Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЦЕЛЛОБИОЗОДЕГИДРОГЕНАЗА ПОЧВЕННОГО АСКОМИЦЕТА ИНБИ 2-26(-)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ЦЕЛЛОБИОЗОДЕГИДРОГЕНАЗА ПОЧВЕННОГО АСКОМИЦЕТА ИНБИ 2-26(-)"



На правах рукописи

КАРАПЕТЯН Карен Навасардовнч

ЦЕЛЛОБИОЗОДЕГИДРОГЕНАЗА ПОЧВЕННОГО АСКОМIIЦЕТА ИИБИ 2-26(-)

03,00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1004

Работа выполнена в научно-учебном отделе биохимических проблем экологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор М.Л. Рабинович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Г.Л. Шапошников кандидат химических наук A.B. Гусаков

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН

Защита диссертации состоится «j£j» 2004 г. в « ¿О » часов на за-

седании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: П9071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2,

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературъ адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.).

Автореферат разослан » «_ ЛШЛ »2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕР] ICH KA РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Клеточные стенки древесных растений имеют сложную, высокопрочную структуру, определяющую их устойчивость к микробноЛ деградации. В природе их разложение осуществляется, главным образом, бачпдпомицетамн и почвенными мицелиальнымн грибами [Рабинович и Др., 2001]. Среди базид! гоми истов наиболее эффективны возбудители белой пшли, разрушающие как полисахар иди ы с компоненты древесины, так н трехмерную феннлпропаноняную сетку лигнпна. Помимо цел-люлаз и гемицеллюлаз он» синтезируют оксидоредуктазы: гемсодержащие лигнин- н марго не ц-пероксндазы и медьсодержащие лакказы [Болобона и др., 2002], которым отводят центральную роль в разложении лигнина в природе. Многие древо разрушаю щг re грибы секретпрэ'Ют также цел лоб и озодеп гдрогенаэу (ЦДГ; КФ 1.1.99.1В). ЦДГ относится к флавогемопротеннам и является единственным внеклеточным представителем этой группы белков. ЦДГ осуществляет процесс сопряженного окисления целлобчозы - продукта ферментативного гидролиза целлюлозы - и восстановления хшюнов или катион-раднкалов - продуктов действия оксндоредуктаз на липшновые структуры [Henrik s son et al., 2000, Cameron and Aust, 2001].

В настоящее время нет единой точки зрения на то, какие именно оксидоредуктазы наиболее эффективны при деградации нефенольпых структур и деполимеризации лиг-нниа [Леонтьевский, 2002]. Известен базндиомицет Pycnoporus cinnabarhius^ эффективно разрушающий лнгнни в отсутствие лнгщш- и марганец-перо кспдаз. Его лигнннраз-рушэющая система включает только яакказу и целлобиозодепшрогенаау [Temp and Eggert, 1999]. Образование лакказ и целлобиозодегпдрогеназ обнаружено и у почвенных грибов-возбудителе il мягкой гнили древесины [Васильчеико и др., 2000; Рабинович к др., 2001; Henrikssoii et al., 2000], однако механизм разложения ими л нгнонел.полозы до настоящего времени мало изучен.

Ранее в пашей лаборатории было выделе ею и охарактеризовано сообщество почвенных мицелпальных грибов ПНБ11 2-26, один из которых (ИНБИ 2-26 (+)) образует лакказу, а второй (ПНБН 2-26(-)> - ЦДГ [Васильчеико, 2003]. Это позволило смоделировать in vivo ферментную систему высокоактивного разрушителя лнгнпна Р. сдам-barima и изучить роль ЦДГ почвенных грибов в раз ложе m iit лнгиоцея-л i о л оо ы :-----

HU

По сравнению с ЦДГ базидчомицетов ЦДГ почвенных аскомицетов относительно мало щучены. Наиболее исследованы из них ферменты, образуемые термофильными грибами Н. iinolens и Л/ (hermophila, [Henriksson et al., 2000J. Обе эти ЦДГ заметно отличаются от ЦДГ базндномнцетов рН-оптнмумом активности. По одной из гипотез [Ludwig et al., 2004] ЦДГ аскомицетов образуют отдельную структурную группу в семействе ЦДГ,

Структура п механизм действия ЦДГ являются в последние годы предметом интенсивного изучения, так как этот фермент представляет серьезный практический интерес для создания биосенсоров с амплификацией сигнала н получения лактобноновой кислоты. Наиболее изучена ЦДГ древоразрушающего базндиомнцета Phanerochaete cfvy-sosporinni, состоящая m двух пространственно разделенных доменов. Бол мин ¡Í ФАД-содержа)Д1 lil N-концевоЛ домен гомологичен оксидоредуктазам семейства флавиновых оксидаа (глюкозо-метанол-холипокащаз), Меньший гемсодержащий С-концевоП домен имеет уникальную структуру, не найденную у других re м-бел ко в. Роль гема и механизм переноса электрона между <шм и ФАД останутся весьма спорными. Роль ЦДГ в разложении целлюлозы также требует отдельного изучения. Полагают, что, специфически адсорбнруясь на целлюлозе, ЦДГ не только удаляет ингибитор целлюлаз - целлобиозу, но и разрушает кристаллическую структуру полисахарида путем генерации ОН-радггкалов через реакцию Феитона, сопряженную с катализнруемым ЦДГ восстановлением Fe3*, Такой механизм, в частности, предложен для базпдномнцета-возбуднтеля бурой гнили Como/ora pnieüíia [Henrjksson et al,, 2000].

Цель и задачи исследования; Цель настоящей работы заключалась в исследовании роли ЦДГ нового мицелиального гриба в процессе разложения лип го целлюлозы, а также изучении ее каталитических свойств.

Поставленная цель определила задачи диссертационной работы:

1, Изучить способность компонентов сообщества мнцелиальных грибов ИНБИ 2-26-, продуцента лакказы (2-26(+}) и продуцента ЦДГ (2-26Í»), а также смешанной кул муры разлагать основные биополимеры натурального л нгноце длю лозного субстрата.

2. Выделить индивидуальную ЦДГ п нзучшгь ее фнзнко-химнческнс свойства и субстратную специфичность,

3. Выяснить возможный кинетический механизм действия фермента в реакциях с двух- ц одноэлектронным акцептором.

4. Изучить способность ЦДГ к адсорбции на целлюлозе м ее функционирование совместно с целлюлазамн в процессе гидролиза целлюлозы.

Научная новизна: Установлена способность разложения продуцентом ЦДГ лигнина в лигноцеллюлозном субстрате. Показано, что выделенная ЦДГ имеет оптимум активности в нейтральной облает» рИ. Спектральные свойства фермента н его способность восстанавливать двух- и одноэлектронные акцепторы указывают на то, что он является флавогемопротеином с цнтохромом типа Ь. Изучена стабильность фермента и его кинетические характер нстнкн в реакциях с пихлорфенолиндофенолом (ДФГ1) п цпто-хромом с. Показана избирательность сорбции ЦДГ на аморфной целлюлозе и способность катализировать сопряженную с целлюлазамп реакцию гидролиза целлюлозы -восстанови ення ДФИ.

Практическая значимость: Изученная ЦДГ обладает рядом преимуществ по сравнению с ЦДГ баз идиом настов при создании бносенсоров на фенолы с амплификацией сигнала, в частности с оптимумом активности в нейтральной области рИ л высоким сродством к целлобггозе и лактозе. Показана возможность многократного использования системы адсорбированных на аморфной целлюлозе ЦДГ н целлюлаз гриба 1ШБИ 2-26(-) для безреагеетного восстановления х и ионов.

Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе три статьи. Основные положения работа были представлены на 1-ом Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), 7-оП школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пушино, 2003) н 7-ой международной научно-практической конференции «Наука - индустрии сервиса» (Москва, 2002).

Объем работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов н методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на \13страшщах, включает £13 рнсун-

ков н -i- О таблиц. Список цитируемой литературы включает наименований, в

том числе на иностранных ятыках.

МАТЕРИАЛЫ H МЕТОДЫ

Объекты исследования; Штаммы продуцента лакказы (ИНБИ 2-26(+)) и продуцента ЦДГ (ИЦЕИ 2-26(-)) выделены егз сообщества неспорулпруюшпх почвенных ми-целпальных грибов ИИБИ 2-26 Л.Г, Васнльченко [Васнльченко, 2003], Поданным снк-вепса 28S рДМК штамм 2-26{-) наиболее близок аскомицетам p. Chaetomium {гомология 99%). Культуры поддерживали, как описано ранее [Васнльченко, 2003].

Культивирование грибов на лнгноцеллюлозном субстрате (овсяноП соломе) проводили в твердофазном н жндкофазном вариантах, при 28°С. При твердофазном культивировании использовали солому 75-80%-noii влажности, процесс вел ¡г от 2 до 4 мес. Глубинное культи вир она икс проводили в жидкой среде Чапека-Докса с 3% резаной овсяной соломы в качестве единственного источника углерода о колбах на качалке при 220 кол/мин в течение 36 сут, В ходе ферментации в пробах культура л ьной жидкости определял!! активности лакказы и ЦДГ. По окончании каждого процесса ферментации остаток соломы промывали, высушивали и определяли потерю массы, а также содержание гемицеллюлоз, лигнина и целлюлозы [Оболенская и др., 1965].

Выделение ЦДГ из 8-суточной глубинно!! культуры продуцента, выращенного на фильтровальной бумаге, проводили путем 4-кратпого концентрирования супернатанта, ионообменной хроматографией ira DEAE-Toyopeari 650 (Tosoh, Япония) и FPLC на колонке monoQ IIR 5/5 (Pharmacia, Швеция) [Карапетян и др., 2003]. Активные фракции с Rz >0,4 собирали il хранили в присутствии хлороформа в качестве консерванта.

Определение ферментов. Активность лакказы определяли сиектрофотометрически при 410 пм с использованием катехола в качестве субстрата. Активность ЦДГ определяли с целлобпозой и дпхлорфеполиндофенолом при рН 6,0 н 520 нм [Henriksson et al,, 2000]. При совместном присутствии лакказы и ЦДГ активность лакказы определяли с использованием ДФИ, частично восстановленного FeSO^, регистрируя увеличение поглощения при 605 нм [Васнльченко и др., 2004]. Целлюлазпую активность определяли с использованием филыровалыгон бумаги в качестве субстрата, концентрацию Сахаров определяли с помощью гндразнда п-окснбензоГиюй кислоты [Lever, 1973];

р-глюкозщазу определяли спектрофотометрнческн с 4-мети лу м бел л нфе ри л-бега-D -глюкозндом при 350 нм [Зверева, 2002], Восстановление цгггохрома с3* с участием ЦДГ регистрировали при 554 нм. Изучение стационарной кинетики и определение активностей проводили при 20°С.

Электрофорез. Для электрофореза белков, адсорбированных на целлюлозе, брали 2 мг аморфной целлюлозы, промывали ЦФБ и депонт lipona иной водоП, кипятили с 200 мкл sample-буфсра и износили на дорожку 20-40 мкл супер натанта.

Адсорбцию белков на не обработан но й или регенерированной из 85% Н3РО4 фильтровальной бумаге изучали с фильтратом культуры продуцента в качестве источника цел л юл аз и ЦДГ, либо с гомогенной ЦДГ, а также с конканавалином А.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разложение компонентов лигпоцеллшлошого субстрата (овсяная солома) сообществом мииелиальных грибов ИНБ1! 2-26, а также его отдельными компонентами - продуцентом лакказы и продуцентом ЦДГ

Природное сообщество почвенных грибов ИНЕ11 2-26 интересно тем, что оно разлагает лигнин, н отдельные ксенобиотики в сопоставимой степени с базидномицета-ми-возбудителями белой гнили [Koroleva et al, 2001, D ас ильченко, 2003]. Сообщество состоит из двух мнцелиальных грибов: 2-26(+) и 2-26(-). На плотной среде с соломой в качестве единственного источника углерода эти грибы растут примерно с одинаковой скоростью и являются взаимотолерантным г i (рис.1). Оба штамма не осветляют соломы, чем отличаются от возбудителен белой гнили. Было установлено, что штамм 2-26(+) образует лзкказу ¡Koroleva el al, 2001, Васн.чьченко, 2003], a штамм 2-26(-) - ЦДГ [Ва-енльченко, 2003, Карапетян и др., 2003]. Отсутствие собственной лакказы у продуцента ЦДГ было показано прямым измерением, т.к. ЦДГ не мешает определению лакказы в отсутствие целлобноэы. Чтобы измерить собственную ЦДГ у продуцента лакказы, последнюю селективно ннгибнрова:н! NaN3 (10 мМ). Степень ее иш'нбпровэння составляла 99,9%, а ЦДГ при этом сохраняла > 60% активности. Так было установлено, что в пределах чувствительности метода продуцент лакказы не образует собственной ЦДГ.

Таким образом, лакхаза ц ЦДГ служат специфическими маркерами штаммов ИНБЦ 2-26(+) и ИНБИ 2-26(-) в природном сообществе и смешанной культуре. Следовательно,

в присутствии источника целлюлозы в смешанных популяциях возможен циклический процесс окисле пня-восстановлен и я ароматических полнфенольных соединений [Васильченко, 2003]. Сходный циклический процесс описан у мощного кснл строф ного гриба, возбудителя белой шили древесины Pycnopoins cinnabartmts [Eggert et, al., 1995]. В процессе сопряженного разложения целлюлозы И лигнина гриб осуществляет таким путем регенерацию натурального

Рис.1, Совместное культивироваиие грйов на платной qieae с овсяной соломой 1-июям1Ш12-ад 2-шгаммИИБИ 2-26(+)

амшюфсиола ~ З-оксиантраниловой кислоты (3-ОАК). Предполагается, что 3-ОАК является медиатором, в присутствии которого лакказа данного базндиомицета способна разрушать иефенольные структуры лигннпа, а также перснстентные ксенобиотнки ароматической природы.

В диссертационной работе нами предпринята попытка выяснить роль ЦДГ в разложении лигнина циклической редокс-спстсшй лакказа-ЦДГ [Temp, Eggert, 1999]. Для этого реконструировали лпгнинразрушающую систему возбудителя белой гншш древесины P. chmabarhms на основе двух вышеназванных грибов, декретирующих те же

ко

60

(б)

40

О

\

ЯСМЁШЭОДЙ

культура

S

продуцент ЦЦГ

0

10 20 30 40

0

10

20

30 40

сут

сут

Pi к. 2.Обраооваш е лаккшы (a) 11 ЦДГ (б) штаммом 2-26(-), смешш и юГ( культ) poll н

шгаммом 2-26(+) iipii глубинном кульи ияцхм п п i на среде с овал [Ш соломой.

ферменты и способных развиваться совместно. При культивировании индивидуальных штаммов и смешанной культуры на овсяной соломе в условиях твердофазной пли глубинной ферментации грибы также хорошо росли, но не отбеливали субстрата и таким образом, не принадлежат к возбудителям белой гнили. Для изучения динамик» образования ферментов грибы выращивали в условии глубинного культивирования.

Как видно из рис. 2, в среде с соломой штаммы 2-26(+) и 2-2б(-) образуют специфические для них ферменты; лакказу и ЦДГ, В среде культивирования активность лак-казы штамма 2-26(+) достигала максимума на 28-е сутки, а активность ЦДГ штамма 2-26(-) была максимальной с 14 по 28 сут. В смешанной культуре обнаруживались оба фермента, однако максимальный уровень синтеза лакказы был в 1,5 раза меньше, чем у штамма 2-26(+), а синтез ЦДГ был таким же, как у штамма 2-2б(-). Степень разложения лигнина, целлюлозы и гемицеллюлоз резаной овсяной соломы за 36 сут составляла 30; 51 и 72% для продуцента лакказы, 16, 34 и 59% для продуцента целлобнозодегпдрогена-зы и 16, 39 и 65% для смешанной культуры (рис, 3).

Содержание кнслоторэстворимого лигнина было во всех образцах одинаковым и составляло около 5% общего содержания лигнина, что соответствует его процентному содержанию в лигнине исходной соломы. Таким образом, низкомолекуляриая фракции лигнина в данном случае потреблялись так же, как и его высокомолекулярная фракция. Накопления низкомолекулярных компонентов, иногда наблюдаемого в бесклеточных системах деградации лнгшгпа (Hyde and Wood, 1997], в нашем случае не отмечено.

Рис, 3. Убыль ка\люнентои

ОВСЯНОЙ Ш'ЮМЫ (в Уа ОГ

пехот юга ешкржшгня) после гпубиннао культивирования грибов в течение 36 сут.

Таким обратом, штамм ИНБИ 2-26(+) в два раза более эффективно разлагает лигнин, чем штамм 2-26(-), Однако последний также достоверно разлагал лигнин, хотя н в меньшей степени.

Возможный механизм разложения лигнина грибами-продуцентами ЦДГ обсуждается в работах [Kremier and Wood, 1992; Hyde and Wood, 1997]. Полагают, что ЦДГ образует ОН-радпкалы через восстановление Fe3+ до Fe1+ и кислорода до Н1О2, и что эти радикалы вызывают деполимеризацию целлюлозы, ксилаиа и в некоторой степени лигнина [Hetmkssoii et al., 2000, Horaityi et al,, 2001]. Секреция ЦДГ обнаружена у грибов-возбудителей мягкой и бурой гнили. Позтому этот фермент, вероятно, может вызывать определенную (хотя п небольшую) деградацию лигнина грибами, не образующими лигнин-, мзрганецпероксидаз и лакказ.

Как видно из рис. 3, совместное действие на лнгноцеллюлозный субстрат продуцентов лакказы и ЦДГ не приводит к явлению синергизма в разложении лигнина. Наоборот, при переходе от продуцента лакказы к смешанной культуре и далее к продуценту ЦДГ наблюдается закономерное снижение степени разложения отдельных компонентов,

Таким образом, идея Temp и Eggen [1999] о стимулирующей функции ЦДГ в разложении лигнина под действием лакказы не подтверждается на примере данного сообщества. Роль ЦДГ в сообществе ИНБИ 2-26 может заключаться в том, что она защищает штамм 2-2б(-) от свободиорадпкальных и хннондных метаболитов, образуемых продуцентом лакказы 2-2б(+), тогда как в чистой культуре 2-26(-) ЦДГ, возможно, участвует в разложении лигнина, так как другие внеклеточные оксидоредуктазы у этого грпба не обнаружены [Хромопыгипа, 2004].

2. Выделение м характеристика ЦДГ из нового продуцента - аскомицета

СЬаеЮпНнш 5р. 1ШБН 2-26(-)

Наиболее эффективное образование ЦДГ штаммом 2-2б(-) происходило при глубинном культивирован ин в жилкой среде, содержащей фильтровальную бумагу. Активность ЦДГ появлялась через 144 ч и в последующие двое суток резко нарастала, дости-

гая максимума, а после 192 ч постепенно снижалась. Максимальная активность (0,4 МЕ/мл по ДФИ) получена через 190 ч культивирования.

kDa

205 ! 116

97,4 «4 66

45

29

Э

far

Схема выделения 11Д Г

П 1с. 4. ЭлегартффЗ бслкш в да шур|вдтопик условиях. 1 н¿-маркеры (^¡д^па"), ¿-препарат ЦДГ после ОЕЛЕ-Тоучхаг!,1 -препаратЦЦГпосле Ш-С на топоС?, 5препарат, азсо^ртвашалй га аморф!юй [елтолоае.

Электрофоретнческая характеристика наиболее активных фракций белка после основных Сталин очистки (см. схему) представлена на рис, 4. Разработанная процедура очистки (табл. I) давала желтовато-коричневый раствор белка, гомогенного по данным электрофореза в денатурирующих условиях (рис. 4, дорожка 3) п нзоэлектрофокуенро-вання. Следует отметить, что выход гомогенного фермента составил 43% (табл. 1). Очищенный белок имел молекулярную массу около 95 кДа по данным электрофореза и удельную активность 7,8 МЕ/мг по восстановлению ДФИ (5,7 МЕ/мг по восстановлению цитохрома с). Способность восстанавливать цнтохром с}* свидетельствовала о выделении полноразмерного белка, состоящего как из ФАД-, так и гсмсодержащего доменов [Невдквйоп «I а1., 2000], Изоэлектрлческая точка белка составляла 4,98±0,02,

Основной пик поглощения очищенного белка в видимой области спектра (рис. 5) наблюдался при 422 им (полоса Сорэ гемового кофактора). Широкое плечо между 450 и 500 км, относилось, вероятно, к поглощению окисленной формы ФАД. Теш аи 1, Выдыетк 11 оо щка целлош Юэодеп шрога мзы иггамма 2-2б(-)

Сгэдш Общаяактив- НОС1Ь,(& Удельная активность, МЕЛмг белка Стак1П.смн- > CTWI, раз Выхш, %

Кутл>рздыоя wj щ. КОСТЪ 180 0,66 1 100

Коннтпририпашге 162 m 1 90

После ( га гообмсиюй кромапхрофмн 111,6 , 1,54 2,33 62 1

После хр:ц\ югогра-фшпш катанке 1 HiaicQ 77,4 7,78 1 IM 43

При восстановлении белка целлобпозой (3& мкМ) при pH 6,0 происходили сдвиг максимума поглощения в полосе Сорэ до 430 нм с одновременным увеличением оптической плотности, а также появлением характерных пиков при 563 и 534 нм, соответствующих о- и ß-нолосам типичного цптохрома типа Ь. Одновременно снижалось поглощение в области между 450 н 500 им, очевидно, благодаря восстановлению ФАД (рис, 5). Такие изменения типичны для большинства известных ЦДГ.

Соотношение Rz (A«3iAi-,}) для очищенного белка составляло 0,43. Для других аналогичных белков оно варьирует в пределах 0,46-0,64 [Lmdgien etal,, 2001].

Оптимум активности выделенной ЦДГ в реакции восстановления ДФИ находится при pH 6,0, причем в диапазоне pH 4,0 - В,0 фермент сохранял не менее 50% максимальной активности (рис, 6), Между pH 8,0 и 9,0 наблюдалось падение активности практически до нуля.

При низких концентрациях цитохрома с}* активность ЦДГ в реакции его восстановления также была максимальна при pH 6,0. Значение рП-оглимума в нейтральной области pH свидетельствует в пользу высказанной (Ludwig et al., 2004] гипотезе об отдельной структурной труппе, образуемой ЦДГ аскомицетов. Выделенный фермент явля-егся лишь третьим известным представителем ЦДГ этой группы, помимо ферментов И. insokns н AI. thermophila [Henriksson et al., 2000).

и

0.40,3 0.20.0

активность. у «./мл

400 430 500 550 600 длина волны.нм

Л-

\

V

рн

Рис. 5, Спектр ] ¡сходной (1) н восстанови (нон цешо6|«шП(2)ЦДГ

Р1 с; 6, Зависимость от рНакпшноанЦДГ шшгмаИШ12-26(-)сДФИвК№сш; Србстучла

Однако, в отличие от двух последних, выделенная нами ЦДГ не относилась к термостабпльным белкам. При 60°С она теряла половину активности менее чем за 5 мин. Это было неудобно в методическом плане, поэтому термостабпльность исследовали при 55°С {табл. 2). При этой температуре ЦДГ наиболее стабильна при рН 6,0 и значительно менее стабильна при рН 4,0 и 8,0. Это согласуется с данным« [Ваппгщег е1 а]., 2000] о более пнзкоП стабильности ЦДГ в кислых средах. Субстраты (целлобиоза и ДФИ) оказывали существенное влияние на стабильность ЦДГ, Целлобиоза замедляла ннактнвацию фермента в 1,5-6 раз в зависимости от рН, тогда как ДФИ, напротив, снижал его стабильность, в особенности, в рН-оптимуме (табл. 2), Сравнение стабильности ЦДГ аскомнцетов показывает, что термофилы образуют более термостабнльпую ЦДГ.

Табя! ш 2. Тф!юстаб[ ыы юсть ЦЦГ при 55Х? (ошг гбка не превышает 10%),

Услоши т13 (мин) при рП

пшкпшпшш 4,0 6,0 8,0

Без субстрат 3,5 99 13

+ДШ(172шМ) 3 16 7,5

+Целлоб] ии (76 мкМ) 24 131 43

Субстратную специфичность фермента по отношению к углеводным субстратам исследовали в присутствии ДФИ, По сравнению с целлобнозой и лактозой Другие изученные сахара незначительно восстанавливали ДФП в присутствии ЦДГ (табл. 3) и не

Тайн им 3. Оя гаю ше раш )чньк сахяроа ЦД Г

Углевод Концентрация, мкМ

Лактоза 6,25 1

Геитиобноэа 1000 <0.1

Метил О-цел лоб иозид 1000 <0.1

Тр и-Н-ацеп! лхнтотри оза 500 <0,1

Мальтоза 1000 0.1

Мальтоза 6000 0,2

Сахароза = 2000 <0.1

Мел нб ноза 2000 <0.1 '

О-глюкоза : 1000 , 0.1

О-глюкоза ; 6000 0.27 '

2-дезоксн- О -глюкоза | 1000 | 0,1

2-дезоксн- О -глюкоза 6000 0.2 !

С-Манноза ' 6000 <0.1 ;

Ь-Рамноза 2000 <0.1

Б-Фруктоза 2 ООО <0.1

О-Арабиноза 2000 <0.1

й-Кенлоза 2000 <0.1

Ь- Арабиноза 2000 <0.1

Ь-Ликсоэа 2000 <0.1

ЫСсшюза 2000 | <0.1

Б-Рибоза 2000 [ <0.1

ннгибиропалн его восстановление лактозой (при ее концентрации <К„). Незначительная активность фермента была обнаружена в присутствии мальтозы, глюкозы и 2-дезоксн глюкозы (табл. 3), причем эти субстраты, по-видимому, имеют на два порядка

более высокие значения К„ и на порядок более низкие значения ка„ по сравнению с лактозой. В целом данные табл. 3 согласуются с данными других авторов [Нетзкззоп et.ii),, 2000, Ватш§ег е( а1. 2001] о высокой субстратно!-} специфичности ЦДГ к сахарам, Анализируя данные табл. 3, можно отметить специфичность ЦДГ к нолуацетальиому гндро-кснлу, р-1,4-глнкозндиой связи, Ц-альдопнранозиому звену и размеру экваториального заместителя при С2. Высокая чувствительность к этим элементам структуры Сахаров может объяснить очень слабое взаимодействие фермента с такими аналогам» цел л об ио-зы, как метнл-р-1>-целлобиозид, гентиобноза и трн-Ы-ацетилхнтотриоза.

3. Стационарная кинетика восстановления одно- и двухэлектронных акцепторов ЦДГ

В отличие от Сахаров - доноров электронов, большинство ЦДГ »«специфичны к природе субстрата-окислителя, а качестве которого могут выступать многие двух- и од-тюэлекгронные акцепторы [Неппквзои й. А1. 2000, Сатегоч апс! Ата^ 2001], В таблице суммированы кинетические параметры действия ЦДГ на субстраты-вое станов! пел и (целлобиоза н лактоза), а также двух- (ДФИ) и одноэлектронный (цитохром с) акцепторы.

Таблица 4. Кажущиеся кинетические параметры действия ЦДГгрнба ИНН] 2-26 (-)ш некойрые доноры иакцешоры электрона (ошибка ± 20%)

Cjfclpar А;,, мш : М '*с 1

р"

4.0 : 6.0 80 ' 4,0 |б.О 8.0 : 4.0 : 6.0 i 8,0 :

Цсллсйквд 4,8 4,7 5 ' 7,9 8,9 4 : 1.66 " ........ ! 1.91 0.81

Лактоза - 56 - ■ - 14 - - 0,25

ДФП 12 16 89 6,4 1U 7,6 0,53 0,71 ; 0,09

Ц |ЮТфОМ с 17 15,8 30.5 ' 3.1 8,1 ИЗ 0,18 ОД 0^7

ЦДГ реализует пинг-понг-механизм катализа, состоящий из двух независимых полуреакций*, восстановления и окисления [Henriksson et al., 2000). На основании проведенного кинетического анализа были выбраны две простейшие кинетические схемы

реакций с участием двух- (I) и одноэлектрочного (2) акцепторов, в наибольшей степени соответствующие экспериментальным данным:

медленно

E+Sj<-*ES|—|—E'+Si—|—Е (1)

P. Pj

медленно

медленно при pl l<6

E+S | —|—'E'+Sj—)—'Е -»-E'+Sj—|—Е (2)

P. Pi Рг

где Е - исходная (окисленная) форма фермента, ESi - комплекс Мнхваэлнса с целлобно-зой, Е" (или 'Е') - детектируемая спектроскопически полностью восстановленная форма фермента (с двумя электронами, распределенными между ФАД и гемом), 'Е - частично восстановленная форма, содержащая электрон на непригодном для одноэлек-тронного окисления кофакторе, Е' - частично восстановленная форма, содержащая электрон на пригодном для одноэле тройного окисления кофакторе, S| - целлобиоза, S2 -субстрат-окислитель, Р| - целлобпоиолактои, Р2 - продукт восстановления Sj.

Тот факт, что при рН 6,0 н особенно рН 4,0 значения кс„, для цитохрома с заведомо меньше, чем удвоенное согласно стехиометрии реакции (2) значение к^ для целло-бнозы (табл. 4), приводит к заключению о наличии в механизме восстановления цитохрома с в кислой среде более медленной мономолекулярной стадии, чем восстановление фермера в комплексе с целлобноэой.

Таким образом, в катализе'выделен пой нами ЦДГ имеется не менее двух медленных стадии внутри молекул яр но го превращения, одна из которых предшествует образованию полностью восстановлен ной формы фермента, а вторая - образованию одноэлек-тронмо восстановленной формы, способной окисляться одноэлектрониым акцепором. В то же время, для аналогичного фермента из P. cluysosporium наиболее медленной стадией считают полное восстановление фермента целлобнозой [Cameron and Aust, 20013В таблице суммированы некоторые характеристики ЦДГ различного происхождения в сравнении с выделенным нами ферментом.

Таблица 5, Сравнение Ш1Г из пятдичлых источников

Оршизм Тш маг масса, пЯд pf pH- oltotmym TCMIL апимум "C IUKM цсодэбшям MKM~'-C~1 Источник

Phanerochaete chiysutporium базцциомицег, баш гниль 89 42 5,0 50 0,15 HcnrikssonetaL (1995)

Trameies versaAr Баэншюмицрг, пвшь 97 4,2 5,0 50 Rm'ctal, (19%)

Schiimfirytlum commune Сшшжрмигкт, Стает гниль 102 4,5 Fang «aL (1997)

Coreophara putema бюцдиомицег, бурая |-шшь Ш & 4J3 SclimitlhaltiT andCarwvasdni (1993)

JVawpams | базидиомицет; rimaharinus j белая гниль 101 3,9 5» : 4j0 ................ .. ........... Temp and Eggert (1999)

Sclerotium {Adx-tia) базишюмицст, rolfsS j фнгспикмен j10 42 ■ 4,0 50 0ДЗ Bamingcraal. (2001)

МуссЬ'ирЫош thamophüa аекомнцег, мяпоя гниль 91 4;1 7j0 65 Gmenasdraela). (1991)

Hisnicola insotens аскомицсг, мягки тиль 92 4j0 7,0 65 0,045 1 Xu etal. (2001)

, 1 < Qiaetomiumsp. j аскомнцст, j ^ INBI2-26- j мягкая ¡тлоть 4,98 6,0 <55 1,9 Карогклмнидр. (2003)

IS

4, Адсорбция ЦДГ на целлюлозе. Катализ сопрлжсиного процесса гидролиза

целлюлозы - восстановления ДФИ

Важнейшей функцией ЦДГ считается ее участие в разложении целлюлозы совместно с целлюлазамн [Henriksson el at., 2000], При этом известные ЦЦГ, подобно целлю-лазам, функци онируют на поверхности целлюлозы н имеют специфическое сродство к неа. Однако, специфичность к целлюлозным субстратам у разных ЦДГ различается: одни предпочтительнее адсорбируются на кристаллических формах целлюлозы, э другие на аморфных. Мы наблюдали весьма слабое связывание выделенной ЦДГ при рИ 6,5 на микрокристаллической целлюлозе и фильтровальной бумаге.

Обработка бумаги концентрированной HjPOj значительно увеличивала связывание, В этом случае при концентрации носителя 50 мг/мл связывалось 2-3 ME ЦДГ, Таким образом, ЦДГ предпочитает гидратнрованные целлюлозные цени, а не гладкую поверхность. По прочности сорбции она значительно уступает ЦДГ Р. chrysosporium [Cameron and Anst, 2001] п грибным целлюлазам, несущим целлюлозосвязывающнй домен, например, СеПА Trichoderma reesei, которая практически полностью связывается уже при Koimeirrpauini микрокристаллической целлюлозы 2-3 мг/мл [Гернер и др.,1999]. Вместе с тем, данные электрофореза подтвердили наличие адсорбированной ЦДГ на поверхности аморфной целлюлозы {рис. 4, дорожка 5).

Рис.7.505-элек1рсфс1ре1рамма конканшшинаА атгерб^юкмшго

на аморфной и£тдюлозс(1), маркерных беиков(2), адсорбированной цсшиошвнон системы

процента ЦЦГ псслс сбрабино] кгакппаватшшА (3) и безобра&лкн (4).

11нтсресно, что при этом проявлялась также слабая высокомолекулярная белковая полоса, примерно соответствующая днмеру ЦДГ, хотя в исходной ЦДГ эта полоса отсутст-

, , SJ.6

S*

вешала.Возможно, это объясняется частичной ассоциацией соседних молекул ЦЦГ па поверхности целлюлозы. Для белков, укладка которых имеет в основе fl-структуру, явление днмернзацнн хорошо известно [Рабинович и др., 2002]. Для те «содержа г иего домена ЦЦГ Р. chrysosporium та ¡оке показана Р-структура [¡Iallberg et al., 2000].

На рис. 7 (дорожка 4) показан состав целлюлозной системы гриба IIHBÍI 2-26(-) по данным SDS-электрофореэа. Внеклеточные белки гриба, выращенного на фильтровальной бумаге, были предварительно адсорбированы на аморфной целлюлозе. Основными компонентами комплекса являются грибная целлобногидролаза I (ЦБГ) с молекулярной массой около 66 кДа (Тернер и др., 1999] и белок массой 55 кДа. Это может быть грибная целлобиопгдролаза !! и/или эидоглюканаза I [Рабинович и др., 2002]. Аналогичную молекулярную массу нмеет н р-глюкозндаза гриба ИНБН 2-26(-) (см. рис. 4), однако ее присутствие на поверхности целлюлозы в качестве основного белка менее вероятно [Рабинович и др., 1983].

Основным отличием дайной ферментной системы от целлюлазной системы наиболее изученного гриба Т. reesei является присутствие на поверхности целлюлозы ЦДГ

(95 кДа) н белка массой около 200 кДа (предположительно днмера ЦДГ (см, рис. 4), детектируемого только на поверхности целлюлозы).

19 М Р-у-: i", ч

Как видно из рпс, 8, последователь [(О работающая на поверхности аморфнзовапной бумаги пол и ферментная система целлюла-зы-ЦДГ эффективно восстанавливает ДФИ в отсутствие экзогенной

Рис. £. Восстэмж га а и ДФ11 адгарСн [роваиноГ] на аморфной целлюкие нршолатшнческой системой продуцента ЦДГ в о [сутсгвие эюогешой цегчобпозы: «-во^товие сшивающего атда,й-гюслеобрлЗат[ конк^йвалшюм А^чай^токк нд графике и]ХТ1ЬДластошибку экегкримета)

целлобнозы. Таким образом, данная система действительно может выполнять функцию восстановления реакшюнноспособиых хннопов и свободнорадикальпых частиц, образуемых лакказой. Процесс характеризуется двумя стадиями, причем медленная стадия,

вероятно, соответству ет такому режиму реакции, при котором скорость обесцвечивания ДФИ определяется скоростью гидролиза бумага под действием адсорбированных цел-люлаз. Система также сохраняла способность восстанавливать ДФИ после высушивания и реувлажнення.

В процессе ферментативного гидролиза целлюлозы ЦЦГ может выполнять важную функцию удаления целлобнозы - продукта и одновременно сильного ингибитора действия целлобиогндролаз. При этом она имеет преимущество перед р-глюкоз и дазой, выполняющей такую же функцию, так как работает на поверхности, в непосредственной близости от целлюлаз, В кинетике действия последовательно работающих иммобилизованных пол и ферментных систем широко известен феномен ком л артм ентал нзашш, когда реакция идет эффективнее при физическом сближении ферментов. В пашем случае можно было ожидать, что промежуточный продукт (целлобиоза) не будет накапливаться вблизи образующей его целл обио гидрол азы, если рядом с ней присутствует молекула ЦДГ.

Чтобы добиться наиболее эффективного удаления целлобнозы, образуемой цел-люлазамн, была предпринята попытка максимально сблизить молекулы целлобиогндролаз и ЦДГ на поверхности целлюлозы. Для этого адсорбированные белкн дополнительно сшивали друг с другом конкашвалниом А (КонА) - субъединнчным лектином, взаимодействующим с остатками маниозы в глнкознлнроваиных частях молекул ферментов.

Электрофорегрпмма показывает, что небольшое количество КоиА связывается с целлюлозой (рис. 7, дорожка 1) и определяется в виде субьединицы массой около 30 кДа. У ферментной системы продуцента ЦДГ в этой области нет белков, связывающихся с целлюлозой (рис. 7, дорожка 4). Вместе с тем, при обработке КонА целлюлозы с предварительно адсорбированными компонентами целлюлазной системы продуцента ЦДГ количество КонА на поверхности резко увеличивается (рис, 7, дорожка 3), что свидетельствует о его связывании с адсорбированными белками. Одновременно происходит нскторое перераспределение интенсивности полос: количество адсорбированного белка 55 кДа снижается, а количество ЦДГ н белка 200 кДа, наоборот, возрастает.

Как видно из рис. 8, на начальной стадии гидролиза скорость действия обработанной КонА фермент011 системы была практически такой же, как у необработанной.

Однако в дальнейшем система, обработанная КонА, работала более эффективно, что было хорошо заметно по более быстрому восстановлению ДФН н обесцвечиванию реакционной смеси.

Наиболее простое объяснение состоит в том, что часть молекул ЦБГ и ЦДГ оказывается соединенной поливалентным реагентом КонА на поверхности целлюлозы. При этом ЦДГ, имеющая столь же высокое сродство к целлобнозе, как н ЦБГ, может более эффективно защищать ЦБГ от ингпбнроваиня. Еше одно объяснение может заключаться в том, что на поверхности целлюлозы ЦДГ более активна в виде днмера, В принципе, адсорбированный димер ЦДГ может окислять сразу 3 молекулы цел л об! юзы н принимать 6 электронов (по 2 на каждый остаток ФАД и по одному на каждый остаток гема). При этом ее эффективность как агента, удаляющего цел л об позу, очевидно, должна возрастать.

ВЫВОДЫ

1. При исследовании роли продуцентов лакказы н цел лобнозодеп i дроге на зы сообщества неспорулпрующих почвенных мпцелнальиых грибов ИПБЦ 2-26 в разложении лигноцеллюлозы овсяной соломы показано, что продуцент лакказы в два раза активнее разлагает липши, чем продуцент целлобиозодегндрогеназы, Синергизма между продуцентами не обнаружено.

2. Впервые выделена и охарактеризована целлобноэодеглдрогенаэа из мезофнлыюго аскомицета p. Chaeiomiwn (Ш1БИ 2-26(-)). Фермент наиболее активен при рН 6,0 и сохраняет не менее 50% активности в диапазоне рН от -1,0 до 8,0. Молекулярная масса фермента составляет =95 кДа, Спектральные характеристики восстановленного целлобнозон фермента указывают на наличие в кем гема типа цнтохрома Ь. Фермент наиболее стабилен при температурах до 50пС и рН 6,0. В кислой среде (pi 1 4,0) целлобиозодепгдрогеназа наименее устойчива. Целлобноэа стабилизирует, а дн-хлорфенолиндофенол дестабилизирует фермент при гермой пактнвацнн,

3. Выделенный фермент характеризуется узкой специфичностью и высоким сродством к целлобнозе и лактозе. Установлена специфичность фермента к совместному присутствию в составе углеводного субстрата полуацетального гндроксила, |М,4-глнкозлдиой связи и экваториальной С2-OI ¡-группы в альдошгранозном кольце.

Цел лоб иозоде ги дро ге наз а способна связываться с аморфной целлюлозой; при этом на электрофореграмме обнаруживается слабая дополнительная полоса, соответствующая д им еру фермента.

4. Фермент катализирует восстановление дихлорофенол индофенол а (двукэлектронный акцептор) н цнтохрома с"и (одноэлекгронный акцептор), что подтверждает присутствие в ферменте функционально активного гемового домена,

5. В механизме действия фермента показано наличие двух скорость-лимитирующих стадий. Одна из них связана с превращением комплекса Ми хам пса с целлобпозоп в восстановленный фермент, а другая, вероятнее всего, относится к переносу электрона между гемовым и флавиновым доменом при восстановлении одмоэлектронного акцептора,

6. Путем совместной адсорбции на аморфной целлюлозе сформирована сопряженная полиферментная система из целлюлаз и иеллобиозодегпдрогеиазы гриба ННБН 2-2б(-), эффективно восстанавливающая дихлорофс пол индофенол в отсутствие экзогенной целлобпозы.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (Гранты 02-04-49033 и 03-04-20002БНТС_а), Министерства промышленности, науки и технологии (Международный проект № 43.700.11.20 в рамках межправительственного соглашения между РФ и СРВ о научно-технологическом сотрудничестве № 0248/01/01,2001-2005 гг. «Разработка биотехнологий получения и применения физиологически активных соединений п ферментных препаратов») и Президиума РАН (Программа поддержки базовых кафедр и учебно-научных центров, 2002 н 2003 гг.).

Список работ, опубликованных но материалам диссертации:

1. Степанова Е.В., Королева О.В., Васнльченко Л.Г., Карапетян К.П., Ландесмаи Е.О., Явметдшюв U.C., Козлов 10.П., Рабинович МЛ. Разложение овсяной соломы грибами при жидкофазиом и твердофазном культивировании. И Прикладная биохимия п микробиология. 2003. Т.39. №1. С.74-84.

2. Карапетян К.Н., Ячкова С.Н., Васнльченко Л.Г., Борзых М.Н., Рабинович МЛ. Выделение и характеристика целлобиоэодегидрогеназы, образуемой неспоро л нрующпм мм-целиальным грибом ИНБИ 2-26 (-), Ц Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т.39. №6.0.542-651.

3. Васнльченко Л,Г., Карапетян К.П., Ячкова С.Н., Зериова Е.С., Рабинович МЛ. Разложение лигноуглеводного субстрата почвенными грнбамп-продуиеитами лакказы и цеи-лобиоэодегндрогеназы, 11 Прикладная биохимия и микробиология 2004. Т.40. №1. С.51-56.

4. Карапетян 1С.If., Ячкова С.Н,, Васнльченко Л.Г., Борзых М.Н., Рабинович М.Л. Цел-лобпозодегн дрогеназ a почвенного гриба ИНБИ 2-26. И В сб.: Тезисы 1-ого Международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития». Москва. 2002. С.449-450

5. Карапетян К.Н., Ячкова С.Н, Целлобиозодегидрогеиаза почвенного гриба ШШП 2-26. // В сб.: Тезисы 7-оп школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино. 2003. С. 105.

6. Рабинович М.Л., Карапетян К.Н., Борзых М.Н., Ячкова С.Н. Бпосепсор лля определения фенольных соединений в сточных водах, //В сб.: Тезисы 7-ой международной научно-практической конференции «Паука - индустрии сервиса» Москва. 2002. С.44-45.

Типография 11МАШ РАН, г, Москва, М. Харитоньевский пер., 4

Лиц. ПД Ns 00492 от 12.04 2000

За к- № ¿ft. от Л.Ш 2 ОСУ тир./йС экз.