нм с использованием катехола в качестве субстрата. Активность ЦДГ определяли с целлобиозой и дихлорфенолиндофенолом при рН 6,0 и 520 нм [Henriksson et al., 2000]. При совместном присутствии лакказы и ЦДГ активность лакказы определяли с использованием ДФИ, частично восстановленного FeSO^, регистрируя увеличение поглощения при 605 нм [Васильченко и др., 2004]. Целлюлазную активность определяли с использованием фильтровальной бумаги в качестве субстрата, концентрацию Сахаров определяли с помощью гндразида п-оксибензойной кислоты [Lever, 1973];

Р-глюкозидазу определяли спектрофотометрически с 4-метилумбеллиферил-бета-В-глюкозидом при 350 нм [Зверева, 2002]. Восстановление цитохрома с3* с участием ЦДГ регистрировали при 554 нм. Изучение стационарной кинетики и определение активностей проводили при 20°С.

Электрофорез. Для электрофореза белков, адсорбированных на целлюлозе, брали 2 мг аморфной целлюлозы, промывали ЦФБ и деионизированной водой, кипятили с 200 мкл sample-буфера и наносили на дорожку 20-40 мкл супернатанта.

Адсорбцию белков на необработанной или регенерированной из 85% Н3РО4 фильтровальной бумаге изучали с фильтратом культуры продуцента в качестве источника целлюлаз и ЦДГ, либо с гомогенной ЦДГ, а также с конканавалином А.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разложение компонентов лигноцеллюлозного субстрата (овсяная солома) сообществом мицелиальиых грибов ННБИ 2-26, а также его отдельными компонентами - продуцентом лакказы и продуцентом ЦДГ

Природное сообщество почвенных грибов ИНБИ 2-26 интересно тем, что оно разлагает лигнин, и отдельные ксенобиотики в сопоставимой степени с базидиомицета-ми-возбудителями белой гнили [Koгoleva et а1., 2001, Васильченко, 2003]. Сообщество состоит из двух мицелиальных грибов: 2-26(+) и 2-26(-). На плотной среде с соломой в качестве единственного источника углерода эти грибы растут примерно с одинаковой скоростью и являются взаимотолерантными (рис.1). Оба штамма не осветляют соломы, чем отличаются от возбудителей белой гнили. Было установлено, что штамм 2-26(+) образует лакказу [Koгoleva et а1., 2001, Васильченко, 2003], а штамм 2-26(-) - ЦДГ [Васильченко, 2003, Карапетян и др., 2003]. Отсутствие собственной лакказы у продуцента ЦДГ было показано прямым измерением, т.к. ЦДГ не мешает определению лакказы в отсутствие целлобиозы. Чтобы измерить собственную ЦДГ у продуцента лакказы, последнюю селективно ингибировали №N3 (10 мМ). Степень ее ингибирования составляла 99,9%, а ЦДГ при этом сохраняла > 60% активности. Так было установлено, что в пределах чувствительности метода продуцент лакказы не образует собственной ЦДГ.

Таким образом, лакказа и ЦДГ служат специфическими маркерами штаммов ИНБИ 2-26(+) и ИНБИ 2-26(-) в природном сообществе и смешанной культуре. Следовательно,

в присутствии источника целлюлозы в смешанных популяциях возможен циклический процесс окисления-восстановления ароматических полифенольных соединений [Васильченко, I 2003]. Сходный циклический процесс описан у I мощного ксилотрофного гриба, возбудителя белой гнили древесины Pycnoporus cinnabarimis ' [Eggert et. al, 1995]. В процессе сопряженного разложения целлюлозы и лигнина гриб осуще-, ствляет таким путем регенерацию натурального

Рис. 1. Совместное культивирование грибов на платой opens с овсяной соломой 1-штаммИНБИ2-260, 2-шгаммИИБИ 2-26(+)

аминофенола - 3-оксиантраниловой кислоты (3-ОАК). Предполагается, что 3-ОАК является медиатором, в присутствии которого лакказа данного базидиомицета способна разрушать нефенольные структуры лигнина, а также персистентные ксенобиотики ароматической природы.

В диссертационной работе нами предпринята попытка выяснить роль ЦДГ в разложении лигнина циклической редокс-системой лакказа-ЦДГ [Temp, Eggert, 1999]. Для этого реконструировали лигнинразрушающую систему возбудителя белой гнили древесины P. cinnabarimis на основе двух вышеназванных грибов, секретирующих те же

ферменты и способных развиваться совместно. При культивировании индивидуальных штаммов и смешанной культуры на овсяной соломе в условиях твердофазной или глубинной ферментации грибы также хорошо росли, но не отбеливали субстрата и таким образом, не принадлежат к возбудителям белой гнили. Для изучения динамики образования ферментов грибы выращивали в условии глубинного культивирования.

Как видно из рис. 2, в среде с соломой штаммы 2-26(+) и 2-26(-) образуют специфические для них ферменты: лакказу и ЦДГ. В среде культивирования активность лак-казы штамма 2-26(+) достигала максимума на 28-е сутки, а активность ЦДГ штамма 2-26(-) была максимальной с 14 по 28 сут. В смешанной культуре обнаруживались оба фермента, однако максимальный уровень синтеза лакказы был в 1,5 раза меньше, чем у штамма 2-26(+), а синтез ЦДГ был таким же, как у штамма 2-26(-). Степень разложения лигнина, целлюлозы и гемнцеллюлоз резаной овсяной соломы за 36 сут составляла 30; 51 и 72% для продуцента лакказы, 16, 34 и 59% для продуцента целлобиозодегидрогена-зы и 16, 39 и 65% для смешанной культуры (рис. 3).

Содержание кислоторастворимого лигнина было во всех образцах одинаковым и составляло около 5% общего содержания лигнина, что соответствует его процентному содержанию в лигнине исходной соломы. Таким образом, низкомолекулярная фракции лигнина в данном случае потреблялись так же, как и его высокомолекулярная фракция. Накопления низкомолекулярных компонентов, иногда наблюдаемого в бесклеточных системах деградации лигнина [Hyde and Wood, 1997], в нашем случае не отмечено.

Рис. 3. Убыль компонентов овсяной соломы (в % отпаянного содержания) после глубинного культивирования грибов в течение 36 сут.

Таким образом, штамм ИНБИ 2-26(+) в два раза более эффективно разлагает лигнин, чем штамм 2-26(-). Однако последний также достоверно разлагал лигнин, хотя и в меньшей степени.

Возможный механизм разложения лигнина грибами-продуцентами ЦДГ обсуждается в работах [Kremer and Wood, 1992; Hyde and Wood, 1997]. Полагают, что ЦДГ образует ОН-радикалы через восстановление и кислорода до и что эти радикалы вызывают деполимеризацию целлюлозы, ксилана и в некоторой степени лигнина [Henriksson et al., 2000, Horanyi et al., 2001]. Секреция ЦДГ обнаружена у грибов-возбудителей мягкой и бурой гнили. Поэтому этот фермент, вероятно, может вызывать определенную (хотя и небольшую) деградацию лигнина грибами, не образующими лигнин-, марганецпероксидаз и лакказ.

Как видно из рис. 3, совместное действие на лигноцеллюлозный субстрат продуцентов лакказы и ЦДГ не приводит к явлению синергизма в разложении лигнина. Наоборот, при переходе от продуцента лакказы к смешанной культуре и далее к продуценту ЦДГ наблюдается закономерное снижение степени разложения отдельных компонентов.

Таким образом, идея Temp и Eggert [1999] о стимулирующей функции ЦДГ в разложении лигнина под действием лакказы не подтверждается на примере данного сообщества. Роль ЦДГ в сообществе ИНБИ 2-26 может заключаться в том, что она защищает штамм 2-26(-) от свободнорадикальных и хиноидных метаболитов, образуемых продуцентом лакказы 2-26(+), тогда как в чистой культуре 2-26(-) ЦДГ, возможно, участвует в разложении лигнина, так как другие внеклеточные оксидоредуктазы у этого гриба не обнаружены [Хромоныгина, 2004].

2. Выделение и характеристика ЦДГ из нового продуцента - аскомицета Chaetomium sp. ИНБИ 2-26(-)

Наиболее эффективное образование ЦДГ штаммом 2-26(-) происходило при глубинном культивировании в жидкой среде, содержащей фильтровальную бумагу. Активность ЦДГ появлялась через 144 ч и в последующие двое суток резко нарастала, дости-

гая максимума, а после 192 ч постепенно снижалась. Максимальная активность (0,4 МЕ/мл по ДФИ) получена через 190 ч культивирования.

Электрофоретическая характеристика наиболее активных фракций белка после основных стадий очистки (см. схему) представлена на рис. 4. Разработанная процедура очистки (табл. 1) давала желтовато-коричневый раствор белка, гомогенного по данным электрофореза в денатурирующих условиях (рис. 4, дорожка 3) и изоэлектрофокусиро-вания. Следует отметить, что выход гомогенного фермента составил 43% (табл. 1). Очищенный белок имел молекулярную массу около 95 кДа по данным электрофореза и удельную активность 7,8 МЕ/мг по восстановлению ДФИ (5,7 МЕ/мг по восстановлению цитохрома с). Способность восстанавливать цитохром свидетельствовала о выделении полноразмериого белка, состоящего как из так и гемсодержащего доменов [НеппЪаэп е! а1., 2000]. Изоэлектрическая точка белка составляла 4,98±0,02.

Основной пик поглощения очищенного белка в видимой области спектра (рис. 5) наблюдался при 422 нм (полоса Сорэ гемового кофактора). Широкое плечо между 450 и 500 нм, относилось, вероятно, к поглощению окисленной формы ФАД.

Таблица 1. Выделение и очцспка целлобиозодещорога изы штамма 2-26(-)

1 Стадия Общая активность, ед. Удельная ак- ■ ишносгь, МБ^гбеяка . Степень ста*- . стаи, раз Выход \ %

с Культуральная жидкость 180 0,66 1 100 1

• Конца прированпе 162 0,66 1 90

После ионообменной хроматографии 111,6 1,54 ! 233 62 i 1

После хроматографии на колонне топор 77,4 7,78 11,1 1 1 43 1

При восстановлении белка целлобиозой (38 мкМ) при рН 6,0 происходили сдвиг максимума поглощения в полосе Сорэ до 430 нм с одновременным увеличением оптической плотности, а также появлением характерных пиков при 563 и 534 нм, соответствующих а- и ß-полосам типичного цитохрома типа b. Одновременно снижалось поглощение в области между 450 и 500 нм, очевидно, благодаря восстановлению ФАД (рис. 5). Такие изменения типичны для большинства известных ЦДГ.

Соотношение Rz (А422/А278) для очищенного белка составляло 0,43. Для других аналогичных белков оно варьирует в пределах 0,46-0,64 [Lindgren et al., 2001].

Оптимум активности выделенной ЦДГ в реакции восстановления ДФИ находится при рН 6,0, причем в диапазоне рН 4,0 - 8,0 фермент сохранял не менее 50% максимальной активности (рис. 6). Между рН 8,0 и 9,0 наблюдалось падение активности практически до нуля.

При низких концентрациях цитохрома активность ЦДГ в реакции его восстановления также была максимальна при рН 6,0. Значение рН-оптимума в нейтральной области рН свидетельствует в пользу высказанной [Ludwig et al., 2004] гипотезе об отдельной структурной группе, образуемой ЦДГ аскомицетов. Выделенный фермент является лишь третьим известным представителем ЦДГ этой группы, помимо ферментов Н. insolensи М. thermophila [Henriksson et al., 2000].

активность,

длина волны,нм рН

Рис.5. Спек1рисходюй(1)и восслшювлавюй Рис. 6. Зависимость от рНакптносшЦДГ

цешюбигоой(2)ЦЦГ штамма ИНШ 2-26(-) с ДФИ в качестве

субстрата

Однако, в отличие от двух последних, выделенная нами ЦДГ не относилась к термостабильным белкам. При 60°С она теряла половину активности менее чем за 5 мин. Это было неудобно в методическом плане, поэтому термостабильность исследовали при 55°С (табл. 2). При этой температуре ЦЦГ наиболее стабильна при рН 6,0 и значительно менее стабильна при рН 4,0 и 8,0. Это согласуется с данными [Ватищег е! а1., 2000] о более низкой стабильности ЦЦГ в кислых средах. Субстраты (целлобиоза и ДФИ) оказывали существенное влияние на стабильность ЦЦГ. Целлобиоза замедляла инактивацию фермента в 1,5-6 раз в зависимости от рН, тогда как ДФИ, напротив, снижал его стабильность, в особенности, в рН-оптимуме (табл. 2). Сравнение стабильности ЦДГ аскоминцетов показывает, что термофилы образуют более термостабильную ЦДГ.

Та&вща 2. Термосгаб) шы юсть ЦДГ при 55°С (оил Йка не превышает 10%).

Условия XIа (мш)прирН

инакптации 4,0 6,0 8,0

Без субстрата 3,5 99 18

+ДФИ(172мкМ) 3 16 V

+Целлоб! юва (76 мкМ) 24 | 131 43

Субстратную специфичность фермента по отношению к углеводным субстратам исследовали в присутствии ДФИ. По сравнению с целлобиозой и лактозой другие изученные сахара незначительно восстанавливали ДФИ в присутствии ЦЦГ (табл. 3) и не

Углевод Концентрация, мкМ ^ ^лактозы

Лактоза 6,25 1

Гентиобиоза 1000 <0 1

Метил-р-О-целлобиозид 1000 <0 1

Три-Ы-ацетилхитотриоза 500 <0 1

Мальтоза 1000 0 1

Мальтоза 6000 02

Сахароза 1 2000 <0 1 ,

Мелибиоза 2000 <01 1

О-глюкоза 1000 1 0 1

Б-глюкоза 6000 0 27

2-дезокси- Б -глюкоза ' 1000 | 01 1

2-дезокси- И -глюкоза ^ 6000 1 02 '

О-Манноза 6000 <0 1

Ь-Рамноза | 2000 <0 1

Б-Фруктоза 2000 <0 1

Б-Арабиноза 2000 <0 1

О Ксилоза 2000 <0 1

Ь- Арабиноза 2000 <01

Ь-Ликсоза 2000 <0 1

Ь-Ксилоза 2000 <0 1

Э-Рибоза 2000 <0 1

ингибировали его восстановление лактозой (при ее концентрации <Ки) Незначительная активность фермента была обнаружена в присутствии мальтозы, глюкозы и 2-дезоксиглюкозы (табл 3), причем эти субстраты, по-видимому, имеют на два порядка

более высокие значения Км и на порядок более низкие значения kcat по сравнению с лактозой. В целом данные табл. 3 согласуются с данными других авторов [Henriksson et.al., 2000, Baminger et al. 2001] о высокой субстратной специфичности ЦДГ к сахарам. Анализируя данные табл. 3, можно отметить специфичность ЦДГ к полуацетальному гидро-ксилу, р-1,4-гликозиднон связи, D-альдопиранозному звену и размеру экваториального заместителя при С2. Высокая чувствительность к этим элементам структуры Сахаров может объяснить очень слабое взаимодействие фермента с такими аналогами целлобио-зы, как

3. Стационарная кинетика восстановления одно- и двухэлектронных акцепторов ЦДГ

В отличие от Сахаров - доноров электронов, большинство ЦДГ неспецифнчны к природе субстрата-окислителя, в качестве которого могут выступать многие двух- и од-ноэлектронные акцепторы [Henriksson et. Al. 2000, Cameron and Aust, 2001]. В таблице суммированы кинетические параметры действия ЦДГ на субстраты-восстановители (целлобиоза и лактоза), а также двух- (ДФИ) и одноэлектронный (цитохром с) акцепторы.

Табшша4. Кажущиеся кинетические параметры действия ЦДГ гриба ИНБИ2-26(-)на некоторые доноры и акцепторы алейрона (ошибка ± 20%)

Субстрат К„ мкМ han С KJK.мкМ '-с '

рН

4.0 6.0 80 1 4.0 ' 6.0 80 40 ! 60 1 80

Целлобиоза 4,8 4,7 5 7,9 8,9 4 1.66 1.91 081

Лающа - 56 - - 14 - - 0,25 -

ДФИ 12 16 89 6,4 11,3 7,6 0,53 0,71 0,09

Ццтохром с 17 15.8 30.5 3.1 81 ИЗ 0,18 0,51 0^7

ЦДГ реализует пинг-понг-механизм катализа, состоящий из двух независимых полуреакций: восстановления и окисления [НепгИжоп е! а1., 2000]. На основании проведенного кинетического анализа были выбраны две простейшие кинетические схемы

реакций с участием двух- (1) и одноэлектронного (2) акцепторов, в наибольшей степени соответствующие экспериментальным данным:

где Е - исходная (окисленная) форма фермента, ESj - комплекс Михваэлиса с целлобио-зой, Е" (или 'Е') - детектируемая спектроскопически полностью восстановленная форма фермента (с двумя электронами, распределенными между ФАД и гемом), 'Е - частично восстановленная форма, содержащая электрон на непригодном для одноэлек-тронного окисления кофакторе, - частично восстановленная форма, содержащая электрон на пригодном для одноэлектронного окисления кофакторе, - целлобиоза, - субстрат-окислитель, - целлобионолактон, - продукт восстановления

Тот факт, что при рН 6,0 и особенно рН 4,0 значения kcat для цитохрома с заведомо меньше, чем удвоенное согласно стехиометрии реакции (2) значение для целло-биозы (табл. 4), приводит к заключению о наличии в механизме восстановления цито-хрома с в кислой среде более медленной мономолекулярной стадии, чем восстановление фермента в комплексе с целлобиозой.

Таким образом, в катализе выделенной нами ЦДГ имеется не менее двух медленных стадий внутримолекулярного превращения, одна из которых предшествует образованию полностью восстановленной формы фермента, а вторая - образованию одноэлек-тронно восстановленной формы, способной окисляться одноэлектронным акцепором. В то же время, для аналогичного фермента из P. chrysosporium наиболее медленной стадией считают полное восстановление фермента целлобиозой [Cameron and Aust, 2001].

В таблице суммированы некоторые характеристики ЦДГ различного происхождения в сравнении с выделенным нами ферментом.

Таблица 5. Сравнение ЦДГ из различных источников

Организм Тнп мол. масса, кДэ р1 рН-оптимум темп, огпимум °С целлобиозы мкМ"'-с-1 Источник

НшепхЬаОе йпузсброгшт базидиомнцег, белая пшль 89 4Д 5,0 50 0,15 НатткБзпаа! (1995)

Тгатош уегасЫог базчдиомицег, бсгшпиш. 97 4,2 5,0 50 Коуйа! (1996)

БсЫгорИуИит соттипе базчдиомицег, белая пиль 102 4,5 Рагщйа].(1997)

СопеорЬога рийапа базчдиомицег, бурая гниль 111 3,9 4,0 Бс11т1с11ц1ит ал!Сапеуазаш (1993)

Г^спороав сшгшЬагп11Б базидиомицег, белая гниль 101 3,9 5,9 4,0 ТепрапсИ^сЛ (1999)

БсклсЛшп (АЙтсНа) го162 базидиомицег, фитопатоген 110 4Д 4,0 50 ОДЗ ВапшщсгеСа!. (2001)

Мусе1юр!иога йтторМа аскомнцег, мягкая пить 91 4,1 7,0 65 СапсуаБст1е1а1. (1991)

11ипи'со1а [гкЫегй аскомнцег, мягкаяшиль 92 4,0 7,0 65 0,045 Хи аа1.(2001)

ОмОатаит эр. ПМВ12-26- аскомнцег, мягкая гга ть 95 4318 6,0 <55 1,9 Карапегянидр. (2003)

4. Адсорбция ЦДГ на целлюлозе. Катализ сопряженного процесса гидролиза целлюлозы - восстановления ДФИ

Важнейшей функцией ЦДГ считается ее участие в разложении целлюлозы совместно с целлюлазами [НепгИжоп е! а1., 2000]. При этом известные ЦДГ, подобно целлю-лазам, функционируют на поверхности целлюлозы и имеют специфическое сродство к ней Однако, специфичность к целлюлозным субстратам у разных ЦДГ различается: одни предпочтительнее адсорбируются на кристаллических формах целлюлозы, а другие на аморфных. Мы наблюдали весьма слабое связывание выделенной ЦДГ при рН 6,5 на микрокристаллической целлюлозе и фильтровальной бумаге.

tr«i

»j ее

«I

Обработка бумаги концентрированной Н3РО„ значительно увеличивала связывание. В этом случае при концентрации носителя 50 мг/мл связывалось 2-3 ME ЦДГ. Таким образом, ЦДГ предпочитает гидратированные целлюлозные цепи, а не гладкую поверхность. По прочности сорбции она значительно уступает ЦДГ Р. chrysosporium [Cameron and Aust, 2001] и грибным целлюлазам, несущим целлюлозосвязывающий домен, например, Се17А Trichoderma reesei, которая практически полностью связывается уже при концентрации микрокристаллической целлюлозы 2-3 мг/мл [Гернер и др.,1999]. Вместе с тем, данные электрофореза подтвердили наличие адсорбированной ЦДГ на поверхности аморфной целлюлозы (рис. 4, дорожка 5).

Рис.7.БОБ-злеетрофорефамма кошатавашшаА, адсорбированного

на аморфной целлюлозе (1), маркерных белков ОД адсорбированной целлюлазной системы

продуцента ЦДГ после обработки конканавалиномА (3) и без обработки (4).

Интересно, что при этом проявлялась также слабая высокомолекулярная белковая полоса, примерно соответствующая димеру ЦДГ, хотя в исходной ЦДГ эта полоса отсутст-

вовала.Возможно, это объясняется частичной ассоциацией соседних молекул ЦДГ на поверхности целлюлозы. Для белков, укладка которых имеет в основе ß-структуру, явление димеризации хорошо известно [Рабинович и др., 2002]. Для гемсодержащего домена ЦДГ P. chrysosporium также показана ß-структура [Hallberg et al., 2000].

На рис. 7 (дорожка 4) показан состав целлюлазной системы гриба ИНБИ 2-26(-) по данным SDS-электрофореза. Внеклеточные белки гриба, выращенного на фильтровальной бумаге, были предварительно адсорбированы на аморфной целлюлозе. Основными компонентами комплекса являются грибная целлобиогидролаза I (ЦБГ) с молекулярной массой около 66 кДа [Гернер и др., 1999] и белок массой 55 кДа. Это может быть грибная целлобиогидролаза II и/или эндоглюканаза I [Рабинович и др., 2002]. Аналогичную молекулярную массу имеет и ß-глюкозидаза гриба ИНБИ 2-26(-) (см. рис. 4), однако ее присутствие на поверхности целлюлозы в качестве основного белка менее вероятно [Рабинович и др., 1983].

Основным отличием данной ферментной системы от целлюлазной системы наиболее изученного гриба Т. reesei является присутствие на поверхности целлюлозы ЦДГ

(95 кДа) и белка массой около 200 кДа (предположительно димера ЦДГ (см. рис. 4), детектируемого только на поверхности целлюлозы).

Как видно из рис. 8, последовательно работающая на поверхности аморфизованной бумаги полиферментная система целлюла-зы-ЦДГ эффективно восстанавливает ДФИ в отсутствие экзогенной

Рис.8.Воссганов11ениеДФИадсорбирован1юй на аморфной целлюлозе неллюлолишческой системой продуцента ЦЦГ в отсутствие экзогенной цешюбишы: я-в отсутствие сшивающего агагга,б-послеобраба!ки конкапавал1пюмА(размер'шчекнаграфикепревышаегошибку эксперимента)

целлобиозы. Таким образом, данная система действительно может выполнять функцию восстановления реакционноспособных хинонов и свободнорадикальных частиц, образуемых лакказой. Процесс характеризуется двумя стадиями, причем медленная стадия,

Вреьн ч

вероятно, соответствует такому режиму реакции, при котором скорость обесцвечивания ДФИ определяется скоростью гидролиза бумаги под действием адсорбированных цел-люлаз. Система также сохраняла способность восстанавливать ДФИ после высушивания и реувлажнения.

В процессе ферментативного гидролиза целлюлозы ЦДГ может выполнять важную функцию удаления целлобиозы - продукта и одновременно сильного ингибитора действия целлобиогидролаз. При этом она имеет преимущество перед Р-глюкозидазой, выполняющей такую же функцию, так как работает на поверхности, в непосредственной близости от целлюлаз. В кинетике действия последовательно работающих иммобилизованных полиферментных систем широко известен феномен компартментализации, когда реакция идет эффективнее при физическом сближении ферментов. В нашем случае можно было ожидать, что промежуточный продукт (целлобиоза) не будет накапливаться вблизи образующей его целлобиогидролазы, если рядом с ней присутствует молекула ЦДГ.

Чтобы добиться наиболее эффективного удаления целлобиозы, образуемой цел-люлазами, была предпринята попытка максимально сблизить молекулы целлобиогидро-лаз и ЦДГ на поверхности целлюлозы. Для этого адсорбированные белки дополнительно сшивали друг с другом конканавалином А (КонА) - субъединичным лектином, взаимодействующим с остатками маннозы в гликозилированных частях молекул ферментов.

Электрофореграмма показывает, что небольшое количество КонА связывается с целлюлозой (рис. 7, дорожка 1) и определяется в виде субъединицы массой около 30 кДа. У ферментной системы продуцента ЦДГ в этой области нет белков, связывающихся с целлюлозой (рис. 7, дорожка 4). Вместе с тем, при обработке КонА целлюлозы с предварительно адсорбированными компонентами целлюлазной системы продуцента ЦДГ количество КонА на поверхности резко увеличивается (рис. 7, дорожка 3), что свидетельствует о его связывании с адсорбированными белками. Одновременно происходит некторое перераспределение интенсивности полос: количество адсорбированного белка 55 кДа снижается, а количество ЦДГ и белка 200 кДа, наоборот, возрастает.

Как видно из рис. 8, на начальной стадии гидролиза скорость действия обработанной КонА ферментной системы была практически такой же, как у необработанной.

Однако в дальнейшем система, обработанная КонА, работала более эффективно, что было хорошо заметно по более быстрому восстановлению ДФИ и обесцвечиванию реакционной смеси.

Наиболее простое объяснение состоит в том, что часть молекул ЦБГ и ЦДГ оказывается соединенной поливалентным реагентом КонА на поверхности целлюлозы. При этом ЦЦГ, имеющая столь же высокое сродство к целлобиозе, как и ЦБГ, может более эффективно защищать ЦБГ от ингибирования. Еще одно объяснение может заключаться в том, что на поверхности целлюлозы ЦДГ более активна в виде димера. В принципе, адсорбированный димер ЦДГ может окислять сразу 3 молекулы целлобиозы и принимать 6 электронов (по 2 на каждый остаток ФАД и по одному на каждый остаток тема). При этом ее эффективность как агента, удаляющего целлобиозу, очевидно, должна возрастать.

ВЫВОДЫ

1. При исследовании роли продуцентов лакказы и целлобиозодегидрогеназы сообщества неспорулирующих почвенных мицелиальных грибов ИНБИ 2-26 в разложении липюцеллюлозы овсяной соломы показано, что продуцент лакказы в два раза активнее разлагает лигнин, чем продуцент целлобиозодегидрогеназы. Синергизма между продуцентами не обнаружено.

2. Впервые выделена и охарактеризована целлобиозодегидрогеназа из мезофильного аскомицета р. СИае^тшт (ИНБИ 2-26(-)). Фермент наиболее активен при рН 6,0 и сохраняет не менее 50% активности в диапазоне рН от 4,0 до 8,0. Молекулярная масса фермента составляет -95 кДа. Спектральные характеристики восстановленного целлобиозой фермента указывают на наличие в нем гема типа цитохрома Ъ. Фермент наиболее стабилен при температурах до 50°С и рН 6,0. В кислой среде (рН 4,0) целлобиозодегидрогеназа наименее устойчива. Целлобиоза стабилизирует, а ди-хлорфенолиндофенол дестабилизирует фермент при термоинактивации.

3. Выделенный фермент характеризуется узкой специфичностью и высоким сродством к целлобиозе и лактозе. Установлена специфичность фермента к совместному присутствию в составе углеводного субстрата полуацетального гидроксила, р-1,4-гликозидной связи и экваториальной С2-ОН-группы в альдопиранозном кольце.

Целлобиозодегидрогеназа способна связываться с аморфной целлюлозой; при этом на электрофореграмме обнаруживается слабая дополнительная полоса, соответствующая димеру фермента.

4. Фермент катализирует восстановление дихлорофенолиндофенола (двухэлектронный акцептор) и цитохрома с3+ (одноэлектронный акцептор), что подтверждает присутствие в ферменте функционально активного гемового домена.

5. В механизме действия фермента показано наличие двух скорость-лимитирующих стадий. Одна из них связана с превращением комплекса Михаэлиса с целлобиозой в восстановленный фермент, а другая, вероятнее всего, относится к переносу электрона между гемовым и флавиновым доменом при восстановлении одноэлектронного акцептора.

6. Путем совместной адсорбции на аморфной целлюлозе сформирована сопряженная полиферментная система из целлюлаз и целлобиозодегидрогеназы гриба ИНБИ 2-26(-), эффективно восстанавливающая дихлорофенолиндофенол в отсутствие экзогенной целлобиозы.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (Гранты 02-04-49033 и 03-04-20002БНТС_а), Министерства промышленности, науки и технологии (Международный проект № 43.700.11.20 в рамках межправительственного соглашения между РФ и СРВ о научно-технологическом сотрудничестве № 0248/01/01, 2001-2005 гг. «Разработка биотехнологии получения и применения физиологически активных соединении и ферментных препаратов») и Президиума РАН (Программа поддержки базовых кафедр и учебно-научных центров, 2002 и 2003 гг.).

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Степанова Е.В., Королева О.В., Васильченко Л.Г., Карапетян К.Н., Ландесман Е.О., Явметдинов И.С., Козлов Ю.П., Рабинович М.Л. Разложение овсяной соломы грибами при жидкофазном и твердофазном культивировании. // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т.39. №1. С.74-84.

2. Карапетян К.Н., Ячкова С.Н., Васильченко Л.Г., Борзых М.Н., Рабинович М.Л. Выделение и характеристика целлобиозодегидрогеназы, образуемой неспоролирующим ми-целиальным грибом ИНБИ 2-26(-). // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т.39.№6.С.542-651.

3. Васильченко Л.Г., Карапетян К.Н., Ячкова С.Н., Зернова Е.С., Рабинович М.Л. Разложение лигноуглеводного субстрата почвенными грибами-продуцентами лакказы и цел-лобиозодегидрогеназы. // Прикладная биохимия и микробиология 2004. Т.40. №1. С.51-56.

4. Карапетян К.Н., Ячкова С.Н., Васильченко Л.Г., Борзых М.Н., Рабинович М.Л. Цел-лобиозодегидрогеназа почвенного гриба ИНБИ 2-26. // В сб.: Тезисы 1-ого Международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития». Москва. 2002. С.449-450

5. Карапетян К.Н., Ячкова С.Н. Целлобиозодегидрогеназа почвенного гриба ИНБИ 2-26. // В сб.: Тезисы 7-ой школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущине 2003. С. 105.

6. Рабинович М.Л., Карапетян К.Н., Борзых М.Н., Ячкова С.Н. Биосенсор для определения фенольных соединений в сточных водах. // В сб.: Тезисы 7-ой международной научно-практической конференции «Наука - индустрии сервиса» Москва. 2002. С.44-45.

Типография ИМАШ РАН, г. Москва, М. Харитоньевский пер., 4

Лиц ПД № 00492 от 12.04 2000

Зак. отJt.W 20 W тир, Ш экз.

»-8098

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карапетян, Карен Навасардович

Введение.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Почвенные грибы и их роль в трансформации растительных остатков.

1.1.1. Разложение древесины грибами.

1.1.2. Грибы, вызывающие мягкую (умеренную) гниль.

1.1.3. Базидиомицеты — возбудители бурой грили.

1.2. Ферменты грибов, трансформирующие полисахаридную и ароматическую часть растительного субстрата.

1.2.1. Внеклеточные ферменты грибов, участвующие в превращении углеводной части лигноцеллюлозныъх субстратов.

1.2.2. Ферментные системы грибов, трансформирующие ароматическую часть растительного субстрата (лакказы).

1.3. Целлобиозодегидрогеназы древоразрушающих и почвенных грибов (мягкая, бурая гниль, базидомицеты).

1.3.1. Характеристика целлобиозодегидрогеназ из различных грибов.

1.3.2. Структура ЦЦГ.

1.3.3. Каталитический механизм.

1.3.4. Связывание с целлюлозой.

1.3.5. Возможные функции ЦДГ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы.

2.2. Культивирование грибов.

2.3. Разложение соломы в лабораторном реакторе для контролируемой твердофазной ферментации.

2.4. Аналитические методы.

2.4.1. Выделение и очистка фермента.

2.4.2. Определение ферментативной активности.63'

2.4.3. Совместное определение лакказы и ЦЦГ с помощью дихлорфенолиндофенола.

2.4.4. Стационарная кинетика.

2.4.5. Концентрация белков.

2.4.6. Электрофорез.

2.4.7. Адсорбция ЦЦГ на целлюлозе.

2.4.8. Изоэлектрофокусирование.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разложение компонентов лигноцеллюлозного субстрата (овсяная солома) сообществом мицелиальных грибов ИНБИ 2-26, а также его отдельными компонентами — продуцентами лакказы и ЦЦГ.

3.1.1. Разложение соломы штаммом-продуцентом лакказы ИНБИ 2-26(+) и смешанной культурой ИНБИ 2-26(+) и продуцента целлюлаз Trichoderma reese.

3.1.2. Разложение овсяной соломы штаммами 2-26(+), 2-26(-) и смешанной культурой в жидкой среде.

3.2. Выделение и характеристика ЦЦГ из нового продуцента — Chaetomium sp. ИНБИ 2-26(-).

3.3. Стационарная кинетика восстановления одно- и двухэлектронных акцепторов ЦЦГ.

3.4. Адсорбция ЦЦГ на целлюлозе. Катализ сопряженного процесса гидролиза целлюлозы-восстановления ДФИ.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Целлобиозодегидрогеназа почвенного аскомицета ИНБИ 2-26(-)"

В круговороте углерода большую роль играют микроорганизмы, которые перерабатывают огромную массу лигноцеллюлозных субстратов. Биологический круговорот включает поступление структурных элементов из почвы и атмосферы в растения, биосинтез полимерных соединений, таких как целлюлозы, гемицеллюлоз, лигнина и последующее разложение микроорганизмами этих полимеров с возвращением элементов в почву и атмосферу. При разложении растительного субстрата грибы утилизируют все основные компоненты растительной клетки, включая углеводы, целлюлозу и лигнин с образованием разнообразных органических кислот, которые затем могут включаться в процессы биосинтеза.

Наличие органического субстрата и его составляющих: Сахаров, гемицеллюлоз, пектина, целлюлозы, лигнина является основным фактором, определяющим состав микрофлоры почвы. Клеточные стенки древесных тканей имеют сложную структуру, твердость и химическая стабильность которой делает ее трудной мишенью для микробной деградации [Рабинович и др., 2001]. Поэтому ферменты, которые включаются в этот процесс, имеют ряд необычных свойств, что определяет теоретический и практический интерес к их исследованию.

В природе разложение древесных тканей осуществляется, главным образом, базидиомицетами и почвенными мицелиальными грибами [Рабинович и др., 2001], которые с помощью секретируемых специфических гидролаз переводят целлюлозу и гемицеллюлозу в растворимые углеводы. Следует отметить поразительное разнообразие целлюлаз, созданных различными микроорганизмами. Помимо целлюлаз многие грибы секретируют также окислительно-восстановительные ферменты: Мп-пероксидазу и лакказу, оксидазы, образующие перекись водорода, и целлобиозодегидрогеназу (ЦДГ, КФ 1.1.99.18), которая имеет ряд уникальных свойств.

Среди разрушающих древесину базидиомицетов наиболее эффективны возбудители белой гнили, которые воздействуют как на полисахаридные компоненты древесины, так и на фенилпропаноидную сетку лигнина. Помимо целлюлаз и гемицеллюлаз эти грибы образуют оксидоредуктазы: гемсодержащие лигнин-пероксидазы (LiP) и марганец-пероксидазы (Mn-Р) и медьсодержащие лакказы [Болобова и др., 2002], которым отводят центральную роль в разложении лигнина. Лакказы чаще встречаются у грибов, хотя они обнаружены и у высших растений [Mayer and Staples, 2002]. Многие древоразрушающие грибы секретируют также ЦДГ [Henriksson etal., 2000; Cameron and Aust, 2001], которая относится к флавогемопротеинам и является единственным внеклеточным представителем этой группы белков. ЦДГ осуществляет процесс сопряженного окисления целлобиозы, продукта ферментативного гидролиза целлюлозы, и восстановления. хинонов или катион-радикалов, продуктов действия оксидоредуктаз на лигниновые структуры [Henriksson et al., 2000, Cameron and Aust, 2001].

В настоящее время нет единой точки зрения на то, какие именно оксидоредуктазы наиболее эффективны при деградации нефенольных структур и деполимеризации лигнина [Болобова и др., 2001; Леонтьевский, 2002]. Наиболее полно изучен базидиомицет Pycnoporus cinnabarinus, эффективно разрушающий лигнин в отсутствие лигнин- и марганец-пероксидаз. Его лигнин-разрушающая система включает только лакказу и ЦЦГ [Eggert et al., 1997; Temp and Eggert, 1999]. Образование лакказ и ЦДГ обнаружено и у почвенных грибов-возбудителей мягкой гнили древесины [Henriksson et al., 2000; Рабинович и др., 2001], однако механизм разложения ими лигноцеллюлозы до настоящего времени мало изучен.

Ранее в нашей лаборатории было выделено и охарактеризовано сообщество почвенных мицелиальных грибов ИНБИ 2-26 [Васильченко и др.,

2000; Васильченко, 2003], один из которых образует лакказу (ИНБИ 2-26(+)), а второй - ЦДГ (ИНБИ 2-26(-)) Это позволило смоделировать in vivo ферментную систему высокоактивного разрушителя лигнина P. cinnabarintis и изучить роль ЦДГ почвенных грибов в разложении лигноцеллюлозы.

По сравнению с ЦЦГ базидиомицетов ЦДГ почвенных аскомицетов относительно мало изучены. Наиболее исследованы из них ферменты, образуемые термофильными грибами Humicola insolens и Myceliophtora thermophila. [Henriksson et al., 2000]. Обе эти ЦДГ заметно отличаются от ЦДГ базидиомицетов рН-оптимумом активности, находящимся в нейтральной области. По одной из гипотез [Ludwig et al., 2004] ЦДГ аскомицетов образуют отдельную структурную группу в семействе ЦДГ.

Структура и механизм действия ЦДГ в последние годы являются предметом интенсивного изучения, так как этот фермент представляет серьезный практический интерес для создания различных биосенсоров [Henriksson et al., 2000]. Интерес к ЦДГ связан, главным образом, с возможностями ее применения (в сочетании с лакказой) в амперометрических биосенсорах на лактозу, целлобиозу, хиноны и фенолы, а также как биокатализатора для производства альдоновых кислот [Elmgren et al., 1992; Larson et al., 1996; Duarte et al., 1999; Lindgren et al., 1999,2001].

Наиболее изучена ЦДГ древоразрушающего базидиомицета Phanerochaete chrysosporium, состоящая из двух пространственно разделенных доменов. Больший ФАД-содержащий N-концевой домен ЦДГ гомологичен оксидоредуктазам семейства флавиновых оксидаз (глюкозо-метанол-холиноксидаз). Меньший; гемсодержащий С-концевой домен имеет уникальную структуру, не найденную у других гем-белков. Роль гема и механизм переноса электрона между ним и ФАД остаются весьма спорными. У фермента P. chrysosporium ФАД-содержащий домен содержит уникальную внутреннюю последовательность, богатую ароматическими аминокислотами, которая, как полагают, отвечает за; связывание с целлюлозой [Henriksson et al:, 1997b].

Роль ЦДГ в разложении целлюлозы требует отдельного изучения. Полагают, что, специфически адсорбируясь на целлюлозе, ЦДГ не только удаляет ингибитор целлюлаз - целлобиозу, но и разрушает кристаллическую структуру полисахарида путем генерации ОН-радикалов через реакцию Фентона, сопряженную с катализируемым ЦДГ восстановлением Fe3+. Такой механизм, в частности, предложен для базидиомицета - возбудителя бурой гнили Coniofora puteana [Henriksson et al., 2000].

Указанные проблемы определили интерес к выделению и характеристике ЦДГ из нового неспорулирующего мицелиального гриба-продуцента ЦДГ. Цель настоящей работы заключалась в исследовании роли ЦДГ этого мицелиального гриба-аскомицета в процессе разложения лигноцеллюлозы, а также изучении ее каталитических свойств.

Поставленная цель определила задачи диссертационной работы:

1. Изучить способность компонентов сообщества мицелиальных грибов ИНБИ 2-26: продуцента лакказы (2-26(+)) и продуцента ЦДГ (2-26(-)), а также смешанной культуры разлагать > основные биополимеры натурального лигноцеллюлозного субстрата.

2. Выделить индивидуальную ЦДГ и изучить ее физико-химические свойства и субстратную специфичность.

3. Выяснить возможный кинетический механизм действия фермента в реакциях с двух- и одноэлектронным акцептором.

4. Изучить способность ЦДГ к адсорбции на целлюлозе и ее функционирование совместно с целлюлазами в процессе гидролиза целлюлозы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Механизм биодеградации лигноцеллюлозы активно исследуется в связи с большой теоретической и практической значимостью этой проблемы [Фенгель и Вегенер, 1988; Eriksson et al., 1990; Blanchette et al., 1990; Zabel and Morell, 1992; Higuchi, 1997; Breen and Singleton, 1999; Рабинович и Мельник, 2000; Рабинович и др., 2001; Болобова и др., 2002]. Поскольку объектом наших исследований было сообщество почвенных мицелиальных грибов ИНБИ 2-26, секретирующих ЦДГ и лакказу, в этой главе будут изложены в основном данные по внеклеточным ферментам грибов, разрушающих растительные субстраты.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Карапетян, Карен Навасардович

ВЫВОДЫ

1. При исследовании роли продуцентов лакказы и целлобиозодегидрогеназы сообщества неспорулирующих почвенных мицелиальных грибов ИНБИ 2-26 в разложении лигноцеллюлозы овсяной соломы показано, что продуцент лакказы в два раза активнее разлагает лигнин, чем продуцент целлобиозодегидрогеназы. Синергизма между продуцентами не обнаружено.

2. Впервые выделена и охарактеризована целлобиозодегидрогеназа из мезофильного аскомицета p. Chaetomium (ИНБИ 2-26(-)). Фермент наиболее активен при рН 6,0 и сохраняет не менее 50% активности в диапазоне рН от 4,0 до 8,0. Молекулярная масса фермента составляет —95 кДа. Спектральные характеристики восстановленного целлобиозой фермента указывают на наличие в-нем гема типа цитохрома Ъ. Фермент наиболее стабилен при температурах до 50°С и рН 6,0. В кислой среде (рН 4,0) ЦДГ наименее устойчива. Целлобиоза стабилизирует, а дихлорфенолиндофенол дестабилизирует фермент при термоинактивации.

3. Выделенный фермент характеризуется узкой специфичностью и высоким сродством к целлобиозе и лактозе. Установлена специфичность фермента к совместному присутствию в составе углеводного субстрата полуацетального гидроксила, р-1,4-гликозидной связи и экваториальной С2-ОН-группы в альдопиранозном кольце. Целлобиозодегидрогеназа способна связываться с аморфной целлюлозой; при этом на электрофореграмме обнаруживается слабая дополнительная полоса, соответствующая димеру фермента.

4. Фермент катализирует восстановление дихлорофенолиндофенола (двухэлектронный акцептор) и цитохрома с3+ (одноэлектронный акцептор), что подтверждает присутствие в ферменте функционально активного гемового домена.

5. В механизме действия фермента показано наличие двух скорость-лимитирующих стадий. Одна из них связана с превращением комплекса Михаэлиса с целлобиозой в восстановленный фермент, а другая, вероятнее всего, относится к переносу электрона между гемовым и флавиновым доменом при восстановлении одноэлектронного акцептора.

6. Путем совместной адсорбции на аморфной целлюлозе сформирована сопряженная полиферментная система из целлюлаз и целлобиозодегидрогеназы гриба ИНБИ 2-26(-), эффективно восстанавливающая дихлорофенолиндофенол в отсутствие экзогенной целлобиозы.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (Гранты 02-04-49033 и 03-04-20002БНТСа), Министерства промышленности, науки и технологии (Международный проект № 43.700.11.20 в рамках межправительственного соглашения между РФ и СРВ о научно-технологическом сотрудничестве № 0248/01/01, 2001-2005 гг. «Разработка биотехнологий получения и применения физиологически активных соединений и ферментных препаратов») и Президиума РАН (Программа поддержки базовых кафедр и учебно-научных центров, 2002 и 2003 гг.).

В заключение я выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю д.х.н., профессору M.JL Рабиновичу за ценные консультации и постоянное содействие при выполнении данной работы. Я благодарен всему коллективу нашего отдела, в частности д.б.н. Г.С. Комоловой, к.б.н. Л.Г. Васильченко, к.б.н. А.В. Болобовой, к.б.н. Е.А. Зверевой, к.т.н. Т.В. Федоровой, В.В. Хромоныгиной за постоянную помощь в работе. Я признателен к.б.н. О.В. Королевой за критические замечания по диссертационной работе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карапетян, Карен Навасардович, Москва

1. Билай В .И., Никольская О.О., Пидопличко М.М. Глюкозооксидаза из P. vitale Pidolp and Bilay. //Микробиол. Ж. 1968. Т. 30. С. 418-424.

2. Болобова А.В., Аскадский А.А., Кондращенко В.И., Рабинович М.Л. // Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Т. 2. Ферменты, модели, процессы. 2002. М.: Наука. С. 343.

3. Васильченко Л.Г. Сообщество неспорулирующих мицелиальных грибов ИНБИ 2-26 из диоксинсодержащих тропических почв. // Дисс. канд. биол. наук. М.: РУДН. 2003. С. 133.

4. Гернер МЛ., Мельник М.С., Рабинович М.Л. Увеличение сродства к целлюлозе целлобиогидролазы I и ее каталитического домена в присутствии продукта реакции целлобиозы. // Биохимия. 1999. Т. 64. № 6. С. 1204-1213.

5. Ермакова А.И. Методы исследования растений. // Колос. Л.: 1972. С. 136-141.

6. Жалсрайн А. Образование целлюлолитических ферментов Trichoderma reesei на труднометаболизируемых соединениях углерода. // Дис. канд. биол. наук, М.: МГУ. 1993. 112 с.

7. Зверева Е.А. Использование протопластов для изучения метаболизма древоразрушающих грибов. // Дисс. канд. биол. наук. М. Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН. 124 с.

8. Королева О.В., Рабинович М.Л., Буглова Т.Т., Ярополов А.И. Некоторые свойства галактооксидазы Fusarium graminearum. И Прикл. Биохим. Микробиол. 1983. Т. 19. №5. С. 632-637.

9. Королева О.В., Явметдинов И.С, Шлеев С.В., Степанова Е.В., Гаврилова В.П. Выделение и изучение некоторых свойств лакказы базидиомицета Сеггепа maxima. И Биохимия. 2001. Т. 66. № 6. С. 618-622.

10. Кураков А.И., Болобова А.В. Микромицеты продуценты термостабильных целлюлаз. // Прикл. Биохим. Микробиол. 1999. Т. 35. № 3. С. 332-341.

11. Леонтьевский А.А. Лигниназы базидиомицетов. // Дисс. докт. биол. наук. Пущино. 2002. 266 с.

12. Леонтьевский А.А., Головлева Л.А. Внеклеточные лигнин-разрушающие ферменты гриба Panus tigrinus. II Биохимия. 1990. Т. 55. С. 423-431.

13. Леонтьевский А.А., Мясоедова Н.М., Баскунов Н.М., Головлева Л.А. Реакции голубых и желтых грибных лакказ с модельными соединениями лигнина. // Биохимия. 1999. Т. 64. № 10. С. 1362-1369.

14. Оболенская А.В., Щеголев В.П., Аким Г.Л., Аким Э.Л., Коссович Н.Л., Емельянова И.З. «Практические работы по химии древесины и целлюлозы» // Изд-во лесная пром. М.: 1965.

15. Рабинович М.Л., Болобова А.В., Кондращенко В.И. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Т. 1. Древесина и разрушающие грибы. // 2001. М. Наука.: 263 с.

16. Рабинович М.Л., Мельник М.С. Прогресс в изучении целлюлолитических ферментов и механизм биодеградации высокоупорядоченных форм целлюлозы. // Успехи биол. химии. 2000. Т. 40. С. 205-266.

17. Рабинович М.Л., Мельник М.С., Болобова А.В. Структура и механизм действия целлюлолитических ферментов. // Биохимия. 2002. Т. 67. № 8. С. 1026-1050.

18. Рабинович М.Л., Мельник М.С., Болобова А.В. Микробные целлюлазы. // Прикл. Биохим. Микробиол.2002. Т. 38. № 4. С. 355-373.

19. Решетникова И.А. Деструкция лигнина ксилотрофными макромицетами. // 1997. М. МГУ. 197 с.

20. Рипачек В. Биология древоразрушающих грибов. // 1967 М., Лесная пром. 258 с.

21. Родионова Н.А., Тиунова Н.А., Фениксова Р.В., Кудряшова Т.И., Мартинович Л.И. Целлюлолитические ферменты Geotrichum candidum II Докл. АН СССР. 1974. Т. 214. №5. С. 1206-1209.

22. Степанова Е.В., Королева О.В., Карапетян К.Н., Васильченко Л.Г., Явметдинов И.С., Козлов Ю.П., Рабинович М.Л. Разложение овсяной соломы грибами при жидкофазном и твердофазном культивировании. // Прикл. Биохим. Микробиол. 2003. Т. 39. № 1.С. 74-84.

23. Фенгель Д, Вегенер Г. Древесина. Химия, ультраструктура, реакции. // 1988. М.: Лесная пром. 512 с.

24. Хромоныгина В.В. Мицелиальные грибы и возможность их использования для детоксикации ксенобиотиков в почве. // Диссертация канд. биол. наук. РУДН. М. 2004.

25. Юлдашев Б.Т., Рахимов М.М., Рабинович М.Л. Сравнительное изучение поведения целлюлаз на поверхности целлюлозы и лигноцеллюлозы в ходе ферментативного гидролиза // Прикл. Биохим. Микробиол. 1993. Т. 29. №1. С. 58-68.

26. Ander P. The cellobiose-oxidizing enzymes CBQ and CbO as related to lignin and cellulose degradation-a review. // FEMS Microbiol. Rev. 1994. V. 13. P. 297-312.

27. Ander P., Eriksson K.E. Selective degradation of wood components by white-rot fungi. II Physiol. Plant. 1977. V. 41. P. 239-248.

28. Ander P., Marzullo L. Sugar oxidoreductases and veratryl alcohol oxidase as related to lignin degradation. //J. Biotechnol. 1997. V. 53. P. 115-131.

29. Ander P., Mishra C., Farrell R., Eriksson K.E. Redox interactions in lignin degradation: interaction between laccase, different peroxidases and cellobiose:quinone oxidoreductase.//J. Biotechnol. 1990. V. 13. P. 189-198.

30. Ander P., Sena-Martin G., Duarte J.C. Influence of cellobiose oxidase on peroxidases from Phanerochaete chrysosporium. II Biochem. J. 1993. V. 293. P. 431-435.

31. Archibald F.S., Bourbonnais R., Jurasek L., Paice M.G., Reid I.D. Kraft pulp bleaching and delignification by Trametes versicolor. //J. Biotechnol. 1997. V. 53. P. 215-236.

32. Ayers A., Ayers S., Eriksson K.E. Cellobiose oxidase, purification and partial characterization of a hemoprotein from Sporotrichum pulverulentum. II Eur. J. Biochem. 1978. V. 90. P. 171-181.

33. Backa S., Gierer J., Reitberger Т., Nilsson Т. Hydroxyl radical activity associated with the groth of white-rot fungi. // Holzforchung. 1993. V. 47. P. 181-187.

34. Baminger U., Subramaniam S.S., Renganathan V., Haltrich D. Purification and characterization of cellobiose dehydrogenase from the plant pathogen Sclerotium (Athelia) rolfsii. II Appl. Enviroment. Microbiol. 2001. V. 67. P. 1766-1774.

35. Bao W., Renganathan V. Triiodide reduction by cellobiose: quinone oxidoreductase of Phanerochaete chrysosporium. IIFEBS. Lett. 1991. V. 279. P. 30-32.

36. Bao W., Renganathan V. Cellobiose oxidase from Phanerochaete chrysosporium enhances crystalline cellulose degradation by cellulases. // FEBS. Lett. 1992. V. 302 (1). P. 77-80.

37. Bao W., Usha S.N., Renganathan V. Purification and characterization of cellobiose dehydrogenase, a novel extracellular hemoflavoenzyme from the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium. I/ Arch. Biochem. Biophys. 1993. V. 300 (2). P. 705— 713.

38. Beguin P., Aubert J.P. The biological degradation of cellulose. // FEMS. Microbiol; Rev. 1994. V. 13. P. 25-58.

39. Bendall D.S., Rolfe S.A. Characterization of chloroplast cytochromes. // Methods in Enzymology. 1987. V. 148. P. 259-273.

40. Bhattachaijee В., Roy A., Majumder AL. Carboxymethylcellulase from Lenzites saepiaria, a brown-rotter. Biochem. // Mol. Biol. Internat. 1993. V. 6. P. 1143-1152.

41. Blanchette R.A., Nilsson Т., Daniel G., Abad A. Biological degradation of wood. // Adv. Chem. 1990. Ser. 225. P. 141-174.

42. Breen A., Singleton F.L. Fungi in lignocellulose breakdown and biopulping. // Curr. Opinion Biotechnol. 1999. V. 10 (3). P. 252-258.

43. Bringer S., Sprey В., Sahm H. Purification and properties of alcohol oxidase from Poria contigua. II Eur. J. Biochem. 1979. V. 101. P. 563-570.

44. Call H.P., Muecke I. History, overview and applications of medated lignolytic systems, especially laccase-mediator-systems (Lignozym®-process). // J. Biotechnol. 1997. V. 53. P. 163-202.

45. Cameron M.D., Aust A.D. Degradation of chemicals by reactive radicals produced by cellobiose dehydrogenase from Phanerochaete chrysosporium. II Arch. Biochem. Biophys. 1999. V. 376. P. 115-121.

46. Cameron M.D., Aust S.D. Kinetics and reactivity of the flavin and heme cofactors of cellobiose dehydrogenase from Phanerochaete chrysosporium. //Biochemistry. 2000. V. 39. P. 13595-13601.

47. Cameron M.D., Aust S.D. Cellobiose dehydrogenase an extracellular fungal flavocytochrome. // Enzyme Microb. Technol. 2001. V. 28. P. 129-138.

48. Canevascini G., Borer P., Dreyer J.L. Cellobiose dehydrogenase of Sporotrichum (Chrysosorium) thermophile. II Eur. J. Biochem. 1991. V. 198. P. 43-52.

49. Canevascini G. Cellulase assay based on cellobiose dehydrogenase. // Meth. Enzymol. 1988. V. 160. P. 112-116.

50. Cavener D. GMC oxidoreductases. A new defined family of homologous proteins with diverse catalytic activities. // J. Mol. Biol. 1992. V. 223. P. 811-814.

51. Chen S., Ma D., Ge W., Buswell J.A. Induction of laccase activity in the edible mushroom, Volvariella volvacea. И FEMS Microbiol Lett. 2003. V. 218. № 1. P. 143148.

52. Chrapkowska K.J. Cellulolytic activity of white, brown and gray wood rot fungi. // Acta Microbiol. Pol. 1984. V. 33. P. 137-145.

53. Chung N., Aust S.D. Degradation of pentachlorophenol in soil by Phanerochaete chrysosporium. //J. Hazard Materials. 1995. V. 41. P. 177- 183.

54. Claus H. Laccases: structure, reactions, distribution. // Micron. 2004. V. 35(1-2). P. 93-96.

55. Clausen C.A. Dyed particle capture immunoassay for detection of incipient brown-rot decay.III. Immunoassay. 1994. V. 15. P. 305-316.

56. Cohen J.D., Bao W., Renganathan V., Subramaniam S.S. Loehr T.M. Resonance raman spectroscopic studies of cellobiose dehydrogenase from Phanerochaete chrysosporium. И Arch. Biochem. Biophys. 1997. V. 341 (2). P. 321-328.

57. Coudray M.R., Canevascini G., Meier H. Characterization of a cellobiose dehydrogenase on the cellulolytic fungus Sporotrichum (Chrysosporium) thermophile. II Biochem. J. 1982. V. 203. P. 277-284.

58. Cox M., Rogers M., Cheesman M., Jones G., Thomson A., Wilson M., Moore G. Spectroscopic identification of the haem ligands of cellobiose oxidase. // FEBS Lett. 1992. V. 307 (2). P. 233-236.

59. Daniel G. Use of electron microscopy for aiding our understanding of wood biodegradation. //FEMS Microbiol. Rev. 1994. V. 13. P. 199-233.

60. Dekker R.F.H. Induction and characterization of a cellobiose dehydrogenase produced by a species of Monilia. II J. Gen. Microbiol. 1980. V. 120. P. 309-316.

61. Dekker R.H.F. Cellobiose dehydrogenase produced by Monilia sp. // Methods Enzymol. 1988. V. 160. P. 454-463.

62. Duarte J.C., Costa-Ferreira M., Sena Martins G. Cellobiose dehydrogenase. Possible roles and importance for pulp and paper biotechnology. // Bioresour. Technol. 1999. V. 68. P. 43-48.

63. Dumonceaux T.J., Bartholomew K.A., Charles T.C., Moukha S.M., Archibald F.S. Cloning and sequencing of a gene encoding cellobiose vdehydrogenase from Trametes versicolor. И Gene. 1998. V. 210. P. 211-219.

64. Eggert C. Laccase-catalyzed formation of cinnabariniv acid is responsible for antibacterial activity of Pycnoporus cinnabarinus. II Microbiol. Res. 1997. V. 152. № 3. P. 315-318.

65. Eggert C., Temp U., Dean J.F.D., Eriksson K.E.L. A fungal metabolic mediates degradation of non-lignin structures and synthetic lignin. // FEBS Lett. 1996. V. 391. P. 144-148

66. Eggert C., Temp U., Eriksson K.E.L. Laccase is essential for lignin degradation by the white-rot fungus Pycnoporus cinnabarinus. И FEBS Lett. 1997. V. 407. P. 89-92.

67. Elmgren M., Lindquist S.-E., Henriksson G. Cellobiose oxidase crosslinked to a redox polymer matrix at an electrode surface a new biosensor. // J. Electroanal. Chem. 1992. V. 341. P. 257-273.

68. Eriksson K.-E.L., Blanchettete R.A., Ander P. Microbial and Enzymatic Degradation of Wood and Wood Components. // Springer Verlag, Berlin. 1990. P. 230 p.

69. Eriksson K.-E.L, Habu N., Samejima M. Recent advances in fungal cellobiose oxidoreductases. // Enz. Microbiol. Technol. 1993. V. 15. P. 1002- 1008.

70. Eriksson K.-E.L., Pettersson В., Westermark U. Oxidation: an important enzyme reaction in fungal degradation of cellulose. // FEBS Lett 1974. V. 49. P. 282-285.

71. Fang J., Qu Y., Gao P. Wide distribution of cellobiose oxidizing enzymes in wood rot fungus indicates a physiological importance in lignocellulose degradation. // Biotechnol. Technic. 1997. 11, 195-197.

72. Fang J., Liu W., Gao P.J. Cellobiose dehydrogenase from Schizophyllum commune: purification and study of some catalytic, inactivation, and cellulose-binding properties. // Arch. Biochem. Biophys. 1998. V. 353 (1). P. 37-46.

73. Gelo-Pujic M., Kim H.H., Bultin N.G., Palmore G.T.R. Electrochemical studies of truncated laccase produced in Pichia pastoris. II Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 5515-5521.

74. Giardina P., Palmieri G., Scaloni A., Fontanella В., Faraco V., Cannamo G., Sannia G. Protein and gene structure of a blue laccase from Pleurotus ostreatus. II Biochem. J. 1999. V. 341. P. 655-663.

75. Gilbertson R.L., Ryvarden L. North American Polypores. Fuiigiflora. 1986. Oslo. 435 P

76. Ghisla S., Massey V. Mechanisms of flavoprotein-catalyzed reactions. II Eur. J. Biochem. 1989. V. 181. P. 1-17.

77. Habu N., Samejima M., Dean J.F.D., Eriksson K-E.L. Release of the FAD domain from cellobiose oxidase by protease from cellulolytic cultures of Phanerochaete chrysosporium. II FEBS Lett. 1993. V. 327 (2). P. 161-164.

78. Habu N. Igarashi К., Samejima M., Pettersson В., Eriksson K-E.L. Enhanced production of cellobiose dehydrogenase in cultures of Phanerochaete chrysosporium supplemented with bovine calf serum. // Biotechnol. Appl. Biochem. 1997. V. 26. P. 97-102.

79. Haemmerli S.D., Schoemaker H.E., Schmidt W.H., Leisola M.S.A. Oxidation of veratryl alcohol by the lignin peroxidase of Phanerochaete chrysosporium, involvement of activated oxygen. // FEBS Lett. 1987. V. 220. P. 149 -54

80. Hakulinen N., Kiiskinen L.L., Kruus K., Saloheimo M., Paananen A., Koivula A., Rouvinen J. Crystal structure of a laccase from Melanocarpus albomyces with an intact trinuclear copper site. //Nat. Struct. Biol. 2002. V. 8. P. 601-605.

81. Hallberg M., Bergfors Т., Baeckbro K., Pettersson G., Henriksson G., Divne С. A new scaffold for binding haem in the cytochrome domain of the extracellular flavocytochrome cellobiose dehydrogenase. // Structure. 2000. V. 8. P. 79-88.

82. Hallberg B.M., Henriksson G., Pettersson G., Divne C. Crystal structure of the flavoprotein domain of the extracellular flavocytochrome cellobiose dehydrogenase. // J. Mol. Biol. 2002. V. 315: № 3. P 421-434.

83. Hallberg B.M., Henriksson G., Pettersson G., Vasella A., Divne C. Mechanism of the reductive half-reaction in cellobiose dehydrogenase. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 7160-7166.

84. Henriksson G. Structure, function and application of cellobiose dehydrogenase from Phanerochaete chrysosporium. II PhD Thesis, Uppsala University, Uppsala Sweden. Almquist and Wiksell Internat., Stockholm, Sweden. 1995. ISBN 91-554-3503-3.

85. Henriksson G., Ander P., Pettersson В., Pettersson G. Cellobiose dehydrogenase (Cellobiose oxidase) as a wood degrading enzyme. Studies on cellulose, xylan and synthetic lignin. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. V. 42. P. 790-796.

86. Henriksson G., Johansson G., Pettersson G. Is cellobiose oxidase from Phanerochaete chrysosporium a one electron reductase? // Biochim. Biophys. Acta. 1993. V. 1144. P. 184-190.

87. Henriksson G., Johansson G., Pettersson G. A critical review of cellobiose dehydrogenases. // J. Biotechnol. 2000. V. 78. P. 93-113.

88. Henriksson G., Pettersson G., Johansson G., Ruiz A., Uzcategui E. Cellobiose oxidase from Phanerochaete chrysosporium can be cleaved by papain into two domains. // Eur. J. Biochem. 1991. V. 196. P. 101-106.

89. Henriksson G., Polk V., Eriksson K.E.L. Assay for cellobiose dehydrogenase in the presence of laccase. // Biotechnol. Techn. 1997a. V.l 1. P. 743-745.

90. Henriksson G., Salumets A., Divne C., Pettersson G. Studies of cellulose binding by cellobiose dehydrogenase and a comparison with cellobiohydrolase I. // Biochem. J. 1997b. V. 324 (3). P. 833-838.

91. Henriksson G., Sild V., Szabo I.J., Pettersson G., Johansson G. Substrate specificity of cellobiose dehydrogenase from Phanerochaete chrysosporium. II Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1383. P. 48-54.

92. Henriksson G., Zhang L., Li J., Ljungquist P., Reitberger Т., Pettersson G., Johansson G. Is cellobiose dehydrogenase from Phanerochaete chrysosporium a lignin degrading enzyme? // Biochimica et Biophysica Acta. 2000. V. 1480. P. 83-91.

93. Higuchi T. (ed). Biochemistry and molecular biology of wood. // London. Springer Verlag. 1997.

94. Hilden L., Johansson G., Pettersson G., Li J., Ljungquist P., Henriksson G. Do the extracellular enzymes cellobiose dehydrogenase and manganese peroxidase form a pathway in lignin biodegradation? // FEB S Lett. 2000. V. 477. P. 79-83.

95. Higham C.W., Gordon-Smith D., Dempsey C.E., Wood P.M. Direct 1HNMR evidence for conversion of 36 5-D-cellobiose to cellobionolactone by cellobiose dehydrogenase from Phanerochaete chrysosporium. //FEBS Lett. 1994. V. 351. P. 128-32.

96. Horanyi P.S., Collins R., Phillips R.S., Eriksson K.L. Investigation of the role of 3-hydroxyanthranilic acid in the degradation of lignin by white-rot fungus Pycnoporus cinnabarinus. //Enzyme Microb Technol. 2001. V. 28. P. 301-307.

97. Huetterman A., Noelle A. Characterization and regulation of cellobiose dehydrogenase in Fomes annous. Holzforschung. 1982. V. 36. P. 283.

98. Jones G.D., Wilson M.T. Rapid kinetic studies of the reduction of cellobiose oxidase from the white-rot fungus Sporotricum pulverulentum by cellobiose. // Biochem. J: 1988! V. 256. P. 713-718.

99. Kremer S., Wood P. Production of Fenton's reagentby cellobiose oxidase from cellulolytic cultures of Phanerochaete chrysosporium. II Eur. J. Biochem. 1992a. V. 208. P. 809-815.

100. Kremer S., Wood P. Continuous monitoring of cellulose oxidation by cellobiose oxidase from Phanerochaete chrysosporium. II FEMS Microbiol. Lett. 1992b. V. 92. P. 187-192.

101. B. Cloning and characterization of cellobiose dehydrogenase from Phanerochaete chrysosporium. // Ph.D. Dissertation, Oregon Graduate Institute of Science and Technology. 1999.

102. X.Z., Huang Y.Z., Xu D.G., Xiao D.P., Jin F.G., Gao P.J. Cellobiose oxidizing enzyme from a newly isolated cellulolytic bacterium* Cytophaga sp LX-7. // Biotechnol. Lett. 1996a. V. 18 (2). P. 205-210.

103. В., Nagalla S.R., Renganathan V. Cloning of a cDNA encoding cellobiose dehydrogenase, a hemoflavoenzyme from Phanerochaete chrysosporium. II Appl. Environ. Microbiol. 1996b. V. 62. P. 1329-1335.

104. Mansfield S.D., Jong E., Saddler J.N. Cellobiose dehydrogenase, an active agent in cellulose depolymerization. // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63(10). P. 38043809.

105. Mason M.G., Wilson M.T., Ball A., Nicholls P. Oxygen reduction by cellobiose oxidoreductase: the role of the haem group. // FEBS Lett. 2002. V. 518. P. 29-32.

106. Mason M.G., Nicholls P., Divne C., ????. The heme domain of cellobiose oxidoreductase: a one-electron reducing system. // Biochim. Biophys. Acta. 2003. V. 1604. P. 47-54.

107. Mayer A.M., Staples R.C. Laccase: new functions for an old enzyme. // Phytochemistry. 2002. V. 60. P. 551-565

108. Morpeth F.F. Some properties of cellobiose oxidase from the white-rot fungus Sporotrickumpulverulentum. Biochem. J. 1985. V. 228. P. 557-564.

109. Morpeth F.F., Jones G.D. Resolution, purification and some properties of multiple forms of cellobiose dehydrogenase from the white rot fungus Sporotrickum pulverulentum. I I Biochem. J. 1985. V. 236. P. 221-226.

110. Morpeth F.F. Cellobiose oxidoreductases chemistry and biochemistry of flavoproteins. // 1990. V. 1. P. 337-348.

111. Moenkemann H., Hoelker U., Hoefer M. Components of the lignolytic system of Fusarium oxysporium and Trichoderma atroviride. // Fuel. Proc. Technol. 1997. V. 52. P. 73-77.

112. Moukha S.M., Dumonceaux T.J., Record E., Archibald F.S. Cloning and analysis of Pycnoporus cinnabarinus cellobiose dehydrogenase. I I Gene. 1999. V. 234 (1). P. 2333.

113. Nutt A., Salumets A., Henriksson G., Sild V., Johansson G. Conversion of oxygen species by cellobiose dehydrogenase (cellobiose oxidase) and glucose oxidase a comparison. // Biotechnol. Lett. 1997. V. 19 (4). P. 379-383.

114. Odier E., Mozuch M.D., Kalyanaraman В., Kirk Т.К. Ligninase-mediated phenoxy radical formation and polymerization unaffected by cellobiose: quinone oxidoreductase. // Biochimie 1988. V. 70. P. 847-852.

115. Palmer A.E., Lee S.K., Solomon E.I. Decay of the peroxide intermediate in laccase: reductive cleavage of the O-O bond. // J. Amer. Chem. Soc. 2001. V. 123. P. 65916599

116. Palmieri G., Giardina P., Bianco C., Scaloni A., Capasso A., Sannia G. A novel white laccase from Pleurotus ostreatus. II J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 31301-31307

117. Pegasova T.V., Zwart P., Koroleva O.V., Stepanova E.V., Rebrikov D.V., Lamzin V.S. Crystallization and preliminary X-ray analysis of a four-copper laccase from Coriolus hirsutus. II Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2003. V. 59 (8). P: 14591961.

118. Piontek K., Antorini M., Choinowski T. Crystal structure of a laccase from the fungus Trametes versicolor at 1.9 A resolution containing a full complement of coppers. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277 (40). P. 37663-37669.

119. Renganathan V., Usha S.N., Lindenburg F. Cellobiose oxidizing enzymes from lignocellulose degrading basidiomycete Phanerochaete chrysosporium: interaction with microcrystalline cellulose. // Appl. Microbiol. Technol. 1990. V. 32. P. 609-613.

120. Rogers M.S., Jones G.D., Antonini G., Wilson M.T., Brunori M. Electron transfer from Phanerochaete chrysosporium cellobiose oxidase to equine cytochrome с and Pseudomonas aeginosa cytochrome c-551. // Biochem. J. 1994. V. 298. P. 329-334.

121. Roy B.P., Archibald F. Effects of kraft pulp and lignin on Trametes versicolor carbon metabolism. //Appl. Environ. Microbiol. 1994a. V. 59. P. 1855-1863.

122. Roy B.P., Archibald; F. An indirect free radical-based assay for the enzyme cellobiose:quinone oxidoreductase. // Anal. Biochem. 1994b. V. 216. P. 291-298.

123. Roy В.Р., Dumonnceaux Т., Koukoulas A.A., Archibald F.S. Purification and characterization of cellobiose dehydrogenases from the white rot fungus Trametes versicolor. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. 62 (12). P. 4417-4427.

124. Sadana J.C., Patil R.V. The purification and properties of cellubiose dehydrogenase from Sclerotium rolfisii. И J. Gen. Microbiol. 1985. V. 131. P. 1917-1923.

125. Samejima M, Eriksson K-EL. Mechanisms of redox interactions between lignin peroxidase and cellobiose:quinone oxidoreductase. // FEBS Lett. 1991. V. 292. P. 151-153.

126. Samejima M:, Eriksson K-E.L. A comparison of the catalytic properties off cellobiose:quinone oxidoreductase and cellobiose oxidase from Phanerochaete chrysosporium. И Eur. J: Biochem. 1992. V. 207. P. 103-107.

127. Samejima M., Philips R.S., Eriksson K-E.L. Cellobiose oxidase from Phanerochaete chrysosporium Stopped-Flow spectrophotometric analysis of pH dependent reaction. // FEBS Lett. 1992. V. 306 (23). P. 165-168.

128. Saparrat M.C., Guillen F., Arambarri A.M., Martinez A.T., Martinez M.J. Induction, isolation, and characterization of two laccases from the white-rot basidomycete Cariolopsis rigide. II Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68 (4). P. 1534-1540.

129. Schmidhalter D.R., Canevascini G. Isolation and characterization of the cellobiose dehydrogenase from the brown rot fungus Coneophora puteana (Schum ex Fr.) Karst. // Arch. Biochem. Biophys. 1993. V. 300 (2). P. 559-563.

130. Shou C., Christensen M.H., Schulein M. Characterization of a cellobiose dehydrogenase from Humicola insolens. И Biochem. J. 1998. V. 330. P. 565-571.

131. Sjoestrom E. Wood chemistry. Fundaments and Applications. // Academic Press. London, UK 1981.

132. Solomon E.I., Sundaram U.M. Multicopper oxidases and oxygenases. // Chem. Rev. 1996. V. 96. P. 2563-2605.

133. Solomon E.I., Machonkin Т.Е., Sundaeam U.M. Spectroscopy of multi-copper oxidases. // In A. Messerschmidt (ed) Multi-copper oxidases. N-Y. World Scientific. River Edge. 1997. P. 103-128.

134. Stahl J.D., Cameron M.D., Haselbach J., Aust S.D. Biodegradation of superabsorbent polymers in soil; // Environ Sci. Pollut. Res. 2000. V. 7. P. 83-88.

135. Subramaniam S.S., Nagalla S.R., Renganathan V. Cloning and characterization of a thermostable cellobiose dehydrogenase from Sporotrichum thermophile. II Arch. Biochem. Biophys. 1999. V. 365 (2). P. 223-230.

136. Szabo I.J., Johansson G., Pettersson G. Optimized cellulase production by Phanerochaete chrysosporium: control of catabolite repression by fed-batch cultivation. // J. Biotechnol. 1996. V. 48. P. 221-230.

137. Temp U., Eggert С. Novel interaction between laccase and cellobiose dehydrogenase during pigment synthesis in the white rot fungus Pycnoporus cinnabarinus. II Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65 (2). P. 389-395.

138. Thorn R.G., Malloch D.W.W., Ginnis J. Leucogyrophana lichenicola sp. Nov., and a comparison with basidomes and culture of the similar Leucogyrophana romelli. И Can. J. Bot. 1999. V. 76. P. 686-693.

139. Thurston C.F. The structure and function of fungal laccases. // Microbiology. 1994. V. 140. P. 19-26.

140. Tokumatsu Т., Nagai Y., Hattori Т., Shimada M. Purification and characteristics of a novel cytochrome с dependent glyoxylate dehydrogenase from a wood-destroying fungus Tyromicespalustris. I/ FEBS Lett. 1998. V. 437. P. 117-121.

141. Tomme P., Warren R.A.J., Gilkes N.R. Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi // Adv. Microbiol. Physiol. 1995. V. 37. P. 1-81.

142. Vallim М.А., Janse B.J.H., Gaskel J., Pizzirani-Klemer A.A., Cullen D. Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase and cellobiose dehydrogenase transcripts in wood. //Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64 (5). P. 1924-1928.

143. Westermark U., Eriksson K.-E.L. Carbohydrate-dependent enzymatic quinone reduction during lignin degradation. //Acta Chem. Scand. 1974a. B. 28. P. 204-208.

144. Westermark U. Eriksson K.-E.L. Celliobioserquinone oxidoreductase, a new wood-degrading enzyme from white-rot fungi. // Acta Chem. Scand. 1974b. B. 28. P. 20914.

145. Westermark U., Eriksson K.-E.L. Purification and properties of cellobiose:quinone oxidoreductase from Sporotrichum pulverulentum. II Acta Chem. Scand. 1975. B. 29. P. 419-424.

146. Whittaker M.M., Kersten P.J., Nakamura N., Sanders-Loehr J., Schweizer E.S., Whittaker J.W. Glyoxal oxidase from Phanerochaete chrysosporium is a new radical-copper oxidase. // J. Biol: Chem. 1996. V. 271(2). P. 681-687.

147. Wilson M., Hogg N., Jones G. Reactions of reduced cellobiose oxidase with oxygen. Is cellobiose oxidase primary an oxidase? // Biochem. J. 1990. V. 270. P. 265-267.

148. Wood P.M. Pathways for production of Fenton's reagent by woodrotting fungi. // FEMS Microbiol. Rev. 1994; V. 13. P. 313-320.

149. Wood J., Wood P. Evidence that cellobiose:quinone oxidoreductase from Phanerochaete chrysosporium is a breakdown product of cellobiose oxidase. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1119. P. 90-96.

150. Xia Z.-X., Mathews F.S. Molecular structure of flavocytochrome b2 at 2.4 A resolution. // J. Mol. Biol. 1990. V. 212. P. 837-863.

151. Xu F. Effects of redox potential and hydroxy inhibition on the pH activity profile on fungal laccases. III. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 924-928.

152. Xu F., Berka R.M., Wahleithner J.A., Nelson B.A., Shuster J.R., Brown S.H., Palmer A.E., Solomon E.I. Site-directed mutations in fungal laccase: effect on redox potential, activity and pH profile. // Biochem. J. 1998. V. 334. P. 63-70.

153. Xu F., Palmer A.E., Yaver D.S. Targeted mutations in a Trametes villosa laccase axial perturbations of the T1 copper. //J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 12372-12375.

154. Yaropolov A.I., Scorobogat'ko O.V., Vartanov S.S., Varfolomeev S.D. Laccase: properties, catalytic mechanism and applicability. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. V. 49. P. 257-280.

155. Youn H.-D., Hah Y.C., Kang S.-O. Role of laccase in lignin degradation by white-rot fungi. //FEMS Microbiol. Lett. 1995. V. 132. P. 183-188.

156. Zabel R.A., Morell J.J. Wood microbiology: decay and its prevention. // Academic Press, San Diego. 1992. 215 p.