Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новая технология культивирования высших базидиомицетов в искусственно замкнутой экосистеме

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Новая технология культивирования высших базидиомицетов в искусственно замкнутой экосистеме"

На правах рукописи

Калашников Андрей Анатольевич

НОВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ высших БАЗИДИОМИЦЕТОВ В ИСКУССТВЕННО ЗАМКНУТОЙ ЭКОСИСТЕМЕ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0 3 ОЕЗ 29п

Саратов - 2011

4843650

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный

университет им. Н.И. Вавилова»

Ведущая организация:-..'' ФГОУ ВПО «Кубанский государственный

аграрный университет»

Защита состоится «17» февраля 2011 г. в 12— часов - на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал. -

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат диссертации разослан «22» января 2011 г. и размещен на сайте университета www.sgau.ru.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова», ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Миронов Александр Давидович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник, Дыкман Лев Абрамович

доктор биологических наук, профессор, Бушов Александр Владимирович

доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Современное развитие грибоводства в России выявило потребность создания новых интенсивных технологий, удовлетворяющих современным требованиям: сокращение сроков обрастания субстрата и выгонки плодовых тел, устойчивость к конкурентной микрофлоре, высокая продуктивность и товарные качества мицелия и плодовых тел.

Несмотря на возрастающие объемы культивирования вешенки, промышленное производство в значительной степени сдерживается из-за отсутствия продуктивных отечественных сортов и штаммов (Таксономический анализ..., 2002). На сегодняшний день в государственном реестре селекционных достижений РФ зарегистрированы четыре сорта, относящиеся к вешенке устричной, и один сорт вешенки флоридской. Общеизвестно, что непрерывное культивирование какого-либо сорта гриба в течение длительного времени неизбежно приводит к потере урожайности в результате генетического «старения». Поэтому, получение новых гибридов вешенки, обладающих повышенной урожайностью по сравнению с родительскими производственными штаммами, является наиболее актуальной задачей в области селекции грибов. " '*"• -

Не менее важной задачей является защита субстрата для получения плодоййх тел от контаминации посторонней микрофлорой при помощи экологически' ' чистых биопрепаратов, не способных оказывать негативное влияние на окружающую среду и здоровье потребителя. Современные способы выращивания мицелия и плодовых тел высших грибов-базндиомицетов основаны на интенсивной стерильной технологии в искусственно замкнутой экосистеме - специальных контейнерах с использованием растительных субстратов, следуя которой возможно получение быстрого и обильного урожая. Однако, применение этой технологии связано со значительными материальными и энергетическими затратами, включающими наличие специализированных бактериологических лабораторий и помещений для подготовки субстрата и выращивания мицелия и плодовых тел грибов небольшими грибоводческимн фирмами.

В связи с этим, важной задачей современной грибной индустрии является создание новых технологий, позволяющих при незначительном повышении материальных затрат получить высокий урожай плодовых тел грибов. Выявлению различных факторов, влияющих на продуктивность плодовых тел, посвящен ряд работ (Eger, Wang, Anderson,

1972; Eger, 1974; Larraya, 2002).

Цель работы: разработка новой технологии культивирования мицелия и плодовых тел Pleurotus ostreatus, позволяющей с минимальными затратами в относительно простых условиях получать качественный мицелий и высокий урожай плодовых тел гриба

Задачи исследования:

1. Получить новые гибриды Р. ostreatus путем скрещивания производственного и полученного из природных объектов штаммов вешенки.

2. Оценить влияние различных стимуляторов на интенсивность роста мицелия изучаемых штаммов гриба на плотных и жидких питательных средах.

3. Провести сравнительный анализ урожайности вешенки на растительных субстратах, обработанных перекисью водорода.

4. Изучить влияние бактерий Bacillus subtilis 26D - основного действующего вещества промышленного биофунгицида «Фитоспорин-М» на характер взаимодействия Р. ostreatus и естественного контаминанта - плесневого гриба р. Trichoderma.

5. Оценить урожайность изучаемых штаммов на субстрате, обработанном препаратом «Фитоспорин-М».

6. Провести промышленные испытания разработанной технологии культивирования Р. ostreatus.

Научная новизна. Получен новый гибридный штамм Pleurotus ostreatus Т5, при скрещивании Р. ostreatus ВС (промышленный штамм) Р. ostreatus L (дикий штамм). Обоснована эффективность применения естественного стимулятора - экстракта дубовой коры для интенсификации роста мицелия при мелкотоварном и промышленном культивировании грибов рода Р. ostreatus - Вешенка.

Впервые изучено биотическое влияние промышленного биофунгицида «Фитоспорин-М», содержащего в качестве биологически активного агента клетки Bacillus subtilis 26Д, на жизнедеятельность Р. ostreatus в частично замкнутой экосистеме.

Практическая значимость работы. Разработанная технология культивирования плодовых тел Pleurotus ostreatus в перспективе может быть использована грибоводческими хозяйствами России, как в мелкотоварных, так и промышленных объемах. Данная технология используется для выращивания грибов вешенки в ОАО «Совхоз-Весна» (г. Саратов), что подтверждается актом о внедрении от 21.04.2009. Материалы диссертационной работы вошли в учебное пособие «Проблемы и перспективы биологического разнообразия» (в соавторстве с Мироновым А.Д., Бондаренко Г.В., Соболевой Л.В., Зиминым П.В., Калашниковым A.A., 2008) для

студентов, специализирующихся в области биоэкологии, рекомендованное и одобренное Учебно-методическим советом биотехнологического факультета СГАУ им. Н.И. Вавилова. Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций и написании дипломных работ в СГАУ им. Н.И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на зашиту:

1. Получено 125 потенциально гибридных дикарионов, из которых было отобрано 5 изолятов, отличающихся от других по способности образовывать наибольшее количество примордиев при 22-25 С

2. Экстракт дубовой коры стимулирует рост мицелия, что зафиксировано при выращивании клеток мицелия гибрида Р. ostreatus Т5 на шуггель-аппараге и лабораторном ферментере «Анкум-2М.

3. Штамм Bacillus subtilis 26Д, выделенный из препарата «Фитоспорин-М», с мицелиальной культурой Р. ostreaius Т5 и спорами чистой культуры Trichoderma spp. на среде MC ингибировал развитие микромицета Trichoderma spp.

4. Наиболее оптимальным субстратом для получения плодовых тел гибрида является солома; обработка материала перекисью водорода служит не только дополнительным средством для поддержания необходимой стерильности, но и повышает общую урожайность.

5. При культивировании штамма Р. ostreatus Т5 на субстрате, обработанном препаратом «Фитоспорин-М», происходит уменьшение времени появления прнмордий и общее увеличение урожайности в первую и вторую волны плодоношения.

Работа выполнена на кафедре экологии, биологии, физиологии и фармакологии ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. H.H. Вавилова» в рамках научно-исследовательской темы: «Изучение биологических свойств высших грибов-базидиомицетов».

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на:

- Всероссийской конференции «Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных. Современные технологии переработки сельскохозяйственной продукции», (Саратов, 2008);

- Всероссийской научно-практическая конференция. «Актуальные проблемы ветеринарной патологии сельскохозяйственных животных и птиц», (Саратов, 2008);

- Международной научно-практической конференции, посвященной 95-летию гоеагроуниверситета. «Вавиловскне чтения-2008», (Саратов, 2008).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 4 работы, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора

литературы, экспериментальной части, включающей в себя материалы и методы исследования, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, предложений производству, списка используемых литературных источников, включающего 116 источников, в том числе 68 зарубежных авторов и приложений. Работа изложена на 143 страницах и иллюстрирована 22 рисунками, 20 таблицами.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Объекты, материалы и методы исследований

В работе использованы два штамма Pleurotus ostreatus БС и P. ostreatus L, полученные из коллекции грибов Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук. Исследование проводили по следующей схеме (рис. 1).

Вегетативный мицелий данных штаммов культивировали на модифицированной среде Семерджиевой с добавлением экстракта дубовой коры.

Гибридизацию исходных штаммов проводили по методу Г. Фритше (1969), используя для этих целей моноспоровую селекцию.

Глубинное культивирование мицелия проводили в ферментере "Анкум-2М" в 6 л вышеуказанной жидкой среды, а также на шуттель-аппарате оригинальной конструкции.

Субстрат для посевного мицелия готовили из зерна пшеницы по традиционной методике (Бисько, 1983; 1987; Бухало, 1988; Методы приготовления..., 1982).

Для изучения оптимального состава субстрата для получения плодовых тел готовили следующие материалы: древесные опилки хвойных и лиственных пород деревьев, пшеничная солома.

Производственные испыталия проводили на базе грибоводческого хозяйства комплекса ОАО «Совхоз-Весна», расположенного в г. Саратов. В качестве контрольного штамма в производственных экспериментах использовали штамм Р. ostreatus НК-35 Duna, полученным из коллекции данного хозяйства.

Для создания дополнительной степени стерильности, при необходимости (рекомендуется для мелкотоварного производства), в субстрат при запаривании добавляли 6% перекись водорода (150 мл/л).

Фунгицидное воздействие препарата "Фитоспорин-М" изучали в процессе подготовки субстрата, культивирования и образования плодовых тел. Раствор препарата (1,5:1000) добавляли непосредственно в воду после запаривания субстрата и

достижения температуры воды от 38-42°С. Через 12 часов выдержки субстрата в воде с биофунгицидом, затем воду сливали, а субстрат использовали непосредственно для экспериментов.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы «STATISTICA 6.0» MS Office.

Систаэдатазацш* литературных данных и постановка задач кесдедеяагаш

---.———----|—--——........—.....-...........—-———- ! ▼

Отбор штаммов для гибридизации

а

Купьтивир ов ание мицелия родитель ских штаммов на модифицированной среде Семерджиевой

—---——------ш-—

Гибридизация штаммов по методу Фригше

—----——————'--—!——-————--. ——.

Изучение биологических свойств попученньк гибридкьгх дикарионов 1

^-----------------------------

Подбор субстрата и условий культивирования гибрида (обработка биофунгицидом «Фито спорик-М»)

--.-Ж.--

Проведение производственных исследований в грибоводчесхом хозяйстве ООО «Весна».

^____

Обр глотка попяченных результатов. Выводы. Поегпожение гюоизвояствт/.

Рис. 1. Схема проведения эксперимента

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Подбор совместимых монокарионов и отбор фертильных дикарионов вешенки обыкновенной В результате проведенных экспериментов по скрещиванию исходных штаммов

было получено 125 потенциально гибридных дикарионов, из которых было отобрано 5

изолятов, отличающихся от других по способности образовывать наибольшее

количество примордий при 22-25 С, обозначенные, соответственно, Т1- Т5 (табл. 1).

Таблица 1 - Динамика образования примордиев

Т, (сут) Штамм

ВС | Ь | Т5 | Т1 | Т2 | ТЗ | Т4

п,(шт)

7 0,0 1,2±0,2 4,3±0,2 3,0+0,5 3,2±0,2 2,7±0,2 3,7±0,2

14 2,3±0,1 4.1±0,2 6,7±0,2 5,0±0,3 5,7±0,3 4,2±0,2 5,0±0,3

16 3,5±0,2 5,3±0,6 9,2±0,2 7,5±0,2 8,0±0,3 7,5±0,2 6,0±0,4

18 4,0±0,3 8,0±0,7 12,5±0,2 9,2±0,5 9,7±0,6 8,7±0,3 9,0±0,3

23 5,3±0,2 9,5±0,5 20,7±0,2 12,0±0,5 13,5±0,2 !4,2±0,6 13,0±0,8

Всего 15,1±0,3 28Д±1,4 53,8±0,4 36,3±1,1 40,2±0,9 37,5±0,2 36,8±1,1

Предварительные эксперименты показали, что наиболее активным ростом мицелия на плотных питательных средах, а также более ранними сроками появления примордий обладает штамм Т5, что и позволило отобрать его для дальнейших исследований.

Полученный штамм способен так же, как и родительские, образовывать кластеры (сростки плодовых тел) от 2-4 до 20-30 шт. Шляпка 1-8 см в диаметре, в молодом возрасте выпуклая, светло-коричневая, затем - плоская, тарелкоподобная, более темная. Пластинки сероватые, ножка, как правило, центральная или слегка эксцентрическая, 4-

Культивирование штаммов Р. оШе&т на различных питательных средах В соответствии с поставленной целью по разработке технологии культивирования мицелия и плодовых тел Р. ояЬ-еаШ, были изучены показатели роста клеток штамма Р. о$1геа!из Т5 на плотных питательных средах.

В качестве субстратов были выбраны модифицированная среда Семерджиевой

МС и минеральная синтетическая среда, обычно применяемая для выращивания мицелия. Подбор питательной среды для проведения дальнейших экспериментов проводили при помощи сравнения коэффициентов роста мицелия на среде МС и минеральной сиитетической среде (табл. 2).

В последующих экспериментах изучено влияние состава питательной среды иа рост мицелия изучаемых штаммов.

Таблица 2 - Зависимость интенсивности роста мицелия изучаемых штаммов

от состава среды

¡2 а ? Ростовой коэффициент

источники углерода в минеральной среде среда МС

а мальтоза лактоза глюкоза

тз 21,00±0,50 42,00±0,30 80,00±0,07 90,00±0,06

Т4 27,00±0,16 40,00±0,40 72,00±0,10 92,00±0,08

Т5 32,00±0,05 43,00±0,08 75,00±0,04 87,00±0,04

БС 18,00±0,08 38,00±0,15 52,0Сьь0,08 70,00±0,50

Ь 22,00±0,05 43,00±0,16 57,00±0,30 64,00±0,08

Примечание. Ростовой коэффициент (Рк) - модифицированный ростовой коэффициент, который рассчитывали по формуле: Рк=Ш;>Л; где Б - диаметр колонии, в мм, g - плотность колонии, в баллах по 3-х балльной шкале, Ь - высота колонии, в мм, I - возраст колонии (сут).

Для исследования интенсивности роста мицелия в жидкой среде, оценивали степень влияния различных стимуляторов роста Были использованы следующие добавки: подсолнечное масло, углекислый кальций, агар-агар, дубовый экстракт.

Установлено, что мицелий Р. <ю1геаш наиболее интенсивно растет на средах с добавлением экстракта дубовой коры. Интенсификация роста происходит в результате стимулирования активности грибных фенолоксидаз, что подтверждается проведенными исследованиями при определении ростового коэффициента (Рк) (табл. 3).

Таблица 3 - Коэффициент зависимости роста мицелия (Рк) штаммов изучаемых грибов от

различных стимуляторов

Стимулятор роста Штамм

Т5 БС Ь ТЗ Т4

подсолнечное масло 14,00±0,07 7,0040,04 11,(Ь0,3 9,00±0,70 9,5040,06

дубовый экстракт 18,00±0,15 5,0040,30 13,0±0,1 6,90±0,030 14,00±0,40

СаСОз 10,00±0,16 6.001:0,10 9,0±0,7 8,00±0,20 9,0040,08

агар 9,00±0,30 8.0040,04 7,0^:0,3 5,00±0,06 7.00±0,06

бездобавок 11.2040,00 6,7040,70 7,4±0,5 8,10±0,04 10,00±0,05

При выращивании клеток мицелия наиболее перспективного гибрида Т5 на лабораторном ферментере «Анкум-2М» также установлено, что добавка экстракта дубовой коры и скорость перемешивания существенно влияют на динамику нарастання клеток мицелия (рис. 3).

Рис. 3. Динамика роста мицелия штамма Т5 на ферментере «Анкум-2М»

Примечание: а- с добавлением или отсутствием

ДЭ: 1 - с ДЭ, 250 об/мин; 2 - без ДЭ, 250 об/мин; 3 - с ДЭ, дробное перемешивание.

б — при разной скорости мешалки ферментера: 1 - 250 об/мин, 2 - 500 об/мин,

3 - без механического перемешивания (барботирование воздухом).

Зависимость роста мицелия от рН среды

Анализ полученных данных о росте мицелия в жидкой среде с аэрацией на

шуттель-аппарате и ферментере «Анкум-2» при различных показателях рН, позволил установить, что наиболее оптимальное значение рН для выхода биомассы равно 5,8 (рис.4).

Исследованный штамм P.ostreatus Т5 отличался по скорости обрастания субстрата мицелием и времени появления плодовых тел от родительских штаммов. Наиболее быстро плодовые тела появлялись у штамма Т5. Известно, что распределение урожайности между волнами плодоношения является индивидуальной характеристикой штамма (табл. 4).

Из таблицы 4 видно, что гибрид Т5 по сравнению с другими гибридами и родительскими штаммами БС и L наиболее быстро колонизирует субстрат, а также дает максимальный выход плодовых тел, т.е. характеризуется повышенной урожайностью.

2 3 4 5 6 7В

Рис. 4. Зависимость выхода биомассы от значения рН

Таблица 4 - Показатели урожайности исследуемых штаммов

Время после инокуляции (сут.) Общая Урожайность

Штамм до полного обрастания субстрата мицелием до первой волны плодоноше ния до второй волны плодоноше Н11Я урожайное ть г/100 г субстрата первая волна плодоношения, %/г вторая волна плодоношения, %/г

ТЗ 16,00±0,20 36,0±0,4 86,0±0,5 27,00±0,01 55,00±0,010/14,85 45,00±0,01/12,15

Т4 14,00±0,Ю 30,0±0,1 67,0±0,3 32,00±0,03 65,00±0,020/28,70 35,00±0,02/3,30

Т5 10,00±0,30 27,0±0,2 53,0±0,1 41,00±0,01 71,00±0,010/29,11 29,00±0,01/11,89

БС 28,00±0,10 39,0±0,5 92,0±0,3 25,00±0,03 60,00±0,012/15,00 40,00±0,02/10,00

Ь 25,00±0,20 37,0±0,1 89,0±0,4 26,00±0,02 61,00±0,020/15,86 39,00±0,01/10,14

Новый гибрид Т5 способен к образованию единичных и срощенных плодовых тел при выращивании на опилочном и соломенном субстратах. Всего было получено до 95 плодовых тел за 1,5 месяца инкубации (с одного контейнера). Из них на субстрате с соломой - 92 плодовых тела, общим весом 80 гр., с опилками - 95 плодовых тел, общим весом 91 гр. Эти данные позволяют констатировать, что гибрид Т5 значительно превышает активность плодообразования родительских штаммов, а также штаммов ТЗ и Т4. Для сравнения, штаммы ТЗ и Т4 образовывали не более 65 базидиом на обоих субстратах (за тоже время выращивания) общим весом 69-72 г.

Следовательно, полученный гибрид Т5 по своим показателям превосходит исходные штаммы, что позволяет также рекомендовать его для дальнейшего внедрения в промышленное культивирование.

Обнаружено, что образование плодовых тел товарного вида гибридом Т5 может

происходить при недостаточной аэрации, т.е., со сменой свежего воздуха менее, чем 8-10 объемов/г субстрата в час, тогда как известно, что превышение концентрации С02 в окружающей среде приводит к аномальному развитию плодовых тел (рис. 5).

Рис. 5. Морфология плодовых тел штаммов Р. ostreatus, выращенных в условиях

ограниченной аэрации

Проведен сравнительный анализ урожайности Р. ostreatus на субстратах, состоящих из пшеничной соломы и опилок смешанных пород деревьев, обработанных в процессе запаривания перекисью водорода. Результаты показали, что наиболее оптимальным субстратом для получения плодовых тел гибрида является солома, а обработка материала перекисью водорода служит не только дополнительным средством для поддержания необходимой стерильности, но и несколько повышает общую урожайность (табл. 5, 6).

Полученные данные можно объяснить тем, что перекись водорода, как активный окислитель, в процессе запаривания вызывает частичный гидролиз лигно-целлюлозного комплекса субстрата с высвобождением определенного количества полисахаридов, служащих дополнительным источником питания для развивающегося мицелия.

Проведена оценка промышленных, экологически безопасных биофунгицидов на процесс культивирования и образования плодовых тел полученным гибридом вешенки путем изучения биотического воздействия штамма В. subtilis 26Д, выделенного из препарата "Фитоспорин-М" на характер взаимоотношений Р. ostreatus и Trichoderma spp.

Таблица 5 - Урожайность штаммов вешенки на соломенном субстрате, обработанном

перекисью водорода

Время после инокуляции (сут.) Урожайность

Штамм Субстрат до полного обрастания субстрата мицелием до первой волны плодоношения до второй волны плодоношения Общая урожайность в г/100 г субстрата первая волна плодоношения, %/г вторая волна плодоношения, %/г

Т5 Без обр. 18,0±0,4 31,00±0,20 46,00±0,06 45,00±0,14 65,00±0,01/29,25 35,00±0,9/15,75

Обр. НА. 14,0±0,3 26,00±0,50 40,00±0,20 65,00±0,30 70,00±0,04/45,50 30,00±0,20/19,50

ТЗ Без обр. 25,0±0,5 34,00±0,07 48,00±0,06 31,00±0,07 51,00±0,01/15,81 49,00±0,03/15,19

Обр. Н,0, 17,0±0,3 29,00±0,40 42,00±0,20 37,00±0,30 72,00±0,04/26,64 28,00±20/10,36

Т4 Без обр. 26,0±0,5 36,00±0,50 35,00±0,06 27,00±0,07 55,00±0,01/14,85 45,00±0,03/12,15

Обр. НО, 17,0±0,3 27,00±0,30 30,00±0,20 35,00±0,30 72,00±0,04/25,20 28,00±0,20/9,80

БС Без обр. 24,0±0,5 37,00±0,50 65,00±0,06 24,00±0,07 65,00±0,01/15,60 35,00±0,03/8,40

Обр. н,о, 17,0±0,3 24,00±0,30 50,00±0,20 30,00±0,30 70,00±0,04/21,00 30,001=0,20/7,00

Без обр. 25,0±0,5 32,00±0,50 60,00±0,0б 35,00±0,07 60,00±0,01/21,00 40,00±0,03/14,00

Обр. №0, 15,0±0,3 27,00±0,30 45,00±0,20 40,00±0,30 71,00±0,04/28,40 29,00±0,20/11,60

Таблица 6 - Урожайность штаммов вешенки на опилочном субстрате, обработанном

перекисью водорода

са н а | Субстрат Время после инокуляции (сут.) Общая Урожай ность в г/100 г субстрата Урожайность

до ПОЛНОГО обрастания субстрата мицелием до первой волны плодоноше ния до второй волны плодоноше ния первая волна плодоношения, %/г вторая волна плодоношения, %/г

Т5 Без обр. Обр. Н;0, 21,0±0,3 16,0±0,1 27,00±0,10 20,00±0,01 80,00±0,60 45,00±0,10 40,00±0,12 55,00±0,40 60,00±0,03/24,00 70,00±0,06/3 8,50 40,00±0,04/16,00 30,00±0,50/16,50

ТЗ Без обр. Обр. НЛ 27,0±0,5 19,0±0,3 35,00±0,07 30,00±0,40 49,00±0,06 43,00±0,20 30,00±0,03 37,00±0,30 51,00±0,01/15,30 72,00±0,04/26,64 49,00±0,03/14,70 28,0040,20/10,36

Т4 Без обр. Обр. Н,0, 29,0±0,5 19,0±0,3 36,00±0,50 27,00±0,30 35,00±0,06 30,00±0,20 27,00±0,07 35,00±0,30 55,00±0,01/14,85 72,00±0,04/25,20 45,00±0,03/12,15 28,00±0,20/9,80

БС Без обр. Обр. Н,0, 28,0±0,5 21,0±0,3 37,0±0,5 24,0±0,3 65,00±0,06 50,0040,20 24,00±0,07 30,0040,30 65,00±0,01/15,60 70,00±0,04/21,00 35,00±0,03/8,40 30,00±0,20/9,00

1 Без обр. Обр. НЮ, 26,0±0,5 17,0±0,3 35,0±0,5 29,0±0,3 60,00±0,06 45,00±0,20 35,00±0,07 40,00±0,30 60,00±0,01/21,00 71,00±0,04/28,40 40,00±0,03/14,00 29,00±0,20/11,60

Биотический эффект рассчитывали согласно (ВгосИак, 1980) по ширине зоны развития макроколонии Р. оя(геаШ Т5. В процессе экспериментов наблюдали образование зон ингибирования роста микромицета и снижение индивидуального биотического воздействия последнего на мицелий вешенки с -8 до -3 (табл. 7) в присутствии В. яиЬИШ.

Характер взаимоотношений штамма В. ¡иЬНШ 26Д, выделенного из препарата "Фитоспорин-М" с мицелиальной культурой Р. оэКгаин Т5 и спорами культуры ТпсНос!егта ¡рр. изучали при совместном культивировании на среде МС.

Таблица 7 - Влияние B.subtilis на развитие Trichoderma spp.

Объект Степень биотического воздействия

1 2 3 4

В. subtilis 4 0 4 8

Т. spp. -4 0 -4 -8

Т. spp. + В subtilis -2 0 -1 -3

Примечание: 1 — согласно оценке взаимного влияния обоих видов,

2 — согласно оценке ширины зоны ингибирования,

3 — согласно оценке развития вешенки,

4 — биотический индивидуальный эффект.

Инокулюм P. ostreatus, помещенный в центре чашки Петри, инкубировали в течение 4 сут, затем подсевали суточную культуру бактерий В. subtilis 26Д в чистом виде и виде смеси со спорами Trichoderma spp. штрихом. Биотический эффект рассчитывали согласно (Brodziak, 1980) по ширине зоны развития макроколонии P. ostrecitus Т5, применяя критерии метода биотических рядов. При этом коэффициенты корреляции рассчитывали методом линейной регрессии по формуле (с использованием программного пакета MS Office Exel):

n-Gx-CTy

Исследование влияния добавления клеток суспензии штамма В. subtilis 26Д, выделенного из препарата "Фитоспорин-М", к пшеничной соломе («вакцинация»), которая изначально может содержать определенное количество спор Trichoderma spp., на урожайность плодовых тел P. ostreatus показало, что такая обработка субстрата значительно (в 3 раза) снижает плотность популяций этих микромицетов и приводит к увеличению количества термофильных бактерий рода В. subtilis.

Изучение урожайности исследуемых штаммов на субстрате, обработанном препаратом "Фитоспорин-М", показало, что на этом субстрате происходит как уменьшение времени появления примордий, так и общее увеличение урожайности в первую и вторую волны плодоношения (табл. 8).

Таблица 8 - Показатели урожайности штаммов Р. ostreatus на соломенном субстрате, обработанном препаратом "Фитоспорин-М"

3 та н э Субстрат Время после инокуляции (сут.) Общая урожайность в г/100 г субстрата Урожайность

до полного обрастания субстрата мицелием до первой волны плодоно шения до второй волны плодоно шения первая волна плодоношения, %/г вторая волна плодоношения, %/г

Т5 Без обраб. Обр."Фит. 15,0±0,1 9,0±0,5 34,0±0,5 20,0±0,3 70,0*0,1 40,0±0,2 37,00±0,02 55,00±0,01 72,00±0,10/26,64 80,00±0.10/44,00 28,0±0,2/10,36 20,0±0.3/11,00

Т4 Без обраб. Обр."Фит". 18,0±0,1 11,0±0,6 41,0±0,7 26,0±0,2 75,0±0,4 43,0±0,3 29,00±0,23 44,00±0,16 66,00±0,12/19,14 76,00±0,14/33,44 34,0±0,2/9,86 24.0±0.3/10,56

ТЗ Без обраб. Обр."Фиг". 21,0±0,1 15,0±0,6 44,0±0,6 29,0±0,3 80,0±0,4 55,0±0,3 26,00±0,42 42,00±0,21 81,00±0,15/21,06 72,00±0,17/30,24 19,0±0,1/4,94 28,0±0,2/11,76

БС Без обраб. Обр. "Фиг". 24,0±0,2 18,0±0,7 47,0±0,3 28,0±0,2 82,0±0,1 57,0±0,3 23,00±0,32 40,00±0,35 78,00±0,12/15,56 60,00±0,18/24,00 22,0±0,3/7,44 40,0±0,2/16,00

L Без обраб. Обр."Фиг". 23,0±0,6 17,0±0,6 40,0±0,3 2б,0±0,2 75,0±0,2 67,0±0.4 27,00±0,22 42,00±0,37 68,00±0,15/18,36 81,00±0,30/34,02 32,0±0,4/8,64 19,0±0,2/5,98

Таким образом, спорообразующие бактерии В. subtilis 26Д при культивировании

полученного гибрида являются не только активным биофунгицидом, но и стимулятором роста и плодообразования.

На основании анализа литературных и полученных нами данных можно заключить, что В. subtilis и P. ostreatus в частично замкнутой искусственной экосистеме связаны по типу прямых и косвенных топических и трофических связей; в создании элективного для P. ostreatus субстрата при культивировании в частично искусственной экосистеме важна роль популяции штамма В. subtilis 26Д.

Органолептическая оценка плодовых тел вешенки

Для оценки потребительских свойств полученного гибрида P. ostreatus Т5 мы использовали рекомендации по органолептической оценке плодовых тел вешенки, изложенных в работах C.B. Копыльцова (2009), а также основные показатели качества, приводимые в международных стандартах ЕЭК ООН FFV-54, CODEX STAN 38-1981 ив отечественной нормативной документации на культивируемые грибы.

Съедобность грибов определяется их физиологической и эстетической привлекательностью, приятным вкусом, кулинарными достоинствами (Бухало, 1988).

Кроме урожайности, существенным показателем уровня промышленного грибоводства является качество получаемых плодовых тел или их товарные качества, необходимые потребителю. Основными критериями, отражающими потребительские свойства плодового тела, являются: вкус., аромат, сочность, нежность, прозрачность бульона и его цвет (Шепелев, 2004).

Вкус плодовых тел складывается из комплекса химических компонентов и может зависеть от компонентов субстрата, на котором проводили культивирование гриба В наших экспериментах при культивировании плодовых тел на соломенном субстрате не было выявлено посторонних, не характерных для грибов вешенка, привкусов. Вешенка относится к группе грибов, не накапливающих алкалоидов, поэтому даже без предварительной тепловой обработки не является токсичной (СП 2.3.4.009-93). В то же время, проведенная кулинарная обработка способствует формированию лучших вкусовых качеств.

Известно, что при повышении общей урожайности возможно снижение качественных показателей грибной продукции. В соответствии с этим, мы провели сравнительную органолептическую оценку качества плодовых промышленно культивируемых, родительских и полученных нами гибридных штаммов.

Результаты оценки выражали в баллах условной шкалы (1-6) с возрастающей последовательностью числа, каждое из которых соответствует определенному уровню того или иного показателя качества. Балловый метод позволяет установить уровень частичного и общего (по комплексу показателей) качества изучаемого продукта (Копыльцов, 2009). Как известно, при использовании научно обоснованной балловой системы и соблюдении предусмотренных требований метод балловой оценки позволяет получать объективные, хорошо воспроизводимые результаты.

Одним из требований, предъявляемых к грибам как сырью для кулинарной обработки и выработки консервированной продукции по ГОСТ 28649-90 «Грибы маринованные» и ГОСТ 28649-90 «Грибы отварные», является качество грибного бульона. Конечный бульон должен быть прозрачным с соломенно-желтой окраской. Результаты органолептического анализа грибного бульона представлены в таблице 9. Для оценки согласованности мнений дегустаторов вычисляли коэффициент конкордации Кендалла с помощью программы «ЗТАТОТГСА 6.0».

В роли экспертов выступали люди со специальной подготовкой, потенциальные потребители и изготовители грибной продукции (грибоводы хозяйства «Весна»).

Различают также индивидуальное и коллективное мнение экспертов, последнее считают более точным, а главное, согласованным.

Согласованность мнения экспертов оценивали по величине коэффициента конкордации:

W

12 S

n^i/r? - ni)

где 8 - сумма квадратов отклонений всех оценок рангов каждого объекта экспертизы от среднего значения; п - число экспертов; т - число объектов экспертизы. Коэффициент конкордации изменяется в диапазоне 0<\У<1, причем 0 - полная несогласованность, 1 -полное единодушие.

Таблица 9 - Органолептическая оценка качества грибного бульона вешенки (в баллах)

Образец Аромат Вкус Прозрачность и цвет Сумма баллов

БС 3,2 4,0 3,4 10,6±0,6

L 4,4 4.2 3.5 12,4±0,5

ТЗ 3,0 3,9 3,7 10,6±0,5

Т4 4,6 4,9 5.3 14,8±0,7

Т5 5,7 5.4 5.9 17,0±0,6

НК35 4,6 3.5 4,3 12,4±0,9

Коэффициент конкордации 0,82 0,6 0,75

Как видно из таблицы 9, ни одному из образцов не было выставлено максимальное количество баллов. По сумме баллов гибридные штаммы в основном не имели достоверных различий в сравнении с промышленным и родительскими, лишь штамм ТЗ несколько уступал остальным образцам. По отдельным критериям, например, «прозрачность и цвет бульона» образцы Т5, Т4, L были оценены как лучшие. После отваривания был получен прозрачный бульон соломенно-желтого цвета без взвеси с ярко выраженным грибным вкусом и ароматом. Коэффициенты конкордации свидетельствуют о значительной согласованности (Олефирова, 2005) мнений дегустаторов в отношении «аромата» и средней - в отношение «вкуса» и «прозрачности» бульона. Органолептическая характеристика свежих и отварных плодовых тел исследуемых штаммов вешенки представлена в таблице 10.

Таблица 10 - Органолептическая оценка качества отварных плодовых тел вешенки

(в баллах)

Образец Аромат плодового тела Вкус Нежность Сочность Сумма баллов

Сырого Вареного

Т5 4,5 4,8 4,6 5.2 4,9 24,0±0,3

ТЗ 3,5 4,6 4.3 4,8 4,6 21,8±0,1

Т4 3,7 4,3 3.9 3,7 3,6 19,2±0,9

БС 2.9 4,0 4.6 3,9 4,9 20.3±0.7

НК35 2.7 3.S 3,7 4,5 4,9 19,6±0,5

L 3.9 3.8 3,2 3,3 3,9 18.1±0.5

Образец Аромат плодового тела Вкус Нежность Сочность Сумма баллов

Сырого Вареного

Т5 4,5 4,8 4,6 5,2 4,9 24,0±0,3

Коэффициент конкордашш 0,95 0,87 0,89 0,75 0,78

Как видно из данных, представленных в таблице 10, по сумме баллов, выставленных экспертами за органолептические показатели, гибридные штаммы несколько отличались в сравнении с коммерческими н родительскими и лишь некоторые незначительно уступали последним. Оценка дегустаторами, указанных показателей является также высокой по «аромату» сырого плодового тела и значительной по другим показателям.

Таким образом, результаты товароведной экспертизы, представленные в таблицах, демонстрируют, что по суммарной органолептической оценке гибридный штамм Т5, отобранный как высокопродуктивный, превосходит остальные штаммы.

Производственные испытания

Разработанная технология была проверена нами в промышленных условиях в грибоводческом хозяйстве ОАО «Совхоз-Весна».

Процедура получения плодовых тел грибов проводилась по следующей схеме:

Субстрат для культивирования - солома пшеницы твердых сортов обрабатывалась перегретым паром в течение 1 часа с добавлением 6% раствора перекиси водорода. После остывания до температуры 45-50°С субстрат обрабатывали раствором «Фитоспорина-М» (10 л/100 кг субстрата). Через 12 часов после обработки субстрат засевали непосредственно в субстратной машине зерновым мицелием штамма Р. ostreatus Т5 в количестве 3% по объему. Предварительное лабораторное выращивание жидкого мицелия проводили на мучной среде с добавлением экстракта дубовой коры (ФГУП «Курская биофабрика»). После перемешивания смеси из нее формировали субстратные блоки весом 12 кг в полипропиленовых контейнерах. Блоки инкубировали в темноте при температуре 26 С до полной колонизации субстрата и затем переносили в отделение для получения плодовых тел с температурой 16-18 С (рис. 9).

В качестве контроля по рекомендации руководства грибоводческого хозяйства ОАО «Совхоз-Весна» использовали наиболее часто культивируемый штамм вешенки НК-35 Duna. Процедуру подготовки субстрата и получение плодовых тел проводили по вышеуказанной технологии.

В результате проведенных испытаний установлено, что:

• полная колонизация субстрата мицелием гибрида Т5 происходит быстрее, чем у штамма НК-35, в среднем на 5 суток.

• урожайность штамма Т5 в первую и вторую волну культивирования существенно выше, чем штамма НК-35 Duna (табл. 11. и 12).

Рис. 9. Блок-схема разработанной технологии культивирования вешенки

Таблица 11 - Сравнительная урожайность штаммов Т5 и НК-35 Duna, выращенных по

традиционной технологии

S 3 л н а Время после инокуляции (сут.) Общая урожайность в г/100 г субстрата Урожайность

до полного обрастания субстрата мицелием до первой волны плодоношения до второй волны плодоношения первая волна плодоношеш!Я, %/г вторая волна плодоношения, %/г

к- >5 5 27,00±0,42 19,00±0,15 52,0±0,2 34,0±0,5 85,00±0,70 45,00±0,20 14,00±0,40 27,00±0,45 67,00±0,04/9,38 65,00±0,07/17,55 23,00±0,05/4,62 35,00±0,20/9,45

Таблица 12 - Сравнительная урожайность штаммов Т5 и НК-35 Duna, выращенных по

новой технологии

Штамм Время после инокуляции (сут.) Общая урожайность в г/100 г субстрата Урожайность

до полного обрастания субстрата мицелием до первой волны плодоношения до второй волны плодоношения первая волна плодоношения, %/г вторая волна плодоношения, %/г

НК- 35 Т5 19,0±0,3 12,0±0,1 40,0(Ш),10 18,00±0,01 80,0±0,6 45,0±0,1 30,0±0,1 43,0±0,4 60,00±0,03/18,00 70,ОСЫ),06/30,10 20,00±0,04/12,00 18,00±0,5 0/12,90

Таким образом, использование новой технологии подготовки субстрата и использование полученного гибрида Т5 существенно ускоряет время колонизации субстрата и повышает общую урожайность.

Выводы

1. Получены новые высокоурожайные гибриды Р. ostreatus ТЗ, Т4 и Т5, отличающиеся от родительских штаммов скоростью колонизации мицелия и повышенной урожайностью.

2. Показано, что применение экстракта дубовой коры в качестве стимулятора роста мицелия вешенки на жидкой питательной среде положительно влияет на выход биомассы.

3. Установлено, что обработка субстратов биофунгицидом «Фитоспорин-М» позволяет защитить субстрат от контаминирующего воздействия посторонней микрофлоры (грибков рода Trichoderma), а также повысить общую урожайность.

4. Обнаружено, что применение перекиси водорода для обработки субстрата служит дополнительным стерилизующим агентом и в разы повышает общую урожайность.

5. Промышленные испытания в искусственно замкнутой экосистеме показали, что культивирование гибрида Т5 и производственного штамма НК-35 Duna, взятого в качестве контрольного, по предлагаемой технологии позволяет сократить время колонизации субстрата, а также значительно повысить общую урожайность.

Предложения производству

В условиях промышленного производства грибоводческим хозяйствам рекомендуется использовать предлагаемую технологию получения мицелия и плодовых тел Р. ostreatus, включающую использование высокоурожайных гибридов вешенки применяя в качестве стимулятора роста мицелия экстракт дубовой коры на жидкой питательной среде и получение плодовых тел на субстрате, обработанном бгюфунгицидом «Фитоспорин-М».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Калашников, А.А. Влияние стимуляторов роста на биологические свойства высших базидиомицетов / А.А. Калашников, А.Д. Миронов, Г,В. Бондаренко // Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных. Современные

технологии переработки сельскохозяйственной продукции: сб. науч. трудов. - Саратов, 2008. -С. 95-97.

2. Бопдаренко, Г.В. Биотехнология получения и исследование культуралыю-морфологическнх свойств новых гибридов грибов рода Р. ostreatus / Г.В. Бопдаренко, А.Д. Миронов, A.A. Калашников // Вавнловские чтения - 2008 : Материалы Межд. науч.-практ. конф. 26-27 ноября 2008. - Саратов, 2008. - С. 258-259.

3. Миронов, А.Д. Влияние биотических факторов на жизнедеятельность гибрида Р. ostreatus Т5 в частично замкнутой искусственной экосистеме / А.Д. Миронов, A.A. Калашников // Вестник Саратовского госагроуннверснтета им. H.H. Вавилова. - 2009. - №8. - С.35-38.

4. Миронов, А.Д. Влияние биофунгицида «Фитоспорин-М» на рост и развитие мицелия и плодовых тел грибов вешенка / А.Д. Миронов, A.A. Калашников // Вавиловские чтения -2010: Материалы Межд. науч.-практ. конф. 25-27 ноября 2010. - Саратов, 2010. - С. 234-236.

Калашников Андрей Анатольевич

НОВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВЫСШИХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ В ИСКУССТВЕННО ЗАМКНУТОЙ ЭКОСИСТЕМЕ

03.01.06 — биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

Подписано в печать 12.01.2011. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Печать офсетная. _Печ. л. 1,4. Тираж 100. Заказ 018._

Общество с ограниченной ответственностью «Леара»

410600, Саратов, ул. Вольская, 12

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Калашников, Андрей Анатольевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика высших базидиомицетов рода Plenrotus.

1.2. Культурально-морфологические свойства Pleurotus ostreatus.

1.3. Поверхностное и глубинное культивирование мицелия. Питательные среды и их состав.

1.4. Компоненты, стимулирующие рост грибов.

1.5. Условия культивирования.

1.6. Ферменты грибов.

1.7. Получение плодовых тел.

1.7.1. Состав субстратов.

1.8. Промышленное культивирование вешенки обыкновенной.

1.9. Гибридизация и селекция. Получение новых гибридов,. перспективных для промышленного культивирования.

1.10. Влияние биотических факторов на процессы роста мицелия и плодовых тел грибов.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Объекты, материалы и методы исследований.

2.2. Результаты исследований и их обсуждение.

2.2.1. Подбор совместимых монокарионов и отбор фертильных дикарионов вешенки обыкновенной.

2.2.2. Культивирование исследуемых штаммов Р. ostreatus на различных питательных средах.

2.2.3. Влияние стимуляторов роста на процесс плодообразования высших базидиомицетов.

2.2.4. Зависимость роста мицелия и плодовых тел от рН среды, аэрации, типа субстрата и его обработки перекисью водорода.

2.2.5. Изучение влияния биофунгицидов на культивирование вешенки.

2.2.6. Органолептическая оценка плодовых тел вешенки.

2.3. Производственные испытания разработанной технологии.

2.4. Финансово-экономическое обоснование.

2.4.1. Расчет годовой производственной мощности.

2.4.2. Расчёт капитальных вложений.

2.4.3. Расчет себестоимости продукции.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новая технология культивирования высших базидиомицетов в искусственно замкнутой экосистеме"

Актуальность темы. Современное развитие грибоводства в России выявило потребность создания новых интенсивных технологий, удовлетворяющих современным требованиям: сокращение сроков обрастания субстрата и выгонки плодовых тел, устойчивость к конкурентной микрофлоре, высокая продуктивность и товарные качества мицелия и плодовых тел.

Несмотря на возрастающие объемы культивирования вешенки, промышленное производство в значительной степени сдерживается из-за отсутствия продуктивных отечественных сортов и штаммов (Таксономический анализ., 2002). На сегодняшний день в государственном реестре селекционных достижений РФ зарегистрированы четыре сорта, относящиеся к вешенке устричной, и один сорт вешенки флоридской. Общеизвестно, что непрерывное культивирование какого-либо сорта гриба в течение длительного времени неизбежно приводит к потере урожайности в результате генетического «старения». Поэтому, получение новых гибридов вешенки, обладающих повышенной урожайностью по сравнению с родительскими производственными штаммами, являётся наиболее актуальной задачей в области селекции грибов.

Не менее важной задачей является защита субстрата для получения плодовых' тел от контаминации посторонней микрофлорой при помощи экологически чистых биопрепаратов, не способных оказывать негативное влияние на окружающую среду и здоровье потребителя. Современные способы выращивания мицелия и плодовых1 тел высших грибов-базидиомицетов основаны на интенсивной стерильной технологии в искусственно замкнутой экосистеме — специальных контейнерах с использованием растительных субстратов, следуя которой возможно получение быстрого и обильного урожая. Однако, применение этой технологии связано со значительными материальными и энергетическими затратами, включающими наличие специализированных бактериологических лабораторий и помещений для подготовки субстрата и выращивания мицелия и плодовых тел грибов небольшими грибоводческими фирмами.

В связи с этим, важной задачей современной грибной индустрии является создание новых технологий, позволяющих при незначительном повышении материальных затрат получить высокий урожай плодовых тел грибов. Выявлению различных факторов, влияющих на продуктивность плодовых тел, посвящен ряд работ (Eger, Wang, Anderson, 1972; Eger, 1974; Larraya, 2002).

Цель работы: разработка новой технологии культивирования мицелия и плодовых тел Pleurotus ostreatus, позволяющей с минимальными затратами в относительно простых условиях получать качественный мицелий и высокий урожай плодовых тел гриба.

Задачи исследования:

1. Получить новые гибриды Р. ostreatus путем скрещивания производственного и полученного из природных объектов штаммов вешенки.

2. Оценить влияние различных стимуляторов на интенсивность роста мицелия изучаемых штаммов гриба на плотных и жидких питательных средах.

3.Провести сравнительный анализ урожайности вешенки на растительных субстратах, обработанных перекисью водорода.

4.Изучить влияние бактерий Bacillus subtilis 26D — основного действующего вещества промышленного биофунгицида «Фитоспорин-М» на характер взаимодействия Р. ostreatus и естественного контаминанта - плесневого гриба p. Trichoderma.

5.Оценить урожайность изучаемых штаммов на субстрате, обработанном препаратом «Фитоспорин-М».

6. Провести промышленные испытания разработанной технологии культивирования Р. ostreatus.

Научная новизна. Получен новый гибридный штамм Pleurotus ostreatus Т5, при скрещивании Р. ostreatus ВС (промышленный штамм) Р. ostreatus L (дикий штамм). Обоснована эффективность применения естественного стимулятора -экстракта дубовой коры для интенсификации роста мицелия при мелкотоварном и промышленном культивировании грибов рода Р. ostreatus - Вешенка.

Впервые изучено биотическое влияние промышленного биофунгицида «Фитоспорин-М», содержащего в качестве биологически активного агента клетки Bacillus subtilis 26Д, на жизнедеятельность Р. ostreatus в частично замкнутой экосистеме.

Практическая значимость работы. Разработанная технология культивирования плодовых тел Pleurotus ostreatus в перспективе может быть использована грибоводческими хозяйствами России, как в мелкотоварных, так и промышленных объемах. Данная технология используется для выращивания грибов вешенки в ОАО «Совхоз-Весна» (г. Саратов), что подтверждается актом о внедрении от 21.04.2009. Материалы диссертационной работы вошли в учебное пособие «Проблемы и перспективы биологического разнообразия» (в соавторстве с Мироновым А.Д., Бондаренко Г.В., Соболевой JI.B., Зиминым П.В., Калашниковым A.A., 2008) для студентов, специализирующихся в области биоэкологии, рекомендованное и одобренное Учебно-методическим советом биотехнологического факультета СГАУ им. Н.И. Вавилова. Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций и написании дипломных работ в СГАУ им. Н.И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Получено 125 потенциально гибридных дикарионов, из которых было отобрано 5 изолятов, отличающихся от других по способности образовывать о наибольшее количество примордиев при 22-25 С

2. Экстракт дубовой коры стимулирует рост мицелия, что зафиксировано при выращивании клеток мицелия гибрида Р. ostreatus Т5 на шутгель-аппарате и лабораторном ферментере «Анкум-2М.

3. Штамм Bacillus subtilis 26Д, выделенный из препарата «Фитоспорин-М», с мицелиальной культурой Р. ostreatus Т5 и спорами чистой культуры Trichoderma spp. на среде MC ингибировал развитие микромицета Trichoderma SPP

4. Наиболее оптимальным субстратом для получения плодовых тел гибрида является солома; обработка материала перекисью водорода служит не только дополнительным средством для поддержания необходимой стерильности, но и повышает общую урожайность.

5. При культивировании штамма Р. ostreatus Т5 на субстрате, обработанном препаратом «Фитоспорин-М», происходит уменьшение времени появления примордий и общее увеличение урожайности в первую и вторую волны плодоношения.

Работа выполнена на кафедре экологии, биологии, физиологии и фармакологии ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» в рамках научно-исследовательской темы: «Изучение биологических свойств высших грибов-базидиомицетов».

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на:

- Всероссийской конференции «Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных. Современные технологии переработки сельскохозяйственной продукции», (Саратов, 2008);

Всероссийской научно-практической конференции. «Актуальные проблемы ветеринарной патологии сельскохозяйственных животных и птиц», (Саратов, 2008);

- Международной научно-практической конференции, посвященной 95-летию госагроуниверситета. «Вавиловские чтения-2008», (Саратов, 2008).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 4 работы, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей в себя материалы и методы исследования, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, предложений производству, списка используемых литературных источников, включающего 116 источников, в том числе 68 зарубежных авторов и приложений. Работа изложена на 143 страницах и иллюстрирована 22 рисунками, 20 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Калашников, Андрей Анатольевич

ВЫВОДЫ

1. Получены новые высокоурожайные гибриды Р. ostreatus ТЗ, Т4 и Т5, отличающиеся от родительских штаммов скоростью колонизации мицелия и повышенной урожайностью.

2. Показано, что применение экстракта дубовой коры в качестве стимулятора роста мицелия вешенки на жидкой питательной среде положительно влияет на выход биомассы.

3. Обнаружено, что применение перекиси водорода для обработки субстрата служит дополнительным стерилизующим агентом и несколько повышает общую урожайность.

4. Установлено, что обработка субстратов биофунгицидом «Фитоспорин-М» позволяет защитить субстрат от контаминирующего воздействия посторонней микрофлоры (микромицетов рода Trichoderma), а также повысить общую урожайность.

5. Промышленные испытания показали, что культивирование гибрида Т5 и производственного штамма НК-35 Duna, взятого в качестве контрольного по предлагаемой технологии позволяет сократить время колонизации субстрата, а также повысить общую урожайность.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

В условиях промышленного производства грибоводческим хозяйствам рекомендуется использовать предлагаемую биотехнологию получения мицелия и плодовых тел Р. ostreatus, включающую использование высокоурожайных гибридов, применение в качестве стимулятора роста мицелия вешенки экстракта дубовой коры на жидкой питательной среде и получение плодовых тел гибридов на субстрате, обработанном биофунгицидом «Фитоспорин-М».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Промышленное культивирование плодовых тел высших съедобных базидиомицетов по экономической эффективности может успешно конкурировать с традиционными методами получения пищевых продуктов (Бисько, 1996). Рентабельность производства вешенки составляет в среднем 28% (Девочкина, Алексеева, 1998). Вешенка обыкновенная Р. ойЪгеаШ (Бг.) Китт. является одним из перспективных компонентов экологически чистых пищевых продуктов, обладающих высокой биологической ценностью и лечебно-профилактическими свойствами. Интенсивное культивирование вешенки на разнообразных целлюлозо- и лигнинсодержащих отходах сельского и лесного хозяйства, а также перерабатывающей промышленности с последующим использованием субстратов после плодоношения в качестве кормовых добавок в животноводстве или удобрений в тепличном хозяйстве позволяет сделать производство съедобного гриба вешенки безотходным (Поединок, 2004). В производственной практике культивирования вешенки представлен небольшой ассортимент штаммов, большая часть из которых являются штаммами зарубежной селекции. Еще меньшее их количество имеют официальную регистрацию на территории России в качестве объекта изобретения или селекционного достижения. Отсутствуют четкие рекомендации по обеспечению технологических условий, обеспечивающих реализацию биологического потенциала того или иного штамма.

Поэтому важной задачей современного интенсивного грибоводства, является получение и внедрение в производство высокоурожайных штаммов, полученных с использованием научно обоснованных методов, в совокупности с применением технологии производства вешенки, соответствующей ее биологическим требованиям.

История развития интенсивной технологии производства вешенки не насчитывает и пятидесяти лет. В настоящее время в разных странах мира используется большое количество разных технологических схем культивирования этого гриба. Способы культивирования и технологические решения постоянно совершенствуются, что не позволяет в долгосрочной перспективе считать какую-либо технологическую схему наилучшей.

С этой целью была предпринята попытка создать новую биотехнологию культивирования вешенки обыкновенной, позволяющую получить значительно больший урожай плодовых тел за сравнительно небольшие сроки и без каких-то значительных дополнительных материальных вложений. Эта технология включает в себя следующие основные стадии:

1. Получение высокоурожайных гибридов.

2. Применение в качестве стимулятора роста мицелия вешенки экстракта дубовой коры на жидкой питательной среде.

3. Запаривание и обработка субстрата перекисью водорода (для мелкотоварного производства) с целью обеспечения дополнительной стерильности.

4. «Вакцинация» субстрата биофунгицидом «Фитоспоприн-М», (который также является эффективным стимулятором роста мицелия и плодовых тел гриба) при культивировании его на лигниноцеллюлозных растительных остатках.

5. Культивирование мицелия высокоурожайного гибрида в исскуственно замкнутой экосистеме на субстрате, обработанном биофунгицидом и получение плодовых тел.

Целесообразность этих стадий новой биотехнологии подтверждается следующими экспериментальными данными. В результате проведенных экспериментов по скрещиванию исходных штаммов было получено 125 потенциально гибридных дикарионов, одним из которых был изолят, отличающийся от других по способности образовывать наибольшее количество примордиев при 22-25 С, обозначенный Т5. Данный штамм способен к образованию единичных и срощенных плодовых тел в количестве 1-15 в первую волну выращивания на опилочном и соломенном субстратах. Всего было получено до 95 плодовых тел за 1,5 месяца инкубации (с одного контейнера). Из них на соломе - 94 плодовых тела, общим весом 82 г, с опилками - 97 плодовых тел, общим весом 96 гр. Эти данные позволяют констатировать, что гибрид Т5 значительно превышает активность плодообразования исходных родительских штаммов.

Установлено, что мицелий Р. озЬ-есйш Т5 наиболее интенсивно растет на средах с добавлением экстракта дубовой коры. Интенсификация роста происходит в результате возможного стимулирования активности грибных фенолоксидаз.

Изучено биотическое воздействие штамма В. БиЫШя 26Д выделенного из препарата "Фитоспорин-М", применяющегося в качестве биофунгицида на характер взаимоотношений Р. оМгеаЫх и Тпскос1егта $рр, - микромицета, который является одним из активных контаминантов субстратов для производства вешенки. Установлено, что спорообразующие бактерии В. яиЫШй 26Д в процессе культивировании полученного гибрида являются не только активным биофунгицидом, но и стимулятором роста и плодообразования.

Производственные испытания предлагаемой биотехнологии также доказывают ее несомненную эффективность. Результаты научно-производственных экспериментов показазли, что при использовании данной технологии возможно получить максимально более высокий урожай плодовых тел грибов, причем стадии подготовки субстрата, включающие тепловую обработку, инокуляцию зерновым мицелием и формирование субстратных блоков можно проводить непосредственно в субстратной машине, что существенно снижает время подготовки и риск контаминации посторонней микрофлорой.

Полученные данные могут служить основой для внедрения данной биотехнологии как в промышленное производство, так и для мелкотоварного культивирования плодовых тел высших съедобных базидиомицетов, в частности Р. оБ^еаШБ — вешенки обыкновенной.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калашников, Андрей Анатольевич, Саратов

1. Алексеева, К.Л. Патент 2160000 Российская Федерация Способ стимуляции роста шампиньонов и вешенки Текст. / Алексеева К.Л.; Малеванная H.H. Дата публикации 11.03.2007 г.

2. Белова, Н.В. Базидиомицеты источники биологически активных веществ / Н.В. Белова // Растительные ресурсы. — 1991. — Вып. 2, Т. 27. - С. 812.

3. Бисько, H.A. Влияние бактерий рода Bacillus на жизнедеятельность вешенки обыкновенной Р. ostreatus (jacq.fr.) kumm. в частично замкнутой искусственной экосистеме / H.A. Бисько, В.Т. Билай // Микология и Фитопатология 1995. - Вып. 5 - 6, Т. 29. - С. 1-7.

4. Бисько, H.A. Высшие съедобные базидиомицеты в поверхностной и глубинной культуре / H.A. Бисько, A.C. Бухало // Киев: Наук, думка, 1983. -С. 347.

5. Бисько, H.A. Микрофлора субстрата Р. ostreatus (Jacq.: fr.) kumm. в частично замкнутой искусственной экосистеме / H.A. Бисько // Микология и фитопатология, 1996. — Вып. 5 6, Т. 30. - С. 35-40.

6. Вассер, С.П. Агариковые грибы СССР / С.П. Вассер // Киев: Наук, Думка, 1985.-С. 331-332.

7. Верзилов, В.Ф. Регуляторы роста и их применение в растениеводстве /В.Ф. Верзилов // — М. "Наука", 1984. -С.61-78.

8. Володина, Е.П. Биохимический состав плодовых тел вешенки обыкновенной в экстенсивной культуре / Е.П. Володина, H.A. Бисько // Тез. Всесоюз. науч. конф. "Мицелиальные грибы". — Пущино, 1983. С. 109-110.

9. Ю.Все о выращивании грибов вешенка. Гидротермическая обработка. Электронный ресурс.: http://grib-portal.nm.ru/carta.htm.

10. Горленко, М. Ф. Положение грибов в системе органического мира / М.Ф. Горленко // В сборнике: Эволюция и систематика грибов: Теоретические и прикладные аспекты. Л.: Наука, 1984. - С. 5-9.

11. ГОСТ 28649-90 Консервы. Грибы маринованные. Технические условия // М.: Стандартинформ, 2007. - С. 4.

12. ГОСТ 28649-90 Консервы. Грибы отварные. Технические условия. // М.: Стандартинформ, 2007. - С. 7.

13. Дудка, И.А. Культивирование съедобных грибов / И.А. Дудка, H.A. Бисько, В.П. Билай // К.: Урожай, 1992. - С. 158.

14. Зерова, М.Я. Насущные проблемы систематики агарикальных грибов / М.Я. Зерова, С.П. Вассер // Современные успехи микологи лихенологии в Советской Прибалтике. Тарту: Изд-во АН ЭССР, 1974. - С. 62-65.

15. Капич, А.Н. Аэробная ферментация субстрата для выращивания вешенки обыкновенной P. ostreatus (jacq.fr.) Kumm. С участием бактерийрода Bacillus / А.Н. Капич, JI.T. Мишин // Микология и фитопатология. -1998.-Вып. 5, Том 32.-С. 61-69.

16. Капич, А.Н. Дереворазрушающие базидиомицеты продуценты белка / А.Н. Капич, И.В. Стахиев, В.Г. Бабицкая // - Минск: АН БССР. Ин-т микробиологии, 1984. - С. 68.

17. Карпов, Ф.Ф. Управление климатом при культивировании шампиньонов и вешенки / Ф.Ф. Карпов // Ж. Школа грибоводства, 2003. -№2. С. 22.

18. Костымин, С.С. Фенол оксидазная активность некоторых базидиомицетов. Оптимизация ферментообразования и скрининг продуцентов / С.С. Костымин, Ф.С. Мошкович, E.H. Домбровская, JI.T. Огшачко // Биотехнология, 1992. № 6. — С. 46-53.

19. Морозов, А.И. Выращивание вешенки / А.И. Морозов // Донецк: Сталкер, 2003.-С. 46.

20. Муромцев, Г.С. Гиббереллин и урожай / Г.С. Муромцев, В.Н. Агнистикова // М.: Колос, 1971. - С. 127.

21. Пат. Российской Федерации RU2249614. Способ получения посевного мицелия съедобных грибов // Никитина В.Е. Дата начала действия патента: 2003.03.21.

22. Пат. Российской Федерации RU 2099947. Использование: биотехнология, производство биопрепаратов для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов // Г.М. Ваньянц Дата начала действия патента: 1997.12.27.

23. Пат. 1-207209 Япония. МКИ4 А01 N 43/90 А01 G, Стимулятор роста для грибов / И. Масаёси, И. Когё, Т. Кохо (Яп). № 63-29926. Заявлено 10.02.88; Опубл. Бюл. 1989. - № 69.

24. Пат. 2096449 РФ, МКИб С12 N1/14. Питательная среда для культивирования базидиальных грибов продуцентов комплекса ферментов / Даниляк Н.И., Решетников СВ. Ин-т ботан. АН Украины. - № 5047644/13. Заявлено 09.04.92.

25. Пат. 35544 Япония, МКИ4 А 01 Н 43/16, А 0Ш 1/04. Заявка №1211508; Заявл. 18.02.1988; Йосикава Масаеси; Ихара Кемикару Коче И.К. (Япония). Интенсификатор роста грибов. Опубл. 24.08.1989. - С. 2.

26. Перепелиця, Л.О. Фитогормоны некоторых базидиомицетов / Л.О. Перепелиця, В.Н. Генералова, В.А. Васюк, Л.И. Мусатенко // Укр. ботан. журн. 2000. - Т.57 №4. - С. 437-442.

27. Применение регуляторов роста растений в сельскохозяйственном производстве // Состояние и перспективы создания и применения регуляторов роста растений в сельском хозяйстве. М., МСХ СССР ЦИНАО 1985.-С. 3-7.

28. Раптунович, Е.С. Искусственное выращивание съедобных грибов / Е.С. Раптунович, Н. Федоров // Минск: Вышэйшая школа, 1994. - С. 206.

29. Сафрай, А.И. И снова новая солома / А.И. Сафрай // Школа грибоводства, №5 - 2002. - С. 12.

30. Семичаевский, В. Д. Активность внеклеточных монофенолмонооксигеназы и целлюлаз у различных видов рода Р1еигоШз (РК.)С>иЕЬ / В.Д. Семичаевский, Н.А. Бисько // Микология и фитопатология. 1987. - Вып. 4, Т. 21. - С. 339-346.

31. Семичаевский, В. Д. Фенолокисляющая способность препаратов внеклеточных ферментов Р. оэ^еаШБ (Рг.) Кшшп / В.Д. Семичаевский, И.А. Бутович, Н.В. Царевич // Докл. АН УССР. Сер. Б. 1984. - N 10. - С. 80-83.

32. Сержанина, Г.И. Макромицеты. / Г.И. Сержанина, И.И. Змитрович // Минск, «Вышэйшая школа». 1978. - С. 7-21.

33. Сидоренко, М.Л. Гуминовые кислоты как стимуляторы роста грибов / М.Л. Сидоренко, Н.Ю. Ефремова // Тезисы докладов второго съезда микологов России. 2001. - Т 2, - С. 341.

34. Средства борьбы с вредителями и болезнями при выращивании вешенки и шампиньона. Электронный ресурс.: http://www.praktikgrib.ru.

35. Тимофеев-Ресовский, Н. В. Микроэволюция: Элемент, явления, материал и факторы эволюц. процесса / Н. В. Тимофеев-Ресовский. — М.: Знание, 1974.-64 с.

36. Тишенков, А.Д. Как повысить надежность субстратного производства вешенки / А.Д. Тишенков // Ж. Школа грибоводства. — 2003, №2. — 12 с.

37. Тишенков, А.Д. Контроль триходермы на грибоводческих фермах. / А.Д. Тишенков // Ж. Школа грибоводства. №4. - 2001. - С. 23-27.

38. Тишенков, А.Д. Приготовление субстрата для вешенки: актуальные проблемы сегодняшнего дня и пути их решения. / А.Д. Тишенков //Ж. Школа грибоводства, 2001. №3. - С. 23.

39. Тишенков, А.Д. Характеристика культивируемых видов и штаммов вешенки производства фирмы Sylvan / А.Д. Тишенков // Школа грибоводства, 2003. — №5. С. 21.

40. Тишенков, А.Д. Технология культивирования вешенки / А.Д. Тишенков, Ф.Ф. Карпов // Школа грибоводства, 2000. №4. - С.36.

41. Тот, К. Вешенки на конвеере / К. Тот // Наука и жизнь, 1975. № 5. -С. 36-136.

42. Шиврина, А.Н. Биосинтетическая деятельность высших грибов / А.Н. Шиврина, О.П. Низовская, H.H. Фалина и др. // Д.: Наука, 1969. - С.241.

43. Широков, A.B. Выделение низкомолекулярных метаболитов штамма Bacillus subtilis 26 Д / A.B. Широков, P.A. Кудоярова, В.И. Кузнецов // Материалы международной научной конференции «МИКРООРГАНИЗМЫ И БИОСФЕРА». 2007. - С. 152-153.

44. Aho, L. Freie Fettsauren einiger Waldpilze / L. Aho, R. Kurkela // Nahrung. 1978. Vol. 22, N 3. - P. 603-607.

45. Austin, B. An ecology and taxonomy of bacteria attaching to wood surfaces in a tropical harbor / B. Austin, D. Alien //Can. J. Microbiol 1979. Vol 25, №4.-P. 447-461.

46. Balazs, S. Effect of composition and heat treatment of culture medium on formation of fruit bodes P. ostreatus and Pleurotus Florida / Balazs S. // Publ. Univ. Horticult. Budapest. - 1979. - Vol. 10. - P. 191-198.

47. Bisko, N. Changes in the cellulose and lignin content in the cultivation of strains P. ostreatus in different substrates in deep and shallow troughs / N. A Bisko, V. T. Bilay, M. Stanek // Int. symp. deep troughs. Prague, 1982. P. 102104.

48. Bisko, N. Mikroorganismy koloniziijichi ruzne substraty pro pestovany hlivy (P. ostreatus ) na nizkych i vysokych vrstvach / N. A. Bisko, M. Stanek // Vest. pest. 1981.-Vol. 7,№2.-P 116-120.

49. Bisko, N.A. Changes in the cellulose and lignin content in the culti vation of strains of P. ostreatus In different substrates in deep and shallow troughs / N.A. Bisko, V.T. Bilay, M. Stanek // int. Symp. Deep troughs. Prague, 1982. - P. 102104.

50. Bresinsky, A. The genus Pleurotus as an aid for understanding the concept of species in Basidiomycetes / A. Bresinsky, O. Hilber, H. Molitoris // Clmencon Vaduz. Cramer, 1976. - P. 229-258.

51. Crisan, E.V. Nutritional value / E.V. Crisan, A. Sands // The biology and cultivation of edible mushrooms. New York etc.: Acad, press, 1978. - P. 137168.

52. De Vries, O.M.H. Release protoplasts from Scizophyllum commune by a lytic enzyme preparation from Trichoderma viride / O.M.H. De Vries, J.G.H. Wessels // J. Gen. Microbiol. 1972 - Vol.73, № 1. - P. 13-22.

53. Eger, G. Biology and breeding of Pieurotus / G. Eger // The biology and cultivation of edible mushrooms. New York etc. - Acad, press, 1978. - P.497-520.

54. Eger, G. Blue-light photomorphogenesis in mushrooms (Basidiomycetes) / G. Eger // Blue light syndrome. Berlin etc : Springer, 1980. - P.555-562.

55. Eger, G. Contribution to the discussion on the species concept on the P. ostreatus complex / G. Eger, S.F. Li, H. Leal-Lara // Mycologia. 1979. - Vol. 71, N3.-P. 577-588.

56. Eger, G. Contribution to the discussion on the species concept on the P. ostreatus complex / G. Eger, S.F. Li, H. Leal-Lara // Mycologia. 1979. - Vol. 71, N 3. — P.577-582.

57. Eger, G. Contribution to the discussion on the species concept on the Pieurotus ostreatus complex / G. Eger, S.F. Li, H. Leal-Lara // Mycologia. 1979.- Vol. 71, № 3. P.583-588.

58. Eger, G. Die Wirkung des Lichts auf die Primordienbildung des Basidiomyceten Pieurotus sp.aus Florida / G. Eger // Ibid. — 1970b. Vol. 74, № 2. -P. 174-192.

59. Eger, G. Die Wirkung einiger N-Verbindungen auf Mycelwachstum und Primordienbildung des Basidiomyceten Pieurotus sp. aus Florida / G. Eger // Ibid.- 1970a. Vol. 74, № 2/5. - P. 160-173.

60. Eger, G. E. Pieurotus ostreatus breeding potential of a new cultivated mushroom / G. Eger, G. Eden, E. Wisslng // Theor. and Appl. Genet. - 1976. -Vol. 47, № 3. -P.155-163.

61. Eger, G. Importance of genetic research for systematics, breeding and production of macromycetes in example of Pieurotus ostereatus / G. Eger // 3th Intern. Symp. physiol., ecol. and cultivai, edible fungi. Prague, 1979. - P. 99101.

62. Eger, G. Importance of genetic research for systematics, breeding and production of macromycetes in example of Pieurotus ostreatus / G. Eger // 3rd Intern. Symp. physiol., ecol. end cultivât, edible fungi. Prague, 1979. -P.99-101.

63. Eger, G. New ways of breeding and strain protection for practical mushroom cultivation / G. Eger // Mushroom Sciense, X : Proc. Tenth Intern. Sci. Congr. Cultivât. Edible Fungi. Paris, 1978, - P. 415-420.

64. Eger, G. Rapid method for breeding Pieurotus ostreatus / G. Eger // Mushroom Sciense, IX : Proc. Ninth Intern. Sei. Congr. Cultivat. Edible Fungi. — Tokyo, 1974. — P.575-583.

65. Eger, G. The action of light and other factors on sporophore initiation in Pieurotus ostreatus / G. Eger, N.O. Gottwold, U. von Netzer // Mushroom Sciense, IX : Proc. Ninth Intern. Sei. Congr. Cultivat. Edible Fungi. Tokyo, 1974. -P.575-583.

66. Eger, G. Untersuchungen liber die Bildung und Regeneration von Fruchtkorpen bei Hutpiizen. 1. Pieurotus fiorida // Arch. Mikrobiol. 1965. - Vol. 50, №2.-P. 343-356.

67. Eger, G. Untersuchungen über die Bildung und Regeneration von Fruchtkorpen bei Hutpilzen. 1. Pieurotus fiorida / G. Eger // Arch. Mikrobiol. — 1965.-NY.-P. 343-356.

68. Elliott, T.J. Breeding strategies in A. bisporus / TJ. Elliott // Mushroom Sei.-1978.-Vol. 10.-P. 8-10.

69. Esser, K. Genetic control of fruit body formation in higher Basidiomycetes. Summaries of communications / K. Esser // X Intern, congr. sei. and cultiv. edible fungi.V Aquitaine. — val De Loire-Paris. Bordeaux. France, 1978.-P. 1-2

70. Eugenio, C.P. The genetics and cultivation of P. ostreatus / C.P. Eugenio, N.A. Anderson //Mycologia. 1968. - Vol. 60, N 3. - P.627-634.

71. Flegg, P.B. Soucacny staw vyskumu ve Velke Britamil / P.B. Flegg // Vestn. pest. 1979.-Vol. №1.-P. 88-91.

72. Flick, M. Biologic und Biotechnologie der Substratfermentetion beim Austernpitz (Pieurotus sp.) / Flick M. // Champignon. 1981. - Vol. 21, № 233. -S. 17-20

73. Flog P.B., Mew G. Mushroom and their possible contribution to world protein lids / P.B. Flog, G. Mew // Mushroom J. 1976. - Vol. №48. - P. 396-405.

74. Fritsche, G. Experimental proof for cross-breeding of the cultivated mushroom Agaricus (Psalliota) bisporus Sing / G. Fritsche // Mushroom Sei. -1969.-Vol. 5.-P. 159-164.

75. Gyurko, P. Breeding of P. ostreatus / P. Gyurko // 3rd Intern, physioloogy, ecology and cultivation of ediblee fungi. Prague, 1979. - P. 109-111

76. Harsh, N.S. Utilization of waste paper and tea leaves to cultivation P. ostreatus / N.S. Harsh, N.S. Brisht, J.C. Upreti // Int. Biodeterior. Bull. — 1981. — Vol. 17, N3.-P. 77-78.

77. Hayes, W.A. The food value of the cultivated mushroom and its importance to the mushroom industry / W.A. Hayes, N. Haddad // Mushroom J. — 1976. -N40. P. 104-110.

78. Hilber, O. Die gattung Pleurotus / O. Hilber // München: Vaduz, 1982. -P. 488.

79. Horriere, F. Etude comparative des exigences trophiques de quelques basidiomycetes supérieurs fructifiant sur milieux syntheques. Analyse bibliographique / F. Horriere // Mushroom Sei. 1979. - Vol. 10, № 1. - P. 665683.

80. Kligman, A.M. Some culturation and genetical problems in the cultivation of the mushroom, Agaricus campestris Fr. / A.M. Kligman // Amer. J. Bot. -1943. Vol. 30, № 5. - P.745-763.

81. Kreizel, H. Grundzuge eines naturlichen Systems der Pilz / H. Kreizel // -Jena: Fischer, 1969. -P. 245.

82. Kubitova, Z. Polysacharidy fermentovane'sla'my pouzivane pro pestovani hlivy ustricne Pieurotus ostreatus (Jacq. ex Fr.) Kummer / Z. Kubitova, M. Wurst, M. Stanek // Vestn. p&st. 1977. - Vol. 13, № 3-4. - P.87-89.

83. Kurtzman Ralph, H. Production and cultivation of mushrooms in the West, particularly Europe and North America / H. Kurtzman Ralph // Food Rew. Int. -1997. -Vol.13 №3. -P. 497-516.

84. Leal Lare, H. Is sporelessness in P. ostreatus a transmissible agent? / H. Leal Lare//Mushroom Sci. 1978.-Vol. 10.-P. 16-17.

85. Leatham, G. Studies on the Laccase of Lentinus edodes, specificity, localization and association with the development of fruiting bodies / G. Leatham, M. Stahmann // J.General Microbiology. III. - Vol. 125. - 1980 - P. 147-157.

86. Maggioni, A. Variazion della composizione del fungo coltivato (Agaricus bisporas) nei processi dinscatolomento e di conservarione in saiamoia / A. Maggioni, F. Renosto // J. Agric. Food Chem. 1970. - Vol. 45. - P. 311-314.

87. Molitiris, H.P. Wood degradation, phenoloxidases and chemotaxonomy of higher fungi / H.P. Molitiris // Mushroom Sciense, X: Proc. Tenth Intern. Sci. Congr. Cultivat. Edible FungL. Paris, 1978. - P. 243-263.

88. Mrazkova, L. Antagonismus bakterii osidlujicich slamu vuci P. ostreatus , Chaetomium olivaceum a Trichoderma sp. / L. Mrazkova, M. Stanek // Ve'stn. pjst. 1978a. - Vol. 14, N 2. - P.42-44.

89. Mrazkova, L. Vliv pndavku N-zdrojil k psenicne slamevna vinos hlivy tatfic v P. ostreatus (Jacq. ex Fr.) Kumm. / L. Mrazkova, M. Stanek // Ibid. — 1978b.-Vol. 14, N 4. P.103-104.

90. Parker, F.H. Пат. 9014769 S, МКИ5 С 05 F 11/00, A 01G 1/04. -Заявка №2234966; Заявл. 03.07.90; Опубл. 20.02.91. Parker F.H. (Великобритания). Method and composition for promoting mushroom growth

91. Piatt, M. Growth of P. ostreatus on cotton straw / M. Piatt, J. Chit, J. Henis // Mushroom J. 1982. - N 120. - P. 425-427.

92. Poppe, J.A. Fruitregulating action of light and chemicals on the cultury of Pleurotus / J.A. Poppe // Moded. Fak. Landbow., Gent. 1973. - Vol. 38, №10. -P. 1387- 1397.

93. Quantitative trait loci controlling vegetative growsth rate in the edible basidiomycete P. ostreatus / Luis M. Larraya et. al. // Appl. Environ. Microbiol.- 2002. Vol. 68, № 3. - P. 1109-1114.

94. Quimio, Т.Н. Indoor cultivation of Pleurotus / Т.Н. Quimio // Phil. Agr.- 1978. Vol. 61, №8. - P. 253-262.

95. Raper, C.A. Genetic analysis of the life cycle of Agaricus bisporus / C.A. Raper, J.R. Raper, R.E. Miller // Mycologia. 1972. - Vol. 64, N 5. - P. 10881117.

96. Raper, J.R. Life cycles, basic patterns of sexuality, and sexual mechanisms / J.R. Raper // The fungi Acad, press. 1966. - Vol. 2. - P. 473-511.

97. Rowlands, R.T. Industrial fungal genetics and strain selection / R.T. Rowlands. The filamentous fungi. Vol. 4. London: Edward, 1983. - P. 346-372.

98. O.Sakamoto, R. Effect of carbon and nitrogen sources on submerged culture of edible fungi / R. Sakamoto, T. Nimi, S. Takahashi // J. Agr. Chem. Soc. Jap. 1978. - Vol. 52, №2. - P. 75-81.

99. Semerdzieva, M.T. Effect of U.V. lught on the basidiomycete Oudemansiel-la mucida / M.T. Semerdzieva, M. Blumaerova // Stud, biophys., -1973. -Vol. 36/37. -P.183-189.

100. Simchen, G. The determination of dikaryotic growth rate in the basidiomycete Schizophyllum commune: abiometrical analysis / G. Simchen, J.L. Jinks //Heredity. 1964. - Vol. 19, №4. -P.629-649.

101. Singer, R. The Agaricales in Modern Taxonomy / R. Singer // Vaduz: Cramer.-1975.-P. 912.

102. Sugimori, T. Studies on Basidiomycetes. I. Production of mycelium and fruit body from moncarbohydrate organic suganic substances / T. Sugimori, Y. Oyama, T. Omichi // J. Fermant. Techol. 1971. - Vol. 49, №5. - P. 435-446.

103. Teplikova, J. Vyskyt mykoparazitickych hub rodu Trichoderma v kultura'ch hlivy ustficne P. ostreatus / J. Teplikova, M. Dobra, M. Stanek, Vesely D. // Vestn. pest. - 1984. - Vol. 19, №1. - P. 114-116.

104. Trandaf, F. Suporturi noi de crestere si rezultatepreliminare la cultura ciupercii P. ostreatus in sera / F. Trandaf, V. Trandaf, R. Leoca // Inst. Cercet. Legume si Fructe. 1978. - Vol. 4, №9. - P. 205-212.