Структурно-генетическая организация лакказ базидиальных грибов

Черкашин, Евгений Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-генетическая организация лакказ базидиальных грибов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-генетическая организация лакказ базидиальных грибов"

¡А-

На правах рукописи

ЧЕРКАШИН Евгений Александрович

СТРУКТУРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАККАЗ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ

Специальность: 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 8 2009

Москва - 2009

003473540

Работа выполнена в лаборатории «Молекулярные основы биотрансформаций» Учреждения Российской академии наук Института биохимии имени А.Н. Баха РАН и на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор В. И. Тишков

доктор биологических наук, профессор О. В.Королева

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор А. П. Синицын доктор биологических наук А. А. Леонтьевский

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Защита состоится "Ц " Щою*. 2009 года в У*- часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии имени А.Н. Баха РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1.

Автореферат разослан" " ^и^_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук А' ^^ А.Ф.Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Разработка эффективных технологий «зеленой» химии, способных заменить существующие химические технологии, обуславливает возрастающее внимание к поиску ферментов и созданию на их основе альтернативных и новых биокаталитических процессов. Одним из таких ферментов является лакказа (/т-дифенол: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2). Лакказа принадлежит к семейству медьсодержащих оксидаз и катализирует реакцию восстановления молекулярного кислорода различными органическими и неорганическими соединениями до воды, минуя стадию образования пероксида водорода. На сегодняшний день выделено и охарактеризовано более 100 ферментов этого типа из различных источников: грибов, растений, насекомых, бактерий. Большая часть лакказ выделена из базидиальных грибов, где этот фермент участвует в процессах деструкции лигнина, синтеза пигментов, детоксификации и синтеза гуминоподобных веществ. Функция лакказы в растениях связана с процессом образования лигнина. В насекомых лакказа участвует в процессе скперотизации, а также играет важную роль при окислении токсичных соединений. Согласно данным ряда исследователей лакказы или лакказоподобные ферменты присутствуют в бактериях и вовлечены в синтез белка оболочки эндоспор.

Ионы меди в биологических системах классифицируют согласно их оптическим и магнитным свойствам на три типа: Т1, Т2 и ТЗ. В активном центре лакказы присутствуют все три типа, однако, несмотря на консервативность его строения, каталитические характеристики различных лакказ значительно отличаются, что, по мнению ряда авторов, определяется значением как окислительно-восстановительного потенциала иона меди первого типа, так и строением белковой и углеводной частей фермента. В этой связи, особый интерес для исследования представляет группа лакказ с высоким значением окислительно-восстановительного потенциала иона меди первого типа Т1.

В настоящее время получены и опубликованы данные по структуре более 30 лакказ из различных источников. Однако даже наличие структурных данных все еще

не позволяет установить однозначную взаимосвязь между структурой фермента и механизмом его действия и ответить на важные с практической и фундаментальной точки зрения вопросы, такие как: 1) что обеспечивает ферменту высокий окислительно-восстановительный потенциал медного центра (Т1); 2) какова роль отдельных аминокислотных остатков, формирующих этот центр; 3) что обеспечивает широкую субстратную специфичность фермента на структурном и молекулярном уровнях. Таким образом, изучение генетической организации лакказ и установление структурно-функциональных особенностей данных ферментов является актуальным как с фундаментальной (принципы организации и функционирования медьсодержащих оксидаз), так и с практической точки зрения (создание рекомбинантных ферментов и их биотехнологическое применение).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было сравнительное изучение генетической и структурной организации высоко и средне редокс-потенциальных лакказ базидиомицетов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Клонирование генов лакказ из базидиомицетов Corioíus hirsutus, Сеггепа maxima, Coriolus zonatus, Coríoíopsis fulvocinerea, Antrodiella faginea и P/eurofus ostreatus с хромосомной ДНК и определение их полных нуклеотидной и аминокислотной последовательностей.

2) Определение экзон-интронной структуры генов исследуемых лакказ и их сравнительный анализ.

3) Уточнение ранее полученных структур базидиальных лакказ из C.hirsutus, C.maximavi C.zonatus на основе полученных аминокислотных последовательностей.

4) Моделирование структур лакказ из С.fulvocinerea и P.ostreatus на основе полученных аминокислотных последовательностей.

5) Структурный анализ окружения активного центра ионов меди Т1 и определение аминокислотных остатков, которые могут влиять на каталитические свойства фермента.

Научная новизна. Впервые проведено систематическое исследование геномной организации высоко и средне редокс-потенциальных лакказ из C.hirsutus, C.maxima, C.zonatus, CMvocinerea, A.faginea и P.ostreatus. Установлено, что высоко редокс-потенциальные лакказы содержат 9-10 интронов, причем их длина и положение совпадают. Средне редокс-потенциальные лакказы характеризуются наличием большего числа интронов. Высказана гипотеза о существовании консервативных и вариабельных интронов в генах лакказ базидиомицетов. Установлена локализация трех интронов, характерная только для лакказ базидиальных грибов. Анализ базы данных GenBank подтвердил высказанную гипотезу. Показано, что разделение лакказ на группы в зависимости от величины окислительно-восстановительного потенциала подтверждается особенностями

генетической организации. Последовательность гена лакказы из C.hirsutus депонирована в банк данных [GenBank Accession code: АСС43989].

Проведен сравнительный анализ аминокислотных остатков в активном центре Т1. Показано, что на редокс-потенциал может влиять наличие в положении 206 остатков Asn или Asp, а так же наличие водородной связи между остатками Glu460 и Ser113 (нумерация остатков приведена по структуре лакказы C.hirsutus).

Показано, что основные структурные отличия между высоко и средне потенциальными лакказами связаны с особенностями третичной структуры фермента - петлями, формирующими вход в субстратсвязывающий карман.

Практическая значимость работы. Результаты сравнительного исследования генетической организации генов высоко и средне редокс-потенциальных лакказ очень важны для поиска штаммов-продуцентов высоко потенциальных лакказ. Разработанные методы клонирования лакказ с хромосомной ДНК, являются быстрыми методами оценки типа лакказ (высоко, средне потенциальные), применимыми к широкому кругу базидиальных штаммов продуцентов. Проведенное исследование геномной организации лакказ является основой для проведения экспериментов по белковой инженерии данных ферментов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих международных и российских конференциях: The Fourth Moscow International Congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development" (Moscow, Russia, 2007), Международные конференции «Ломоносов -2006», «Ломоносов - 2007» (Москва, Россия, 2006, 2007), 15 Международный микологический конгресс «XV Congress of Europian Mycologist» (С.-Петербург, Россия, 2007), III Конференция молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике (Киев, Украина, 2007), Международная конференция «Биокатализ-2007» (С.-Петербург, Россия, 2007), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008), 4th European meeting in Oxizymes (Helsinki, Finland, 2008), The Fifth Moscow International Congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development" (Moscow, Russia, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 9 тезисов конференций. Обе статьи опубликованы в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация содержит j j страниц печатного текста, рисунков, 11

таблиц и ссылок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор штаммов для исследования. В качестве объекта исследования были выбраны следующие штаммы - продуценты лакказ из коллекции Ботанического Института им. Комарова РАН (ЛЕ(БИН)):

Coríoíus hirsutas ( Trame tes hirsuta (Wulfen), Pilât, 1939);

Coriolus zonatus ( Trametes ochracea (Pers.), Gilbe&Ryvarden, 1897);

Cerrena maxima ( Trame tes maxima (Mont.), A. David&Rajchenb, 1985);

Corio/opsis fuivoœnerea (Corioiopsis caperata, Murrill, 1908);.

Pleurotus ostreatus ((Jacq.), P. Kumm&Pilzk,1871);

Androdieiia faginea {Vampola et Pouzar, 1996);

Xeruia radicata (Relhan&Dôrfelt, 1975).

Следует отметить, что классификация базидиальных грибов достаточно запутана и поэтому в работе будет использовано то название штамма, которое он имеет в коллекции ЛЕ(БИН)а со ссылкой на современное название согласно CABI Bioscience и базе данных CBS (www.indexfungorum.org).

По предварительным биохимическим исследованиям лакказы, продуцируемые базидиомицетами С. hirsutus, C.zonatus, C.maxima, A.faginea и C.fulvocenerea, являются высоко редокс-потенциальными и имеют потенциал иона меди Т1 > 700 мВ [Buldrian P. et а!., 2006]. В то время как лакказы, продуцируемые базидиомицетами P.ostreatus, и X.radicata, имеют средний редокс-потенциал.

Определение наличия генов лакказ в геномах базидиальных грибов. Лакказы базидиальных грибов кодируются сложным семейством генов, причем в одном штамме может содержаться как один, так и несколько генов изоформ фермента. Несмотря на ограниченное количество публикаций о геномной организации грибных лакказ, общей чертой лакказных генов можно считать высокую гомологию участков нуклеотидной последовательности, кодирующих аминокислотное окружение ионов меди активного центра фермента. Проведенный анализ более 100 аминокислотных последовательностей лакказ, имеющихся в базе данных GenBank, позволил выделить 4 консервативных для всех лакказ участка, причем аминокислотные остатки, входящие в их состав, отвечали за координацию ионов меди. На основании нуклеотидных последовательностей этих участков были сконструированы и синтезированы праймеры (табл. 1).

Праймеры LacA1 For и LacAIL For были сконструированы на один и тоже же участок гена и отличались только в 6 триплете ТТ(ТС) и (CT)T(GC) соответственно. Синтез двух практически одинаковых праймеров обусловлен наличием с равной вероятностью в указанном положении как остатка фенилаланина, так и остатка лейцина.

Таблица 1

Универсальные праймеры на высоко консервативные участки гена лакказ.

Название Последовательность

ЬасА1 Яог 5'-СА(СТ) ТСв СА(СТ) Св{АТ) ТТ(ТС) ТТ(ТС) СА(АС)-3

1асА11. Рог 5'-СА(СТ) ТС в СА(СТ) СС(АТ) ТТ(ТС) (СТ)Т(СС) СА(Ав)-3'

1_асА2 Рог 5'-Т(ТА)(ТС) ТСС ТА(ТС) СА(СТ) (ТА)(С6)Т СА(СТ) (СТ)ТА-З'

1_асА4 5'-(А0)Т6 (АТ)СС (Двуте (ТА)АС (АО)ТС (СА)АА (АТ)СС (АС)ТС-З'

1_асА5 5'-(АС)ТС (Ав)АА (АС)ТС {АСТ)АТ (А0)Т6 (АС)СА (АС)Т6-3'

Вышеуказанные праймеры были использованы для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) на геномной ДНК исследуемых штаммов. В результате для всех исследуемых штаммов за исключением Х.гасИса1а были получены соответствующие ПЦР-продукты. Полученные данные свидетельствовали об отсутствии генов лакказы у Х.гасИса/а. Для подтверждения результатов ПЦР, было проведено поверхностное и глубинное культивирование исследуемых штаммов на оптимизированной для максимальной продукции лакказ среде. Все изученные штаммы, за исключением Х.гасИса1а, секретировали при культивировании лакказу в культуральную жидкость, из которой были выделены очищенные препараты фермента.

Разработанная ПЦР-методика является универсальной для детекции генов лакказ в различных штаммах базидиомицетов и позволяет в короткий срок определять наличие или отсутствие гена лакказы, его частичную нуклеотидную последовательность, и, как следствие, оценить уровень гомологии этой последовательности с уже известными данными. Это позволяет применять ее для экспресс-метода поиска грибных продуцентов лакказ.

Неоспоримым достоинством данной методики, следует также считать, возможность определения с помощью инвертной ПЦР полной последовательности гена лакказы, включая интроны даже в случаях, когда неизвестны ни аминокислотная, ни нуклеотидная последовательности.

Определение полной нуклеотидной последовательности, с использованием геномной ДНК обладает рядом достоинств по сравнению с методом определения последовательности через клонирование кДНК, поскольку исключает возможные ошибки, которые могут возникнуть при проведении реакции обратной транскрипции. Кроме того, данный метод позволяет определить экзон-интронную структуру гена лакказы.

Определение аминокислотной последовательности лакказы С./м'гвий/в клонированием гена с хромосомной ДНК. Для определения полной нуклеотидной

последовательности лакказы из базидиомицета С.МгзиШз было проведено ампли-фицирование полноразмерного гена этого фермента с хромосомы при помощи ПЦР.

Участок аминокислотной последовательности С.МгвиШз, полученный путем трансляции нуклеотидной последовательности с кДНК, был использован для поиска гомологичных аминокислотных последовательностей в базе данных СепВапк. Высокий уровень гомологии (более 90%) наблюдался для аминокислотных последовательностей высоко редокс-потенциальных лакказ из базидиомицетов С. тахт а и Т^етсо/ог, определенных на основании данных рентгено-структурного анализа [РОВ сос!е:2Н5и,1КУА]. Для конструирования праймеров был проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей этих лакказ и выявлены консервативные аминокислотные участки. На основе анализа и данных по частоте встречаемости кодонов для СМгвиШз, был проведен дизайн вырожденных праймеров, которые кодируют консервативные участки аминокислотной последовательности лакказ. Нукпеотидная последовательность лакказы из С.Л//5£/Л/5, полученная секвенированием кДНК, и последовательность сигнального пептида для Тлегэ/соЬг были использованы для синтеза вырожденного праймера, который с высокой степенью вероятности применим для определения нуклеотидных последовательностей, кодирующих сигнальные пептиды лакказ других штаммов. Таким образом, были разработаны и синтезированы 8 праймеров для определения нуклеотидной последовательности лакказы из С.ЫгэЫиз, которые могут быть использованы и для определения нуклеотидных последовательностей других высоко потенциальных лакказ (табл. 2).

Разработанные праймеры были использованы для получения ПЦР-фрагментов, нуклеотидные последовательности которых были определены методом секвенирования. Поскольку не все пары праймеров давали выход целевого ПЦР-продукта, определить полную нуклеотидную последовательность гена лакказы не удалось, что вызвало необходимость синтеза дополнительных праймеров комплементарных к уже определенным участкам гена лакказы из С.МгзиШэ.

Нуклеотидные последовательности ПЦР-фрагментов, полученных с помощью дополнительных праймеров (табл. 3), позволили определить всю последовательность гена лакказы из С.ЫгъиШв. Полная нуклеотидная последовательность гена лакказы имела длину 2120 пар нукпеотидов. По данным кДНК и рентгено-структурного анализа аминокислотная последовательность лакказы из С.ЫгзиШ$ состоит из 500 аминокислотных остатков, что составляет 1500 пар нукпеотидов. Следовательно, 620 нуклеотидов в гене фермента локализованы в интронах, что составляет около 30% от общей длины последовательности. Полученная таким образом нукпеотидная последовательность была транслирована в аминокислотную. Для определения правильной рамки считывания при трансляции использовались аминокислотные последовательности, определенные с помощью

клонирования кДНК и рентгено-структурного анализа. Положение интронов локализовали на основании GT-AG сайтов сплайсинга в интронах [Mount S. et at., 1982]. Таким образом, установлено, что ген лакказы из C.hirsutus состоит из 11 экзонов и 10 интронов.

Таблица 2

Праймеры, использованные для клонирования генов высоко редокс-потенциальных лакказ.

Название Последовательность

Сигнальный пептид Lac1For 5'- ATG TCG AGG TTT CAC TCT CT(TG) TTC (GA)C(TC) TTC (GA)TC -3'

N-конец гена Lac2For 5'- GCC GAC CT(AC) ACC АТС ACC AAC GC -3'

Lac3For 5 - CAC TGG CA(CT) GG(CT) TTC TTC CAG CA(GT) G-3'

Lac4For 5 - ACC TTC TGG TA(CT) CAC AGT CAC TTG TC(CG) AC- 3'

Lac4Rev 5'- GT (CG)GA CAA GTG ACT GTG {GA)TA CCA GAA GGT -3'

Lac5For 5'-GT(CG) GAC ТСС АТС CAG АТС TTC GC(GC) GC -3'

Lac5Rev 5 - GC (GC)GC GAA GAT CTG GAT GGA GTC (CG)AC -3'

Lac6For 5'- CAC CC(GC) TTC CAC TTG CAC GG(GC) CAC- 3'

Lac6Rev 5'- GTG (GC)CC GTG CAA GTG GAA (GC)GG GTG -3'

Lac7Rev 5'- С GAT GTG GCA GTG GAG GAA CCA (GC)GG -3'

С-конец гена LacSRev 5'- TTA CTG GTC (GA)CC (GC)GG (GC)GC GTT CG -3'

Таблица 3 Дополнительные праймеры для клонирования гена лакказы из C.hirsutus.

Название Последовательность

LacH1For 5'-ATG TCG AGG TTT CAG TCT CT{TG) CT(TG) AC(CG) TTC ATC-3'

Lac9For 5'- ACC TTC AGC ATT GAT GGT CAC AAC TTG -3'

LaclOFor 5'- CAG GAC CTC CTG CCC TCC GGC AGT GTA TAC -3'

Lac11 Rev 5 - CGC GTC GTA (GC)GT CGG GCA CAG GTC (CG)GA CCA -3'

Lac8HRev 5'- TTA CTG GTC (GA)TT (GC)GG GTC (GC)AG CG -3'

Определение полной аминокислотной последовательности высоко редокс-потенциальных лакказ C.maxima, C.zonatus и C.fulvocinerea. Для

определения полной нуклеотидной последовательности лакказ из базидиомицетов C.maxima, C.zonatus и C.fulvocinerea использовали ту же стратегию клонирования и те же праймеры, как и в случае лакказы из C.hirsutus.

В результате исследований было установлено, что гены лакказ из C.maxima и C.fulvocinerea содержат по 10 интронов каждый, а фермент из C.zonatus - 9 интронов. Аминокислотная последовательность (без сигнального пептида) лакказы из C.maxima включает 499, а лакказ из C.fulvocinerea и C.zonatus - 497 аминокислотных остатков. В случае лакказы из C.maxima удалось установить и последовательность сигнального пептида, длина которого составила 21 аминокислотный остаток.

Определение аминокислотной последовательности средне редокс-потенциальной лакказы из P.ostreatus. Для средне редокс-потенциальной лакказы из P.ostreatus использование праймеров для клонирования высоко редокс-потенциальных лакказ не давало выхода целевого ПЦР-продукта, и в дальнейшей работе использовали универсальные праймеры для лакказ (табл. 1). Для пары праймеров LacA1 For- LacA4 Rev был получен ПЦР-фрагмент размером 1200 п.н. Определение нуклеотидной последовательности этого фрагмента показало, что он обладает 100% гомологией с лакказой РОХ1 [GenBank Accession code: Z22591] из P/eurotus sp. 'Florida'. Поэтому для разработки праймеров использовали имеющуюся в банке данных нуклеотидную последовательность лакказы РОХ1. В результате были синтезированы праймеры на 5'- и 3'- участки гена (табл. 4).

Таблица 4

Праймеры, использованные для клонирования лакказы из P.ostreatus.

Название Последовательность

Сигнальный пептид LacPOl For 5-ATG TTT CCA GGC GCA CGG ATT CTC GC-3'

LacP04 For 5-CCC AATTTC ACG TTC TCG АТС GAC GGT CAC-3'

LacP04 Rev 5'- GTG ACC GTC GAT CGA GAA CGT GAA ATT GGG -3'

LacP05 For 5'-CCA CTT GAA AAT CCT GGT GCT CCT GG-3'

LacP05 Rev 5'-CCA GGA GCA CCA GGA TTT TCA AGT GG -3'

С-конец гена LacPOl 1 Rev 5 - СТА GAC TCG АТС TTA TGG AAA CG -3'

Использование этих лраймеров дало возможность определить нуклеотидную последовательность лакказы из P.ostreatus, которая полностью совпала с последовательностью лакказы РОХ1, определенной ранее [GenBank Accession code: Z22591]. Длина нуклеотидной последовательности составляет 2756 п.н. Аминокислотная последовательность лакказы была получена прямой трансляцией с нуклеотидной последовательности. Анализ полученной последовательности показал, что она содержит 20 экзонов и 19 интронов.

Определение аминокислотной последовательности лакказы из A.faginea Базидиомицет A.faginea, а так же экспрессируемая им лакказа, в литературе описаны ранее не были. Поэтому для определения нуклеотидной и аминокислотной последовательности лакказы из этого организма использовалась методика инвертного ПЦР. Для реализации данного подхода ключевым шагом является определение нуклеотидной последовательности внутренней области ДНК исследуемого образца (300-500 п.н). В качестве праймеров для получения внутренней области гена использовали пару универсальных праймеров для лакказ-LacA1 For-Laca5 Rev. В результате амплификации были получены два ДНК-фрагмента длиной около 1100 п.н. и 1300 п.н. После секвенирования этих фрагментов, были обнаружены значительные отличия в их нуклеотидной последовательности. Фрагмент размером 1100 п.н имел 94% гомологию с лакказой из Т.versicolor [GenBank Accession code:AY081188]. Фрагмент размером 1300 п.н. содержал многочисленные «вставки» в нуклеотидной последовательности, которые не встречались в полных нуклеотидных последовательностях генов изучаемых лакказ. Поэтому было проведено клонирование гена содержащего более легкий ПЦР-фрагмент. Для этого были разработаны и синтезированы новые праймеры, обеспечивающие проведение инвертного ПЦР (табл. 5).

Таблица 5

Праймеры для проведения инвертного ПЦР (лакказа из A.faginea).

Название Последовательность

LacAfl For 5-CGC AGT ACT GTG ACG GTC TGA GGG GGC-3'

LacAf3 Rev 5-TGG AGG TCA АСА TTG ACG CGT TAT GTC АСА АСА AAG-3'

LacAf4 For 5-TTC CAC TTG CAC GGT CAC GCG TTC GCC-3'

LacAfl Rev 5-GCC CCC TCA GAC CGT CAC AGT ACT GCG-3'

LacAf6 Rev 5-GTT CAC CAC GAC GGC CTG GCG AGA AAA GC-3'

Гидролиз геномной ДНК проводили рестриктазами Hindlll, EcoRI, BamHI и Pst в стандартных условиях. В результате в случае рестриктаз Hindlll и EcoRI при амплификации с инвертными праймерами были получены ПЦР-фрагменты, которые были высокогомологичны лакказе из T.versicolor. Таким образом, была полностью

определена нуклеотидная последовательность лакказы из A.faginea. Полученная нуклеотидная последовательность была транслирована в аминокислотную. Анализ базы данных GenBank показал, что полученные нуклеотидная и аминокислотная последовательности были гомологичны на 94 и 98% соответствующим последовательностям лакказы из базидиомицета T.versícolor. Полная длина гена составила 2002 п.н., организованных в 9 экзонов и 8 интронов.

Сравнение аминокислотных последовательностей исследуемых лакказ. Сравнение аминокислотных последовательностей исследуемых лакказ с последовательностями средне редокс-потенциальных лакказ из Coprinus cinereus и Rigidoporus íignosus приведено на (рис. 1). Видно, что высоко редокс-потенциальные ферменты имеют высокий уровень гомологии между собой (>80%). Средне редокс-потенциальная лакказа из P.ostreatus имеет более низкий уровень гомологии 63% по аминокислотной последовательности по отношению к ферменту из C.hirsutus и характеризуется заметными отличиями (делеции/вставки) в аминокислотной последовательности. Различия имеют преимущественно точечный характер и, как показал анализ структур, находятся вдали от активного центра фермента. Интересно также отметить, что дипептид Ala-Ala 452-453, который присутствует в лакказах из C.hirsutus, C.maxima и A.faginea (Т.versicolor) характерен только для семейства Trametes (Coríoíus).

Экзон-интронная структура генов исследуемых лакказ. Большинство нуклеотидных последовательностей генов лакказ, имеющихся в базе данных, получены секвенированием кДНК и не содержат интронов. Последовательностей, полученных клонированием с хромосомной ДНК, описано около 30. Анализ зкзон-интронной структуры генов исследуемых лакказ показал, что для высоко редокс-потенциальных лакказ характерно наличие меньшего числа интронов (8-10), чем для средне редокс-потенциальных. Эти данные хорошо согласуются с результатами анализа экзон-интронной структуры для других высоко и средне редокс-потенциальных ферментов. Так средне редокс-потенциальные лакказы из C.cinereus, P.ostreatus (РохС) и R.tignosus содержат 19, 21 и 12 интронов соответственно. Все исследованные в данной работе лакказы имеют в трех положениях интроны, идентичные по локализации и длине (положения 80, 90 и 210) (рис. 2). Анализ базы данных показал, что данные интроны характерны для всех бззидиальных лакказ с описанной экзон-интронной структурой. У лакказ из аскомицетов интроны в данных положениях не обнаружены, что позволяет высказать предположение об общности экзон-интронного строения генов у базидиомицетов. Также следует отметить наличие у исследованных в данной работе высоко редокс-потенциальных лакказ четырех интронов, не характерных для средне редокс-потенциальной лакказы из P.ostreatus (положения 160, 240, 330 и 370) (рис. 2). Анализ последовательностей средне редокс-потенциальных лакказ из

Т.риЬеэсепз (1_ас1), ¿.(¡дг/пиз, Я.Ндпозиэ, С.стегеив и в./иаёит показал отсутствие у них интронов в этих положениях это свидетельствует о том, что эти четыре интрона характерны только для высоко редокс-потенциальных лакказ.

"О s о

¡r

ш X

га

2 s

s о н

X Е X

о §

ш Ь о ш ш

О-X

Sí ti ш

С.biz 1 С.max X С. son 1 A. fag 1 С.ful 1

Р.OSt 1

Я.Ii g 1 С. ein 1

С.Ыт 90 С.max 90 C.zon 85 Д. Сад 90 С. ful SO Р.ose 99 Я.Ид 91 С.ein 90

-AVGPVADLT ITDAAVSPDG F-SRQAVWN G---------VTPGPLVAGN IGDRFQLNVI DNLTNHTWLK STSIHWHGFF QHGTNWADGP AFINQCPISP 89

....................................................................................................................................89

---------GF....IT.. K..N..I........................К..........V......А 84

..........G.....IT. . К. .И...........................К.................S 89

................G.....IT.. К..............................К..........V......А - 89

AR SDPTTNGTSE TLT.V. .Q. . К. .N.....LNQ.SDT.... T..........S.ST.......V.....AS 98

.TAE .---------T.IA..IT.. .D....I... .Q. .DAK.RR A..........А. .ТЕМ.....V.....I. 90

------------N. .1

-GI......A .SN.. .

-CI. .1.....S N.DI

-.I..TG.MY . VNED. -.ATVAL..H .LN.NLD AI.NS.DTM. L.N.N. .

-T.S TGA.S

----VH. . . IR.G KN.N.E...V ND.D.P...R P.......L. .R.

____A DGV.

GHSFLYDFQV PDQAGTFWYH SHLSTQYCDG LRGPFWYDP NDPHASRYDV DNDDTVITLA DWYH----TA AKLGPRFPGG ADATLINGKG RAPSDSPA-E

..............................................................................L................ТТ. - .

....----V......AI..............S. .NLN. - .

. . . .----V......A. .L............S. .TTT. -D

....----. . . .......L................TT. -.

....----W .PQNAVL.T- ..S........FAGGPTS-A

____SLSTVL FPNPNKA. PA P.T.....L. . NSANPS . GQ

....-----1 PAPSIQGAAQ P..........YVGGPA. - .

. N......................................................

.N. . . .N....................................S.DL.........

• N......................................................

• N......N..........................I. . . . S. . .L.L.....A. .1

NE..V. ..V. .G....Y............. ...A..........L.L... .DAS..

. .A. . .K.TP AGH.........FG..........M.I..D.....AL..E . DEN. I

C.hir 185 LSVIKVTKGK RYRFRLVSLS CNPNHTFSID GHNLTIIEVD SVNSQPLEVD SIQIFAAQRY SFVLDANQAV DNYWIRANPN FGNVGFDG--

C.max 185 .....................D................................................................N. --

C.zon 180 .A. .T................D..Y..................T...V......................N...............T.--

A.faff 185 .A..S. .A.............D..YV.......M. ...T. .I.T...V................E.....................T.--

C. fui 185 .....................D...........W..........X..................W. D .P. N......... V..K..T.--

P.ost 193 .A. .N.ESN.......I.M. .D..F.......S.QV..A. A. .IV.IV........G.......N. .-T........D.. L.ST____--

R.lig 191 .A.VS.QS.......I..T. .F. .YA......RM.V.... G.S H...T.. .LT...G... .V.VE.....G........SN.RN..T.--

C. Gin 184 ..IVN.EQ.. K. . M. . I. . . .D..WQ......E.......GELTE.HT..

RL.

.TG.

• P........Q.. K.RN.LA.TF AN.V.

C.max 281 ........

C.zon 276 .....P..

A.fag 281 ....A.I.

C.tul 281 .....P. .

P.os t 289 .A. . TEDD

R.lig 287 .Q..AVA.

С.ein 284 .A. .ANAD

184 184 179 184 184 192 190 183

-GINSAILR 280

-................280

-................275

-................280

-D..............288

-......F. 286

283

C.biz- 281 YDGAPAVEPT TNQTTSVKPL NEVDLHPLVS TPVPGSPSSG GVDKAINMAF NFNGSNF--F INGASFVPPT VPVLLQILSG AQTAQDLLPS GSVYVLPSNA 378

378 373 378

.V.PP..I.M V.A,.TTFEE R.A....VP. ...L.L...........--..................V. . ..A...........S.

.T____TQ.....H.....A .A.....VA. ...L..........T..--.......T..........I.. . .N...........S.

.V.PP. .I.M V.A. .TTFDE R.A. .R.VP. ...L.L.LL. S......--.......................A...........S. .A.. 378

.TSS..T-.. E.TN.V.PEN PGA. .PAVP. . A. IN. . L. M A. DVT. . ELT ...SP.KA.. A..........T..AS......I.S.EASK 387

.S.NSGT-A. ..AN.I..IN PGA. .N.VP. .A.INL.LRI GR. ATTADFT ....P.I.............VTNPN. ... G .A.IS..A.Q 385

■SANPNPAQ. ..A...A.ID PAA..I.TP. AA, VNLRFQL G. S. GR. --T ...TAYES.S ..T....M.. ..S.N.,..A ....E..R.Q 381

C.bir 379 SIEISFPATA AAPGAPHPFH LHGHTFAWR SAGSTVYNYD NPIFRDWST GTPAAGDNVT IRFDTNNPGP WFLHCHIDFH LEGGFAWMA EDTPDVKAVN 478

C.zon 3 74 471

A. fag 379 478

C.ful 379 476

P. oat 388 W. . . .1. • L. - -V. G..... ......D.I. .....T. . F. T.AR. . . .N. . .D-.N---- . . .V.D____ . . .W. ..I.L.. • F. . .VTSIT.P- 483

R.lig 386 V. . . . .1. G-- ---.GN.... ____N.D... TP..S. . . .V . .VS. . . . .1 ■NIPIA. 476

C.cin 382 W, .LW. • G- . .VK. . . . .L ...V.D.... . .F. . . .E. . .HN.L.I F 477

С.Ыг 479 PVPQAWSDLC PTYDALDPND 0-

C.max 479 .................... -

C.zon 472 .................... -A. fag 479 ...........I......S. .C. ful 477 .............N.......-

P.oet 483 --.A.-D...

R.lig 479 AISP..D... . K.N .NN .DS GLA---501

C.cin 478 NP.VE.AQ.. EI..D.P.EA TSIQTV 503

499 493 4 84 499 497

.1....SDS. KGGIA- 506

А О« ft CU № А >>>>>>

аоааог fa fe h fa pti fa

SBBBSfi

>4 h Cu

д j JTT

h b b №

ra m та m и и

И M Я Я Я Я

О С5 И С5 CS О

(ь № < та та

и to та м и л:

н н н н н н

Pi р< Oi ft pi

и о и и о и

<у а а а а а

a в g g я g

н н > > н ^

A h № h b b

л: л; < л;

Л О» Л Л Л di

в о е о о и

§§§§§§

lllllg H H H H H и и а и и о о м к w « w ш cu а cu о а си

fxi ta Pu Eu Pu Eu Eu Eu Pu Eu fci tu О о о О О О

H H H H

w w со и w w

H H H H H H

« pt я M я я

a a a a a д

§ l

4 4¡t¡t'<m

• а а □ а а та СО

— OÍ 01 2 « « к н

• та и та м та н

• ь Eu ь tb Pu Eu

• и а и ООО

о • д а д д д д о

-Í -Ol а, Ol Ol 0» Pi VD

• та та та та та та H

• > > н н > >

Pi pi Ol Ol Ol Pi

o< с» а а а >

И И Н О Г "

« w M M «

и о о и и

й; л; < я; я;

о о a о в

и ^ О i-J J

Ol Ol

Eu h

Ri С

а. oí

и о

>3 J

H H > П X w

>н * >н

S S 8

P Q

"— ta та та и та о

>4 >4 >H (НЙ

к & в; tí «к| „„ а а о» о ак»

— h № fu (ti № &I N — {ц h Ец bi h h

0i 0i Ol Pi Pi 0i

ooaooo я д n а д д

h tu h ь ь, н

a я a 5 S н и та та и н J ооооои

- - - , ou

■ a

i H

I î>

a о

h Eu

> Ъ

Ol й! Pi CS Oí «ä И

Ol P* Oi Oi Oi КЯ

> > > > >ra

Pi Pi Pi Pi Oi 1*1 -É É É É §1

„ b h h

w w > >

Ol Ol й № . .

CO W W 0Í w

ü о о и о

Ol 0* Ol Ol

О • Д д д Д

OS -0, Ol Pi Ol

1Л • н H H H

• с < < <

о • Eu Cu Eu Eu

а> — О О И О

m • i i i 1

I1? a i • 1 — u i О й! 4

ft. Pi Ol Ol < i • Efl Ы H M

И W о о о и • ^ J J ►3

a a H H H д • W w ж №

h Eu tu Eu lu Eu о • EU Du EU Cu

о о О a О — Д Д Д Д

■ i i i i 1Л • H H H H

i i i i i i i i i i • « • i W t » Я i

о о о u u

Cu Eu Eu > Eu

я a a й a

Pi Ol Pi Ol Oi

Ц> • 1Л

emee

rt¡ < й! Oi < H

O O O Oí Oí Oí %%%%%%

Q Д Д í> и a

oí а oí а oí а

H H H H H H W W W M M и

и Ea > ЕД > . ^ j j j j H

та

. , rt¡ H > > > H

~ ~ д та

йе

Éu 3

О U Ж «

а ^

Eu (и S -Ен

U U U

Ш Я ÍX3

J J а

Eu № bi

S S

H H

• И « » « № Ж

— J й J й J

• « И и M К «

• Eu Eu Cu Pu № Cu

• Oi Oi Ol P. Oi Pi

• W W w M Я

о — Oi Oi Ol Pi

о • й! < tu b <

1Л * i i 1 1 i

• О О ¿ Ó О Ol

— Ol Ol Pi Pi Ol о

• й: й! й! й! < и

• Oi Ol Oi Oi Pi Ol

; > > > > >

о • i 1 i 1 1

• H H H H

• Pi Pi Oi 0<

• Pi Oi Ol Pi

— > > > >

• s. Eu Eu Eu

• и И та И

• й! «С < <

. О СЭ 1 u ■ а 1

* 1 • a 1 a r a t a

• и H H H

— h Pu Eu Eu

H H

. . Oi Pi

■ Eu Eu

01 Л

rt¡ U

ra ш M

Ф И

Q 3

3 m •H ГС JJ

u w э о m m

0 R <u

а ■4 «s > •4 ц

Я R rH tn -4

-H m Q Я m w

E¡ N tí 0

d ci d cj «i a,'

Л) 0) 14

S) а

tu R 3

3 m *H m ■и

4J m 3 0 <D та

3 u 0 R щ

Q •и m Í» -H 1ч

H Я R M tn -U

■rt m 0 3 та Ч

■q N •H 0

u ü d d «i о!

0) И

ED R 3

Я ч •4 та -u

-и та 3 о 01 n

Э S 4J 0 в a

а ■н та t> -H h

M R •4 b) -u

•ri та 0 3 та n

« N 44 44 0

d d d d я; oi

щ m

а R 3

3 Ol та u

4J та 3 U 01 «

3 S Al 0 R 01

» ■H <11 i> -H V4

M X R 4 tn -U

-H я 0 3 та m

Xi В N "Ц "ц 0

d d d d «Í n]

Рис.2. Экзон-интронная структура исследуемых лакказ.

Определение видовой принадлежности базидиальных грибов. Поскольку из семи базидиальных штаммов, продуцирующих лакказу при росте на жидких и твердых средах (согласно данным из коллекционного фонда - ЛЕВИН), Х,га<Лса1а не содержала ген лакказы, а в случае Р. озкеаШэ и А^адтеа гены лакказ были гомологичны генам, кодирующим данный фермент из других базидиомицетов, было проведено определение видовой принадлежности базидиомицетов методом ДНК-типирования. Для проведения ПЦР с хромосомной ДНК исследуемых штаммов были использованы праймеры на консервативные участки генов рибосом 1ТЭ1Г и 1ТБ4В (рис. 3).

ПЦР-продукгы были секвенированы, и полученные нуклеотидные последовательности ДНК сравнивались с последовательностями, имеющимися в банке данных бепВапк с целью определения наиболее близкородственного штамма к исследуемому организму. В случае, если уровень гомологии превышал 98%, можно сделать вывод, что исследуемый штамм идентичен имеющемуся в банке данных. В результате была определена видовая принадлежность следующих штаммов базидиальных грибов (табл. 6)

гшк

ПГ51 Ш?

Ю$йШ 1Т81 5.8 ЙЖА ШВ 2ШГЖЛ

1Ш ГШВ 1Ж!

тьу

KS2

Название Последовательность

ITS1F 5-СТТ GGT CAT ТТА GAG GAA GTA А -3'

ITS4B 5'- CAG GAG ACT TGT АСА CGG ТСС AG -3'

Рис. 3. Схема кластера ДНК, кодирующего рибосомальные субъединицы. Стрелками обозначены праймеры для ПЦР.

Таблица 6

Таксономическое определение штаммов базидиальных грибов.

Название используемое в коллекции ЛЕВИН Наиболее гомологичный штамм из базы данных (Taxonomy ID) Уровень гомологии

Coríolus hirsutos Trametes hirsuta (5327) 100%

Coriolus zona tus Trametes ochracea (230624) 100%

Cerrena maxima Trametes maxima (259368) 100%

Coriolus fulvocinerea Corio/opsis caperata (195176) 99%

Pleurotus ostreatus Pleurotus sp. 'Florida'(188765) 99%

Antrodieita faginea Trametes versicoior(5325) 100%

Xerula radicata Xerula radicata (170858) 100%

Для базидиомицетов Р.оз^еаШэ и А/адтеа эти данные хорошо согласуются с результатами клонирования генов лакказ, что позволило выдвинуть предположение об ошибочном определении видовой принадлежности по данным морфологических исследований и анализу характера базидиом.

Структурные исследования лакказ. В результате проведенных экспериментов по кристаллизации исследуемых в работе лакказ, были получены кристаллы трех лакказ СМ/гвиШв, С.тах/та и С.гопаШэ, пригодные для РСА. Получить кристаллы лакказ из С.Ыюс/пегеа и Р.оэКеа^з не удалось, что может быть связано с высокой степенью гликозилирования этих ферментов. Проведенный рентгено-структурный анализ выращенных кристаллов позволил получить трехмерные структуры ферментов. Для С.ЫгзиЮэ были получены две структуры с разрешениями 1.8А (рис. 4) и 1.2А, в случае структур лакказ из С.тамта и С.гопаШз достигнутое разрешение составило 1.9А и 2.6А соответственно. Наложение основного хода полипептидной цепи и анализ аминокислотного окружения активных центров показали высокую степень сходства всех трех структур.

Поскольку трехмерная структура для лакказы из Г.\zersicolor была получена ранее (РОВШУС), а уровень гомологии полученной аминокислотной последовательности и определенной по данным РСА составил 91%, то для дальнейшего анализа структуры активного центра использовали структуру фермента из Т.уегз/'со/ог.

Получить кристаллы лакказы из Р.озКеаШэ и СЛиЫостегеа не удалось, поэтому было проведено математическое моделирование данных структур на основе

Рис. 4. Структура лакказы из С.ЫзиШэ, полученная с разрешением 1.8А.

опубликованных структур. Для этого из имеющихся в базе данных PDB (Protein data bank) структур ферментов были выделены наиболее гомологичные по аминокислотной последовательности структуры. Для моделирования структуры лакказы из P.ostreatus была использована структура фермента из T.versicolor (PDB1GYC), полученная с разрешением 1.9А. Уровень аминокислотной гомологии между лакказами из P.ostreatus и Т. versicolor составил 66%. Моделирование лакказы из C.fulvocinerea проводили на основе структуры из C.hirsuta (PDB3FPX), полученной с разрешением 1.8А. Данная структура была выбрана как модельная, поскольку уровень аминокислотной гомологии между ферментами из C.fulvocinerea и C.hirsuta составил 86%.

Анализ аминокислотного окружения Т1 медного центра лакказ. Активный центр лакказ сформирован четырьмя ионами меди и состоит из двух медьсодержащих центров: мономолекулярного «голубого» иона меди (Т1 центр), координированного двумя остатками гистидина и одним остатком цистеина, и трехъядерного медного кластера Т2/ТЗ, который содержит один ион меди типа Т2, координированный двумя гистидинами, и два иона меди типа ТЗ, координированные тремя остатками гистидина каждый (рис. 5).

Эффективность катализа у лакказ зависит от окислительно-восстановительного потенциала иона меди Т1 (первичного акцептора электронов) и может быть обусловлена несколькими параметрами, главными из которых являются структура субстрат-связывающего кармана и состав формирующих его аминокислотных остатков, а также аминокислотного окружения иона меди Т1. Единого мнения по поводу того, какие же аминокислотные остатки могут оказывать существенное

JJ400

< «О Н452

Ь * .

"Ч СчЗа Ч J>

^ Ъ ,Н395 ^

Ъвг \

к .V. .

Cs, УН109

Рис. 5. Структуры каталитических центров Т1 и Т2/ТЗ лакказы из C.hirsutus.

влияние как на величину ОВП, так и на эффективность связывания субстратов, все еще не существует.

Для выявления аминокислотных остатков, которые могут влиять на ОВП, и как следствие, на каталитические свойства фермента, был произведен анализ аминокислотного окружения Т1 центра лакказ с использованием трехмерных структур ферментов. Для анализа использовали полученные в работе структуры высоко редокс-потенциальных лакказ из C.hirsutus (разрешение 1.2А и 1.85А) C.maxima (разрешение 1.9А), C.zonatus (разрешение 2.6А) и Т. versicolor (разрешение 1.9А). Для анализа аминокислотного окружения Т1 центра были также использованы структуры двух средне редокс-потенциальных лакказ из R.iignosus (PDB1V10, разрешение 1.7А) и C.cinereus (PDB1HFU, разрешение 1.68А) с ОВП 700мВ и 550 мВ соответственно.

Наложение полипептидных цепей выбранных, а также смоделированных структур лакказ показало, что ход цепи этих ферментов практически полностью совпадает. Отличия наблюдаются лишь в нескольких местах, причем отличающиеся структурные элементы представлены в основном петлями. Ход полипептидной цепи непосредственно вблизи от активных центров практически идентичен.

В литературе были выдвинуты две гипотезы о влиянии аминокислотных остатков на ОВП меди Т1. Согласно первой гипотезе для высоко редокс-потенциальных лакказ характерно наличие остатка фенилаланина в ближайшей координации иона меди Т1, в то время как для средне и низко редокс-потенциальных в данном положении находится остаток лейцина или метионина. Согласно второй гипотезе, различие в ОВП связано с существованием водородной связи между боковыми цепями остатка глутамата 460 (нумерация остатков приведена по последовательности лакказы из C.hirsutus) из третьего домена фермента и остатка серина 113, входящего в первый домен (рис. 5). Эта водородная связь может влиять на ОВП активного центра, поскольку с уменьшением ее длины подвижность петли, которая содержит глутамат 460 и координирующий ион меди Т1 гистидин 458 снижается. Данное взаимодействие наблюдается у лакказ из С.мах/та, C.hirsutus, C.zonatus, T.versicoior и R.iignosus, которые имеют ОВП 700-800 мВ, причем для высоко редокс-потенциальных ферментов при увеличении расстояния между этими остатками происходит уменьшение ОВП (рис. 6), однако прямой корреляции не наблюдается. У лакказы из C.cinereus, обладающей самым низким потенциалом из известных грибных ферментов, такое взаимодействие отсутствует, поскольку в данных положениях у нее находятся остатки глицина 113 и метионина 459 (нумерация остатков приведена по последовательности лакказы из C.cinereus).

■ J.13 (SER)

* , /бо^ш) • u (HIS)

. ¿53 (CYS) .

' , -,463 (PHE)

* • • it ■{ , G'

Г 95 (HIS)

41 I

Рис. 6. Взаимодействие Glu460 и Ser113 вблизи активного центра Т1 структуры C.hirsutus.

Ион меди в центре Т1 непосредственно координируется двумя остатками His395 и His458 и остатком Cys453, которые являются строго консервативными у всех лакказ. Кроме того, в ближайшую сферу окружения попадают также консервативный у всех лакказ остаток Пе455 и остаток Phe337 у высоко редокс-лотенциальных лакказ (нумерация остатков по последовательности лакказы из C.hirsutus), который замещен на остаток лейцина у средне редокс-потенциальных лакказ и на остаток метионина у низко редокс-потенциальных.

Аминокислотные остатки Phe337 (нумерация по последовательности лакказы C.hirsutus) и замещающий его остаток лейцина для высоко и средне редокс-потенциальных лакказ соответственно находятся на расстоянии превышающем 3,5А от иона меди Т1. Поэтому прямое взаимодействие с ионом меди представляется маловероятным, и, как следствие, наличие остатка фенилаланина в данном положении может быть только маркером для высоко редокс-потенциальных ферментов, но не одним из ключевых остатков, влияющим на ОВП лакказы. Это предположение было доказано в работе Ф. Key, показавшего отсутствие изменения редокс-лотенциала лакказы из Myceliophthora thermophila при замене остатка метионина на остаток фенилаланина в этом положении.

Следовательно, для поиска аминокислотных остатков, которые могут оказывать влияние на ОВП, необходимо рассматривать вторичную сферу окружения активного центра Т1, а именно, остатки находящиеся на расстояниях до 8А.

Анализ второй координационной сферы меди Т1. Для выявления влияния остатков второй координационной сферы окружения иона меди Т1, сформированной в случае лакказы из C.hirsutus остатками Phe162, Cys205, Asn206, Phe330, Phe337, Ala390, Pro391, Gly392, Ala393, Pro394, His395, РгоЗЭб, Phe397, Thr428, His452,

Организм Расстояния Glu460 Ser113 ,A ОВП T1, mB

C.zonatus 2.5 820±20

C.hirsutus 2.8 812±10

A.faginea (T. versicolor) 2.9 780±10

C.Maxima 2.9 750±15

R.Hgnosus 2.6 700±15

C.cinereus - 550±10

СуэДбЗ, №5454, Пе455, Аэр456, РЬе457, Н1з458, Leu459 и РИе463, было проведено детальное сравнение структур исследованных в работе лакказ. Сравнение проводили путем наложения структур лакказ из С.ЫгзиЮэ, С.таюта, Я.Ндпозиэ и С.с'тегеиз по ходу полипептидной цепи. Далее был произведен анализ местоположения и возможных взаимодействий этих аминокислотных остатков в наложенных структурах. В итоге были выделены места в структуре, отличающиеся у этих лакказ. Все эти отличия находятся в предполагаемом субстрат-связывающем кармане для фенольных субстратов.

Анализ окружения иона меди Т1 у лакказ СМгзиШз и С.тах/'та показал, что оно практически идентично. Было обнаружено лишь единственное отличие - это замена в лакказе из С.таюта остатка Авп206 на остаток аспарагиновой кислоты. При этом ОВП этих ферментов отличается на 50 мВ, что может быть объяснено этой заменой. У других лакказ, рассматриваемых в работе, в данном положении находится остаток аспарагиновой кислоты (рис. 1). Этот остаток аспартата (аспарагина) принимает участие в связывании фенольных субстратов. Исключение составляет лишь фермент из Я.Ндпозиэ, в котором в этом положении обнаружен фенилаланин. Для этой лакказы замена аспартата на фенилаланин сопряжена с заменой РЬе265 (нумерация по последовательности лакказы из СМгвМиэ), характерного для остальных исследуемых в работе лакказ, на остаток аспарагина, Этот остаток в лакказе из Я.Идповиэ играет роль якорного остатка в субстратсвязывающем кармане.

'Л ' "

¡1Ъ9ШЬ1)

ЗИ(в1Х) 383(АЬА)

Рис.7. Петли, формирующие вход в субстрат-связыва-ющий карман лакказы. Желтый цвет - структура С.ЫгБиШ, зеленый цвет - структура С.стегеиэ.

Сравнение структур показало большие отличия у высоко и средне потенциальных лакказ в петлях, формирующих вход в субстрат-связывающий карман (остатки 157-161, 332-343, 386-394, нумерация по последовательности лакказы из СМгэиЮэ) (рис. 7). Для всех высоко редокс-потенциальных ферментов

положение и состав этих петель являются высокогомологичным, в отличие от средне редокс-потенциальных, где в зависимости от фермента могут наблюдаться отличия как по составу, так и по положению этих петель.

ВЫВОДЫ

1. Определены полные нукпеотидные и аминокислотные последовательности пяти высоко редокс-потенциальных лакказ из базидиомицетов C.hirsutus, С.maxima, C.zonatus, C.fulvocinerea, A. faginea(T. versicolor) и одной средне редокс-потенциальной из P.ostreatus.

2. Определена экзон-интронная структура генов лакказ. Показано, что высоко редокс-потенциальные лакказы содержат 8-10 интронов, в то время как средне редокс-потенциальные более 10. Для всех базидиальных грибов обнаружено наличие трех интронов в положениях 80, 90 и 210. Установлены интроны, характерные только для высоко редокс-потенциальных лакказ (положения 160, 240, 330 и 370).

3. Определено филогенетическое положение исследуемых штаммов базидиомицетов.

5. Проведено сравнение центров Т1 высоко и средне редокс-потенциальных лакказ, структуры которых получены РСА и математическим моделированием. Показано, что на редокс-потенциал может влиять наличие в положении 206 остатков аспарагина или аспартата, а также наличие в структуре водородной связи между остатками Glu460 и Ser113.

6. Показано, что основные структурные отличия между высоко и средне потенциальными лакказами связаны с особенностями третичной структуры фермента - петлями, формирующими вход в субстратсвязывающий карман.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Lyashenko AV, Zhukhlistova NE, Gabdoulkhakov AG, Zhukova YN, Voelter W, Zaitsev VN, Bento I, Stepanova EV, Ka chalo va GS, Koroleva OV, Cherkashvn EA. Tishkov VI, Lamzin VS, Schirwitz K, Morgunova EY, Betzel C, Lindley PF, Mikhailov AM. Purification, crystallization and preliminary X-ray study of the fungal lacease from Cerrena maxima.// Acta Crystallogr., Sect F. 2006, V.62, pp. 954-7.

2. E. А. Черкашин. E. В. Степанова, E. О. Ландесман, О. В. Королева, В. И. Тишков. Сравнительный анализ последовательностей генов трех высоко редокс-потенциальных лакказ из базидиомицетов.// Доклады Академии Наук, 2007, Т. 417, с. 348-351.

Тезисы

1. Черкашин Е.А.. Степанова Е.В., Королева О.В., Тишков В.И. Клонирование гена лакказы из базидиомицета Сеггепа maxima.ll Тезисы докладов Международной конференции «Ломоносов - 2006». М., 2006, с. 61.

2. Черкашин Е.А.. Степанова Е.В., Королева О.В., Тишков В.И. Сравнительный анализ последовательности генов трех лакказ из базидиомицетов Сеггепа maxima, Coriolus hirsutus и Coriolus zonatus.// Тезисы докладов Международной конференции «Ломоносов -2007». М., 2007, с. 472.

3. Cherkashvn Е.А., Stepanova E.V., Landesman Е.О., Koroleva O.V., Tishkov V.I. Comparative analysis of full gene sequences of laccases from white-rot fungi Сеггепа maxima, Coriolus hirsutus and Coriolus zonatus. II The Fourth Moscow International Congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development". M., 2007, p. 267.

4. Cherkashin E.A.. Stepanova E.V., Landesman, E.O., Tishkov V.I., Koroleva O.V. Gene structure analysis of high redox potential laccases from basidiomycetes Cerrena maxima, Coriolus hirsutus and Coriolus zonatus.// XV Congress of European Mycologists. S.-Pb. 2007, p. 184.

5. Cherkashin E.A., Stepanova E.V., Landesman, E.O., Koroleva O.V., Tishkov V.I. Comparative analysis of gene sequences of three high redox potential laccases from basidiomycetes. //Conference for young scientists, PhD-students and students on molecular biology and genetic. Kiev, 2007, p. 55.

6. Cherkashin E.A.. Stepanova E.V., Landesman, E.O., Koroleva O.V., Tishkov V.I. Comparative analysis of gene sequences of three high redox potential laccases from basidiomycetes Cerrena maxima, Coriolus hirsutus и Coriolus zonatus.// Abstracts of International Conference «Biocatalysis-2007» M. 2007, p. 89.

7. Королева О.В., Степанова Е.В., Курзеев С.А., Черкашин Е.А.. Федорова Т.В., Поляков К.М., Тишков В.И. Молекулярная и структурная организация «голубых» лакказ.// IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск 2008, с. 40.

8. Koroleva O.V., Polyakov К.М., Kurzeev S.A., Fedorova T.V., Cherkashin E.A.. Stepanova E.V., Tishkov V.I. Comparative analysis of 3D structures of laccases from Coriolus hirsutus at resolution 1.85 A and 1.2 A. II 4th European meeting in Oxizymes. Helsinki, 2008.

9. Koroleva O.V., Loginov D.S., Cherkashin E.A.. Fedorova T.V., Stepanova E.V., Chulkin A.M., Abianova A.R., Vavilova E.A., Benevolensky S.V. Novel approaches for design of industrial enzymes.11 The Fifth Moscow International Congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development". M„ 2009, p. 274.

Подписано в печать 29 апреля 2009 г. Объем 1,2 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 529 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Черкашин, Евгений Александрович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Медьсодержащие оксидазы.

2.1.1. Аскорбатоксидаза.

2.1.2. Церулоплазмин.

2.1.3. Лакказа.'.'./.

2.2. Структура медных центров.

2.3. Спектральные свойства ионов меди.

2.3.1. Предполагаемый механизм катализа у лакказ.

2.4. Структурная организация медьсодержащих оксидаз.

2.4.1. Доменная организация медьсодержащих оксидаз.

2.4.2. Структуры лакказ.

2.5. Геномная организация лакказ.

2.5.1.Изоферменты лакказ.

2.5.2. Экзон-интронная организация гена лакказ.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Материалы.

3.1.1. Штаммы микроорганизмов и ферменты.

3.1.2. Носители.

3.1.3. Реагенты.

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Культивирование штаммов продуцентов лакказы.

3.2.2. Выделение хромосомной ДНК.

3.2.3. Проведение ПЦР.

3.2.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.2.5. Очистка ПЦР-продуктов.

3.2.6. Рестрикция ДНК.

3.2.7. Лигирование ДНК.

3.2.8. Секвенирование ДНК.

3.2.9. Математическая обработка данных секвенирования.

3.2.10. Компьютерное моделирование.

3.2.11. Визуализация белковых структур.

3.2.12. Выделение и очистка лакказы.

3.2.12.1. Очистка фермента методом ВЭЖХ.

3.2.12.2. Очистка фермента методом гаоэлектрофокусировапия.

3.2.12.3. Очистка фермента методом препаративного электрофореза.

3.2.13. Контроль гомогенности препаратов.

3.2.14. Определение активности лакказы.

3.2.15. Определение концентрации белка.

3.2.16. Выравнивания аминокислотных и нуклеотидных последовательностей лакказ.

3.2.17. Получение кристаллов лакказы.

3.2.18. Сбор кристаллографических данных и их обработка.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Определение наличия гена лакказы в геноме базидиальных грибов.

4.2. Определение аминокислотной последовательности лакказы C.hirsutus клонированием гена с хромосомной ДНК.

4.2.1. Конструирование и синтез праймеров для клонирования лакказы из C.hirsutus

4.2.2. Оптимизация условий проведения ПЦР.

4.2.3. Оптимизация конструкций новых олигонуклеотидных праймеров для клонирования лакказы из C.hirsutus.

4.2.4. Получение полных нуклеотидной и аминокислотной последовательностей лакказы C.hirsutus.

4.3. Определение полной аминокислотной последовательности высоко редокс-потенциальных лакказ C.maxima, C.zonatus и C.fulvocinerea.

4.4. Определение аминокислотной последовательности средне редокс-потенциальной лакказы из P.ostreatus.

4.5. Определение аминокислотной последовательности лакказы из A.faginea.

4.6. Сравнение аминокислотных последовательностей исследуемых лакказ.

4.7. Экзон-интронная структура генов исследуемых лакказ.

4.8. Определение видовой принадлежности базидиальных грибов.

4.9. Структурные исследования лакказ.

4.9.1. Структуры лакказы C.hirsutus.

4.9.2. Структуры лакказ C.maxima, C.zonatus.

4.9.3. Моделирование структур лакказ P.ostreatus и C.fulvocinerea.

4.10. Анализ аминокислотного окружения Т1 центра лакказ.

4.13. Анализ второй координационной сферы иона меди Т1.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-генетическая организация лакказ базидиальных грибов"

Лакказа (я-дифенол:кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2) принадлежит к семейству медьсодержащих оксидаз и катализирует реакцию восстановления молекулярного кислорода различными органическими и неорганическими соединениями непосредственно до воды, минуя стадию образования перекиси водорода.

Впервые лакказа была обнаружена в соке японского лакового дерева Rhus vernicifera в 1883 году и к настоящему времени она насчитывает более чем столетнюю историю изучения[1]. На сегодняшний день выделено и охарактеризовано более 100 лакказ из различных источников: грибы, растения, насекомые и бактерии. Большая часть изученных лакказ выделена из базидиальных грибов, в которых этот фермент играет ключевую роль в процессах биодеградации лигнина, образовании пигментов, детоксификации и т.д. Лакказа является полифункциональным ферментом, в растениях функция лакказы связана с процессом синтеза лигнина - биополимера, составляющего до 50% сухой массы древесины; в насекомых она участвует в процессах склеротизации [2] и детоксификации, в частности, при метаболических нарушениях, связанных с обменом железа [3]. Также было показано наличие лакказ или лакказоподобных ферментов в бактериях, однако, классификация и сам факт отнесения этих ферментов к лакказам все еще вызывает споры [4].

Лакказы обладают широкой субстратной специфичностью. Они способны катализировать окисление моно-, ди- и полифенолов, ароматических аминов и других соединений. Субстратную специфичность можно также расширить, используя различные редокс-медиаторы, в присутствии которых лакказы способны также окислять различные нефенольные соединения, такие как соли Мп2+ в составе хелатных комплексов [5].

Все эукариотические лакказы являются гликопротеинами с различной степенью гликозилирования (от 10 до 44%). Активный центр лакказы содержит четыре иона меди, организованных в моноядерный медный центр (Т1) и трехъядерный медный кластер (Т2/ТЗ). Лакказа является наиболее просто организованной медьсодержащей оксидазой, что позволяет использовать ее в качестве модели в фундаментальных исследованиях медьсодержащих белков [6].

Каталитические свойства фермента и его широкая субстратная специфичность, возможность использования в качестве субстрата акцептора электронов молекулярного кислорода, способность катализировать реакцию электровосстановления кислорода по безмедиаторному механизму и достаточно высокая стабильность обеспечивают широкое практическое применение лакказ. Первые попытки практического использования лакказы определялись ее способностью эффективно разлагать лигнин в присутствии редокс медиаторов [7]. Этот биополимер является одним из самых устойчивых к химической и микробиологической деградации отходом деревообрабатывающей и целлюлозно-бумажной промышленности, поэтому альтернативные технологии на основе лакказы, позволяющие резко снизить техногенную нагрузку, вызывали и вызывают значительный интерес. Широкое использование этого фермента при создании различных типов биосенсоров, в первую очередь, связано с его способностью катализировать реакцию электровосстановления кислорода по безмедиаторному механизму. Возможности практического использования лакказы в биотехнологии и различных отраслях промышленности достаточно полно освещены в обзорах [6-8]. Однако, следует подчеркнуть, что все практические разработки выполнены только на лабораторном уровне.

Наиболее консервативной частью лакказы является активный центр, содержащий четыре иона меди и координирующие их аминокислотные лиганды, формирующие уникальную структуру, определяющую спектральные и каталитические характеристики фермента. Уникальный ансамбль из четырех ионов меди, организованных в моноядерный медный центр (Т1) и трехъядерный медный кластер (Т2/ТЗ) обеспечивает процесс катализа. Известно, что эффективность катализа у лакказ зависит от структурных особенностей субстрата - донора электронов и окислительно-восстановительного потенциала медного центра (Т1) фермента (ОВП). Следовательно, наибольший практический интерес представляют лакказы с высоким ОВП, поскольку они способны более эффективно разрушать лигнин и другие соединения как фенольной, так и нефенольной природы [9]. Тем не менее, ответить на вопрос, что обеспечивает ферменту высокий окислительно-восстановительный потенциал медного центра, до сих пор не удалось. Структурный анализ лакказ из различных источников позволил выдвинуть ряд гипотез, ни одна из которых пока не получила экспериментального подтверждения. Несмотря на использование самых современных физико-химических методов, наличия большого количества данных по аминокислотной последовательности лакказ и структурных данных, однозначную взаимосвязь между структурой фермента и механизмом его действия установить не удается. Также не удается ответить на важные с практической и фундаментальной точки зрения вопросы, такие как: какова роль отдельных аминокислотных остатков, формирующих Т1 центр, и что обеспечивает широкую субстратную специфичность фермента на структурном и молекулярном уровнях. Таким образом, изучение генетической организации лакказ и установление структурно-функциональных особенностей данных ферментов является актуальным как с фундаментальной (принципы организации и функционирования медьсодержащих оксидаз), так и с практической точки зрения (создание рекомбинантных ферментов и их биотехнологическое применение).

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Черкашин, Евгений Александрович

5. ВЫВОДЫ

1. Определены полные нуклеотидные и аминокислотные последовательности пяти высоко редокс-потенциальных лакказ из базидиомицетов C.hirsutus, C.maxima, C.zonatus, C.fulvocinerea, A.faginea(T.versicolor) и одной средне редокс-потенциальной из P.ostreatus.

3. Определено филогенетическое положение исследуемых штаммов базидиомицетов.

4. Проведено сравнение центров Т1 высоко и средне редокс-потенциальных лакказ, структуры которых получены РСА и математическим моделированием. Показано, что на редокс-потенциал может влиять наличие в положении 206 остатков Asn или Asp, а также наличие в структуре водородной связи между остатками Glu460 и Serl 13.

5. Показано, что основные структурные отличия между высоко и средне потенциальными лакказами связаны с особенностями третичной структуры фермента - петлями, формирующими вход в субстратсвязывающий карман.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Черкашин, Евгений Александрович, Москва

1. Nitta, К., К. Kataoka, and Т. Sakurai, Primary structure of a Japanese lacquer tree laccase as a prototype enzyme of multicopper oxidases. J Inorg Biochem, 2002. 91(1): p. 125-31.

2. Hoegger, P.J., et al., Phylogenetic comparison and classification of laccase and related multicopper oxidase protein sequences. FEBS J, 2006. 273(10): p. 2308-26.

3. Valderrama, В., et al., Evolutionary and structural diversity of fungal laccases. Antonie Van Leeuwenhoek, 2003. 84(4): p. 289-99.

4. Claus, H., Laccases and their occurrence in prokaryotes. Arch Microbiol, 2003. 179(3): p. 145-50.

5. Ullrich, R. and M. Hofrichter, Enzymatic hydroxylation of aromatic compounds. Cell Mol Life Sci, 2007. 64(3): p. 271-93.

6. Baldrian, P., Fungal laccases occurrence and properties. FEMS Microbiol Rev, 2006. 30(2): p. 215-42.

7. Kunamneni, A., et al., Laccases and their applications: a patent review. Recent Pat Biotechnol, 2008. 2(1): p. 10-24.

8. Mayer, A.M. and R.C. Staples, Laccase: new functions for an old enzyme. Phytochemistry, 2002. 60(6): p. 551-65.

9. Xu, F., et al., Site-directed mutations in fungal laccase: effect on redox potential, activity andpHprofile. Biochem J, 1998. 334 ( Pt 1): p. 6370.

10. Nakamura, К. and N. Go, Function and molecular evolution of multicopper blue proteins. Cell Mol Life Sci, 2005. 62(18): p. 2050-66.

11. Suzuki, S., K. Kataoka, and K. Yamaguchi, Metal coordination and mechanism of multicopper nitrite reductase. Acc Chem Res, 2000. 33(10): p. 728-35.

12. Sakurai, T. and K. Kataoka, Structure and function of type I copper in multicopper oxidases. Cell Mol Life Sci, 2007. 64(19-20): p. 2642-56.

13. Brissos, V., et al., Expression system of CotA-laccase for directed evolution and high-throughput screenings for the oxidation of high-redox potential dyes. Biotechnol J, 2009.

14. Enguita, F.J., et al., Subsfrate and dioxygen binding to the endospore coat laccase from Bacillus subtilis. J Biol Chem, 2004. 279(22): p. 23472-6.

15. Tanaka, A., et al., Static and kinetic studies on the binding of Streptomyces trehalose inhibitor SGI with Rhizopus glucoamylase. Comparison with glucose and gluconolactone. J Biochem, 1982. 91(1): p. 1-9.

16. Askwith, C., et al., The FET3 gene of S. cerevisiae encodes a multicopper oxidase required for ferrous iron uptake. Cell, 1994. 76(2): p. 403-10.

17. Dancis, A., et al., Molecular characterization of a copper transport protein in S. cerevisiae: an unexpected role for copper in iron transport. Cell, 1994. 76(2): p. 393-402.

18. Rensing, С. and G. Grass, Escherichia coli mechanisms of copper homeostasis in a changing environment. FEMS Microbiol Rev, 2003. 27(2-3): p. 197-213.

19. Kosman, D.J., FET3P, ceruloplasmin, and the role of copper in iron metabolism. Adv Protein Chem, 2002. 60: p. 221-69.

20. Francis, C.A. and B.M. Tebo, cumA multicopper oxidase genes from diverse Mn (II)-oxidizing and non-Mn (II) -oxidizing Pseudomonas strains. Appl Environ Microbiol, 2001. 67(9): p. 4272-8.

21. Wu, W.S., W.H. Li, and B.S. Chen, Computational reconstruction of transcriptional regulatory modules of the yeast cell cycle. BMC Bioinformatics, 2006. 7: p. 421.

22. Webb, S.M., et al., Evidence for the presence of Mn(III) intermediates in the bacterial oxidation of Mn(II). Proc Natl Acad Sci USA, 2005. 102(15): p. 5558-63.

23. Silver, S. and G. Ji, Newer systems for bacterial resistances to toxic heavy metals. Environ Health Perspect, 1994. 102 Suppl 3: p. 107-13.

24. Sakurai, T. and K. Kataoka, Basic and applied features of multicopper oxidases, CueO, bilirubin oxidase, and laccase. Chem Rec, 2007. 7(4): p. 220-9.

25. Kataoka, K., et al., Structure and function of the engineered multicopper oxidase CueO from Escherichia coli—deletion of the methionine-rich helical region covering the substrate-binding site. J MolBiol, 2007. 373(1): p. 141-52.

26. Farver, О., et al., The effect of driving force on intramolecular electron transfer in proteins. Studies on single-site mutated azurins. Eur J Biochem, 1992. 210(2): p. 399-403.

27. Liso, R., et al., Localization of ascorbic acid, ascorbic acid oxidase, and glutathione in roots of Cucurbita maxima L. J Exp Bot, 2004. 55(408): p. 2589-97.

28. Messerschmidt, A. and R. Huber, The blue oxidases, ascorbate oxidase, laccase and ceruloplasmin. Modelling and structural relationships. Eur J Biochem, 1990. 187(2): p. 341-52.

29. Pignocchi, C., et al., The function of ascorbate oxidase in tobacco. Plant Physiol, 2003. 132(3): p. 1631-41.

30. Wilson, J.X., Mechanism of action of vitamin С in sepsis: ascorbate modulates redox signaling in endothelium. Biofactors, 2009. 35(1): p. 5-13.

31. Messerschmidt, A., et al., X-ray crystal structure of the blue oxidase ascorbate oxidase from zucchini. Analysis of the polypeptide fold and a model of the copper sites and ligands. J Mol Biol, 1989. 206(3): p. 51329.

32. Santagostini, L., et al., Probing the location of the substrate binding site of ascorbate oxidase near type 1 copper: an investigation through spectroscopic, inhibition and docking studies. Int J Biochem Cell Biol, 2004. 36(5): p. 881-92.

33. Mei, G., et al., Role of quaternary structure in the stability of dimeric proteins: the case of ascorbate oxidase. Biochemistry, 1997. 36(36): p. 10917-22.

34. Holmberg, C.G., On the presence of a laccase-like enzyme in serum and its relation to the copper in serum. Acta Physiol. Scand, 1944. 8: p. 227-229.

35. Holmberg, C.G. and C.B. Laurell, Investigation in serum copper. Acta Chem. Scand., 1948. 2: p. 550-556. .

36. Osaki, S., Kinetic studies of ferrous ion oxidation with crystalline human ferrooxidase (ceruloplasmin). J. Biol. Chem., 1966. 241: p. 5053-5059.

37. Mukhopadhyay, C.K., et al., Identification of the prooxidant site of human ceruloplasmin: a model for oxidative damage by copper bound to protein surfaces. Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(21): p. 1154651.

38. Vachette, P., et al., A key structural role for active site type 3 copper ions in human ceruloplasmin. J Biol Chem, 2002. 277(43): p. 40823-31.

39. Hellman, N.E. and J.D. Gitlin, Ceruloplasmin metabolism and function. Annu Rev Nutr, 2002. 22: p. 439-58.

40. Hellman, N.E., et al., Mechanisms of copper incorporation into human ceruloplasmin. J Biol Chem, 2002. 277(48): p. 46632-8.

41. Texel, S.J., X. Xu, and Z.L. Harris, Ceruloplasmin in neurodegenerative diseases. Biochem Soc Trans, 2008. 36(Pt 6): p. 1277-81.

42. Healy, J. and K. Tipton, Ceruloplasmin and what it might do. J Neural Transm, 2007. 114(6): p. 777-81.

43. Vassiliev, V., Z.L. Harris, and P. Zatta, Ceruloplasmin in neurodegenerative diseases. Brain Res Brain Res Rev, 2005. 49(3): p. 633-40.

44. Ryden, L., Human ceruloplasmin as a polymorphic glycoprotein. Tryptic glycopeptides from two forms of the protein. Int J Protein Res, 1971. 3(4): p. 191-200.

45. Magdoff-Fairchild, В., F.M. Lovell, and B.W. Low, An x-ray crystallographic study of ceruloplasmin. Determination of molecular weight. J Biol Chem, 1969. 244(13): p. 3497-9.

46. Broman, L., Separation and characterization of two coeruloplasmins from human serum. Nature, 1958. 182(4650): p. 1655-7.

47. Ortel, T.L., N. Takahashi, and F.W. Putnam, Structural model of human ceruloplasmin based on internal triplication, hydrophilic/hydrophobic character, and secondary structure of domains. Proc Natl Acad Sci U S A, 1984. 81(15): p. 4761-5.

48. Boivin, S., et al., Molecular characterization of human and bovine ceruloplasmin using MALDI-TOF mass spectrometry. Biochem Biophys Res Commun, 2001. 288(4): p. 1006-10.

49. Ryan, T.P., T.A. Grover, and S.D. Aust, Rat ceruloplasmin: resistance to proteolysis and kinetic comparison with human ceruloplasmin. Arch Biochem Biophys, 1992. 293(1): p. 1-8.

50. Cappelli-Bigazzi, M., et al., Ceruloplasmin impairs endothelium-dependent relaxation of rabbit aorta. Am J Physiol, 1997. 273(6 Pt 2): p. H2843-9.

51. Bielli, P. and L. Calabrese, Structure to function relationships in ceruloplasmin: a 'moonlighting'protein. CellMol Life Sci, 2002. 59(9): p. 1413-27.

52. Grossmann, J.G., et al., X-ray absorption studies and homology modeling define the structural features that specify the nature of the copper site in rusticyanin. Biochemistry, 1995. 34(26): p. 8406-14.

53. Munoz, C., et al., Laccase isoenzymes of Pleurotus eryngii: characterization, catalytic properties, and participation in activation of molecular oxygen and Mn2+ oxidation. Appl Environ Microbiol, 1997. 63(6): p. 2166-74.

54. Guillen, F., et al., Quinone redox cycling in the ligninolytic fungus Pleurotus eryngii leading to extracellular production of superoxide anion radical. Arch Biochem Biophys, 1997. 339(1): p. 190-9.

55. Munoz, C., et al., Induction and Characterization of Laccase in the Ligninolytic Fungus Pleurotus eryngii. Curr Microbiol, 1997. 34(1): p. 1-5.

56. Shleev, S.V., et al., Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie, 2004. 86(9-10): p. 693-703.

57. Slomczynski, D., J.P. Nakas, and S.W. Tanenbaum, Production and Characterization of Laccase from Botrytis cinerea 61-34. Appl Environ Microbiol, 1995. 61(3): p. 907-912.

58. Kawasaki, N., et al., The significance of glycosylation analysis in development of biopharmaceuticals. Biol Pharm Bull, 2009. 32(5): p. 796-800.

59. Cambria, M., et al., Production, purification, and properties of an extracellular laccase from Rigidoporus lignosus. Protein Expr Purif, 2000. 18(2): p. 141-7.

60. Palmieri, G., et al., Copper induction of laccase isoenzymes in the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus. Appl Environ Microbiol, 2000. 66(3): p. 920-4.

61. Fernandez-Larrea, J. and U. Stahl, Isolation and characterization of a laccase gene from Podospora anserina. Mol Gen Genet, 1996. 252(5): p. 539-51.

62. Bollag, J.M. and A. Leonowicz, Comparative Studies of Extracellular Fungal Laccases. Appl Environ Microbiol, 1984. 48(4): p. 849-854.

63. Morozova, O.V., et al., "Blue" laccases. Biochemistry (Mosc), 2007. 72(10): p. 1136-50.

64. Xu, F., et al., Targeted mutations in a Trametes villosa laccase. Axial perturbations of the T1 copper. J Biol Chem, 1999. 274(18): p. 123725.

65. Bourbonnais, R., et al., Reactivities of Various Mediators and Laccases with Kraft Pulp and Lignin Model Compounds. Appl Environ Microbiol, 1997. 63(12): p. 4627-4632.

66. Giardina, P., et al., Cloning and sequencing of a laccase gene from the lignin-degrading basidiomycete Pleurotus ostreatus. Appl Environ Microbiol, 1995. 61(6): p. 2408-13.

67. Giardina, P., et al., The gene, protein and glycan structures of laccase from Pleurotus ostreatus. Eur J Biochem, 1996. 235(3): p. 508-15.

68. Palmieri, G., et al., A novel white laccase from Pleurotus ostreatus. J Biol Chem, 1997. 272(50): p. 31301-7.

69. Giardina, P., et al., Protein and gene structure of a blue laccase from Pleurotus ostreatusl. Biochem J, 1999. 341 ( Pt3): p. 655-63.

70. Zumarraga, M., et al., Altering the laccase functionality by in vivo assembly of mutant libraries with different mutational spectra. Proteins, 2008. 71(1): p. 250-60.

71. Pezzella, C., et al., The Pleurotus ostreatus laccase multi-gene family: isolation and heterologous expression of new family members. Curr Genet, 2009. 55(1): p. 45-57.

72. Cullen, D., Recent advances on the molecular genetics of ligninolytic fungi. J Biotechnol, 1997. 53(2-3): p. 273-89.

73. Lomascolo, A., et al., Basidiomycetes as new biotechnological tools to generate natural aromatic flavours for the food industry. Trends Biotechnol, 1999. 17(7): p. 282-9.

74. Eggert, C., U. Temp, and K.E. Eriksson, Laccase is essential for lignin degradation by the white-rot fungus Pycnoporus cinnabarinus. FEBS Lett, 1997. 407(1): p. 89-92.

75. Bajpai, P., A. Anand, and P.K. Bajpai, Bleaching with lignin-oxidizing enzymes. Biotechnol AnnuRev, 2006. 12: p. 349-78.

76. Garrett, T.P., et al., The ciystal structure of poplar apoplastocyanin at 1.8-A resolution. The geometry of the copper-binding site is created by the polypeptide. J Biol Chem, 1984. 259(5): p. 2822-5.

77. Palmer, A.E., et al., Spectroscopic characterization and 02 reactivity of the trinuclear Си cluster of mutants of the multicopper oxidase Fet3p. Biochemistry, 2002. 41(20): p. 6438-48.

78. Palmer, A.E., et al., Spectroscopic characterization of the Leu513His variant offungal laccase: effect of increased axial ligand interaction on the geometric and electronic structure of the type 1 Си site. Inorg Chem, 2003. 42(13): p. 4006-17.

79. Solomon, E.I., et al., 02 and N20 activation by Bi-, Tri-, and teti-anuclear Си clusters in biology. Acc Chem Res, 2007. 40(7): p. 581-91.

80. Fraterrigo, T.L., et al., Which copper is paramagnetic in the type 2/type 3 cluster of laccase? J Biol Inorg Chem, 1999. 4(2): p. 183-7.

81. Adman, E.T., Copper protein structures. Adv Protein Chem, 1991. 42: p. 145-97.

82. Huang, H.W., et al., Magnetic studies of the trinuclear center in laccase and ascorbate oxidase approached by EPR spectroscopy and magnetic susceptibility measurements. Biochim Biophys Acta, 1998. 1384(1): p. 160-70.

83. Augustine, A.J., et al., Spectroscopic and kinetic studies of perturbed trinuclear copper clusters: the role of protons in reductive cleavage of the O-O bond in the multicopper oxidase Fet3p. J Am Chem Soc, 2007. 129(43): p. 13118-26.

84. Peyratout, C.S., et al., EPR studies of ligand binding to the type 2/type 3 cluster in tree laccase. Arch Biochem Biophys, 1994. 314(2): p. 40511.

85. Enguita, F.J., et al., Structural Characterization of a Bacterial Laccase Reaction Cycle. To be Published.

86. Lu, H., et al., Reversible translocation of glycoprotein lb in plasmin-treated platelets: consequences for platelet function. Eur J Clin Invest, 1993. 23(12): p. 785-93.

87. Dawson, K.A., M.C. Preziosi, and D.R. Caldwell, Some effects of uncouplers and inhibitors on growth and electron transport in rumen bacteria. J Bacterid, 1979. 139(2): p. 384-92.

88. Sakurai, Т., Kinetics of electron transfer between cytochrome с and laccase. Biochemistry, 1992. 31(40): p. 9844-7.

89. Sakurai, T. and J. Takahashi, EPR spectra of type 3 copper centers in Rhus vernicifera laccase and Cucumis sativus ascorbate oxidase. Biochim Biophys Acta, 1995. 1248(2): p. 143-8.

90. Quintanar, L., et al., Shall we dance? How a multicopper oxidase chooses its electron transfer partner. Acc Chem Res, 2007. 40(6): p. 445-52.

91. Ducros, V., et al., Structure of the laccase from Coprinus cinereus at 1.68 A resolution: evidence for different 'type 2 Си-depleted' isoforms. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr., 2001. D57: p. 333-336.

92. Beratan, D.N., et al., Electron-tunneling pathways in proteins. Science, 1992. 258(5089): p. 1740-1.

93. Hakulinen, N., et al., A near atomic resolution structure of a Melanocarpus albomyces laccase. Journal of Structural Biology, 2008. 162(1): p. 29-39.

94. Bento, I., et al., Dioxygen reduction by multi-copper oxidases; a structural perspective. Dalton Trans, 2005(21): p. 3507-13.

95. Castilho, F.J., et al., On the diversity of the laccase gene: a phylogenetic perspective from Botryosphaeria rhodina (Ascomycota: Fungi) and other related taxa. Biochem Genet, 2009. 47(1-2): p. 80-91.

96. Ducros, V., et al., Crystal structure of the type-2 Си depleted laccase from Coprinus cinereus at 2.2 A resolution. Nat Struct Biol, 1998. 5(4): p. 310-6.

97. Hakulinen, N., et al., Crystal structure of a laccase from Melanocarpus albomyces with an intact trinuclear copper site. Nat Struct Biol, 2002. 9(8): p. 601-5.

98. Ferraroni, M., et al., Crystal structure of a blue laccase from Lentinus tigrinus: evidences for intermediates in the molecular oxygen reductive splitting by multicopper oxidases. BMC Struct Biol, 2007. 7: p. 60.

99. Garavaglia, S., et al., The structure of Rigidoporus lignosus Laccase containing a full complement of copper ions, reveals an asymmetrical arrangement for the T3 copper pair. J Mol Biol, 2004. 342(5): p. 151931.

100. Piontek, К., M. Antorini, and Т. Choinowski, Crystal structure of a laccase from the fungus Trametes versicolor at 1.90-A resolution containing a full complement of coppers. J Biol Chem, 2002. 277(40): p. 37663-9.

101. Ducros, V., et al., Structure of the laccase from Coprinus cinereus at 1.68 A resolution: evidence for different 'type 2 Си-depleted' isoforms. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2001. 57(Pt 2): p. 333-6.

102. Lyashenko, A.V., et al., Purification, crystallization and preliminary X-ray study of the fungal laccase from Cerrena maxima. Acta Crystallogr SectF Struct Biol Cryst Commun, 2006. 62(Pt 10): p. 954-7.

103. Polyakov, K.M., et al., Structure of native laccase from Trametes hirsuta at 1.8 A resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2009. 65(Pt 6): p. 611-7.

104. Enguita, F.J., et al., Crystal structure of a bacterial endospore coat component. A laccase with enhanced thermostability properties. J Biol Chem, 2003. 278(21): p. 19416-25.

105. Skalova, Т., et al., The structure of the small laccase from Streptomyces coelicolor reveals a link between laccases and nitrite reductases. J Mol Biol, 2009. 385(4): p. 1165-78.

106. Hakulinen, N., et al., A crystallographic and spectroscopic study on the effect of X-ray radiation on the crystal structure of Melanocarpus albomyces laccase. Biochem Biophys Res Commun, 2006. 350(4): p. 929-34.

107. Ong, E., W.B. Pollock, and M. Smith, Cloning and sequence analysis of two laccase complementary DNAs from the ligninolytic basidiomycete Trametes versicolor. Gene, 1997. 196(1-2): p. 113-9.

108. Yaver, D.S., et al., Purification, characterization, molecular cloning, and expression of two laccase genes from the white rot basidiomycete Trametes villosa. Appl Environ Microbiol, 1996. 62(3): p. 834-41.

109. Wahleithner, J. A., et al., The identification and characterization of four laccases from the plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani. Curr Genet, 1996. 29(4): p. 395-403.

110. Collins, P.J. and A. Dobson, Regulation of Laccase Gene Transcription in Trametes versicolor. Appl Environ Microbiol, 1997. 63(9): p. 34443450.

111. Yaver, D.S. and E.J. Golightly, Cloning and characterization of three laccase genes from the white-rot basidiomycete Trametes villosa: genomic organization of the laccase gene family. Gene, 1996. 181(1-2): p. 95-102.

112. Hoegger, P. J., et al., The laccase gene family in Coprinopsis cinerea (Coprinus cinereus). Curr Genet, 2004. 45(1): p. 9-18.

113. Kiiskinen, L.L., M. Ratto, and K. Kruus, Screening for novel laccase-producing microbes. J Appl Microbiol, 2004. 97(3): p. 640-6.

114. Baralle, D. and M. Baralle, Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. J Med Genet, 2005. 42(10): p. 737-48.

115. Patthy, L., Intron-dependent evolution: preferred types of exons and introns. FEBS Lett, 1987. 214(1): p. 1-7.

116. Rogozin, I.B., et al., Analysis of evolution of exon-intron structure of eukaryotic genes. Brief Bioinform, 2005. 6(2): p. 118-34.

117. Ochman, H., A.S. Gerber, and D.L. Hartl, Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction. Genetics, 1988. 120(3): p. 621-3.

118. Quaratino, D., et al., Production, purification and partial characterisation of a novel laccase from the white-rot fungus Panus tigrinus CBS 577.79. Antonie Van Leeuwenhoek, 2007. 91(1): p. 57-69.

119. D'Souza, T.M., K. Boominathan, and C.A. Reddy, Isolation of laccase gene-specific sequences from white rot and brown rot fungi by PCR. Appl Environ Microbiol, 1996. 62(10): p. 3739-44.

120. Liu, W., et al., Molecular cloning and characterization of a laccase gene from the basidiomycete Fome lignosus and expression in Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol, 2003. 63(2): p. 174-81.

121. Bonomo, R.P., et al., A comparative study of two isoforms of laccase secreted by the "white-rot" fungus Rigidoporus lignosus, exhibiting significant structural and functional differences. J Inorg Biochem, 1998. 71(3-4): p. 205-11.

122. Nicole, M., et al., Immunocytochemical localization of laccase LI in wood decayed by Rigidoporus lignosus. Appl Environ Microbiol, 1992. 58(5): p. 1727-39.

123. Heinzkill, M., et al., Characterization oflaccases and peroxidases from wood-rotting fungi (family Coprinaceae). Appl Environ Microbiol, 1998. 64(5): p. 1601-6.

124. Joo, S.S., et al., Molecular cloning and expression of a laccase from Ganoderma lucidum, and its antioxidative properties. Mol Cells, 2008. 25(1): p. 112-8.

125. Hellman, N.E., et al., Biochemical analysis of a missense mutation in aceruloplasminemia. J Biol Chem, 2002. 277(2): p. 1375-80.

126. Jasalavich, C.A., A. Ostrofsky, and J. Jellison, Detection and identification of decay fungi in spruce wood by restriction fragment length polymorphism analysis of amplified genes encoding rRNA. Appl Environ Microbiol, 2000. 66(11): p. 4725-34.

127. Lyashenko, A.V., et al., X-ray structural studies of the fungal laccase from Cerrena maxima. J Biol Inorg Chem, 2006. 11(8): p. 963-73.1. БЛАГОДАРНОСТИ

128. Автор выражает глубокую признательность:

129. Полякову К.М. ст.н.с. Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН за оказанную помощь в проведении анализа структур лакказ.

130. Упорову И.В ст.н.с. кафедры химической энзимологии Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова за помощь в проведении математического моделирования структур лакказ.

131. Рожковой A.M. н.с. Института биохимии имени А.Н. Баха РАН за оказанную помощь в проведении экспериментов по клонированию генов лакказ.

Информация о работе

Черкашин, Евгений Александрович
кандидата химических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Структурно-генетическая организация лакказ базидиальных грибов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Структурно-генетическая организация лакказ базидиальных грибов ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-генетическая организация лакказ базидиальных грибов"

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Черкашин, Евгений Александрович

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-генетическая организация лакказ базидиальных грибов"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Черкашин, Евгений Александрович

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Черкашин, Евгений Александрович, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-генетическая организация лакказ базидиальных грибов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия