Влияние регуляторных генов ВИЧ-1 tat и nef на пролиферацию, морфологию и дифференцировку клеток грызунов in vitro

Шугурова, Ирина Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние регуляторных генов ВИЧ-1 tat и nef на пролиферацию, морфологию и дифференцировку клеток грызунов in vitro
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние регуляторных генов ВИЧ-1 tat и nef на пролиферацию, морфологию и дифференцировку клеток грызунов in vitro"

На правах рукописи

Шугурова Ирина Михайловна

ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ ГЕНОВ ВИЧ-1 tat И и*/НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ, МОРФОЛОГИЮ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ КЛЕТОК ГРЫЗУНОВ in vitro

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики соматических клеток Отдела вирусной и клеточной молекулярной генетики Института молекулярной генетики РАН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

кандидат биологических наук Гривенников Игорь Анатольевич

доктор биологических наук, профессор Гараев Мансур Мухаметович кандидат биологических наук, Арман Инга Павловна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Научно-исследовательский институт вирусных препаратов им. О.Г. Анджапаридзе РАМН

Защита состоится 2005 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 001.020.01 в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: г. Москва, ул. Гамалеи, Д. 16

Автореферат разослан 2005 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Н.П. Косякова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) - этиологический агент синдрома приобретенного иммунодефицита, названного чумой ХХ-ого века. По прогнозу, в 2005 году, в России число инфицированных ВИЧ достигнет 1 миллиона человек. Серьезность этой проблемы для всего мирового сообщества не вызывает сомнений.

Главным клиническим показателем СПИДа является резкое уменьшение количества С04+ Т-лимфоцитов. Белки оболочки ВИЧ связываются с молекулой СБ4, что в результате эндоцитоза приводит к проникновению вируса внутрь клеток субпопуляции Т1/Ъ.

Иммунный дефицит, возникающий в результате инфицирования ВИЧ, сопровождается развитием ряда сопутствующих патологических изменений: нейропатией, энтеропатией, нефропатией, миопатией, нарушением гематопоэза, опухолеобразованием. Частота таких изменений у ВИЧ-носителей возрастает в десятки и тысячи раз, по сравнению со средними показателями в популяции. Однако до сих пор детальные молекулярные механизмы их возникновения остаются неизвестными.

После обнаружения ВИЧ и вируса иммунодефицита обезьян (ВИО) были начаты исследования механизмов взаимодействия между этими вирусами и клетками. Особое внимание было уделено влиянию вирусов иммунодефицита и их отдельных генов на клеточный метаболизм и зависимость репликации вирусов от многих факторов клеток-хозяев (Свердлов, Тарантул, 1992).

1го вирусного генома в

информацию для

{одмсдк? тншч ь н н*п

БИГ. X "ИТ.'КА сди^р!5.)!*

эд>и>к

координированном взаимодействии его отдельных генов между собой и с геномом клетки-хозяина. Большое внимание в этих исследованиях было обращено на изучение роли регуляторных генов ВИЧ/ВИО, которые участвуют не только в регуляции экспрессии и репликации вирусного генома, но также оказывают существенное влияние на метаболизм клеток. Это делает возможным поиск более эффективных медикаментозных способов борьбы с клиническими проявлениями ВИЧ-инфекции.

Объектами наших исследований являлись два регуляторных гена ВИЧ-tat и nef Эти гены, по существовавшим к началу настоящей работы данным, имели разнонаправленное влияние на экспрессию и репликацию ВИЧ в клетках. Ген tat рассматривался как трансактиватор транскрипции ВИЧ, а ген nef как негативный фактор экспрессии вирусных генов и репликации вируса. При этом мало было известно относительно влияния этих генов на клеточные гены. Однако уже первые исследования по влиянию продуктов регуляторных генов на клеточный метаболизм показали, что существует тесная взаимосвязь между этими процессами. Постепенно накапливались данные, указывающие на плейотропные эффекты генов tat и nef на клетки, и их участие в развитии некоторых патологий, сопутствующих СПИДу.

Продукт гена tat представляет собой секретируемый фактор, который является трансактиватором транскрипции как вирусных, так и отдельных клеточных генов, влияет на рост и пролиферацию клеток, их миграцию, апоптоз и ангиогенез. Наряду с этим ген tat иногда оказывает и ингибирующее воздействие на экспрессию клеточных генов. Показана нейротоксичность белка Tat, которая проясняет молекулярные механизмы некоторых нейропатологий, сопровождающих СПИД. Важным было обнаружение у гена tat онкогенного потенциала, который, по-видимому, ассоциирован с развитием лимфом и саркомы Капоши у ВИЧ-инфицированных пациентов. В дальнейшем было определено, что многие из эффектов гена tat на клетки осуществляются в результате взаимодействия белка Tat с определенным набором клеточных белков.

Ген nef участвует в многочисленных процессах, происходящих в клетках, в частности, в негативной и в позитивной регуляции экспрессии генов ВИЧ/ВИО и клеточных генов, а также в репликации вируса. Кроме того был обнаружен эффект гена nef на эндоцитоз и ряд других процессов. На астроцитах человека был выявлен модулирующий эффект гена nef на уровень TNF-a, что проявлялось в задержке апоптоза (Robichaud, Paulin, 2000). В настоящее время ясно, что продукт гена nef также как и гена tat, взаимодействует в клетках с большим числом белков, участвующих в передаче клеточных сигналов и транспорте белковых продуктов (Benichou et al., 1994; Collette et ai, 1996).

Таким образом, имеющиеся данные указывают на полифункциональность генов nef и tat ВИЧ-1 на клетки. Однако в полной мере молекулярные механизмы влияния продуктов этих генов на процессы метаболизма в клетках и их роль в развитии различных патологий у ВИЧ-инфицированных пациентов остается неизвестной. Остается также много вопросов, связанных с ткане- и видо-специфическими эффектами продуктов этих двух регуляторных вирусных генов.

В связи с этим представляется важным проведение экспериментов по изучению влияния регуляторных генов ВИЧ на непермиссивные к вирусу нормальные, псевдонормальные и злокачественные клетки грызунов, что позволяет изучить общие эффекты воздействия на клетки, присущие отдельным вирусным генам.

Цель исследования

Изучение влияния регуляторных генов вируса иммунодефицита человека nef и tat на пролиферацию, морфологию и дифференцировку клеток грызунов для выяснения их роли в развитии различных патологических изменений у человека.

Задачи исследования

1. Изучение влияния продуктов регуляторных генов nef и tat ВИЧ на пролиферативную активность и морфологию различных клеточных культур крысы: псевдонормальная линия клеток (Rat-2) и линия опухолевых клеток феохромоцитомы крысы (PC 12).

2. Оценка онкогенного потенциала регуляторных генов nef и tat ВИЧ на культуре первичных фибробластов эмбрионов крысы, исследование кооперативного эффекта между генами nef и tat, а также онкогенами На-ras и с-туе.

3. Изучение влияния регуляторных генов nef и tat ВИЧ на пролиферацию и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши.

Научная новизна и практическая ценность работы

В результате проведенной работы впервые получены данные о кооперации между геном tat и известными онкогенами c-Ha-ra.ç и с-туе, а также регуляторным геном nef ВИЧ-1, в трансформирующем эффекте на культуры клеток крысы.

Впервые получены данные о том, что регуляторный ген nef ВИЧ-1 инициирует образование многоядерных синцитиальных клеток при трансфекции опухолевой линии феохромоцитомы крысы.

Проведенные эксперименты по изучению влияния регуляторных генов ВИЧ на модели непермиссивных к вирусу нормальных, псевдонормальных и злокачественных клеток грызунов позволили изучить общие эффекты воздействия на клетки, присущие отдельным вирусным генам, что в дальнейшем может быть использовано в разработке эффективных походов к терапии ВИЧ-инфицированных больных, созданию принципиально новых высокоспецифичных медицинских препаратов.

Изучение направленной тканеспецифической дифференцировки эмбриональных стволовых клеток может быть в перспективе использовано в клеточной терапии некоторых тяжелых патологий у человека.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены на Всероссийском симпозиуме «Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 1719 октября 2000 г.) и III Съезде Биохимического Общества РФ (Санкт-Петербург, 26 июня-1 июля 2002 г.). В завершенном виде результаты диссертационной работы были представлены на заседании Ученого совета Института молекулярной генетики РАН 22 ноября 2004 г. и Объединенном совещании отделов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского 23 декабря 2004 г.

Положения, выносимые на защиту

• Под влиянием регуляторного гена tat ВИЧ-1 увеличивается пролиферативная активность псевдонормальной линии клеток крысы (Rat-2), линии опухолевых клеток феохромоцитомы крысы (PC 12) и R1 линии эмбриональных стволовых клеток мыши.

• Регуляторный ген tat ВИЧ-1 вызывает морфологическую трансформацию псевдонормальной линии клеток крысы (Rat-2) и формирование фокусов трансформации в эмбриональных фибробластах крысы, что свидетельствует о его онкогенным потенциале.

• Существует кооперация между геном tat и известными онкогенами с-Ha-ras и с-туе, а также регуляторным геном nef ВИЧ-1, в трансформирующем эффекте на культуры клеток крысы.

• Под влиянием регуляторного гена nef ВИЧ-1 уменьшается пролиферативная активность псевдонормальной линии клеток крысы (Rat-2), линии опухолевых клеток феохромоцитомы крысы (PC 12) и линии R1 эмбриональных стволовых клеток мыши.

• Регуляторный ген nef ВИЧ-1 инициирует образование многоядерных синцитиальных клеток только при трансфекции опухолевой линии феохромоцитомы крысы (PC 12), что указывает на клеточно-специфическое действие этого гена.

• Регуляторные гены tat и пе/ВИЧ-1 оказывают влияние как на ранние стадии дифференцировки эмбриональных стволовых клеток (на уровне формирования эмбриоидных тел), так и на процесс спонтанной дифференцировки этих клеток в кардиомиоциты.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в российских и зарубежных журналах и тезисы двух докладов.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 101 странице машинописного текста, включает 5 таблиц и 18 рисунков. Библиография включает 125 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Культуры клеток. В экспериментах были использованы следующие культуры: псевдонормальная линия клеток фибробластов крысы Rat-2; первичные фибробласты крысы; клетки феохромоцитомы крысы линии PC 12; первичные эмбриональные фибробласты мыши; эмбриональные стволовые (ЭС) клетки мыши.

Плазмиды, использованные в экспериментах.

рМТга/ - рекомбинантная плазмида с геном tat под контролем промотора металлотиониенового гена мыши;

pTat-neo - рекомбинантная плазмида с геном устойчивости к неомицину пео и геном tat под контролем промотора цитомегаловируса;

pNef - рекомбинантная плазмида с геном nef под контролем промотора цитомегаловируса;

pNef-fs - контрольная плазмида, со сдвигом рамки в гене nef,

pSV2neo - рекомбинантная плазмида с геном устойчивости к неомицину пео

под контролем промотора цитомегаловируса;

pEJ6,6 - рекомбинантная плазмида с геном На-ras;

pSVc-mvc - рекомбинантная плазмида с геном с-тус;

pEGFP-Cl (Clontech №6084-1) - плазмида, содержащая ген, кодирующий «зеленый белок» под контролем промотора цитомегаловируса; Плазмида, содержащая ген ß-gal.

Для экспериментальной работы по стандартной методике выделяли от 100 до 500 мкг каждой плазмиды.

Перенос генов в клетки методом электропорации. Перенос генов в клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста, осуществляли с помощью электропорации на приборе СУМ4 (ИМБ РАН). Для каждой клеточной линии были экспериментально подобраны оптимальные параметры электропорации.

Клетки, трансфицированные различными плазмидами, содержащими ген устойчивости к неомицину, растили на селективной среде с добавлением антибиотика G418 в концентрации, подобранной в ходе эксперимента для каждой линии клеток. Эффективность переноса гена определяли по числу образовавшихся иео-резистентных колоний на 10-14 день культивирования. Колонии окрашивали метиленовым синим.

Получение поликлональных tat- и яе/-трансфицированных культур. Для трансфекции 1 млн клеток использовали суммарно 11 мкг плазмидной ДНК. Плазмиды pMT-iai (10 мкг) и pNef (10 мкг) котрансфицировали в соотношении 10:1 с плазмидой pSV2пео (1 мкг) для дальнейшей селекции Neo-котрансфектантов на среде, содержащей

антибиотик G418. Параллельно ставили контрольную трансфекцию клеток плазмидой pSV2/7<?<? (1 мкг/млн кл.). Клетки после электропорации высевали по 100 тыс (Rat-2), по 250 тыс (PC 12), по 1 млн (ЭС клетки) на чашки d=50 мм в стандартную культуральную среду. Селективный агент G418 добавляли через 24 ч до концентрации 1 мг/мл - для Rat-2, 0,5 мг/мл - для PC 12, 0,2 мг/мл - для ЭС клеток. Поликлональные культуры получали через 10-14 дней культивирования со сменой селективной среды каждые 3-4 дня путем снятия суммарного пула резистентных клонов. Эффективность переноса генов варьировала в диапазоне от 10"4 до 102.

Тестирование переноса генов. Для выявления наличия трансгена в клетках трансфицированных культур использовали ПЦР со следующими праймерами:

для гена tat: - 5 ' -G AGCC AGTAG ATCCTAGACTAGAGC-3 ' и 5'-TCTG ATGAGCTCTTCGTCGCTGTC-3 ',

для гена nef: - 5 ' -GGTGGC AAGTGGTC АА A AAGTAGTG-3' и 5'-А АТС AGGGAAGTAGCCTTGTGTGTG-3 '.

Изучение пролиферации клеток. Пролиферацию клеток Rat-2 оценивали по изменению их числа (подсчет проводили в камере Горяева) на 1-ый, 4-ый и 7-ой день после посева.

Пролиферацию клеток PC 12 оценивали по изменению их числа каждые двое суток в течение недели. Количество клеток определяли по показателям оптической плотности с помощью метода, использующего МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид^), который является витальным реагентом, имеющим тропность к митохондриям живых клеток. Для определения ростовых характеристик в каждом эксперименте клетки рассевали по 2 тыс на лунку в 96-луночные плашки, показатели снимали через 24 часа после посева, а затем каждые двое суток (3, 5, 7 день в культуре), путем инкубации с 0,1 мг/мл МТТ в течение 6 часов с

последующим 3-х часовым лизисом и определением оптической плотности при 600 нм. Полученные в результате эксперимента значения соотносили с числом клеток по предварительно построенному калибровочному графику. Калибровочный график, в котором показатели оптической плотности и соответствующее им число клеток находились в прямой зависимости, строили по 10 точкам. Индукцию экспрессии гена tat осуществляли добавлением ZnS04 до конечной концентрации 0,2 мМ в среду культивирования клеток при их посеве.

Оценку пролиферативной активности контрольных и трансфицированных линий ЭС клеток проводили цитохимическим методом с применением МТТ, как описано выше. Параллельно количество клеток в экспериментах оценивали с помощью их прямого подсчета под микроскопом в камере Горяева. Показатели снимали на 3-ий день после посева клеток.

Изучение дифференцировки клеток. Для выяснения возможного влияния гена tat на дифференцировку клеток PC 12 под действием NGF клетки рассевали по 2 тыс на лунку в 96-луночные плашки в среду, содержащую 1 % эмбриональной сыворотки телят и 100 нг/мл NGF (фактор роста нервов). На 4-й день в культуральную среду добавляли свежий NGF до концентрации 100 нг/мл. В качестве контроля использовали исходные нетрансфицированные клетки PC 12. Степень дифференцированности определяли на 7-ой день, визуально (под микроскопом, ув. хЮО) анализируя изменения морфологии клеток PC 12. Дифференцированные под действием NGF клетки РС12 имели нейрональный фенотип.

Цитохимический тест для выявления активности щелочной фосфатазы. ЭС клетки высевали на покровные стекла с блокированным митомицином слоем фидерных фибробластов. Через сутки клетки фиксировали охлажденным ацетоном (+4° С) в течение 1 мин, высушивали на воздухе, после чего инкубировали в растворе AS-B 1-фосфата и красителя

ВВ-синего в течение 1 ч при 37° С. Окрашенные препараты исследовали под микроскопом. Недифференцированными считали клетки, дающие положительную реакцию на активность щелочной фосфатазы.

Иммуноцитохимический анализ. Клетки, полученные из эмбриоидных тел с сокращающимися кластерами клеток, фиксировали 4%-ным формальдегидом в фосфатно-солевом буфере (PBS)b течение 15 мин. После 4х-кратной отмывки PBS, клетки преинкубировали в PBS с 0,1% Тритон Х-100 и 2-5% эмбриональной сыворотки телят в течение 5-15 мин. Для выявления кардиомиоцитов клетки инкубировали с мышиными моноклональными антителами к тропонину (любезно предоставлены проф. А.Г. Катрухой, кафедра биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова) для выявления кардиомиоцитов в течение ночи при температуре +4° С, затем обрабатывали биотинилированными козьими антителами против IgG мыши и проявляли с помощью FITC, конъюгированного с авидином (ИМТЕК, Россия). Для определения экспрессии «зеленого белка» окрашенные клетки детектировали с использованием флуоресцентного микроскопа Аксиоскоп-2 ("Карл Цейсс", Германия).

Статистическая обработка результатов экспериментов. Результаты обрабатывались с помощью программы Jandel Scientific SigmaPlot для Windows (Jandel Scientific), Statistica (StatSoft) и Origin для Windows. Ha графиках представлены средние значения с учетом стандартной ошибки. Определение достоверности различий проводилось с помощью теста multiway ANOVA. Достоверными считались отличия с р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Конструирование и анализ рекомбииантных плазмид с экспресснрующимися генами ВИЧ-1

pMTtof

Для конструирования рекомбинантной плазмиды с геном tat, экспрессирующимся в животных клетках, использовали плазмиду pRIP7 (любезно предоставлена S. Kim, США), содержащую провирус ВИЧ-1 (изолят НХВ-2). Первоначально из pRIP7 выделяли 2,7 т.п.н. EcoRl/BamHi-фрагмент, в котором локализованы два транслируемых экзона гена tat, и субклонировали его в векторе pBS (плазмида pBStar). Затем в pBStaf вставляли 1,75 т.п.н. /?аЛЮФа/-фрагмент из pRIP7, содержащий часть LTR ВИЧ-1 (участки R и U5) и фланкирующую его область геномной ДНК человека (плазмида pBS ¡tat LTR). После делении части фланкирующей области (удаление 1,4 т.п.н. Psil-фрагмента) в полученную плазмиду pTat вставляли 0,84 т.п.н. £,ссЖ1/5аЮ1-фрагмент, содержащий промотор металлотиониенового гена мыши. На рис. 1 приведена рестрикционная карта вставки в плазмиде pMTtoi, содержащей два транслируемых экзона гена tat ВИЧ-1 (темные прямоугольники), промотор металлотиониенового гена (МТ-1) мыши (светлый прямоугольник) и длинный концевой повтор (LTR) ВИЧ-1 в качестве терминатора транскрипции (подчеркнуто).

sä ei г

УТ »

ta!2

о, s

оэ i

,8>1 9 J

СО э;

I-

Рис. 1. Рестрикционная карта вставки в плазмиде pMTtei, содержащая два транслируемых экзона гена tat ВИЧ-1 (темные прямоугольники), промотор металлотиониенового гена (МТ-1) мыши (светлый прямоугольник) и длинный концевой повтор (LTR) ВИЧ-1 в качестве терминатора транскрипции (подчеркнуто).

pTat-иео

Для конструирования плазмиды, несущей одновременно гены tat и neo ВИЧ использовали SalI/PstI-фрагмент (с 5786 нуклеотида и до 3' конца провирусной ДНК, изолята НХВ2, в котором делетирован участок, несущий ген nef - BamHI/BglII-фрагмент с 8475 по 9558 нуклеотид). Sall/Pstl фрагмент, содержащий 2-ой и 3-ий экзоны гена tat (1-ый и 2-ой транслируемые экзоны соответственно) и собственный сигнал полиаденилирования, был клонирован после затупления концов в экспрессионном векторе pcDNA3 (Invitrogen) по сайту EcoRV. Полученная плазмида pTat-иео несет ген устойчивости к неомицину и содержит ген tat под промотором цитомегаловируса. Структура сконструированной плазмиды представлена на рис. 2.

PrCMV

Рис. 2. Схема рекомбинантной плазмиды PTat-neo. pNef и pNef-fs

Плазмида pNef, содержащая ген nef изолята НХВЗ ВИЧ-1 (типа-1) (HindIII/TaqI-фрагмент, с 8306 по 8998 нуклеотид) под промотором цитомегаловируса (CMV) в векторе pBC12/CMV, а также контрольная плазмида, со сдвигом рамки в гене nef по сайту Xhol в позиции 8475 (pNef-fs), была любезно предоставлена докт. Hamme (Howard Hughes Medical Institute).

Для подтверждения структуры плазмиды pNef провели комбинированный рестрикционный анализ. В качестве контроля использовали плазмиду РСЬ2. Были взяты рестриктазы для идентификации сайтов ХЬо1, Рей, ЕсоШ. Анализ проводили с индивидуальными рестриктазами и с их комбинациями - Х1тоТ+Рх1Л, РвИ+ЕсоМ. Рестриктная карта плазмиды pNef приведена на рис. 3.

I Ш&ш1с

.ее

щ Р ^ фланкирующая человеческая • ро|уА геномная ДНК

Рис. 3. Рестрикционная карта плазмиды

ЭФФЕКТЫ ГЕНА Ш ВИЧ-1 Морфология и пролиферативная активность Ш-трансфицироваиных псевдонормальных фибробластов крысы (линия 1Ы-2)

Поликлональную 1а1-трансфицированную культуру клеток получали с помощью электропорации клеток 1Ы-2 двумя плазмидами рМТ-1а1 и рБУ2пео (в соотношении 10:1) с последующей селекцией котрансформантов на среде, содержащей антибиотик С418. Известно, что при таком количественном соотношении плазмид, взятых для проведения трансфекции, более 80% получаемых резистентных клеток, экспрессирующих селективный ген пео одной плазмиды, содержат также последовательности неселективного гена другой плазмиды. Поликлональную культуру снимали через 2 недели культивирования на селективной среде в виде суммарного пула й418-резистентных 'лонов. Параллельно трансфицировали клетки

только плазмидой pSV2«eo и полученную поликлональную культуру использовали как контрольную. Присутствие гена tat в культурах G418-резистентных клеток тестировали с помощью метода ПЦР, который показал наличие этого гена в рМТ-Га£ф8У2пео-трансфицированной культуре и его отсутствие в контрольных р8У2яео-трансфектантах. В результате проведения реакции был получен апликон размером 170 пар нуклеотидов.

Трансфицированные геном tat клетки Rat-2 образовали колонии, которые окрашивали метиленовым синим через 14 дней роста. Как показал морфологический анализ, сформировавшиеся колонии были многослойными. Морфология клеток (их форма) существенно изменена по сравнению с контрольными (рис. 4а, б). Еще одним контролем могут служить аналогичные эксперименты с геном nef (см. далее). В Rat-2, трансфицированных этим геном, также не наблюдали никаких изменений в морфологии клеток, а

Рис. 4. Морфология нормальных (а) и трансфицированных 1еном tat (б) клеток Rat-2 (ув. 320 х).

Далее, для изучения влияния гена tat ВИЧ-1 на пролиферацию, клетки высевали на среде Игла с различным содержанием сыворотки - 1 % и 10 %. Анализ показал, что трансфицированные геном tat клетки характеризуются значительно более высокой пролиферативной активностью по сравнению с контрольными клетками. Наиболее существенные различия выявлялись на 4-й день при низкой концентрации сыворотки и в присутствии ZnS04, являющегося индуктором металлотионеинового промотора, контролирующего экспрессию гена tat в плазмиде рМТ-гя? (рис. 5).

10% FBS

- PI

10* F*» 1% FB8 ГПг-i-i . 1«FM 1 !

1-йдань 4>йдмь

Рис. 5. Динамика роста поликлональных культур клеток Rat-2 в стандартных условиях культивирования в присутствии индуктора металлотионеиново!о промотора (ионов цинка). 1 - контрольная культура (трансфекция pSV2neo), 2 - iai-трансфицированная культура (когрансфекция pMT-iaf/pSV2neo); (р < 0,05).

Онкогенный потенциал гена tat и кооперативный эффект

Для определения онкогенного потенциала гена tat проводили трансфекцию плазмидой pMTtoi первичных фибробластов крысы. Через 14 дней роста клетки окрашивали метиленовым синим. В результате проведенного анализа было обнаружено, что в популяции клеток, трансфицированных плазми/ой pMTtaf, образуются фокусы трансформации,

которых не было в контроле (табл. 1). Это свидетельствует об онкогенном потенциале гена tat.

При котрансфекции гена tat с плазмидой, содержащей ген Ha-ras, наблюдали достоверный (р < 0,05) кооперативный эффект между двумя генами. Эффективность фокусообразования при совместном действии генов tat и На-гал- была сопоставима с эффективностью фокусообразования при котрансформации клеток такими известными онкогенами, как с-туе и На-га\. Такой же достоверный кооперативный эффект на трансформирующую активность наблюдали у гена tat с геном с-туе и гена tat с геном nef.

Таблица 1. Эффективность образования фокусов трансформации при трансфекции первичных фибробластов эмбрионов крысы различными плазмидами*

Плазмиды, используемые для трансфекции Число фокусов на 1,5x10s клеток Эффективность трансформации р, ошибка

контроль - трансфекция без плазмиды не формируются 0

рМТ tat 6,5 ± 1,0 4,3 х 10'' <0,05

pMTtaf + pNef 9,3 ± 2,4 6,2 х 105 <0,05

pMTiai + pEJ6,6 13,2 ±2,2 8,8 х 105 <0,05

pMTiai + pSVc-mvr 9,0 ± 2,6 6,0 х 10"5 <0,05

pNef + pEJ6,6 не формируются 0 <0,05

pNet не формируются 0 <0,05

pEJ6,6 + pSVc-myc 15,1 ±1,5 1,0 х 10"4 <0,05

* Среднее из трех опытов

Морфология и пролиферативная активность клеток феохромоцитомы крысы (линия РС12), трансфицированных геном tat

Поликлонапьную iai-трансфицированную культуру клеток PC 12 получали с помощью электропорации плазмидами pMT-fai и pSV2пео (в соотношении 10:1) с последующей селекцией котрансформантов на среде, содержащей антибиотик G418.

После трансфекции клетки высевали на среде RPMI с 15% сыворотки. G418-резистентные клетки, трансфицированные геном tat, и контрольные культуры клеток не проявляли видимых морфологических различий. Вместе с тем, как показано на рис. 6, трансфицированные геном tat клетки характеризовались значительно более высокой пролиферативной активностью по сравнению с контрольными клетками. Наиболее существенное различие в росте клеток (почти двукратное) выявлялось на 5-ый и 7-ой дни в присутствии ZnS04, индуктора металлотионеинового промотора, контролирующего экспрессию гена tat в плазмиде рМТ-tat.

Рис. 6. Динамика роста поликлональных культур клеток РС12 в стандартных условиях культивирования 1 - контрольная культура (трансфекция р8У2пео),

2 - 1а1-трансфицированная культура (котрансфекция рМТ-1а1/рБУ2пео),

3 - 1а1-трансфицированная культура в присутствии индуктора металлотионеинового промотора (ионов цинка); (р < 0,05).

Влияние генов tat и nef на пролиферацию и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши

В результате проведения трансфекции и последующей селекции ЭС клеток R1 были получены пи различные линии клеток: es-пеок (трансфекция

ео

плазмидой рБУ2пео) контроль, ея-Ш (трансфекция плазмидой рТа1 пео) и еч-пе/ (трансфекция плазмидами pNef и рБУ2пео). У всех трех полученных линий ЭС клеток не наблюдалось никаких изменений в морфологии. Одним из маркеров плюрипотентного статуса ЭС клеток млекопитающих является метод выявления активности щелочной фосфатазы. Все полученные линии клеток имели одинаковую положительную реакцию по активности этого фермента (рис. 7).

Рис 7 Выявление активности щелочной фосфатазы в ЭС KJieiKax (окрашены колонии, сформированные ЭС клетками, неокрашены клетки фидерного слоя, ув. х 200).

Различия между линиями трансфицированных клеток обнаружены при изучении их пролиферативной активности. Пролиферация ЭС клеток линии es-tat выше, а пролиферация ЭС клеток линии es-nef ниже по сравнению с контрольными ЭС клетками линии es-пеок (рис. 8). Использование для трансфекции плазмиды, содержащей ген tat под контролем металлотеининового промотора, приводило к аналогичным результатам.

1400 I_I - es-neok

— - es-tat !

■H - es-nef i

1200 -----

§ 1000

к о

ф 800

о 600

400

200

1 -й день

2-й день

Рис. 8. Влияние регуляторных генов tat и ле/ВИЧ-1 на пролиферацию ЭС клеток линии R1 (р<0,05 - es -tat и es-пеок\ р<0,01 - es-nef и es-neok).

Дифференцировка трансфицированных ЭС клеток

На следующем этапе исследовали влияние генов tat и nef на процессы спонтанной дифференцировки ЭС клеток.

Анализ спонтанной дифференцировки ЭС клеток линии R1 в отсутствии фидерного слоя фибробластов показал, что на 2-3 сутки после пересева клеток формируются эмбриоидные тела. При переносе эмбриоидных тел на подложку с желатиной, они прикрепляются к субстрату, происходит миграция клеток из эмбриоидного тела по поверхности чашки и их дифференцировка в различные типы клеток (рис. 9).

Рис. 9. Эмбриоидные тела, 3-4 сутки после прикрепления к желатиновой подложке, а -эмбриоидное тело, б - миграция клеток из эмбриоидного тела, увел.: об. х5, ок. хЮ.

В результате предварительных методических экспериментов показано, что эффективность образования эмбриоидных тел в клетках R1 зависит от количества клеток, высеваемых на поверхность чашки без фидерного слоя, способных образовывать эмбриоидные тела; от времени культивирования эмбриоидных тел до начала дифференцировки. При проведении экспериментов по спонтанной дифференцировке в клетках линии R1, на 4-5 сутки после прикрепления эмбриоидных тел к подложке, было обнаружено появление участков спонтанно сокращающихся клеток-кардиомиоцитов, что было подтверждено результатами иммуноцитохимического анализа с использованием антител к тропонину. Время развития кардиомиоцитов in vitro варьировало от 7 до 20 суток. Частота пульсации этих клеток также менялась в зависимости от времени после посева эмбриоидных тел. В первые сутки частота не превышала 60 сокращений в минуту, а затем она снижалась.

При изучении возможного влияния генов tat и nef m дифференцировку ЭС клеток проводили эксперименты, где определяли следующие показатели для всех трех линий клеток:

1) время, необходимое для формирования эмбриоидного тела;

2) количество сформированных эмбриоидных тел на 3-й сутки после посева клеток;

3) размер эмбриоидного тела;

4) появление клеток с различной тканеспецифичностью (в наших экспериментах оценивалась дифференцировка ЭС клеток в кардиомиоциты).

В результате проведенных экспериментов было показано, что время для образования эмбриоидных тел одинаково для ЭС клеток всех трех линий (es-пеок, es-tat, es-nef). Значительных различий в размерах эмбриоидных тел для этих линий также не обнаружено. Однако количество эмбриоидных тел, сформированных клетками разных линий, несколько различалось: для линий es-tat оно было меньше, чем для линии es-пеок, а в случае линии es-nef, наоборот, наблюдалось увеличение количества эмбриоидных тел по сравнению с клетками линии es-пеок (табл. 2). На 6-й день после прикрепления эмбриоидных тел к подложке в ЭС клетках линий es-пеок, estai, es-nef • начинали появляться участки сокращающихся клеток-кардиомиоцитов. Количество эмбриоидных тел с сокращающимися кардиомиоцитами увеличивалось в клетках линии es-пеок и es-nef в период проведения эксперимента, а для клеток линии es-fa? такого увеличения не наблюдалось. Процент эмбриоидных тел с сокращающимися кардиомиоцитами был самый высокий для клеток линии es-nef, в клетках же линии es-tat он существенно снижался по сравнению с контрольными клетками (табл. 2).

Таблица 2. Влияние регуляторных генов ВИЧ-1 tat и nef на дифференцировку в кардиомиоциты клеток линии R1.

Линия клеток Число эмбриоидных тел на 3 день после посева 1000 кл/лунку Число кластеров с сокращающимися кардиомиоцитами на 200 эмбриоидных тел

es-пеок (контроль) 10,00±0,80* 5,0

es-tat 6,27±0,33** 3,0

es-nef 14,05±1,80*** 11,0

*р<0,01 (es-tat и es-пеок) **р<0,05 (es-nef и es-neok) ***р<0,01 (es-tai и es-nef)

Результаты представленных экспериментов позволяют заключить, что под влиянием гена tat наблюдается тенденция повышения пролиферативной активности ЭС клеток мыши и подавление ее под влиянием гена nef что согласуется с данными, полученными на клетках крысы двух линий: псевдонормальных клетках Rat-2 и клетках феохромоцитомы PC 12. Полученные данные также позволяют предположить, что регуляторные гены ВИЧ-1 tat и nef могут оказывать влияние как на ранние стадии дифференцировки ЭС клеток (на уровне эмбриоидных тел), так и на процесс дифференцировки этих клеток в кардиомиоциты. Ген tat подавляет образование эмбриоидных тел и препятствует их спонтанной дифференцировке в кардиомиоциты. Ген nef имеет противоположный эффект: способствует образованию эмбриоидных тел и увеличивает долю сокращающихся кардиомиоцитов.

Результаты проведенных экспериментов показали, что повышение пролиферации клеток препятствует их дифференцировке, тогда как понижение пролиферации способствует некоторым дифференцировочным процессам.

В заключение необходимо отметить, что имеющиеся в настоящее время факты подчеркивают полифункциональность продуктов генов tat и nef и позволяют заключить, что эффекты этих генов могут существенно отличаться в разных типах клеток, т.е. являются клеточно-специфичными.

Выводы

1. Регуляторный ген tat ВИЧ-1 увеличивает пролиферативную активность псевдонормальной линии клеток крысы (Rat-2), линии опухолевых клеток феохромоцитомы крысы (РС12) и R1 линии эмбриональных стволовых клеток мыши.

2. Регуляторный ген tat ВИЧ-1 обладает онкогенным потенциалом. Он вызывает морфологическую трансформацию псевдонормальной линии клеток крысы (Rat-2) и формирование фокусов трансформации в эмбриональных фибробластах крысы.

3. Существует кооперация между геном tat и известными онкогенами с-На-ras и с-туе, а также регуляторным геном nef ВИЧ-1, в трансформирующем эффекте на культуры клеток крысы.

4. Регуляторный ген nef ВИЧ-1 уменьшает пролиферативную активность псевдонормальной линии клеток крысы (Rat-2), линии опухолевых клеток феохромоцитомы крысы (PC 12) и линии эмбриональных стволовых клеток мыши.

5. Регуляторный ген nef ВИЧ-1 инициирует образование многоядерных синцитиальных клеток только при трансфекции опухолевой линии феохромоцитомы крысы (PC 12), что указывает на клеточно-специфическое действие этого гена.

6. Регуляторные гены tat и nef ВИЧ-1 оказывают влияние как на ранние стадии дифференцировки эмбриональных стволовых клеток (на уровне формирования эмбриоидных тел), так и на процесс спонтанной дифференцировки этих клеток в кардиомиоциты.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Шугурова И.М., Андреева JT.E., Дубовая В.И., Зуева J1.A., Серова И.А., Тарантул В.З. Влияние генов nef и tat вируса иммунодефицита человека типа 1 на клетки грызунов in vivo и in vitro. Генетика, 1997, 33,1202-1208.

2. Шугурова И.M., Бобрышева И.В., Гривенников И.А., Тарантул В.З. Эффекты генов nef и tat вируса иммунодефицита человека типа 1 на клетки феохромоцитомы крысы РС12. Генетика, 2000, 36, 1140-1146.

3. Шугурова И.М., Мануйлова Е.С., Гривенников И.А., Тарантул В.З. Влияние генов tat и nef вируса иммунодефицита человека типа 1 на эмбриональные стволовые клетки мыши в культуре. Цитология, 2001, 43, 415-416. (Всероссийский симпозиум «Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 17-19 октября 2000 г.).

4. Shugurova I, Bobrisheva I, Surkova I, Grivennikov I, Tarantul V. The expression of HIV-1 tat and nef genes induces cell-specific changes in growth properties and morphology of different types of rat cells. Cell Prolif. 2002 Aug; 35(4): 237-245.

5. E.C. Мануйлова, E.JT. Арсеньева, Н.Н.Хайдарова, И.М. Шугурова, И.А. Гривенников, В.З. Тарантул. Влияние регуляторных генов (tat, nef) вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) на пролиферацию и дифферепцировку эмбриональных стволовых клеток мыши. Тезисы научных докладов III съезда Биохимического Общества, (Санкт-Петербург, 26 июня -1 июля 2002 г.) 407.

6. Мануйлова Е.С., Арсеньева E.JT., Хайдарова Н.В., Шугурова И.М., Горностаева С.Н., Иноземцева JI.C., Катруха А.И., Гривенников И.А., Тарантул В.З. Влияние регуляторных генов (tat, nef) вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) на пролиферацию и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши. Онтогенез, 2003, 34, 204-210.

) J

i ¡

1 >1

РНБ Русский фонд

2005-4 47939

/ *

/ С Ь- ь

[ I" ■ 2293

' ..Ш2МГ ' '

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шугурова, Ирина Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫИ

1.1. Вирус иммунодефицита человека

1.2. Геном ВИЧ

1.3. Эффекты гена tat2Л

1.4. Эффекты гена nef

1.4.1. Генные мишени Nef в Т-клетках

1.5. Эмбриональные стволовые клетки в изучении функции генов в процессах дифференцировки и развития

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Культуры клеток

2.1.1. Псевдонормальная линия клеток фибробластов крысы Rat

2.1.2. Первичные фибробласты крысы

2.1.3. Глиальные клетки

2.1.4. Клетки феохромоцитомы крысы PC

2.1.5. Первичные эмбриональные фибробласты мыши

2.1.6. Эмбриональные стволовые клетки

2.2. Плазмиды, использованные в экспериментах4J

2.3. Перенос генов в клетки методом электропорации

2.4. Получение поликлональных tat- и nef-трансфицированных культур

2.5. Тестирование переноса генов

2.6. Изучение пролиферации клеток

2.7.Изучение дифференцировки клеток

2.8. Цитохимический тест для выявления активности щелочной фосфатазы

2.9. Иммуноцитохимический анализ

2.10. Статистическая обработка результатов экспериментов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Конструирование и анализ рекомбинантных плазмид с экс дрессирующимися генами ВИЧ

3.1.2. рМТtat

3.1.3. pTat-neo

3.1.4. pNef и pNef-fs

3.2. Эффекты гена tat ВИЧ

3.2.1. Морфология и пролиферативная активность fatf-трансфицированных псевдонормальных фибробластов крысы (линия Rat-2)

3.2.2. Онкогенный потенциал гена tat и кооперативный эффект

3.2.3. Морфология и пролиферативная активность клеток феохромоцитомы крысы (линия PC 12), трансфицированных геном tat

3.2.3. Нейрональная дифференцировка и пролиферативная активность tat-трансфицированных клеток феохромоцитомы крысы в присутствии фактора роста нервов (NGF)

3.3. Эффекты гена nefRWl

3.3.1. Морфология ие^трансфицированных первичных фибробластов эмбрионов крысы

3.3.2. Морфология и пролиферативная активность клеток феохромоцитомы крысы (линия PC 12), трансфицированных геном nef

3.4. Влияние генов tat и nef на пролиферацию и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши

3.4.1. Оценка активности промотора CMV

3.4.2. Пролиферативная активность генетически модифицированных линий ЭС клеток

3.4.3. Дифференцировка трансфицированных ЭС клеток

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние регуляторных генов ВИЧ-1 tat и nef на пролиферацию, морфологию и дифференцировку клеток грызунов in vitro"

Актуальность проблемы

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) - этиологический агент синдрома приобретенного иммунодефицита, названного чумой ХХ-ого века. По данным ООН, на начало 2004 года в мире зарегистрировано 40 миллионов ВИЧ-инфицированных, из них 2,5 - дети в возрасте до 15 лет.

Только в 2000 г. СПИД стал причиной трех миллионов смертей, а общее количество погибших от заболевания достигло к этому моменту 21,8 миллиона. В России в 1997 году выявлено более 3500 ВИЧ-инфицированных, что в 1,5 раза больше, чем за предыдущие 10 лет. По состоянию на начало 2005 года число официально зарегистрированных инфицированных составило в нашей стране около 350 000 человек, однако по подсчетам их истинное количество значительно больше - 600-700 тысяч, т.е. носителями ВИЧ являются уже около 1 % населения России. По прогнозу, в 2005 г. число инфицированных может быть более 1 миллиона.

В первые 10 лет эпидемия ВИЧ-инфекции распространялась, в основном, среди молодых мужчин, однако теперь она представляет серьезную проблему и здоровью молодых женщин. В США СПИД уже занял 4-ое месте среди наиболее часто встречающихся причин смерти женщин в возрасте 15-45 лет, а в некоторых крупных городах вышел на 3-е место после рака и несчастных случаев. Серьезность этой проблемы для всего мирового сообщества не вызывает сомнений.

Главным клиническим показателем СПИДа является резкое уменьшение количества CD4+ Т-лимфоцитов. Белки оболочки ВИЧ связываются с молекулой CD4 и СХСЯ4-корецептором, что в результате эндоцитоза приводит к проникновению вируса внутрь клеток субпопуляции T4/h.

Иммунный дефицит, возникающий в результате инфицирования ВИЧ, сопровождается развитием ряда сопутствующих патологий: нейропатией, энтеропатией, нефропатией, миопатией, нарушением гематопоэза, опухолеобразованием. Частота такого рода патологий у ВИЧ-носителей возрастает в десятки и тысячи раз, по сравнению со средними показателями в популяции. Однако до сих пор детальные молекулярные механизмы возникновения этих и других патологий остаются неизвестными.

В первых же экспериментах было показано, что в ряде патологических процессов, сопровождающих ВИЧ-инфекцию, могут участвовать продукты как структурных, так и регуляторных генов ВИЧ/ВИО. Глубокое и всестороннее изучение функций вирусных генов, которое можно назвать этапом функциональной анатомии генома вируса, позволит получить информацию для следующего этапа (синтеза) - исследования функций целого вирусного генома в координированном взаимодействии его отдельных генов между собой и с геномом клетки-хозяина. Большое внимание в этих исследованиях было обращено на изучение роли регуляторных генов ВИЧ/ВИО, которые участвуют не только в регуляции экспрессии и репликации вирусного генома, но также оказывают существенное влияние на метаболизм клеток. Это делает возможным поиск более эффективных медикаментозных способов борьбы с клиническими проявлениями ВИЧ-инфекции.

Объектами наших исследований являлись два регуляторных гена ВИЧ-tat и nef. Эти гены, по существовавшим к началу настоящей работы данным, имели разнонаправленное влияние на экспрессию и репликацию ВИЧ в клетках. Ген tat рассматривался как трансактиватор транскрипции ВИЧ, а ген nef как негативный фактор экспрессии вирусных генов и репликации вируса. При этом мало было известно относительно влияния этих генов на жизнедеятельность клетки. Однако уже первые исследования по влиянию продуктов регуляторных генов на клеточный метаболизм показали, что существует тесная взаимосвязь между этими процессами. Постепенно накапливались данные, указывающие на плейотропные эффекты генов tat и nef на клетки, и их участие в развитии некоторых патологий, сопутствующих СПИДу.

Ген nef участвует в многочисленных процессах, происходящих в клетках, в частности в негативной и в позитивной регуляции экспрессии клеточных генов, а также в репликации вируса. Кроме того был обнаружен эффект гена nef на эндоцитоз и ряд других процессов. На астроцитах человека был выявлен модулирующий эффект гена nef на уровень TNF-a, что проявлялось в задержке апоптоза (Robichaud\ Poulin, 2000). В настоящее время ясно, что продукт гена nef также как и гена tat, взаимодействует в клетках с большим числом белков, участвующих в передаче клеточных сигналов и транспорте белковых продуктов {Benichou et al., 1994; Collette et al., 1996).

Таким образом, имеющиеся данные указывают на полифункциональность генов nef и tat ВИЧ-1 на клетки. Однако в полной мере молекулярные механизмы влияния продуктов этих генов на процессы метаболизма в клетках и их роль в развитии различных патологий у ВИЧ-инфицированных пациентов остается неизвестной. Остается также много вопросов, связанных с видо-специфическими эффектами продуктов этих двух регуляторных вирусных генов.

Нами проведены эксперименты по изучению влияния регуляторных генов ВИЧ на непермиссивные к вирусу нормальные, псевдонормальные и злокачественные клетки грызунов. Это позволило изучить общие эффекты воздействия на клетки, присущие отдельным продуктам вирусных генов, что в дальнейшем может быть использовано в разработке эффективных подходов к терапии ВИЧ-инфицированных больных, созданию принципиально новых высокоспецифичных медицинских препаратов.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение влияния регуляторных генов вируса иммунодефицита человека nef и tat на пролиферацию, морфологию и дифференцировку клеток грызунов для выяснения их роли в развитии различных патологий у человека. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1 .Изучение влияния продуктов регуляторных генов nef и tat ВИЧ на пролиферативную активность и морфологию различных клеточных культур крысы: псевдонормальная линия клеток (Rat-2) и линия опухолевых клеток феохромоцитомы крысы (PC 12).

2.Оценка онкогенного потенциала регуляторных генов nef и tat ВИЧ на культуре первичных фибробластов эмбрионов крысы, исследование кооперативного эффекта между генами nef и tat, а также онкогенами Ha-ras и с-тус.

3.Изучение влияния регуляторных генов nef и tat ВИЧ на пролиферацию и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши.

Научная новизна и практическая ценность работы

В результате проведенной работы впервые получены данные о кооперации между геном tat и известными онкогенами c-Ha-ras и с-туе, а также регуляторным геном nef ВИЧ-1, в трансформирующем эффекте на культуры клеток крысы.

Положения, выносимые на защиту

• Существует кооперация между геном tat и известными онкогенами с-На-гау и с-туе, а также регуляторным геном nef ВИЧ-1, в трансформирующем эффекте на культуры клеток крысы.

• Регуляторные гены tat и nef ВИЧ-1 оказывают влияние как на ранние стадии дифференцировки эмбриональных стволовых клеток (на уровне формирования эмбриоидных тел), так и на процесс спонтанной дифференцировки этих клеток в кардиомиоциты.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Шугурова, Ирина Михайловна

ВЫВОДЫ

1. Регуляторный ген tat ВИЧ-1 увеличивает пролиферативную активность псевдонормальной линии клеток крысы (Rat-2), линии опухолевых клеток феохромоцитомы крысы (PC 12) и R1 линии эмбриональных стволовых клеток мыши.

2. Регуляторный Ген tat ВИЧ-1 обладает онкогенным потенциалом. Он вызывает морфологическую трансформацию псевдонормальной линии клеток крысы (Rat-2) и формирование фокусов трансформации в эмбриональных фибробластах крысы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шугурова, Ирина Михайловна, Москва

1. Свердлов Е.Д., Тарантул В.З. Структурно-функциональная анатомия и вариабельность генома вирусов иммунодефицита приматов. Итоги науки и техники. Сер. Иммунология. М.: ВИНИТИ. 1992. - С. 3-82.

2. Karn J. Control of human immunodeficiency virus replication by the tat, rev, nef and protease genes // Curr. Opin. Immunol. 1991. - V. 3, № 4. - P. 526536.

3. Horwitz M.S., Boyce-Jacino M.T., Faras A.J. Novel human endogenous sequences related to human immunodeficiency virus type 1 // J. Virol. 1992. -V. 66.-P. 2170-2179.

4. Lotz М., Kekow J., Cronin М.Т. et al. Induction of transforming growth factor-beta by HIV-1 tat: a noncytopathic pathway of immunodeficiency in HIV infection // FASEB J. 1990. - V. 4. - P. A2014.

5. Sastry K.J., Reddy R.H.R., Pandita R. et al. HIV-1 tat gene induces tumor necrosis factor-beta (lymphotoxin) in a human B-lymphoblastoid cell line // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. - P. 20091-20093.

6. Buonaguro L., Barillari G., Chang H.K. et al. Effect of the human immunodeficiency virus type 1 Tat protein on the expression of inflammatory cytokines // J. Virol. 1992. - V. 66. - P. 7159-7167.

7. Rautonen J., Rautonen N., Martin N.L., Wara D.W. HIV type 1 Tat protein induced immunoglobulin and interleukin 6 synthesis by uninfected peripheral blood mononuclear cells // AIDS Res. Hum. Retrovir. 1994. - V. 10. - P. 781-785.

8. Шугурова И.М., Андреева Л.Е., Дубовая В.И. , Зуева JI.A., Серова И.А., Тарантул В.З. Влияние генов nef и tat вируса иммунодефицита человека типа 1 на клетки грызунов in vivo и in vitro // Генетика. — 1997. — Т. 33. С. 1202-1208.

9. Vogel J., Hindrichs S.H., Reynolds R.K. et al. The HIV tat gene induces dermal lesions resembling Kaposi's sarcoma in transgenic mice // Nature. -1988.-V. 335.-P. 606-611.

10. Corallini A., Altavilla G., Pozzi L. et al. Systemic expression of HIV-1 tat gene in transgenic mice induced endothelial proliferation and tumors of different histo types // Cancer Res. 1993. V. 53. - P. 5569-5575.

11. Campioni D., Corralini A., Zaula G. et al. HIV type 1 extracellular Tat protein stimulates growth and protects cells of BK virus/tat transgenic mice from apoptosis // AIDS Res. Hum. Retrovir. 1995. - V. 11. № 9. - C. 10391048.

12. Karn J. Tackling Tat. J Mol Biol. 1999. - Oct 22. -293(2). - P.235-54. Review.

13. Ensoli В., Barillari G., Salahuddin S.Z. et al. Tat protein of HIV-1 stimulates growth of cells derived from Kaposi's sarcoma lesions of AIDS patients // Nature. 1990. - V. 345. - P.84-86.

14. Milani D., Mazzoni M., Zauli G. et al. HIV-1 Tat induces tyrosine phosphorytion of pl25FAK and its association with phosphoinositide 3-kinase in PC12 cells // AIDS. 1998. - V. 12. - P. 1275-1284.

15. Lotz M., Clark-Lewis I., Ganu V. HIV-1 transactivator protein Tat induces proliferation and TGF beta expression in human articular chondrocytes // J. Cell. Biol. 1994. - V. 124. - P. 365-371.

16. Patki A.H., Lederman M.M. HIV-1 Tat protein and its inhibitor Ro 24-7429 inhibit lymphocyte proliferation and induce apoptosis in peripheral blood mononuclear cells from healthy donors // Cell. Immunol. 1996. - V. 169. - P. 40^6.

17. Shi В., Ranina J., Lorenzo A. et al. Neuronal apoptosis induced by HIV-1 Tat protein and TNF-alpha: potentiation of neurotoxicity mediated by oxidative stress and implications for HIV-1 dementia // J. Neurovirol. 1998. - V. 4. - P. 281-290.

18. New D.R., Maggirwar S.B., Epstein L.G. et al. HIV-1 Tat induces neuronal death via tumor necrosis factor-alpha and activation of non-N-methyl-D-aspartate receptors by a NF-kappaB-independent mechanism // J. Biol. Chem.

19. Zauli G., Gibellini D., Milani D. et al. Human immunodeficiency virus type 1 Tat protein protects lymphoid, epithelial, and neuronal cell lines from death apoptosis // Cancer Res. 1993. - V. 53. - P. 4481-4485.

20. Maggirwar S.B., Tong N., Ramirez S., Gelbard H.A., Dewhurst S. HIV-1 Tat-mediated activation of glycogen synthase kinase-3beta contributes to Tat

21. Romano G., Kasten M., De Falco G., Micheli P., Khalili K., Giordano A. Regulatory functions of Cdk9 and of cyclin T1 in HIV tat transactivation pathway gene expression // J. Cell Biochem. 1999. - V. 75. - P. 357-368.

22. Srivastava D.K., Tendler C.L., Milani D., English M.A., Licht J.D., Wilson S.H. The HIV-1 transactivator protein Tat is a potent inducer of the human DNA repair enzyme beta-polymerase // AIDS 2001. - V. 15. - P. 433^140.

23. Teitell M., Damore M.A., Sulur G.G., Turner D.E., Stern M.-H., Said J.W., Denny C.T., Wall R. TCL1 oncogene expression in AIDS-related lymphomas and lymphoid tissues // Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. - V. 96. - P. 9809-9814.

24. Arora V.K., Fredericksen B.L., Garcia J.V. Nef: agent of cell subversion. // Microbes Infect. 2002 Feb. - V. 4, № 2. - P. 189-199.

25. Wei B.L., Arora V.K., Foster J.L., Sodora D.L., Garcia J.V. In vivo analysis of Nef function // Curr HIV Res. 2003 Jan. - V. 1, № 1. - P. 41-50.

26. Jamieson B.D., Aldrovandi G.M., Planelles V. et al. Requirement of human immunodeficiency virus type 1 nef for in vivo replication and pathogenicity // J. Virol. 1994. - V. 68. - P. 3478-3485.

27. Kestler H.W., Ringler D.J., Mori K. et al. Importance of the nef gene for maintenance of high virus loads and for development of AIDS // Cell. 1991. — V. 65.-P. 651-662.

28. Fackler O.T., Baur A.S. Live and let die: Nef functions beyond HIV replication // Immunity. 2002 Apr. V. 16, № 4. - P. 493-497.

29. Arendt C.W., Littman D.R. HIV: master of the host cell // Genome Biology -2001.-V. 2(11). Reviews 1030.1-1030.4.

30. Schwariz 0., Marechal V., Le Gall S. et al. Endocytosis of major histocompatibility complex class I molecules is induced by the HIV-1 Nef protein // Nature Medicine 1996. - V. 2. - P. 338-342.

31. Levesque K., Finzi A., Binette J., Cohen E.A. Role of CD4 receptor down-regulation during HIV-l infection // Curr HIV Res. 2004 Jan. - V. 2, № 1. -P. 51-59.

32. James C.O., Huang M.B., Khan M., Garcia-Barrio M., Powell M.D., Bond V.C. Extracellular Nef protein targets CD4+ T cells for apoptosis by interacting with CXCR4 surface receptors // J. Virol. 2004 Mar. - V. 78, № 6. - P. 30993109.

33. Simmons A., Aluvihare V., McMichael A. Nef triggers a transcriptional program in T cells imitating single-signal T cell activation and inducing HIV virulence mediators // Immunity. 2001 Jun. - V. 14, № 6. - P. 763-777.

34. Meylan P.R., Baumgartner M., Ciuffi A. et al. The nef gene controls syncytium formation in primary human lymphocytes and macrophages infected by HIV type 1 // AIDS Res. Hum. Retrovir. 1998. - V. 14. - P. 1531-1542.

35. Мудрик H.H., Андреева JI.E., Дубовая В.И. и др. Эффект гена nef ВИЧ-1 на соотношение клеток в костном мозге и периферической крови у трансгенных животных // Докл. Акад. наук. 1992. - Т. 325. - № 3. - С. 606-608.

36. Skowronski J., Parks D., Mariani R. Altered T cell activation and development in transgenic mice expressing the HIV-1 nef gene // EMBO J. -1993.-V. 12.-P. 703-713.

37. Piguet V., Trono D. The Nef protein of primate lentiviruses // Rev Med Virol. 1999. - Apr-Jun. - 9(2). - P. 111-20. Review.

38. Graziani A., Galimi F., Medico E. et al. The HIV-1 Nef protein interferes with phosphatidylinosol 3-kinase activation 1 //J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. -P. 6590-6593.

39. Greenwey A., Azad A., McPhee D. Human immunodeficiency virus type 1 Nef protein inhibits activation pathways in peripheral blood mononuclear cells and T-cell lines // Virol. 1995. - V. 69. - P. 1842-1850.

40. Wang J.K., Kiyokawa E., Verdin E., Trono D. The Nef protein of HIV-1 associates with rafts and primes T cells for activation // Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jan 4. - V. 97, № 1. - P. 394-399.

41. Krautkramer E., Giese S.I., Gasteier J.E., Muranyi W., Fackler O.T. Human Immunodeficiency Virus Type 1 Nef Activates p21-Activated Kinase via Recruitment into Lipid Rafts // J. Virol. 2004 Apr. - V. 78, № 8. - P. 40854097.

42. Tobiume M., Lineberger J.E., Lundquist C.A., Miller M.D., Aiken C. Nef does not affect the efficiency of human immunodeficiency virus type 1 fusion with target cells // J. Virol. 2003 Oct. - V. 77, № 19. - P. 10645-10650.

43. Swingler et al. HIV-1 Nef intersects the macrophage CD40L signalling pathway to promote resting-cell infection Nature. 2003. - V. 424. - P. 213219.

44. Scowronski J., Parks D., Mariani R. Altered T cell activation and development in transgenic mice expressing the HIV-1 nef gene // EMBO J. -1993.-V. 12.-P. 703-713.

45. Pennington et al. Genes and Function. 1997. - V. 1. - P. 321-335.

46. Wu Y., Marsh J.W. Selective transcription and modulation of resting T cell activity by preintegrated HIV DNA // Science 2001 Aug. - V. 24, № 293 (5534).-P. 1503-1506.

47. Adriaansen H.J., Osman C., Van Dongen J.J.M. et al. Immunological marker analysis of mitogen-induced proliferating lymphocytes using BrdU incorporation or screening of metaphases // Scand. J. Immunol. 1990. - V. 32. -P. 687-694.

48. Quaranta M.G., Camponeschi В., Straface E., Malorni W., Viora M. Induction of interleukin-15 production by HIV-1 Nef protein: a role in the proliferation of uninfected cells // Exp. Cell Res. 1999. - V. 250. - P. 112— 21.

49. Otake K., Fujii Y., Nakaya T. et al. The carboxyl-terminal region of HIV-1 Nef protein is a cell surface domain that can interact with CD4+ T cells // J. Immunol. 1994. - V. 153. - P. 5826-5837.

50. Tangsinmankong N., Day N.K., Good R.A., Haraguchi S. Monocytes are target cells for IL-10 induction by HIV-1 nef protein // Cytokine. 2000. - V. 12. - P. 1506-1511.

51. Robichaud G.A., Poulin L. HIV type 1 nef gene inhibits tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis and promotes cell proliferation through the action of МАРК and JNK in human glial cells // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2000. - V. 16.-P. 1959-1965.

52. Collette Y., Dutartre H., Benziane A., Ramos-Morales F., Olive D. Physical and functional interaction of Nef with Lck-HIV-1 Nef induced T-cell signalling defects // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 6333-6341.

53. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos // Nature. 1981. - V. 292. - P. 154-156.

54. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - V. 78. -P. 7634-7638.

55. Nichols J., Evans E.P., Smith A.G. Establishment of germlinecompetent embryonic stem (ES) cells using differentiation-inhibiting activity (LIF) // Development. 1990. - V. 110. - P. 1341-1348.

56. McMahon A.P., Bradley A. The Wnt-1 (int-1) proto-oncogene is required for development of a larch region or the mouse brain // Cell. 1990. - V. 62. -P. 1073-1085.

57. Nichols J., Chambers I., Smith A. Derivation of germ line competent embryonic stem cells with combination of interleukin-6 and solube interleukin-6 receptor//Exp. Cell Res. 1994. -V. 215. - P. 237-239.

58. Rose T.M., Bruce G. Oncostatin M is a member of a cytokine family that includes leukaemia inhibitory factor granulocyte colony stimulating factor and interleukin-6 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 88. - P. 8641-8645.

59. Conover J.C., Ip N.I., Poueymirou W.T., Bates В., Goldfarb M.P., DeChiara T.M., Yancopoulos G.D Ciliary neutrophic factor maintains thepluripotentiality of embryonic stem cells // Development. 1993. - V. 119. - P. 559-565.

60. Pease S., Braghetta P., Gearing D., Grail D., Williams R.L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media suplemented with recombinant leukemia inhibiting factor (LIF) // Dev. Biol. 1990. - V. 141. - P. 344-352.

61. Robertson E.J., Bradley A. Experimental approaches to mammalian embryonic development Cambridge: Cambridge University Press. 1986. — P. 475-508.

62. Миталипов Ш.М., Миталипова M.M., Иванов В.И. Влияние длительности культивирования на плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток in vitro и in vivo // Онтогенез. 1994. - № 25. - С. 19-27.

63. Wobus A.M., Holzhausen H., Jakel P., Schoneich J. Characterization of pluripotent stem cell line derived from mouse embryo // Exp. Cell Res. 1984. - V. 152.-P. 212-219.

64. Дыбан А.П. Раннее развитие млекопитающих. JI.: Наука. - 1988. — С. 34-49.

65. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marshall V.S., Jones J.M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998. - V. 282. - P. 1145-1147.

66. Reddel R.R., Yeager T.R. Constructing immortalized human cell lines // Cur. Opion in Biotechnology 1999. - V. 10. - P. 455^169.

67. Kemler R., Morello D., Jacob F. In Cell lineage, stem cells an cell determination (Le Douarin, N, ed) North-Holland, Amsterdam. 1979. - P. 101-113.

68. Bain G., Kitchens D., Yao M., Huettner J.E., Gottlieb D.I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro // Dev. Biol. 1995. - V. 168. - P. 342-357.

69. Doetschman T.C., Eistetter H., Katz M. et al. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium // J. Embryol. and Exp. Morphol. 1985. - V. 87.-P. 27^15.

70. Nagy A., Rossant J., Nagy R., Abramow-Newerly W., Roder J.C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 84248428.

71. Лойда 3., Госсрау P., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. М.: Мир. - 1982. - С. 64-67.

72. Межевикина Л.М., Мануйлова Е.С., Попов В.И., Савченкова И.П. Физико-химические аспекты роста и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в условиях культуры. Консервация генетических ресурсов. Пущино. - 1998. - С. 182-186.

73. Межевикина Л.М., Смирнов С.В., Смолихина Т.П., Глазко Т.Т., Костенко С.А., Мануйлова Е.С. Плюрипотентность и генетическое разнообразие эмбриональных стволовых клеток линии D3 в зависимости от условий культивирования // Цитология. 2001. - № 4. - 363 с.

74. Schuldiner M., Yanuka O., Itskovitz-Eldor J., Melton D.A., Benvensity N. Effects of eight growth factors on the differentiation of cells derived human embryonic stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. - P. 11307-11312.

75. Bagutti С., Wobus A.M., Fassler R., Watt F.M. Differentiation of embryonal stem cells into keratinocytes. Comparison of wild-type and integrin-deficient cells // Dev. Biol. 1996. - V. 179. - P. 184-196.

76. Bar-Sagi D., Feramisco J.R. Microinjection of the ras oncogene protein into PC12 cells induces morphological differentiation // Cell. 1985. - V. 42. - P. 841-848.

77. Bondioli K.R., Westhusin M.E., Looney C.R. Production of identical bovine offspring by nuclear transfer // Theriogenology. 1990. - V. 33. - P. 165-173.

78. Stice S.L., Robl J.M. Current successes in cloning mammalian embryos // Age. 1989. - V. 12. - P. 83-88.

79. Campbell K., Me Whir J., Ritchie В., Wilmut I. Production of live lambs following nuclear transfer of cultured embryonic disc cells // Theriogenology. -1995.-V. 42.-P. 181.

80. Sanes J.K., Rubenstein L.R., Nicolas J.-F. EMBO J. 1986. - V. 5. - P. 3133-3142.

81. Hansen M.B., Nielsen S.E., Berg K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill // J. Immunol. Methods. 1989. - V. 119, № 2. - P. 203-210.

82. Kirn S., Ikeuchi K., Byrn R. et al. Lack of a negative influence on viral grosth by the nef gene of human immunodeficiency virus type 1 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 9544-9548.

83. Маниатис "Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование". 1984.

84. Hammes S.R, Dixon E.P., Malim L.H. et al. Nef protein of human immunodeficiency virus type 1: evidence against its role as a transcriptional inhibitor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 9549-9553.

85. Shih C., Weinberg R.A. Isolation of a transforming sequence from a human bladder carcinoma cell line // Cell. 1982. - V. 29. - P. 161-169.

86. Land H., Parada L.F., Weinberg R.A. Tumorogenic conversion of primary embryo fibroblasts requires at least two cooperating oncogenes // Nature. -1983. V. 304. - P. 596-602.

87. Southern P.J., Berg P. Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV40 early region promoter // Mol. Appl. Genet. 1982. - V. 1. - P. 327-341.

88. Huttner K.M., Scangos G.A., Ruddle F.M. DNA-mediated gene transfer of a circular plasmid into murine cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76.-P. 5820-5824.

89. Chung S., Andersson Т., Sonntag K.C. et al. Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines // Stem Cells. 2002. - V. 20. - P. 139-145.

90. Гордеева О.Ф., Мануйлова E.C., Гуляев Д.В., Гривенников И.А. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток в культуре. Морфологические аспекты // Цитология. 2001. — Т. 43. - № 9. - 851 с.

91. Chang L.-J., Chen C.-H., Urlacher V., Lee T.-F. Differential apoptosis effect of primate lentiviral Vpr and Vpx in mammalian cells // J. Biomed. Sci. -2000.-V. 7.-P. 322-333.

92. Macreadie I.G., Thorburn D.R., Kirby D.M., Castelli L.A., de Rozario N.L., Azad A.A. HIV-1 protein Vpr causes gross mitochondrial dysfunction inthe yeast Saccharomyces cereviciae // FEBS Lett. 1997. - V. 410. - P. 145149.

93. Шугурова И.М., Бобрышева И.В., Гривенников И.А., Тарантул В.З. Эффекты генов nef и tat вируса иммунодефицита человека типа 1 на клетки феохромоцитомы крысы PC 12 // Генетика. — 2000. — № 36. С. 1140-1146.

94. Beniasz P.D., Cullen B.R. Multiple blocks to human immunodeficiency virus type 1 replication in rodent cells // J. Virol. 2000. - V. 74. - P. 98689877.

95. Briggs S.D., Lerner E.C., Smithgall Т.Е. Affinity of src family kinase SH3 domains for HIV nef in vitro does not predict kinase activation by nef in vivo // Biochemistry. 2000. - V. 39. - P. 489-495.

96. Kohleisen В., Shumay E., Sutter G., Foerster R., Brack-Werner R., Nuesse M., Erfle V. Stable expression of HIV-1 Nef induces changes in growth properties and activation state of human astrocytes // AIDS. 1999. - V. 13. -P. 2331-2341.

97. Kosaka M., Nishina Y., Takeda M., Matsumoto R., Nishimune Y. Reversible effects of sodium butyrate on the differentiation of F9 embryonal carcinoma cells // Exp. Cell Res. 1991. - V. 192. - P. 46-51.

98. Мануйлова E.C., Гордеева О.Ф., Гривенников И.А., Озернюк Н.Д. Эмбриональные стволовые клетки; спонтанная и направленная дифференцировка // Известия АН. 2001. - № 6. - С. 704-710.

99. Шугурова И.М., Мануйлова Е.С., Гривенников И.А., Тарантул В.З. Влияние генов tat и nef вируса иммунодефицита человека типа 1 на эмбриональные стволовые клетки мыши в культуре // Цитология. 2001. -№43.-С. 415-416.

100. Green L.A., Tischler A.S. Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. - V. 73. - P. 2424-2428.

101. Garcia J.V., Miller A.D. Serine phosphorylation-independent downregulation of cell-surface CD4 by nef II Nature. 1991. - V. 350. - P. 508-511.

102. Zauli G., Secchiero P., Rodella L. et al. HIV-1 Tat-mediated inhibition of the tyrosine hydroxylase gene expression in dopaminergic neuronal cells // J. Biol. Chem. 2000 Feb 11. - V. 275, № 6. - P. 4159-4165.

103. Гордеева О.Ф., Мануйлова E.C., Гуляев Д.В., Гривенников И.А. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток в культуре. Морфологические аспекты // Цитология. 2001. - Т. 43. - № 9. - 851 с.

104. Федченко В.И., Межевикина JI.M., Гурьев С.О., Мануйлова Е.С. Поддержание устойчивой плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro в результате трансформации этих клеток геном lif // Цитология. 2001. - Т. 43. - № 4. - 407 с.

105. Рахманова А.Г., Виноградова Е.Н., Воронин Е.Н., Яковлев А.А. ВИЧ-инфекция. 21 век. 2004. - 694 с.

106. Белозеров Е.С, Змушко Е.И. ВИЧ-инфекция. Питер. - 2003. - 368 с.

107. Pavlakis G.N., Felber В.К. Regulation of expression of human immunodeficiency virus // New Biol. 1990 Jan. - V. 2, № 1. - P. 20-31.

108. Berkhout В., Gatignol A., Rabson A.B., Jeang K.T. TAR-independent activation of the HIV-1 LTR: evidence that tat requires specific regions of the promoter // Cell. 1990 Aug 24. - V. 62, № 4. - P. 757-767.

109. Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1. — М.: Наука.-2003.-372 с.

110. Arendt Ch. W., Littman D. R. HIV: master of the host cell // Genome Biology. 2001. - V. 2, № 11. - Reviews 1030.1-1030.4.

111. ОСОБАЯ БЛАГОДАРНОСТЬ И ПРИЗНАТЕЛЬНОСТЬ МАНУЙЛОВОЙ Е.С., ПРЕКРАСНОМУ ЧЕЛОВЕКУ, ЗА МНОГОЛЕТНЮЮ ПОДДЕРЖКУ И УЧАСТИЕ, БЕЗ ПОМОЩИ КОТОРОЙ МНОГИЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ БЫЛИ НЕВОЗМОЖНЫ.

112. ХОЧУ ПОБЛАГОДАРИТЬ МОИХ ЗАМЕЧАТЕЛЬНЫХ ОППОНЕНТОВ МАНСУРА МУХАМЕТОВИЧА ГАРАЕВА И ИНГУ ПАВЛОВНУ АРМАН ЗА ВНИМАТЕЛЬНОЕ ОТНОШЕНИЕ К МОЕЙ РАБОТЕ И ЦЕННЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ, КОТОРЫЕ ПОЗВОЛИЛИ В ЗНАЧИТЕЛЬНОЙ СТЕПЕНИ УЛУЧШИТЬ ДИССЕРТАЦИЮ

Информация о работе

Шугурова, Ирина Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.03

Диссертация

Влияние регуляторных генов ВИЧ-1 tat и nef на пролиферацию, морфологию и дифференцировку клеток грызунов in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы