Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химические закономерности катализа лакказой из различных источников

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические закономерности катализа лакказой из различных источников"

Академия наук СССР Ордена Ленина Институт биохимии им. А. Н. Баха

На правах рукописи

УДК 577.152

ГИНДИЛИС АНДРЕЙ ЛЬВОВИЧ

ФИЗИК0-ХИМИЧЕ6КИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ КАТАЛИЗА ЛАШ36Й ИЗ РАЗЛИЧНЫХ источников

Специальность 03.00,04 — биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва — 1988

Работа выполнена в лаборатории кинетики биохимических процессов Института Биохимии им. А. Н. Баха АН СССР.

Научный руководитель — доктор химических наук А. И. Ярополов.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор А. А. Клесов; кандидат химических наук, С. О. Бачурин.

Ведущая организация — Химический факультет

Московского государственного университета им.

М. В. Ломоносова. \ »

Защита состоится Л6 иидЬ_ 1988 г.

в 10 час. на заседании специализированного совета К 002.96.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А. Н. Баха АН СССР (117071 Москва, Ленинский пр., 33, корп. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР (117071 Москва, Ленинский пр., 33, корп. 1).

Автореферат разослан /-^С-'с -¿иГ 1988 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

М. И. МОЛЧАНОВ

'общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. В последние годы в различных областях науки и техники все более широкое применение находят ферментные катализаторы. Особый интерес представляет использование ферментов в качестве катализаторов электродных процессов. Основные перспективы применения биокатализаторов для ускорения электродных процессов по безмедиаторному механизму связаны с анализом различных веществ, специфическим электросинтезом, созданием электрохимических преобразователей энергии и применением в системах биологической обработки и хранения информации. На сегодняшний день свойство бе.змедиаторного электрокатализа установлено для ряда окислительно-восстановительных ферментов, однако, до сих пор остается открытым вопрос о возможностях прогнозирования эяе-ктрокаталитических свойств для конкретных редокс-ферментов.

Успешное, прогнозирование злеитрокаталитических свойств ферментов на основе исследования кинетического механизма их действия позволит интенсифицировать исследования в области безмедиа-торного бнозлектрокатализа и практического применения процессов Ферментативного ускорения электродных реакций.

Особый интерес среди ферментов, обладающих злектрокаталитиче-скими свойствами, вызывает лакказа. Этот фермент обладает ярко выраженными каталитическими свойствами в реакции злектровосста-новления кислорода по четырехэлектронному механизму. Важным представляется также то обстоятельство, что существуют другие "голубые" оксидазы, имеющие близкую к яакказе субстратную специфичность. Все это позволяет говорить об актуальности изучения взаимосвязи кинетических и злеитрокаталитических закономерностей действия лакказы с целью выработки критериев прогнозирования электрокаталитических свойств ферментов. Кроме того представяя-ется важным расширение круга изучаемых представителей лакказы. Способность фермента катализировать окисление полифенолов обуславливает интерес к изучению его свойств и делает перспективным для использования в аналитических целях.

Научная новизна. На основании экспериментального и литературного исследования сформулировано положение о необходимости подчинении катализа окислительно-восстановительного фермента в на-гивнои состоянии механизму типа "пинг-понг" для проявления фе-

рментом электрокаталитических свойств. Выделена и охарактеризована лакказа из грибов Certería maxima и Coriolus hirsutus, ранее не изучавшаяся. Исследованы кинетические закономерности действия этих ферментов. Предложена кинетическая схема механизма действия ферментов.

Практическая ценность работы. Определены пути прогнозирования электрокаталитических свойств конкретно выбранных редокс-фермен-тов. Предложен фермента тинный метод анализа полнфенояьных соединений и лигнинов; разработан газодиффузионный электрод на основе иммобилизованной лакказы и выработаны подходы к использованию биоэлектрокаталитических процессов в системах обработки и хранения информации.

Целью исследования ,проводимого с 1983 г., явилось теоретическое обоснование и разработка подходов к прогнозированию результатов применения ферментов в сопряженных биоэлектрокаталитичес-кнх системах, функционирующих по механизму безмедматорного электронного транспорта между ферментом и электродом и использование полученных данных для создания технических устройств.

В связи с этим, в работе были поставлены следующие задачи: 1) исследовать взаимосвязь кинетических и электрокаталитических закономерностей действия лакказы; 2) получить гомогенные препараты ферментов, определить некоторые биохимические характеристики лакказ из грибов Coriolus hirsutos и Cerrería maxima, установить кинетический механизм действия ферментов; 3) создать модели устройств для оценки возможностей практического применения лакказы в системах анализа, преобразования энергии и, выработать подходы к реализации биоэлектрокаталитических процессов в системах молекулярной биоэлектроники.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на V Всесоюзном симпозиуме по получении! н применению иммобилизованных ферментов (Кобулеттн 1985 г.), Международной симпозиуме "Биозлекг-Рохимия в биотехнологии" (Зрфурт 1986 г.), VII Республиканской конференции молодых ученых (Таллин 1987), Ш Всесоюзна конференции по вычислительной оптоэлектронике (Ереван 1987 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, резуяь-

татов и обсуждения (Б глав), выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на -/¿^страницах машинописного текста, со-держит-^рисунков и з^таблиц. Список литературы насчитывает названия.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.

СВЯЗЬ МЕЖДУ КИНЕТИЧЕСКИМ МЕХАНИЗМОМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТА И ПРОЯВЛЕНИЕМ ЕГО ЗПЕКТРОКЙТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ.

К настоящему времени явление безмедиаторного злектрокатализа установлено для ряда редокс-фериентов, В самом общем виде процесс биоэлектрокатаяиза можно представить как двухстадийный акт, состоящий из переноса электрона с электрода на активный центр фермента и последукицей каталитической стадии трансформации суб-

стпата Э в продукт Р:

■* #

е + Е -> Е -» Е

/Л

5 Р

Исходя из этого, м"жно сформулировать ряд Факторов, влияющих на возможность биоэлектрокатаяиза по механизму прямого переноса электрона на активный центр фермента. Так, эффективность первой стадии процесса будет зависеть от глубины нахождения активного центра внутри белковой глобулы, материала электрода и ориентации фермента на поверхности электрода. Эффективность второй стадии связана со степень» сохранения активности Фермента при иммобилизации и с удельной активность» биокатализатора. Однако, неясным остается вопрос - как сам каталитический механизм влияет на наличие или отсутствие у редоке-фериента электрокаталитических свойств. Основной цель» данной работы было выяснение причин обуславливающих саму возможность безмедиаторного электрокатализа в конкретно выбранной электроферментативной системе, установление взаимосвязи межцу кинетическими закономерностями катализа ферментов и проявлением у них электрокаталитических свойств.

С этой цель» нами был выбран в качестве объекта фермент лак-каза. Этот фермент обладает ярковыраженными каталитическими свойствами в реакции электровосстановяений кислорода по четыре-

хэлектронному механизму:

02 + 4Н+ + 4е -ааШМЗ-» 2Н20

Способность лакказы катализировать окисление ароматических полиаминов и полифенолов делает этот полиядерный металлофермент весьма интересным как в плане Фундаментального изучения каталитического механизма восстановления молекулярного днкислорода до воды, так и плане практического использования.

Окислительно-воссстановительные превращения простетической грчппм яакказы.

Вопрос о связи характера редокс-превращений простетических групп с электрокаталитической активность» фермента является важным аспектом в понимании механизма безмедиаторного злектроката-лиза. В литературе высказываются мнения о тождественности редокс-превращений простетических групп фермента акту электрокатализа. Потенциодинамическим методом нами были изучены окислительно-восстановительные реакции лакказы из Coriolus versicolor, иммобилизованной на сажевом электроде, в анаэробных условиях. Показано, что потенциодинамические кривые характеризуются наличием обратимых катодных и анодных максимумов токов с потенциалами 0,75-0,85 В* соответственно. В присутствии апофермента окислительно-восстановительные процессы на электроде не протекают. Анаэробное восстановление лакказы на платиновом электроде при потенциале 550 мВ сопровождалось уменьшением поглощения на длине волны 610 нм, соответствующего максимуму поглощения меди 1-го типа. Таким образом, можно заключить, что потенциодинамические максимумы токов соответствуют редокс-превращенияи меди 1-го типа, входящей в активный центр лакказы.

Примечательным является тот факт, что потенциалы восстановления-окисления простетической группы лакказы расположены более, чем на 300 мВ отрицательнее равновесного кислородного потенциала, который реализуется на электроде с иммобилизованной лакказой в присутствии кислорода. Полученные результаты позволяют говорить о нетождественности редокс превращений простетической труп-

* - Значения потенциалов в работе приведены относительно водородного электрода в том же буферном растворе.

пы фермента акту электрокатализа. По-видимому, в присутствии кислорода происходит изменение редокс-потенциалов ионов меди, входящих в активный центр фермента.

Для выяснения роли редокс-преврзщеиий простетической группы в проявлении эяектрокаталитическнх свойств фермента были изучены потеициодинамические характеристики церулоплазинна, иммобилизованного на электроде из саяи. Известно, что по структуре активного центра, субстратном специфичности и по' гомологии значительных участков аминокислотном последовательности церулоплазиин весьма близок к лакказе. Потеициодинамические кривые, записанные для церулоплазмина в тех гсе условиях, что и для лакказы, весьма похожи, и характеризуются наличием обратимых катодного-и анодного максимумов токов при потенциалах 0,74-0,63 В, соответственно. Злектровоестановление церулоплазмина также приводит к уменьшения поглощения на длине волны 610 нм. Как и для лакказы этот процесс обратим и церулоплазмнн может быть реокислен кислородом без потери ферментативной активности.

Однако, нами было показано, что церулоппазмнн не обладает способностью катализировать реакцию электровосстановления кислорода. На рис. 1 представлены поляризационные кривые злектровосс-тановления кислорода, записанные на электроде с церулоплазмином, иммобилизованным на case и в полимерной матрице ион-радикальной соли полипентамзтилендипнридил-тетрацианхинодиметана (ППДЛ-ТЦХДЮ. Видно, что кривые практически не отличаются от фоновой, записанной в отсутствие фермента. Причем отсутствие у церулоплазмина злектрокаталитических свойств нельзя объяснить его низ-

Рис.1. Поляризационные кривые электровосстановпения кислорода, записанные на электродах из сажи ЛМ-105 с иммобилизованной лакка-зой Со г i о 1us hirsutus (1); яак-казой Cerrena maxima (2); в отсутствие фермента (3); церулоп-лазмином (4); из полупроводнико-0.6 Ер,Вр0й проводящей матрицы

ППДП-ТЦХДМ с иммобилизованным церулоплазмином (5).

«А 11 Г

О

30

/

/ /

10 * У -

1% 0.7

- б -

кой удельной активностью, т.к. в контрольных экспериментах нами уравнивались активности электродов с иммобилизованными церулоп-лазмином и лакказой путем адсорбции малых количеств лакказы.

' Роль кинетического механизма действие Фермента в проявлении его электрокаталитических свойств.

На основании вышеизложенных результатов можно констатировать, что несмотря на значительное сходство редокс-превращений прос-тетических групп двух структурно и Функционально близких ферментов, их способность к безмедиаторному электрокатализу диаметрально различается. Можно сделать вывод, что не стадия переноса электрона, а каталитическая стадия определяет в данном случае процесс бноэлектрокатализа. Известно, что лакказа Coriolus versicolor^ использовавшаяся в настоящей работе, и церуяоппазмин катализируют окисление органических субстратов по механизмам различных типов. Так для лакказм Coriolus versicolor характерен катализ по механизму типа "пинг-понг", а для церулоплазмина -катализ с образованием тройного комплекса.

Анализ этих данных позволяет сделать предположение о необходимости подчинения фермента каталитическому механизму типа "пинг-понг" для возможности проявления у него электрокаталитических свойств. Это условие является необходимым, не не достаточным, т.к. ограничивать электрокаталитические свойства фермента могут и другие факторы, перечисленные выше. При наличие в каталитическом акте комплекса донор-фермент-акцептор невозможность безмедиаторного электрокатализа обусловлен«, по-виднмому, жесткими требованиями к структуре этого комплекса. Из анализа литературных данных следует, что все ферменты, для которых на настоящий момент установлена способность катализировать электродные реакции по безмедиаторному механизму, подчиняются закономерностям катализа по схеме типа "пинг-понг". Это является косвенным подтверждением сделанного выше предположения.

ОЧИСТКА И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА ГМККЙЗЫ ИЗ ГРИБОВ Coriolus hirsutus и Сеггena maxima.

До сих пор свойство безмедиаторного зпектрикатализа было ус-

тановлено лишь для лакказы из Coríolus versicolor. Расширение круга изучаемых лакказ представляло интерес в плане установления общности электрокаталитических свойств лакказы из различных источников, а также в связи с поиском фермента с наиболее высокими каталитическими константами н стабильностью для целей практического использования.

Были выделены лакказы из базидиальных грибов Coriolus hirsu-tus и Cerrería maxima по оригинальной методике, приведенной на схеме 1. Основной трудностью очистки является устранение пигментов, содержащихся в культуральной жидкости. Значительной очистки удается достигнуть при высаливании 90% от насыщения сульфатом аммония. Практически все оставшиеся пигменты удается отделить на первой стадии ионообменной хроматографии вс.ледствин их исключительно прочного связывания с носителем. Профиль элюции для стадии рехроматографии на ДЗЙЗ-целлюлозе при очистке лакказы Coriolus hirsutus приведен на рис. 2. В дальнейшем методика была

ÍZ5 гSO Vsmcu,, мп

усовершенствована, заменой первой стадии ионообменной хроматографии на бесколоночную стадию с использованием ДЗАЗ-волокнистой целлюлозы. Усовершенствованная методика позволяет получить гомогенный фермент при использовании только одной колоночной стадии хроматографии (схема 1).

Значения молекулярных масс ферментов определяли в каждом случае 2-мя независимыми методами: с использованием градиентного электрофореза и геяьхропатографии для лакказы Coriolus hirsutus, и с использованием электрофореза в присутствии додецнлсульфата натрия и градиентного электрофореза для лакказы Cerrería maxima.

Рис.2. Профиль элюции при рехроматографии белка на колонке с ДЗАЗ-целлюлозой с элюцией линейным градиентом К-фосфатного буфера рН=7,2 5-200мГ1. 1- активность фермента; 2 - оптическая плотность при Д=280 нм.

torsutus

Усредненные значения молекулярных масс соответствуют 55 кД для ' лакказы Coriolus hirsu1:us и SB кД для лакказы Cerrena maxima. Для лакказы Coriolus hirsutus определена ¡изоэлектрическая точка равная 4,5.

Определены значения каталитических констант и констант Ммхаэ-лиса по ряду донорных субстратов для ферментов из обоих источников. Значения констант приведены в таблице 1. Следует отметить, что полученные значения каталитических констант для ферментов из обоих источников значительно (в 2-5 раз) превосходят сответсл-вукидие значения каталитических констант для лакказы из грибов Coriolus versicolor и Coriolus anisoporus (литературные данные). Таблица 1. Значения К(1 и ккат для ферментов из Coriolus hirsutas и Cerrena maxima.

Субстрат Лакказа Coriolus Лакказа Cerrena

Tiirsutus maxima

Значение Значение Значение Значение

Кп, мкМ 1< с""1 кат' ■ Км, мкМ 1< г-1 кат' с-

Пирокатехин 390 462 123 404

Гидрохинон 180 257 -г- -

Шелезистосине- 97 457 - —

родистый калий

Установлено, что как лакказа Coriolus hirsutus так и лакказа Cerrena maxima способны катализировать реакцию электровосстановления кислорода. На рис. 1 представлены поляризационные кривые, записанные на электроде из сажи с иммобилизованной лакказой из Coriolus hirsutus и Cerrena maxima.

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ЛАККАЗЫ Coriolus hirsutus и Cerrena maxima.

В работе для обоих ферментов из Coriolus hirsutus и Cerrena maxima установлено, что механизм катализа окисления кислородвос-станавливающих субстратов подчиняется механизму типа "пинг-понг". На рис.. 3 а,б представлены зависимости обратных каталитических констант по кислороду и отношения констант Мнхазлиса к каталитическим константам по кислороду от обратной концентрации донора электронов для ферментов из обоих источников. Харак-

Рис.3. Зависимость формальных кинетических параметров лакказы от обратной концентрации донорного субстрата. Условия: О,01 М Ыа-

цитрат-фосфатный буфер; 0,05 М КШ_; * - 25°С. д-(кЙг)"^ о» ----------- ' " ' "

катехин; б -

- лакказа Coriolus hircutus, pH^i,lG; субстрат пиро-лакказа Cerrena maxima, рНЧ5,2;субстрат гидрохинон.

Кс

кип

X

Л-

г-

w бо sc мтмт у so щцм оТо so~ о- §

tоЧгхГ'нi

тер этих зависимостей указывает на подчинение ферментов из этих источников механизму типа "пинг-понг". Этот факт служит дополнительным подтверждением высказанному выше предположению о необходимости подчинения фермента механизму катализа типа "пинг-понг", для проявления у него электрокаталитмческой активности.

Исходя из схемы типа "пинг-понг", скорость реакции можно описать уравнением:

Е0

V- - (1)

а + Ь/5± + с./Б г где. а., Ь, с - эффективные параметры. "Пинг-понг" характер механизма катализа указывает на то, что каждой стадии присоединения любого из субстратов предшествует моно-ияи бимолекулярная необратимая стадия. Отличие от нуля параметра <а) указывает на наличие мономолекулярных процессов в каталитическом акте. Нами была предложена простейшая схема катализа, ла.кказой реакции окисления доноров электронов. При этом делались следующие допущения: 1) полифенолы выступают как одноэлектронные доноры и взаимодействуют с ферментом по бимолекулярному механизму; 2) присоединение-кислорода к молекуле фермента, происходит обратимо.

Исходя из этого, предложена простейшая схема катализа лакка-

зой окисления донорного субстрата, (схема 2), еключаницая в себя: последовательное восстановление активного центра фермента (Е) двумя электронами, последующее обратимое связывание дикислорода, разрыв связи 0-0 и отщепление молекулы воды в результате внутримолекулярного процесса, последовательный прием »2-х электронов на активный центр в результате 2-х бимолекулярных стадий, завершение каталитического акта отщеплением второй молекулы воды.

Схема 2.

нго

«i2[°2] .. 1 knC« . kr2CM . , - > ЕО,—г-» ЕО -► ЕО -► ЕО

2 25

кГ4С0]

н2о

krjto]

Выражение для стационарной скорости реакции для схемы 2 запи-сыватся в виде:

V -

СЕо3

1Л1г.< k2,/l< + 1)1/С0 Ь(1Л< +1Л )Л Ш j* 1/CD3

1~1 . .( 2 ) Предложенная схема является достаточно общей вообще для "пинг-понг" катализа восстановления кислорода, по четырехэлект-ронному механизму.

Для лакказы Cerrena maxima была проведена дальнейшая детализация механизма с учетом стадий протонизации. На рис. 4 представлена экспериментальная зависимость логарифмов параметров а, Ь и с уравнения 1 от рН для лакказы Cerrena maxima. Пропорциональность параметра с, представляющего собой сумму обратных констант скоростей бимолекулярного восстановления фермента (см. уравнение 2), концентрации протонов до рН =» 5 свидетельствует об обусловленности бимолекулярного восстановления фермента либо депротони-рованием субстрата, либо депротонированием некой группы ВН фермента. Однако, рК гидрохинона имеет значение ~ 10, что позволяет исключить вероятность участия гидрофенолят иона в каталитическом акте. Поэтому следует считать, что контроль стадии восстановления фермента осуществляется кислотно-основной группой с рК > 5. Параметр а представляет сумму nf,ратных констант внутримолеку-

яярного восстановления 02 до воды. Важно отметить, что тангенс наклона логарифмической зависимости параметра а от рН равен 1, т.е.1 процесс контролируется одной кислотно-основной группой, а не двумя, как следовало бы ожидать из материального баланса. Этот факт свидетельствует о неэквивалентности протонируемых групп, участвующих в процессе. Влияние на скорость внутреннего восстановления кислорода оказывает в данном диапазоне рН только группа с рК - 4-5, вторая группа с рК > 6 кинетически не проявляется.

С учетом протонирования групп фермента зависимость параметра Ь уравнения 1 можно записать в виде:

Ь - 1Л1гГкг1/к2,(1 + КЙ/[Н+]) +1] (3)

в предположении независимости к.г1 и к1г от рН. Действительно наблюдается слабая зависимость параметра Ь от рН в соответствии с уравнением (3) (рис. 4).

ч.

Рис.4. Зависимость логарифмов параметров а, Ь и с уравнения (1) для лакказы Cerrería maxima от рН. Условия: 0,1Л М Na-цит-рат-фосфатнмй буфер, содержащий 0,05 М KNOj , t ■= 25°С. в - а; О- Ь; А- с.

6 рН

Общее уравнение скорости для процесса катализа лакказой Сеггепа 1ойн1ма с учетом участия протона имеет следующий вид:

V»

[Е0]

К

[НЧ

25 56

12

2j

■Й А 1 1 к21 Kfl 1 СН+] 1 1

ít^X;) + RT: (RT:(1+ÍI?FT)+í)) го+ Ш

Г 1 ( 4 )

¡i

Схема 3 описывает действие фермента в соответствии с. уравнением 4.

схенлЗ

>

i

Ш Ш ¥внт*^вш Ш-внШ

Kii м ¿o К

¿éOfl

J kr*W

^Ш^-вШ^в'Еп J±bh Е/ вти

лЧлн-г) ' i J*

Предложенная схема не содержит принципиальных отличий от литературных схем для лакказы Rhus vernisifera и Coriolus versicolor. Основным отличием рН-завйсимостей кинетических параметров ферментов из Corjolus versicolor и Cerrena maxima является то, что величина тангенса наклона логарифмов параметров для лакказм Cerrena maxima не превышает единицы. Полученные результаты свидетельствует, что это отличие не является характеристическим для возможности проявления у фермента злектрокатаяитических свойств.

В литературе имеются данные о "пинг-понг" механизме катализа у лакказы из Rhus vernisifera и Córiolus versicolor. В работе установлено это свойство также для ферментов из Coriolus hirsutos и Cerrena maxima, что позволяет предположить определенную общность данного типа механизма катализа для лакказы иг большинства продуцентов. Таким образом, перспективность поиска лакказы, обладающей энектрокаталитическими свойствами, в различных источниках должна оцениваться достаточно высоко.

ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ЛАККАЗЫ'В ПРАКТИКЕ.

1. Кислородный газодиМмзионный электрод на основе иммобн-

пизованной лакказы.

Способность лакказы катализировать реакцию электровосстанов-)1ения кислорода дает возможность использовать &тот фермент в малоточных элементах типа металл-воздух. Нами совместно с. ИЗУМН им. А.Н.фрумкина был разработан воздушный газоднффузионный элек-

трод на основе иммобилизованной лаккази. Конструкция электрода предусматривает диффузии кислорода воздуха к катализатору непосредственно из газовой фазы через тело электрода. В этих условиях между иммобилизованным ферментом и газовой фазой находится лишь тонкий слой раствора, что значительно облегчает диффузию.

На рис. 5 представлены поляризационные кривые, записанные для газодиффузионного электрода на воздухе и в атмосфере кислорода.

Рис.5. Поляризационные кривые злектровосстановления кислорода, записанные на газодиффузионном электроде с иммобилизованной лак-казой: на воздухе (1); в атмосфере кислорода (2). Условия: 0,1 М цитратный буфер рН - 5>1.

V

Видно, что ток злектровосстановления кислорода для электрода в

Я

воздушной атмосфере значительно ниже, чем в атмосфере кислорода, особенно при большой поляризации. Этот факт объясняется разными концентрациями электрохимически активного компонента в газовой фазе и подтверждает газодиффузионный характер электродного процесса;

При значениях силы тока 20 мкД удается реализовать потенциал электрода свыше ИЗО мВ. Установлено также, что при малых значениях силы тока инактивация электрода связана только с. термоинактивацией фермента, специфической электрохимической инактивации не происходит. Оптиьизирован ряд параметров изготовления электрода. Изучена стабильность электрода при малых токовых нагрузках. Показано, что в этих условиях в течение 28 суток среднее падение потенциала электрода составляет ~ 1 мВ/сутки. Это позволяет расчитывать на стабильны» работу электрода в течение 3-4 месяцев.

?. Ферментный электрод дня определения полнФенольных соединении и лигнинов на основе иммобилизованной яакказы.

Способность лакказм катализировать реакции окисления полифенолов делает этот фермент перспективным для анализа этих соединений, а также их полимерных комплексов - лигнинов. Нами был разработан ферментный электрод для определения суммы фенольных соединений и лигнинов (суммарного фенольиого эквивалента) на основе кислородного электрода типа Кларка и иммобилизованной.лакказы. На рис.6а представлена зависимость конечного отклика кислородного электрода от концентрации гидрохинона и пирокатехина., Очевидно, что эта зависимость будет совпадать для всех дифено-

а

Рис.б. Зависимость конечного отклика ферментного электрода от концентрации анализируемого вещества. Условия: К-ацетатный буфер; рН = 4,5; 1 = 25°С. а - калибровочный график для определения полифенолов: О - пирокатехин; х - гидрохинон, б - калибровочный график для определения лигнинов: 1 - общий лигнин; 2 -лигнинсульфатнмй комплекс (Котласский ЦБК).

лоб, т.к. величина конечного отклика электрода представляет собой меру количества кислорода, затраченного на окисление данного субстрата: Калибровочные графики для двух образцов лигнина приведены на рис. 66.

Лакказа была иммобилизована на BrCM-активированнэй агарозе и ДЗАЗ-еолокнистой целлюлозе с использованием реагента Вудворда. Последний носитель обладает хорошими гидродинамическими характеристиками и позволяет производить измерения в проточном режиме. Кроме того, иммобилизация фермента на ДЗйЗ-волокнистой целлюлозе приводит к значительной стабилизации катализатора. Так, лакказа из Coriolus hi»>sutus и Coriolus versicolor, иммобилизованная на этом носителе не изменяет своей активности в течение месяца при комнатной температуре, в то время как нативнмй фермент е этйх условиях теряет 75-90% исходной активности.

Условия практического применения ферментного электрода требуют максимальной стабильности и активности катализатора. Нами было установлено, что из ферментов Coriolus hirsutus, Coriotus versicolor и Cerrena maxima в наибольшей степени этим требованиям отвечает лакказа из Coriolus hirsutus. Этот фермент следует рассматривать, как наиболее перспективный для аналитических целей. *

5. Биозяектрокаталитические системы в молекулярной электронике.

Способность биоэлёктрокаталитических систем трансформировать химический сигнал в электрический позволяет говорить о перспективности использования безмедиаторного эдектрокатадиза в процессах молекулярной биоэлектроники. Параметры современных оптических систем памяти лимитированы точностью механической адресации сигнала. Нами предложена система оптобиохипическон памяти, которая в перспективе может быть реализована на уровне субмикронных и молекулярных размеров.

Система представляет собой регистр сдвига (РС) - полиферментный комплекс, задающий биоколебательную реакцию. В результате вдоль РС генерируется волна некоего вещества - химического сигнала (ХС). Данный ХС трансформируется в электрический ферментами-индикаторами, иммобилизованными на общей шине (ОШ) и формиру-

кицими элементы связи (ЗС) (рис. 7), В результате, сдвигаясь по РС вдоль ОШ, волна КС наводит на ОШ электрический потенциал, причем только в тех местах ОШ, где наличиствуют ЭС. временная зависимость потенциала ОШ представляет собой информационную развертку (рис., 7). .

элехтрад ¿мЗнени«

потенцией

д_I_I—

,0 , О , ¿7 , У . ¿ ,0 . / . /

инФОРняция В дЗоичмон ходе

Рис.7. Считывание информации в системах оптобиохимической памяти.

1

I, Рис.8. Запись информации в сис-

те.мах оптобиохимической памяти.

зс систетРС

&/7/М

Для того чтобы расположить ЭС вдоль ОШ в заданном порядке необходимо модифицировать ферменты-индикаторы соответствующим фо-тос.енсибилизатороп. Последний имеет свойство необратимо разрушать фермент-индикатор при одновременном воздействии на него светового излучения и волны ХС. Ни один из этих факторов по отдельности не разрушает фермент-индикатор. Т.о.' для -записи информации необходима промодулированная во времени засветка ОШ при прохождении вдоль нее волны ХС (рис. 8).

Конкретным примером подобной системы может явиться модельная система на основе биферментного комплекса уреаза-протеиназа, задавшего параметры концентрационной волны протонов водорода. Где, протеиназа обуславливает генерацию протонов, а уреаза - их диссипацию. ЗС сформирован иммобилизованной лакказой, наводящей на ОЩ лотециал за счет злектровосстановления кислорода в момент прохождения через ЗС. концентрационной волны протонов, т.е. в условиях низкого рН (схема 4). Сйеиа 4.

Система регистра сдвига.

1. Н+ + Ei EiH+

2. ВОNHC + НгО ■> BOOH + KIH£C

3. BOOH --> BOO" + H*

4. C0(WH2)2 + 2H+ + H20 2NH* + C02 Система элемента связи.

1- н+ + Еинд. ' Н*Еинд.

НЕ ,

2. 4Н+ + 4е + 02--ШШ-* 2НгО

Фотодинапичекая система.

tv, + + р (активный) _> г (инак^ивированный)

rv п ^инд. синд.

где Ei - протеиназа, Е2 - уреаза, Ellt,„ - дакказа, BOWHC - субст-

ИпД.

рат протеиназм.

Запуск концентрационной волны протонов осуществляется инициированным подкислениеп входа системы PC.

Предложенные подходы к реализацйм системы оптобиохимической памяти являются на сегодняшний день, по-видимому, единственной альтернативой механическим способам адресации информации.

выводы.

1. Разработан способ очистки, подучены гомогенные препараты лак-казы из базидиальных грибов Coriolus hirsntus и Cerrena maxima. Определен ряд молекулярных характеристик Ферментов

из этих источников.

2. Изучена стационарная кинетика окисления кислородом субстратов - доноров электронов в присутствии яакказы из Coriolus hirsutus и Cerrena maxima. Показано, что механизм действия этих ферментов относится к группе "пинг-понг" механизмов. Дня лакказы Cerrena maxima предложен кинетический механизм дейст-

вия с учетом стадий протонировэния.

3. Показана способность лакказы из Coriolus hirsutos и Cerrería maxima катализировать реакции электровосстановления кислорода до воды по безмедиаторному механизму. Исследован характер ре-докс-преврящений медьсодержащих нростетических групп лакказы и церулопяазмина. Показано, что характер редокс-превращений активного центра фермента не определяет способности последнего катализировать электродные реакции по механизму безмедиа-торного электронного транспорта. Установлено, что церулоплаз-иин не способен катализировать реакцию электровосстановления' кислорода. Выдвинуто предположение о том, что возможность проявления электрокаталитических свойств окислительно-восста-ноеитеяьного фермента определяется подчинением фермента катализу по механизму типа "пинг-понг".

4. Разработан кислородный газодиффузионный электрод на основе иммобилизованной лакказы. При малых токовых нагрузках электрод Функционирует в течение 700 часов при сохранении основных рабочих параметров. Подобные электроды могут применяться в малоточных источниках тока типа металл-воздух.

5. Разработан ферментный электрод для анализа полифенолов и лм-гнинов на основе лакказы, иммобилизованной на ВгСМ-активиро-ванной эгзрозе и ДЭАЗ-вонокнистой целлюлозе. При использовании последнего носителя достигнута значительна стабилизация фермента. „

6. Предложены подходы у. реализации устройств биооптнческой памяти на основе сопряженных фотодинамических, бмокояебательных и биозлектрокаталитических систем.

Основные иатериалы диссертации изложены р следующих работах:

1. Гиндилис й.Л., Ярополов й.И., Березин И.В. Роль механизма действия фермента в проявлении его эдектрокаталитических свойств// Докл. АН СССР.-1987.-Т.293, N 2.-С.383-398.

2. Ярополов й.И., Гиндилис. fl.i1. Связь между электрохимическими превращениями простатической группы и каталитической активность)« лакказы// Электрохимия -1985.-Т;21, М 7.-0.982-993.

3. Гиндилис fl.i1. и др. Выделение и свойства лакказы из базиди-

ального гриба Coriolus hirsutus (Fr.) Quel/ Гиндилис ft.Л., Шажина E.O., Баранов Ш.А. и др.// Биохимия-1988.-Т.53, N 3.-С.545-550.

4. Богдановская В.А. и др. Использование углей для создания ферментного электрода/ Богдановская В.Й., Гаврилова Е.Ф., Шим-шелевич Я.Б., Ярополов А. И., Гиндилис Я.Л.// Электрохимия-1985,-Т.21, N 6.-С.1147-1149.

5. Gfi'indilis fl.L., Yaropolov A.I., Malovik V.,Ari enzyme electrode for detection of lignins and polyphenols/ XI Jena. Symposium on Biophysical Chemistry, Erfurt (GDR) -1986.-P.25.

6. Гиндилис А. Л., Шажича E.O., Баранов й.й. Кинетические закономерности катализа лакказой из базидиального гриба Coriolus

' hirsutus (Fr.) Quel, Таллин. Тезисы докладов VII республиканской конференции молодых ученых-химиков.-1967.-Н.1.-С.93.

7. Гиндилис А.Л. и др. Оптическая память на биохимической структуре/ Гиндилис й.Л.,Киселев Б.С., Никаэлян А.Л. и др.// Тезисы докладов III Всесоюзной конференции по вычислительной оптоэлектронике, Ереван.-1987.-Ч.1.-С.127-128.