Характеристика изоформ лакказы гриба Cerrena unicolor

Лисова, Зоя Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика изоформ лакказы гриба Cerrena unicolor
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика изоформ лакказы гриба Cerrena unicolor"

На правах рукописи

Лисова Зоя Александровна

4854394

ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОФОРМ ЛАККАЗЫ ГРИБА CERRENA UNICOLOR

03.01.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2011

1 7 ФЕВ 2011

4854394

Работа выполнена в Путинском государственном университете на базе лаборатори микробной энзимологии Учреждения Российской академии наук Института биохимш и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино

Научный руководитель: доктор биологических наук

A.A. Яеонтьевский

доктор биологических наук Г.Д. Миронова доктор биологических наук И.Г. Моргунов

Учреждение Российской академи наук Институт биохимии им. А. Баха РАН

Защита диссертации состоится «оЗ » дl/O^lstf 2011 г. в^^асов CtZma. на заседани Диссертационного совета Д 002.121.01 при Учреждении Российской академии на Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН п адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, проспект Науки, д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академш наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН. Автореферат размещен на сайте: http://www/ibpm.ru/ Автореферат разослан « '/» <73e£jpCZt/d) 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биол. наук

В.М.Вагабов

Актуальность проблемы

Лакказа (К.Ф. 1.10.3.2, пара-дифенол: кислород оксидоредуктаза) медьсодержащий фермент - катализирует окисление широкого спектра субстратов кислородом, восстанавливая его до воды. Этот фермент обнаружен у бактерий, грибов, растений и насекомых. Лакказа участвует в процессах синтеза меланинов, пигментов, развитии спор, детоксикации опасных метаболитов, деградации лигнина (Thurston, 1994; Leonovvicz et al., 2001; Eggert et al., 1996a). Лакказы могут продуцироваться в виде единственной формы фермента, но чаще - в виде множественных форм. Наиболее изучены лакказы грибов-базидиомицетов, вызывающих белую гниль древесины.

Лакказа обладает особыми каталитическими свойствами: обладает высоким редокс-потенциалом (Е° лакказ базидиальных грибов достигает 790 мВ); лакказа неспецифична (способна окислять широкий набор субстратов, различающихся по строению и свойствам: moho-, ди-, полифенолы, амино- и метоксизамещенные фенолы, ароматические амины; неорганические ионы ([Mo(CN)8]4', [Fe(CN)6]4", [Os(CN)6]4", [W(CN)g]4",Mn2+); спектр субстратной специфичности может быть значительно расширен при участии в реакции низкомолекулярных соединений, так называемых редокс-медиаторов (пара лакказа/медиатор способна окислять субстраты с редокс-потенциалом, превышающим 1100 мВ); лакказы бактериального происхождения часто отличаются высокой термостабилыюстыо (сохраняют каталитическую активность при 80-90°С) и катализируют реакции при нейтральных или щелочных значениях pH; для катализа не требуются кофакторы (фермент зависим лишь от наличия кислорода воздуха).

Эти качества сделали лакказу одним из наиболее распространенных инструментов в современной биотехнологии для разрушения ксенобиотиков, трансформации продуктов разложения лигнина, делигнификации и отбеливания растительного волокна, обесцвечивания красителей в стоках текстильного производства, при получении древесноволокнистых плит, древесных блоков и картона без применения токсичных связующих, в косметике, в пищевой промышленности, в органическом синтезе.

Несмотря на огромный потенциал использования лакказ в биотехнологии, примеров практического применения лакказ в промышленных масштабах немного: лакказы хорошо известны как компоненты красок для волос, препарат Deni Lite II (Novo Nordisk Co) используется для отбеливания хлопчатобумажных тканей в текстильной промышленности.

Причины такого несоответствия заключаются в том, что пока не удается найти или сконструировать фермент, который сочетал бы в себе все перечисленные особенности лакказ разного происхождения. Например, лакказы бактерий имеют низкии редокс-потенциал (Е° = 300 - 400 мВ), лакказы базидиомицетов редко бывают термостабильными, еще реже - активными при нейтральных и щелочных значениях pH.

Поэтому поиск новых ферментов по-прежнему актуален, причем особенно востребованы ферменты с высоким редокс-потенциалом, термостабильные и активные в области pH, близкой к нейтральной. При этом, как правило, исследователи ориентированы на доминирующие формы в семействах множественных изоформ лакказ, так что минорные формы или трудноразделяемые формы лакказ остаются неизученными.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования было сравнительное изучение двух изоформ лакказы базидиомицета Cerrena unicolor ВКМ F-3196.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1) Провести скрининг продуцентов лакказы среди грибов-базидиомицетов для отбора наиболее эффективного продуцента.

2) Изучить условия продуцирования лакказы отобранным штаммом гриба С. unicolor ВКМ F-3196 и определить оптимальный индуктор.

3) Разработать схему очистки двух изоформ лакказы С. unicolor ВКМ F-3196 и получить их препараты в электрофоретически гомогенном состоянии.

4) Изучить физико-химические и каталитические свойства очищенных ферментов.

5) Определить нуклеотидные и аминокислотные последовательности двух изоформ лакказы С. unicolor ВКМ F-3196.

6) Изучить структурную организацию двух изоформ лакказы С. unicolor ВКМ F-3196.

7) Оценить возможность применения лакказы С. unicolor ВКМ F-3196 в биотехнологии.

Научная новизна

Впервые выделены и охарактеризованы две изоформы гриба базидиомицета С. unicolor ВКМ F-3196. Разработана схема очистки, позволяющая надежно разделять и получать с большим выходом две изоформы лакказы. Детально изучены их физико-химические и каталитические свойства. Определены неполные нуклеотидные и аминокислотные последовательности. Доказано, что изоферментный состав лакказы С. unicolor ВКМ F-3196 связан с наличием разных генов в геноме базидиомицета. Впервые определена экзон-интронная структура фрагментов гена лакказы С. unicolor ВКМ F-3196. Смоделирована и охарактеризована трехмерная структура двух изоформ лакказы С. unicolor ВКМ F-3196.

Практическая значимость

Показано, что одна из изоформ лакказы (LacCl) имеет высокую термостабильность, сохраняет активность при нейтральных значениях рН, обладает высокой каталитической активностью в отношении фенольных соединений, что определяет широкие возможности применения данного фермента в биотехнологических целях. На примере реакции фермента с высокотоксичным ксенобиотиком - пентахлорфенолом, показана возможность использования системы ЬасС1/1-гидроксибензотриазол в качестве агентов первичной атаки при разработке технологических приемов очистки природных сред, загрязненных хлорфенолами. Показана возможность применения лакказы в синтезе лигниноподобных водорастворимых полимеров, обладающих противовирусной активностью. Впервые показана антивирусная активность препаратов, полученных в реакциях сополимеризации с участием лакказы.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: «Современная биотехнология - защите окружающей среды»

(Пущино, 2006), «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино, 2007); 12-й и 13-й Международных Путинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2008, 2009), 16-й международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009), а также на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2006, 2010). По материалам диссертации опубликованы 3 статьи из списка, рекомендованного ВАК, патент RU № 2394912 С2 (17.06.2008.) и 4 тезиса.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, список литературы и приложение. Работа изложена на 193 страницах, содержит 47 рисунков, 13 таблиц. Библиографический указатель содержит 440 источников литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования н условия культивирования. В работе были использованы 23 штамма базидиомицетов из коллекции лаборатории микробной энзимологии ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН. Основным объектом являлся базидиомицет Cerrería unicolor ВКМ F-3196.

В работе были использованы следующие среды: среда для скрининга грибов на продукцию лакказы (среда А), в состав которой входили (г/л): NH4NO3 - 0,2; КН2Р04- 0,2; К2НР04 - 0,02; MgS04 - 0,12; мальт-экстракт - 20; агар - агар - 19; соево-глицериновая среда; пептон-глюкозная среда; среда Кирка («Basal-II medium» (Kirk et al., 1978; Fenn and Kirk, 1981)) с высокой концентрацией азота; среда Лурия-Бертани (LB); среда SOC.

Скрининг грибов-продуцентов лакказы проводили в два этапа. На первом этапе культивирование проводили на агаризованной среде А с одним из индукторов (гваякол, вератровый спирт, C11SO4 в концентрации 1 мМ). На девятые сутки роста с каждой чашки были вырезаны кусочки мицелия диаметром 6,85 мм и помещены на чашки с агаризованной средой А, содержащей 0,5 мМ АБТС (индикатор лакказной активности). Чашки с кусочками мицелия инкубировали в течение 22 ч при 29°С. Оценка лакказной активности проводилась по величине характерной темно-зеленой зоны, образовавшейся в результате катализируемого лакказой окисления АБТС. Количественно активность лакказы выражали с помощью коэффициента Кц, который равен отношению диаметра окрашенной зоны (Dez, мм) к диаметру колонии (кусочка мицелия) (De, мм) (Gochev and Krastanov, 2007).

На втором этапе скрининга отобранные в ходе первого этапа штаммы культивировали на минеральной среде Кирка с индуктором (CuS04, гваякол или вератровый спирт в концентрации 1 мМ).

Очистка фермента. Культуральную жидкость (КЖ) отделяли от мицелия фильтрацией, концентрировали ультрафильтрацией на полых волокнах (аппарат разделительный АР-0,2-15ПА) с последующим высаливанием до 90 % от насыщения (NH4)2S04. Препараты лакказ получали в 5 стадий, включавших ионообменную

хроматографию на ДЭАЭ -Sepharose CL с линейным градиентом 0 - 1 М NaCl в 20 мМ Na - ацетатном буфере, рН 5,0 (буфер А), гидрофобную хроматографию на Phenyl-Sepharose с линейным градиентом 1-ОМ (NH^SC^ в буфере А, анионообменную хроматографию на MonoQ5/50 GL с линейным градиентом 0 - 0,5 М NaCI в 5 мМ Na - ацетатном буфере, рН 5,0 (буфер В), препаративную изоэлектрофокусировку (ИЭФ) в слое гранулированного геля Sephadex IEF, гельфильтрацию на Superdex 200. Активные фракции объединяли, концентрировали с помощью микроконцентраторов Vivaspin 2 (Sartorius group, США). Ионообменную хроматографию на колонке MonoQ5/50 GL, гидрофобную хроматографию и гельфильтрацию проводили с помощью системы ACTA FPLC (General electric, США).

Активность лакказы определяли по скорости окисления АБТС со спектрофотометрической фиксацией окисленного продукта при 420 нм, е42о=36000 М"'см"' (Heinfling et al., 1998). За единицу активности принимали количество фермента, образующего 1 мкмоль продукта за 1 мин.

Концентрацию белка определяли методом Бредфорд (Bradford ,1976).

Денатурирующий электрофорез очищенных ферментов проводили по методу Леммли (Laemmli, 1970) с 0,1% додецилсульфатом Na (SDS) в 12% полиакриламидном геле (ПААГ). Белки в гелях окрашивали Coomassie Brilliant Blue R-250 no Fairbanks et al. (1971). Молекулярная масса денатурированного белка определялась с помощью маркеров (General Electric, США).

Натнвный электрофорез фермента проводили в системе для кислых белков. Специфическое окрашивание лакказы в геле проводили 1 мМ гваяколом.

Аналитическую ИЭФ проводили в 5% ПААГ в градиенте рН 3,0 - 10,0 (Pharmalytes, Sigma). Изоэлектрические точки определяли с помощью набора маркеров Amersham Calibration Kits for pi Determinations using Isoelectric Focusing Broad range pi (pH 3-10) (GE Healthcare, США).

Спектры поглощения лакказ в УФ/видимой области регистрировали на спектрофотометре Shimadzu UV - 1650 PC в буфере А при комнатной температуре.

Спектры кругового дихроизма (КД) получали на спектрополяриметре JASCO - 600 (Япония) в диапазонах длин волн от 200 нм до 250 нм. Измерения проводились в 0,1 мм кювете при концентрации белков 1 мг/мл.

Углеводный состав лакказы определяли с помощью Carbohydrate Analyzer LC2000 BIOTRONIC (German). Препараты фермента гидролизовали в присутствии трифторуксусной кислоты в течение 4 ч при 100°С.

Дегликозилирование лакказы проводили с помощью трифторметансульфоновой кислоты (ТФМС) (Edge A. et al., 1981), а также с использованием Enzymatic Protein Deglycosylation Kit и Native Protein Deglycosylation Kit (Sigma-Aldrich, США) согласно инструкции производителя.

Определение рН оптимумов окисления субстратов проводили в 0,1 М буфере Britton and Robinson в интервале рН 2,7 - 7,2.

Температурный оптимум определяли в диапазоне температур 25°С - 82°С для изоформы LacCl и 25°С - 76°С для изоформы LacC2 по скорости окисления АБТС в буфере А. %

Термостабильность лакказ определяли в буфере А. Для оценки стабильности лакказ фермент инкубировали при температуре 50°С, 60°С или 70°С в течение часа, измеряя остаточную активность через каждые 5 мин.

Плавление белков проводили, измеряя зависимость эллиптичности на длине волны 215 нм от температуры. Скорость нагрева составляла 1°С/мин.

Определение каталитических констант. Значения Кт и Vmax определяли с помощью линеаризации уравнения Михаэлиса-Ментен в двойных обратных координатах 1/V и 1/S. Значения рК ионогенных групп, участвующих в катализе, определяли построением зависимости logVmax/Km от величины pH.

N-концевые аминокислотные последовательности определяли с помощью фенилизотиоционатного метода Эдмана на белковом секвенаторе (модель 477А, Applied biosystems, США), оснащенном он-лайн анализатором (модель 120А, Applied biosystems, США) для автоматической идентификации фенилтиогидантионовых производных аминокислот.

MALDI TOF MS анализ. Масс-спектры белков были получены на тандемном MALDI-времяпролетно-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенном УФ лазером (Nd). Масс-спектры получены в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона; точность измеренных моноизотопных масс в рефлекто-моде после докалибровки по пикам автолиза трипсина составляла 0,007%, точность измеренных масс фрагментов составляла 1 Да.

Молекулярно-генетические методы. Препарат общей ДНК получали по методике Aljanabi and Martinez (1997). Для амплификации гена лакказы с геномной ДНК использовали прямой праймер lccClf (5'-ATCGGGCCTGTCGCTGACAT-3'), который был сконструирован на основании N-концевой аминокислотной последовательности лакказы LacCl, и обратный праймер lccCr (5'-GATGTGGCAGTGGAGGAACCA-3) (сконструирован на основании консервативной для базидиомицетных лакказ гистидинбогатой С-концевой последовательности четвертого медьсвязывающего сайта, расположенного в С-концевой области белка). Продукты ПЦР разделяли с помощью гель-электрофореза в 0,8% агарозном геле в присутствии этидиума бромида (1%) в однократном буфере ТАЕ (50-кратный раствор ТАЕ: 2М Трис-ацетат (pH 7,6), 0,05 М ЭДТА). Выделение и очистку ДНК из агарозного геля проводили с использованием коммерческого набора DNA Extraction (Fermentas, Литва). Очищенный ПЦР фрагмент был клонирован в Escherichia coli DH10B (Invitrogen, США) в составе векторной плазмиды pAL-TA (Евроген, Россия). Процедуры клонирования были выполнены в соответствии со стандартными методиками (Sambrook et al., 1989). Идентификация и отбор трансформантов E.coli со вставкой осуществлялись на основе «бело-голубой» селекции. Клоны анализировали на наличие вставки необходимого размера с помощью ПЦР с колоний с использованием специфических праймеров, а также с помощью ПЦР с препарата выделенной плазмиды. Плазмидную ДНК выделяли с использованием набора реактивов Plasmid Midiprep Kit (BioRad, США). Секвенирование выполнено на секвенаторе DNA Analysis System CEQ 2000 XL (Beckman Coulter, США) с использованием набора реактивов GenomeLab™ Methods Development Kit Dye Terminator Cycle Sequencing и на секвенаторе Genetic Analyzer 3130XL (Applied Biosystems) с использованием набора реактивов Big dye sequencing kit ver. 3.1 согласно рекомендациям производителя.

Суммарную РНК получали с помощью реагента TRI REAGENT™ (Sigma, США). Для очистки РНК использовали набор RNeasy Mini (Qiagen, США). Качество РНК и ее концентрацию в препарате оценивали электрофоретически. Электрофорез РНК проводили в 1% агарозном геле и буфере того же состава, что и электрофорез

ДНК, но с добавлением формальдегида в качестве ингибитора РНКаз. В ТАЕ буфер и агарозный гель формальдегид добавляли в 50-кратном разведении, в краску для нанесения образцов - в 15-кратном. Препараты РНК хранили при -70°С. Обратную транскрипцию проводили с использованием набора реагентов Revert Aid H Minus First Strand cDNA Synthesis (Fermentas, Литва) (в качестве праймера использовали универсальный праймер Oligo(dT)is). Для амплификации гена лакказы с кДНК использовали прямой вырожденный праймер lccCf2 (5'-GCNATHGGYCCNGTNGC-3'), сконструированный на основании N-концевых аминокислотных последовательностей LacCl и LacC2, и обратный праймер lccCr. ПЦР-амплификацию проводили с использованием набора Encyclo PCR (Евроген, Россия) в градиенте температур 51°С - 61°С. Продукты ПЦР разделяли с помощью гель-электрофореза в 1% агарозном геле в присутствии этидиума бромида (1%) в однократном буфере ТАЕ. Для выделения ДНК из агарозного геля использовали набор Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, США). Очищенный продукт использовали как матрицу для секвенирования. Секвенирование выполнено на секвенаторе Genetic Analyzer 3130XL (Applied Biosystems) с использованием набора реактивов Big dye sequencing kit ver .3.1. Анализ полученных последовательностей проводили с помощью программ Chromas и базы данных GenBank. Анализ нуклеотидных последовательностей, их трансляцию в аминокислотные последовательности осуществляли при помощи пакета программ Vector NTI AdvanceTM v. 10. Сравнительный анализ последовательностей ДНК и белков проводили с помощью программы BLAST (Altschul et al., 1997), доступной с сервера (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), а также с помощью пакета программ Vector NTI AdvanceTM v. 10, используя последовательности, депонированные в GenBank и Protein Data Bank. Предварительный поиск близких последовательностей проводили с использованием программы BLAST, расчет степени идентичности - с помощью программы Vector NTI AdvanceTM v. 10, используя гомологичные последовательности, найденные с помощью BLAST.

Компьютерное моделирование. Компьютерное моделирование структур лакказ проводили с помощью пакета программ SWISS-MODEL на основе имеющихся в Protein Data Bank рентгеноструктурных данных (http://swissmodel.expasy.org) (Arnold et al., 2006; Schwede et al., 2003; Guex and Peitsch, 1997). Модельные структуры лакказ визуализировали с помощью пакета программ «PyMol 0_99».

Реакция лакказы с пентахлорфенолом (ПХФ) и идентификация продуктов. Реакцию проводили при 30°С в 20 мМ Na-тартратном буфере, pH 5,0, содержащем 40% этанола и 2 мМ ПХФ. Объём реакционной смеси - 1 мл, количество фермента - 25 Ед. Концентрация медиатора - 1-гидроксибензотриазола, составляла 1 мМ. ПХФ и продукты его реакции с лакказой разделяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (хроматограф «LKB», Швеция), на колонке Nova-Pak С18 (3,9 х 150 мм, «Waters», США) в линейном градиенте: 1%-ная уксусная кислота - метанол, 0 - 60% метанола за 6 мин при скорости потока 1 мл/мин. Продукты трансформации ПХФ определяли по времени удерживания. Для идентификации разделяемых соединений, элюаты ВЭЖХ собирали и определяли методом масс-спектрометрии на приборе Finnigan Mat 8430 (Германия).

Синтез лигниноподобных водорастворимых полимеров (ЛВП).

Сополимеризацию фенольных соединений с АБТС проводили в буфере А при 30°С. Реакцию начинали внесением лакказы в количестве 0,01 Ед/мл и проводили в течение суток. Затем реакционную смесь диализовали против дистиллированной воды в мешках для диализа с размером пор 10 кДа. Диализованный препарат концентрировали с помощью роторного вакуумного испарителя и высушивали в вакуум-эсикаторе. Сополимеризацию фенольных соединений с акриламидом проводили в аналогичных условиях, за исключением состава реакционной среды, которая включала акриламид, фенольное соединение и персульфат аммония. Реакцию также начинали внесением лакказы в количестве 0,01 Ед/мл. Выход определяли как выраженное в процентах отношение массы полученного препарата к массе исходных мономеров.

Определение токсичности ЛВП в отношении клеток. Клетки почки хомяка линии ВНК-21 выращивали в 96-ти луночном планшете в среде DMEM. В каждую лунку засевали 15 тыс. клеток. Культивировали в течение 24 ч при +37°С в инкубаторе с 10% концентрацией С02. Клетки выращивали до полного монослоя. Препараты ЛВП разводили в ростовой среде DMEM. В лунки, содержащие клетки, вносили по 100 мкл препарата ЛВП, инкубировали 72 ч в СОг инкубаторе. Анализировали визуально в течение четырех дней.

Исследование антивирусной активности ЛВП. Антивирусную активность ЛВП определяли в отношении альфагерпесвируса - вируса болезни Ауески PRV (Suid herpesvirus 1), штамм К. Вирус разводили до концентрации 1:100 в среде DMEM, содержащей препараты ЛВП с концентрациями 0,5 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,005 мг/мл. В качестве контроля использовали препарат вируса, приготовленный на ростовой среде DMEM, не содержащей ЛВП. Разведенными препаратами вирусов заражали клетки и культивировали их в течение 48 ч при +37°С в инкубаторе с 10% концентрацией СО2. Противовирусную активность определяли визуально по образованию вирусных бляшек через 48 ч культивирования.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Скрининг грибов-продуцентов лакказы и отбор наиболее эффективного

продуцента лакказы

Для отбора наиболее эффективного продуцента лакказы были исследованы 23 штамма базидиомицетов из коллекции лаборатории микробной энзимологии ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН. На первом этапе скрининга штаммы тестировали на чашках Петри со средой А, как индикатор лакказной активности использовали АБТС. Использование среды А обусловлено её универсальностью, среда содержит все необходимые элементы питания и подходит для роста большинства базидиальных грибов. В качестве индукторов лакказы в среду А вносили вещества, являющиеся обычными индукторами лакказы у грибов - базидиомицетов: вератровый спирт, гваякол, ионы Си2+. Активность лакказы была обнаружена у 14 штаммов. Для второго этапа скрининга были отобраны штаммы, значение KL которых превышало 1,5 Ед (Pleurotus cornucopiae ВКМ F-1979, PI. eryngii ВКМ F-2402, PL ostreatus В KM F-3468, Fomes fomentarius BKM F-3203, Ganoderma applanatum BKM F-3208,

Trámeles sp., Lentinula edodes BKM F- 2001, G. lucidum FW-1125, Agaricus bisporus BKM F-1998, Ag. bisporus BKM F-1589, Armillaria mellea BKM F-1163, G. applanatum BKM F-717, Cerrería unicolor BKM F-3196). Субстраты сложного состава (мальт-экстракт, пептон) содержат ароматические соединения, которые могут бьггь индукторами лакказы. Поэтому для второго этапа скрининга грибы выращивали на синтетической среде Кирка. Инокулят для засева грибов на среду Кирка выращивали на соево-глицериновой среде в течение 5 суток. Пять штаммов (A. mellea BKM F-1163, Ag. bisporus BKM F-1998, Ag. bisporus BKM F-1589, L. edodes BKM F-2001, G. lucidum FW-1125) не росли на соево-глицериновой среде, поэтому для получения инокулята данные грибы выращивали на пептон-глюкозной среде в течение 8 суток. На втором этапе скрининга для каждого штамма использовали тот индуктор, который оказался более эффективным на первом этапе скрининга при выращивании на агаризованной среде. У пяти штаммов (Ag. bisporus BKM F-1589, A. mellea BKM F-1163, G. applanatum BKM F-717, L. edodes BKM F-2001, G. lucidum FW-1125) при росте на среде Кирка активности лакказы обнаружено не было. У шести штаммов (PL cornucopiae BKM F-1979, PI. eryngii BKM F-2402, PI. ostreatus BKM F-3468, F. fomentarius BKM F-3203, G. applanatum BKM F-3208, Ag. bisporus BKM F-1998) была обнаружена следовая активность лакказы (менее 0,02 Ед/мл). Только два штамма (С. unicolor BKM F-3196 и Trametes sp.) синтезировали лакказу в значительных количествах, при этом максимальная активность лакказы С. unicolor BKM F-3196 превышала таковую Trametes sp. почти в 2 раза и составляла 7,3 Ед/мл.

В результате проведенного скрининга в качестве объекта исследования был выбран штамм С. unicolor BKM F-3196.

2. Изучение индукции лакказы гриба С. unicolor

Лакказа гриба С. unicolor BKM F-3196 была индуцибельным ферментом, в отсутствие индуктора наблюдалась только следовая активность. Обычными индукторами лакказы являются ароматические соединения и неорганические ионы. Поэтому в качестве индукторов в первую очередь использовали ароматические соединения, которые разделили на две группы. Фенольные соединения - субстраты лакказы: 2,6-диметоксифенол (2,6-ДМФ), 2,6-диметилфенол, 3,4,5-тригидроксибензойная кислота (галловая кислота), 2-метоксифенол (гваякол), таниновая кислота. Нефенольные соединения: 2-метоксибензальдегид, 3-метоксибензальдегид, 4-метоксибензальдегид, бензиловый спирт, 2-метилбензиловый спирт, 3-метилбензиловый спирт, 4-метилбензиловый спирт, 4-метоксибензиловый спирт, 3,4-диметоксибензиловый спирт. Также в качестве индукторов использовали неорганические ионы: Си2+ и Мп2+. Концентрация всех индукторов была 1 мМ, кроме таниновой кислоты, концентрация которой составляла 0,002%, поскольку это соединение не имеет определенной химической формулы. Все ароматические соединения были неэффективны в качестве индукторов. Незначительная активность лакказы наблюдалась только в присутствии 2-метоксифенола (0,18 Ед/мл) и 3,4-диметоксибензилового спирта (0,14 Ед/мл). Лучшим индуктором являлись ионы Си2+, в присутствии которых активность лакказы увеличивалась более чем в 2000 раз по сравнению с контролем и достигала 7,2 Ед/мл на восьмые сутки культивирования. Известно, что ионы Си2+ регулируют транскрипцию генов лакказы (Collins and Dobson, 1997; Galhaup et al., 2002). О стимулирующем влиянии ионов меди на продукцию лакказы С. unicolor уже

сообщалось, однако эффективные концентрации ионов меди заметно варьировали, как для С. unicolor, так и в случае других грибов (Michniewicz et al., 2006; Степанова с сотр., 2003; Palmieri et al., 2000; Galhaup and Haltrich, 2001). В нашем случае при увеличении концентрации ионов меди выше 0,1 мМ активность лакказы падала, что может объясняться токсичным эффектом высоких концентраций ионов Си2+. Известно, что совместное использование индукторов различной химической природы может приводить к увеличению продукции лакказы по сравнению с использованием каждого индуктора в отдельности (Collins and Dobson, 1997; De Souza et al., 2004). Было изучено два варианта совместного внесения различных индукторов в питательную среду (Си2+ с 2-метоксифенолом и Си2+ с 3,4-диметоксибензиловым спиртом). 2-Метоксифенол и 3,4-диметоксибензиловый спирт были выбраны на том основании, что из протестированных в качестве индукторов ароматических соединений незначительное повышение продукции лакказы отмечалось только в присутствии данных соединений. В обоих вариантах совместного внесения ионов меди и ароматического соединения кумулятивного эффекта на продукцию фермента не было обнаружено. Продукция лакказы в присутствии только Си2+ была выше, чем при совместном использовании индукторов.

Для оптимизации условий получения лакказы было изучено влияние на продукцию фермента различных концентраций Си2+: 0,05 мМ; 0,1 мМ; 0,5 мМ; 1 мМ; 1,5 мМ, 2мМ. Оптимальная концентрация Си2+ составляла 0,1 мМ. Активность лакказы в присутствии такой концентрации меди составляла 15 Ед/мл на восьмые сутки культивирования (рис. 1).

I 18 íf 16 а 14 й 12

2 4 6 8 10 12 14

Время культивирования, сутки

Рисунок 1. Активность лакказы гриба С. unicolor ВКМ F-3196 в зависимости от различных концентраций ионов Си2+. (□ - 0 мМ; ■ -0,05 мМ; А - 0,1 мМ; Д - 0,5 мМ; * - 1,0 мМ; 0 - 1,5 мМ; I- - 2,0 мМ).

Увеличение продукции лакказы С. unicolor ВКМ F-3196 при культивировани на минеральной среде Кирка с 1 мМ-Си2+ более чем в 2000 раз (соответственно, при оптимальной концентрации Си2+ 0,1 мМ - почти в 5000 раз) по сравнению с контролем представляет показательный пример индукции и соответствует лучшим мировым результатам.

3. Очистка изоформ лакказы

В ходе культивирования на среде Кирка с ионами Си2+ в качестве индуктора базидиомицет С. unicolor ВКМ F-3196 продуцировал лакказу в виде двух изоформ, LacCl и LacC2. У базидиальных грибов часто наблюдается наличие множественных изоформ лакказы. Изоферментный состав лакказы базидиомицета С. unicolor варьирует от штамма к штамму. Единственная изоформа лакказы С. unicolor была

обнаружена в культурах штаммов CFC- 120, Т143, IBB 62, 0784 (Kim et al., 2002; Gianfreda et al., 1998; Беккер с сотр., 1990; Степанова с сотр., 2003). Из культуры С. unicolor 137 были выделены и очищены две изоформы лакказы (Michniewicz et al., 2006), у С. unicolor 059 обнаружили две доминирующие и одну минорную формы лакказы (Степанова с сотр., 2003).

Внеклеточная лакказа была выделена и очищена из культуральной жидкости (КЖ) С. unicolor ВКМ F-3196 в период максимальной активности, который наступал на восьмые сутки культивирования на модифицированной среде Кирка с 0,1 мМ CuS04.

Наибольшую сложность при очистке фермента представляло разделение двух изоформ, близких по молекулярной массе и заряду. В ходе исследования была разработана схема очистки, обеспечивающая надежное разделение двух изоформ с высоким выходом (33,5% для LacCl и 31% для LacC2). Оптимизированная схема очистки включала следующие стадии.

Стадия I. Получение исходного ферментного препарата. КЖ отделяли от мицелия фильтрованием, затем концентрировали ультрафильтрацией на полых волокнах с помощью аппарата разделительного АР-0,2-15ПА.

Стадия 2. Белки КЖ осаждали (NH4)2S04 при 90% от насыщения. Осадок растворяли в буфере А, диализовали против буфера А.

Стадия 3. Анионообменная хроматография на ДЭАЭ-Sepharose CL. Препарат наносили на колонку с ДЭАЭ-Sepharose CL, уравновешенную буфером А. Элюировали белок градиентом 0 - 1М NaCl в буфере А, скорость элюции 1 мл/мин, фракции по 5 мл. Фракции с активностью лакказы объединяли, диализовали против 1 М (NH4)2S04 в буфере А. Применение ДЭАЭ-Sepharose CL позволило отделить фермент от пигмента, присутствие которого было нежелательно из-за его необратимой адсорбции на носителях при последующих стадиях хроматографии.

Стадия 4. Гидрофобная хроматография на Phenyl-Sepharose. Диализованный препарат наносили на колонку с Phenyl-Sepharose, уравновешенную 1 М (NH^SC^ в буфере А. Белки элюировали градиентом 1-ОМ (NH4)2S04 в буфере А со скоростью 1 мл/мин, объем фракций 5 мл. Активные фракции объединяли, диализовали против буфера В.

Стадия 5. Анионообменная хроматография на MonoQ5/50 GL. Препарат наносили па колонку, предварительно уравновешенную буфером В. Скорость нанесения 0,5 мл/мин. Связавшиеся белки элюировали линейным градиентом 0 - 0,5 М NaCl в буфере В. Скорость элюции 0,5 мл/мин, объем фракций 1 мл.

Стадия б. Разделение двух изоформ достигалось в ходе проведения препаративной ИЭФ в слое гранулированного геля Sephadex IEF. Две четкие зоны геля Sephadex, содержащие изоформы лакказы, собирали по отдельности. Sephadex из каждой зоны переносили в колонки 130 х 25 мм, суспендировали в буфере В, давали осесть гелю, а затем элюировали лакказу примерно четырьмя - пятью объемами буфера В по отношению к объему исходного геля Sephadex. Гомогенность каждого препарата проверяли с помощью нативного и SDS-электрофореза. Полученные препараты двух изоформ лакказы концентрировали по отдельности с помощью микроконцентраторов Vivaspin 2.

Стадия 7. Удаление амфолинов из препаратов фермента проводили в ходе гельфильтрации на Superdex 200, уравновешенной буфером В. Элюировали лакказу тем же буфером, скорость элюции 0,8 мл/мин, объём фракций 1 мл. Полученные

активные фракции объединяли, концентрировали с помощью микроконцентраторов Х^уаэрт 2. Гомогенность полученных препаратов была подтверждена электрофоретически, а также идентичностью М-концевых аминокислотных последовательностей очищенных белков.

4. Характеристика лакказ 4.1. Молекулярные свойства ЬассС1 и ЬассС2

Лакказа - гликопротеин. По данным ЭОЗ-ПААГ электрофореза молекулярные массы ЬасС1 и ЬасС2 составляли 75 кДа и 67 кДа, соответственно (рис. 2). Кажущиеся молекулярные массы лакказ, определенные методом гельфильтрации, были равны 75 кДа для ЬасС1 и 57 кДа для ЬасС2. Следовательно, исследованные лакказы имели односубъединичную структуру белковой части молекулы.

Дегликозилирование с помощью ТФМС, а также с использованием ферментов М-гликозидазы Р и эндогликозидазы П позволило достоверно определить степень гликозилирования белков: 16% и 6% для ЬасС! и ЬасС2, соответственно (молекулярная масса ЬасС1 снижалась с 75 до 63 кДа, ЬасС2 - с 67 до 63 кДа) (рис. 2,3).

кДа м 1 2 3 4

Рисунок 2. ЗОБ-ПААГ электрофорез 30—► «и» лакказ ЬасС1 и ЬасС2 после

дегликозилирования ТФМС: М -белш-маркеры, 20,1—► <** 1 -ЬасС1, 2 - ЬасС 1 после дегликозилирования,

3 - ЬасС2, 4 - ЬасС2 после дегликозилирования.

кда .... М........1 2 3 4 5 6 7

97—► яя?

г , . Ш .. . .:;/ :::

00—щщф »и» «•

45—► 88) •

кда м 1 2 3 4 5 6 7

97—► ¡¡ш

66 ^ ЩШ тот .„.,.;,., шит й»

45—► в

30-К в» 20,1—► <•» 14,4—

Рисунок 3. ЗОБ-ПААГ электрофорез лакказ ЬасС1 (А) и ЬасС2 (Б) после энзиматического дегликозилирования: М - белки-маркеры, 1 - лакказа, обработанная О - гликозидазой; 2 - лакказа, обработанная М-гликозидазой И; 3 - лакказа, обработанная О - гликозидазой + М-гликозидазой Р; 4 - недегликозилированная лакказа; 5 - лакказа, обработанная эндогликозидазой Р1; 6 - лакказа, обработанная эндогликозидазой Р2; 7 - лакказа, обработанная эндогликозидазой РЗ.

Отсутствие эффекта при обработке LacCl и LacC2 О-гликозидазой указывает на отсутствие углеводных цепей, связанных с белковой молекулой через остатки серина или треонина, т.е. О-тип гликозилирования не характерен для исследованных лакказ. В то же время, дегликозилирование лакказ N-гликозидазой F и эндогликозидазой F1 указывает на связь углеводных цепей через остатки аспарагина белковой цепи в сайтах Asn - X - Ser/Thr (N - X - S/T). Следовательно, для LacCl и LacC2 характерен только N-тип гликозилирования (рис. 3). Отсутствие влияния эндогликозидаз F2 и F3 на молекулярные массы лакказ и положительное действие эндогликозидазы F1 позволило заключить, что в молекулах ферментов углеводная часть представлена олигоманнозными неразветвленными структурами. Последующий анализ углеводной части белков подтвердил правильность такого заключения.

Аналитическая ИЭФ показала, что LacCl и LacC2 имели изоэлектрические точки, равные 4,0 и 3,6 Ед, соответственно (рис. 4).

Р1 М 1 2

■mm*

4,55-►

5 2 -► ^

6,55-

9,3

-t

..-¿ill.

¡¡¡¡я

Рисунок 4. ИЭФ LacCl (1) и LacC2 (2), М ■ белковые маркеры.

4.2. Спектральные свойства ЬасС1 и ЬасС2

Концентрированные препараты LacCl и LacC2 были интенсивного синего цвета. Спектры поглощения лакказ являлись типичными спектрами «голубых» медьсодержащих оксидаз (рис. 5) с характерным максимумом поглощения при 610 нм, что указывает на наличие в молекуле фермента атома меди первого типа. Плечо при 330 нм, характеризующее наличие медьсвязывающего центра ТЗ, определялось в спектрах обеих лакказ.

Е 0,5

Рисунок 5. Спектр поглощения ЕасС1 (жирная линия) и ЕасС2 (тонкая линия) в УФ/видимом спектре.

Длина волны,нм

Исследование фермента с помощью спектроскопии КД выявило преобладание р-структур в молекулах обеих изоформ (рис. 6А, Б). Плавление ЬасС1 и ЬасС2 в диапазоне температур 20 - 97°С обнаружило, что полного разрушения р-слоев не происходило.

а Бк

Рисунок 6. КД спектр лакказ С. unicolor ВКМ F-3196 до (1) и после (2) плавления (А - LacCl, Б - LacC2).

4.3. Каталитические свойства LacCl и LacC2

Температурный оптимум составлял 50°С для LacC2 и 55°С для LacCl. Обе изоформы характеризуются широкими температурными оптимумами, сохраняя более 60% активности в диапазоне температур 25 - 80°С.

LacCl и LacC2 обладали различной термостабилыюстыо. При 70°С время полуинактивации LacCl составляло 30 мин. Время полуинактивации LacC2 при такой же температуре составляло 3 мин. Более высокая термостабилыюсть LacCl была подтверждена плавлением белков с фиксацией конформацнонного состояния молекулы с помощью КД спектроскопии. Денатурация LacCl происходила при более высокой температуре. Температура полуплавления LacCl составляла 77°С, в то время как у LacC2 она равнялась 69°С. Одним из факторов, определяющих стабильность лакказы, является гликозилирование белковой молекулы (Ко et al, 2001; Yoshitake et al., 1993; Slomczynski et al, 1995;). Поэтому можно полагать, что более высокое содержание углеводов в молекуле LacCl и объясняет большую термостабильность данной изоформы.

После обработки эндогликозидазой F термостабильность обеих изоформ снизилась: при 70°С активность LacCl через 30 мин снижалась до 16% от исходной величины, в то время как активность недегликозилированного фермента при 70°С через 30 мин снижалась до 50%; активность LacC2 при этой же температуре через 5 мин снижалась до 6%, в то время как активность недегликозилированной формы LacC2 через 5 мин снижалась до 22%.

Полученные данные позволили заключить, что гликозилирование не является единственным фактором, определяющим термостабильность белка. По-видимому, существуют и другие факторы, определяющие термостабильность молекулы фермента. Среди таких факторов отмечали повышенное содержание дисульфидных связей в молекуле белка, а также повышенное число гидрофобных или заряженных остатков в белковой молекуле (Chernykh et al., 2008).

Зависимость скорости окисления АБТС от рН была одинаковой для LacCl и LacC2. Оптимальное значение рН было ниже 2,7 Ед рН. С увеличением рН скорость реакции уменьшалась. Однако рН оптимум окисления 2,6-ДМФ у LacCl и LacC2 был разным. Максимальная активность LacCl была при рН 4,4, a LacC2 - при рН 3,8. При этом пик активности LacCl был более широкий, чем у LacC2. LacCl сохраняла более 50% активности в диапазоне рН 3,4 - 6,3, в то время как LacC2 теряла до 50% активности уже при рН 4,9. Сдвиг оптимума рН окисления АБТС в кислую область для обеих изоформ подтверждает общие положения о реакциях, происходящих при окислении субстратов-доноров электрона. Профиль зависимости окисления 2,6-ДМФ от величины рН согласуется с радикальным механизмом реакций окисления фенольных субстратов с участием лакказы (Хи, 1997).

Для выяснения причины различия рН оптимума окисления 2,6-ДМФ у обеих изоформ были определены значения рК ионогенных групп активного центра, задействованных в катализе. Установлено, что за катализ отвечала одна ионогенная группа. Значения рК этой группы для LacCl составляло 5,5, а для LacC2 - 3,8. Это указывает на участие в катализе одной аминокислоты, способной присоединять протоны. В молекулах разных изоформ лакказы такой аминокислотой могут быть разные аминокислоты. Возможно также, что в обеих изоформах это одна и та же аминокислота, но разное микроокружение в разных белках меняет ее способность присоединять протоны. Из литературных данных известно об участии протонируемых аминокислот в катализе лакказы. Было показано участие протонированной аминокислоты Asp206 в формировании рН оптимума окисления 2,6-ДМФ лакказой Т. versicolor (Madzak et а!., 2006). Выравнивание аминокислотных последовательностей фрагментов лакказ LacCl и LacC2 с последовательностью лакказы Т. versicolor показало, что в молекулах обеих исследованных лакказ в положении 206 также находится Asp. Следовательно, можно предположить, что разные значения рК обусловлены различным микроокружением Asp206. По-видимому, более низкое значение рК ионогенной группы в случае LacC2 обусловливает более кислый диапазон оптимума рН для изоформы LacC2.

Были определены кинетические константы для нескольких типичных субстратов лакказ - замещенных фенолов, доноров электронов и протонов, и АБТС, донора только электронов. Сравнение каталитических параметров лакказ LacCl и LacC2 показало, что константы Михаэлиса для LacCl превышают таковые для LacC2, что свидетельствует о более низком сродстве LacCl к типичным субстратам. Однако эффективность катализа (величина Vmax/Km) окисления фенольных соединений была выше у LacCl. Нефенольный субстрат - АБТС, напротив, более эффективно окислялся в присутствии LacC2 (табл.1).

Таблица 1.

Кинетические параметры изоформ лакказы С. unicolor ВКМ F-3196

Субстрат LacCl LacC2

Vmax, Km, Vmax/Km Vmax, Km, Vmax/Km

Ед/мг мкМ Ед/мг мкМ

2-Метоксифенол (Гваякол) 29,15 0,71 41 4,5 0,19 23,5

4-Метоксифенол 17,4 0,76 22,8 7,75 0,7 11,15

2,6-ДМФ 86,2 0,3 291,8 7,98 0,17 46,9

3,4-Диметоксифенол 47,4 0,47 99,5 6,4 0,1 58,7

Гидрохинон 86,9 1,1 80,2 14,8 0,53 27,8

АБТС 138,9 35 4 92,6 10 9,3

5. MALDI TOF MS анализ и определение N-концсвых аминокислотных последовательностей лакказ LacCl и LacC2

Различия молекулярных и каталитических свойств LacCl и LacC2 вызывали вопрос о причине этих различий: являются ли LacCl и LacC2 продуктами разных генов или же различия в свойствах вызваны посттрансляционной модификацией общего предшественника?

Явление множественности изоформ с разными молекулярными и биохимическими характеристиками очень распространено среди продуцентов лакказы (Koroleva et al., 2002; Yaver et al., 1996; Hoegger et al., 2004; Wahleithner et al., 1996; Soden and Dobson, 2001; Palmieri et al., 2003; Larrondo et al., 2003; Kilaru et al., 2006). Среди причин множественности изоформ известны посттрансляционные модификации, например, гликозилирование, продукта одного и того же гена (Larrondo et al., 2003), либо наличие множественных генов лакказы в грибных геномах (Yaver et al., 1996; Hoegger et al., 2004; Wahleithner et al., 1996; Palmieri et al., 2003; Kilaru et al., 2006).

Пептидные карты для LacCl и LacC2, полученные с помощью MALDI TOF MS анализа продуктов трипсинолиза в геле препаратов обоих белков, были разными (рис. 7). Это позволило предположить, что аминокислотные последовательности LacCl и LacC2 различаются между собой.

N-концевые аминокислотные последовательности лакказ LacCl и LacC2 имели высокую гомологию (90%). Для LacCl была определена аминокислотная последовательность: AIGPVADIHI, для LacC2 - AIGPVADLHI (эти последовательности внесены в базу данных UniProt Knowledgebase (UniProtKB) под номерами Р86328 и Р86327, соответственно). Отличие наблюдалось в позиции восемь, где у LacCl присутствовал изолейцин, а у LacC2 - лейцин.

Таким образом, на основании результатов MALDI TOF MS анализа и анализа N-концевых аминокислотных последовательностей лакказ LacCl и LacC2, можно сделать предположение о том, что данные белки являются продуктами разных генов.

4 Xio5 л.

2122.100

4404. m

1665.0У9 1471 70.1

15P0 ÍOOO 7SOO 3000

Рисунок 7. Пептидные карты лакказ LacCI (А) и LacC2 (Б), полученные с помощью MALDI TOF MS.

6. Анализ нуклеотидных последовательностей генов лакказ LacCI и LacC2 и определение аминокислотных последовательностей лакказ

Для однозначного ответа на вопрос о причине множественности изоформ лакказы С. unicolor ВКМ F-3196 были определены нуклеотидные и соответствующие им аминокислотные последовательности лакказ.

Последовательность гена лакказы LacCI была получена с геномной ДНК с использованием прямого праймера lccClf и обратного праймера lccCr. По результатам секвенирования длина фрагмента гена лакказы LacCI с пекодирующими участками составляла 1930 п.н.

Последовательность части зрелого гена лакказы LacC2 получили с кДНК с использованием прямого вырожденного праймера lccCf2 и обратного праймера

lccCr. Длина фрагмента части зрелого гена лакказы по результатам секвенирования составляла 1308 п.н.

Поскольку обратный праймер был сконструирован на основании внутренней С-концевой аминокислотной последовательности, полученные в результате исследования нуклеотидные последовательности представляют собой не полные гены лакказ, а их фрагменты, составляющие примерно 90% полной последовательности гена. Сравнение последовательности фрагмента гена лакказы LacCl, содержащей некодирующие участки, и последовательности фрагмента зрелого гена лакказы LacC2 выявило наличие во фрагменте гена лакказы LacCl 11 экзонов и 10 интронов. Размер интронов колебался от 51 до 65 п.н. и являлся типичным для большинства грибных геномов (Gurr et al., 1987).

Кодирующие участки нуклеотидных последовательностей фрагментов двух генов лакказ различались по 135 п.н. из 1308 п.н., т. е. на 10,3%. В результате компьютерной трансляции нуклеотидных последовательностей фрагментов генов в программе Vector NTI AdvanceTM v. 10 были получены аминокислотные последовательности фрагментов лакказ LacCl и LacC2, содержащие 451 и 436 аминокислотных остатков, соответственно (рис. 8).

Аминокислотные последовательности двух лакказ различались между собой на 13 аминокислотных остатков, что в совокупности с различиями на уровне нуклеотидных последовательностей подтверждает, что LacCl и LacC2 - продукты двух разных генов.

Аминокислотные последовательности фрагментов обеих лакказ содержат структурные гистидиновые мотивы (НХН) в трех консервативных участках, характерных для всех лакказ: ^HWH66; 107WYHSHnl; 393HPFHLH398. Четвертый консервативный участок 44SWFLHCH450 присутствует только в последовательности LacCl. В последовательности LacC2 данный участок отсутствует (рис. 8).

В обоих фрагментах лакказ были обнаружены потенциальные сайты N-гликозилирования (N-X-T/S). В последовательности LacC2 присутствует один сайт N-гликозилирования (ASII432), который обнаружен и во фрагменте лакказы LacCl. В последовательности LacCl присутствует еще один сайт N-гликозилирования (Asn249) (рис. 8). Большее число потенциальных сайтов N-гликозилирования у LacCl может обусловливать более высокую степень гликозилирования данной изоформы в сравнении с LacC2.

Таким образом, данные фрагменты лакказ содержат необходимые для формирования активного центра аминокислотные остатки, и, следовательно, полученные в ходе исследования нуклеотидные последовательности являются фрагментами генов, потенциально кодирующих функционально активные ферменты.

Аминокислотные последовательности фрагментов лакказ LacCl и LacC2 демонстрировали между собой высокую степень гомологии (степень идентичности 97%).

Сравнение аминокислотных последовательностей фрагментов лакказ LacCl и LacC2 с соответствующими фрагментами 14 других базидиомицетных лакказ показало высокую степень идентичности (57 - 90%), в то время как с аскомицетной лакказой М. albomyces степень идентичности LacCl и LacC2 была низкой (32% и 31%, соответственно).

LacCl (1)

LacC2 (1)

LacCl (51)

LacC2 (51)

LacCl (101)

LacC2 (101)

LacCl (151)

LacC2 (151)

LacCl (201)

LacC2 (201)

LacCl (251)

LacC2 (251)

LacCl (301)

LacC2 (301)

LacCl (351)

LacC2 (351)

LacCl (401)

LacC2 (401)

LacCl (451)

LacC2 (437)

Рисунок

aigpvadJhitddtiapdgfsraavlaggtfpgplitgnmgdafklnvid aigpvad|hitddtiapdgfsrpavlagggfpgplitgnkgdafklnvid

wyhtlarqivgvaisdttlinglgrntdgpadaalavinv|agkryrfrl

wyhtlarqivgvaisdttlinglgrntngpadaalavinv§agkryrfrl

vsiscdpnwvfsidnhdftvievdgvnsqplnvdsvqifagqryslvlna vsiscdpnwvfsidnhdftvievdgvnsqplnvdsvqifagqryslvlna

sqpvdnywiradpnlgttgfagginsailrykgaavaepttsqttstkpl nqpvdnywiranpnlgttgfagginsailryngaavaepttsqttstkpl

LETDLHPLVSTPVPGLPQPGGTDWQNLILGFNAGQFTINGASFVPPgVP

LETDLHPLVSTPVPGLPQPGGTDWQNLILGFNAGQFTINGASFVPPgvP

vllqilsgttnaqdllpsgsvfelplgktveltlaagvlggp vllqilsgttnaqdllpsgsvfelplgktveltlaagvlggp

-iPFHLH -IPFHLH

3H H

313

nfhwrsagqdtpnyddpivrdwstga|gdnvtirfttdnpgp|wflhch

nfhwrs agqdt pnyddpivrd wn pgagg dnvtir-------

8. Сравнение транслированных аминокислотных последовательностей фрагментов лакказ ЬасС1 и ЬасС2. Сайты Ы-гликозшшрования подчеркнуты, в сайтах гликозилирования звездочкой отмечены остатки Аэп, к которым присоединяется углеводная цепь; рамками выделены четыре консервативные участка с гистидиновыми мотивами; цифрами 1, 2, 3 обозначены лиганды Т1, Т2 и ТЗ медьсвязывающих центров, соответственно. Красным на желтом фоне выделены консенсусные остатки, совпадающие в данной позиции во всех последовательностях; черным на зеленом фоне - консервативные замены; черным на белом фоне - неидентичные остатки.

7. Изучение структурной организации лакказ

Моделирование трехмерных структур исследованных лакказ по гомологии со структурой лакказы Т. versicolor, полученной с разрешением 1,9 A (Piontek et al., 2002), подтвердило принадлежность LacCl и LacC2 к типичным трехдоменным лакказам грибов. В структурных моделях LacCl и LacC2 преобладали р-складчатые структуры, что типично для лакказ и согласуется с КД - спектрами обоих исследованных ферментов (рис. 9).

Структуры обоих ферментов стабилизировались дисульфидным мостиком Cysll7- Cys205, связывающим первый и второй домены. Сравнение трехмерных моделей LacCl и LacC2 с референтной структурой lgycA обнаружило возможность

наличия углеводных остатков в потенциальных сайтах гликозилирования (N249 и N432 у ЬасС1 и N432 у ЬасС2) ввиду их расположения на поверхности белковой молекулы. Наличие двух сайтов гликозилирования в молекуле ЬасС1 возможно объясняет большую степень гликозилирования этой изоформы по сравнению с ЬасС2 (рис. 9).

Рисунок 9. Третичная структура молекул лакказ LacCl (А) и LacC2 (Б). Домен 1 изображен красным цветом, домен 2 - синим, домен 3 - зеленым. Структура стабилизируется дисульфидным мостиком Cysin-Cys205 (показан крупным планом), соединяющим первый и второй домены. Крупным планом показаны сайты N-гликозилирования (N249, N432 у LacCl, N432 у LacC2).

8. Трансформация пентахлорфенола лакказой LacCl

Из двух изученных изоформ лакказы С. unicolor LacCl обладала более высокой термостабильностью, сохраняла активность в более широком дапазоне рН при окислении фенольных субстратов, особенно, в области рН, близкой к нейтральной, и более эффективно окисляла фенольные соединения. Поэтому изучение возможности практического применения проводили на примере этой изоформы. Мы изучили реакции фермента с высокотоксичным ксенобиотиком -пентахлорфенолом (ПХФ). Реакцию проводили в присутствии 1-гидроксибензотриазола (1-ГБТ) как медиатора и без него. При участии медиаторов лакказы приобретают способность окислять субстраты с более высоким редокс-потенциалом. ПХФ не окислялся лакказой LacCl в течение 3 ч реакции без 1-ГБТ (рис. 10). В присутствии 1-ГБТ содержание ПХФ снижалось в течение 3 ч на 85%. В реакционной смеси обнаруживались три продукта реакции со временем удерживания 10,37; 10,77 и 11,48 мин. Методом масс-спектрометрии было установлено, что продукты со временем удерживания 10,37 и 10,77 мин являлись коньюгатами продуктов разложения двух молекул ПХФ, содержащими пять

молекул хлора на два ароматических кольца. Это указывает на то, что происходило дегалогенирование молекул ПХФ в ходе окисления лакказой с участием 1-ГБТ. Дегалогенирование хлорфенолов и их производных открывает возможность последующего раскрытия ароматического кольца другими ферментами (например, оксигеназами), что определяет значительное снижение токсичности такого поллютанта. Полученные результаты указывают на возможность использования системы ЬасС1/1-ГБТ в качестве агентов первичной атаки при разработке технологических приемов очистки природных сред, загрязненных хлорфенолами.

Время реакции, минуты

Рисунок 10. Окисление ПХФ лакказой LacCl С. unicolor ВКМ F-3196 • - без 1-ГБТ; ■ - в присутствии 1-ГБТ.

9. Синтез лигниноподобных водорастворимых полимеров (ЛВП) с участием лакказы и исследование их антивирусной активности

Антивирусная активность природного лигнина известна из литературы (Suzuki et al., 1990). Однако у препаратов природного происхождения имеются существенные недостатки: неопределенный состав и низкая растворимость в воде. Решением этих проблем может быть синтез искусственных лигниноподобных полимеров из фенольньгх мономеров. Учитывая природную способность лакказы полимеризовать фенолы, мы использовали LacCl С. unicolor для проведения подобных реакций.

В качестве фенольных мономеров при синтезе ЛВП использовали три фенольные соединения, которые являются обычными продуктами разложения лигнина: 2-метоксифенол, 2,5-дигидроксибензойная кислота и 1,2,3-тригидроксибензол. Эти соединения содержали различные заместители в ароматическом кольце. При полимеризации таких фенолов под действием лакказы образовывались водонерастворимые полимеры. Для получения водорастворимых полимеров была проведена сополимеризация фенольных мономеров с молекулами, увеличивающими водорастворимость лигниноподобных полимеров. Ранее было показано, что в ходе синтеза полимеров из фенольных соединений с помощью лакказы, возможна их сополимеризация с молекулами АБТС и производными акрилата, в результате чего водорастворимость конечных продуктов увеличивалась (Rittstieg et al., 2003; Mai et al., 2003). Поэтому для сополимеризации с фенольными

мономерами и мы выбрали АБТС и акриламид. Фенольные соединения окисляются лакказой до феноксирадикалов, которые далее подвергаются спонтанной полимеризации (Сарканен, 1975). АБТС окисляется лакказой до катионрадикала, который способен сополимеризоваться с радикалами фенольных мономеров, также образующихся под воздействием лакказы. Акриламид не окисляется лакказой, поэтому для получения радикалов акриламида в реакционную смесь вносили персульфат аммония.

В ходе синтеза были получены препараты ЛВП с различным выходом конечного продукта (табл. 2). Больший выход наблюдался для ЛВП на основе сополимеров фенольных соединений и АБТС. Были исследованы токсичность полученных препаратов в отношении клеточных культур и их антивирусная активность в отношении вируса болезни Ауески PRV. Как видно из табл. 3, ЛВП на основе акриламида оказывали токсический эффект на клетки и обладали низкой антивирусной активностью. При этом ЛВП на основе акриламида и 1,2,3-тригидроксибензола обладал более высокой антивирусной активностью по сравнению с другими ЛВП на основе акриламида. Сополимеры на основе АБТС не обладали токсическим эффектом в отношении клеток и проявляли высокую антивирусную активность. Необходимо отметить, что ЛВП на основе АБТС и 1,2,3-тригидроксибензола ингибировал развитие вируса уже при концентрации 0,005 мг/мл.

Таблица 2

Выходы препаратов ЛВП

Препарат ЛВП Выход

Сополимер акриламида с 2-метоксифенолом 1,5%

Сополимер акриламида с 2,5-дигидроксибензойной кислотой 1%

Сополимер акриламида с 1,2,3-тригидроксибензолом 1,9%/

Сополимер АБТС с 2-метоксифенолом 10%

Сополимер АБТС с 2,5-дигидроксибензойной кислотой 15%

Сополимер АБТС с 1,2,3-тригидроксибензолом 10%

Таблица 3

Токсичность и антивирусная активность препаратов ЛВП

Препарат ЛВП Цитотоксический эффект на сформированный монослой клеток ВНК-21 (концентрация Ингибирова- ние пролиферации клеток ВНК-21 (концентра- Кратность ингибирования развития вируса болезни Ауески при разных концентрациях препаратов лигнина

лигнинов 1 мг/мл) ция лигнинов 1 мг/мл) 0,5 мг/мл 0,05 мг/мл 0,005 мг/мл

Сополимер акриламида с 2-метоксифенолом +* + _** -

Сополимер акриламида с 2,5- дигидроксибензойной кислотой + + 100

Сополимер акриламида с 1,2,3-тригидрокси-бензолом + + 300

Сополимер АБТС с 2-метоксифенолом >1000 -

Сополимер АБТС с 2,5- дигидроксибензойной кислотой — — >1000 >300 —

Сополимер АБТС с 1,2,3- тригидроксибензолом >1000 >300 5

* + - отмечается; **--отсутствует.

Таким образом, в нашей работе впервые показана антивирусная активность препаратов, полученных в реакциях сополимеризации с участием лакказы.

ВЫВОДЫ

1. Проведен скрининг продуцентов лакказы среди 23 штаммов базидиомицетов. В качестве эффективного продуцента лакказы был отобран штамм С. unicolor ВКМ F-3196.

2. Изучен эффект индукторов различной химической природы па продукцию лакказы С. unicolor ВКМ F-3196. Лучшим индуктором оказались ионы Си2+ в концентрации 0,1 мМ, обеспечивающие почти 5000-кратное увеличение продукции лакказы.

3. Установлено, что при глубинном культивировании на среде Кирка с Си2+ в качестве индуктора лакказа С. unicolor ВКМ F-3196 продуцировалась в виде двух изоформ - LacCl и LacC2. Разработана схема очистки, позволяющая надежно разделять две изоформы лакказы с высоким выходом (33,5% для LacCl и 31% для LacC2).

4. Впервые охарактеризованы физико-химические и каталитические свойства двух изоформ лакказы С. unicolor ВКМ F-3196. Показано, что изоформа LacCl обладает более высокой термостабильностью и эффективностью окисления субстратов, а также проявляет активность в более широком диапазоне pH.

5. Впервые определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов двух изоформ лакказы С. unicolor ВКМ F-3196. Впервые определена экзон-интронная структура фрагмента гена лакказы С. unicolor ВКМ F-3196. На основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов лакказ LacC 1 и LacC2 и соответствующих им аминокислотных последовательностей доказано, что LacCl и LacC2 - продукты разных генов.

6. Анализ трехмерных моделей LacCl и LacC2 подтвердил их принадлежность к типичным трехдоменным лакказам грибов.

7. Показана возможность практического применения LacCl на примерах окисления пентахлорфенола системой лакказа/медиатор и синтеза лигниноподобных водорастворимых полимеров с антивирусной активностью.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность к.ф.-м.н. Б.С. Мельнику (лаборатория физики белка, УРАН Институт белка РАН) за определение КД-спектров и плавление белков; н.с. В .Я. Лысанской (отдел «Всероссийская коллекция микроорганизмов», УРАН ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН) за определение углеводного состава лакказ; к.б.н. Т.А. Мурановой (УРАН ФИБХ РАН) за определение N-концевых аминокислотных последовательностей белков; к.б.н. Ж.И. Будариной и к.б.н. Ж.И. Ковалевской (лаборатория молекулярной микробиологии, УРАН ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН) за помощь в определении нуклеотидной последовательности фрагмента гена лакказы LacC2 с кДНК; к.ф.-м.н. A.A. Лашкову (УРАН Институт кристаллографии им. A.B. Шубникова РАН, Москва) за помощь в компьютерном моделировании трехмерной структуры белков; к.х.н. Б.П. Баскунову (лаборатория масс-спектрометрии, УРАН ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН) за масс-спектрометрический анализ; лаборатории культур клеток и клеточной инженерии под руководством Моренкова О.С. (УРАН Институт биофизики клетки РАН) за определение токсичности и антивирусной активности препаратов лигниноподобных водорастворимых полимеров.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Ребриков Д.Н., Степанова Е.В., Королева О.В., Бударина Ж.И., Захарова М.В., Юркова Т.В., Солонин A.C., Белова О.В., Пожидаева (Лисова) З.А., Леонтьевский A.A. Лакказа лигнинолитического гриба Trameíes hirsuta: очистка и характеристика фермента, клонирование и первичная структура гена. - Прикладная биохимия и микробиология, 2006, т. 42, с. 645-653.

2. Лисов A.B., Пожидаева (Лисова) ЗА., Степанова Е.В., Королева О.В.,. Леонтьевский A.A. Трансформация полихлорированных фенолов лакказами с участием 1-гидроксибензотриазола как медиатора. - Прикладная биохимия и микробиология, 2007, т. 43, с. 691-694.

3. Королева О.В., Степанова Е.В., Федорова Т.В., Логинов Д.С., Черкашин Е.А., Беневоленский C.B., Вавилова Е.А., Чулкин A.M., Абянова А.Р., Бударина Ж.И., Юркова Т.В., Захарова М.В., Леонтьевский A.A., Солонин A.C., Пожидаева (Лисова) З.А. Рекомбинантная лакказа лигнинолитического гриба Trámeles sp. и способ ее получения. Патент RU № 2394912 С2, 17.06.2008.

4. Lisova Z.A., Lisov A.V., Leontievsky A.A. Two lacease isoforms of the basidiomycete Cerrena unicolor VKM F-3196. Induction, isolation and properties. -J Bas Microbiol, 2010, v. 50, p. 72-82.

Тезисы

1. Пожидаева (Лисова) З.А. Разработка среды для получения высокого выхода лакказы при культивировании гриба Cerrena unicolor ВКМ F-3196. Материалы 1-ой Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» - Пущино, 24-25 мая 2007, с. 55.

2. Лисова З.А., Леонтьевский A.A. Характеристика изоформ лакказы базидиомицета Cerrena unicolor ВКМ F-3196. - Сб. тезисов 12-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология

- наука 21 века». - Пущино, 10-14 ноября 2008, с. 90.

3. Лисова З.А. Изоформы лакказы базидиомицета Cerrena unicolor ВКМ F-3196.

- Тез. докладов 16-ой Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», Москва, 13-18 апреля 2009, с. 54.

4. Лисова З.А., Леонтьевский A.A. Свойства лакказ Cerrena unicolor ВКМ F-3196. - Сб. тезисов 13-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века». - Пущино, 28 сентября - 2 октября 2009, с. 73-74.

Подписано в печать:

31.01.2011

Заказ № 4912 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лисова, Зоя Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. ЛАККАЗА. ОБЩЕЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О ФЕРМЕНТЕ

1.1.1. История открытия.

1.1.2. Лакказа - представитель семейства «голубых» медьсодержащих оксидаз.

1.1.3. Распространение в природе

1.1.4. Функции лакказы.

1.1.5. Локализация лакказы.

1.1.6. Молекулярные свойства лакказы.

1.2. РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ЛАККАЗЫ.

1.3. СТРУКТУРА ЛАККАЗЫ.

1.3.1. Строение активного центра лакказ

1.3.2. «Необычные» лакказы.

1.3.3. Трехмерная структура лакказы.

1.4. ТИПЫ СУБСТРАТОВ, ОКИСЛЯЕМЫХ ЛАККАЗОЙ.

1.5. МЕХАНИЗМ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЛАККАЗЫ.

1.5.1. Каталитический цикл лакказы.

1.5.2. Механизм восстановления кислорода в трехъядерном кластере.

1.6. ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ РЕАКЦИОННУЮ СПОСОБНОСТЬ ЛАККАЗ.

1.6.1. Разница окислительно-восстановительных потенциалов Т1 центра и субстрата и факторы, влияющие на величину редокс-потенциала Т1 центра лакказ.

1.6.2. Стерическое соответствие молекулы субстрата субстратсвязывающему центру лакказы.

1.6.3. Энергия реорганизации.

1.7. ЭФФЕКТ «МЕДИАТОРОВ»

1.8. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛАККАЗ.

1.8.1. Каталитические параметры реакций окисления субстратов лакказами.

1.8.2. рН Оптимум.

1.8.3. Температурный оптимум окисления субстрата и термостабильность лакказ.

1.8.4. Ингибиторы лакказной активности.

1.9. ПРИКЛАДНОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЛАККАЗЫ.

1.9.1. Применение лакказы в целлюлозно-бумажной промышленности.

1.9.2. Применение лакказы в текстильной промышленности.

1.9.3. Применение лакказы в пищевой промышленности.

1.9.4. Использование лакказы в производстве технического спирта.

1.9.5. Биоремедиация с помощью лакказы.

1.9.6. Применение лакказы в косметической промышленности.

1.9.7. Применение лакказы в органическом синтезе.

1.9.8. Биосенсоры, электроиммуноанализ и биотопливные элементы на основе лакказы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект исследования и условия культивирования.

2.2. Скрининг грибов - продуцентов лакказы.

2.3. Очистка фермента.

2.4. Определение активности лакказы и концентрации белка.

2.5. Характеристика фермента.

2.5.1. Электрофорез. Определение молекулярной массы.

2.5.2. Аналитическая изоэлектрофокусировка.

Определение изоэлектрических точек.

2.5.3. Определение спектральных характеристик.

2.5.4.0пределение углеводного состава.

2.5.5. Дегликозилирование лакказы.

2.5.6. Определение оптимумов и стабильности фермента.

2.5.7. Определение каталитических свойств.

2.5.8. Определение N-концевых последовательностей.

2.5.9. Триптический гидролиз белка в полиакриламидном геле.

2.5.10. MALDITOF MS анализ.

2.6. Молекулярно-генетические методы.

2.6.1. Выделение геномной ДНК.

2.6.2. Амплификация гена лакказы с геномной ДНК.

2.6.3. Очистка ПЦР-фрагментов с помощью препаративного электрофореза.

2.6.4. Лигирование ПЦР-продукта.

2.6.5. Получение компетентных клеток Е. coli.

2.6.6. Трансформация компетентных клеток Е. coli.

2.6.7. Отбор клонов и скрининг.

2.6.8. Выделение плазмидной ДНК из Е. coli.

2.6.9. Секвенирование.

2.6.10. Выделение и очистка суммарной РНК С. unicolor ВКМ F-3196.

2.6.11. Синтез, амплификация кДНК и секвенирование.

2.7. Компьютерное моделирование.

2.8. Реакция лакказы с пентахлорфенолом (ПХФ) и идентификация продуктов.

2.9. Синтез лигниноподобных водорастворимых полимеров (ЛВП).

2.10. Определение токсичности ЛВП в отношении клеток.

2.11. Исследование антивирусной активности ЛВП.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Скрининг грибов-продуцентов лакказы и отбор наиболее эффективного продуцента лакказы.

3.2. Изучение индукции лакказы гриба С. unicolor.

3.3. Оптимизация условий очистки изоформ лакказы.

3.4. Характеристика лакказ.

3.4.1. Молекулярные свойства LacCl и LacC2.

3.4.2. Спектральные свойства LacCl иЬасС2.

3.4.3. Каталитические свойства LacCl и LacC2.

3.4.4. MALDITOF MS анализ и определение N-концевых аминокислотных последовательностей лакказ LacCl nLacC2.

3.5. Анализ нуклеотидных последовательностей генов лакказ LacCl и LacC и определение аминокислотных последовательностей лакказ.

3.6. Изучение структурной организации лакказ.

3.7. Трансформация пентахлорфенола лакказой LacCl

3.8. Синтез лигниноподобных водорастворимых полимеров (ЛВП) с участием лакказы и исследование их антивирусной активности.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика изоформ лакказы гриба Cerrena unicolor"

Актуальность проблемы.

Лакказа (К.Ф.1.10.3.2, пара-дифенол: кислород оксидоредуктаза) - медьсодержащий фермент - катализирует окисление широкого спектра субстратов кислородом, который восстанавливается в ходе реакции до воды. Этот фермент обнаружен у бактерий, грибов, растений и насекомых. Лакказа участвует в процессах синтеза меланинов, пигментов, развитии спор, детоксикации опасных метаболитов, деградации лигнина (Thurston, 1994; Leonowicz et al., 2001; Eggert et al., 1996a). Лакказы могут продуцироваться в виде единственной формы фермента, но чаще - в виде множественных форм. Наиболее изучены лакказы грибов-базидиомицетов, вызывающих белую гниль древесины. Лакказа обладает особыми каталитическими свойствами:

- обладает высоким редокс-потенциалом (Е° лакказ базидиальиых грибов достигает 790 мВ);

- лакказа неспецифична (способна окислять широкий набор субстратов, различающихся по строению и свойствам: моно-, ди-, полифенолы, амино- и метоксизамещенные фенолы, ароматические амины; неорганические ионы ([Mo(CN)8]4-, [Fe(CN)6]4-, [Os(CN)6]4-, [W(CN)8]4—,Mn2+));

- спектр субстратной специфичности может быть значительно расширен при участии в реакции низкомолекулярных соединений, т. н. редокс-медиаторов (пара лакказа/медиатор способна окислять субстраты с редокс-потенциалом, превышающим 1100 мВ);

- лакказы бактериального происхождения часто отличаются высокой термостабильностью (сохраняют каталитическую активность при 80 - 90°С) и катализируют реакции при нейтральных или щелочных значениях pH;

- для катализа не требуются кофакторы (фермент зависим лишь от наличия кислорода воздуха).

Несмотря на огромный потенциал лакказ в биотехнологии, примеров практического применения лакказ в промышленных масштабах немного: лакказы хорошо известны как компоненты красок для волос, препарат Déni Lite II (Novo Nordisk Co) используется для отбеливания хлопчатобумажных тканей в текстильной промышленности.

Причины такого несоответствия заключаются в том, что пока не удается найти или сконструировать фермент, который сочетал бы в себе все перечисленные особенности лакказ разного происхождения. Например, лакказы бактерий имеют низкий редокс— потенциал (Е° - 0,3 - 0,4 В), лакказы базидиомицетов редко бывают термостабильными, еще реже - активными при нейтральных и щелочных значениях рН.

Поэтому поиск новых ферментов по-прежнему актуален, причем особенно востребованы ферменты с высоким редокс-потенциалом, термостабильные и активные в области рН, близкой к нейтральной. При этом, как правило, исследователи ориентированы на доминирующие формы в семействах множественных изоформ лакказ, так что минорные формы, или трудноразделяемые формы лакказ остаются неизученными.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования было сравнительное изучение двух изоформ лакказы базидиомицета Cerrería unicolor ВКМ F—3196.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

4) Изучить физико-химические и каталитические свойства очищенных ферментов.

5) Определить нуклеотидные и аминокислотные последовательности двух изоформ лакказы С. unicolor ВКМ F—3196.

6) Изучить структурную организацию двух изоформ лакказы С. unicolor ВКМ F

3196.

7) Оценить возможность применения лакказы С. unicolor ВКМ F-3196 в биотехнологии.

Научная новизна.

Впервые выделены две изоформы гриба базидиомицета С. unicolor ВКМ F-3196. Разработана схема очистки, позволяющая надежно разделять и получать с большим выходом две изоформы лакказы. Детально изучены их физико-химические и каталитические свойства. Определены неполные нуклеотидные и аминокислотные последовательности. Доказано, что изоферментный состав лакказы С. unicolor ВКМ F—3196 связан с наличием разных генов в геноме базидиомицета. Впервые определена экзон— интронная структура фрагмента гена лакказы С. unicolor ВКМ F-3196. Смоделирована и охарактеризована трехмерная структура двух изоформ лакказы С. unicolor.

Практическая значимость.

Показано, что одна из изоформ лакказы (ЬасС1) имеет высокую термостабильность, сохраняет активность при нейтральных значениях рН, обладает высокой каталитической активностью в отношении фенольных соединений, что определяет широкие возможности применения данного фермента в биотехнологических целях. На примере реакции фермента с высокотоксичным ксенобиотиком - пентахлорфенолом, показана возможность использования системы ЬасС 1 /1 -гидроксибензотриазол в качестве агентов первичной атаки при разработке технологических приемов очистки природных сред, загрязненных хлорфенолами. Показана возможность применения лакказы ЬасС1 в синтезе лигниноподобных водорастворимых полимеров, обладающих противовирусной активностью. Впервые показана антивирусная активность препаратов, полученных в реакциях сополимеризации с участием лакказы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Лисова, Зоя Александровна

выводы

2. Изучен эффект индукторов различной химической природы на продукцию лакказы С. unicolor ВКМ F—3196. Лучшим индуктором оказались ионы Си2+ в концентрации 0,1 мМ, обеспечивающие почти 5000-кратное увеличение продукции лакказы.

3. Установлено, что при глубинном культивировании на среде Кирка с Си2+ в качестве индуктора лакказа С. unicolor ВКМ F—3196 продуцировалась в виде двух изоформ -LacCl и LacC2. Разработана схема очистки, позволяющая надежно разделять две изоформы лакказы с высоким выходом (33,5% для LacCl и 31% для LacC2).

4. Впервые охарактеризованы физико-химические и каталитические свойства двух изоформ лакказы С. unicolor ВКМ F-3196. Показано, что изоформа LacCl обладает более высокой термостабильностыо и эффективностью окисления фенольных субстратов, а также проявляет активность в более широком диапазоне рН.

5. Впервые определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов двух изоформ лакказы С. unicolor ВКМ F—3196. Впервые определена экзон-интронная структура фрагмента гена лакказы С. unicolor ВКМ F-3196. На основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов лакказ LacCl и LacC2 и соответствующих им аминокислотных последовательностей доказано, что LacCl и LacC2 — продукты разных генов.

6. Анализ трехмерных моделей LacCl и LacC2 подтвердил их принадлежность к типичным трехдоменным лакказам грибов.

7. Показана возможность практического применения LacCl в биотехнологии на примерах окисления пентахлорфенола системой лакказа/медиатор и синтеза лигниноподобных водорастворимых полимеров с антивирусной активностью.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лисова, Зоя Александровна, Пущино

1. Беккер Е.Г., Петрова С.Д., Ермолова О.В., Элисашвили В.И., Синицын А.П. Выделение, очистка и некоторые свойства лакказы из Cerrena unicolor. Биохимия, 1990, т. 5,с.2019-2024.

2. Заварзина А.Г., Заварзин A.A. Лакказная и тирозиназная активности у лишайников. -Микробиология, 2006, т. 75, с. 630-641.

3. Королева О.В., Явметдинов И.С., Шлеев C.B., Степанова Е.В., Гаврилова В.П. Выделение и изучение некоторых свойств лакказы из базидиального гриба Cerrena maxima. — Биохимия, 2001, т. 66, с. 762-767.

4. Леонтьевский A.A. Лигниназы базидиомицетов. Дисс. докт. биол. наук. Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 2002, 266 с.

5. Леонтьевский A.A., Мясоедова Н.М., Баскунов Б.П., Позднякова H.H., Варес Т., Калккинен Н., Хатакка А.И., Головлева Л.А. Реакции голубых и желтых лакказ с модельными соединениями лигнина. Биохимия, 1994, т. 64,с. 1362-1369.

6. Морозова О.В., Шумакович Г.П., Горбачева М.А., Шлеев C.B., Ярополов А.И. «Голубые» лакказы. Биохимия, 2007а, т. 72, с. 1396-1412.

7. Морозова О.В., Шумакович Г.П., Шлеев C.B., Ярополов А.И. Лакказа-медиаторные системы и их использование. — Прикланая биохимия и микробиология, 20076, т. 43, с. 583-597.

8. Сарканен К.В. Лигнины. Структура, свойства, реакции. М.: «Лесная промышленность», 1975, 632 с.

9. Черкашин Е.А. Структурно-генетическая организация лакказ базидиальных грибов. Дисс. канд. хим. наук. Москва, Институт биохимии им. А.Н. Баха, 2009, 117 с.

10. Шлеев C.B., Хан И.Г., Морозова О.В., Мажуго Ю.М., Халунина A.C. Ярополов А.И. Фенил-пиразолоны новый класс редокс-медиаторов оксидоредуктаз для деградации ксенобиотиков. - Прикладная биохимия и микробиология, 2004, т. 40, с. 165-172.

11. Элисашвили В., Качлишвили Е., Бакрадзе М. Зависимость активности полисахаридгидролаз и оксидаз Cerrena unicolor от источника и ароматических соединений в среде. — Прикладная биохимия и микробиология, 2002, т. 38, с. 243247.

12. Aaslyng D., Rorbaek К., and Sorensen N.H. An ezyme for dying keratinous fibres. Int Pat Api W09719998, 1996.

13. Abadulla E., Tzanov T., Costa S., Robra K.H., Cavaco P.A., Guebitz G.M. Decolorization and detoxification of textile dyes with a laccase from Trametes hirsuta. Appl Environ Microbiol, 2000, vol. 66, p. 3357-3362.

14. Abdel-Raheem A. and Shearer C.A. Extracellular enzyme production by freshwater ascomycetes. Fungal Diversity, 2002, vol. 11, p. 1-19.

15. Adman E.T. Copper protein structures. Adv Protein Chem, 1991, vol. 42, p. 145-197.

16. Agostinelli, E., Cervoni, L., Giartosio, A., Morpurgot, L. Stability of Japanese-lacquer-tree (Rhus vernicifera) laccase to thermal and chemical denaturation: comparison with ascorbate oxidase. Biochem J, 1995, vol. 306, 697-702.

17. Aktas N., Cicek H., Ûnal A.T., Kibarer G., Kolankaya N., Tanyolac A. Reaction kinetics for laccase-catalyzed polymerization of 1-napthol. — Bioresour Technol, 2001, vol. 80, p. 29-36.

18. Aktas N. and Tanyolac A. Reaction conditions for laccase catalyzed polymerization of catechol. Bioresour Technol, 2003, vol. 87, p. 209-214.

19. Alcalde M: Laccase: biological functions, molecular structure and industrial applications. In Industrial Enzymes: structure, function and applications. Edited by: J Polaina J, MacCabe A.P. New York, Springer; 2007, p. 459^74.

20. Alcalde M., Bulter T., and Arnold F.H. Colorimetric assays for biodégradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by fungal laccases. J Biomol Screening, 2002, vol.7, p.547-553.

21. Alexandre G. and Zhulin I.B. Laccases are widespread in bacteria. -Trends Biotechnol, 2000, vol. 18, p. 41-42.

22. Aljanabi S.M. and Martinez I. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques. Nucleic Acids Res, 1997, vol. 25, p. 4692-4693.

23. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. -Nucleic Acids Res, 1997, vol. 25, p. 3389-3402.

24. Amann M. The Lignozym process coming closer to the mill. Materials of 9th Int Symp on Wood and Pulping Chem, Montreal, 1997, p. 1^4.

25. Amitai G., Adani R., Sod-Moriah G., Rabinivitz I., Vincze A., Leader H., Chefetz B., Leibovitz-Persky L., Friesem D., Hadar Y. Oxidative biodégradation of phosphorothiolates by fungal laccase. -FEBS Lett, 1998, vol. 438, p. 195-200.

26. Ander P. and Eriksson K.-E. The importance of phenol oxidase activity in lignin degradation by the white-rot fungus Sporotrichum pulverulentum. Arch Microbiol, 1976, vol. 109, p. 1-8.

27. Andersen S.O., Peter M.G., Roepstorff P. Cuticular sclerotization in insects. Comp Biochem Physiol, 1996, vol. 113, p. 689-705.

28. Andreasson L.-E., Branden R., Reinhammar B. Kinetic study of Rhus vernicifera laccase. Evidence for multi-electron transfer and an oxygen intermediate in the reoxidation reaction. Biochim Biophys Acta, 1976, vol. 438, p. 370-379.

29. An E.S., Kim S.C., Kim Y.H., Park S.Y., Ryu J.Y., Song B.K., Song J.K. Production of phenolic polymers using bio-catalysts for polymerization. Patent KR2005011958A, 2005.

30. Aracri E., Colom J.F., and Vidal T. Application of laccase-natural mediator systems to sisal pulp: An effective approach to biobleaching or functionalizing pulp fibres. -Bioresour Technol, 2009, vol. 100, p. 5911-5916.

31. Ardon O., Kerem Z. and Hadar Y. Enhancement of laccase activity in liquid cultures of the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus by cotton stalk extract. J Biotechnol, 1996, vol. 51, p. 201-207.

32. Arias M.E., Arenas M., Rodriguez J., Soliveri J., Ball A.S., Hernandez M. Kraft pulp biobleaching and mediated oxidation of a nonphenolic substrate by laccase from Streptomyces cyaneus CECT 3335. Appl Env Micr, 2003, vol. 69, p. 1953-1958.

33. Arnold K., Bordoli L., Kopp J., and Schwede T. The SWISS-MODEL Workspace: A web-based environment for protein structure homology modelling. -Bioinformatics, 2006, vol. 22, p. 195-201.

34. Assavanig A., Amornkitticharoen B., Ekpaisal N., Meevootisom V., Flegel T.W. Isolation, characterization and function of laccase from Trichoderma. — Appl Microbiol Biotechnol, 1992, vol. 38, p. 198-202.

35. Baldrian P., Gabriel J. Copper and cadmium increase laccase activity in Pleurotus ostreatus. FEMS Microbiol Lett, 2002, vol. 206, p. 69-74.

36. Baldrian P. Purification and characterization of laccase from the white-rot fungus Daedalea quercina and decolorization of synthetic dyes by the enzyme. — Appl Microbiol Biotechnol, 2004, vol. 63, p. 560-563.

37. Baldrian P. Fungal laccases occurrence and properties. - FEMS Microbiol Rev, 2006, vol. 30, p. 215-242.

38. Banerjee U.C. and Vohra R.M. Production of laccase by Curvidaria sp. — Folia Microbiol, 1991, vol. 36, p. 343-346.

39. Bao W., O'Malley D.M., Whetten R., Sederoff R.R. A laccase associated with lignification in Loblolly pine xylem. Science, 1993, vol. 260, p. 672-674.

40. Baratto L., Candido A., Marzorati M., Sagui F., Riva S., Danieli B. Laccase- mediated oxidation of natural glycosides. J Mol Cat B: Enzym, 2006, vol. 39, p. 3-8.

41. Barbosa A.M., Dekker R.F.H., Hardy G.E.St. Veratryl alcohol as an inducer of laccase by an ascomycete, Botryosphaeria sp., when screened on the polymeric dye Poly R—478. — Lett Appl Microbiol, 1996, vol. 23, p. 93-96.

42. Bar-Nun N. and Mayer A.M. Cucurbitacins-repressors of induction of laccase formation. -Phytochem, 1989, vol. 28, p. 1369-1371.

43. Bar-Nun N. and Mayer A.M. Cucurbitacins protect cucumber tissue against infection by Botrytis cinerea. Phytochem, 1990, vol. 29, p. 787- 791.

44. Basto C, Tzanov T, Cavaco-Paulo A. Combined ultrasoundlaccase assisted bleaching of cotton. Ultrason Sonochem, 2007, vol. 14, p. 350-354.

45. Battistuzzi G., Di Rocco G., Leonardi A., and Sola M. 1II NMR of native and azide-inhibited laccase from Rhus vernicifera. J Inorg Biochem, 2003, vol. 96, p. 503-506.

46. Bauer C.G., Kuhn A., Gajovic N., Skorobogatko O., Holt P.J., Bruce N.C., Makower A., Lowe C.R., Scheller F.W. New enzyme sensors for morphine and codeine based on morphine dehydrogenase and laccase. Fresenius J Anal Chem, 1999, vol. 364, p. 179183.

47. Bento I., Martins L.O., Lopes G.G, Carrondoa M.A., Lindley P.F. Dioxygen reduction by multi-copper oxidases; a structural perspective. Dalton Trans, 2005, p. 3507-3513.

48. Berka R.M., Schneider P., Golightly E.J., Brown S.H., Madden M., Brown K.M., Halkier T., Mondorf K., Xu F. Characterization of the gene encoding an extracellular laccase of

49. Myceliophthora thermophila and analysis of the recombinant enzyme expressed in Aspergillus oryzae. Appl Env Micr, 1997, vol.63, p. 3151-3157.

50. Binz T. and Canevascini G. Purification and partial characterization of the extracellular laccase from Ophiostoma novo-ulmi. — Curr Microbiol, 1997, vol. 35, p. 278-281.

51. Bligny R. and Douce R. Excretion of laccase by sycamore (Acer pseudoplatanus L.) cells. Purification and properties of the enzyme. Biochem J, 1983, vol. 209, p. 489-496.

52. Bollag J.-M. and Leonowicz A. Comparative studies of extracellular fungal laccases. -Appl Environ Microbiol, 1984, vol. 48, p. 849-854.

53. Bourbonnais R., Leech D., Paice M. G. Electrochemical analysis of the interaction of laccase mediators with lignin model compounds. Biochim Biophys Acta, 1998, vol. 1379, p. 381-390.

54. Bourbonnais R. and Paice M.G. Oxidation of non-phenolic substrates. An expanded role for laccase in lignin biodégradation. FEBS Lett, 1990, vol. 267, p. 99-102.

55. Bourbonnais R. and Paice M. G. Demethilation and delignification of kraft pulp by Trametes versicolor laccase in the presence of 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate). Appl Microbiol Biotechnol, 1992, vol. 36, p. 823-827.

56. Bourbonnais R., Paice M.G., Freiermuth B., Bodie E., Borneman S. Reactivities of various mediators and laccases with kraft pulp and lignin model compounds. Appl Environ Microbiol, 1997, vol. 63, p. 4627-4632.

57. Bourbonnais R., Rocherfort D., Paice M.G., Renand S., Leech D. Transition metal complexes: A new class of laccase mediators for pulp bleaching. Tappi J, 2000, vol. 83, p. 68-76.

58. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976, vol. 72, p. 248-254.

59. Bragd P.L., van Bekkum H., Besemer A.C. TEMPO-mediated oxidation of polysaccharides: survey of methods and applications. — Topics in Catal, 2004, vol. 27, p. 49-66.

60. Bulter T., Alcalde M., Sieber V., Meinhold P., Schlachtbauer C., Arnold F.H. Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution. Appl Environ Microbiol, 2003, vol. 69, p. 987-995.

61. Burton S. Laccases and phenol oxidases in organic synthesis. Curr Org Chem, 2003, vol. 7, p. 1317-1331.

62. Calcaterra A., Galli C., Gentili P. Phenolic compounds as likely natural mediators of laccase: A mechanistic assessment. J Mol Catal B: Enzym, 2008, vol. 51, p. 118-120.

63. Call H.P. Process for modifying, breaking down or bleaching lignin, materials containing lignin or like substrates. PCT. World patent application WO, 1994, vol. 94, p. 29510.

64. Call H.P. and Miicke I. History, overview and application of mediated lignolytic systems, especially laccase-mediator-system (LignozymR-process). J Biotechnol, 1997, vol. 53, p. 163-202.

65. Camarero S., Canas A.I., Nousiainen P., Record E., Lomascolo A., Mart'inez M.J., Mart'inez A.T. p-Hydroxycinnamic acids as natural mediators for laccase oxidation of recalcitrant compounds. Environ Sci Technol, 2008, vol. 42, p. 6703-6709.

66. Camarero S., Ibarra D., Mart'inez M.J., Mart'inez A.T. Lignin-derived compounds as efficient laccase mediators for decolorization of different types of recalcitrant dyes. Appl Environ Microbiol, 2005, vol. 71, p. 1775-1784.

67. Camarero S., Ibarra D., Mart'inez A.T., Romero J., Guti'errez A., del R'io J.C. Paper pulp delignification using laccase and natural mediators. — Enzyme Microb Technol, 2007, vol. 40, p. 1264-1271.

68. Campos R., Kandelbauer A., Robra K.H., Cavaco-Paulo A., Giibitz G.M. Indigo degradation with purified laccases from Trametes hirsuta and Sclerotium rolfsii. — J Biotechnol-2001, vol. 89, p. 131-139.

69. Cantarella G., Galli C., and Gentili P. Free radical vs. electron-transfer routes of oxidation of hydrocarbons by laccase/mediator systems. Catalytic or stoichiometric procedures. J Mol Catal B: Enzym, 2003, vol. 22, p. 135-144.

70. Cantarella G., Galli C., and Gentili P. Oxidation of non-phenolic substrates with the laccase/N-hydroxyacetanilide system: Structure of the key intermediate from the mediator and mechanistic insight. New J Chem, 2004, vol. 28, p. 366-372.

71. Cantarelli C., Brenna O., Giovanelli G., Rossi M. Beverage stabilization through enzymatic removal of phenolics. Food Biotechnol, 1989, vol. 3, p. 203-213.

72. Caparros-Ruiz D., Fornale S., Civardi L., Puigdomenech P., Rigau J. Isolation and characterisation of a family of laccases in maize. Plant Science, 2006, vol. 171, p. 217225.

73. Ceylan H., Kubilay S., Aktas N., Sahiner N. An approach for prediction of optimum reaction conditions for laccase-catalyzed biotransformation of 1-naphthol by response surface methodology (RSM). Bioresour Technol, 2008, vol. 99, p. 2025-2031.

74. Chandra R.P. and Ragauskas A.J. Evaluating laccase-facilitated coupling of phenolic acids to high-yield kraft pulps. Enzyme Microb Technol, 2002, vol. 30, p. 855-861.

75. Chefetz B., Chen Y., and Hadar Y. Purification and characterization of laccase from Chaetomium thermophilium and its role in humification. — Appl Env Micr, 1998, vol. 64, p. 3175-3179.

76. Chernykh A., Myasoedova N., Kolomytseva M., Ferraroni M., Briganti F., Scozzafava A., Golovleva L. Laccase isoforms with unusual properties from the basidiomycete Steccherinum ochraceum strain 1833. J Appl Microbiol, 2008, vol. 205, p.2065-2075.

77. Claus H., Faber G., Konig H. Redox-mediated decolorization of synthetic dyes by fungal laccases. Appl Microbiol Biotechnol, 2002, vol. 59, p. 672-678.

78. Claus H. and Filip Z. The evidence of a laccase-like activity in a Bacillus sphaericus strain. Microbiol Res, 1997, vol. 152, p. 209-215.

79. Claus H. Laccases and their occurrence in prokaryotes. Arch Microbiol, 2003, vol. 179, p. 145-150.

80. Cole J.L., Tan G.O., Yang E.K., Hodgson K.O., Solomon E.I. Reactivity of the laccase trinuclear copper active site with dioxygen: an X-ray absorption edge study. — J Am Chem Soc, 1990, vol. 112, p. 2243-2249.

81. Coll P.M., Fernandez-Abalos J.M., Villanueva J.R., Santamaria R., Perez P. Purification and characterization of phenoloxidase (laccase) from the lignin-degrading basidiomycete PM1 (CECT 2971). Appl Environ Microbiol, 1993, vol. 59, p. 2607-2613.

82. Collins P.J. and Dobson A.D.W. Regulation of laccase gene transcription in Trametes versicolor.- Appl Env Microbiol, 1997, vol. 63, p. 3444-3450.

83. Conrad L.S., Sponholz W.R., Berker O. Treatment of cork with a phenol oxidizing enzyme. US patent US6152966, 2000.

84. Couto S.R. and Herrera J.L.T. Industrial and biotechnological applications of laccases: A review. Biotech Adv, 2006, vol. 24, p. 500-513.

85. Couto S.R. and Herrera J.L.T. Lacasses in the textile industry. Biotechnol Mol Biol Rev, 2006, vol. l,p. 117-122.

86. Crowe J.D and Olsson S. Induction of laccase activity in Rhizoctonia solani by antagonistic Pseudomonas fluorescens strains and a range of chemical treatments. Appl Env Micr, 2001, vol. 67, p. 2088-2094.

87. Curir P., Thurston C.F., Daquila F., Pasini C., Marchesini A. Characterization of a lacease secreted by Armillaria mellea pathogenic for Genista. — Plant Physiol Biochem, 1997, vol. 35, p. 147-153.

88. D'Acunzo F., Baiocco P., Fabbrini M., Galli C., Gentili P. The radical rate-determining step in the oxidation of benzyl alcohols by two N-OH-type mediators of lacease: the polar N-oxyl radical intermediate. New J Chem, 2002, vol. 26, p. 1791-1794.

89. D'Annibale A., Celletti D., Felici M., Dimattia E., Giovannozzi-Sermanni G. Substrate specificity of lacease from Lentinus edodes. Acta Biotechnol, 1996, vol. 16, p. 257-270.

90. D'Annibale A., Stazi S.R., Vinciguerra V., Giovannozzi-Sermanni G. Oxirane-immobilized Lentinula edodes laccase: stability and phenolics removal efficiency in olive mill wastewater. J Biotechnol, 2000, vol. 77, p. 265-273.

91. Das N., Sengupta S., Mukherjee M. Importance of laccase in vegetative growth of Pleurotus florida. Appl Environ Microbiol, 1997, vol. 63, p. 4120 - 4122.

92. Datta A., Betterman A., Kirk K.T. Idendification of a specific manganese peroxidase among lignolytic enzymes secreted by Phanerochaete chrysosporium during wood decay. -Appl Environ Microbiol, 1991, vol. 57, p. 1453 1460.

93. Dean J.F.D. and Eriksson K.-E.L. Laccase and the deposition of lignin in vascular plants. Holzforshung, 1994, vol. 48, p. 21-33.

94. Dedeyan B., Klonowska A., Tagger S., Tron T., Iacazio G., Gil G., Le Petit J. Biochemical and molecular characterization of a laccase from Marasmius quercophilus. Appl Environ Microbiol, 2000, vol. 66, p. 925-929.

95. De Gregorio E., Spellman P.T., Rubin G.M., Lemaitre B. Genome-wide analysis of the Drosophila immune response by using oligonucleotide microarrays. Proc Nat Acad Sci USA, 2001, vol. 98, p. 12590-12595.

96. Dekker R.F.H. and Barbosa A.M. The effects of aeration and veratryl alcohol on the production of two laceases by the ascomycete Botryosphaeria sp. Enzyme Microb Technol, 2001, vol. 28, p. 81-88.

97. De la Rubia T., Ruiz E., Pérez J.,-Martínez J. Properties of a laccase produced by Phanerochaete flavido-alba induced by vanillin. Arch Microbiol, 2002, vol. 179, p. 7073.

98. De Marco A. and Roubelakis-Angelakis K.A. Laccase activity could contribute to cellwall reconstitution in regenerating protoplasts. Phytochem, 1997, vol. 46, p. 421-425.

99. De Souza C.G.M. and Peralta R.M. Purification and characterization of the main laccase produced by the white-rot fungus Pleurotus pulmonarius on wheat bran solid state medium. J Basic Microbiol, 2003, vol. 43, p. 278-286.

100. De Souza C.G.M., Tychanowicz G.K., De Souza D.F., Peralta R.M. Production of laccase isoforms by Pleurotus pulmonarius in response to presence of phenolic and aromatic compounds. J Basic Microbiol, 2004, vol. 44, p. 129-136.

101. De Vries O.M.H., Kooistra W.H.C.F., Wessel J.G.H. Formation of an extracellular laccase by a Schizophyllum commune dikaryon. — J Gen Microbiol, 1986, vol. 132, p. 2817—2826.

102. Diamantidis G., Effosse A., Potier P., Bally R. Purification and characterization of the first bacterial laccase in the rhizospheric bacterium Azospirillum lipoferum. Soil Biol Biochem, 2000, vol. 32, p. 919-927.

103. Dias A.A., Bezerra R.M., Pereira A.N. Activity and elution profile of laccase during biological decolorization and dephenolization of olive mill wastewater. Biores Technol, 2004, vol. 92, p. 7-13.

104. Dijkstra L. and Walker J.R.L. Enzymic browning in apricots Primus armeniaca. — J Sci Food Agric, 1991, vol. 54, p. 229-234.

105. Dittmer J.K., Patel N.J., Dhawale S.W., Dhawale S.S. Production of multiple laccase isoforms by Phanerochaete chrysosporium grown under nutrient sufficiency. FEMS Microbiol Lett, 1997, vol.149, p. 65-70.

106. Dong J.L. and Zhang Y.Z. Purification and characterization of two laccase isoenzymes from a ligninolytic fungus Ti-ametes gallica. — Prep Biochem Biotechnol, 2004, vol. 34, p. 179-194.

107. D'Souza T.M., Merritt C.S., Reddy C.A. Lignin-modifying enzymes of the white rot basidiomycete Ganoderma lucidum. Appl Environ Microbiol, 1999, vol. 65, p. 5307— 5313.

108. Edens W.A., Goins T.Q., Dooley D., Henson J.M. Purification and characterization of a secreted laccase of Gaeumannomyces graminis var. tritici. — Appl Environ Microbiol, 1999, vol. 65, p. 3071-3074.

109. Edge A.S.B., Faltynek C.R., Hof L., Reichert L.E.Jr., Weber P. Deglycosylation of glycoproteins by trifluoromethanesulfonic acid. Analyt Biochem, 1981, vol. 118, p. 131— 137.

110. Eggert C., LaFayette P.R., Temp U., Eriksson K.—E.L., Dean J.F.D. Molecular analysis of a laccase gene from the white rot fungus Pycnoporus cinnabarinus. — Appl Environ Microbiol, 1998, vol. 64, p. 1766-1772.

111. Eggert C., Temp U., Dean J.F.D., Eriksson K.E.L. Laccase-mediated formation of the phenoxazinone derivative, cinnabarinic acid. — FEBS Lett, 1995, vol. 376, p. 202-206.

112. Eggert, C., Temp U., Dean J. F., Eriksson K—E.L. A fungal metabolite mediates degradation of non-phenolic lignin structures and synthetic lignin by laccase. FEBS Lett, 1996b, vol. 391, p. 144-148.

113. Eggert C., Temp U., Eriksson K.E.L. The ligninolytic system of the white rot fungus Pycnoporus cinnabarinus: purification and characterization of the laccase. — Appl Environ Microbiol, 1996a, vol. 62, p. 1151-1158.

114. Eggert C., Temp U., Eriksson K.E.L. Laccase is essential for lignin degradation by the white-rot fungus Pycnoporus cinnabarinus. FEBS Lett, 1997, vol. 407, p. 89-92.

115. Endo K., Hayashi Y., Hibi T., Hosono K., Beppu T., Ueda K. Enzymological characterization of EpoA, a laccase-like phenol oxidase produced by Streptomyces griseus. J Biochem, 2003, vol. 133, p. 671-677.

116. Endo K., Hosono K., Beppu T., Ueda K. A novel extracytoplasmic phenol oxidase of Streptomyces'. its possible involvement in the onset of morphogenesis. — Microbiol, 2002, vol. 148, p. 1767-1776.

117. Enguita F.J., Marcal D., Martins L.O., Grenha R., Henriques A.O., Lindley P.F., Carrondo M.A. Substrate and dioxygen binding to the endospore coat laccase from Bacillus subtilis. J Biol Chem, 2004, vol. 279, p. 23472-23476.

118. Enguita F.J., Martins L.O., Henriques A.O., Carrondo M.A. Crystal structure of a bacterial endospore coat component. A laccase with enhanced thermostability properties. J Biol Chem, 2003, vol. 278, p. 19416-19425.

119. Esposito E., Innocentinini-Mei L.H., Ferraz A., Canhos V.P., Duran N. Phenoloxidases and hydrolases from Pycnoporus-sangiuneus EUC-2050 strain applications. J Biotechnol, 1993, vol. 20, p. 219-228.

120. Fabbrini M., Galli C., Gentili P. Comparing the catalytic efficiency of some mediators of laccase. J Mol Catal B: Enzym, 2002, vol. 16, p. 231 - 240.

121. Fahraeus G. and Tullander V. Effect of indole-3-acetic acid on the formation of oxidases in fungi. Physiol Plant, 1956, vol. 9, p. 494-501.

122. Fahraeus G., Tullander H., Ljiunggren H. Production of high laccase yields in cultures of fungi. Physiol Plant, 1958, vol. 11, p. 631-643.

123. Fairbanks J., Steek T.K., Wallach D.F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry, 1971, vol. 10, p. 2606-2617.

124. Faraco V., Giardina P. Sannia G. Metal-responsive elements in Pleurotus ostreatus laccase gene promoters. Microbiol, 2003, vol. 149, p. 2155-2162.

125. Farrel R.L., Murtagh K.E., Tien M., Mozuch M.D., Kirk K.T. Physical and enzymatic properties of lignin peroxidase isoenzymes from Phanerochaete chrysosporium. Enzyme Microb Technol, 1989, vol. 11, p.322 - 328.

126. Felby C., Pedersen L.S., Nielsen B.R. Enhanced autoadhesion of wood fibers using phenol oxidases. Holzforschung, 1997, vol. 51, p. 281-286.

127. Fenn P. and Kirk T.K. Relationship of nitrogen to the outset and suppression of ligninolytic activity and secondary metabolism in Phanerochaete chrysosporium. Arch Microbiol, 1981, vol. 130, p. 59 - 65.

128. Fernández-Larrea J. and Stahl U. Isolation and characterization of a laccase gene from Podospora anserina.- Mol Gen Genet, 1996, vol. 252, p. 539-551.

129. Froehner S.C. and Eriksson K.E.L. Induction of Neurospora crassa laccase with protein synthesis inhibitors. J Bacteriol, 1974a, vol. 120, p. 450-457.

130. Froehner S.C. and Eriksson K.E.L. Purification and properties of Neurospora crassa laccase. J Bacteriol, 1974b, vol. 120, p. 458-465.

131. Galai S., Limam F., Marzouki M.N. A new Stenotrophomonas maltophilia strain producing laccase. Use in decolorization of synthetics dyes. Appl Biochem Biotechnol, 2009, vol. 158, p. 416-431.

132. Galhaup C., Goller S., Peterbauer C.K., Strauss J., Haltrich D. Characterization of major laccase isoenzyme from Trametes pubescens and regulation of its synthesis by metal ions. Microbiol, 2002, vol. 148, p.2159-2169.

133. Galhaup C. and Haltrich D. Enhanced formation of laccase activity by the white-rot fungus Trametes pubescens in the presence of copper. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, vol. 56, p. 225-232.

134. Galliano H., Gas G., Seris J., Boudet A.M. Lignin degradation by Rigidosporus lignosus involves synergistic action of two enzymes: Mn peroxidase and laccase. Enzyme Microb Technol, 1991, vol. 13, p. 478^182.

135. Gamella M., Campuzano S., Reviejo A.J., Pingarron J.M. Electrochemical estimation of the polyphenol index in wines using a laccase biosensor. J Agric Food Chem, 2006, vol. 54, p. 7960-7967.

136. Garzillo A.M.V., Colao M.C., Caruso C., Caporale C., Celletti D., Buonocore V. Laccase from the white-rot fungus Trametes trogii. Appl Microbiol Biotechnol, 1998, vol. 49, p. 545-551.

137. Garzillo A.M.V., Di Paolo S., Burla G., Buonocore V. Differently-induced extracellular phenol oxidases from Pleurotus ostreatus. Phytochem, 1992, vol. 31, p. 3685-3690.

138. Gavnholt B., Larsen K., Rasmussen S.K. Isolation and characterisation of laccase cDNAs from meristematic and stem tissues of ryegrass (Lolium perenne). — Plant Sci, 2002, vol. 162, p. 873-885.

139. Geng X., Li K., Xu F. Investigation of hydroxamic acids as laccase-mediators for pulp bleaching. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, vol.64, p. 493^96.

140. Germann U.A., Muller G., Hunziker P.E., Lerch K. Characterization of two allelic forms of Neurospora crassa laccase. Amino— and carboxyl-terminal processing of a precursor. -J Biol Chem, 1988, vol. 263, p. 885-896.

141. Ghindilis A.L., Gavrilova V.P., Yaropolov A.I. Laccase-based biosensor for determination of polyphenols: determination of catechols in tea. Biosens Bioelectron, 1992, vol. 7, p. 127-131.

142. Gianfreda L., Sannino F., Filazzola M.T., Leonowicz A. Catalytic behavior and detoxifying ability of a laccase from the fungal strain Cerrena unicolor. J Molecular Catalysis B:Enzymatic, 1998, vol. 4, p. 13-23.

143. Gianfreda L., Xu F., Bollag J.-M. Laceases: a useful group of oxidoreductive enzymes. -J Bioremediation, 1999, vol. 3, p. 1—25.

144. Giardina K., Palmieri G., Scaloni A., Fontanella B., Faraco V., Cennamo G., Sannia G. Protein and gene structure of a blue lacease from Pleurotus ostreatus. — Biochem J, 1999, vol. 341, p. 655-663.

145. Giovanelli G. and Ravasini G. Apple juice stabilization by combined enzyme-membrane filtration process. Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie, 1993, vol. 26, p. 1-7.

146. Gluttenbuck A.J. Absence of lacease from yellow spored mutants of Aspergillus nidulans. J Gen Microbiol, 1972, vol. 70, p. 423^135.

147. Gochev V. K. and Krastanov A. I. Isolation of lacease producing Trichoderma spp. Bulg J Agrie Sci, 2007, vol. 13, p. 171-176.

148. Golz-Berner K., Walzel B., Zastrow L., Doucet O. Cosmetic and dermatological preparation containing copperbinding proteins for skin lightening. Int Pat Appl W02004017931,2004.

149. Gomes S.A.S.S., Nogueira J.M.F., Rebelo M.J.F. An amperometric biosensor for polyphenolic compounds in red wine. Biosens Bioelectron, 2004, vol. 20, p. 1211-1216.

150. Guex N. and Peitsch M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modelling. Electrophoresis, 1997, vol. 18, p. 2714-2723.

151. Guillen F., Martinez M. J., Muñoz C., Martinez A. T. Quinone redox cycling in the ligninolytic fungus Pleurotus eryngii leading to extracellular production of superoxide anion radical. Arch Biochem Biophys, 1997, vol. 339, p. 190-199.

152. Guillen F, Munoz C., Toribio V. G., Martinez A. T, Martinez M. J. Oxygen activation during oxidation of methoxyhydroquinones by laccase from Pleurotus eryngii. Appl Environ Microbiol, 2000, vol. 66, p. 170-175.

153. Gunther H., Perner B., Gramss G. Activities of phenol oxidizing enzymes of ectomycorhizal fungi in axenic culture and in symbiosis with Scots pine {Pinns sylvestris L). J Basic Microbiol, 1998, vol.38, p. 197-206.

154. Gurr S.J., Unkles S.E., Kinghorn J.R. The structure and organization of nuclear genes of filamentous fungi. In: Kinghorn JR (ed) Gene structure in eukaryotic microbes. 1987, IRL, Oxford, p. 93-139.

155. Haars A. and Hüttermann A. Laccase induction in the white rot fungus Hetrobasidion annosum fomes-annosus. Arch Microbiol, 1983, vol. 134, p. 309-313.

156. Hakulinen N., Andberg M., Kallio J., Koivula A., Kruus K., Rouvinen J. A near atomic resolution structure of a Melanocarpus albomyces laccase. J Struct Biol, 2008, vol. 162, p. 29-39.

157. Hakulinen N., Kiiskinen L.-L., Kruus K., Saloheimo M., Paananen A., Koivula A., Rouvinen J. Crystal structure of a laccase from Melanocarpus albomyces with an intact trinuclear copper site. Nat Struct Biol, 2002, vol. 9, p. 601-605.

158. Harkin J.M. and Obst J.R. Lignification in trees: indication of exclusive peroxidase participation. Science, 1973, vol.180, p. 296-298.

159. Hatakka A. Biodegradation of lignin. Lignin, humic substances and coal (Hofrichter M. and Steinbüchel A., eds). 2001, p. 129-179. Wiley-VCH, Weinheim, Germany.

160. Hatvani N. and Mecs I. Effects of certain heavy metals on the growth, dye decolorization, and enzyme activity of Lentinula edodes. Ecotoxicol Environ Saf, 2003, vol. 55, p. 199203.

161. Heinfling A., Martinez A.T., Martinez M.J., Bergbauer M., Szewzyc U. Purification and characterization of peroxidases from the dye-decolorizing fungus Bjerkandera adusta. -FEMS Microbiol Lett, 1998, vol. 165, p .43-50.

162. Heinzkill M., Bech L., Halkier T., Schneider P., Anke T. Characterization of laccases from wood-rotting fungi (family Coprinaceae). Appl Environ Microbiol, 1998, vol. 64, p. 1601-1606.

163. Hermann T.E., Kurtz M.B., Champe S.P. Laccase localized in hulle cells and cleistothecial primordial of Aspergillus nidulans. J Bacteriol, 1983, vol.154, p. 955-964.

164. Hoegger P.J., Navarro-Gonzalez M., Kilaru S., Hoffmann M., Westbrook E.D., Kues U. The laecase gene family in Coprinopsis cinerea (Coprinus cinereus). — Curr Genet, 2004, vol. 45, p. 9-18.

165. Hosny M. and Rosazza J.P.N. Novel oxidations of (+)-catechin by horseradish peroxidase and laccase. J Agric Food Chem, 2002, vol. 50, p. 5539-5545.

166. Huang H., Zoppellaro G., Sakurai T. Spectroscopic and kinetic studies on the oxygen-centered radical formed during the four-electron reduction process of dioxygen by Rhus vernicifera laccase. J Biol Chem, 1999, vol. 274, p. 32718 - 32724.

167. Hu M.R., Chao Y.P., Zhang G. Q., Xue Z. Q., Qian S. Laccase-mediator system in the decolorization of different types of recalcitrant dyes. — J Ind Microbiol Biotechnol, 2009, vol. 36, p. 45-51.

168. Hullo M.-F., Moszer I., Danchin A., Martin-Verstraete I. CotA of Bacillus subtilis is a copper-dependent laccase. J Bact, 2001, vol. 183, p. 5426-5430.

169. Huttermann A., Mai C., and Kharazipour A. Modification of lignin for the production of new compound and materials. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, vol. 55, p. 387-394.

170. Ikeda R., Sugihara J., Uyama H., Kobayashi S. Enzymatic oxidative polymerization of 4-hydroxybenzoic acid derivatives to poly(phenylene oxide)s. — Polym Int, 1998a, vol. 47, p. 295-301.

171. Ikeda R., Tanaka H., Uyama H., Kobayashi S. Laccase-catalyzed polymerization of acrylamide. Macromol Rapid Commun, 1998b, vol. 19, p.423-425.

172. Ikeda R., Tanaka H., Oyabu H., Uyama H., Kobayashi S. Preparation of artificial urushi via an environmentally benign process. Bull Chem Soc Jpn, 2001, vol. 74, p. 1067-1073.

173. Ikeda R., Tsujimoto T., Tanaka H., Oyabu H., Uyama H., Kobayashi S. Man-made Urushi. Preparation of crosslinked polymeric films from renewable resources via air-oxidation processes. Proc Jpn Acad, 2000, vol. 76B, p. 155-160.

174. Iyer G. and Chattoo B.B. Purification and characterization of laccase from the rice blast fungus, Magnaporthe grisea. FEMS Microbiol Lett, 2003, vol. 227, p. 121-126.

175. Jarosz-Wilkolazka A., Ruzgas T., and Gorton L. Use of laccase-modified electrode for amperometric detection of plant flavonoids. Enzyme Microb Technol, 2004, vol. 35, p. 238-241.

176. Joel D.M., Marbach I., and Mayer A.M. Laccase in Anacardiaceae. Phytochem, 1978, vol. 17, p. 796-797.

177. Johannes C. and Majcherczyk A. Natural mediators in the oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons by laccase mediator systems. Appl Environ Microbiol, 2000a, vol. 66, p. 524-528.

178. Johannes C. and Majeherczyk A: Lacease activity tests and lacease inhibitors. J Biotechnol, 2000b, vol. 78, p. 193-199.

179. Johnson D.L., Thompson J.L., Brinkmann S.M., Schuller K.A., Martin L.L. Electrochemical characterization of purified Rhus vernicifera lacease: voltammetric evidence for a sequential four-electron transfer. Biochemistry, 2003, vol. 42, p. 1022910237.

180. Jong de E., Field J.A., de Bont J.A.M. Aryl alcohols in the physiology of ligninolytic fungi. FEMS Microbiol Rev, 1994, vol. 13, p. 153-187.

181. Junghanns C., Moeder M., Krauss G., Martin C., Schlosser D. Degradation of the xenoestrogen nonylphenol by aquatic fungi and their laceases. Microbiol, 2005, vol. 151, p. 45-57.

182. Kantelinen A., Hatakka A., Viikari L. Production of lignin peroxidase and laccase by Phlebia radiata. Appl Microbiol Biotechnol, 1989, vol. 31, p. 234-239.

183. Karahanian E., Corsini G., Lobos S., Vicuña R. Structure and expression of a laccase gene from the ligninolytic basidiomycete Ceriporiopsis subvermispora. Biochim Biophys Acta, 1998, vol. 1443, p. 65-74.

184. Karhunen E., Niku-Paavola M.-L., Viikari L., Haltia T., van der Meer R.A., Duine J.A. A novel combination of prosthetic groups in a fungal laccase; PQQ and two copper atoms. -FEBS Lett, 1990, vol. 267, p. 6-8.

185. Kaufmann U. and Wellendorf H. Mycelial growth and extracellular laccase cellobiose and sodium lignin sulfonate. Eur J Forest Pathol, 1980, vol. 10, p. 90-95.

186. Kersten P.J., Kalyanaraman B., Hammel K.E., Reinhammer B., Kirk T.K. Comparison of lignin peroxidase, horseradish peroxidase and laccase in the oxidation of methoxybenzenes. Biochem J, 1990, vol. 268, p. 475-480.

187. Kiiskinen L.L., Viikari L., Kruus K. Purification and characterisation of a novel laccase from the ascomycete Melanocarpus albomyces. Appl Microbiol Biotechnol, 2002, vol. 59, p. 198-204.

188. Kilaru S., Hoegger P.J., Kües U. The laccase multi-gene family in Coprinopsis cinerea has seventeen different members that divide into two distinct subfamilies. Curr Genet, 2006, vol. 50, p. 45-60.

189. Kim Y., Cho N.S., Eom T.J., Shin W. Purification and characterization of a laccase from Cerrena unicolor and its reactivity in lignin degradation. Bull Korean Chem Soc, 2002, vol. 23, p. 985-989.

190. Kirk T.K., Schultz E., Connors W.J., Lorenz L.F., Zeikus J.G. Influents of cultural parameters on lignin metabolism by Phanerochaete chrysosporium. Arch Microbiol, 1978, vol. 177, p. 277.

191. Kobayashi S., Ikeda R., Oyabu H., Tanaka H., Kobayashi S. Artificial Urushi: Design, synthesis, and enzymatic curing of new urushiol analogues. — Chem Lett, 2000, vol. 29, p. 1214-1215.

192. Kobayashi S., Uyama H, and Ikeda R. Artificial urushi. Chemistry. 2001, vol. 7, p. 4754-4760.

193. Ko E.M., Leem Y.E., and Choi H.T. Purification and characterization of lacease isozymes from the white-rot basidiomycete Ganoderma lucidum. — Appl Microbiol Biotechnol, 2001, vol. 57, p. 98-102.

194. Koschorreck K., Schmid R.D., Urlacher V.B. Improving the functional expression of a Bacillus licheniformis lacease by random and site-directed mutagenesis. BMC Biotechnol, 2009, vol. 9, p. 12-21.

195. Kramer K.J., Kanost M.R., Hopkins T.L., Jiang H., Zhu Y.C., Xu R., Kerwin J.L., Turecek F. Oxidative conjugation of catechols with proteins in insect skeletal systems. -Tetrahedron, 2001,vol. 57, p. 385-392.

196. Kunamneni A., Camarero S., García-Burgos C., Plou F.J., Ballesteros A., Alcalde M. Engineering and applications of fungal laccases for organic synthesis. Microbial Cell Factories, 2008, vol. 7, p. 32 - 48.

197. Kurisawa M., Chung J.E., Uyama H., Kobayashi S. Laccase-catalyzed synthesis and antioxidant property of poly (catechin). Macromol Biosci, 2003, vol. 3, p. 758-764.

198. Labat E., Morel M.H., Rouau X. Effect of lacease and manganese peroxidase on wheat gluten and pentosans during mixing. Food Hydrocoll, 2001, vol. 15, p. 47-52.

199. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, vol. 227, p. 680-685.

200. LaFayette P.R., Eriksson K.-E., Dean J.F. Characterization and heterologous expression of lacease cDNAs from xylem tissues of yellow-poplar (Liriodendron tidipifera). — Plant Mol Biol, 1999, vol. 40, p. 23-35.

201. Lalitha Kumari H. and Sirsi M. Purification and properties of lacease from Ganoderma lucidum. Arch Microbiol, 1972, vol. 84, p. 350-357.

202. Lang G. and Cotteret J. Hair dye composition containing a lacease. (L'Oreal, Fr.). Int Pat Appl W09936036,1999.

203. Lantto R., Schíinberg C., Buchert J. Effects of laccase-mediator combination on wool. -Textile Res J, 2004, vol. 74, p. 713-717.

204. Larrondo L.F., Avila M., Salas L., Cullen D., Vicuña R. Heterologous expression of lacease cDNA from Ceriporiopsis subvermispora yields copper-activated apoprotein and complex isoform patterns. Microbiol, 2003, vol. 149, p. 1177-1182.

205. Lee S.-K., George S.D., Antholine W.E., Hedman B., Hodgson K.O., Solomon E.I. Nature of the intermediate formed in the reduction of O2 to H2O at the trinuclear copper cluster active site in native lacease. J Am Chem Soc, 2002, vol. 124, p. 6180-6193.

206. Lee I.-Y., Jung K.-H., Lee C.-H., Park Y.-H. Enhanced production of lacease in Trametes vesicolor by the addition of ethanol. Biotechnol Lett, 1999, vol. 21, p. 965968.

207. Lee J.S. and Suh D.S. Production and enzymatic properties of lacease from Flammulina velutipes. Korean J Mycol, 1985, vol. 13, p. 111-115.

208. Lehman E., Harel E., Mayer A.M. Copper content and other characteristics of purified peach lacease. Phytochem, 1974, vol. 13, p. 1713-1717.

209. Leite O.D., Lupetti K.O., Fatibello-Filho O., Vieira I.C., de Barbosa A.M. Synergic effect studies of the bi-enzymatic system lacease peroxidase in a voltammetric biosensor for catecholamines. Talanta, 2003, vol. 59, p. 889-896.

210. Leonowicz A., Cho N.S, Luterek J., Wilkolazka A., Wojtaswasilewska M., Matuszewska A., Hofrichter M., Wesenberg D., Rogalski J. Fungal lacease: properties and activity on lignin. J Basic Microbiol, 2001, vol. 41, p. 185-227.

211. Leonowicz A., Grzywnowicz K., and Malinowska M. Oxidative and demethylating activity of multiple forms of lacease from Pholiota mutabilis. Acta Biochim Polon, 1979, vol. 26, p. 431-434.

212. Leonowicz A., Trojanowski J., and Orlicz B. Induction of lacease EC 1.14.18.1 in basidiomycetes: Apparent activity of the inducible and constitutive forms of the enzyme with phenolic substrates. 1978, Acta Biochim Polon, vol. 25, p. 369-378.

213. Leontievsky A.A., Myasoedova N.M., Baskunov B.P., Golovleva L.A., Bucke C., Evans C.S. Transformation of 2,4,6-trichlorophenol by free and immobilized fungal lacease. -Appl Microbiol Biotechnol, 2001, vol. 57, p. 85-91.

214. Leontievsky A., Myasoedova N., Pozdnyakova N., Golovleva L. "Yellow" lacease of Partus tigrinus oxidizes nonphenolic substrates without electron-transfer mediators. -FEBS Lett, 1997, vol. 413, p. 446^148.

215. Levin L., Forchiassin F., Ramos A.M. Copper induction of lignin-modifying enzymes in the white-rot fungus Trametes trogii. Mycologia, 2002, vol. 94, p.377-383.

216. Li X, Wei Z, Zhang M, Peng X, Yu G, Teng M, Gong W. Crystal structures of E. coli lacease CueO at different copper concentrations. Biochem Biophys Res Commun, 2007, vol. 354, p. 21-26.

217. Lisov A.V., Zavarzina A.G., Zavarzin A.A., Leontievsky A.A. Laceases produced by lichens of the order Peltigerales. FEMS Microbiol Lett, 2007, vol. 275, p. 46-52.

218. Liu L.J., Dean F.D., Friedman W.E., Friedman K.-E.L. A laccase-like phenoloxidase is correlated with lignin biosynthesis in Zinnia elegans stem tissues. Plant J, 1994, vol. 6, p. 213-224.

219. Lopez-Cruz J.I., Viniegra-Gonzalez G., Hernandez-Arana A. Thermostability of native and pegylated Myceliophthora thermophila lacease in aqueous and mixed solvents. -Bioconjugate Chem, 2006, vol. 17, p. 1093-1098.

220. Lucas-Elfo P., Solano F., Sanchez- Amat A. Regulation of polyphenol oxidase activities and melanin synthesis in Marinomonas mediterránea: identification of ppoS, a gene encoding a sensor histidine kinase. Microbiol, 2002, vol. 148, p. 2457-2466.

221. Lund M. and Ragauskas AJ. Enzymatic modification of kraft lignin through oxidative coupling with water-soluble phenols. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, vol. 55, p. 699703.

222. Lundquist K. and Kristersson P. Exhaustive laccase-catalysed oxidation of a lignin model compound (vanillyl glycol) produces methanol and polymeric quinoid products. — Biochem J, 1985, vol. 229, p. 277-279.

223. Lyons J.I., Newell S.Y., Buchan A., Moran M.A. Diversity of ascomycete laccase gene sequences in a southeastern US salt marsh. — Microb Ecol, 2003, vol. 45, p. 270-281.

224. Machczynski M.C., Vijgenboom E., Samyn B., Canters G.W. Characterization of SLAC: A small laccase from Streptomyces coelicolor with unprecedented activity. Protein Science, 2004, vol. 13, p. 2388-2397.

225. Mai C., Majcherczyk A., and Hiittermann A. Chemo-enzymatic synthesis and characterization of graft copolymers from lignin and acrylic compounds. Enzyme Microb Technol, 2000, vol. 27, p. 167-175.

226. Mai C., Schormann W., Hiittermann A. Chemo-enzymatically induced copolymerization of phenolics with acrylate compounds. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, vol. 55, p. 177-186.

227. Majcherczyk A. and Johannes C. Radical mediated indirect oxidation of a PEG-coupled polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) compound by fungal Iaccase. Biochim Biophys Acta - Gen Subj, 2000, vol. 1474, p. 157-162.

228. Malkin R. and Malmstrom B.G. The state and function of copper in biological systems. -Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol, 1970, vol. 33, p. 177-244.

229. Malmstrom B.G., Reinhammar B., and Vanngard T. The state of copper in stellacyanin and Iaccase from the lacquer tree Rhus vernicifera. Biochim Biophys Acta, 1970, vol. 205, p. 48-57.

230. Mansur M., Suares T., Fernandez-Larrea J.B., Brizuela M.A., Gonzalez A.E. Identification of a Iaccase gene family in the new lignin-degrading basidiomycete CECT 20197. Appl Environ Microbiol, 1997, vol. 63, p. 2637-2646.

231. Mansur M., Suares T., and Gonzalez A.E. Differential gene expression in the Iaccase gene family from basidiomycete 1-62 (CECT 20197). Appl Environ Microbiol, 1998, vol. 64, p. 771-774.

232. Manzanares P., Fajardo S., and Martin C. Production of ligninolytic activities when treating paper pulp effluents by Trametes versicolor. J Biotechnol, 1995, vol. 43, p. 125132.

233. Marbach I., Harel E., Mayer A.M. Inducer and culture medium dependent properties of extracellular Iaccase from Botrytis cinerea. Phytochem, 1983, vol. 22, p. 1535- 1538.

234. Marbach I., Harel E., Mayer A.M. Molecular properties of extracellular Botrytis cinerea Iaccase. Phytochem, 1984, vol. 23, p. 2713-2717.

235. Marbach I., Harel E., Mayer A.M. Pectin a second inducer for Iaccase production by Botrytis cinerea. Phytochem (Oxford), 1985, vol. 24, p. 2559-2562.

236. Marcus R.A. and Sutin N. Electron transfer in chemistry and biology. Biochim Biophys Acta, 1985, vol. 811, p. 265-322.

237. Marzorati M., Danieli B., Haltrich D., Riva S. Selective laccase-mediated oxidation of sugars derivatives. Green Chem, 2005, vol. 7, p. 310-315.

238. Mathiasen T.E. Lacease for improved beer storage. Trends Food Sci Technol, 1996; vol. 7, p. 272.

239. Mayer A. and Harel E. Polyphenol oxidases in plants. Phytochem, 1979, vol.18, p. 193215.

240. Mayer A. and Staples R.C. Lacease: new function for an old enzyme. Phytochem, 2002, vol. 60, p. 551-565.

241. Messerschmidt A. Copper metalloenzymes. In: Comprehensive biological catalysis. Vol. 3 (Sinnet M., Ed.). Academic Press Limited, London, 1997, p. 401-426.

242. Michniewicz A., Ullrich R., Ledakowicz S., Hofrichter M. The white-rot fungus Cerrena unicolor strain 137 produces two lacease isoforms with different physico-chemical and catalytic properties. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, vol. 69, p. 682-688.

243. Mikolasch A., Hammer E., Jonas U., Popowski K., Stielow A., Schauer F. Synthesis of 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-propionic acid derivatives by N-coupling of amines using lacease. Tetrahedron, 2002, vol. 58, p. 7589-7593.

244. Mikolasch A., Wurster M., Lalk M., Witt S., Seefeldt S., Hammer E., Schauer F., Julich W.-D., Lindequist U. Novel (3-lactam antibiotics synthesized by amination of catechols using fungal lacease. Chem Pharm Bull, 2008b, vol. 56, p. 902-907.

245. Min K.L., Kim Y.H., Kim Y.W., Jung H.S., Hah Y.C. Characterization of a novel lacease produced by the wood-rotting fungus Phellinus ribis. Arch Biochem Biophys, 2001, vol. 392, p. 279-286.

246. Minussi R.C., Pastore G.M., and Durán N. Potential applications of lacease in the food industry. Trends Food Sci Technol, 2002, vol. 13, p. 205-216.

247. Miyazaki K. A hyperthermophilic lacease from Thermus thermophilic HB27. -Extremophiles, 2005, vol. 9, p. 415-425.

248. Molina-Guijarro J.M., Pérez J., Muñoz-Dorado J., Guillén F., Moya R., Hernández M., Arias M.E. Detoxification of azo dyes by a novel pH-versatile, salt-resistant lacease from Streptomyces ipomoea. Int Microbiol, 2009, vol. 12, p. 13-21.

249. Molino B.F., Haydar S.N., Yang Z., Michels P.C., Hemenway M.S., Rich J.O., Khmelnitsky Y. Preparation of novel cyclosporins. Patent WQ2004082629 A2 2004.

250. Molitoris H.P. and Esser K. The phenoloxidases of the ascomycete Podospora anserina. V. Properties of laccase I after further purification. Arch Microbiol, 1970, vol. 72, p. 267-296.

251. Monti D., Candido D., Manuel Cruz Silva M., Ken V., Riva S., Danieli B. Biocatalyzed generation of molecular diversity: selective modification of the saponin asiaticoside. — Adv Synth Catal, 2005, vol. 347, p. 1168-1174.

252. Mougin C., Boyer F.D., Caminade E., Rama R. Cleavage of the diketonitrile derivative of the herbicide isoxaflutole by extracellular fungal oxidases. J Agric Food Chem, 2000, vol. 48, p. 4529-4534.

253. Munoz C., Guillen F., Martinez A.T., Martinez M.J. Induction and characterization of laccase in the ligninolytic fungus Pleurotus eryngii. — Curr Microbiol, 1997b, vol. 34, p. 1-5.

254. Mustafa R., Muniglia L., Rovel B., Girardin M. Phenolic colorants obtained by enzymatic synthesis using a fungal laccase in a hydroorganic biphasic system. Food Res Int, 2005, vol.38, p. 995-1000.

255. Nakamura W. J. Studies on the biosynthesis of lignin. I. Disproof against the catalytic activity of laccase in the oxidation of coniferyl alcohol. — J Biochem, 1967, vol. 62, p. 54— 61.

256. Nakamura K. and Go N. Function and molecular evolution of multicopper blue proteins. -Cell Mol Life Sci, 2005, vol. 62, p. 2050-2066.

257. Ncanana S., Baratto L., Roncaglia L., Riva S., Burton S.G. Laccase-mediated oxidation of totarol. Adv Synth Catal, 2007, vol. 349, p. 1507-1513.

258. Ng T.B. and Wang H.X. A homodimeric laccase with unique characteristics from the yellow mushroom Cantharellus cibarius. Biochem Biophys Res Commun, 2004, vol. 313, p. 37-41.

259. Nicole M., Chamberland H., Geiger J.P., Lecours N., Valero J., Rio B., Ouellette G.B. Immunocytochemical localization of laccase LI in wood decayed by Rigidoporus lignosus. Appl Environ Microbiol, 1992, vol. 58, p. 1727-1739.

260. Nicole M., Chamberland H., Rioux D., Lecours N., Rio B., Geiger J.P., Ouellette G.B. A cytochemical study of extracellular sheaths associated with Rigidoporus lignosus during wood decay. Appl Environ Microbiol, 1993, vol.59, p. 2578-2588.

261. Niedermeyer T.H.J., Mikolasch A., Lalk M. Nuclear amination catalyzed by fungal laccases: reaction products of p-hydroquinones and primary aromatic amines. — J Org Chem, 2005, vol. 70, p. 2002-2008.

262. Niku-Paavola M.L., Karhunen E., Kantelinen A., Viikari L., Lundell T., Hatakka A. The effect of culture conditions on the production of lignin modifying enzymes by the white-rot fungus Phlebia radiata. J Biotechnol, 1990, vol. 13, p. 211-222.

263. Omura T. Studies on laccase of Lacquer trees. Comparison of laccases obtained from Rhus vernicifera and Rhus succedanea. J Biochem (Tokyo), 1961, vol. 50, p. 264—272.

264. Onuki T., Nogueji M., Mitamura J. Oxidative hair dye composition containing laccase| WO 0037030. Chem Abstr 133, 78994m| 2000. Ref. Type: Patent.

265. Ossiadacz J., Al-Adhami A.J.H., Bajraszewska D., Fischer P., Peczynska-Czoch W. On the use of Trametes versicolor laccase for the conversion of 4-methyl-3-hydroxyanthranilic acid to actinocin chromophore. J Biotechnol, 1999, vol. 72, p. 141— 149.

266. Ossola M. and Galante Y.M. Scouring of flax rove with the aid of enzymes. Enzyme Microb Technol, 2004, vol. 34, p. 177-186.

267. Palmieri G., Cennamo G., Faraco V., Amoresano A., Sannia G., Giardina P. Atypical laccase isoenzymes from copper supplemented Pleurotus ostreatus cultures. Enzyme Microb Technol, 2003, vol. 33, p. 220-230.

268. Palmieri G., Giardina P., Bianco C., Fontanella B., Sannia G. Copper induction of laccase isoenzymes in the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus. Appl Environ Microbiol, 2000, vol. 66, p. 920-924.

269. Palmieri G., Giardina P., Bianco C., Scaloni A., Capasso A., Sannia G. A novel white laccase from Pleurotus ostreatus. J Biol Chem, 1997, vol. 272, p. 31301-31307.

270. Palmieri G., Giardina P., Marzullo L., Desiderio B., Nitti G., Cannio R., Sannia G. Stability and activity of a phenol oxidase from the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus. -Appl Microbiol Biotechnol, 1993, vol. 39, p. 632-636.

271. Palonen H., Saloheimo M., Viikari L., Kruus K. Purification, characterization and sequence analysis of a laccase from the ascomycete Mauginiella sp. — Enzyme Microb Technol, 2003, vol. 33, p. 854-862.

272. Padgett R.A., Konarska M.M., Grabowski P.J., Hardy S.F., Sharp P.A. Lariat RNAs as intermediates and products in the splicing of messenger RNA precursors. Science, 1984, vol. 225, p. 898-903.

273. Pazarhoglu N.K., Sariiçik M., Telefoncu A. Laccase: production by Trametes versicolor and application to denim washing. Process Biochem, 2005, vol. 40, p. 1673-1678.

274. Pegasova T.V., Zwart P., Koroleva O.V., Stepanova E.V., Rebrikov D.V., Lamzin V.S. Crystallization and preliminary X—ray analysis of a four-copper laccase from Coriolus hirsutus. Acta Crystallogr, 2003, vol. 59, p. 1459-1461.

275. Pereira L., Bastos C., Tzanov T., Cavaco-Paulo A., Gubitz G.M. Environmentally friendly bleaching of cotton using laccases. Environ Chem Lett, 2005, vol. 3, p. 66-69.

276. Piontek K., Antorini M., Choinowski T. Crystal structure of a laccase from the fungus Trametes versicolor at 1.90—Â resolution containing a full complement of coppers. J Biol Chem, 2002, vol. 277, p. 37663-37669.

277. Plonka P.M. and Grabacka M. Melanin synthesis in microorganisms — biotechnological and medical aspects. Acta Biochimica Polonika, 2006, vol. 53, p. 429-443.

278. Pointing S.B., Pelling A.L., Smith G.J.D., Hyde K.D., Reddy C.A. Screening of basidiomycetes and xylariaceous fungi for lignin peroxidase and laccase gene-specific sequences.-Mycol Res, 1999, vol. 109, p. 115-124.

279. Pointing S.B., Jones E.B.G., Vrijmoed L.L.P. Optimization of laccase production by Pycnoporus sanguineus in submerged liquid culture. Mycologia, 2000, vol. 92, p. 139144.

280. Portaccio M., Di Martino S., Maiuri P., Durante D., De Luca P., Lepore M., Bencivenga U., Rossi S., De Maio A., Mita, D.G. Biosensors for phenolic compounds: The catechol as a substrate model. J Mol Catal B: Enzymes, 2006, vol. 41, p. 97-102.

281. Pruche F., Saint L.P., Bernards B. Hair dye compositions containing hydroxystilbene |Eur Pat Appl EP 1013,260, Chem Abstr 133,63587g.|. 2000. Ref Type: Patent.

282. Quintanar L., Stoj Ch., Taylor A.B., Hart J., Kosman D.J., Solomon E.I. Shall We dance? How a multicopper oxidase chooses its electron transfer partner. Acc Chem Res, 2007, vol. 40, p. 445-452.

283. Record E., Punt P.J., Chamkha M., Labat M., van Den Hondel C.A.M.J.J., Asther M. Expression of the Pycnoporus cinnabarinus laccase gene in Aspergillus niger and characterization of the recombinant enzyme. Eur J Biochem, 2002, vol. 269, p. 602-609.

284. Reinhammar B. Purification and properties of laccase and stellacyanin from Rhus vernicifera. -Biochim Biophys Acta, 1970, vol. 205, p. 37—47.

285. Reinhammar B. Laccase. In: Copper proteins and copper enzymes. Ed. By R. Lontie CRC Press; Boca Raton, Florida, 1984, vol. 3, p. 1-35.

286. Reinhammar B. An EPR signal from the half-reduced type 3 copper pair in Rhus vernicifera laccase. J Inorg Biochem, 1981, vol. 15, p. 27—39.

287. Reinhammar B., Malkin R., Jensen P., Karlsson B., Andreasson L.-E., Aasa R., Vanngard T., Malmstrom B.G. A new copper (II) electron paramagnetic resonance signail in two laccases and in cytochrome C oxidase. J Biol Chem, 1980, vol. 255, p.5000-5003.

288. Rigling D. and Van Alfen N.K. Regulation of laccase biosynthesis in the plant-pathogenic fungus Cryphonectria parasitica by doublestranded RNA. J Bacteriol, 1991, vol. 173, p. 8000-8003.

289. Rigling D. and Van Alfen N.K. Extra- and intracellular laccases of the chestnut blight fungus Cryphonectria parasitica. — Appl Environ Microbiol, 1993, vol. 59, p. 3634—3639.

290. Rittstieg K., Suurnakki A., Suortti T., Kruus K., Guebitz G.M., Buchert J. Polymerization of guaiacol and a phenolic p-O-4—substructure by Trametes hirsuta laccase in the presence of ABTS.-Biotechnol Prog, 2003, vol. 19, p. 1505-1509.

291. Riva S. Laccases: blue enzymes for green chemistry. TRENDS in Biotechnology, 2006, vol. 24, p. 219-226.

292. Robles A., Lucas R., Martinez-Canamero M., Omar N.B., Perez R., Galvez A. Characterisation of laccase activity produced by the hyphomycete Chalara (syn. Thielaviopsis) paradoxa CH32. Enzyme Microb Technol, 2002, vol. 31, p. 516-522.

293. Rodriguez A., Falcon M.A., Carnicero A., Perestelo F., Delafuente G., Trojanowski J. Laccase activities of Penicillium chrysogenum in relation to lignin degradation. Appl Microbiol Biotechnol, 1996, vol. 45, p. 399-403.

294. Rodriguez Couto S., Sanroman M.A., Gtibitz G.M. Influence of redox mediators and metal ions on synthetic acid dye decolourization by crude laccase from Trametes hirsuta. — Chemosphere, 2005, vol. 58, p. 417-422.

295. Rodriguez E., Pickard M.A., Vazquez D.R. Industrial dye decolorization by laccases from ligninolytic fungi. Curr Microbiol, 1999, vol. 38, p. 27-32.

296. Rogalski J., Dawidowicz, A.L., Leonowicz A. Purification and immobilization of the inducible form of extracellular laccase of the fungus Trametes versicolor. Acta Biotechnol, 1990, vol. 10, p. 261-269.

297. Rogalski J. and Leonowicz A. Phlebia radiata laccase forms induced by veratric acid and xylidine in relation to lignin peroxidase and manganese-dependent peroxidase. Acta Biotechnol, 1992, vol. 12, p. 213-221.

298. Rogalski J., Lundell T.K., Leonowicz A., Hatakka A.I. Influence of aromatic compounds and lignin on production of ligninolytic enzymes by Phlebia radiata. Phytochem, 1991a, vol. 30, p. 2869-2872.

299. Rogalski J., Lundell T., Leonowicz A., Hatakka A. Production of laccase, lignin peroxidase and manganese-dependent peroxidase by various strains of Trametes versicolor depending on culture conditions. Acta Microbiol Polon, 1991b, vol. 40, p. 221-224.

300. Roure M., Delattre P., Froger H. (03.03.1992). Composition for an enzymic coloration of keratin fibres, especially for hair and its use in a dyeing process. Eur Pat Appl EP0504005.

301. Roy-Arcand L. and Archibald F.S. Direct dechlorination of chlorphenolic compounds by laccase from Trametes (Coriolus) versicolor. Enzyme Microb Technol, 1991, vol.13, p. 194-203.

302. Ruijssenaars H.J. and Hartmans S. A cloned Bacillus halodurans multicopper oxidase exhibiting alkaline laccase activity. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, vol. 65, p. 177182.

303. Ruiz J.C., De la Rubia T., Perez J., Martinez J. Effect of olive oil mill wastewater on extracellular ligninolytic enzymes produced by Phanerochaete flavido-alba. FEMS Microbiol Lett, 2002, vol. 212, p. 41-45.

304. Sadhasivam S., Savitha S., Swaminathan K., Feng-Huei Lin. Production, purification and characterization of mid-redox potential laccase from a newly isolated Trichoderma harzianum WL1. Process Biochemistry, 2008, vol. 43, p. 736-742.

305. Saito T., Honga P., Kato K., Okazaki M., Inagaki H., Maedac S., Yokogawa Y. Purification and characterization of an extracellular laccase of a fungus (family Chaetomiaceae) isolated from soil. Enzyme Microb Technol, 2003, vol. 33, p. 520-526.

306. Sakurai T. and Kataoka K. Basic and applied features of multicopper oxidases, CueO, bilirubin oxidase, and lacease. Chem Ree, 2007, vol. 7, p. 220-229.

307. Salas C., Lobos S., Larraín J., Salas L., Cullen D., Vicuña R. Properties of lacease isoenzymes produced by the basidiomycete Ceriporiopsis subvermispora. — Biotechnol Appl Biochem, 1995, vol. 21, p. 323-333.

308. Saloheimo M., Niku-Paavola M.—L., Knowles J.K. Isolation and structural analysis of the lacease gene from the lignin-degrading fungus Phlebia radiata. J Gen Microbiol, 1991, vol. 137, p. 1537-1544.

309. Salony S.M. and Bisaria V.M. Production and characterization of lacease from Cyathus bidleri and its use in decolonization of recalcitrant textile dyes. — Appl Microbiol Biotechnol, 2006, vol. 71, p. 646-653.

310. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. MolecularCloning: a Laboratory Maual. NewYork: Cold Spring Harbor Lab Press, 1989.

311. Saparrat M.C.N., Arambarri A.M., Balatti P.A. Growth and extracellular lacease production in liquid cultures of Minimidochium parvum LPSC 548 Strain. Bol Soc Argent Bot, 2007, vol. 42, p. 39 - 44.

312. Saparrat M.C.N., Guillen F., Arambarri A.M., Martinez A.T., Martinez M.J. Induction, isolation, and characterization of two laceases from the white rot basidiomycete Coriolopsis rigida. Appl Environ Microbiol, 2002b, vol. 68, p. 1534-1540.

313. Saparrat M.C.N., Martínez M.J., Cabello M.N., Arambarri A.M. Screening for ligninolytic enzymes in autochthonous fungal strains from Argentina isolated from different substrata. Rev Iberoam Micol, 2002a, vol. 19, p. 181-185.

314. Sariaslani F.S., Beale J.M., Rosazza P. Oxidation of rotenone by Polyporus anceps lacease. J Natt Prod (Lloydia), 1984, vol. 47, p. 692-697.

315. Sato Y., Wuli B., Sederoff R., Whetten R. Molecular cloning and expression of eight lacease cDNAs in loblolly pine (Pinus taeda). J Plant Res, 2001, vol. 114, p. 147-155.

316. Schäfer A., Specht M., Hetzheim A., Francke W., Schauer F. Synthesis of substituted imidazoles and dimerization products using cells and lacease from Trametes versicolor. -Tetrahedron, 2001, vol. 57, p. 7693-7699.

317. Scheel T., Höfer M., Ludwig S., Hölker U. Differential expression of manganese peroxidase and lacease in white-rot fungi in the presence of manganese or aromatic compounds. Appl Microbiol Biotechnol, 2000, vol. 54, p. 686-691.

318. Scherer M. and Fischer R. Purification and characterization of laccase II of Aspergillus nidulans. Arch Microbiol, 1998, vol. 170, p. 78-84.

319. Schneider P., Caspersen M.B., Mondorf K., Halkier T., Skov L.K., Ostergaard P.R., Brown K.M., Brown S.H., Xu F. Characterization of a Coprinns cinereus laccase. -Enzyme Microb Technol, 1999, vol. 25, p. 502-508.

320. Schwede T., Kopp J., Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server. Nucleic Acids Research, 2003, vol. 31, p. 3381-3385.

321. Selinheimo E., Kraus K., Buchert J., Hopia A., Autio K. Effects of laccase, xylanase and their combination on the rheological properties of wheat doughs. J Cereal Sei, 2006, vol. 43, p. 152-159.

322. Semenov A.N., Lomonosova I.V., Berezin V., Titov I. Peroxidase and laccase as catalysts for removal of phenylhydrazide protecting group under mild conditions. Biotechnol Bioeng, 1993, vol. 42, p. 1137-1141.

323. Servili M., De Stefano G., Piacquadio P., Sciancalepore V. A novel method for removing phenols from grape must. Amer J Enol Viticult, 2000, vol. 51, p. 357-361.

324. Setti L., Giuliani S., Spinozzi G., Pifferi P.G. Laccase catalyzed oxidative coupling of 3-methyl 2-benzothiazolinone hydrazone and methoxyphenols. Enzyme Microb Technol, 1999, vol. 25, p. 285-289.

325. Sharma R., Goel R., Capalash N. Bacterial laccases. World J Microbiol Biotechnol, 2007, vol. 23, p. 823-832.

326. Sharma H.S.S., Whiteside L., Kernaghan K. Enzymatic treatment of flax fibre at the roving stage for production of wet-spun yarn. Enzyme Microb Technol, 2005, vol. 37, p. 386-394.

327. Shiba T., Xiao L., Miyakoshi T., Chen C.-L. Oxidation of isoeugenol and coniferyl alcohol catalyzed by laccase isolated from Rhus vernicifera Stokes and Pycnoporus coccineus. J Mol Catal B: Enzym, 2000, vol. 10, p. 605-615.

328. Shin H., Gübitz G., Cavaco-Paulo A. In situ enzymatically prepared polymers for wool coloration. Macromol Mater Eng, 2001, vol. 286, p. 691-694.

329. Shleev S., Persson P., Shumakovich G., Mazhugo Y., Yaropolov A., Ruzgas T., Gorton L. Laccase-based biosensors for monitoring lignin. Enzyme Microbiol Technol, 2006, vol. 39, p. 835-840.

330. Shleev S., Tkac J., Christenson A., Ruzgas T., Yaropolov A. I., Whittaker J. W., Gorton L. Direct electron transfer between copper-containing proteins and electrodes. Biosens Bioelectron, 2005, vol. 20, p. 2517-2554.

331. Shumakovich G.P., Shleev S.V., Morozova O.V., Khohlov P.S., Gazaryan I.G., Yaropolov A.I. Electrochemistry and kinetics of fungal laccase mediators. — Bioelectrochemistry, 2006, vol. 69, p. 16-24.

332. Shuttleworth K.L., Postie L., Bollag J.-M. Production of induced laccase by the fungus Rhizoctoniapraticola. Can J Microbiol, 1986, vol. 32, p. 867-870.

333. Si J.Q. Use of laccases in baking. 1994. PCT Int. Appl. WO 9428728 Al.

334. Slomczynski D., Nakas J.P., Tanenbaum S.W. Production and characterization of laccase from Botrytis cinerea 61-34. Appl Environ Microbiol, 1995, vol. 61, p. 907-912.

335. Smirnov S.A., Koroleva O.V., Gavrilova V.P., Belova A.B., Klyachko N.L. Laccases from basidiomycetes: physicochemical characteristics and substrate specificity towards methoxyphenolic compounds. Biochemistry (Mosc), 2001, vol. 66, p. 774-779.

336. Soden D.M. and Dobson A.D.W. Differential regulation of laccase gene expression in Pleurotus sajor-caju. Microbiol, 2001, vol. 147, p. 1755-1763.

337. Soden D.M. and Dobson A.D.W. The use of amplified flanking region-PCR in the isolation of laccase promoter sequences from the edible fungus Pleurotus sajor-caju. — J Appl Microbiol, 2003, vol. 95, p. 553-562.

338. Soden D.M., O'Callaghan J., Dobson A.D.W. Molecular cloning of a laccase isozyme gene from Pleurotus sajor-caju and expression in the heterologous Pichia pastoris host. -Microbiol, 2002, vol. 148, p. 4003-4014.

339. Sojka-Ledakowicz J., Lichawska-Olczyk J., Ledakowicz S., Michniewicz A. Bio-scouring of linen fabrics with laccase complex from Cerrena unicolor. — Fibres & Textiles in Eastern Europe, 2007, vol. 15, p. 86-89.

340. Solomon E.I., Augustine A.J., Yoon J. O2 Reduction to H2O by the multicopper oxidases. Dalton Trans, 2008, vol. 30, p. 3921-3932.

341. Solomon E.I., Sundaram U.M., Machonkin T.E. Multicopper oxidases and oxygenases. -Chem Rev, 1996, vol. 96, p. 2563-2606.

342. Sugumaran M., Giglio L., Kundzicz H., Saul S., Semensi V. Studies on the enzymes involved in puparial cuticle sclerotization in Drosophila melanogaster. — Arch Insect Biochem Physiol, 1992, vol. 19, p. 271-283.

343. Suzuki H., Iiyama K., Yoshida O., Yamamoto N., Toda S. Structural characterization of the immunoactive and antiviral water-soluble lignin in an extract of the culture medium of Lentinus edodes mycelia (LEM). Agric Biol Chem, 1990, vol.54, p. 479-487.

344. Suzuki T., Endo K., Ito M., Tsujibo H., Miyamoto K., Inamori Y. A thermostable laccase from Streptomyces lavendulae REN-7: purification, characterization, nucleotide sequence, and expression. — Biosci Biotechnol Biochem, 2003, vol. 67, p. 2167-2175.

345. Tadesse M.A., D'Annibale A., Galli C., Gentili P., Sergi F. An assessment of the relative contributions of redox and steric issues to laccase specificity towards putative substrates. -Org Biol Chem, 2008, vol.6, p. 868-878.

346. Tagger S., Perissol C., Gil G., Vogt G., Lepetit J. Phenoloxidases of the white-rot fungus Marasminus quercophilus isolated from an evergreen oak litter (Quercus ilex L.). -Enzyme Microb Technol, 1998, vol. 23, p. 372-379.

347. Takahara J. Enzymic manufacture of polyphenylene oxide (PPO). Patent JP2004313057 A2 2004.

348. Tekere M., Zvauya R., Read J. S. Ligninolytic enzyme production in selected sub-tropical white rot fungi under different culture conditions. J Basic Microbiol, 2001, vol. 41, p. 115-129.

349. Tetsch L., Bend J., Holker U. Molecular and enzymatic characterization of extra- and intracellular laccases from the acidophilic ascomycete Hortaea acidophila. Antonie van Leeuwenhoek, 2006, vol. 90, p. 183-194.

350. Thakker G.D., Evans C.S., Rao K.K. Purification and characterization of laccase from Monocillium indicum Saxena. Appl Microbiol Biotechnol, 1992, vol. 37, p. 321-323.186

351. Thurston C.F. The structure and function of fungal laccases. — Microbiol, 1994, vol.140, p. 19-26.

352. Timo H.J.N, and Michael L. Nuclear amination catalyzed by fungal laccases: Comparison of laccase catalyzed amination with known chemical routes to aminoquinones. — J Mol Catal B: Enzym, 2007, vol. 45, p. 113-117.

353. Torecilla J.S., Mena, M.L., P.Yanez-Sedeno, Garsia J. Quantification of phenolic compounds in olive oil mill wastewater by artificial neural network/laccase biosensor. — J Agric Food Chem, 2007, vol. 55, p. 7418-7426.

354. Trojanowski J., Kharazipour A., Mayer F., Hiittermann A. Utilization of potato pulp and potato liquor for the production of laccase by selected basidiomycetes. Starch, 1995, vol. 47, p. 116-118.

355. Tzanov T., Basto C., Gubitz G.M., Cavaco-Paulo A. Laccases to improve the whiteness in a conventional bleaching of cotton. Macromol Mater Eng, 2003a, vol. 288, p. 807-810.

356. Tzanov T., Silva C.J., Zille A., Oliveira J., Cavaco-Paulo A. Effect of some process parameters in enzymatic dyeing of wool. Appl Biochem Biotech, 2003b, vol. Ill, p. 114.

357. Ullah M.A., Bedford C.T., Evans C.S. Reactions of pentachlorophenol with laccase from Coriolus versicolor. Appl Microbiol Biotechnol, 2000, vol. 53, p. 230-234.

358. Ullrich R., Huong L.M., Dung N.L., Hofrichter M. Laccase from the medicinal mushroom Agaricus blazer, production, purification and characterization. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, vol. 67, p. 357-363.

359. Vasconcelos A.F.D., Barbosa A.M., Dekker R.F.H., Scarminio I.S., Rezende M.I. Optimization of laccase production by Botryosphaeria sp. in the presence of veratryl alcohol by the response-surface method. Process Biochem, 2000, vol. 35, p. 1131-1138.

360. Wariishi H., Nonaka D., Nishihashi S., Hirahashi T., Ito K. Enzymic preparation of polyphenylne oxides. Patent JP2006280259 A2 2006.

361. Wesenberg D., Kyriakides I., and Agathos S.N. White-rot fungi and their enzymes for the treatment of industrial dye effluents. Biotechnol Adv, 2003, vol. 22, p. 161-187.

362. Williamson P.R. Laccase and melanin in the pathogenesis of Crypiococcus neoformans. -Front Biosci, 1997, vol. 199, p. 99-107.

363. Witayakran S. and Ragauskas A.J. One-pot synthesis of 1,4-naphthoquinones and related structures with laccase. Green Chem, 2007, vol. 9, p. 475 480.

364. Witayakran S., Zettili A., Ragauskasa A.J. Laccase-generated quinones in naphthoquinone synthesis via Diels-Alder reaction. Tetrahedron Lett, 2007, vol. 48, p. 2983-2987.

365. Wood D. A. Inactivation of extracellular laccase during fruiting of Agaricus bisporus. J Gen Microbiol, 1980, vol. 117, p. 339-345.

366. Woolery G.L., Powers L., Peisach J., Spiro T.G. X-ray absorption study of Rhus laccase: evidence for a copper-copper interaction, which disappears on type 2 copper removal. -Biochemistry, 1984, vol. 23, p. 3428-3434.

367. Xiao Y.Z., Hong Y.Z., Li J.F., Hang J., Tong P.G., Fang W., Zhou C.Z. Cloning of novel laccase isozyme genes from Trametes sp. AH28-2 and analyses of their differential expression. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, vol. 71, p. 493-501.

368. Xu F. Effects of redox potential and hydroxyl inhibithion on the pH activity profile on fungal laccases. J Biol Chem, 1997, vol. 272, p. 924-928.

369. Xu F. Dioxygen reactivity of laccase: dependence on laccase source, pH, and anion inhibition. Appl Biochem Biotechnol, 2001, vol. 95, p. 125-133.

370. Xu F. Oxidation of phenols, anilines, and benzenethiols by fungal laccases: correlation between activity and redox potentials as well as halide inhibition. — Biochemistry, 1996, vol. 35, p. 7608-7614.

371. Xu F., Berka R.M., Wahleithner J.A., Nelson B.A., Shuster J.R., Brown S.H., Palmer A.E., Solomon E.I. Site-directed mutations in fungal laccase: effect on redox potential, activity and pH profile. Biochem J, 1998, vol. 334, p. 63-70.

372. Xu F., Deussen H.J., Lopez B., Lam L., Li K. Enzymatic and electrochemical oxidation of N-hydroxy compounds. Redox potential, electrontransfer kinetics, and radical stability. -Eur J Biochem, 2001, vol. 268, p. 4169-4176.

373. Xu F., Kulys J.J., Duke K., Li K., Krikstopaitis K., Deussen H.J., Abbate E., Galinyte V., Schneider P. Redox chemistry in laccase-catalyzed oxidation of N-hydroxy compounds. -Appl Environ Microbiol, 2000, vol. 66, p. 2052-2056.

374. Xu F., Palmer A.E., Yaver D.S., Berka R.M., Gambetta G.A., Brown S.H., Solomon E.I. Targeted mutations in a Trametes villosa laccase. Axial perturbations of the T1 copper. J Biol Chem, 1999, vol. 274, p. 12372-12375.

375. Yaropolov A.I., Kharybin A.N., Emneus J., Marko-Varga G., Gorton L. Flow-injection analysis of phenols at a graphite electrode modified with co-immobilised laccase and tyrosinase. Anal Chim Acta, 1995, vol. 308, p. 137-144.

376. Yaropolov A.I., Skorobogat'ko O.V., Vartanov S.S., Varfolomeyev S.D. Laccase: Properties, catalytic mechanism, and applicability. Appl Biochem Biotechnol, 1994, vol. 49, p. 257-280.

377. Yoon M.Y. Process for improved shrink resistance in wool. 1998. WO patent 98/27264.

378. Yoshida H. Chemistry of Lacquer (Urushi), part 1. J Chem Soc, 1883, vol. 43, p. 472486.

379. Yoshitake A., Katayama Y., Nakamura M., Iimura Y., Kawai S., Morohoshi N. N-Linked carbohydrate chains protect laccase-III from proteolysis in Coriolus versicolor. — J Gen Microbiol, 1993, vol. 139, p. 179-185.

380. Zavarzina A.G., Leontievsky A.A., Golovleva L.A., Trofimov S.Y. Biotransformation of soil humic acids by blue laccase of Partus tigrinus 8/18: an in vitro study. Soil Biol Biochem, 2004, vol. 36 - p. 359-369.

381. Zavarzina A.G. Mineral support and biotic catalyst are essential in the formation of highly polymeric soil humic substances. Eur Soil Sci, 2006, vol.39, p. 48-53.

382. Zhukhlistova N.E., Zhukova Yu.N., Lyashenko A.V., Zaitsev V.N., Mikhailov A.M. Three-dimensional organization of tree-domain copper oxidases: A review. Crystallogr Reports, 2008,vol. 53, p. 92-109.

383. Zille A. Laccase reactions for textile applications. PhD Thesis. Universidade do Minho, Portugal, 2005.

384. Zouari N., Romette J.L., Thomas D. Purification and properties of 2 laccase isoenzymes produced by Botrytis cinerea. Appl Biochem Biotechnol, 1987, vol. 15, p. 213-225.

385. Международный патент. 2003. № WO 2003023142.

386. Международный патент. 2003. WO 03106966.

387. Патент США. 2006. №7,018,735.

388. Патент Японии. 2001.№JP2001037465.

389. Патент Японии.2003. JP2003128835.

390. Патент Японии.2004. JP2004339438.1. БЛАГОДАРНОСТИ

391. Автор приносит благодарность своему руководителю д.б.н. Алексею Аркадьевичу Леонтьевскому за предоставление темы диссертационной работы, благожелательное отношение, внимание, консультации и плодотворное обсуждение этапов работы.

392. Особую благодарность автор выражает любимому мужу Лисову Александру за любовь, заботу, терпение, моральную поддержку и вдохновение, участие и помощь в планировании экспериментальной работы, обсуждение результатов и ценные советы.

393. Особую благодарность автор выражает всем сотрудникам лаборатории микробной энзимологии за создание благоприятной эмоциональной атмосферы для выполнения работы, доброжелательное отношение, дружеское участие, поддержку и внимание.

394. Теплые слова благодарности автор выражает своим родителям, бабушке и сестре за понимание, поддержку, заботу и помощь.

395. Р1еигоШь сотисоргае ВКМ Р 1979

396. НеигоШ.ч ох/геМиэ ВКМ р 3468шпойегта 1ис1йит К\\-1125

397. Сапойсгта арр1апа1иэ ВКМ Р 3208

398. Agaricus ЬЬрогш ВКМ Р-15891. Тгате1ея эр.1. Ротеа/отеМагшэ ВКМ Р 32031. ПРйЛОЖЕ! 1ПЕ

Информация о работе

Лисова, Зоя Александровна
кандидата биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Характеристика изоформ лакказы гриба Cerrena unicolor - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы