Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Введение антител в клетки и изучение их влияния на цАМФ-зависимую пртеинкиназу и казеиновую киназу
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Александрова, Наталья Анатольевна
ВВЕДЕНИЕ АНТИТЕЛ В КЛЕТКИ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ВЛИЯНИЯ НА цАМФ-ЗАВИСИМУЮ ПРОТЕИНКИНАЗУ И КАЗЕИНОВУЮ КИНАЗУ.
03.00.04. - Биохимия
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.
Научные руководители: доктор биологических наук, профессор П.Г. Свешников; / кандидат биологических наук
И.Д. Гроздова
Москва,
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.-.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. .—.
I. Исследование цАМФ-зависимой протеинкиназыin vitro.
1.1. Основные свойства каталитической субъедштцы.
I. 2. Строение регуляторной субъединицы.
I. 3. Основные свойства регуляторной субъединицы.
I. 4. Иммунохимические свойства регуляторной субъединицы.
I. 5. Свойствахолофермента.-.
II. Исследование цАМФ-зависимой протеи^й^азы/д vim.
II. 1. Биологическая роль различных типов цАМФ-зависимой протеинкиназы.
П. 2. Внутриклеточная локализация регуляторной субъединицы П типа и ее взаимодействие с другими белками.
II. 3. цАМФ-зависимые протеинкиназы и пролиферация клеток.
III. Пермеабилизация клеток дигитонином как метод введения в них различных веществ.
МЕТОДЫ.
Список сокращений.
Материалы.А.
Методы.:.
РЕЗУЛЬТАТЫ.
I. Влияние специфических антител на свойства ПКАIIтипа in vitro.
1.1. Характеристика МоАт.
1.2. Взаимодействие МоАт с RII мозга млекопитающих.
1.3. Влияние МоАт на образование холофермента.
1.4. Влияние МоАг на присоединение цАМФ к ЯП.
1.5. Взаимодействие моноклональных антител с ЯП фиксированных клеток РС12 .—
1.6. Взаимодействие МоАт с нативным антигеном в экстракте клеток РС12.
II. Введение МоАт к Ш1 в живые клетки РС12.
II. 1. Пермеабилизациа клеточной мембраны.
112. Введение белков в клетки РС12.
П.З. Восстановление целостности клеточной мембраны.
III. Действие введенныхМоАт на активность ПКА и КК внутри клетки.
III. 1. Влияние МоАт внутри клеток на активность цАМФзависимой протеинкиназы через 0,5 ч после введения.
1П.2. Влияние МоАт на активность цАМФ-зависимой протеинкиназы через 4 ч после их введения в клетки.
III.3. Опосредованное влияние введенных в клетки МоАт к Ю на цАМФ-независимую казеинкиназу.
1114. Активность цАМФ-зависимых и -независимых протеинкиназ в покоящихся и пролиферирующих клетках РС12.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.4.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Введение антител в клетки и изучение их влияния на цАМФ-зависимую пртеинкиназу и казеиновую киназу"
ft í
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Одной из актуальных проблем современной клеточной биохимии является изучение ферментативных процессов, происходящих при пролиферации клеток, так как это связано с фундаментальными вопросами клеточной трансформации и развития злокачественных опухолей. Исследование активности проте-инкиназ в процессе пролиферации и дифференцировки тканей показало, что злокачестI венная трансформация часто сопровождается возрастанием активности цАМФ-независимых протеинкиназ, фосфорилирующих кислые белки, в частности, казеин (казеинкиназы, КК). Наряду с этим отмечалось изменение активности и цАМФ-зависимых протеинкиназ (ПКА). Анализ ПКА I и II типа позволил предположить, что первая из них вовлечена, главным образом, в стимуляцию размножения клеток и их трансформацию, тогда как ПКА II типа участвует в процессах дифференцировки клеток и подавлении пролиферации [Ekanger R., 1985; Roesler W.T., 1988; Lohmann S.M., 1984а,б].
Особый интерес представляет участие ПКА II типа в ингибировании пролиферации раковых клеток. В работах Чо-Чанг с сотр. было показано, что аналоги цАМФ, активирующие ПКА II типа, ингибируют пролиферацию лейкемических клеток человека [Tagliaferri Р., 1988; Ally S., 1988; Tortora G., 1990]. Соотношение активности КК и ПКА было предложено использовать для дифференциальной диагностики злокачественных опухолей человека [Гроздова И.Д., 1989]. В нормальной ткани разных людей абсолютные значения активности КК и ПКА варьируют в пределах порядка, тогда как их соотношение - сравнительно постоянная величина. В связи с этим возник вопрос, каким образом поддерживается это постоянство, существует ли связь между данными типами протеинкиназ.
Решение этой проблемы возможно путем направленного изменения свойств одного из ферментов в клетке и анализа состояния второго фермента. Изменение его акл тивности при воздействии на первый фермент могло бы служить указанием на существование связи между ними. В качестве специфических модуляторов активности одного из ферментов можно использовать антитела к регуляторной субъединице ПКА, поскольку они способны влиять на ее свойства и, следовательно, на фермент [Weldon S.L., 1983; Эшба И.Р., 1987; Grozdova I.D., 1992]. Таким образом, иммунологические методы дают I возможности для направленного воздействия на свойства ПКА и выяснения вопроса о взаимосвязи двух протеинкиназ в клетке. .
Для воздействия на внутриклеточный фермент с помощью антител нужно ввести их в клетку, сохранив при этом ее целостность. Один из методов введения в клетки чужеродных веществ заключается в обработке клеток неионным детергентом дигитони-ном. Он образует отверстия в цитоплазматической мембране, размеры которых достаточны для прохождения таких крупных молекул, как белки. Введение различных веществ в клетки использовали для изучения локализации ферментов, регуляции их активности и других процессов. Однако, ввиду больших размеров образующихся перфораций через них вытекают цитоплазматические белки, что приводит к гибели клеток. По этой причине эксперименты на клетках, как правило, длятся не более 30 мин после пермеабилиза-ции плазматической мембраны.
Поэтому актуальной задачей являлась разработка методики получения живых клеток, нагруженных антителами, в количестве, достаточном для проведения их биохимического анализа. Такой метод позволил бы регистрировать эффекты, развивающиеся внутри клеток под действием введенных антител на протяжении длительного времени.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель настоящей работы заключалась в разработке метода введения антител в живые клетки PC 12 с последующим восстановлением целостности плазматической мембраны и сохранением жизнеспособности клеток; изучении влияния антител, выработанных на регуляторную субъединицу II типа (RII) цАМФ-зависимой протеинкиназы, на активность фермента in vitro и in vivo и исследовании взаимосвязи двух систем фосфорилирования в клетке.
В соответствии с поставленной целью работа состояла из следующих этапов:
1) изучение влияния моноклональных антител (МоАт) к RII на ее основные функции (связывание цАМФ и образование холофермента);
2) разработка методики пермеабилизации клеток PC 12 дигитонином с последующим i восстановлением целостности цитоплазматической мембраны и сохранением жизнеспособности клеток;
3) введение МоАт к RII в живые клетки РС12 и изучение их действия на активность ПКА;
4) исследование взаимосвязи между активностью ПКА и КК в клетке;
5) изучение зависимости активности этих ферментов от пролиферативного статуса клеток.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.
Разработана методика введения антител в живые клетки феохромоцитомы PC 12 путем пермеабилизации этих клеток неионным детергентом дигитонином с последующим восстанавлением целостности цитоплазматической мембраны и сохранением жизнеспособности клеток, по крайней мере, в течение недели. Положительный эффект был достигнут благодаря использованию низких концентраций дигитонина и минимального времени его контакта с клетками.
Впервые было изучено влияние МоАт к RII на свойства внутриклеточной ПКА путем введения антител внутрь клеток РС12. Было показано, что МоАт, обладающие различным действием на регуляторную субъединицу in vitro, также по-разному изменяют свойства фермента в живой клетке. Полученные результаты продемонстрировали возможность целенаправленного изменения свойств ПКА внутри клеток.
Впервые прямо была показана связь между, активностью двух протеинкиназ в клетке - цАМФ-зависимой ПКА и цАМФ-независимой КК, - и исследовано изменение их активности в РС12 в зависимости от пролиферативного статуса клеток.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ if'
Фосфорилирование белков играет важную роль в регуляции клеточного метаболизма. Реакция фосфорилирования осуществляется специфическими ферментами - про-теинкиназами, среди которых выделяют большую группу цАМФ-зависимых ПКА, активность которых значительно возрастает в присутствии цАМФ.
В 1958 году Сазерленд с сотр'. установили, что цАМФ является внутриклеточным вторичным мессенджером при передаче гормонального сигнала в клетку [Sutherland ? E.W., 1958], а в 1968 году в лаборатории Э. Г. Кребса впервые была выделена цАМФ-зависимая протеинкиназа из скелетных мышц кролика [Walsh D.A., .1968]. Вслед за этим началось активное изучение этой группы ферментов.
Воздействие внеклеточных агентов (гормонов, простагландинов, нейротрансмит-теров) стимулирует синтез цАМФ аденилатциклазой, что приводит к увеличению его внутриклеточной концентрации. Основным внутриклеточным акцептором цАМФ являются цАМФ-зависимые протеинкиназы, которые опосредуют его воздействие на многие биохимические процессы.
В отсутствие цАМФ эти протеинкиназы существуют в виде ферментативно неактивного холофермента, состоящего из двух регуляторных (R) и двух' каталитических (С) субъединиц. Присоединение цАМФ к регуляторной субъединице снижает ее сродство к каталитической и вызывает диссоциацию холофермента на димер регуляторных субъединиц в комплексе с 4 молекулами цАМФ и две молекулы активных С-субъединиц. Общепринятая сейчас схема диссоциации R.2C2 была предложена Корбином с сотр. в 1977 году [CorbinJ.D., 1977]:
C-R-R-C + 4 цАМФ = (цАМФ)2К-11(цАМФ)2 + 2С неактивен . активны
Данная схема диссоциации - ассоциации холофермента представляется упрощен> ной, поскольку она не учитывает возможности образования большого числа промежуточных комплексов.
Существует два типа ПКА, I и II, нумерация которых соответствует порядку их элюции с ДЕАЕ-целлюлозы. Различия между ПКА I и ПКА II обусловлены главным образом их регуляторными субъединицами, тогда как С-субъединицы протеинкиназ обоих типов обладают сходными свойствами [Corbin J.D., 1975; Hofmann F., 1975]. г I i
I. Исследование цАМФ-зависимой протеинкиназы in vitro. r I. 1. Основные свойства каталитической субъединицы.
Каталитическая субъединица была выделена из различных тканей млекопитающих: печени [Sugden P.N.,1976], сердца [Peters К. А., 1977], скелетной мышцы [Bechtel P.J., 1977]. Она представляет собой белок, состоящий из 349 аминокислотных остатков, молекулярной массы 40 кДа, pi 7,4-8,5 [Bechtel P.J., 1977]. цАМФ-зависимые протеинкиназы катализируют бисубстратную реакцию переноса у-фосфата молекулы АТФ на гидроксильные группы остатков серина или треонина белка. Одним из субстратов является донор фосфата АТФ [Walsh D.A., 1968]. Значения Км для АТФ составляют 5-12 мкМ в зависимости от источника фермента, тогда как Км для других трифосфатов (ГТФ, ИТФ, ЦТФ, УТФ) на один-два порядка выше [Majumder G.C., 1971; Lemaire S., 1971; Shizyta Y., 1975]. Для протекания фосфотрансферазной реакции необходимо присутствие ионов Mg2+, оптимальная концентрация которых 1-3 мМ. Вместо ионов Mg2+ могут быть использованы ионы Со2+ и Mn2+ [Walsh D.A., 1973], хотя величина kcat для ПКА в присутствии ионов Мп2+ в 20 раз ниже, чем в присутствии Mg2+ [Zhou J.,1997].
Вторым субстратом ПКА являются белки, содержащие вблизи фосфорилируемого остатка серина положительно заряженные аминокислотные последовательности: лиз(арг)-лиз(арг)-Х-сер- или -лиз(арг)-лиз(арг)-Х-Х-сер- [Cohen Р., 1977; Embi N., 1981; Yeman S.J., 1976; Hjelmqust G., 1974; Murray К., 1984; Северин E.C., 1985]. Если судить по относительной скорости фосфорилирования, то лучшими белковыми субстратами этого фермента являются: ß-субъединица киназы фосфорилазы (100%), гликогенсинтетаза из скелетных мышц кролика (80%), гистон Н2Ь из мозга свиньи (50%). Относительная скорость фосфорилирования гистона HI - 8% [Северин Е.С., 1985].
Кристаллографический анализ С-субьединицы показал, что ее молекула состоит I из двух глобул. Меньшая N-концевая глобула образует участок связывания MgATO. В его состав входит так называемая "глициновая петля" (три консервативных остатка глицина), необходимая для связывания нуклеотида. В С-концевой глобуле молекулы фермента находится участок связывания субстрата. Присоединение MgAT<D к С-субъединице изменяет ее конформацию и делает возможным ее связывание с белком-субстратом [Knighton D.R., 1991].
В настоящее время обнаружено три изоформы каталитической субъединицы - Ca, Cß и Су, являющиеся продуктами различных генов [Reinton N., 1998; Shuntoh Н., 1992; Wiemann S., 1992]. Аминокислотные последовательности Ca и Cß быка, мьппи, свиньи и человека идентичны на 93% [Uhler M.D., 1986а; Showers М.О., 1986; Adavani S.R., 1987]. Су сильнее отличается от других изоформ, имея только 79% гомологии с Ca и 83% с Cß [Beebe S.J., 1990]. Ca и Cß экспрессируются во всех тканях, однако в мозге преобладает Cß [Uhler M.D., 1986,6]. Су преимущественно экспрессируется в семенниках [Beebe S.J., 1990]. Несмотря на это, все три изоформы обладают одинаковой субстратной специфичностью и имеют сходные физико-химические свойства [Taylor S.S., 1990]. Перекрестная реакция моноклональных антител, полученных к С-субъединице ПКА I, с С-субъединицей ПКА II [Koide Y., 1981] свидетельствует о том, что одинаковые С-субъединицы могут входить в состав холоферментов I и II типа.
1.2. Строение регуляторной субъединицы. f
Различия между двумя типами ПКА обусловлены свойствами их регуляторных К субъединиц, которые обозначают RI и RII, соответственно. К настоящему времёни клонированы 4 гена R-субъединиц, кодирующие а и ß изоформы каждого типа: Ria, RIß, Rila, Rllß [Solberg R., 1993; Clegg C.H., 1988; Scott J.D., 1987; Luo Z.,1990], Они различаются по аминокислотному составу, физико-химическим и иммунологическим характеристикам. Общим свойством всех изоформ является способность связывать цАМФ, а в i его отсутствие - ингибировать активность С-субъединицы. Этим функциям соответствует одинаковая доменная организация их молекул. Регуляторная субъединица представляет собой асимметричный белок, в котором выделяют 4 домена: N-концевой домен, определяющий димеризацию и субклеточную локализацию фермента, участок присоединения С-субъединицы и два гомологичных домена, содержащих участки связывания цАМФ (рис.
1. цАМФ-связывающие домены.
Каждый мономер регуляторной субъединицы содержит два цАМФ-связывающих участка, А и Б, расположенных в С-концевой части молекулы [Titani К., 1984; Ranneis S.J., 1979; Takio К., 1984; Weber I.Т., 1982] Высокая гомология их первичных структур позволила предположить, что они образовались в процессе эволюции путем дупликации генов.
Присоединение по одной молекуле цАМФ к каждому мономеру R приводит к образованию комплекса C2R2(uAM®)2, который можно элюировать с ДЕАЕ-целлюлозы и выделить в чистом виде. При этом цАМФ равномерно распределен между всеми участками его связывания. Активация такого комплекса наблюдалась при более низкой концентрации цАМФ, чем холофермента, не содержавшего цАМФ. Поэтому авторы предположили, что холоферменты, в которых насыщено 50% центров связывания цАМФ, in vivo в первую очередь реагируют на внутриклеточные колебания цАМФ [Cobb С.Е., 1987].
1 г
ДИМЕРИЗАЦИЯ
Ат
Рис. 1 Общая схема строения регуляторной субъединицы. ' к, ' '
На схеме указаны 4 домена регуляторной субъединицы: два гомологичных участка связывания цАМФ (А и Б); участок взаимодействия с С-субъединицей и ТЯ-концевой домен, который взаимодействует с другими белками, а именно, со второй регуляторной субъединицей (участок димеризации), с заякоривающими белками (АКАР) и антителами (Ат).
Связывание двух молекул цАМФ с каждой регуляторной субъединицей вызывает конформационные изменения в холоферменте, что ведет к понижению сродства R к С на 4 порядка и освобождению активной С-субъединицы [Titani К., 1984, Ranneis S.J., 1979, Takio К., 1984, Builder S.E., 1980]. Присоединение цАМФ к двум участкам на одной и той же молекуле R происходит кооперативно, причем, сначала цАМФ быстро связывается с участком Б и медленнее с участком А. Его удаление из комплекса R2(hAM®)4 после диссоциации холофермента происходит в обратном порядке: сначала из участка А и относиI тельно медленнее из участка Б [Ranneis S.R., 1980, а, б].
2. Домен взаимодействия с С-субъединицей. . j
Основная функция R - присоединяться к каталитической субъединице и ингиби-ровать ее активность в отсутствие цАМФ. Участок взаимодействия с С-субъединицей находится на молекуле Rila из сердца быка в области 90-100 аминокислотных остатков.
Необходимость и важность этого участка для взаимодействия с С-субъединицей была доказана ограниченным протеолизом Rila из сердца быка. При расщеплении молекулы по Phe 90 ее С-концевой фрагмент сохранял способность взаимодействовать с каталитической субъединицей, тогда как при расщеплении после Arg 93 образовывался фрагмент, который не взаимодействовал с С-субъединицей [Weldon S.L., 1985а]. В холоферменте участок взаимодействия с каталитической субъединицей на молекуле R защищен от протеолиза [Potter R.L., 1979; Takio К., 1980].
3. Домен димеризаиии.
В N-концевой части молекулы регуляторной субъединицы находятся области, которые участвуют во взаимодействии R с другими белками: участок димеризации регуля-торных субъединиц, антигенные детерминанты и участки связывания "заякоривающих" белков (см. ниже).
Димер регуляторных субъединиц представляет собой стабильный комплекс, сохраняющийся после удаления С-субъединиц. Связь между R-субъединицами возникает в области первых 40 аминокислотных остатков [Potter R.L., 1978; Weber W., 1979; Reinmann
E.M., 1986]. Их участие было доказано тем, что удаление первых 14 аминокислотных остатков молекулы Rila предотвращало димеризацию [Cupp J., 1989; Scott J.D., 1990], а ее ощепленный N-кондевой пептид, содержащий 1-30 аминокислотных остатка, сохранял способность к димеризации [Scott J.D., 1990]. Димер R-субъединиц I типа стабилизируется двумя дисульфидными связями, возникающими между Cys 16 и Cys 37 каждого мономера [Zick S., 1982], причем, возможно образование димера Ria - RIß in vivo [Tasken К., 1993].
Димеризйция RII происходит без образования дисульфидных мостиков, по-♦ видимому, в результате взаимодействия 8-23 аминокислотных остатков молекулы RII, последовательность которых позволяет предполагать образование ими ß-складок, что, согласно данным кристаллографического анализа, может обеспечивать белок - белковые взаимодействия [Scott J.D., 1990]. Интересно, что последовательность аминокислот в области димеризации (1-30) является очень консервативной и присутствует во всех известных RII [Scott J.D., 1987; Oyen О, 1989].
I. 3. Основные свойстварегуляторной субъединицы.
Изоформы регуляторных субъединиц различаются по многим параметрам: молекулярному весу, аминокислотной последовательности, способности к аутофосфорилиро-ванию, тканевой специфичности, внутриклеточной локализации, иммунохимическим свойствам (таблица 1).
У регуляторных субъединиц I и II типа наблюдается 73-86% гомологии в участках связывания цАМФ. Сходство первичных структур а- и ß-изоформ в этой области еще выше и у регуляторных субъединиц II типа достигает 100% [Jahnsen Т., 1986].
Наиболее яркое отличие RI от RII состоит в том, что последняя подвергается фос-форилированию собственной каталитической субъединицей. При этом фосфатный оста
Таблица 1.
Свойства регуляторных субъединиц цАМФ-зависимых протеинкиназ.
Свойства RI RII Литература а 3 а 0
М.м., кДа 47-49 49-53 54-56 51-52, 54-55 11,44, 50, 122, 131, 144, 187, 198
Р1 4,5 3,8 11,34
Аутофос- форили- рование нет есть 135, 137
К0 комплекса Ы-цАМФ 0,1-1,0 нМ 2,8; 4,0; 6,0; 7,5 нМ 29, 51, 139, 142; 150
Тканевая специфичность Сердце, печень крысы, мыши, быка; скелетная мышца быка. Мозг, яичники, плацента мыши и крысы. Сердце быка, морской свинки; скелетная мышца, печень мыши. Преимущественно ней-рональные ткани; а также бурый и белый жир мыши; яичники крысы; семенники человека. 20, 39, 96, 97, 115, 116, 131, 147
Внутриклеточная локализация Преимущественно в цитоплазме, но существует мембранно-связанная RI в эрит-• роцитах. 50-75 % связано с: -плазматической мембраной, -цитоскелетом, -аппаратом Гольджи, - ядерной мембраной, -эндоплазматическим ретикулумом. 21,31,52, 63,74, 88,91, 101, 110, 111,131, 136, 138 ток переносится на серин, расположенный в области присоединения С-субъединицы [Rosen О.М.,1975; Rymond М., 1982]. Способность холофермента II типа к аутофосфори-лированию обусловлена наличием в молекуле RII аминокислотной последовательности -асп-арг-арг-вал-сер-вал- [Potter R.L., 1979], которая соответствует субстратной специфичности ПКА [Titani К., 1984; Takio К., 1984]. Аутофосфорилирование RII снижает ее сродство к каталитической субъединице почти в 10 раз [Rangel-Aldao R, 1977]. В отличие от RII, RI не подвергается аутофосфорилированию, потому что в участке ее взаимодейст вия с каталитической субъединицей она содержит псевдосубстратную последовательность, в которой фосфорилируемый Ser замещен на остаток Ala (Ria) или Gly (RIß) [Scott
J.D., 1991].
Процесс аутофосфорилирования RII обратимый. Обратную реакцию катализирует протеинфосфатаза. Аутофосфорилирование RII увеличивает сродство фосфохолофермен-та к цАМФ (КОцАМФ=1,0 нМ) по сравнению с холоферментом, содержащим дефосфорили-рованную RII (К0цамф=7,5 нМ) [Severin E.S., 1981]. Концентрация цАМФ, при которой возможна реассоциация субъединиц, в 10 раз ниже для фосфорилированной RII по сравнению с дефосфорилированной формой [Rangel-Aldao R, 1977]. Важное отличие а и ß-изоформ регуляторной субъединицы II типа состоит в способности Rila изменять свою электрофоретическую подвижность при аутофосфорилировании с 55 (дефосфорилиро-ванная форма) до 57 кДа, в то время как RUß не изменяет своей подвижности в SDS-электрофорезе после включения фосфата [Weldon S.L., 1985а].
I. 4. Иммунохимические свойства регуляторной субъединицы.
Регуляторные субъединицы I и II типа также различаются по своим иммунологическим свойствам. Анализ взаимодействия RI и RII с моноспецифическими поликлональ-ными антисыворотками показал, что RI и RII не дают перекрестной реакции независимо от источника антигена и животного - продуцента антител [Fleisher N., 1976; Weber W.,
1981; Erlichman J., 1980; Lohmann S.M., 1980; Kapoor C:L., 1979; Squinto S.P., 1985]. Этот t результат указал на отсутствие или слабую гомологию аминокислотных последовательк' ностей этих белков в области антигенных детерминант. Позже это подтвердил анализ первичной структуры разных типов регуляторных субъединиц [Titani К., 1984; Clegg С.Н, 1988; Takio К., 1982; Stein J.C., 1984]. Антисыворотки, выработанные на R и С-субъединицы, также не давали перекрестной реакции [Fleischer N., 1976; Weber W., 1981; Erlichman J., 1980 и 1983; Lohmann S.M., 1980]. Мышиные моноклональные антитела, поI лученные к RII из сердца быка, были специфичны только к регуляторной субъединице II типа и не взаимодействовали ни с RI, ни с С-субъединицей [Weldon S.L., 1983]. а- и ß-изоформы регуляторных субъединиц одного типа дают перекрестную реакл цию. Так, антисыворотка, полученная к Rllß мозга быка, осаждала и Rlla сердца быка. Однако, для осаждения a-изоформы требовалось в 10 раз больше антисыворотки, чем для осаждения такого же количества гомологичного антигена (Rllß) [Erlichman J., 1980]. Пониженное сродство к гетерологичной изоформе было обнаружено и у моноклональ-ных антител, выработанных на Rlla из сердца быка [Weldon S.L., 19856]. Полученные результаты указывают на различие в иммунохимических свойствах Rllä и Rllß.
Использование моноклональных антител к RII позволило выяснить расположение антигенных детерминант на ее молекуле. Две детерминанты были обнаружены на молекуле Rlla сердца быка. Они расположены по обе стороны участка присоединения С-субъединицы в области 46-89 и 102-121 аминокислотных остатков [Weldon S.L., 1983, 1985]. На молекуле Rllß, выделенной из мозга свиньи и быка, имеется не менее пяти антигенных детерминант и все они расположены в ее N-концевом 18 кДа фрагменте [Эшба И.Р., 1987, Grozdova I.D., 1992].
Таким образом, различными авторами установлено, что иммуногенностью обладает только N-концевая часть молекулы регуляторной субъединицы II типа не зависимо от источника этого белка.
Интересно, что присоединение антител оказывало разное влияние на а и ß t изоформы RII. Так, антитела к Rila одинаково взаимодействовали как со свободной ре-гуляторной субъединицей, так и с ассоциированной с каталитической субъединицей [Fleisher N., 1976; Weber W., 1981; Erlichmati J., 1980 и 1983; Weldon S.L., 1983]. Причем, присоединение антител, выработанных на Rila, к холоферменту не вызывало его диссоциации [Weber W., 1981; Erlichmaii J., 1980; Weldon S.L., 19856]. Эти результаты свидетельствовали о том, что связь Rila с С-субъединицей не препятствует присоединению антител ко всем детерминантам регуляторной субъединицы.
В отличие от a-изоформы, антитела7 к RUß обладали разным сродством к свободной RII и холоферменту. На это указывают данные по вытеснению 1251-меченой нейро-нальной RII из иммунного комплекса или холоферментом или свободной регуляторной субъединицей. Для 50%-ного вытеснения требовалась в 6 раз более высокая концентрация холофермента, чем свободной RII [Erlichman J., 1980]. Можно предположить, что взаимодействие с С-субъединицей экранирует некоторые детерминанты RJIß. В результате только часть антител в поликлональной антисыворотке взаимодействовала с RII в составе холофермента. Поэтому для полного связывания холофермента требовалось большее количество антисыворотки.
При анализе различных клонов МоАт, выработанных к RII из мозга быка, было обнаружено, что часть клонов предотвращала взаимодействие R и С и образование холофермента. Предварительная инкубация RII с этими МоАт препятствовала ингибированию активности С-субъединицы регуляторной субъединицей. В то же время, другие клоны антител никак не влияли на взаимодействие R и С [Grozdova I.D., 1992].
Также по-разному влияли различные клоны МоАт на связывание R-субъединицы с цАМФ. В ряде работ было обнаружено, что присоединение моноклональных антител к Rila из сердца свиньи усиливало этот процесс, причем, 'действие антител проявлялось при ненасыщающих концентрациях цАМФ (10"6 - 10"7 М) [Weldon S.L., 1983]. Интересно, что это свойство было особенно выражено у антител, выработанных на RII из мозга быка t
Rllß). Их присоединение к RII мозга в 10 раз увеличивало связывание цАМФ, а к Rila из к' других тканей - лишь в 2-3 раза [Erlichmann J., 1980]. Видимо, антитела стабилизировали RII в конформации, оптимальной для связывания цАМФ.
Однако, такой способностью обладают только антитела, выработанные к определенным детерминантам. Например, из двух охарактеризованных клонов МоАт к RH мозга один увеличивал сродство регуляторной субъединицы к цАМФ, а другой уменьшал, i хотя детерминанты обоих клонов, по-видимому, расположены на молекуле RII достаточно близко друг от друга [Эшба И.Р., 1987].
Эти данные были подтверждены позднее при исследовании влияния МоАт, получе-ных к RII из мозга быка, на связывание цАМФ с RII. Было показано, что одни клоны МоАт ингибировали присоединение цАМФ к регуляторной субъединице, другие усиливали это связывание, а часть клонов никак не влияла на взаимодействие RII и цАМФ [Grozdova, 1992]. Однако, по сравнению с RH из сердца, действие МоАт на RII из мозга наблюдалось при более высоких концентрациях цАМФ (10"6-8*10"6 М).
Использование антител представляет собой эффективный метод для исследования цАМФ-зависимой протеинкиназы: определения содержания ПКА в тканях [Hofmann F., 1977; Weber W., 1981], видовой и тканевой специфичности фермента [Fleisher N., 1976; Weber W., 1981; Erlichman J., 1980], соотношения ПКА I и ПКА II в тканях разных видов млекопитающих [Fleisher N., 1976; Weber W., 1981; Erlichman J., 1983]. В последнее десятилетие антитела, в основном, применяют при изучении локализации ПКА в клетке [Moos J., 1998; Reinitz С.А., 1997; Vijayaraghavan S., 1997; Levy F.O., 1996; Licameli V., 1992; Schwoch G., 1985, Koide Y., 1981] и взаимодействия R с различными внутриклеточными белками [McCartney S., 1995; Glantz S.B., 1992; Keryer G., 1993; Dransfield D.T., 1997; Gray P.C., 1997; Coghlan V.M., 1994; Tournier S., 1991; Mei X., 1997; Bregman D.B., 1991]. При исследовании связи RII с этими белками в клетке антитела к R-субъединице используют для осаждения комплексов RII - АКАР с целью выделения "заякоривающих" белков и изучения их свойств [McCartney S., 1995; Glantz S.B., 1992; Keryer G., 1993; Coghlan V.M., 1994; Mei X., 1997; Bregman D.B., 1991]. Специфические антитела к этим белкам и R-субъединице используются также при анализе состава выделенного белкового комплекса [Dransfield D.T., 1997; Gray P.C., 1997].
Таким образом, использование разнообразных антител дает -возможность для широкого спектра исследований как ПКА в целом, так и отдельных ее субъединиц.
I. 5. Свойства холоферЫента. *
Регуляторные субъединицы образуют с каталитической прочный комплекс (Ко = 0,2-0,3 нМ) в отсутствие цАМФ и MgATO [Hofmann F., 1980]. Он образуется за 2 мин при 37°С и сохраняется по меньшей мере в течение 30 мин при 30°С и в течение 8-12 ч при 0-4°С. Ассоциация субъединиц сопровождается снижением активности каталитической субъединицы в 5-10 раз. Несмотря на то, что С-субъединица является основным белком с pi 7,4-8,5 (стр. 9), образующиеся холоферменты имеют pi 5,2 (ПКА I) и 4,6-4,8 (ПКА II) [Северин Е.С., 1985], т. е. сохраняют общий отрицательный заряд, свойственный регуля-торным субъединицам (таблица 1).
Свободные регуляторные субъединицы обладают различным сродством к цАМФ. KD RI-цАМФ составляет 0,1-1 нМ, KD RII-цАМФ - 2,8-7,5 нМ (таблица 1). При их ассоциации с каталитической соответствующие значения KD возрастают. Однако, и в составе холофермента RI сохраняет на порядок большее сродство к цАМФ (Ко = 7-10 нМ), чем RII в холоферменте II типа (Ко = 100 нМ) [Erlichman J., 1983]. Таким образом, в отсутствие MgATФ как свободная, так и связанная в холофермент RI имеет на порядок большее сродство к цАМФ, чем RII.
Ситуация кардинально меняется при внесении в систему MgATФ. В его присутствии Ко R-цАМФ становится равной 60 нМ для ПК AI и 80 нМ для ПК All [Erlichman J.,
1983]. Таким образом, вероятность диссоциации обоих типов протеинкиназ под действием цАМФ становится одинаковой. Однако, этот эффект достигается разными путями.
4"
Присоединение MgATO к ПКАI типа понижает ее сродство к цАМФ на порядок. Поэтому для диссоциации холофермента требуются более высокие концентрации цАМФ. Таким образом, М^АТФ тормозит диссоциацию ПКА I и в то же время он ускоряет реас-социацию субъединиц протеинкиназы при понижении уровня цАМФ [Taylor S.S., 1990].
Присоединение MgATO к протеинкиназе II типа сопровождается аутофосфорилиI рованием ее регуляторной субъединицы. Это снижает ее сродство к С-субъединице почти в 10 раз и холофермент диссоциирует при более низких концентрациях цАМФ. Реассо-циация субъединиц ПКА II типа ускоряется при дефосфорилировании RII [Taylor S.S., 1990]. В результате в присутствии физиологических концентраций MgAT® оба типа ПКА начинают проявлять активность in vitro при сопоставимых концентрациях цАМФ.
П. Исследование ПКА in vivo. цАМФ-зависимые протеинкиназы участвуют в регуляции различных процессов метаболизма, секреции, работе ионных каналов, пролиферации и экспрессии генов. Таким образом, они катализируют множество реакций, хотя составляют всего 0,1% от содержащихся в клетке белков. Регуляция метаболизма путем обратимого фосфорилирова-ния белков очень экономична: на каждый каскад фосфорилирования расходуется менее 0,02% всего количества АТФ, производимого клеткой [Shacter Е., 1988].
Анализ ПКА в различных тканях показал, что а-изоформы регуляторных субъединиц экспрессируются практически во всех тканях и в клетках в культуре [Lee D.C., 1983; Scott J.D., 1987], тогда как ß-изоформа обладает тканевой специфичностью. RIß обнаружена только в нейрональной ткани, семенниках и плаценте [Clegg С.Н., 1988]. В этих тканях присутствует и Rllß [Jahnsen Т., 1986; Cadd G., 1989]. Она также обнаружена и в мозговом слое надпочечников [Erlichman, 1980], клетках жировой ткани мышей [Amieux P.S., 1997].
Число изоформ R-субъединиц и их соотношение зависит от типа ткани. Так, если в сердце человека и кролика содержится примерно равное количество RI и RII, то сердечная мышца быка содержит 90% Rila [Erlichman J., 1983]. В эксгракте всего мозга быка обнаружено 50% Rllß, 30% Rila, 20% RIß [Lohmann S., 1980]. i
II. 1. Биологическая роль различных типов цАМФ-зависимой протеинкиназы.
Регуляторные субъединицы, входящие в состав холоферментовЛ и II типа, определяют субстратную специфичность ПКА и обеспечивают участие ПКА I и ПКА II в различных биохимических процессах.
Влияние изоферментного состава ПКА на протекание биохимических процессов было продемонстрировано на мышах, мутантных только по одному гену - RUß. Такие мыши выглядели вполне здоровыми, были подвижны, плодовиты и долго жили. Однако, у них уменьшались запасы жира с 15% (в норме) до 6% общего веса, повышалась температура тела на 0,8°С и увеличивалось потребление кислорода. Даже после 4-месячной диеты, содержавшей 58% жира, они не толстели, тогда как нормальные мыши становились тучными. Исследование биохимических механизмов наблюдаемых физиологических изменений показало, что в клетках жировой ткани мутантных мышей полностью отсутствовала Rllß, которая в норме преобладает в буром и белом жире. У мышей, мутантных по данному гену, в адипоцитах компенсаторно возрастало количество Ria, практически полностью заменяя Rllß. Образующийся холофермент в мутантных мышах более эффективно связывал цАМФ и, соответственно, легче активировался, что вызывало накопление свободной С-субъединицы в клетке. Увеличение базальной активности ПКА в 5 раз в жировой ткани стимулировало экспрессию цАМФ-индуцибельных белков, в частности, липопротеинлипазы и протонного разобщителя окислительного фосфорилирования
Cummings D.E., 1996]. Увеличение количества липопротеинлипазы приводило к активации расщепления жиров. Протонный разобщитель ^находится во внутренней мембране митохондрий клеток бурого жира и выполняет роль переносчика протонов и разобщите-. ля цепи окислительного фосфорилирования [Cummings D.E;, 1996]. Увеличение его количества в 4-5 раз вызывало нарушение синтеза АТФ и энергия расщепления липидов рассеивалась в виде тепла. Таким образом, замена ПКА П на ПКАI привела к изменению метаболических процессов в организме. i
Однако, как было отмечено выше, в клетках могут одновременно присутствовать несколько изоформ ПКА, причем их состав и соотношение специфичны для каждого ти-« па ткани. Возникает логичный вопрос - каким образом клетки поддерживают необходимый баланс этих ферментов?
В последнее время были получены интересные результаты при изучении взаимодействия различных изоформ регуляторной субъединицы с каталитической в клетке. Работа была проведена на клетках ЗТЗ, трансформированных онкогеном ras, которые содержали примерно равное количество RI и RII изоформ. Введение в эти клетки плазмид, содержавших ген Rila, привело к увеличению количества Rila и снижению при этом количества Ria. В аналогичных экспериментах по суперэкспрессии Ria не наблюдали никаких изменений в составе протеинкиназ в клетках. Суперэкспрессия С-субъединицы сопровождалась образованием ПКА I. На основании этих фактов было сделано заключение о том, что холофермент образуется в первую очередь RIIa-субъединицей, а ПКА I типа обнаруживается в клетке только в том случае, когда С-субъединица присутствует в избытке по сравнению с Rila [Otten A.D., 1989]. Эти данные были подтверждены и в работах других авторов [DeManno D.A., 1991].
Таким образом, Ría, Rila и Rllß конкурируют между собой за связывание с каталитической субъединицей. Причем, Rila вытесняет Rllß при недостатке каталитической субъединицы, a Rllß, в свою очередь, может вытеснять Ria из холофермента, [Orten A.D., 1991].
Следовательно, если по тем или иным причинам концентрация свободной каталитической субъединицы в клетке высока (насыщение всей RII, суперэкспрессия С-субъединицы, искусственное удаление RII), то образуется ПКАI. Причем, было показано, что уровень мРНК и скорость синтеза Ria одинаковы у мутантных и нормальных мышей. Эти данные свидетельствуют о том, что ее количество контролировалось не на уровне транскрипции и трансляции, а определялось скоростью ее протеолиза. Свободные Ria и Rllß изоформы в клетке не стабильны и легко подвергаются протеолитической деградации, тогда как в составе холофермента время полужизни, например, Ria возрастает в 4-5 раз [Amieux P.S., 1997]. Таким образом, в клетках содержание регуляторных субъединиц определяется не только скоростью их синтеза, но и деградации и зависит от способности данной изоформы образовывать холофермент. Компенсаторная стабилизация Ria, возможно, представляет собой важный биологический механизм, защищающий клетки от нерегулируемой активности каталитической субъединицы. Подтверждением этого вывода служит тот факт, что у мышей, мутантных по гену Ria, погибали эмбрионы. Возможно, их гибель была связана с образованием избытка активной каталитической субъединицы [Amieux P.S., 1997].
Однако, возникает вопрос, почему в клетках образуется прежде всего ПКА II? Это противоречит данным об одинаковом сродстве холоферментов I и II типов к цАМФ в присутствии М^АТФ in vitro (стр. 20).Оказалось, что in vivo в жировой ткани мышей 50%-ная активация протеинкиназы I типа наблюдалась при 80 нМ цАМФ, а ПКА II типа -при 350 нМ цАМФ [Cummings D.E., 1996]. В связи с этим, возник вопрос о причине пониженного сродства ПКА II к цАМФ по сравнению с ПКА I. Ответ могут дать исследования внутриклеточной локализации регуляторных субъединиц I и II типов.
II. 2. Внутриклеточная локализация RII и ее взаимодействие с другими белками. t
Вскоре после открытия ПКА было обнаружено, что они находятся в различных
4' субклеточных фракциях [Rubin C.S., 1972; Corbin J.D., 1975]. В большинстве тканей ПКА I находится исходно в цитозоле, хотя есть данные, что в эритроцитах существует мем-бранно-связанная регуляторная субъединица I типа [McCartney S., 1995]. В отличие от нее, 50-70% RII (как а, так и ß) ассоциировано с различными клеточными органеллами (таблица 1) и 10-30% - с белками цитозоля. Возможно, связанные с регуляторной субъеI диницей II типа белки стабилизируют RII и защищают ее от деградации, тогда как свободная RI быстро подвергается протеолитическому расщеплению. *
Исследование ассоциации протеинкиназы с другими белками представляется важным в связи с выяснением механизма передачи гормонального сигнала в клетку. Известно, что воздействие на клетку различных веществ приводит к активации ПКА, используя общую сигнальную систему - повышение внутриклеточной концентрации цАМФ, но вызывает разный физиологический ответ клетки. Очевидно, что в зависимости от природы первичного мессенджера в клетках подвергаются цАМФ-зависимому фосфорилированию строго определенные белки. Однако, поскольку ПКА имеет широкий спектр субстратов, то механизм такой избирательности пока не ясен.
Для объяснения наблюдаемого противоречия была выдвинута гипотеза, состоящая из следующих постулатов: 1) цАМФ накапливается в различных клеточных компартмен-тах в ответ на действие разных гормонов; 2) локализация протеинкиназы II типа обусловлена взаимодействием регуляторной субъединицы фермента со специфическими белками; 3) эти белки являются предпочтительными субстратами связанной с ними протеинкиназы.
Таким образом, аккумуляция цАМФ в определенном месте клетки приводит к диссоциации ПКА И, локализованной там же, и фосфорилированию связанного с ней белка ее свободной каталитической субъединицей [Scott J.D., 1992].
Различная компартментализация синтезируемого цАМФ в зависимости от природы первичного мессенджера была показана экспериментально. Так, в работе Барсони и Маркс [Barsony J., Marx S.J., 1990] было обнаружено, что изопротеренол вызывал накопление цАМФ вблизи плазматической мембраны, тогда как воздействие кальцитонина приводило к повышению концентрации цАМФ вокруг ядер, а длительная обработка клеток форсколином способствовала накоплению цАМФ внутри ядер. Полученные результаты продемонстрировали локальную аккумуляцию синтезируемого цАМФ и принципиI альную возможность избирательной активации ПКА только в определенном месте клетки. В связи с этим представляют интерес данные о внутриклеточной локализации этих ферментов.
Как упоминалось ранее, более 80% ПКА II типа связано с белками цитозоля и субклеточными структурами: аппаратом Гольджи, центросомами и микротрубочками [Rios R.M., 1992; Keryer G., 1990 и 1993; Pariset С., 1994; Cheley S., 1994], саркоплазматическим ретикуломом [McCartney S., 1995], актином [Dransfield D.T., 1997], пероксисомами [Lester L.B., 1996]. Эта связь опосредована регуляторной субъединицей фермента. Она взаимодействует N-концевым доменом с "заякоривающим" белком, ассоциированным с клеточной органеллой.
Скотт с сотр. [Hausken Z.E., 1994] предложили схему взаимодействия холофермента с "заякоривающими" белками, согласно которой каталитические субъединицы, присоединенные к димеру RII, находятся в непосредственной близости от АКАР, что обеспечивает быстрое и предпочтительное фосфорилирование "заякоривающего" белка при активации фермента (рис. 2).
Одним из первых обнаруженных белков, "заякоривающих" RII, был МАР2, белок, ассоциированный с микротрубочками. Было показано, что ПКА Б фосфорилирует МАР2 по многим участкам и возможно включение до 11 молей фосфата на моль белка [TheurkaufW.E., 1982; Obar RA., 1989]. Фосфорилирование МАР2 ингибирует полимери
Рис. 2 Схема взаимодействия ПКА II с "заякоривающими" белками.
Модель иллюстрирует основные свойства "заякоривающего" белка: а - а-спираль в участке взаимодействия с Ы1; Ь - участок взаимодействия с внутриклеточной органеллой; с - участок фосфорилирования, расположенный в непосредственной близости от каталитической субъединицы фермента, что обеспечивает его быстрое и преимущественное фосфорилирование при диссоцйации холофермента под действием цАМФ. зацию микротрубочек и его взаимодействие с другими элементами цитоскелета [Seldon S.C., 1983; Akiyama Т., 1986]. Проведенные исследования показали, что локальная активация ПКА II приводит к фосфорилированию "заякоривающего" бежа и изменению его свойств и состояния ассоциированной с ним клеточной органеллы.
Вслед за МАР2 в мозге быка был открыт другой белок, связывающий преимущественно нейрональную Rllß, - кальмодулин-связывающий белок Р 75 [Sarkar D., 1984]. Аналогичные белки были обнаружены в мозге и других видов млекопитающих. Они разI личаются по молекулярной массе: в мозге быка присутствует только белок 75 кДа [Leiser
М., 1986], у свиньи - 82 кДа, у кролика.^ 66, у крысы - 150 [Bregman D.B., 1989], у чело века - 79 [Hirsch А.Н., 1992]. Тем не менее, их объединяют в одно семейство, потому что они имеют сходную первичную структуру [Hirsch А.Н., 1992; Carr D.W., 1992], перекрестно реагируют с выработанными на них антисыворотками и обладают высоким сродством к Rllß. Эти белки фиксируют ПКА II в постсинаптической мембране [Carr D.W., 1992], центросомах и аппарате Гольджи нейронов [De Camilli P., 1986].
Белок AK АР 15 связывает RII с кальциевым каналом в скелетной мышце кролика [Gray P.C., 1997] и натриевым каналом в мозге крысы [Tibbs V.C., 1998]. Таким образом, он обеспечивает участие ПКА в регуляции этих каналов. Не так давно был выделен и охарактеризован "заякоривающий" белок в ядре - АКАР 95. Было показано, что он содержит домены связывания как RII, так и ДНК. Возможно, это белок ядерного матрикса, на котором он может фиксировать регуляторную субъединицу в ядре [Coghlan V.M., 1994].
Было обнаружено, что а и ß-изоформы RII обладают разным сродством к "заякоривающим" белкам. Так, сродство Rila к МАР2 в 7 раз выше, чем у Rllß [Leiser М., 1986]. Rila преимущественно присоединяется к АКАР кальциевых каналов, эндоплазма-тического ретикулума, компонентам цитоскелета [Leiser М., 1986].Тогда как только Rllß связана с АКАР 85 аппарата Гольджи и АКАР 160/центросом лимфобластов человека, t хотя в самих клетках присутствует и Rila тоже [Rio§ R.M., 1992].
Область взаимодействия RII с другими белками, как и домен димеризации, находится в N-концевой части молекулы. К АКАР присоединяется только димер регулятор-ных субъединиц [Scott J.D., 1990]. Сведения о размерах участка на молекуле RII, взаимодействующего с "заякоривающими" белками, несколько разноречивы. Так, для присоединения Rllß мозга быка к АКАР 75 были необходимы первые 50 аминокислотных остатков [Luo Z., 1990]. Однако, сродство такого 50-членного пептида было снижено по сравнению с целой молекулой RIÍ [Leiser М., 1986; MacLeod J., 1994]. Значительно больший участок Rila (1-79) участвует во взаимодействии с МАР2 [Scott J.D., 1990]. При этом разные АКАР, видимо, присоединяются к одному и том же участку регуляторной субъелдиницы или участки их связывания в значительной степени перекрываются. Об этом свидетельствует тот факт, что присоединение к регуляторной субъединице МАР2 блокировало ее взаимодействие с АКАР 75 и наоборот [Luo Z., 1990]. В то же время было показано, что для этого взаимодействия необходимы первые пять аминокислотных остатков RII. Замена Не 3 и 5 в молекуле RII на Ala в 6 раз снижало ее сродство к АКАР, не влияя при этом на димеризацию, связывание цАМФ или вторичную структуру Rila [Hausken Z.E., 1994].
Изучение различных АКАР показало, что их участки, к которым присоединяется RII, различаются по первичной структуре. Однако, все они имеют сходство во вторичной структуре - участок, состоящий из чередующихся гидрофильных и гидрофобных аминокислот, способных образовывать a-спираль. Мутации в этой области, нарушающие а-спираль, или совсем предотвращали взаимодействие многих АКАР с регуляторной субъединицей [Сагг D.W., 1991], или снижали ее связывание по крайней мере в 6 раз [Hausken Z.E., 1994]. Эти результаты свидетельствуют о том, что амфипатическая 14-членная а-спираль является детерминантой для присоединения RII. 24-членный пептид АКАР, содержащий амфипатическую спираль, предложено использовать как конкурентный ингиt битор любых "заякоривающих" белков [Scott J.D., 1994].
Следует отметить, что не вся ПКА II типа в клетке связана с органеллами: не менее 25% фермента обнаруживается в цитозоле [Scott, 1994]. И далеко не все участки потенциального связывания RII на АКАР заняты регуляторной субъединицей.
Особый интерес вызывают "заякоривающие" белки, к которым могут присоединяться одновременно несколько ферментов. Таким свойством обладает I калмодулин-связывающий белок АКАР 79, который взаимодействует одновременно с
ПКА Ilß, протеинкиназой С и фосфатазой 2В. Все три фермента присоединяются в раз» ных местах "заякоривающего" белка. Интересно, что АКАР 79 является субстратом обеих протеинкиназ [Coghlan V.M., 1995; Klauck Т.М., 1996].
Таким образом, проведенные исследования выявили в клетке белки, которые являются основой образования мультиферментных комплексов, что, вероятно, способствует координации биохимических процессов.
Вопрос о локализации регуляторных субъединиц в клетке и особенно о возможном "заякоривании" RII в ядре тесно связан с проблемой транслокации субъединиц фермента в ядро и участии ПКА I и II типов в пролиферации клеток.
II. 3. цАМФ-зависимые протеинкиназы и пролиферация теток.
Известно, что состав фосфорилированных клеточных белков меняется при переходе клеток от состояния покоя к размножению. Так, например, стимуляция покоящихся диплоидных фибробластов человека или фибробластов мыши линии ЗТЗ к пролиферации сопровождалась дефосфорилированием 110 кДа белка цитоплазматической мембраны [Wehner J.M., 1977] и быстрым фосфорилированием другого мембранного белка 33 кДа [Nilsen-Hamilton М:, 1979]. Такого рода исследования привели к выводу, что пролифери-рующие и покоящиеся клетки различаются по составу и активности протеинкиназ.
Косвенным указанием на участие цАМФ-з^вйсимых протейнкиназ в регуляции ' t пролиферативных процессов является изменение уровня цАМФ в клетках в зависимости от их пролиферативного статуса. Приведем некоторые данные, полученные на том объекте, который был использован и в настоящей работе, а именно, на клетках мышиной феохромоцитомы линии PC 12, имеющей нейрональное происхождение. Увеличение уровня цАМФ в этих клетках подавляло их пролиферацию и стимулировало дифферен-цировку [Kvanta А., 1993]. I
Дифференцировка этих клеток, индуцированная фактором роста нервов, сопровождалась увеличением количества натриевых каналов посредством активации, в частности, ПКА. (Эти результаты хорошо согласуются с данными о взаимодействии RII с натриевым каналом в мозге крысы при участии АКАР 15 [Tibbs VC., 1998]), [Kaiman D., 1990].
Изучение механизма действия брадикинина, который вызывает дифференцировку клеток PC 12, показало, что брадикинин увеличивает внутриклеточный уровень цАМФ приблизительно в 1,6 раза. При этом во столько же раз возрастает активность цАМФ-зависимой протеинкиназы. Последняя принимает участие в транслокации ПКСер8йоп, которая регулирует в PC 12 рост нейритов и дифференцировку клеток. Таким образом, развитие дифференцировки под действием брадикинина происходит в клетках PC 12 с участием ПКА [Graness А., 1997].
В связи с этим вопрос об активности ПКА в клетках и тканях при изменении их физиологического состояния изучался весьма широко как на уровне целого организма, так и на клеточных культурах. Результаты большинства работ свидетельствуют о различной роли ПКА I и II типа в пролиферации клеток. ПКА II преимущественно экспрессируется в нормальных непролиферирующих тканях и клетках, тогда как повышенный уровень ПКА I отмечается неизменно в опухолевых тканях [Ciardiello F., 1998; Piroli G., 1992] и временно в нормальных клетках, подвергнутых действию митогенных стимуляторов
Ciardiello F., 1998]. На основании такого рода данных'была сформулирована концепция, согласно которой ПКА I вовлечена, главным образом, в процессы, происходящие при размножении клеток и их трансформации, тогда как ПКА II активируется при дифферен-цировке клеток и торможении пролиферации [Ekanger R., 1985; Roesler W.T., 1988; Lohmann S.M., 19846]. Действительно, при развитии злокачественных опухолей, например, молочной железы [Ciardiello F., 1998] и печени [Skarpen Е., 1998] наблюдалась суперэкспрессия ПКА I. Ингибирование же ее экспрессии подавляло рост различных ракоI вых клеточных линий человека in vitro и in vivo [Ciardiello F., 1998].
Подтверждением этой концепции могут служить результаты работы по определению соотношения количеств RI и RII в сердце мышей разного возраста. Известно, что через 3 недели после рождения у грызунов прекращается деление миоцитов сердца, и дальнейшее увеличение его размеров происходит вследствие гипертрофии клеток. При этом, у 2-3-недельных мышат отношение RI/RII в сердечной мышце было равно 3, а у взрослых животных оно снижалось до 1 [Haddox М.К., 1979; Malkinson A.M., 1978; Claycomb W.C., 1975]. Таким образом, торможение пролиферации клеток коррелировало с уменьшением относительного содержания ПКА I. Аналогичные данные были получены при изучении соотношения RI/RII в процессе эмбрионального развития клеток печени крысы [Skarpen Е., 1998].
Приведенные примеры демонстрируют связь между активностью ПКА и делением клеток и участие этих ферментов в регуляции пролиферативных процессов.
Возможный механизм такой регуляции состоит в активации генов, транскрипция которых усиливается при повышении внутриклеточного уровня цАМФ (цАМФ-индуцибельные гены). Связь между этими двумя событиями включает несколько последовательных стадий. В промоторе цАМФ-индуцибельных генов обнаружена специфическая последовательность нуклеотидов (cAMP-responsive element, CRE) [Weber I.T., 1982; Roesler W.J., 1988]. Активация транскрипции происходит вследствие присоединения к
CRE определенных белков (CRE - binding proteins, CREBp). Образование комплекса регу
• / лируется обратимым фосфорилированием CREBp под действием каталитической субъединицы ПКА [Yamamoto К.К., 1988]. В связи с этим большое внимание уделялось изучению транслокации субъединиц фермента из цитоплазмы в ядро и возможности фосфори-лирования ею ядерных белков.
Было показано, что после микроинъекций FITC-меченой С-субъединицы ПКА в клетки фибробластов мыши ее обнаруживали в ядрах уже через 10 мин после введения. I
Она присутствовала в ядрах в течение, по крайней мере, последующих двух часов
Meinkoih J.L., 1990]. Для изучения транслокации субъединиц протеинкиназы были ис-♦ пользованы также холоферменты, содержавшие FITC-меченую С-субъединицу и родамин-меченые RI и RII. В предварительных экспериментах in vitro было показано, что при возбуждении FITC происходил перенос энергии в холоферменте и можно было наблюдать свечение родамина. При диссоциации ПКА под действием цАМФ возможно было видеть лишь свечение FITC. Такой холофермент вводили в фибробласты путем микроинъекций. При повышении концентрации цАМФ в клетках наблюдали диссоциацию хо-лофермента и транслокацию С-субъединицы в ядро, а при удалении цАМФ - переход ее обратно в цитоплазму. Эти результаты показали, что каталитическая субъединица может диффундировать через ядерную мембрану в зависимости от условий, создаваемых в клетке [Adams S.R., 1991]. Таким образом было установлено, что С-субъединица ПКА может транслоцироваться в клеточное ядро из цитоплазмы и фосфорилировать ядерные белки, участвуя тем самым в активации цАМФ-зависимых генов.
В то же время возможность транслокации R-субъединицы в ядро остается и поныне предметом дискуссий. С одной стороны, иммунофлюоресцентным методом было показано присутствие RI и RII в ядрах нейронов [Cumming R, 1991]. Наличие R-субъединиц в ядрах было подтверждено в экспериментах на клетках гепатомы с использованием флюоресцентно-меченой С-субъединицы [Fletcher W.H., 1986]. В ядрах клеток гепатомы линии t
MDBK и Н41 IE была обнаружена только RII [Nigg Е.А., 1985,а,б].
С другой стороны, при микроинъекции флюоресцентно-меченой RI в цитоплазму живых фибробластов мыши она не транслоцировалась в ядро [Meinkoth J.L., 1990; Fantozzi D.A., 1992]. Такие же результаты были получены при инъекции в клетки холо-ферментов I и II типа, в которых С-субъединица была мечена FITC, a RI или RII - родамином. В отличие от каталитической субъединицы, ни RI, ни RII в ядро не транслоцироI вались [Adams S.R., 1991]. Однако, необходимо отметить, что присоединение флюоресцентных веществ к молекуле R могло препятствовать ее транслокации в ядро [Scott Ii).,
1994].
Противоречивость приведенных выше данных, возможно, связана с объектом исследования. Ранее в нашей лаборатории было обнаружено, что транслокация RII зависит от типа клеток и их пролиферативного статуса. Так, иммунофлюоресцентньш методом с использованием моно- и поликлональных антител к RII было показано, что в активно пролиферирующих клетках феохромоцитомы крысы PC 12 регуляторная субъединица II типа находилась в ядрах, а в покоящихся - только в цитоплазме. В отличие от клеток PC 12, в фибробластах мыши линии ЗТЗ RII обнаруживалась только в цитозоле вне зависимости от пролиферативного статуса клеток [Shmyrev I.I., 1990].
Была выдвинута гипотеза, объясняющая появление регуляторной субъединицы II типа внутри ядер активно пролиферирующих клеток. Согласно этой гипотезе, в интерфазе RII находится в цитоплазме и не транслоцируется в ядро. В процессе митоза ядерная оболочка разрывается и локализованный внутри ядра "заякоривающий" белок становится доступен для регуляторной субъединицы. В результате, по окончании деления клетки во вновь образованных ядрах обнаруживается RII, ассоциированная с АКАР 95 [Scott J.D., 1994].
Особый интерес вызывают работы по изучению роли регуляторных субъединиц в t процессах пролиферации и дифференцировки клеток,/ Прямое доказательство участия RH i]' в развитии дифференцировки клеток было получено для Rllß [Mednieks M.I., 1989; Tortora G., 1990]. В этих работах клетки различных линий (рака толстой кишки LS-174T, рака желудка ТМК-1, лейкемии К-562, феохромоцитомы грызунов РС12 [Mednieks M.I., 1989], промиелоцитической лейкемии человека HL-60 [Tortora G., 1990]) подвергали действию 8-С1-цАМФ, который преимущественно связывается с участком Б на молекуле
RII (рис. 1) [Robinson-Steiner А.М., 1983; Ogreid D., 1985]. Ранее было показано, что обработка клеток 8-С1-цАМФ7вызывала торможение пролиферации и изменение морфологии * раковых клеток [Tagliaferri Р., 1988]. Эти процессы сопровождались транслокацией Rllß в ядро, экспрессией ее гена и последующим увеличением количества RUß в цитоплазме за счет вновь синтезированного белка [Ally S., 1988]. Таким образом, Rllß сама является цАМФ-индуцибельным белком. При трансфекции клеток линии HL-60 олигонуклеоти-дом (21 пара оснований) антисмысловой мРНК Rllß наблюдали ингибирование накопления Rllß в клетках. В таких клетках не происходило торможения пролиферации при обработке их 8-С1-цАМФ. Трансфекция клеток олигонуклеотидами, антисмысловыми по отношению к мРНК Ria и Rila или смысловой мРНК Rllß не препятствовало последующей дифференцировке клеток, обработанных 8-С1-цАМФ [Tortora G., 1990]. Полученные факты свидетельствуют о том, что Rllß опосредует цАМФ - зависимую регуляцию дифференцировки клеток и является отрицательным фактором пролиферации.
Ввиду вышеизложенных фактов представляется интересным дальнейшее изучение свойств регуляторной субъединицы II типа in vivo. Для этого можно использовать специфические антитела, направленные к RII. Как указывалось выше, антигенные детерминанты на молекуле регуляторной субъединицы находятся в N-концевом домене, в котором расположен и участок связывания "заякоривающих" белков. Поэтому образование иммунного комплекса может служить моделью взаимодействия RII с АКАР. Кроме того, использование моноклональных антител, обладающих различным влиянием на Я11, по/ ^ зволяет модулировать свойства ПКА. ^
Однако, для воздействия на ПКА внутри клеток антитела необходимо ввести в клетку, сохранив при этом ее целостность. Один из методов введения в клетки чужеродных веществ заключается в обработке клеток неионным детергентом дигитонином.
Ш. Пермеабилизация клеток дигитонином для введения в них различных веществ. I
Дигитонин представляет собой неионное поверхностно-активное вещество класса стероидов, являющееся производным спиростана (рис. 3), М.м. 1229,34. Это белое кристаллическое вещество, растворимое в горячем этаноле, хуже в холодном этаноле, эфире и хлороформе; в воде растворяется при кипячении. Дигитонин способен образовывать комплекс с холестерином в стехиометрии 1:1, нерастворимый в воде [Химическая Энциклопедия, 1995 и 1998; Справочник Биохимика, 1991]. Предполагается, что эта реакция лежит в основе образования пор в плазматической мембране клеток, хотя детали этого процесса не ясны.
Размеры образующихся перфораций зависят от концентрации дигитонина. Это свойство использовали в ряде работ для выяснения вопроса о том, находится ли рассматриваемое вещество в живой клетке в цитозоле или же ассоциировано с клеточной мембраной или органеллами. При этом, после образования перфораций в плазматической мембране регистрируют высвобождение (в %) ферментов из клетки и на основании этих данных делают вывод о том, в свободном или связанном состоянии белок присутствует в клетке. В качестве маркера цитозольных белков используется лактатдегидрогеназа.
Используя этот метод, Макилини исследовал внутриклеточную локализацию протеин ]М-миристоилтрансферазы на линии клеток НеЬа. При пермеабилизации 50 мкМ дигитонином из клеток высвобождалось 90-93% лакгатдегидрогеназы и только 73-85% ис-следумого фермента. Эти результаты позволили заключить, что часть протеин И" 36
С1с(1-►3)Сга1 (1) ч
2)
СНс(1—"4 ) <Эа1 - О (3)
ХЬ (1)
Рис. 3 Химическая формула дигитонина. миристоилтрансферазы ассоциирована с мембранами'или органеллами. Данный вьшод t был подтвержден иммунофлюоресцентным методом и изучением распределения ферментативной активности в разных субклеточных фракциях [McIlhinneyR. А., 1996].
В другой работе исследовали содержание в цитозоле введенных в клетку олигонук-леотидов. Условия пермеабилизации подбирали исходя из подвижности маркеров: вытекание лактатдегидгогеназы > 80% (тест для цитозольных белков) и вытекание декстран-родамина < 15% (тест на нахождение в эндоцитозных везикулах и лизосомах). Было поI казано, что 50-60% фосфодиэфирных олигомеров находится в цитозоле, тогда как олиго-меры, несущие на себе гидрофобные группы (флюоресцеин, холестерол), в значительно меньшей степени вытекали через поры, возможно, в силу их связи с мембраной [Tenu J.P., 1997].
Этот метод был использован для изучения состояния ПКАI и П типа внутри клетки. После пермеабилизации клеток дигитонином в различных концентрациях анализировали молекулярную массу вытекающих белков методом проникающей гель-хроматографии и наличие протеинкиназ в этих фракциях иммуноферментным методом. Полученные результаты показали, что ПКА I типа находилась во фракции 150-250 кДа белков, что соответствует молекулярной массе холофермента (180 кДа). В отличие от нее, ПКА II типа была обнаружена во фракции белков М.м. более 500 кДа. Эти результаты подтверждают ассоциированность ПКА II с другими внутриклеточными белками [Vintermyr O.K., 1991].
Пермеабилизацию клеток дигитонином используют также для изучения роли различных белков во внутриклеточных процессах. При этом к перфорированным клеткам добавляют специфические лиганды исследуемого белка - субстраты, ингибиторы, антитела - и изучают их влияние на тот или иной процесс. Этот метод был использован при изучении механизма активации аденилатциклазы при воздействии внеклеточных агентов на Р2-адренергический рецептор. В пермеабилизованныё дигитонином клетки вводили
4 38 антитела к фосдуцину, белку, связывающему р,у-субъединицы G-белка. Это вызывало t торможение синтеза цАМФ в человеческих клетка^ линии А431, тогда как в отсутствие антител наблюдали накопление внутриклеточного цАМФ сразу же после воздействия на рецептор внеклеточных агентов. Полученные результаты свидетельствовали о том, что фосдуцин участвует в передаче сигнала от Р2-адренергического рецептора к аденилат-циклазе. [Schultz К., 1996].
Для пермеабилизации клеток применяли дигитонин в различных концентрациях -от 1 до 100 мкМ [Adam S.R., 1990; Lohse M.J., 1989]. В большинстве работ перфорированные клетки использовали для последующих экспериментов-^ течение первых 30 мин по еле пермеабилизации. Это связано с вытеканием из клеток содержимого цитозоля через образованные дигитонином перфорации, что приводит к быстрой гибели клеток.
Ввиду всего вышеизложенного была поставлена задача подобрать условия пермеабилизации клеток PC 12 дигитонином, позволяющие им восстанавливать целостность внешней мембраны и сохранять свою жизнеспособность, и в этих условиях ввести в клетки МоАт к RII, влияние которых на регуляторную субъединицу было предварительно изучено in vitro.
МЕТОДЫ , ' ' •/ /
4¡'
Список сокращений
Ат-антитела;
МоАт - моноклональные антитела; БСА бычий сывороточный альбумин;
PBS - 10 мМ фосфатный буфер, pH 7,4, содержащий 145 MMNaCl; i
ПКА - протеинкиназа А; КК - казеинкиназа;
RII - регуляторная субъединица цАМФ-зависимой протеинкиназы II типа;
С - субъединица - каталитическая субъединица цАМФ-зависимой протеинкиназы; трис - 2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол;
ABTS - 2,2'-азинобис-(3-этилбензтиазолин-6-сульфокислота)*2]ЧН4 соль;
SDS- додецилсульфат натрия;
ТХУ - трихлоруксусная кислота;
ФИТЦ - флюоресцеинизотиоцианат;
МЗХ - метил-изобутил-ксантин;
PBS-T - раствор PBS, содержащий 0,05% твин-20;
PBS-AT - раствор PBS, содержащий БСА, 2 мг/мл, и 0,1% твин-20;
ДАБ - диаминобензидин;
ОФД - орто-фенилендиамин;
ДТТ - дитиотреитол;
PEPES - 1,4-пиперазиндиэтансульфоновая кислота;
ЭГТА - этиленгликоль-бисф-аминоэтиловый эфир) - N,N,N',N' - тетрауксусная кислота.
ОССИЙО&Ш
Материалы. „ * ГОСУДдРСЩИМ^ t
В работе использовали среду Игла, модифицированную Дульбекко (DMEM), фирмы "Sigma", сыворотку крови лошади "Sigma", эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота фирмы "Gibco".
При постановке экспериментов использовали следующие реактивы:
KCl, PIPES, ЭГТА, FITC, трипсин и ингибитор трипсина, ДТТ, NaF, NaGl, офенилендиамин, лимонная кислота, казеин, метил-изобутилксантин, глицин, (NH^SO^ i одно- и двузамещенный карбонат натрия, NaJ04, Na2S04, NaBH4, белок А-сефароза фирмы "Sigma" (США); одно- и двузамещенные фосфаты калия фирм "Sigma" и "Реахим" (Россия), х. ч.; полилизин фирм "Sigma" и "Serva" (Германия); тритон Х-100, парафор-мальдегид, твин-20, ABTS, MgCb, БСА, дигитонин фирмы "Serva"; антимышиные IgG овцы фирмы "Serotec" (Англия); АТФ и цАМФ фирмы "Reanal" (Венгрия); HCL и три-хлоруксусная кислота -"Реахим", х. ч.; 3Н-тимидин - "Chemapol" (Чехия).
Для ведения культуры клеток использовали пластиковые матрасы фирмы "Sigma", для экспериментов на клетках - 6-луночные планшеты фирмы "Costar". При анализе включения 3Н-тимидина использовали 6-луночные планшеты фирмы "Costar", для имму-ноферментного анализа - 96-луночные планшеты фирмы "Greiner".
За процессом пермеабилизации клеток следили с помощью микроскопа NIKON (Япония). Флюоресценцию клеток наблюдали под микроскопами ЛЮМАМ (Россия) и OPTON (Германия). Клетки фотографировали на пленку "микрат-изопан" (Россия) и Kodak (США).
Для регистрации оптической плотности растворов использовали спектрофотометр ШТАСШ-557 (Япония) и Multiscan (Titertek, Англия). При определении включения 3Н-тимидина использовали автоматическое устройство для сбора клеток Harvester (Flow Laboratory). V
1. Культивирование клеток РС12.
Клетки феохромоцитомы крысы PC 12 культивировали в инкубаторе при 37°С в атмосфере 4% СО2 в среде Игла, модифицированной Дульбекко (ДМЕМ), с добавлением
4 мМ глутамина, 7,5% инактивированной лошадиной сыворотки, 7,5% инактивирован-ной эмбриональной сьшоротки крупного рогатого скота, 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептамицина. Культуру вели в пластиковых матрасах площадью 25 см2. Клетки пересевали раз в неделю по достижении ими монослоя (0,5 млн/см2), разбавляя их в 5 I раз.
2. Введение моноклональных антител в клетки РС12.
Перед экспериментом клетки PC 12 культивировали в течение 1 суток на подложке из полилизина. Для этого в лужи 6-луночного планшета вносили по 2 мл раствора полилизина в воде, 10 мкг/мл, и инкубировали в течение 18-20 ч в стерильных условиях при комнатной температуре или в течение 2 ч при 37°С. Затем планшеты промывали два раза раствором PBS. В таком виде планшеты не стоит хранить дольше одной недели, а лучше использовать сразу после покрытия.
В опыт брали клетки, достигшие монослоя, через неделю после очередного пересева. Их суспендировали в 1 мл свежей культуральной среды, переносили на планшеты, покрытые полилизином, по 2 млн кл в лунку (0,22 млн кл/см2), выдерживали в течение 5 мин на встряхивателе для равномерного распределения клеток по дну лунки и оставляли на ночь в СОг-инкубаторе. Прикреплялось 50-70% клеток.
На следующий день к началу эксперимента плотность клеток составляла 0,11-0,14 млн/см2 (рис. 4, А). После удаления культуральной среды их ополаскивали один раз К+-буфером следующего состава: 140 мМ KCl, 20 мМ PIPES, 5 мМ ЭГТА, 2 мМ MgCl2 и 0,1% БСА, pH 7,2, приготовленном на деионизованной воде. Клетки пермеабилизовали
5 мкМ дигитонином в том же буфере (1 мл раствора в лунку) в течение 4-6 мин при 37°С в СОг-инкубаторе (рис. 4, Б). Процесс пермеабилизации и последующее
МоАт ^ МоАт
МоАт ^ - ~ N ^оАт г " МоАт / л, * / М»А1 МоАт ' ✓ V
Интакгные клетки РС12
Пермеабилизация клеток 5 мкМ дигитонином в К +-буфере
МоАт
Инкубация клеток с МоАт, 0,5 мг/мл, в К+ -буфере с одновременной обработкой ультразвуком. В
МоАт МоАт МоАт МоАт Зарастание перфорированных МоА1 ^ ^сАг" - МоАт клеток в присутствии МоАт в питательной среде.
Иммунофлюоресцентаый анализ
Иммуноферментный анализ
Определение активности протеинкиназ д
Рис. 4. Пермеабилизация клеток и введение антител. восстановление целостности клеток контролировали визуально с помощью фазово-контрастной микроскопии (Nikon, х 400). Инкубацию с дигитонином проводили в течение времени, необходимого для перфорации всех клеток в монослое; при этом отдельно лежащие клетки частично лизировались. Когда большая часть клеток была пермеабили-зована, дигитонин удаляли, клетки быстро промывали один раз К+-буфером и добавляли в каждую лунку по 0,5 мл раствора- МоАт, 0,5 мг/мл, в том же буфере. Планшет с клетками в присутствии антител обрабатывали ультразвуком 4 раза по 2 сек с интервалом в I
20 с в водяной бане (Sonorex Super RK 510 Н) при 37°С, поворачивая планшет на 90° после каждого ультразвукового импульса для одинакового воздействия на клетки всех лунок (рис. 4, В). Затем удаляли антитела в К+-буфере, вносили в лунки по 0,5 мл раствора МоАт того же клона, 0,5 мг/мл, в бессывороточной среде ДМЕМ, содержавшей 0,1% БСА, и помещали клетки в ССЬ-инкубатор на 15-20 мин до полного восстановления их целостности (рис. 4, Г).
По окончании этого процесса из лунок удаляли антитела, клетки открепляли от подложки 0,25% раствором трипсина в 0,02% растворе ЭДТА (1 мл/лунка) в течение 5 мин при 37°С и собирали центрифугированием (10 мин, 200 g). Клетки тщательно суспендировали в PBS, содержавшем 10 мкг/мл ингибитора трипсина, и через 5 мин инкубации при комнатной температуре осаждали центрифугированием в том же режиме, затем промывали еще один раз раствором PBS. В промытых образцах определяли общее количество клеток в камере Горяева. С помощью трипанового синего было показано, что во всех образцах находились только живые клетки. Видимо, клетки, погибшие в процессе эксперимента, разрушались во время промывок (особенно при центрифугировании). Супернатант отсасывали шприцем с загнутой иглой во избежание захвата клеток.
Для уменьшения клеточных потерь открепившиеся от подложки клетки после их обработки дигитонином и всех последующих стадий собирали центрифугированием и возвращали в соответствующую лунку. Супернатанты,'содержавшие МоАт, хранили при -70°С для повторного использования при введении.антител.
В качестве контроля использовали: 1) клетки, не обработанные ни дигитонином, ни МоАт; 2) клетки, обработанные только МоАт (без дигитонина); 3) клетки, обработанные только дигитонином (без МоАт).
Клетки из каждой лунки делили на две порции. Каждый образец содержал 0,5-1,5 млн клеток. Наличие менее 0,5 млн клеток затрудняло дальнейший анализ. К осадку одI ной порции клеток добавляли 50 мкл буфера для гомогенизации, содержавшего 5 мМ трис, рН 7,4, 2 мМЭДТА, 3' мМ NaF, 0,5 мМ ДТТ, 150 MMNaCl, и хранили при -70°С для дальнейшего определения в них активности ПКА и КК. Вторую порцию клеток ли-зировали в 120 мкл PBS, содержавшем 1% тритона Х-100. Через 5 мин образец центрифугировали (5-10 мин, 5500 g) и в 100 мкл супернатанта определяли количество антител методом ИФА (рис. 4, Д).
3. Обнаружение Rile клетках РС12 иммунофлюоресцентным методом реакция Кунса).
Реакция Кунса [Coons А.Н., 1958] основана на взаимодействии антител с антигеном в фиксированных клетках и выявлении иммунного комплекса с помощью флюорес-циирующего препарата, реагирующего с антителами.
Накануне опыта на покровные стекла наносили концентрированный раствор коллагена или полилизина и подсушивали его в течение 15-30 мин при 37°С. Стекла помещали в лунки 24-луночного планшета и на них высевали клетки PC 12 в плотности 0,2 млн/см2 в 1 мл среды для культивирования.
На следующий день клетки выдерживали в течение часа при +4°С для снижения аутофлюоресценции и трижды промывали охлажденным'раствором Хэнкса без фенолового красного, рН 1,2-1,4, профильтрованным через миллипоровый фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Клетки фиксировали в течение 30 мин при комнатной температуре холодным раствором (+4°С) 4% формальдегида, приготовленным непосредственно перед опытом путем гидролиза параформальгегида в дистиллированной воде при нагревании в течение 15 мин. После фиксации клетки промывали 5 раз раствором 20 мМ PBS, содержавшем 0,1% тритона Х-100. Затем для снижения аутофлюоресценции клетки выдерживали в 0,1 I
М растворе глицина, рН 7,4, 30 мин при комнатной температуре и после этого промывали еще 2 раза раствором PBS. Неспецифическое связывание блокировали 3% раствором БСА в PBS в течение 1 ч при 37°С. Затем клетки инкубировали с антителами, 20-70 мкг/мл PBS, в тех же условиях (1 ч, 37°С). Несвязавшиеся антитела отмывали 3 раза раствором PBS, содержавшем 0,1% тритон, и 2 раза PBS.
Присоединившиеся антитела выявляли конъюгатом ФИТЦ с антителами к иммуноглобулинам мыши, 6 мкг /мл PBS, содержавшем 1 мг/мл БСА, в течение 1 ч при 37°С. В используемом препарате приходилось 2,5 ФИТЦ / Ат (моль/моль). Конъюгат с большим содержанием ФИТЦ (6 ФИТЦ / Ат, моль/моль) обладал высокой неспецифической сорбцией. Затем клетки снова отмывали от непрореагировавших веществ 3 раза раствором PBS, содержавшем 0,1% тритон, и 2 раза PBS.
После проведения опыта покровные стеклышки помещали клетками вниз на предметные стекла в каплю (5-10 мкл) смеси PBS с глицерином, 1:1 (v/v), и оконтуривали лаком, чтобы предотвратить высыхание клеток. В таком виде образцы можно хранить в течение 1-2 недель в темноте при +4°С.
Флюоресценцию регистрировали визуально на флюоресцентном микроскопе i
ЛЮМАМ, х 900, или Opton, х 600, и фотографировали на пленки (микрат-изопан, выдержка 5-7 мин, или KODAK, выдержка 15-30 сек.
В качестве контроля использовали: а) фиксированные клетки, не подвергавшиеся последующей обработке (контроль на аутофлюоресценцию); б) клетки, обработанные конъюгатом сразу после фиксации (контроль на неспецифическое присоединение конъ-югата); в) клетки, обработанные нормальными 1^0 мыши вместо антител (контроль на неспецифическое связывание антител). Нормальные мыши использовали в той же концентрации, что и МоАт.
Для доказательства проникновения МоАт в пермеабилизованные клетки последние I обрабатывали раствором антител, 1-5 мг/мл, в К+-буфере, содержавшем 2 мкМ дигито-нин, в течение 40 мин при 37°С и постоянном встряхивании. Затем раствор МоАт в К+-буфере с дигитонином собирали и замораживали при -70°С. Клетки промывали К+-буфером и инкубировали в растворе антител того же клона, 1-5 мг/мл, в бессывороточной среде ДМЕМ, содержавшей 0,1% БСА, в течение 15-20 мин в ССЪ - инкубаторе. После восстановления целостности плазматической мембраны клетки выдерживали 1 ч при 4°С, промывали раствором Хэнкса, фиксировали 4% формальдегидом, выдерживали в растворе глицина и обрабатывали конъюгатом ФИТЦ с антителами к иммуноглобулинам мыши, содержавшем 2,5 ФИТЦ / Ат (моль/моль), как описано выше.
В качестве контроля использовали: 1) клетки, не подвергавшиеся никакой обработке до фиксации формальдегидом (контроль на неспецифическое присоединение конъю-гата); 2) непермеабилизованные клетки, обработанные МоАт (контроль на неспецифическое присоединение антител к поверхности клеток); 3) клетки, в которые вводили нормальные мыши вместо МоАт (контроль на специфичность проникновения антител).
Мы обнаружили, что при повторном использовании смеси МоАт с дигитонином, хранившейся при -70°С, не происходило пермеабилизации клеток. В то же время хранение ранее не использованной смеси как в течение двух суток при -70°С, так и 1 ч при 37°С, не влияло на способность дигитонина к образованию перфораций в клеточной мембране. По-видимому, при инкубации дигитонина с клетками происходило истощение его раствора. Таким образом, смесь антител с дигитонином нельзя использовать повторно. ,
4. Определение количества антител, введенных в клетки, методом иммуноферментного анализа.
Метод основан на использовании двух типов антител - овцы и козы - к иммуноглобулинам G мыши, способных одновременно присоединяться к молекуле МоАт. I
На 96-луночном планшете (Greiner) сорбировали антимышиные IgG овцы, 2 мкг/мл, в PBS в течение 2 ч при 37°С и удаляли избыток 6елкат5-кратным промыванием лунок 150 мкл PBS-T, В лунки вносили по 100 мкл клеточного лизата в PBS, содержавшем 2 мг/мл БСА и 1% тритона Х-100. Контрольная лунка содержала только этот буфер. Для построения калибровочной кривой в ряд лунок планшета вносили по 100 мкл раствора МоАт в различной концентрации от 0,8 до 100 нг/мл в том же буфере. (Использовали антитела того же клона, что и при введении в клетки в анализируемом образце). Планшет инкубировали в течение 1 ч при 37°С и промывали PBS-T, как описано выше. Присоединившиеся МоАт обрабатывали конъюгатом антимышиных IgG козы с пероксидазой в заранее подобранной концентрации (100 мкл/лунка) в течение 1 ч при 37°С. Затем планшет промывали 5 раз раствором PBS-T, добавляя по 150 мкл в лунку. Образовавшийся иммунный комплекс выявляли с помощью хромогенной реакции окисления о-фенилендиамина перекисью водорода, катализируемой пероксидазой. О-фенилендиамин растворяли в 50 мМ цитратном буфере, рН 5,0, до концентрации 0,8 мг/мл и добавляли 8 мкл/мл 3% Н202 (конечная концентрация - 0,024%). Через 15 мин после внесения субстратной смеси (100 мкл в лунку) ферментативную реакцию останавливали добавлением 50 мкл 25% серной кислоты и измеряли величину оптического поглощения раствора при длине волны 492 нм на спектрофотометре Multiscan (Titertek) относительно поглощения в лунке, в которую не вносили клеточный лизат. Количество антител в лизате рассчитывали по калибровочной кривой, построенной с помощью Моt
Ат того же клона, который использовали в данном эксперименте.
В качестве контроля использовали непермеабилизованные клетки, обработанные тем же клоном МоАт и в той же концентрации, что и в опыте.При расчете количества проникших в клетки МоАт из значений, полученных в опытных образцах, вычитали соответствующие значения в контроле. I
5. Определение содержания RII в клетках РС12. f Содержание RII в клеточном экстракте определяли иммуноферментным методом, основанным на ее взаимодействии с двумя типами специфических антител: аффинно-очищенными поликлональными антителами кролика и МоАт мыши.
Ранее в нашей лаборатории были получены, аффинно очищены на иммобилизованном антигене и охарактеризованы поликлональные антитела кролика к RII свиньи [Гроздова И.Д., 1990]. В лунки 96-луночного планшета вносили по 50 мкл этих антител в концентрации 5 мкг/мл в 0,1 М карбонатном буфере, pH 9,3, и выдерживали в течение ночи при 4°С. На следующий день планшет промывали 5 раз раствором PBS-T, добавляя по 150 мкл в лунку, и вносили по 100 мкл экстракта 0,5 млн клеток. Для построения калибровочного графика в ряд лунок планшета добавляли RII быка в концентрации 0,0310,5 мкг/мл. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре и перемешивании непрореагировавшую регуляторную субъединицу и белки экстракта удаляли пятикратным промыванием лунок раствором PBS-T.
В лунки, в которые вносили клеточный экстракт, добавляли МоАт в концентрации 0,78-50 мкг/мл, а в лунки с RII быка - МоАт в одинаковой концентрации 25 мкг/мл и инкубировали в тех же условиях (1 ч, 20 °С). Непрореагировавшие антитела удаляли пятикратным промыванием лунок раствором PBS-T.
Связавшиеся с регуляторной субъединицей МоАт выявляли конъюгатом пероксиt дазы хрена с антителами козы к IgG мыши путем инкубации по 100 мкл раствора конъ-югата в лунках планшета в течение 30 мин при 37°С. Активность пероксидазы определяли, как описано выше ("Методы", п. 4).
В качестве контроля на неспецифическое взаимодействие МоАт с поликлональны-ми антителами кролика были использованы лунки планшета, в которые вносили всё' компоненты, кроме клеточного экстракта. В качестве контроля на неспецифическую сорбцию клеточного экстракта использовали лунки, в которые не были добавлены кроличьи антитела. Базальный уровень оптической плотности определяли по лунке, в которую не вносили антиген.
Результаты рассчитывали по методу Скэтчарда [Маршел Э., 1981]. Для этого из полученных опытных значений оптической плотности при 492 нм вычитали значения D492 в контролях. Полученные результаты представляли графически в виде зависимости D492/[MoAt],M от D492. Из уравнения, описывающего исследуемую зависимость, было получено значение оптической плотности (D492), которое соответствует максимальному содержанию RII в PC 12. Это количество RII определяли по калибровочному графику зависимости D492 от концентрации RII быка. Таким образом было определено количество RII в экстракте известного количества клеток.
6. Определение фосфотрансферазной активности протеинкиназ.
Фосфотрансферазную активность измеряли по методу Де Ланге [De Lange R.J., 1968], основанному на определении количества радиоактивного у-фосфата АТР, перенесенного на белок-субстрат.
Активность ПКА в экстрактах клеток определяли по фосфорилированию гистона Н1, выделенного из тимуса теленка, а активность ЮС - по-фосфорилированию казеина молока. Среда инкубации, 80 мкл, содержала 18,75 мМ трисморфолиноэтансульфоновой кислоты, рН 7,5, 0,375 мМ ЭГТА, 0,375 мМ ДТТ< 1,875 мМ MgCl2, 50 мкМ АТФ, t около 5x106 имн/мин 32Р-у-АТФ и либо 0,2 мг HI, 5 мкМ цАМФ и 0,5 мкМ MIX (ПКА*), либо 0,2 мг HI (ПКА~), либо 0,3 мг казеина. Реакционную смесь разливали по 70 мкл в пробирки и инкубировали 10-15 мин при 30°С. Реакцию начинали добавлением 0,1-1 мкг свободной С-субъединицы или 4-7 мкг белка экстракта (что соответствует 0,1 млн клеток) в объеме 10 мкл. После инкубации в течение 15 мин при 30°С реакцию останавливали перенесением 50 мкл каждой пробы на фильтр из Ватмана ЗММ размером 18x18 I мм, который сразу же помещали в 12% раствор ТХУ на 30 мин для фиксации белков. Фильтры промывали при комнатной температуре и легком перемешивании в 3-х порциях 6% ТХУ по 20 мин в каждой. В четвертой смене 6% раствора ТХУ фильтры оставляли на ночь при 4°С. На следующий день их отмывали от ТХУ двумя порциями ацетона, высушивали и измеряли их радиоактивность в 5 мл толуольного сцинтиллятора (ЖС-106 или ЖС-107) на жидкостном сцинтилляционном счетчике Rackbeta. Количество белка в экстракте определяли по методу Брэдфорд [Bradford М., 1976].
Удельную активность ферментов выражали в наномолях фосфата АТФ, перенесенного на белок-субстрат за 1 мин под действием 1 мг общего белка экстракта, и рассчитывали по формуле: имп/минт,рп^. - имп/минупнтрпшЛ х АТФ в пробе, нмоль х Укмкл 32Р-у-АТФ в пробе, имп/мин, х время, мин х белок, мг х V2, мкл где имп/минкотроля - радиоактивность пробы, не содержавшей фермент; Vi - общий объем пробы; У2 - объем пробы, нанесенный на фильтр. Количество 32Р-у-АТФ в пробе определяли по радиоактивности 35 мкл инкубационной смеси, высушенных на фильтре (без отмывания).
Для определения активности КК использовали казеин, дефосфорилированный путем щелочного гидролиза. Для этого казеин, 100 мг/мл, инкубировали в 5 мМ трисбуфере, рН 9,5, в течение 10-15 мин в кипящей водяной бане, нейтрализуя отщепляюt щийся фосфат добавлением 1н NaOH. По окончании гидролиза, когда рН раствора перестает изменяться, казеин осторожно подкисляли 0,1н уксусной кислотой до рН 8 при интенсивном перемешивании, диализовали против воды, осветляли центрифугированием при 8000 g и хранили при -20°С.
7. Определение связывания цАМФ регуляторной субъединицей. 1
Метод основан на конкурентном связывании радиоактивного и холодного цАМФ с RII и последующей сорбции комплекса нуклеотидов с белком на нитроцеллюлозном . фильтре [Gilman A.G., 1970].
Инкубацию RII с цАМФ проводили в 70 мМ К-фосфатном буфере, рН 6,5, содержавшем 5 мМ теофиллина, 5 мМ MgCI2, 5 мкМ БСА, 2,7 мкМ цАМФ, 3-4*105 имп/мин 3Н-цАМФ. Объем проб составлял 0,3 мл. Контрольные пробы не содержали RII.
Пробы инкубировали в течение 1,5-2 часов при комнатной температуре. Комплекс белков с цАМФ сорбировали на нитроцеллюлозных фильтрах Сынпор с диаметром пор 0,3 мк, а свободный цАМФ отмывали 20 мМ Na-фосфатным буфером, рН 6,0-6,6. Фильтр предварительно смачивали буфером, так как сухой фильтр хуже связывает белки. Пробу количественно переносили на фильтр и промывали 20 мл буфера, добавляя его порциями по 3-5 мл. Фильтры высушивали, помещали в 10 мл толуольного сцинтилля-тора, содержавшего 99,6% толуола, 0,4% ППО, 0,022% ПОПОП, и измеряли радиоактивность на жидкостном сцинтилляционном счетчике фирмы LKB (Швеция).
Количество цАМФ, связавшегося с белком, рассчитывали по формуле: ими/минпрпйы-имп/мин^нтрп™) х цАМФ в пробе, нмоль
3Н-цАМФ в пробе, имп/мин х белок, мг где имп/минКонтроля - радиоактивность пробы, не содержавшей RII.
Количество 3Н-цАМФ в пробе определяли по радиоактивности 10 мкл инкубационной смеси, высушенных на фильтре (без отмывания).
8. Выделение монотональных антител из асцитной жидкости. t
Антитела выделяли методом хроматографии на/ белок А - сефарозе в соответствии с инструкцией фирмы "Sigma". Носитель уравновешивали 1,5 М глициновым буфером, рН 8,9, содержавшем 3 М NaCl (буфер для нанесения). К асцитной жидкости добавляли NaCl до ЗМ, что способствовало агрегации липидов, доводили рН до 8,9 насыщенным водным раствором трис и центрифугировали 15 мин при 2000 g. В случае образования пленок жира супернатант фильтровали через стеклянный фильтр G1 и фильтрат разво дили равным объемом буфера для нанесения. Полученный раствор наносили на колонку белок А-сефарозы со скоростьюг10-15 мл/час методом циклизации в течение ночи при
4°С . Балластные белки отмывали тем же буфером со скоростью 6 мл/час и элюировали антитела 0,1 М цитратным буфером, рН 4,5, со скоростью 13 мл/час. Антитела диализо-вали против PBS в течение ночи, концентрировали центрифугированием в конических миллипоровых фильтрах при 300-500 g и хранили в концентрации 1,5-17 мг/мл при -70°С. Носитель регенерировали 0,1 М цитратным буфером, рН 3,0, и затем отмывали PBS, в котором оставляли на хранение при +4°С. Сорбционная емкость колонки - 15 мг антител на 1 мл носителя.
Очищенные таким образом препараты были гомогенны по данным SDS-электрофореза по методу Лэммли [Laemmli U.K., 1970] и в отсутствие восстанавливающих агентов были представлены одной белковой полосой молекулярной массы 160 кДа.
9. Выделение нормальных иммуноглобулинов G мыши. Нормальные иммуноглобулины G мыши осаждали из сыворотки крови животных равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония, рН 7,2, при комнатной температуре и непрерывном перемешивании, центрифугировали в течение 10 мин, 13000 g. Осадок растворяли в PBS и дважды переосаждали половинным объемом того же раствора (NH4)2S04. Если в сыворотке много липидов и на ее поверхности образуется жировая пленка, то сыворотку следовало предварительно отцентрифугировать, иначе при высаI ливании осадок не образовывался. После высаливания осадок растворяли в небольшом объеме PBS и диализовали в течение ночи против PBS при +4°С.
По данным SDS-электрофореза в присутствии меркаптоэтанола основная часть белков в полученном препарате иммуноглобулинов была представлена их легкими и тяжелыми цепями молекулярной массы 20 и 50 кДа, соответственно. В них также были обнаружены две примеси - сывороточный альбумин, 67 кДа, и в небольшом количестве I белок 94 кДа.
10. Иммуноферментньш анализ моноклональных антител.
Иммуноферментный анализ (ИФА) основан на определении количества антител, присоединившихся к сорбированному на планшете антигену, с помощью конъюгата антивидовых антител и пероксидазы хрена. Измеряемая ферментативная активность перок-сидазы пропорциональна количеству присоединившихся антител.
В лунки 96-луночного планшета для иммуноферментного анализа вносили по 100 мкл RII мозга быка, 2 мкг/мл в PBS, и инкубировали в течение ночи при +4°С или 2 часа при 37°С. Избыток антигена отмывали пять раз раствором PBS-T, 200 мкл/лунка, и к сорбированному антигену добавляли по 100 мкл раствора антител в концентрации от 0,9 до 2000 нг/мл в PBS-AT и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Избыток антител отмывали 5 раз по 200 мкл PBS-T. Присоединившиеся антитела выявляли добавлением в лунки до 100 мкл антител козы к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с перок-сидазой хрена в растворе PBS-AT, в течение 1 часа при 37°С; затем промывали 5 раз по 200 мкл PBS-T. В качестве хромогенного субстрата пероксидазы использовали 0,41 мМ раствор ABTS в 50 мМ цитратном буфере, pH 4,5 (100 мкл раствора ABTS, 22,4 мг/мл, на 10 мл буфера), в присутствии 7,1 мМ (0,024%) перекиси водорода (80 мкл 3% Н2О2 на 10 мл буфера). Развитие зеленой окраски происходило в течение 15-30 мин при легком перемешивании при комнатной температуре. Величину оптического поглощения в лунках измеряли при длине волны 405 нм на спектрофотометре МиШэсап (ТйеНек) относительно поглощения в лунке, в которую не были добавлены антитела к 1Ш.
Из полученных данных рассчитывали кажущиеся Кс иммунных комплексов МоАт с М1 быка по методу Скэтчарда [Маршел Э., 1981]. Для этого из величины оптической плотности, измеренной при каждой концентрации МоАт, вычитали О405 в контроле. Полученные значения представляли графически в виде зависимости О405/[МоАт], М от В405. I
Из уравнения, описывающего исследуемую зависимость, были рассчитаны значения Кс.
11. Получение конъюгатов антител с пероксидазой хуена периодатным методом.
Метод основан на окислении углеводных цепей пероксидазы периодатом натрия с образованием альдегидных групп, вводимых далее в реакцию восстановительного алки-лирования с аминогруппами антител [Туввеп Р., 1984]. Он был использован для получения конъюгатов пероксидазы с антителами козы, выработанными к 1§0 мыши.
5 мг пероксидазы хрена растворяли в 0,5 мл 0,1 М карбонатного буфера (0,1 М КаНСОз и 0,01 М ШгСОз), рН 9,3. К этому раствору добавляли 0,5 мл 16 мМ раствора КаГО4 и оставляли смесь на 2 часа при комнатной температуре в темноте при непрерывном перемешивании. К концу инкубации раствор приобретал оранжево-коричневый цвет.
В это время антитела высаливали добавлением сухого сульфата натрия непосредственно к раствору антител из расчета 18 г На2504 на 100 мл раствора и встряхивали до образования белого осадка. Его отделяли центрифугированием (5 мин, 8000 ¡¡) и растворяли в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,3.
К приготовленному раствору антител, 5-10 мг/мл, добавляли раствор пероксидазы хрена в молярном соотношении 2:1 и сухой сефадекс 0-250 в количестве 1/6 части от общего объема смеси и оставляли на ночь при 4°С.
На следующий день образовавшийся конъюгат отделяли от сефадёкса центрифуги/ рованием в течение 5 мин при 20 g. К супернатанту добавляли раствор NaBKU, 5 мг/мл, в 0,1 мМ NaOH в количестве 1/20 части от объема конъюгата и инкубировали в течение 30 мин при непрерывном перемешивании. Затем добавляли такой же раствор NaBHtB количестве 3/20 от исходного объема конъюгата и инкубировали 1 ч при комнатной температуре и непрерывном перемешивании.
Для получения чистого конъюгата к смеси добавляли равный объем насыщенного I раствора сульфата аммония, выдерживали в течение 15 мин при 4°С и центрифугировали 5 мин при 8000 g. Полученный осадок растворяли в минимальном объеме PBS и диали-зовали в течение ночи при 4°С против раствора PBS.
После диализа к раствору конъюгата добавляли БСА, мертиолат и равный объем глицерина. Конечные концентрации БСА и мертиолата после разведения глицерином составляли 1% и 0,05%, соответственно. Конъюгат хранили при -20°С.
12. Получение конъюгатов антител с флюоресцеинизотиоиианатом (ФИТЦ).
Метод основан на образовании ковалентной связи между изотиоцианатной группой ФИТЦ и NH2-rpynnaMH иммуноглобулинов ["Иммунологические методы", 1987].
25-300-кратный молярный избыток флюоресцеинизотиоцианата, 1 мг/мл в этаноле, добавляли к раствору антител, 1,35-2,5 мг/мл, в 0,1 М боратном или карбонатном буфере, рН 8,2-9,3. Смесь инкубировали при комнатной температуре (14°С) или 37°С в течение 2-3 часов. Образовавшийся конъюгат отделяли от непрореагировавшего ФИТЦ гель-фильтрацией на биогеле Р4, уравновешенном PBS. Фракции, содержавшие белок, объединяли и определяли его концентрацию. Молярное соотношение ФИТЦ и антител в конъюгате рассчитывали на основании спектрофотометрического определения концентрации ФИТЦ при длине волны 495 нм, принимая коэффициент его молярной экстинк-ции равным 80000 М'^см"1.
Количество прореагировавших аминогрупп белка повышалось при увеличении
4 / времени, температуры реакции и количества добавляемого ФИТЦ (таблица 2).
Таблица 2.
Зависимость количества модифицированных на белке аминогрупп от условий реакции.
Время реакции, ч Температура, °С Избыток ФИТЦ ФИТЦ/Ат, моль/ моль
2 14 25 0,5
3 14 50 1,2
3 14 25 1,6
3 14 100 2,5
3 37 300 6,2
Было получено 3 конъюгата ФИТЦ с антителами кролика, направленных к иммуноглобулинам мыши, содержавших 1,6, 2,5 и 6,2 молей ФИТЦ в расчете на 1 моль Ат. Оптимальным для работы оказался препарат, в котором на 1 моль антител приходилось 2,5 моля ФИТЦ.
13. Выделение гистона HI.
Гистон HI выделяли из тимуса теленка по методу Джонса [Jones E.W., 1962] с некоторыми модификациями. Все процедуры проводили при 4°С.
Замороженный тимус дробили на мелкие куски, пропускали через мясорубку и гомогенизировали в трех объемах 0,1 М HCl в гомогенизаторе Waring Blender три раза по 15 с. Гомогенат центрифугировали при 4000 g в течение 10 мин и супернатант фильтровали через 4 слоя марли. Балластные белки осаждали из супернатанта 5% хлорной кислотой в течение 3 часов во льду и удаляли центрифугированием (4000 g, 10 мин). Гистон HI осаждали из супернатанта 13-18% ТХУ в течение 2 часов при 4°С (можно оставить на ночь). Осадок собирали центрифугированием (400Ö g, 10 мин) и промывали 3-4 раза ацетоном для удаления ТХУ. При суспендировании в первых порциях ацетона оса' " 57 док был поначалу вязкий, липкий, но по мере удаления ТХУ он становился все более пушистым. Промытый осадок высушивали на воздухе до исчезновения запаха ацетона.
Из 200 г тимуса теленка получали 600 мг гистона Н1. Препараты были гомогенцы. по данным БОБ-электрофореза. Н1 был представлен одной белковой полосой молекулярной массы 21-22 кДа.
Отсутствие в препарате других гистонов проверяли методом кислотного электрофореза [Рапут Б., 1969] в 15% полиакриламидном геле, содержавшем 8 М мочевину и I
12,5% уксусную кислоту. Анализируемые белки растворяли в 0,9 М уксусной кислоте, содержавшей 8 М мочевину и краситель родамин А. Перед нанесением образцы кипяти* ли в водяной бане в течение 10 мин. В лунки геля вносили по 2,5-5 мкг белка. В качестве электродного буфера использовали 0,9 М уксусную кислоту. Электрофорез проводили в геле толщиной 1 мм при 20-25 мА в течение времени, необходимого для полного прохождения родамина через гель плюс половина этого времени.
По окончании электрофореза гель фиксировали в растворе 50% ТХУ в течение ночи и окрашивали в течение 30 мин 0,25% раствором Кумасси 11-250 в смеси изопропа-нол: уксусная кислота: вода = 25:10:65. Избыток красителя удаляли 7% уксусной кислотой. На электрофореграмме наблюдалась одна полоса, соответствующая гистону Н1. В качестве контроля использовали ранее полученный и охарактеризованный препарат гистона Н1.
14. Анализ пролиферативной активности клеток. Интенсивность пролиферации клеток оценивали по включению 3Н-тимидина в ки-слотонерастворимую фракцию клеток в процессе биосинтеза ДНК.
Клетки РС12 высевали в лунки 96-луночного планшета в плотности 0,033 и 0,1 млн клеток/см2 в 200 мкл среды культивирования за сутки до Эксперимента. На следующий день во все лунки первого ряда планшета вносили 3Н-тимидин, 0,5 мкКи/лунка (2,5 мкКи/мл), и оставляли на 3 часа в СОг-инкубаторе пр^ 37°С.
Через 3 часа клетки собирали на бумажные фильтры фирмы Titertek с помощью автоматического устройства для сбора клеток Harvester. Кислоторастворимые продукты отмывали 5% ТХУ. Затем фильтры промывали дистиллированной водой, высушивали при комнатной температуре в течение ночи и измеряли их радиоактивность в 5 мл толуольного сцинтиллятора ЖС-106 или ЖС-107 на жидкостном сцинтилляционном счетчи
KeRackbeta.
Следующий ряд лунок на планшете анализировали таким же образом на второй день и так до тех пор, пока клетки не достигали монослоя и не переставали делиться.
IS. Определение концентрации белков. Концентрацию белков определяли тремя методами:
1) спектрофотометрически при длине волны 280 нм, принимая коэффициент экс-тинкции БСА равным 0,67 мл*мг"1*см"1; иммуноглобулинов - 1,36 мл*мг1*см"1;
2) по методу Брэдфорд [Bradford М., 1976] в микроварианте на 96-луночных планшетах, измеряя оптическую плотность при 594 нм на мультискане (Titertek);
3) по методу Лоури [Lowry О.Н., 1951], осаждая белки 5% ТХУ на холоду. Белковый осадок промывали дважды ацетоном для удаления ТХУ, подсушивали до исчезновения запаха ацетона, растворяли в 1н NaOH и определяли количество белка по окрашиванию реактивом Фолина.
RII и С-субъединицы были выделены из мозга человека и животных (бык, свинья) Гроздовой И.Д. по ранее описанному методу [Grozdova I.D., 1992]. МоАт к RII быка были получены Шемчуковой О.Б в отделе биотехнологии Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Цель настоящей работы состояла в решении двух задач: 1) разработка метода введения белков (IgG) в живые клетки феохромоцитомы крысы РС12 с сохранением жизнеспособности нагруженных белками клеток; 2) изучение внутриклеточных систем фосфо-рилирования с помощью введенных в клетки МоАт к регуляторной субъединице цАМФ-зависимой протеинкиназы II типа.
I. Влияние специфических антител на свойства ПКАII типа in vitro.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Александрова, Наталья Анатольевна
выводы
1. Впервые разработан метод введения иммуноглобулинов G в пермеабилизован-ные дигитонином клетки феохромоцитомы крысы PC 12 с последующим восстановлением целостности цитоплазматической мембраны и сохранением жизнеспособности нагруженных белками клеток. Предлагаемый метод позволяет изучать биохимию живой клетки.
2. Показано, что антитела, препятствовавшие присоединению цАМФ к регулятор-ной субъединице цАМФ-зависимой протеинкиназы II типа in vitro, полностью подавляли диссоциацию холофермента in vivo под действием циклического нуклеотида. В то же время, антитела, повышавшие in vitro сродство регуляторной субъединицы к цАМФ, усиливали диссоциацию протеинкиназы через 4 часа после их введения в клетку. Таким образом, с помощью введенных в клетки разных клонов антител, обладающих различным влиянием на регуляторную субъединицу, возможна модуляция свойств цАМФ-зависимой протеинкиназы in vivo.
3. Исследована длительность существования введенных антител внутри клеток и их влияние на свойства фермента во времени. При этом образование иммунного комплекса стабилизировало введенные в клетки антитела.
4. Впервые изучена связь активности цАМФ-зависимой протеинкиназы и цАМФ-независимой казеинкиназы с пролиферативным статусом клеток РС12. Показано, что в отличие от других типов клеток, для линии PC 12 в процессе пролиферации характерно относительное увеличение активности цАМФ-зависимых процессов по сравнению с цАМФ-независимыми.
5. Впервые обнаружено существование взаимосвязи между цАМФ-зависимой протеинкиназой и казеинкиназой в клетке. Направленное увеличение активности цАМФ-зависимой протеинкиназы под действием введенных в клетку специфических антител сопровождалось синхронным пропорциональным увеличением активности казеинкина-зы.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Александрова, Наталья Анатольевна, Москва
1. Александров В.Б., Левитан М.Х., Минаев Б.Н., Эшба И.Р., Васильев В.Ю., Гроздова И. Д. Определение цАМФ и протеинкиназ в диагностике опухолей толстой кишки. -Вопр. Онкол., 1986, т. 32, № 8, с. 45-53.
2. Васильев В.Ю., Дорофеев Г.И., Ивашкин В.Т. Показатели протеинкиназной активности и проблемы биохимической диагностики злокачественного роста. Бюл. Экс-пер. Биол., 1984, № 6, с. 717-719.
3. Гроздова И.Д., Михайловскиий А.В., Эшба И.Р., Петухов С.П., Васильев В.Ю., Северин Е.С. Изменение активности протеинкиназ в коже при раке. Вопр. Мед. Химии, 1986, т. 32, №3, с. 104-108.
4. Гроздова И.Д., Нюпенко Е.В., Свешникова Е.В., Северин Е.С. Иммунохимические свойства регуляторной субъединицы сАМР-зависимой протеинкиназы II типа. Биохимия, 1990, т. 55, вып. 7, стр. 1244-1250.
5. Z. "Иммунологические методы", Москва, "Медицина", 1987, стр. 130-131.
6. Маршел Э. "Биофизическая химия", Москва, "Мир", 1981, т. 1, стр. 80-86.9\ Ребиндер П. А. Избранные труды. Физико-химическая механика Москва, 1979.
7. Свешникова Е.В. Иммунохимическое исследование регуляторной субъединицы сАМР-зависимой протеинкиназы II типа. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Москва, 1994, стр. 67, 75, 77.
8. Северин Е.С., Кочеткова М.Н. Роль фосфорилирования в регуляции клеточной активности. Москва, "Наука", 1985, с. 74-101.
9. Справочник Биохимика, Москва, "Мир", 1991, стр.171.
10. Химическая Энциклопедия, Москва, "Большая Российская Энциклопедия", 1995, т.4, стр. 576-579; 1998, т.5, стр. 588-590.
11. Эшба И.Р., Кочанова Н.А., Попов К.М., Буларгина Т.В.,Северин Е.С. Изучение структурных особенностей регуляторной субъединицы цАМФ-зависимой протеинкиназы II типа с помощью моноклоналъных антител. Биохимия, 1987, т. 52, № 10, стр. 1740-1746.
12. Adam S R., Sterne-Marr R., Gerace L. Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors. J. Cell Biol, 1990, v. 111, pp. 807-816.
13. Ж Adams S.R., Harootunian A.T., Buechler Y.J., Taylor S.S., Tsien R.Y. Fluorescence ratio imaging of cyclic AMP in single cells. Nature, 1991, v. 349, pp. 694-697.
14. Amieux P.S., Cummings D.E., Motamed K., Brandon E.P.,Wailes L.A., Le K., Idzerda R.L., McKnight G.S. Compensatory regulation of RIa protein levels in protein kinase A mutant mice. J. Biol. Chem., 1997, v. 272, No 7, pp. 3993-3998.
15. Angelo R., Rubin C.S. Molecular characterization of an anchor protein (AKAPCE) that binds the RI subunit (RCE) of type I protein kinase A from Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem., 1998, v. 273, No 23, pp. 14633-14643.
16. Barsony J., Marx S.J. Immunocytology on microwave-fixed cells reveals rapid and agonist-specific changes in subcellular accumulation patterns for cAMP or cGMP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, v. 87, pp. 1188-1192.
17. Bechtel P.J., Beavo J.A., Krebs E.G. Purification and characterization of catalytic subunit of skeletal muscle adenosine 3',5'-monophosphate-dependent protein kinase. J. Biol. Chem., 1977, v. 252, pp. 2691-2697.
18. Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteins utilizing a principle of protein-dye binding. Anal. Biochim., 1976, v. 72, pp. 248254.
19. Bregman D.B., Hirsch A.H., Rubin C.S. Molecular characterization of bovine brain P 75, a high affinity binding protein for the regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinase II beta. J. Biol. Chem., 1991, v. 266, No 11, pp. 7207-7213.
20. Builder S.E., Beavo J.A., Krebs E.G. The mechanism of activation of bovine skeletal muscle protein kinase by adenosine 3':5'-monophosphate. J. Biol. Chem., 1980, v. 255, pp. 35143519.
21. Buss J.E., McCune R.W., Gill G.N. Comparison of cyclic nucleotide binding to adenosine 3' 5'-monophosphate and guanosine 3',5'monophosphate protein kinases. J. Cyclic Nucleotide Res., 1979, v. 5, pp. 225-237.
22. Carr D.W., Stofko-Hahn RE., Fraser I.D.C., Cone R.D., Scott J.D. Localization of the cAMP-dependent protein kinase to the postsynaptic densities by A-kinase anchoring proteins. Characterization ofAKAP 79. J. Biol. Chem., 1992, v. 267, pp. 16816-16823.
23. Cheley S., Panchal R.G., Carr D.W., Scott J.D., Bayley H. Type II regulatory subunits of cAMP-dependent protein kinase and their binding proteins in the nervous system. J. Biol. Chem., 1994, v. 269, No 4, pp. 2911-2920.
24. Chen L.J., Walsh D.A. Multiple forms of hepatic adenosine 3',5'-monophosphate-dependent protein kinase. Biochemistry, 1971, v. 10, No 19, pp. 3614-3621.
25. Ciardiello F., Tortore G. Interactions between the epidermal growth factor receptor and type I protein kinase A: biological significance and therapeutic implications. Clin. Cancer Res., 1998, v. 4, No 4, 821-828.
26. Claycomb W.C. Biochemical aspects of cardiac muscle differentiation. J. Biol. Chem., 1975, v. 250, pp. 3229-3235.
27. Clegg C.H., Cadd G.G., McKnight G.S. Genetic characterization of a brain-specific form of the type I regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1988, v. 85, pp. 3703-3707.
28. Cobb C.E., Beth A.H., Corbin J.D. Purification and characterization of an inactive form of cyclic AMP-dependentprotein kinase containing bound cyclic AMP. J. Biol. Chem., 1987, v. 262, pp. 16566-16574.
29. Coghlan V.M., Perrino B.A., Howard M., Langeberg L.K., Hicks J.B., Gallatin W.M., Scott J.D. Association ofprotein kinase A and protein phosphatase 2B with a common anchoring protein. Science, 1995, v. 267, pp. 108-111.
30. Cohen P., Pylatt D.B., Nimmo G.A. The hormonal control of glycogen metabolism: the amino acid sequence at the phosphorylation site of protein phosphatase inhibitor-1. FEBS Lett.,1977,v. 76, pp. 182-186.
31. Coons A.H. Fluorescent antibody methods. In: General cytochemical methods., ed. By J.F. Danielli, Acad. Press., New York, 1958, pp. 399-447.
32. Corbin J.D., Kelly S.L., Park C.R. The distribution and dissociation of cyclic adenosine 3',5'-monophosphate-dependent protein kinases in adipose, cardiac, and other tissues. J. Biol. Chem., 1975, v. 250, pp. 218-225.
33. Corbin J.D., Kelly S.L. Characterization and. regulation of heart adenosine 3',5'-mono-phosphate-dependentprotein kinase isozymes. J. Biol. Chem., 1977, v. 252, pp. 910-914.
34. Cummings D.E., Brandon E.P., Pianos J.V., Motamed K., Idzerda RL, McKnight G.S. Genetically lean mice result from targeted disruption of Rllfi-subunit of protein kinase A. -Nature, 1996, v. 382, pp. 622-626.
35. Cupp J., Vitalis E.A, Scott J.D. Dimerization of the type II regulatory subunit of the cAMP-dependent protein kinase is maintained through the extreme aminoterminal residues. -Protein Soc. Proc., 1989, 3rd Symp. (Abstr. T141).
36. De Lange R.J., Kemp R.G., Riley W.D., Cooper R.A., Krebs E.G. Activation of skeletal muscle phosphorylase kinase by adenosine triphosphate and adenosine 3\5'-monophosphate. -J. Biol. Chem., 1968, v. 243, No 9, pp. 2200-2208.
37. DeManno D.A., Hunzicker-Dunn M. cAMP-dependent protein kinase isozymes in porcine follicles and corpora lutea. Mol. Cell Endocrinol, 1991, v. 80, pp. 91-104.
38. Doskeland S.O., Ueland P.M. Binding proteins for adenosine 3',5'-cyclic monophosphate in bovine adrenal cortex.- Biochem. J., 1977, v. 165, pp. 561-573.
39. Dransfield D.T., Bradford A.J., Smith J., Martin M., Roy C., Mangeat P.H., Goldenring J.R. Ezrin is a cyclic AMP-dependent protein kinase anchoring protein. The EMBO J., 1997, v. 16, No l,pp. 35-43.
40. Erlichman J., Sarkar D., Fleischer N., Rubin C.S. Identification of two subclasses of type II cAMP-dependentprotein kinases. J. Biol. Chem., 1980, v. 255, pp. 8179-8184.
41. Erlichman J., Bloomgarden D., Sarkar D., Rubin C.S. Activation of cyclic AMP-dependent protein kinase isoenzymes: studies using specific antisera. Arch. Biochem. Biophys., 1983, v. 227, No 1, pp. 136-146.
42. Fleischer N., Rosen O.M., Reichlin M. Radioimmunoassay of bovine heart protein kinase. -Proc. Natn. Acad. Sci. USA, 1976, v. 73, pp. 54-58.
43. Fletcher W.H., Van Patten S.M., Cheng H.C., Walsh D.A. Cytochemical identification of the regulatory subunit of the cAMP-dependent protein kinase by use of fluorescently labeled catalytic subunit. J. Biol. Chem., 1986, v. 261, pp. 5504-5513.
44. Gilman A.G. A protein binding assay for adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate. Proc. Natn. Acad. Sci., USA, 1970, v. 67, No 1, pp. 305-312.
45. Gray P C., Tibbs V.C., Catterall W.A., Murphy B.J. Identification of a 15-kDa cAMP-dependent protein kinase-anchoring protein associated with skeletal muscle L-type calcium channels.-J. Biol. Chem., 1997, v. 272, No 10, pp. 6297-6302.
46. Haddox M.K., Roeske W.R., Russel D.H. Independent expression of cardiac type I and II cyclic AMP-dependent protein kinase during murine embryogenesis and postnatal development. Biochim. Biophys. Acta, 1979, v. 585, pp. 527-534.
47. Hirsch A.H., Glantz S.B., Li Y., You Y., Rubin C.S. Cloning and expression of an intronless gene for AKAP 75 an anchor protein for the regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinase Hp- J. Biol. Chem., 1992, v. 267, pp. 2131-2134.
48. Hofmann F., Beavo J.A., Bechtel P.J., Krebs E.G. Comparison of adenosine 3',5'-mono-phosphate-dependent protein kinases from rabbit skeletal and bovine heart muscle. J. Biol. Chem., 1975, v. 250, pp. 7795-7801.
49. Hofmann F., Bechtel P.J., Krebs E.G. Concentrations of cyclic AMP-dependent protein kinase subunits in various tissues. J. Biol. Chem., 1977, v. 252, pp. 1441-1447.
50. Hofmann F. Apparent constants for the interaction of regulatory and catalytic subunit of cAMP-dependentprotein kinase I andII. J. Biol. Chem., 1980, v. 255, pp. 1559-1564.
51. Horenstein A., Piras M.M., Mordoch J. Protein phosphokinase activities of resting and proliferation lymphocytes. Changes upon phytohemagglutinin stimulation and acute lymphobblastic leukemia cells. Exp. Cell Res., 1976, v. 101, pp. 260-266.
52. Jones E.W., Butler J.A.V. Further fractionations of histones from calf thymus. Biochem. J., 1962, v. 82, pp. 15-18.
53. Kalman D., Wong B., Horvai A.E., Cline M.J., O'Lague P.H. Nerve growth factor acts through cAMP-dependent protein kinase to increase the number of sodium channels in PC 12 cells. Neuron, 1990, v. 4, No 3, pp. 355-366.
54. Kapoor C.L., Beavo J. A., Steiner A.L. Radioimmunoassay of the regulatory subunit of type I cAMP-dependent protein kinase. J. Biol. Chem., 1979, v. 254, pp. 12427-12432.
55. Keryer G., Rios R.M., Lohmann S., Bornens M. A 350 kD centrosomal protein binds the regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinase type II in human lymphoblasts. Cell Biol. Intn. Rep., 1990, Abstracts Supplement, v. 14, P284.
56. Kvanta A., Fredholm B.B. Synergistic effects between protein kinase C and cAMP on activator protein-1 activity and differentiation of PC12 pheochromocytoma cells. J. Mol. Neurosci., 1993, v. 4, No 4, pp. 205-214.
57. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of Bacteriophage T4. Nature, 1970, v. 227, pp. 680-685.
58. Lee D.C., Carmichael D.F., Krebs E.G., McKnight G.S. Isolation of a cDNA clone for the type I regulatory subunit of bovine cAMP-dependent protein kinase. Proc. Natn. Acad. Sci. USA., 1983, v. 80, pp. 3608-3612.
59. Leiser M, Rubin C.S., Erlichman J. Differential binding of the regulatory subunits (RII) of cAMP-dependent protein kinase II from bovine brain and muscle to Rll-binding proteins. -J. Biol. Chem., 1986, w. 261, pp. 1904-1908.
60. Lemaire S., Pelletier G., Labrie F. Adenosine 3',5'-monophosphate-dependentprotein kinase from bovine anterior pituitary gland. J. Biol. Chem., 1971, v. 246, No 23, pp. 7307-7310.
61. Licameli V., Mattiace L.A., Erlichman J., Davies P., Dickson D., Shafit-Zagardo B. Regional localization of the regulatory subunit (RII beta) of the type II cAMP-dependent protein kinase in human brain. Brain Res., 1992, v. 578, No 1-2, pp. 61-68.
62. Lohmann S.M., DeCamilli P., Einig I.,Walter U. High-affinity binding of the regulatory subunit (RII) of cAMP-dependent protein kinase to microtubule-associated and other cellular proteins. Proc. Natn. Acad. Sci. USA, 1984a, v. 81, pp. 6723-6727.
63. Lohmann S.M., Walter U. Regulation of cellular and subcellular concentration and distribution of cyclic nucleotide dependent protein kinases. - Adv. Cyclic Nucleotide Protein Phosphor.Res., 19846, v. 18, pp. 63-117.
64. Lohmann S.M., Walter U., Greengard P. Identification of endogenous substrate proteins for cAMP-dependentprotein kinase in bovine brain. ~ J. Biol. Chem., 1980, v. 255, No 20, pp. 9985-9992.
65. Lohse M.J., Lefkowitz R.J., Caron M.G., Benovic J.L. Inhibition of fi-adrenergic receptor kinase prevents rapid homologous desensitization of fe-adrenergic receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, v. 86, No9, pp. 3011-3015.
66. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, v. 193, p. 265.
67. Macleod J., Mei X., Erlichman J., Orr G.A. Association of the regulatory subunit of a type II cAMP-dependent protein kinase and its binding proteins with the fibrous sheath of rat sperm flagellum. Eur. J. Biochem., 1994, v. 225, pp. 107-114.
68. Majumder G.C., Turkington R.W. Adenosine 3',5'-monophosphate-dependent and independent protein phosphokinase isoenzymes from mammary gland. J. Biol. Chem., 1971, v. 246, No 8, pp. 2650-2657.
69. Malkinson A.M., Hogy L., Charrett A. J., Gunderson T.J. Ontogenetic studies of cyclic AMP-dependent protein kinase enzymes from mouse heart and other tissues. J. Exp. Zool., 1978, v. 205, pp. 423-432.
70. Matthews H.R., Huebner V.D. Nuclear protein kinases. Mol. Cell. Biochem., 1984, v. 59, pp. 81-99.
71. McCartney S.,Little B.M., Langeberg L.K., Scott J.D. Cloning and characterization of A-kinase anchor protein 100 (AKAP 100). J. Biol. Chem., 1995, v. 270, No 16, pp. 93279333.
72. Meek D.W., Simon S., Kikkawa U., Eckhart W. The p53 tumor suppressor protein is phosphorylated at serine 389 by casein kinase II. The EMBO J., 1990, v. 9, No 10, pp. 3253-3260.
73. Meinkoth J.L., Ji Y., Taylor S.S., Feramisco J.R. Dynamics of the distribution of cyclic AMP-dependent protein kinase in living cells. Proc. Natn. Acad. Sci. USA, 1990, v. 87, pp. 9595-9599.
74. Nilsen-Hamilton M., Hamilton R.T. Fibroblast growth factor causes an eatly increase in phosphorylation of a membrane protein in quiescient 3T3 cells. Nature, 1979, v. 279, No 5712, pp. 444-446.
75. Obar R.A., Dingus J., Bayley H., Vallee R.B. The RII subunit of cAMP-dependent protein kinase binds to a common amino-terminal domain in microtubule-associated proteins 2A, 2B, and2C. Neuron, 1989, v. 3, pp. 639-645.
76. Ogreid D., Ekanger R, Suva R.H., Miller J.P., Sturm P., Corbin J.D., Doskeland S.O. Activation of protein kinase isozymes by cyclic nucleotide analogs used singly or in combination. Eur. J. Biochem., 1985, v. 150, pp. 219-227.
77. Otten A.D., McKnight G.S. Over expression of the type II regulatory subunit of the cAMP-dependent protein kinase eliminates the type I holoenzyme in mouse cells. J. Biol. Chem., 1989, v. 264, No 34, pp. 20255-20260.
78. Peters K.A., Démaillé J.G., Fischer E.H. Adenosine 3',5'-monophosphate-dependentprotein kinase from bovine heart. Characterization of the catalytic subunit. Biochemistry, 1977, v. 16, pp. 5691-5697.
79. Piroli G., Pignataro O., De Nicola A.F. Increased activity of type I regulatory subunit of cyclic adenosine 3',5'-monophosphate-dependent protein kinase in estrogen-indused pituitary tumor. J. Natn. Cancer Inst., 1992, v. 84, No 20, pp. 1565-1571.
80. Potter R.L., Stafford P.H., Taylor S.S. Regulatory subunit of cyclic AMP-dependent protein kinase I from porcine sceletal muscle: purification and proteolisis. Arch. Biochem. Biophys., 1978, v. 190, pp. 174-180.
81. Potter R.L., Taylor S.S. Correlation of the cAMP-binding domen with a site of autophosphorylation on the regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinase II from porcine skeletal muscle. J. Biol. Chem., 1979, v. 254, pp. 2413-2448.
82. AMRangel-Aldao R, Rosen O.M. Effect of cAMP and ATP on the reassociation of phosphorylated and nonphosphorylated subunit of the cAMP -dependent protein kinase from bovine cardiac muscle. J. Biol. Chem., 1977, v. 252, pp. 7140-7145.
83. Rannels S.R., Corbin J.D. Characterization of small cAMP-binding fragments of cAMP-dependentprotein kinases. J. Biol. Chem., 1979, v. 254, pp. 8605-8610.
84. Robinson-Steiner A.M., Corbin J.D. Probable involvment of both intrachain cAMP binding sites in activation of protein kinase. -J. Biol. Chem., 1983, v. 258, pp. 1032-1040.
85. Roesler W.T., Vandenbark G.R., Hanson R.W. Cyclic AMP and the induction of eukaryotic gene transcription. J. Biol. Chem, 1988, v. 263, pp. 9063-9066.
86. TMRose KM., Bell L.E., Siefken D.A., Jacob S.T. A heparin-sensitive nuclear protein kinase. -J. Biol.Chem, 1981, v. 256, pp. 7468-7477.
87. Rymoncl M., Hofmann F. Characterization of phosphorylated and dephosphorylated regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinase II. Eur. J. Biochem., 1982, v. 125, pp. 395-400.
88. Sanborn B.M., Korenman S.G. Further studies of the interaction of cyclic adenosine 3',5'~ monophosphate with endometrial protein kinase.- J. Biol. Chem., 1973, v. 248, pp. 47134715.
89. Schwechheimer K., Hofmann F. Properties of the regulatory subunit of cyclic AMP-dependent protein kinase (peak I) from rabbit skeletal muscle prepared by urea treatment of the holoenzyme.- J. Biol. Chem., 1977, v. 252, pp. 7690-7696.
90. Scott J.D. Cyclic nucleotide-dependentprotein kinases. Pharmac. Ther., 1991, v. 50, pp. 123-145.
91. Scott J.D., Carr D.W. Subcellular localization of the type II cAMP-dependent proteinkinase. NIPS, 1992, v. 7, pp. 143-148. 148.Scott J.D., McCartney S. localisation of A-kinase through anchoring proteins. - Mol.
92. Sharoni J. CAMP-independent prottein kinase activity is correlated with growth of rat mammary tumors. Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 1984, v. 20, pp. 277-282.
93. Shizyta Y., Beavo J.A., Bechtel P.J., Hofmann F., Krebs E.G. Reversibility of adenosine 3',5'-monophosphate-dependentprotein kinase reactions. J. Biol. Chem., 1975, v. 250, No 17, pp. 6891-6896.
94. Showers M.O., Mauer R.A. A cloned bovine cDNA encodes an alternate form of the catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase. J. Biol. Chem., 1986, v. 261, pp. 16288-16291.
95. Skarpen E., Thoresen G.H., Tasken K., Samuelsen J.T., Jahnsen T., Schwarze P.E., Huitfeld H.S. Localization of cAMP-dependent signal transducers in early rat liver carcinogenesis. -Hystochem. Cell Biol., 1998, v. 109, No 3, pp. 203-209.
96. Stein J.C., Sarkar D., Rubin C.S. Trypticpeptide mapping studies on the regulatory subunits of type II protein kinases from cerebral cortex and differences in the autophosphorylation and cAMP-binding domains. J. Neurochem., 1984, v. 42, pp. 547-553.
97. Sugden P.H., Holladay L.A., Reimann E.M., Corbin J.D. Purification and characterization of the catalytic subunit of adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate-dependent protein kinase from bovine liver. Biochem. J., 1976, v. 159, pp. 409-422.
98. Takio K., Walsh K.A., Neurath H., Smith S.B., Krebs E.G., Titani K. The amino acid sequence of a human region in the regulatory subunit of bovine cardiac muscle cyclic AMP-dependentprotein kinase II. FEBS Lett., 1980, v. 114, pp. 83-88.
99. Takio K., Smith S.B., Krebs E.G., Walsh K.A., Titani K. Primary structure of the regulatory subunit of type II cAMP-dependent protein kinase from bovine cardiac muscle. Proc. Natn. Acad. Sci. USA., 1982, v. 79, pp. 2544-2548.
100. Theurkauf W.E., Vallee R.B. Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associatedprotein 2. J. Biol. Chem., 1982, v. 257, pp. 32843290.
101. Tibbs V.C., Gray P C., Catterall W.A., Murphy B.J. AKAP15 anchors cAMP-dependent protein kinase to brain sodium channels. J. Biol. Chem., 1998, v. 273, No 40, pp. 2578325788.
102. Titani K., Sasagava T., Ericsson L.H., Kumar S., Smith S.B., Krebs E.G., Walsh K.A. Protein sequence of the rabbit type I regulatory subunit of the cAMP-dependent kinase. -Biochemistry, 1984, v. 23, pp. 4193-4199.
103. Tournier S., Raynaud F., Gerbaud P., Lohmann S.M., Doree M., Evain-Brion D.E. Association of type II cAMP-dependent protein kinase with p34cdc2 protein kinase in human fibroblasts. J. Biol. Chem., 1991, v. 266, No 28, pp. 19018-19022.
104. Uhler M.D., Chrivia J.C., McKnight G.S. Evidence for a second isoform of the catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase. J. Biol. Chem., 19866, v. 261, pp. 1536015363.
105. Vintermyr O.K., Dao K.K., Doskeland S.O. Restricted efflux of the type II isoform of cyclic AMP-dependent protein kinase in permeabilized rat hepatocytes. Biochem. Soc. Trans., 1991, v. 19, No 4, pp. 1161-1162.
106. Walsh D.A., Perkins J.P., Krebs E.G. An adenosine 3',5'-monophosphate-dependentprotein kinase from rabbit skeletal muscle. J. Biol. Chem., 1968, v. 243, No 11, pp. 3763-3765.
107. Walsh D.A., Krebs E.G. Protein kinases. In: Enzymes/ Ed. P.D. Boyer, N.Y. Acad. Press., 1973, v.8, pp. 555-581.
108. Weber W., Hilz H. Stoichiometry ofcAMP binding and limited proteolysis of protein kinase regulatory subunits RI andRII. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1979, v. 90, pp. 10131081.
109. Weber W., Schroder H., Hilz H. Quantitation of heterologous protein kinase subunits RI and RII with the aid of type specific antibodies. Biochem. And Biophys. Res. Commun., 1981, v. 99, pp. 475-483.
110. Weber I.T., Takio K., Titani K., Steitz T.A. The cAMP-binding domains of the regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinase and the catabolite gene activator protein are homologous. Proc. Natn. Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, pp. 7679-7683.
111. TMWehner J.M, Sheppard JR., Malkinson A.M. Density-dependent phosphorylation of specific protein in cultured cells. Nature, 1977, v. 266, No 5605, pp. 842-844.
112. Weldon S.L., Mum by M.C., Taylor S.S. The regulatory subunit of neural cAMP-dependent protein kinase II represents a unique gene product. J. Biol. Chem., 1985a, v. 260, No 10, pp. 6440-6448.
113. Yamamoto K.K., Ganzalez G.A., Biggs W.H. Ill, Montminy M.R. Phosphorylation-induced binding and transcriptional efficacy of nuclear factor CREB. Nature, 1988, v. 334, pp. 494-498.
114. Yanagava T., Yuki K., Yoshida H., Bannai S., Ishii T. Phosphorylation of A170 stress protein by casein kinase II like activity in macrophages. - Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, v. 241, No 1, pp. 157-163.
115. Zick S., Taylor S.S. Interchain disulfide binding in the regulatory subunit of cAMP-dependentprotein kinase I. J. Biol. Chem., 1982, v. 257, pp. 2287-2293.
116. Zoller M.J., Kervalage A.R., Taylor S.S. Structural comparison of cAMP-dependent protein kinases I andIIfrom porcine skeletal muscle. J. Biol. Chem., 1979, v. 254, No 7, pp. 24082412.1. БЛАГОДАРНОСТИ
-
Александрова, Наталья Анатольевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 1999
-
ВАК 03.00.04
- Аденилатциклазный сигнальный механизм действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных
- Взаимодействие киназы фосфорилазы скелетных мышц кролика с гликогеном и другими структурными компонентами клетки
- Молекулярное моделирование механизма активации протеинкиназы A Ia
- Мутационный анализ возможных сайтов фосфорилирования транспортного белка вируса табачной мозаики
- Вторичные медиаторы и регуляция конденсации Са2+ в цитоплазме растительной клетки
