Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие некоторых грибных ферментов биодеградации лигноцеллюлозных субстратов

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Участие некоторых грибных ферментов биодеградации лигноцеллюлозных субстратов"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

РГБ ОД

ДЗЕДЗЮЛЯ ЕКАТЕРИНА ИГОРЕВНА '' ! ^

УЧАСТИЕ НЕКОТОРЫХ ГРИБНЫХ ФЕРМЕНТОВ В БИОДЕГРАДАЦИИ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ СУБСТРАТОВ.

03.00.24 - микология 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2000

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета и на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Гарибова Л. В., доктор химических наук, профессор Синицын А. П.

Консультант:

кандидат химических наук Беккер Е. Г.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Краснопольская Л. М. доктор биологических наук, профессор Никитин Д. И.

Ведущая организация:

Институт Биохимии и Физиологии Микроорганизмов РАН, Пущино

Защита состоится « 3 » марта 2000 года в 1530 ч. на заседании Диссертационного Советг Д 053.05.65 по биологическим наукам при Московском государственном университете им, М.В.Ломоносова по адресу: 119899 Москва, Воробьёвы горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Автореферат разослан 28 января 2000 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук

Лекомцева С. Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Природная деструкция растительных остатков грибами осуществляется, благодаря комплексу их внеклеточных ферментов. При этом особенности строения растительного субстрата определяют состав и свойства ферментного комплекса гриба-деструктора. Так, субстраты с высоким содержанием фенил-пропанового полимера лигнина (например, древесина) эффективно разрушаются окислительными ферментами базидиальных ксилотрофных грибов. В частности, избирательной способностью разрушать лигнин обладают грибы белой гнили. В основном, это представители порядка Aphyllophorales s.l. -Bjerkandera adusta (Willd: Fr.) Karst., Daedaleopsis confragosa Alb. et Schiw., Cerrena unicolor (Bull: Fr.) Murriell., и порядка Agaricales s. I. - Pleurotus ostreatus (Jocq: Fr.) Kumm. и др. Их ферментный комплекс обычно включает лигнинпероксидазу (ЛП), лакказу и Mn-пероксидазу (NOT). Взаимосвязь биохимических путей превращения лигнина и целлюлозы происходит через систему Н^Ог-продуцирующих ферментов. Присутствие Н2О2 обеспечивает работу пероксидаз. Кроме того, многие авторы полагают, что Н202 является источником активированных форм кислорода - неферментных окислителей лигнина (супероксид-анион, гидроксильные радикалы). Однако, несмотря на значительный прогресс в исследовании процессов биоконверсии лигнина до сих пор не ясно, что именно инициирует реакции окисления лигнина, какова роль каждого из ферментов, как осуществляется взаимосвязыферментных и неферментных факторов биоконверсии. Решение этих вопросов возможно при культивировании грибов белой гнили на лигнинсодержащем субстрате (например, на лигносульфонатах). При этом важно определять ферментативную активность грибов, а также изменения, происходящие с субстратом под действием грибов. Наконец, необходимо исследование свойств гомогенных ферментов, которые принимают участие в биоконверсии лигнина.

- Относительно недавно было установлено, что многие сапротрофные дейтеромицеты, особенно представители родов Aspergillus, Penicillium, Trichoderma и др., образуют ферменты - ферулоилэстеразы, - которые способны гидролизовать сложноэфирные связи между остатками феруловой кислоты, присоединенной к полисахариду (например, к ксилану) и лигнином. Таким образом, с помощью феруоилэстеразы возможно отделение лигнина от гемицеллюлоз и целлюлоз.

Исследование значения и свойств ферулоилэстераз актуально, в первую очередь, в связи с широкими возможностями применения эстеразных ферментных препаратов в биотехнологических процессах пищевой, кормовой, целлюлозно-бумажной и других областей промышленности.

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось выяснение роли лигнолитических ферментов и активированных форм кислорода в биоконверсии лигнина, а также исследование процессов разрушения лигноуглеводного комплекса ферулоилэстеразами. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Определить динамику лигнолитической активности грибов белой гнили В. adusta, С. unicolor, D. confragosa var. rubescens, Р. ostreatus и характер их действия на лигносульфонаты в процессе роста грибов.

2. Исследовать возможное участие активированных форм кислорода в биоконверсии лигносульфонатов под действием В. adusta.

3. Изучить свойства гомогенной МП, выделенной из культуральной жидкости (КЖ) В. adusta.

4. Исследовать действие гомогенной ферулоилэстеразы, выделенной из КЖ A. heteromorhus на растительные субстраты.

Научная новизна. В процессе роста на среде с лигносульфонатами исследована ферментативная активность D. confragosa, С. unicolor, Р. ostreatus и В. adusta. Установлено, что лакказа D. confragosa и С. unicolor, а также МП и лакказа Р. ostreatus и В. adusta участвуют скорее в процессах полимеризации, а не деструкции лигносульфонатов. Впервые проведен анализ молекулярно-массовых изменений лигносульфонатов под действием грибных культур. Показано, что Р. ostreatus и В. adusta активно деструктируют лигносульфонаты, а в КЖ D. confragosa, С. unicolor преобладают процессы полимеризации. Установлено, что для первоначального окисления лигносульфонатов в КЖ В. adusta необходимо присутствие гидроксильных радикалов, образующихся из Н2О2.

Из КЖ В. adusta выделена гомогенная МП, не обладающая ЛП активностью в отличие от большинства известных МП, и способная, в зависимости от присутствия Мп2+ в реакционной среде, проявлять различные свойства при окислении ряда органических субстратов.

В условиях твердофазной ферментации (ТФФ) A. heteromorphus на пшеничных отрубях получен ферментный препарат, из которого выделены гомогенные ферулоилэстераза и ксиланаза. Установлено сйнергетическое взаимодействие между ферулоилэстеразой и ксиланазой A. heteromorphus при гидролизе пшеничных отрубей (по выходу феруловой кислоты). Практическая значимость работы. Показана возможность использования грибов белой гнили, особенно Р. ostreatus к В. adusta,- для утилизации отходов переработки древесины (лигносульфонатов). Способность МП В. adusta окислять субстраты фенольной и нефенольной природы делают этот фермент и продуцент перспективными для детоксикации стоков целлюлозно-бумажной промышленности. Показано, что применение эстеразных ферментных препаратов позволяет увеличить эффективность гидролиза ксиланазами травянистых субстратов богатых гемицеллюлозами.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях: Internationa] Workshop on Peroxidase Biotechnology Application (St. Petersburg, Russia, 1997); International Conference on Biotechnology in Pulp and Paper Industry (Vancouver, Canada, 1998); International Conference Biocatalysis-98: Fundamental & Applications (Puschino, Russia, 1998); Международная Конференция Современные проблемы микологии и фитопатологии (Москва, Россия, 1998). Публикации. По результатам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура н объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), экспериментальной части (4 главы), включающей описание материалов и методов исследования, результатов и их обсуждение, выводов и списка цитируемой литературы: Работа изложена на 117 страницах, содержит 34 рисунка и 9 таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материал исследования. В работе исследовали. 4 штамма (4 вида) грибов белой гнили - В. adusta, P. ostreatus, D. c'onfragosa var. rubescens и С. unicolor. Культивирование проводили на среде с лигноеульфонатами. Молекулярно-массовое распределение лигносульфонатов. Образцы КЖ грибов белой гнили лиофильно высушивали и получали молекулярно-массовое распределение (ММР) лигносульфонатов КЖ методом гель-проникающей хроматографии (ГПХ) [Русаков А. Е. и др., 1982]. Молекулярно-массовые изменения продуктов гидролиза пшеничных отрубей, свекловичного жома и пшеничной соломы под действием ферулоилэстеразы A. heteromorphus регистрировали методом ГПХ. Изучение лигнолитической активности грибов белой гнили и субстратной специфичности МП В. adusta проводили спектрофотометрически, определяя скорость образования продуктов окисления следующих субстратов: MnS04, 2-метоксифенол (гваякол), феноловый красный, пирокатехин (специфический субстрат лакказы), о-фенилёндиамин и 2,2-азино-бис(3-этил-6-бензотиазолин сульфонат)аммония (АБТС), которые обычно используют для определения пероксидазной активности, субстраты ЛП и ААО - вератровый спирт, модельные соединения лигнина (конифериловый и о-ванилиновый спирты, 3,5-дитрет-бутил-4-гидроксианизол (ДТБА)). Все реакции проводили в 0,05М Na-лактатном буфере, рН 4,5 в присутствии и отсутствии Мп2+ и Н202. Активность ферулоилэстеразы определяли по выходу феруловой кислоты при гидролизе метилового эфира феруловой кислоты и 5-о-транс-ферулоил-а-Ь-арабинофуранозида (ферулоиларабинозида) а также природных полимерных субстратов - пшеничных отрубей, свекловичного

жома и пшеничной соломы. Количества образовавшейся феруловой кислоты определяли методом обращенно-фазовой хроматографии на колонке 0,4 х 25 см с носителем Spherisorb RBI8. В качестве элюента использовали смесь вода:бутанол ¡уксусная кислота в соотношении 93,8:6,0:0,2. В качестве стандарта для калибровки колонки использовали 1мМ раствор феруловой кислоты.

Деацетилирующую активность ферулоилэстеразы определяли спектрофотометрически по скорости образования «-нитрофенола при гидролизе я-нитрофенил- (n-НФ) ацетата. Активность по отношению к а-нафтил ацетату определяли качественно, окрашивая гель после ИЭФ. Активность ксиланазы A. heteromorphus определяли по отношению к глюкуроноксилану березы и карбоксиметилцеллюлозе (КМЦ) при 50°С и рН 5,0, метилумбеллиферил (МУФ) -ксилозиду, МУФ-целлобиозиду, п-НФ-а-Ь-арабинофуранозиду и и-НФ-а-Ь-арабинопиранозиду.

2. ОБЩИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ БИОКОНВЕРСИИ ЛИГНОСУЛЬФОНАТОВ ГРИБАМИ БЕЛОЙ ГНИЛИ.

2.1. Ферменты, продуцируемые грибами белой гнили.

Ежедневно, начиная со 2 суток роста, в КЖ грибов белой гнили измеряли активности МП, ЛП, лакказы и арилалкогольоксидазы (ААО).

D. confragosa и С. unicolor, начиная с 6 суток, продуцировали только лакказу. В. adusta и Р. ostreatus - лакказу и МП. ААО и ЛП активности в КЖ исследованных штаммов отсутствовали. На рис. 1 представлена

ц s

50,2

^ / §о,1-У

со А

<0,0

/4

а Л

ы

А—2

6 8 10 12 1416182022 Время роста, сут

Рис. 1. Динамика образования лакказы в процессе роста грибов белой гнили на среде с лигносульфонатами: 1 -D. confragosa; 2-й. adusta-, 3-Р. ostreatus; 4-С. unicolor.

динамика образования лакказы в КЖ исследованных грибов белой гнили. Как видно из рисунка, D. confragosa и В. adusta проявили относительно невысокий уровень активности лакказы (0,05-0,07 ед/мл). Максимум лакказной активности в КЖ D. confragosa и В. adusta отмечали на 12-14 сутки роста.

В КЖ С. unicolor и Р. ostreatus лакказная активность была несколько выше (0,1-0,2 ед/мл) и появлялась, начиная с 6 суток роста. Максимальную

б

активность лакказы (0,2-0,24 ед/мл) в КЖ С. unicolor и Р. ostreatus наблюдали на 18-22 сутки роста.

Активность МП была обнаружена в КЖ В. adusta и Р. ostreatus, начиная с 6 суток роста (рис. 2). В КЖ Р. ostreatus в период с 6 по 14 сутки уровень активности МП почти не менялся и составлял 0,3-0,4 ед/мл. Наибольшую МП активность (0,5 ед/мл) Р. ostreatus наблюдали на 15 сутки роста. В КЖ В. adusta МП активность появлялась несколько раньше - на 5 сутки роста. Максимальная активность МП (2 ед/мл) в КЖ В. adusta была отмечена на 15 сутки роста.

Рис. 2. Динамика образования Мп-пероксидазы грибами белой гнили на среде с лигносульфонатами: 1 -Р. ostreatus, 2 - В. adusta.

2 4 6 8 1012 14 16 1820 Время роста, сут

Таким образом, исследованные культуры можно разделить на две условные группы: ,;!), confragósa и С. unicolor, которые продуцировали только лакказу, и Р. ostreatus и В. adusta, образовывавшие МП и лакказу. Для всех культур образования ААО и ЛП не наблюдали.

2.2. Трансформация лигносульфонатов в процессе роста грибов белой гнили.

Благодаря наличию сульфогрупп, лигносульфонаты растворимы в воде и, следовательно, ММР этого полимера можно анализировать методом ГПХ. Как видно из рисунков 3-6, исходное ММР лигносульфонатов в составе питательной среды для роста грибов белой гнили, представляет собой два пика. Основной (высокомолекулярный) пик отражает степень полимеризации лигносульфонатов, точка его максимума соответствует средней степени полимеризации. Таким образом, для исходной среды средняя степень полимеризации лигносульфонатов находится в области 3500Да. Второй (небольшой) пик - лежит в низкомолекулярной области ММР, его наличие обусловлено присутствием в питательной среде вератрола (М\у 138Да).

При сопоставлении ММР в процессе роста исследованных грибов можно выделить две основные фазы.

Первая - длится до момента достижения максимума деструкции лигносульфонатов. Наличие процессов деструкции устанавливают по

увеличению высоты второго (низкомолекулярного) пика на ММР, т.е. по накоплению низкомолекулярных продуктов окисления лигносульфонатов. При этом время достижения максимальной высоты низкомолекулярного пика на ММР соответствует максимуму их деструкции.

Вторая фаза роста наблюдается после достижения максимума деструкции лигносульфонатов и характеризуется, преимущественно, процессами их реполимеризации - на ММР происходит уменьшение высоты низкомолекулярного пика. Одновременно с этим может наблюдаться сдвиг основного пика лигносульфонатов в высокомолекулярную область, т. е. увеличение средней степени полимеризации лигносульфонатов.

Исследованные грибы белой гнили проявляли некоторые различия в стратегии окисления лигносульфонатов. В связи с этим их также можно разделить на две группы:

Грибы первой группы - С. unicolor и D. confragosa (рис. 3,4), которые продуцировали только лакказу, - в первую фазу роста разрушали лигносульфонаты мало интенсивно, на ММР происходило лишь небольшое увеличение высоты низкомолекулярного пика. Интересной

Рис. 3. ММР лигносульфонатов КЖ в процессе роста С. unicolor: 1-исходная среда, 2-6 сут., 313 сут., 4-26 сут.

Стандарты: a-полистирол (Mw 35000Да), b-полистирол (Mw 3500Да), с-вератрол (Mw 138Да). ММР были получены методом ГПХ на колонке 7,5 х 600 мм с носителем Separon Р1000. Элюент: ДМФА, содержащий 0,03М LiBr и 0,03М Н3РО4. Детекция продуктов при 280 нм.

Рис. 4. ММР лигносульфонатов КЖ в процессе роста О. соп/^озсг. 1-исходная среда, 2-8 сут. 3-12 сут. Стандарты: а-полистирол (М\у 35000Да), Ь-полистирол (М\у 3500Да), с-вератрол (Ми/ 138Да). Условия ГПХ как на рис. 3.

особенностью грибов этой группы было то, что процессы деструкции лигносульфонатов сопровождались увеличением средней степени полимеризации субстрата до 7000Да. А в КЖ D. confragosa (см. рис. 4, кривая 2) на ММР появлялись высокомолекулярные фракции в области ЗООООДа (в КЖ С. unicolor такие высокомолекулярные фракции образовывались только на 13 сутки роста, после достижения максимума деструкции, см. рис. 3).

Таким образом, в первую фазу роста С. unicolor и D. confragosa одновременно протекало два процесса - слабая деструкция и интенсивная полимеризация лигносульфонатов. Вторая фаза роста грибов из первой группы (С. unicolor и D. confragosa) характеризовалась реполимеризацией низкомолекулярных продуктов окисления лигносульфонатов (на ММР происходило уменьшение низкомолекулярного пика), при этом продолжалось увеличение степени полимеризации лигносульфонатов. В КЖ D. confragosa наблюдался дальнейший сдвиг основного пика на ММР в высокомолекулярную область до ЮОООДа (рис. 4, кривая 3), в КЖ С. unicolor происходило появление высокомолекулярных фракций в области ЗООООДа (см. рис. 3, кривые 3,4).

Под действием грибов второй группы - В. adusta и P. ostreatus, которые продуцировали МП и лакказу, - в первую фазу роста происходило интенсивное накопление низкомолекулярных продуктов деструкции лигносульфонатов (см. рис. 5, 6). В отличие от С. unicolor и D. confragosa, этот процесс не сопровождался увеличением средней степени полимеризации лигносульфонатов. Максимум деструкции для В. adusta отмечали на 5 сутки роста (рис. 5, кривая 2), для Р. ostreatus -на 7 сутки (рис. 6, кривая 3).

Вторая фаза роста В. adusta и Р. ostreatus характеризовалась процессами реполимеризации (рис. 5, кривые 3-5, рис. 6, кривая 4). Однако, как видно из полученных ММР, в КЖ В. adusta процесс реполимеризации происходил одновременно с увеличением средней степени полимеризации лигносульфонатов до ЮОООДа на 13-20 сутки роста. На ММР это выражалось в сдвиге основного пика лигносульфонатов в высокомолекулярную область ММР (рис. 5, кривые 4, 5). В КЖ Р. ostreatus такого изменения не наблюдалось (см. рис. 6).

Известно, что биоконверсия лигнина происходит двумя путями [Озолиня Н. и др., 1988, Медведева С. и др., 1991]. С одной стороны - это окисление С-С связей боковых цепей лигнина, которое может проявляться на ММР субстрата как сдвиг основного пика лигносульфонатов в низкомолекулярную область. При этом возможно образование новых небольших пиков, соответствующих низкомолекулярным продуктам деструкции (рис. 5, кривые 2, 3, рис. б, кривые 2-3). С другой стороны, происходит разрыв С-С связей ароматических колец, что выражается в уменьшении оптического поглощения на 280 нм и, следовательно,

Рис. 5. ММР лигносульфонатов КЖ в процессе роста В. adusta: 1-исходная среда, 2-5 суг., 3-7 сут., 4-13 суг., 5-20 сут.

Стандарты: a-полистирол (Mw 35000Да), b-полистирол (Mw 3500Да), с-вератрол (Mw 138Да). Условия I IIX как на рис. 3.

Время выхода, мин

Рис. 6. ММР лигносульфонатов КЖ в процессе роста Р. о.^геашх: 1-исходная среда, 2-5 сут., 3-7 сут., 4-20 суг. Стандарты: а-полистирол ( 35000Да), Ь-полистирол (М\у 3500Да), с-вератрол (Mw 138Да).

Условия ГПХ как на рис. 3.

уменьшению высоты основного пика лигнина на ММР. Однако при этом сильного изменения молекулярной массы полимера может не наблюдаться (см. рис. 5, кривая 2, рис. 6, кривые 2-3). Под действием грибов второй группы - Р. ostreatus и В. adusta, вероятно, реализуются оба процесса, что приводит к значительному уменьшению высоты основного пика лигносульфонатов и увеличению низкомолекулярного пика продуктов деструкции в первую фазу роста.

Интересной структурной особенностью лигнина является то, что некоторые фенольные группы боковых цепей остаются свободными, благодаря этому сохраняется способность лигнина к дальнейшей конденсации при дополнительном окислении. Этот процесс выражается в увеличении средней степени полимеризации лигносульфонатов. Вероятно, подобные процессы происходили, в основном, под действием грибов первой группы - D. confragosa и С. unicolor (см. рис. 3, кривая 2, рис. 4, кривая 2).

Таким образом, грибы первой группы (D. confragosa и С. unicolor) в значительной степени полимер изовали лигносульфонаты. Процессы деструкции лигносульфонатов в первую фазу роста этих грибов были незначительны и сопровождались увеличением средней степени полимеризации до 7000Да. В случае D. confragosa, одновременно с деструкцией лигносульфонатов происходило образование высокомолекулярных (в области ЗООООДа) фракций. Вторая фаза роста характеризовалась реполимеризацией низкомолекулярных продуктов

окисления и сопровождалась дальнейшим увеличением средней степени полимеризации лигносульфонатов до ЮОООДа. В случае С. unicolor образование высокомолекулярных фракций на ММР (в области ЗООООДа) происходило одновременно с процессом реполимеризации.

В. adusta и Р. ostreatus в первую фазу роста вызывали значительное накопление продуктов окисления- лигносульфонатов, на ММР при этом наблюдалось существенное уменьшение высоты основного пика лигносульфонатов, образование новых низкомолекулярных пиков и значительное увеличение их высоты. Во вторую фазу роста в КЖ В. adusta реполимеризация продуктов деструкции лигносульфонатов на ММР сопровождалась увеличением их средней степени полимеризации до ЮОООДа. В случае Р. ostreatus таких изменений не происходило.

2.3. Сопоставление данных ГПХ с ферментативной активностью грибов белой гнили.

До 5-6 суток роста во всех культурах не наблюдали лигнолитической активности, в то же время на ММР происходило первое появление низкомолекулярных продуктов деструкции субстрата, т.е. начальная деструкция лигносульфонатов происходила независимо от участия лигнолитических ферментов. Появление лакказной активности в КЖ С. unicolor и D. confragosa наблюдали, начиная с 6 суток роста, а увеличение уровня активности лакказы в КЖ этих грибов происходило во вторую фазу роста и совпадало с процессами реполимеризации. В литературе отмечалась способность лакказ к конденсации фенолов за счет рекомбинации радикалов, образуемых при лакказном окислении [Озолиня Н. Р. и др., 1987]. С другой стороны, существует точка зрения, допускающая участие лакказы в деметоксилировании лйгнина - ключевого этапа биодеструкции [Ander Р. et al, 1978]. Вероятно, лакказа, образуемая С. unicolor и D. confragosa, параллельно осуществляет оба процесса, однако образование низкомолекулярных фрагментов лигносульфонатов (деструкция) происходит менее интенсивно, чем процессы их KOHfleHcáuHH. и реполимеризации. Таким образом, лакказа С. unicolor и D. confrágosa принимает участие, скорее в процессах полимеризации, а не деструкции лигносульфонатов.

В КЖ Р. ostreatus и В. adusta появление лакказы и МП также происходило после появления первых продуктов деструкции лигносульфонатов на ММР. В КЖ Р. ostreatus значительное увеличение активности лакказы происходило во вторую фазу роста, параллельно с процессами реполимеризации. Однако средняя степень полимеризации лигносульфонатов в КЖ Р. ostreatus не менялась (уровень МП активности при этом был в 4 раза ниже уровня МП в культуре, В. adusta). Как видно на рис. 5, во вторую фазу роста В. adusta процесс реполимеризации продуктов окисления лигносульфонатов сопровождался увеличением средней

п

степени полимеризации субстрата. Эти изменения совпадали с увеличением уровня активности МП, что предполагает непосредственное участие МП В. adusta в процессах реполимеризации лигносульфонатов.

Таким образом, ферменты (лакказа для С. unicolor и D. confragosa и МП и лакказа для В. adusta и Р. ostreatus) участвуют скорее в реакциях полимеризации, а не деструкции лигносульфонатов.

2.4. Роль H2Oj и супсроксид-аниона в процессах биоконверсии лигносульфонатов культурой В. adusta.

В первые сутки роста в КЖ В. adusta не было обнаружено лигнолитической активности. В тоже время на ММР КЖ наблюдали первичное ' образование низкомолекулярных продуктов деструкции лигносульфонатов. В связи с этим, нами было сделано предположение о том, что первичная деструкция лигносульфонатов происходит за счет неферментных эффекторов, например, за счет присутствия в КЖ активных форм кислорода - супероксид-аниона и Н2О2.

Защиту организма от разрушительного воздействия активных форм кислорода осуществляет система внутриклеточных ферментов, основные из которых каталаза и супероксиддисмутаза (СОД). В присутствии катал азы происходит разложение Н2О2 по реакции 1. В присутствии СОД инактивируется супероксид-анион по реакции 2:

2Нг02 -> 2Н20 + 02 (1)

О2" + 2Н* Н202 + 02. (2)

.Таким образом, добавляя эти ферменты в КЖ В. adusta можно удалить свободные радикалы и Н202, и, следовательно, повлиять на процессы окисления лигнина. На 3 сутки роста, т.е. до момента образования лигнолитических ферментов, в КЖ В. adusta добавляли по 500 ед. каталазы

4 6 8 101214161820 . Время роста, сут

Рис. 7. Динамика образования Мп-пероксидазы в процессе роста В. adusta на среде с лигносульфонатами:

1-в присутствии инактивированной каталазы или СОД (для двух ферментов . результаты совпадают),

2-в присутствии каталазы (500 ед),

3-в присутствии СОД (500 ед).

или СОД. В качестве контролей использовали культуры с добавлением термически инактивированных ферментов в тех же концентрациях.

Добавление ферментов в целом не влияло на состав образующихся впоследствии лигнолитических ферментов. Изменений в динамике

образования лакказы обнаружить не удалось. Как видно из рис. 7, присутствие инактивированных ферментов также не влияло на активность МП (для двух контрольных культур результаты совпадали). Однако в присутствии каталазы уровень МП активности увеличивался в 4 раза, по сравнению с контролем, а при добавлении СОД - в 1,5 раза. В связи с этим можно предположить, что присутствие Н2Ог в КЖ Б. adusta, ингибирует МП активность. Этот эффект отмечался и в литературе [Timofeevski S. et al, 1998]. В присутствии каталазы в КЖ происходит разложение перекиси (см. реакцию 1), что, вероятно, обеспечивает увеличение активности МП.

При анализе изменения ММР лигносульфонатов было установлено, что высота пика, соответствующего низкомолекулярным продуктам окисления лигносульфонатов (около 140Да) не зависит от наличия или отсутствия каталазы или СОД, т. е. не происходит изменения количества продуктов окисления. Однако, как видно из рисунка 8, достижение

Рис. 8. Изменение высоты низкомолекулярного пика на ММР лигносульфонатов КЖ в процессе роста В. adusta'. 1 -в присутствии инактивированной каталазы или СОД (для двух ферментов результаты совпадают),

2-в присутствии каталазы (500 ед),

3-в присутствии СОД (500 ед).

максимума деструкции лигносульфонатов для культуры с добавлением каталазы наблюдали раньше (на 4 сутки роста), чем для контроля и культуры с СОД (максимум деструкции наблюдался на 5 сутки). Таким образом, присутствие Н2О2 также влияет на деструкцию лигносульфонатов под действием В. adusta: каталаза удаляет из^КЖ Н202, активизируя процессы деструкции. Поскольку добавление СОД не оказывало существенного влияния- та ферментативные активности и процессы деструкции лигносульфонатов, можно предположить, что супероксид-анион не играет решающей роли в этих процессах.

Необходимо- отметить, что появление первых продуктов деструкции лигносульфонатов связано с появлением МП в КЖ В. adusta. Низкомолекулярные продукты окисления лигнина в КЖ могут йгра'ть роль индукторов синтеза ферментов [Rogalski J. et al, 1991]. Поэтому накопление определенного количества продуктов' ' деструкции лигносульфонатов в КЖ, возможно, приводит к индукции МП. При добавлении каталазы в среде наблюдалось более интенсивное накопление

Время роста, сут

продуктов деструкции лигносульфонатов и поэтому, максимум активности МП, наблюдался раньше чем в контрольной культуре.

Таким образом, было установлено, что присутствие Н2О2 замедляло процессы деструкции лигносульфонатов в первую фазу роста В. adusta. Добавление каталазы в КЖ В. adusta вызывает разложение Н2О2, при этом процесс образования низкомолекулярных продуктов деструкции лигносульфонатов ускоряется. Одновременно с этим происходит увеличение уровня активности МП. Супероксид-анион, вероятно, не принимает участие в биодеструкции лигнина in vivo.

3. ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА Мп-ПЕРОКСИДАЗЫ В. adusta.

Одной из задач нашего исследования было выделение и характеристика гомогенной МП В. adusta в .сравнении с известными. из литературы МП других грибов.

Была разработана двухстадийная схема выделения МП из КЖ В. adusta: первая стадия - ионообменная хроматография (ИОХ) на колонке 1,6 х 10 см с носителем DEAE-Toyopearl 650М. Стартовый буфер: 0,05М Na-ацетатный, рН 4,5, связавшиеся с носителем белки элюировали в линейном градиенте от 0 до 100% 1М NaCl в стартовом буфере. Вторая стадия очистки - хроматофокусирование (ХФ) на колонке Mono Р HR 5/20. Стартовый буфер: 0,04М гистидин, содержащий 0,01М NaCl, рН 4,2. Связавшиеся белки элюировали 5% раствором полибуфера 74 в воде, рН 3,2. Таким образом, на колонке был создан градиент рН от 4,2 до 3,2. В ходе очистки активность фермента определяли по скорости окисления MnS04- Результаты очистки МП представлены в табл. 1. Удельная активность фермента после второй стадии очистки составляла 35 ед на 1мг гомогенного белка. По данным ДДС-ПААГ электрофореза и ИЭФ молекулярная масса МП В. adusta была равна 43 кДа, изоэлектрическая точка (р!) - 3,5.

Таблица 1. Результаты очистки Mn-пероксидазы В. adusta.

Общая активность, ед** Содержание белка, мг Удельная активность, ед/мг** Выход, % Степень очистки

Исходный препарат* 180 350 0,5 100 . . 1 .

ИОХ на DEAE Toyopearl 65 100 0,65 36 ' 1,3

ХФ на МопоР 7 0,2 35 3,9 70

*КЖ В. adusta, обессоленная в 0,05М Na-ацетатном буфере, рН 4,5. **Активность по отношению к M11SO4.

Для гомогенного фермента был определен рН оптимум реакции окисления Мп804: при температуре 20°С он составлял 4,5. Время

полуинактивации МП В. adusta при 20°С составляло 5 часов, при 40°С - 3 часа. После хранения фермента при температуре 5°С он терял 50% активности через 28 дней.

Гомогенная МП В. adusta не проявляла активности по отношению к ЛП субстратам фенольной (ДТБА, о-ванилиновый, конифериловый спирты) и нефенольной (вератровый спирт) природы. Окисление других субстратов было возможно только в присутствии Н202, что подтвердило пероксидазную природу фермента. Данные о субстратной специфичности МП В. adusta представлены в табл. 2.

Добавление MnSOí в реакционную смесь по-разному влияло на активность МП В. adusta при окислении разных субстратов. В отсутствии Мп2+ в реакционной смеси, т.е. независимо от образования комплекса Мп3+-лактат, происходило окисление АБТС, о-фенилендиамина и фенолового красного. При этом активность фермента по АБТС и о-фенилендиамину при добавлении MnS04 в реакционную смесь возрастала. В случае окисления фенолового красного при добавлении Mn2f наблюдали ингибирование пероксидазной активности. Пирокатехин и гваякол без Мп2+ МП из В. adusta, не окислялись, окисление происходило только при добавлении в реакционную смесь MnSOí (см. табл. 2).

Таблица 2. Субстратная специфичность Mn-пероксидазы В. adusta.

Субстраты Удельная активность, ед/мг

Без Мп^т

MnS04 — 35,0

АБТС 12,0 23,5

о-Фенилендиамин 2 12,0

Пирокатехин 0 15,3 .

Гваякол 0 47

Феноловый красный 1,2 0

♦Содержание MnS04 в реакционной смеси 0,74мМ, в реакции с феноловым красным 0,ЗмМ.

Из литературы известно, что МП Phanerochaete chrysosporium обладала способностью окислять ароматические субстраты только через образование комплекса с Мп3+ в присутствии Мп2+. В связи с этим фермент назвали Мп-зависимьш. [Glenn J. et al, 1983, Paszczynski A. et al., 1986]. Предложенная для МП Ph. chrysosporium схема каталитического цикла, предусматривала образование комплекса Мп3+-лактат прй- окислении ароматического субстрата. Однако многие МП из других источников проявляли Мп-независимую активность к фенольным и нефенольным субстратам, способность окислять вератровый спирт, и даже независимо от присутствия марганца [Heinfling A. et al, 1998, Nyman P. et al, 1990].

В отличие от известных ранее МП, нами была выделена гомогенная МП В. adusta, которая окисляла MnS04, но не обладала ЛП активностью. Фермент проявлял Mn-независимые свойства по отношению к АБТС, о-

фенилендиамину и феноловому красному, но был Mn-зависимым по отношению к пирокатехину и гваяколу. Активность МП В. adusta по АБТС и о-фенилендиамину возрастала в присутствии MnSCV, а по отношению к феноловому красному - ингибировалась. Т.е. выделенный фермент сочетал все особенности Mn + "зависимостей", известные к настоящему времени для Мп-пероксидаз.

В связи С этим роль МП В. adusta в биоконверсии лигносульфонатов может быть связана со способностью окислять субстраты при . разных концентрациях Мп2г в среде: в зависимости от содержания Mn + фермент способен катализировать реакции окисления с участием различных субстратов.

4. РОЛЬ ФЕРУЛОИЛЭСТЕРАЗЫ В ДЕСТРУКЦИИ ЛИГНОУГЛЕВОДНЫХ СУБСТРАТОВ.

4.1. Выделение и свойства ферулоилэстеразы A. heteromorphus.

Совместно с ИБФМ РАН (г. Пущино) нами был проведен скрининг препаратов КЖ несовершенных грибов (.Aspergillus, Penicillum, Trichoderma), направленный на получение ферментных препаратов, обладающих высокой ферулоилэстеразной активностью (эту активность измеряли по образованию феруловой кислоты из её метилового эфира).

Таблица- 3. " Ферулоилэстеразная активность ферментных препаратов КЖ несовершенных грибов. . .___

Препарат - Удельная активность, ед/г Препарат Удельная активность, ед/г

Aspergillus japonicus A. heteromorphus

#349.1 2 #35.7 13

#349.2 11 #35.7 (ТФФ), 10 сут. 25

#349.3 10 #35.7 (ТФФ), 12 сут. 28

#349.3.1 10 #35.7 (ТФФ), 14 сут. 28

A. foetidus #35.10 5

#7.8 10 #35.13 10

A. awamori #35.14 0,7

#97.1 1 #35.15 6

#97.2 2 #35.15.1 3

Penicillium canescens #35.18.1 10

R201 379.2.1 3 #35.19.1 4 -,

P.verruculosum ИЗ 5 Trichoderma reesei 0

Как видно из табл. 3, наибольшая активность ферулоилэстеразы была характерна для А. НегеготогрИт 35.7 (13 ед/г). Причем в условиях твердофазной ферментации (ТФФ) на пшеничных отрубях уже на 10 сутки роста наблюдалось увеличение уровня активности. Препарат А.

heteromorphus 35.7, полученный на 12 сутки роста в условиях ТФФ выбран для выделения ферулоилэстеразы.

В качестве первой стадии очистки была выбрана ИОХ на колонке 1,6 х 10см, с носителем DEAE-Spheron 1000. Стартовый буфер: 0,05М Na-ацетатный, рН 5,0. Связавшиеся с носителем белки элюировали в линейном градиенте от 0 до 100% 1М NaCl. Обладавшие ферулоилэстеразной активностью фракции после ИОХ объединили и использовали для второй стадии очистки - гидрофобной хроматографии (ГХ) на Phenyl Superóse HR 5/5. Стартовый буфер: 0,1М аммоний-ацетатный, рН 5,0, содержащий 1,7М (NHO2SO4. Связавшиеся с носителем белки элюировали снижая концентрацию (NH4)2S04 до нуля. В процессе очистки активность ферулоилэстеразы определяли по отношению к метиловому эфиру феруловой кислоты. Результаты очистки представлены в табл. 4.

Таблица 4. Результаты очистки ферулоилэстеразы Л. heteromorphus.

Стадии очистки Общая активность, ед* * Содержание белка, мг Удельная активность, ед/мг** Выход, % Степень очистки

Исходный препарат* . 1,25 20 0,063 100 1

ИОХ на DEAE-Spheron 0,43 4 0,1 34 1,6

ГХ на Phenyl Superóse 0,16 0,13 1,23 Í3 " 19,5

*КЖ/4. heteromorphus, обессоленная в 0,05М Na-ацетатном буфере, рН 5,0.

** Активность к метиловому эфиру феруловой кислоты.

По данным ДДС-ПААГ электрофореза и ИЭФ молекулярная масса ферулоилэстеразы А. ¡1е1еготогрИт была равна 42 кДа, р13,7.

3.2. Субстратная специфичность и свойства ферулоилэстеразы А. ¡Меготогркш.

Результаты исследования субстратной специфичности ферулоилэстеразы А. Ие1еготогркиз представлены в табл. 5. Удельная активность гомогенного фермента по отношению к ферулоиларабинозиду была существенно выше (26 ед/мг), чем к метиловому эфиру феруловой кислоты (1,2 ед/мг). Вероятно, это происходит потому, что ферулоиларабинозид является структурным аналогом природного субстрата ферулоилэстеразы. Выделенный фермент не проявлял активности к метиловому эфиру я-кумаровой кислоты, катализировал деацетилирование и-НФ-ацетата и а-нафтил ацетата (см. табл. 5), что является отличительным свойством ацетилэстераз. Однако активность ферулоилэстеразы к и-НФ-ацетату (0,03 ед/мг) была на несколько порядков ниже, чем к метиловому эфиру феруловой кислоты и

ферулоиларабинозиду. Таким образом, выделенный фермент был определен как ферулоилэстераза.

Метиловый эфир феруловой кислоты, ед/мг Ферулоила рабинозид, ед/мг Пшеничные отруби* Свеклович ный жом* Пшенич ная солома л-НФ-ацетат, ед/мг а-нафтил ацетат"

1>2 ... 26 : , 5'8 0,2 0 0,03 +

Активности ферулоилэстеразы в реакции гидролиза пшеничных отрубей и свекловичного жома выражали в мк^олях образовавшейся феруловой кислоты за 60 мин реакции." ' '

Активность эстеразы по а-нафтил ацетату была оценена качественно по окрашиванию ИЭФ-геля.

Из литературы известны ферулоил- и кумароилэстеразы, которые проявляют ацетилэстеразную активность, отщепляя ацетильный остаток от низкомолекулярных (и-НФ-ацетат) или полимерных субстратов ;:(ацетилированный ксилан). Например, ферулоилэстераза А. оматоп интенсивно гидролизовала как метиловый эфир феруловой кислоты, так и я-НФ- ацетат [МсСгае Б. е1 а1., 1994]. Ферулоилэстераза А. niger [ТаиИв С. еГа1., 1993] также имела широкую субстратную специфичность, проявляя активность к метиловым эфирам коричной, кофейной, феруловой и кумаровой кислот и к и-НФ-ацетату. В то же время, ацетилэстеразы не способны отщеплять ароматические кислоты (феруловую, л-кумаровую и коричную) от соответствующих эфиров.

рН-зависимость активности гомогенного фермента имела максимум в области 4-6, при использовании в качестве субстратов как метилового эфира феруловой . кислоты, так и ферулоиларабинозида. Оптимальные значения рН активности ферулоилэстераз из других источников варьируют от 5,5 до 7. . „

Максимальная активность ферулоилэстеразы А. Ие1еготогркш к метиловому,., .эфиру феруловой кислоты наблюдалась при 40°, а температурный- оптимум активности, измеренной по ферудоидарабйнозиду, составил 50-60°. Гомогенный фермент был достаточно стабилен - при 50° и рН 5,0 период полуинактивации составлял 20 ч (активность измерялась по отношению к ферулоиларабинозиду). При 70° и рН 5,0 фермент полностью инактивировался в течение 30 мин.

3.3. Действие ферулоилэстеразы на природные лигнинсодержащие субстраты.

Действие гомогенной ферулоилэстеразы и КЖ А. Ь^еготогрИж на пшеничные отруби, свекловичный жом и пшеничную солому изучали с помощью'гидролиза этих субстратов в течение 5 часов при рН 5,0 и 50°С. Эффективность гидролиза оценивали, регистрируя в качестве продукта

выход феруловой кислоты из этих субстратов. При этом ферулоилэстеразную активность КЖ и гомогенного фермента уравнивали по активности к метиловому эфиру феруловой кислоты. Количество образовавшейся в результате гидролиза феруловой кислоты выражали в %, относительно общего её содержания в субстрате.

Общее содержание феруловой кислоты в природных субстратах определяли, осуществляя полный щелочной гидролиз в течение 24 часов, согласно методике [БаиМз С., 1995]. В пшеничных отрубях содержалось 0,3% феруловой кислоты, в свекловичном жоме - 0,5%, в пшеничной соломе - 0,2%, т.е. общее содержание феруловой кислоты в исследованных природных субстратах существенно не отличалось.

На рисунке 9 представлены результаты гидролиза пшеничных отрубей, свекловичного жома и пшеничной соломы гомогенной ферулоилэстеразой и КЖ А. ИеГеготогрИт. Как видно из рисунка, исследованные субстраты проявили различную реакционную способность (по выходу феруловой кислоты). Наибольшая реакционная способность была отмечена для пшеничных отрубей - как под действием гомогенного

Рис. 9. Образование феруловой кислоты при гидролизе природных субстратов КЖ и гомогенными ферментами комплекса А. ¡ге1еготогрИи5 в течение 5 часов при рН 5,0 и 50°С: ■

1-КЖ, 2-гомогенная ферулоилэстераза, 3-гомогенные ферулоилэстераза и ксиланаза в соотношении 25:75%. Количества образовавшейся феруловой И Пшеничные Пшеничная Свеклович- кислоты выражали в %, относительно её

общего содержания в субстрате.

отруби солома ньш жом

Высокая реакционная способность отрубей, по-видимому, объясняется тем, что остатки феруловой кислоты в их структуре наиболее доступны для действия ферулоилэстеразы (в составе отрубей остатки феруловой кислоты преимущественно связывают между собой молекулы ксилана). Низкая реакционная способность пшеничной соломы (см. рис. 9) связана с относительно высоким содержанием в её структуре лигнина, который затрудняет доступ ферулоилэстеразы к ферулоильным остаткам. В составе свекловичного жома феруловая кислота, наряду с другими ароматическими кислотами, связана с полигалактуроновыми и пектиновыми структурами.

фермента, так и КЖ А. 11е1еготогрИш.

Необходимо отметить, что под действием КЖ А. Не1еготогркш из пшеничных1 - отрубей происходило образование гораздо большего количества феруловой кислоты, чем под действием гомогенной ферулоилэстеразы. Это, вероятно, свидетельствует о наличии синергетических взаимодействий ферментов КЖ А. ЬегеготогрИж (вероятнее всего ксиланаз) и ферулоилэстеразы.

Изменения ММР продуктов гидролиза исследованных природных субстратов регистрировали, анализируя методом ГПХ фракции, полученные после окончания гидролиза и растворимые в элюенте (ДМФА, содержащий О.ОЗМ ЫВг 0,03М Н3РО4). В качестве контроля использовали фракции, полученные в тех же условиях, но без добавления фермента!

В случае гидролиза пшеничной соломы не наблюдали изменения ММР растворимых в ДМФА продуктов, как под действием гомогенной ферулоилэстеразы, так и под действием КЖ А. Ье1еготогрИи8. Эти данные коррелируют с тем, что в процессе гидролиза пшеничной соломы КЖ А. /1е1еготогркш и гомогенной ферулоилэстеразой выход феруловой кислоты из этого субстрата был незначительным (см. рис. 9).

При гидролизе пшеничных отрубей гомогенной ферулоилэстеразой заметных изменений ММР растворимых в ДМФА продуктов гидролиза зафиксировать не удалось (рис. 10). При действии КЖ А. ИегеготогрЫз на

Рис. 10. ММР продуктов гидролиза пшеничных отрубей: \у 3 1-контроль (реакционная смесь без

1 2 sil И фермента), 2-гидролиз под действием

' У/ и гомогенной ферулоилэстеразы, 3-

/ / \\ гидролиз под действием КЖ А.

/ / \\ heteromorphus.

J J у4"^ Стандарты: a-полистирол (Mw ЗбООДа),

' —— b-феруловая кислота (Mw 194Да), с-

0 jq 20 30 вератрол (Mw 138Да). Условия ГПХ как

Время выхода, мин на рис. 3.

пшеничные отруби происходило накопление продуктов деструкции в области 194Да (феруловая кислота).

В результате гидролиза свекловичного жома гомогенной ферулоилэстеразой (рис. И) были отмечены значительные изменения ММР. В частности, происходило накопление низкомолекулярных продуктов гидролиза в области ММР, соответствующей массе феруловой кислоты - 194Да, - и ниже - 130Да. При действии КЖ A. heteromorphus образовывалось больше продуктов деструкции с массой 194Да, чем при действии гомогенной ферулоилэстеразы.

Таким образом, наибольшая реакционная способность была характерна для пшеничных отрубей, причем в качестве основного продукта гидролиза образовывалась феруловая кислота (см. рис 9, 10). Под

I феруловой кислоты был 8 раз

Рис. 11. ММР продуктов гидролиза свекловичного жома: ¡-контроль (реакционная смесь без фермента),

2-гидролиз под действием гомогенной ферулоилэстеразы,

3-гидролиз под действием КЖЛ. heíeromorphus.

Стандарты: a-полистирол (Mw ЗбООДа), b-феруловая кислота (Mw ' 194Да), с-вератрол (Mw 13 8Да). Условия ГПХ как на рис.3.

^енной ферулоилэстеразы, что предполагает наличие синергизма ферулоилэстеразы с другими ферментами КЖ (скорее всего с ксиланазами).

3.4. Выделение и свойства ксиланазы Л. heíeromorphus.

Для проверки гипотезы о синергетическом взаимодействии компонентов ферментного комплекса A. heíeromorphus (а именно ферулоилэстеразы и ксиланазы) нами была разработана схема выделения ксиланазы A. hetromorphus. В качестве исходной использовали фракцию, полученную в ходе очистки ферулоилэстеразы и содержащую белки, не связавшиеся с носителем DEAE Spheron в стартовых условиях, и обладавшую наибольшей ксиланазной активностью (42 ед/мг общего белка). Очистку ксиланазы проводили методом ГХ на Phenyl Superóse HR 5/5. Стартовый буфер: 0,1М аммоний-ацетатный, рН 5,0, содержащий 1,7М (KH4)2S04. Связавшиеся с носителем белки элюировали, снижая концентрацию (NH4)2S04 до нуля.

После проведения ГХ была получена гомогенная по данным ДЦС-ПААГ электрофореза и ИЭФ ксиланаза с молекулярной массой 53 кДа и pi 4,6. Удельная активность гомогенного фермента была равна 134 ед/мг белка (см. табл.6).

При изучении субстратной специфичности ксиланазы было установлено, что фермент проявлял специфическую способность к деструкции (3-1,4-связей полимерного ксилана - обладал высокой удельной ксиланазной активностью по отношению к глюкуроноксилану и не гидролизовал КМЦ и n-НФ-производные арабинозы (см. табл. 6).

действием КЖ A. heíeromorphus выход

А280 а| bf я 0,2-

0,1 0,0,

0 10 15 20 25 30 Врем

зремя выхода, мин больше, чем при действии гомог

Таблица 6. Субстратная специфичность гомогенной ксиланазы

A. heteromorphus(рН 5,0, 50°С).

, Субстраты Удельная активность, ед/мг

Глюкуроноксилан березы .-. . 134

МУФ-целлобиозид 0,13

МУФ-ксилозид 0,023

я-НФ-а-Ь-арабинофуранозид 0

я-НФ-а-Ь-арабннопиранозид 0

КМЦ - • ..-•:■ 0

Низкая (0,023 ед/мг) активность по МУФ-ксилозиду и МУФ-целлобиозиду показывает лишь незначительную способность фермента действовать на концевые (3-1,4-гликозидные связи (свойства, характерные для экзодеполимераз). Таким образом, ксиланаза A. heteromorphus была определена как ксиланаза ,эндо- действия. Наличие активности к МУФ-целлобиозиду (0,13 ед/мл) показывает свойственную некоторым ксиланазам целобиогидролазную активность.

Для гомогенной эндоксиланазы A. heteromorphus температурный оптимум гидролиза глюкуроноксилана березы при рН 5,0 составил 50°С. рН-оптимум при 50°С составил 5,0.

3.5 Синергетическое действие ксиланазы и ферулоилэстеразы A. heteromorphus при гидролизе пшеничных отрубей.

Наличие синергетического взаимодействия между гомогенными ферулоилэстеразой и ксиланазой ферментного комплекса A. heteromorphus изучали, детектируя выход- феруловой кислоты в результате гидролиза : пшеничных отрубей. Гидролиз проводили в течение 5 часов в условиях рН и температурных оптимумов ферулоилэстеразы и ксиланазы (рН 5,0, 50°С). Исходные растворы индивидуальных ферментов равные по содержанию белка (0,075 мг/мл), смешивали в общем объеме 0,120 мл в следующих пропорциях ферулоилэстераза: ксиланаза (%) 0:100; 25:75; 30:70; 50:50; 75:25; 100:0. Количества образовавшейся феруловой кислоты выражали в процентах от общего её содержания в субстрате (относительные %). Таким образом, была получена экспериментальная кривая гидролиза (см. рис.12, кривая 1).

Для получения теоретической кривой гидролиза (рис. 12, кривая 2) на пшеничные отруби действовали отдельно каждым из индивидуальных гомогенных ферментов, в концентрациях, которые были использованы при их совместном действии. Полученные при действии каждого из ферментов результаты, (выход образовавшейся феруловой кислоты за 5 часов гидролиза) суммировали, таким образом получили теоретическую кривую гидролиза. Коэффициент синергизма, представляет собой отношение экспериментальных величин к теоретическим (рис. 12, кривая 3). Наибольший коэффициент синергизма (16,3) наблюдали при соотношении

ферулоилэстераза: ксиланаза 25:75 (%), при этом образуется 18,2%

Содержание ферулоилэстеразы

2.—о

^ • ■ • ■ - * - • • ■

О 20 40 60 80 100

в смеси с ксиланазой,%

Рис. 12. Синергитическое действие ферулоилэстеразы и ксиланазы ферментного комплекса А. ке/еготогрИм при гидролизе пшеничных отрубей в течение 5 часов при рН 5,0, и 50°С: [-экспериментальная кривая гидролиза, 2-теоретическая кривая, 3-коэффициент синергизма (соотношение экспериментальных величин к теоретическим).

феруловой кислоты относительно общего содержания в субстрате, что почти соответствует количеству феруловой кислоты, образовавшейся под действием КЖ - 20 отн. % (см рис. 9). Таким образом, по выходу феруловой кислоты из пшеничных отрубей установлено наличие значительного синергизма между ферулоилэстеразой и ксиланазой комплекса/! кегеготогрИт.

1. Грибы белой гнили D. confragosa и С. unicolor на среде с лигносульфонатами продуцируют только лакказу; Р. ostreatus и В. adusta - продуцируют Mn-пероксидазу и лакказу.

2. На первой фазе роста D. confragosa и С. unicolor происходит незначительная деструкция лигносульфонатов и, одновременно, увеличение их средней степени полимеризации. В культуре D. confragosa одновременно с деструкцией лигносульфонатов происходит образование высокомолекулярных продуктов окисления в области ЗООООДа. Вторая фаза роста этих грибов характеризуется реполимеризацией продуктов окисления лигносульфонатов и сопровождается дальнейшим увеличением средней степени полимеризации (до ЮОООДа). В культуре С. unicolor образование высокомолекулярных продуктов окисления в области ЗООООДа происходит одновременно с процессом реполимеризации.

3. Р. ostreatus и В. adusta на первой фазе роста значительно разрушают лигносульфонаты. Во вторую фазу роста В. adusta реполимеризация продуктов деструкции лигносульфонатов сопровождается увеличением их средней степени полимеризации.

ВЫВОДЫ:

4. ' Образование лигнолитических ферментов - лакказы в культурах С. unicilor и D. confragosa, Mn-пероксидазы и лакказы в культурах Р. ostreatus и В. adusta - происходит после начала образования низкомолекулярных продуктов деструкции лигносульфонатов. Максимальный уровень ферментативной активности наблюдается во второй фазе роста грибов. Это предполагает участие лакказы и Mn-пероксидазы в реакциях реполимеризации, но не деструкции лигносульфонатов.

5.' Установлено, что присутствие перекиси водорода в культуральной жидкости В. adusta ингибирует процессы деструкции лигносульфонатов. Добавление каталазы в культуральную жидкость вызывает разложение перекиси, и процесс образования продуктов деструкции лигносульфонатов ускоряется, причем одновременно в культуральной жидкости В. adusta происходит увеличение уровня Мп-пероксидазной активности. Супероксид-анион не принимает активного участия в биодеградации лигнина in vivo.

6. Из культуральной жидкости В. adusta выделена гомогенная Mn-пероксидаза с молекулярной массой 43 кДа и pl 3,5. Фермент не обладал лигнинпероксидазной активностью, в отличие от известных Mn-пероксидаз, и сочетал Mn-независимые и Mn-зависимые свойства при окислении ряда ароматических субстратов. При окислении фенолового красного в присутствии MnS04 наблюдали ингибирование активности.

7. Выявлен продуцент ферулоилэстеразы и ксиланазы - А. heteromorphus 35.7. Из культуральной жидкости A. heteromorphus выделена гомогенная ферулоилэстераза с молекулярной массой 42 кДа и pl 3,7.

8. Из культуральной жидкости A. heteromorphus выделена гомогенная ксиланаза эндо- действия. Молекулярная масса фермента 53 кДа, pl 4,6.

9. На примере гидролиза пшеничных отрубей установлено синергитическое взаимодействие ферулоилэстеразы и ксиланазы комплекса A. heteromorphus (по выходу феруловой кислоты). Максимальный коэффициент синергизма составил 16,4.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ.

1. Becker Н. G., Dzedzyulya Е., Fadeev A., Reshetnikova I. А. Depolymerization of lignosulfbnates by white-rot fungus Bjerkandera adusta: studies on the ligninoolytic system. Abstracts of the Sixth International Conference on Biotechnology in the Pulp and Paper Industry, Vienna, Austria, P-Fl, 1995.

2. Becker H. G., Fedeev A. A., Dzedzyulya E.I., Reshetnikova I. A., Sinitsyn A. P. Lignin and manganese peroxidases of the white-rot fungus Bjerkandera adusta: the role in lignin biotransformation. Abstracts of the International Workshop Peroxidase Biotechnology Application, Puschino, Russia, 1995.

3. Dzedzyulya E. I., Becker E. G. Mn-peroxidase from the white-rot fungus Bjerkandera adusta\ the action on lignosulfonates. Abstracts for the International Workshop on Peroxidase Biotechnology Application, St. Petersburg, Russia, 1997.

4. Dzedzyulya E. I., Becker E. G. Characterization of some white-rot fungi toward ligninolytic activities produced and lignosulfonate effect. Abstracts of International Conference on Biotechnology in Pulp and Paper Industry, Vancouver, Canada, 1998.

5. Dzedzyulya E. I., Becker E. G., Okunev 0. N., Sinitsyn A. P. Purification and properties of the feruloyl esterase from Aspergillus heteromorphus. Abstracts of International Conference Biocatalysis-98: Fundamental & Applications, Puschino, Russia, 1998.

6. Дзедзюля E. И., Беккер E. Г., Решетникова И. А. Полимеризация лигносульфонатов Mn-пероксидазой гриба Bjerkandera adusta, Биохимия, 6\, 1697-1703, 1996.

7. Дзедзюля Е. И., Беккер Е. Г., Окунев О. Н., Синицын А. П. Ферулоилэстераза из Aspergillus sp.: выделение, свойства и действие на природные субстраты, 1999, Биохимия, 64, 483-489.

8. Дзедзюля Е. И., Беккер Е.Г. Лигнолитическая активность некоторых грибов белой гнили, их действие на лигносульфонаты. Современные проблемы микологии и фитопатологии (сборник трудов Международной Конференции посвященной 80-летию кафедры микологии и альгологии МГУ им. М. В. Ломоносова и 90-летию со дня рождения М. В. Горленко), Москва, Россия, 188-189,1998.

9. Дзедзюля Е. И., Беккер Е.Г. Mn-пероксидаза Bjerkandera adusta Биохимия, 2000 (в печати).