Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие киназы фосфорилазы скелетных мышц кролика с гликогеном и другими структурными компонентами клетки

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие киназы фосфорилазы скелетных мышц кролика с гликогеном и другими структурными компонентами клетки"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 577.151:577.152.27 Земскова Марина Альбертовна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КЙНАЗЫ Ф0СФ0Р1ШАЗЫ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ КРОЛИКА С ГЛИКОГЕНОМ И ДРУГИМИ СТРУКТУРНЫМИ КОМПОНЕНТАМИ КЛЕТКИ 03. 00. 04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ . на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1391

Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета Московского государственного университета . имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель: академик С.Е.Северин Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук

ведущий научный сотрудник Н.Б.Ливанова

- доктор биологических наук ведущий научный сотрудник В.И.Муронец

Ведущая организация - Институт биологической и медицинской химии АМН СССР

»/Л ^92 г. в /Л

Защита состоится " ' У " у**ву'1*"? 1992 г. в '_чау мин

на заседании специализированного совета Д.053.05.32 по присуждению ученой степени кандидата наук в Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: г..Москва, 119899, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ

Автореферат разослан "/Х " г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук г^уус^ссм^ /ю.Н.Лейкин/

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Фосфорилирование белков является одним из важнейших механизмов регуляции различных клеточных функций. Киназа фосфорилазы (АТРгфосфорилаза Ь трансфераза КФ 2.7.1.38), катализирующая фосфорилированиэ фосфорилазы Ь, превращая её в активную форму - фосфорилазу а, играет первостепенную роль в регуляции гликогенолиза при сокращении мышц. Активность киназы фосфорилазы находится под контролем нервной и гуморальной систем (Cohen Р., 1988; Pickeff-Gless-'0., Walsh D.t 1986). Молекула киназы фосфорилазы построена из 4-х типов субъединиц, образующих комплекс (aß7Ö)4 с молекулярной массой 1,3 х 10^Да. IIa 7-субъединице расположен каталитический центр, остальные субьединицы участвуют в регулировании активности фермента. Одной из задач, • связанных с изучением .. функционирования киназы фосфорилазы, является выявление механизмов, осуществлявших координацию скорости сокращения мышц и гликогенолиза. В этой связи наряду с известными способами активации фермента (Malencik D., Fischer, 1983) особое внимание заслуживает вопрос о компартментализации киназы фосфорилазы. В настоящее время известно, что активность киназы фосфорилазы обнаруживается в гликогеновых частицах (Meyer- et al, 1970), находящихся в непосредственной близости от саркоплазматического ретикулума (СПР) и тонких филаментов (Arnold, Pefte, 1969). Это. позволяет предположить возможность взаимодействия фермента как с гликогеном, так и с другими структурными компонентами клетки. Полученные к

1

настоящему времени данные о роли гликогена для регуляции активности киназы фосфорилазы недостаточны. Более того, до сих пор. неизвестна субъединичная природа взаимодействия фермента с полисахаридом. Существует мнение, что активация киназы фосфорилазы тропонином С может иметь функциональное' значение в том случае, если она сопровождается связыванием фермента с миофиламентами. Однако такого рода сведения в литературе отсутствуют. Что касается взаимодействия киназы фосфорилазы с СИР, то указания на киназную активность во фракции СПР (ЕгЛтап М.Ь. е! а1, 1980) не разрешают вопроса о том, какое это имеет значение для функционирования фермента.

Цель работы. Целью исследования' было изучение взаимодействия киназы фосфорилазы из скелетных мышц кролика со структурными компонентами мышечной клетки (гликогеном, СПР, белками тонких филаментов) и выяснение их роли в регулировании активности Фермента. Наше внимание было уделено решению следующих задач.

1) Изучить возможность образования комплексов киназы с гликогеном, СПР и сократительными филаментами. Выявить условия взаимодействий фермента со структурными компонентами-мышечной клетки.

2) Провести анализ влияния этих взаимодействий на функционирование фермента.

3) Исследовать участие субъединиц киназы во взаимодействии со структурными' компонентами мышечной клетки, используя различные методические подхода.

4) Выяснить роль киназы для фосфорилирования белков СПР и белков мышечных филаментов.

о С.

Научная новизна и практическая значимость работы. Методом гель-фильтрации на Сефарозе CL-4B были исследованы условия образования комплекса киназы фосфорилазы с гликогеном. Показано, что для образования комплекса необходимо наличие ионов Са2+и Mg2"1". В результате образования комплекса киназа-гликоген происходит активация фермента, которая связана с увеличением сродства к белковому субстрату - фосфорилазе Ъ. Использование иммобилизации киназы на CNBr-активированном гликогене и бифункциональных реагентов - глутарового альдегида и 1,5-дифтор-2,4-динитробензола - позволило впервые установить, что во взаимодействии с гликогеном участвует 7-субъединица фермента. Установлено, что гликоген является посредником в связывании киназы фосфорилазы с СПР. Для -образования комплекса киназа-гликоген-СПР необходимо также наличие ионов Са2+ и Mg2+. .Полученные в нашей .работе данные показывают, что киназа фосфорилазы не катализирует фосфорилирование белков СПР. Установлено, что во взаимодействии киназы с тонкими филаментами существенное значение имеют компоненты тропонгаювого комплекса. Наибольшее количество киназы связывается • с полным реконструированным комплексом: Р-актин-тропомиозин-тропонин. Изучение фосфорилирования белков тонких филаментов киназой фосфорилазы указывает на участие киназы в фосфорилировании не только связанной с этими белками фосфорилазы Ь, тропонина Т и I, но и ряда белков с молекулярными массами' 114-, 70, 51-58 кДа, природа которых остается неясной. Результаты, полученные в работе, позволяют Еысказать предположение, что in vivo кгашза распределяется мезду гликогеновыми гранулами, СПР и тс аспми

филаментами. Такое распределение может быть обусловлено функциональным состоянием клетки, вследствие чего происходит пространственное -сближение со структурами, от которых зависит активность фермента и функция которых в свою очередь зависит от данного фермента.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, на Всесоюзных конференциях по биохимии мышц (Тбилиси, 1985, 1989), на 14 Международном симпозиуме ilo биохимии (Прага, 1988), 10 Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР - ГДР (Ташкент,1989).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов . исследования, изложения результатов и их обсуждение, выводов и- списка цитируемой литературы. Работа содержит S^/'страниц машинописного текста/ таблиц VL '&f рисунков. Список литературы включает «б^йсточкика.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. 'Материалы и методы исследования. Киназу фосфорилазы и ФосФорилазу b выделяли из скелетных мышц кролика по ранее описанным методам (Collen P., 1973; Fischer E.H., Krebs E.G., 1958). Определение активности киназы фосфорилазы проводили по измерению активности образовавшейся в процессе •ферментативной реакции фосфорилазы а, а также измерением включения

по

Р в молекулу фосфорилазы. Определение активности фосфорилазы а

основано на образовании в процессе реакции синтеза гликогена неорганического фосфата, который определяли по методу Самнера (Sumner, 1944). Активность киназы выражали в мкмолях фосфорилази а (мономера), образующихся за 1 мин на мг киназы. За единицу активности фосфорилази а принимали количество фермента, образующего 1 мкмоль Р^/мин в условиях опыта.

Визикулы СПР получали из скелетных мышц кролика, комбинируя два ранее описанных метода (Болдырев и др., 1983, De Meis L., Haaselbach ff., 1971).

.Актин выделяли из ацетонового порошка (Spudlch J.A., Waif S., 1971), который получали из скелетных мышц кролика ранее описанным методом■ (Feues G., 1948).

Тропомиозин. тропонин и его компоненты были любезно предоставлены Н.Б. Гусевым.

Гликоген получали из гачэни кролика экстракцией трихлоруксусной кислотой (Мешкова Н.П., СеЕерин С.Е., 1950).

Действие бифункциональных реагентов . Обработку сшивающими реагентаг>т проводили по методам, описанным ранее: для глутарового альдегида (Han К.К. et al, 1984) и для 1,5-дифтор-2,4-,1]инитро-бензола (Fitzgerald Т., Carlson G., 1984).

Иммобилизация киназы ФэсФорклззы на ГЛЩЗГШЬ. Для получения активированного СНВг-гликогена использовали методику Сотнроудиса и др.(Sotlroudls T. et al, 19Т8). Активированный гликоген диализовали против 50 мМ р-глицерофосфата, рК 6,8 в течение 4-х часов. В тех же условиях диализовали юшазу. После диализа растворы СНВг-гликогана и киназы объединяли и добавляли СаСЬ., до

с и

0,05 мМ и Mg(CH3C00)2 до 10 мМ. Реакционную смесь инкубировали в течение ночи при +4°С. По окончании инкубации смесь диализовали против 50 мМ p-глицерофосфата, 2 мМ ЭДТА, 10% сахарозы, рН 6,8. Для отделения иммобилизованной киназы от несвязавшегося белка использовали последовательно хроматографию на колонках с DEAE-целлюлозой и фенил-сефарозой. В этих условиях ковалентннй комплекс выходил со свободным объемом, а растворимая киназа связывалась с сорбентами. '

Реконструкцию тонких йиламентов проводили полимеризацией G-актина в присутствии избытка тропомиозина, тропонина или его компонентов в среде, содержащей 2 мМ трис, 0,2 мМ АТР, 0,5 мМ lígGlg, 120 мМ КС1, рН 7,0. G-актин : тропомиозин : тропонин, смешивали в молярном соотношении,- равном 5,5 : 1 : 1, и инкубировали 45 мин при комнатной температуре. Реконструированные филамонты отделяли центрифугированием (100 ООО g, 60 мин) 25°С) и ресуспендировали в буфере, в котором исследовали связывание киназы с филаментами..

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Взаимодействие киназы фосфорилазы с гликогеном.

Киназа фосфорилазы, как и ряд других ферментов обмена гликогена, была обнаружена, в составе белок-гликогеновых гранул (Meyer F. et al, 1970). Однако в отличие от фосфорилазы и гликогенсинтазы, для которых гликоген является субстратом, она имеет более низкое сродство к полисахариду. (Satoh К., 1980) и в определенных условиях способна переходить в растворимое состояние.

Выяснение • условий, в которых происходит взаимодействие киназы с полисахаридом, способствовало бы дальнейшему развитию представлений о функционировании фермента в клетке.

Взаимодействие киназы фосфорилазы с гликогеном исследовали методом гель-фильтрации на сефарозе СЬ-4В. Установили, что в связывании участвуют ионы двухвалентных металлов Са2+ и Кь . Результаты этих экспериментов представлены на рис.1. В первой серии опытов элюцию проводили 50 мМ. р-глицерофосфатом, рН 6,8, содержащим 2 мМ ЭДТА. В этих условиях киназа и гликоген выходят двумя разными пиками (рис.1 А, пики II и I, соответственно). Во второй серии опытов добавление 0,1 мМСа2+ и 10 мМ Мд24' 'в буфер приводит ' к образованию комплекса гликоген-киназа, о чем свидетельствует профиль элюции на рис.1 Б. Чтобы исключить действие высокой концентрации ионов Са на агрегацию киназы, поставили контрольный зксперимент, в котором в отличие от двух предыдущих проводили элюцию киназы в отсутствие гликогена, тогда как элюирующий буфер содержал оба катиона - Са2+ и ■(рис.1В). Сравнивая профили элюции, показанные на рис.1 А и 1В, видно, что в отсутствие'гликогена фермент элюируется в таком же объеме, как и несвязанная с гликогеном киназа. Таким образом, подтверждается положение о том, что для образования комплекса между киназой и

р , о ,

гликогеном необходимо присутствие ионов Са и М.

Связывание киназы с гликогеном сопровождается стимулировали™ активности фермента в 2-4 раза- при рН 6,8 и 8,2, при эт<.м отношение активностей при рН 6,8 и 8,2 не изменяете.' . К характеристике действия гликогена следует отметить повышение

Рис.1. Взаимодействие киназы фосфорилазы с гликогеном.

-в-профиль элюции по белку, —|-профиль элюции

по гликогену, —«—*— профиль элюции по активности киназы. Условия элюции: А - 50 мМ ß-глицерофосфат, pH 6,8, 2 мМ ЭДТА, гликоген - 20 мг; Б - 50 мМ ß-глицерофосфат, pH 6,8, 10 мМ Mg2"1", 0,1 мМ Ca2f, гликоген - 20 мг; В - 50 мМ ß-глицерофосфат, pH 6,8, 10 мМ Mg2"1", 0,1 мМ Са2+. На колонку (2,5x80 см) наносили 1 мг киназы. Концентрацию белка измеряли по методу Брэдфорд , гликогена - с Kl+Ig.

сродства киназы к' белковому субстрату - фосфорилазе Ъ, а также к свободному Mg24". Ранее считали активацию киназной реакции гликогеном результатом влияния полисахарида на субстрат киназы -фосфорвдазу ъ, для которой гликоген служит субстратом, и .активатором (Tabatabai L.B., Graves D.J., 1978). С другой стороны, полученный в результате протеолиза активный фрагмент киназы лишен способности активироваться гликогеном (Severin S.E. et al, 198!). Ряд экспериментов, .проведенных нами, позволил сделать заключение о непосредственном влиянии гликогена на киназу. Так, например, оказалось, что активация киназы гликогеном лучше выявляется после предварительной инкубации. Можно отметить также, что в присутствии гликогена не происходит потери активности фермента при разведении. Вместе с тем, фермент полностью лишается регуляторного воздействия гликогеном после ограниченного протеолиза. По-видимому, активация гликогеном сопровождается какой-то структурной перестройкой фермента, которая невозможна для частично протеолизировашгЛ молекулы.

- В этой связи особый интерес представляет изучение jxww

9

субъединиц киназы во взаимодействии с гликогеном. Поскольку . наиболее чувствительной к протеолизу является а-субъедишща, можно было предположить, что именно она и участвует в' ассоциации с гликогеном. Тем более,что сгуб-комплекс активируется гликогеном, а 76-комплекс не активируется (Chan K.F.J.', Gravea D.J., 1982). Мы использовали метод иммобилизации киназы на CNBr-активированном гликогене для выяснения вопроса, какая из . субъединиц взаимодействует с гликогеном. Результаты кинетического анализа растворимого и иммобилизованного фермента приведены в табл.1, из которой видно, что по сродству к фосфорилазе b и ионам растворимая киназа в присутствии гликогена и ковалентно связанная с гликогеном не различаются. •

Таблица 1. Кинетические свойства растворимой и •: иммобилизованной на GNBr-гликогвнв киназы фосфорилазы

Форш фермента Kjjj для фосфори- Kfl для Ка для Са2+,

лазы Ь, мкМ мМ М

Растворимая 333 15,3 •

киназа 2,5 10 1 .

Растворимая ки- 148

наза+гликоген 3,0

Связанная с . •

CNBr-гликоге- 132 ; -3,0- 1,6 10

ном киназа '■'..■■' -v

Чтобы выявить, какие субъединицы (или субъединица), ковалентно связаны с гликогеном, проводили электрофорез в присутствии Ш-Ш. •Предварительно препарат связанной с. гликогеном ...киназы сконцентрировали центрифугированием (2 ч, 100 ООО £). В качестве

контрольной пробы использовали аналогично обработанную свободную киназу. Так как ковалентно связанные субъединицы не могут войти в гель из-за большой молекулярной массы полисахарида, то мы ожидали увидеть полосы, соответствующие только свободным от гликогена субъединицам. Денситограммы гелей, представленные на рис.2, демонстрируют результаты электрофоретического анализа, показавшего отчетливое различие субъединичного состава свободной и ковалентно связанной' киназы. В последнем случае в значительно меньшем количестве обнаруживается 7-субъединица, а в некоторых опытах она полностью отсутствует.

Рис.2. Денситограммы гелей, полученные после ББ-Ш-электрофореза растворимой (А) и иммобилизованной на гликогене (Б) киназы фосфорилазы. Для растворимой Киназы соотношение субъединиц а:р.-7

- 0,7:1:0,9, для иммобилизованной - а : р : 7

- 0,9:1:0,5.

Из данных результатов мы сделали вывод, что 7-субъединица является тем компонентом, через который -киназа непосредственно взаимодействует с гликогеном. Этот вывод был подтвержден с помощью сшивающих реагентов: глу'тарового. альдегида и

1,5-дифтор-2,4-динитробензола. Сшивание субъединиц киназы

проводили в присутствии или в отсутствие гликогена. В различные промежутки времени из реакционной, среды отбирали аликвоты для. электрофоретического анализа и определения активности. Присутствие гликогена не оказывает защитного действия от ингибирования ферментативной активности сшивающими реагентами. Электрофорез

Рис.3. Защитный эффект гликогена от действия 1,5-дафтор-2,4-динитробензола в зависимости от времени преинкубации фермента с реагентом. А - без гликогена, Б - в присутствии гликогена (12 мг/'мл). Графики построенн по результатам электрофореза в' присутствии ОБ-Иа. За 100% принята площадь пика каждой субгеднницц а,р,7 до обработки киназы реагентом.

проводили в присутствии Ш-Ыа. Количественный анализ денситограмм гелей позволил построить графики, показывающие исчезновение каждой субъединицы в зависимости от времени реакции (рис.3) и установить, что действие этих двух реагентов .весьма сходно. В присутствии гликогена исчезновение 7-субъединицы заметно уменьшается, тогда как на исчезновение а- и р-субъединиц присутствие гликогена не влияет. По мере уменьшения а- и р-субъединиц появляется полоса с молекулярной массой 270-280 кДа, что соответствует суммарной молекулярной массе этих субъединиц. Таким образом, ми впервые показали участие каталитической 7-субъединицы во взаимодействии с гликогеном.

Роль гликогена в связывании киназы с СПР.

Белок-гликогеновые частицы ассоциированы с визикулами СПР. В некоторых случаях активность, киназы обнаруживают во фракции СПР, а не только в составе гликогеновых гранул. Неизвестно, однако, в каких условиях происходит связывание киназы с визикулами СПР, неясно также, способна ли киназа фосфорилазы фосфорилировать белковые компоненты СПР.

С помощью метода гель-хроматографии мы установили, что обязательным компонентом при взаимодействии киназы и СПР является гликоген. В отсутствие гликогена связывания не происходит. Креме того, существенное значение имеют ионы металлов Са2+ и Результаты опытов, представленных на рис.4, демонстрируют влияние Са2+' и Мд2+ на адсорбцию киназы на визикулах СПР. Получешше •данные свидетельствуют о том, что для образования тройного

Рис.4. Гельхроматография киназы фосфэрилазы (1 мг) и. СПР (10 мг) в присутствии гликогена (20 мг/мл). А - буфер для элюции содержит 20 мМ гистидня, 0,5 мМ ЭГТА, 0,53 мМ Са2+, рН 7,0, Б - то ' же. плюс Ь Ш . Скорость элюции 7,2 мл/час, объем фракции - 1,8 мл.

~о—в— - белокмкг/мл, -о-'- гликоген, А460,о-о- -

нк7ийн-зс.-ь Д'ГРазы, ед'мл, —й-1--активность киназы, ед/мл.

комплекса гликоген-киназа-СПР недостаточно присутствие только Са^ Из рис.4А видно, что белок в. пике I содержит АТР-азную активность, присутствующую в СПР, и немного гликогена. Основное количество гликогена выходит из колонки в комплексе с киназой (рис.4А, пик II). Когда в буфер для уравновешивания колонки и. элюирования добавляли 30 мкМ Са2+ и 5 мМ то большая часть

киназы из комплекса с. гликогеном переходит в комплекс с СПР (рис.4Б, пик1}. На этом же рисунке видно, что в объеме элюции, соответствующем выходу гликогена, количество киназы значительно снижается (рис.4Б, пик И). Киназа, по-видимому, в этих условиях "связывается с визикулами СПР. Однако взаимодействие киназы с СПР опосредуется через гликоген. Таким образом,' роль гликогена заключается не только в связывании ряда белков, в том числе и киназы фосфорилазы, но и . в образовании связи с СПР, что, по-видимому, необходимо для комйартментализвции основных процессов, происходящие в мышечной клетке. ; _

Полученный нами факт связывания киназы через гликоген с СПР дает основание предположить участие киназы в фосфоршшрованш не только фосфорилазы Ь, но и белков СПР. Были поставлены опыты, в которых в качестве субстратов использовали [7~3?Р]-АТР и препарат СПР. Нам не удалось выявить дополнительное включение радиоактивной метки в препарат СПР. На основании. этих данных можно заключить, что связывание киназы с СПР не сопрововдается фосфорилированиэм каких-либо его белковых компонентов, но имеет, по-видалому, ■существенное значение для активации ионами Са2+, в отсутствие 'Которых киназа вообще неактивна.

Взаимодействие киназы фосфорилазы с миофиламентами.

Для изучения связывания киназы с тонкими филаментами получали Г-актин. Последовательно реконструируя тонкий филамент посредством добавления к Р-актину регуляторных белков, выясняли роль троиомиозина и компонентов тропонина в ассоциации с киназой. После инкубации филамента с ферментом проводили ультрацентрифугирование (20 мин, 90 ООО g). В этих условиях актиновые филаменты полностью оседают, а количество связавшейся киназы определяли по ее убыли в супернатанте. Поскольку на один полувиток спирали Р-актина, состоящей из 7 мономеров Б-актина, приходится 1 моль троггомиозина и 1 моль тропонина, то все результаты приведены в пересчете на 7 молей С-актина.

Рис.5. Связывание я

X

киназы фосфорила-зи с Р-актином в присутствии 0,5 мМ ЭГТЛ (1), 30 мкМ Са2+ (2) и 1 мМ ЛТР, 0,5 мМ ЭГТА (31.

Концентрация актина - 225 мкг/ мл, концентрация КИ.Ч.-'ЭЫ - 0,1 -1,8 мкМ.

.ео.75

ай50

£025-

п сс а ьз

О.Б ЛЛГ 1.5

[Ш*азаЗс51Ц8Я.м*М

16

На рис.5 представлены результаты связывания киназы с F-актином в присутствии и в отсутствие Са и АТР. Как видно, S-образная зависимость взаимодействия F-актина с киназой от концентрации фермента (рис.5, кривая 1) в присутствии Са2+ или АТР превращается в гиперболическую (кривые 2 и 3). Под влиянием Сав 6 раз повышается сродство киназы к F-актину, АТР увеличивает максимальное связывание (табл.2).

Таблица 2. Характеристика связывания киназы фосфорилазы с F-актином

Состав пробы В макс 9 ) Sq мкМ

0,5 мМ ЭГТА 0,32 0,46

0,53 мМ Са2+ + 0,5 мМ ЭГТА 0,22 0,09

1 мМ АТР + 0,5 ММ ЭГТА . 0,88 0,55

1) Вмакс расчитывали как молярное ■ отношение связанной при насыщающей концентрации киназы фосфорилазы на 7 молей О-актина. Молекулярную массу киназы принимали равной 1300 кДа.

2) Б0 £ рассчитывали в координатах Хилла.

Учитывая полученные данные, все последующие опыты проводили с добавлением 30 мкМ Са в реакционную смесь.

Рис.6 демонстрирует эффективность связывания киназы и различных комплексов Р-актина с регуляторными белками. Адсорбция киназы на комплексе ' Р-актин-тропомиозин имеет хорошо выраженную кооперативность (кривая 2). Характер взаимодействия фермента с сократительными белками обусловлен, по-видимому, .структурными

17

особенностями киназы. Возможно, существенное значение имеет наличие на 7-субъединице участков, гомологичных участкам тропонина I, ответственных за связывание с Р-актином (Раис1е1 Н.К., Саг1зоп О.М., 1990). При добавлении к комплексу Р-актин-тропомиозин тропонина Т кривая насыщения становится гиперболической, и уменьшается количество связанной киназы (рис.6, кривая 3). Из этих

Рис.6. Связывание киназы фосфорилазы с тонкими филаментами в зависимости от кон-пентрации фермента: 1 - с Р-актином, 2 -Р- ¡жтин-тропомиозином 3 - актин-тропомио-^шт-трогюнином Т, 4 -Г -лстгл-тропомиозин-тропоклном Т+1, 5 -Р-актин-тропомиозин-ТроИОНИНОМ Т+1+С.

О.Ь . 1.0 1.5 ИГ

[КИНАЗ^о6щая,мкМ

данных следует, что тропонин Т конкурирует с киназой за связывание с Р-актин-тропомиозином и вытесняет ее из комплекса, поскольку обладает более высоким сродством к тропомиозину.

. Резко изменяется картина связывания в присутствии комплекса тропонин Т+1. Максимальное связывание и сродство киназы практически такие же, как для полного тропонина (рис.6, кривые 4,5). Так как параметры связывания с комплексом без тропонина 0 и с полным тропонином отличаются весьма незначительно, можно полагать, что 6-субъединица киназы способна заменить сходный по структуре тропонин С, связываясь- с комплексом тропонина Т+1. Однако взаимодействие в присутствии тропонина С, по всей

е

вероятности, происходит иначе. Известно, что внешний калмодулин кли тропонин С, дополнительно активирующие фермент, могут связываться на а- • и , р-субъединицах, в аминокислотной последовательности которых . имеются ■ локусы. . формирующие калмбдулинсвязывающие участки (КШтапп М.УУ. et а1, 1988, СоЬеп Р., 1988). Можно, предположить, что в присутствии тропонинового комплекса киназа взаимодействует через а- или р-субъединицу. Из полученных данных следует, что степень активации киназы под влиянием полного тонкого филамента и отдельных его компонентов должна быть различной. И действительно, из результатов, показанных на рис.7, видно, что наиболее высокую активацию оказывает полный реконструированный фяламент, несколько ниже киназа активируется тропонином. Так как Р-актин и тропомиозин практически не активируют киназу, следовательно, активирующее действие выполняет тропонин (или тропонин С) Если учесть, что доля (по Садку)

тропонина в . комплексе невелика (около 15%), то для полной активации требуется гораздо меньшее количество тропонина, когда он находится в составе комплекса.

Рис.7. Влияние белков, входящих в состав тонкого филамента, на активность киназы фосфорилазы. Активность фермента определяли в присутствии Г-ьктина (1), тропомиозина (2), тропонина (3), комплекса Г-актин-тропомиозин-тропонина (4). А - отношение

активностей киназы в присутствии и в отсутствие сократительных

белков.

го

Таким образом, полученные нами результаты, указывающие на корреляцию между активацией фермента и связыванием его с белками тонких филаментов, служат доказательством в пользу важной роли тропонина (или тропонина С) в функционировании кинази в мышечной клетке.

Чтобы выяснить, какие белки тонких филаментов могут быть субстратами киназы фосфорилазы, мы использовали экстракт, полученный из ацетонового порошка, из которого обычно выделяют белки тонких филаментов. Фосфорилирование проводили в стандартных условиях определения активности фермента. Реакцию останавливали добавлением ББ-Ка и смесь, наносили на пластину полиакриламидного геля для электрофоретического разделения белков. Фосфорилированные белки выявляли методом авторадиографии.

При изучении включения, радиоактивной метки в полученную из ацетонового порошка- фракцию, содержащую тонкие филаменты, мы получили доказательства того, что, помимо фосфорилазы Ь и

тропонинов Т и I, киназа катализирует фосфорилирование еще ряда

- ч?

.белков этой фракции (рис.8). Основное включение Р происходит в

.белки с молекулярными массами 114,8; 94; 51-58; 38 и 22,4 кДа.

Среди этих белков была идентифицирована фосфорилаза Ъ (94 кДа),

тропонины Т (38 кДа) и Г (22,4 кДа). Природа белков с

молекулярными массами 114,8 и 51-58 кДа остается неясной. Можно

.предположить, что бедок с молекулярной массой 114 кДа является

р-субъединицей киназы фосфорилазы. Включение метки могло быть

следствием аутофосфорилирования. В состав белков с молекулярными

Рис.8. Радиоавтография гель после разделения фосфорили-рованных киназой фосфорила-зы белков экстракта, полученного из ацетонового порошка мышц.

А - в отсутствие киназы; В - в присутствии киназы.

«и

-114.8

* ''--Л-

513 -58.9

3а0-40.3

•22.4

массами 51-58 кДа предположительно .входят белки промежуточных филаментов - десмин (50 кДа) и Еиментин- (58 кДа). Известно, что белки промежуточных филаментов подвергаются фосфорилированию под действием сАМР-зависимой протеинкиназы. Относительно фосфорилирования этих белков киназой фосфорилазы никаких сведений в литоратурэ нет.

Таким образом, полученные результаты указывают еще на одну роль киназы (фосфорилазы, заключающуюся в том, что среди структурных белков сократительной ' системы существуют пока Кгизьостные субстраты киназы, фосфорилирование которых может иметь вакчое значение для их Функций.

выводы

1. В образовании комплекса, киназы с гликогеном участвуют ионы Са2+ и Мб2*. В комплексе с гликогеном увеличивается активность киназы и ей сродство к белковому субстрату -.фосфорилазе Ь.

2. Взаимодействие 7-субъединицы с гликогеном доказано с помощью иммобилизации фермента на СИВг-гликогене и действия сшивающих реагентов.

3. Киназа фосфорилазы способна образовывать комплекс с ОПР

?+ С 4.

опосредовано через гликоген в присутствии ионов Са и . В фосфорилировании белковых компонентов СПР киназа фосфорилазы не участвует.

4. Киназа фосфорилазы образует комплекс с Г-актином, Р-актин-тропомиозином и Р-актин-тропомиозин-тропонином. Наиболее высокая стехиометрия связывания наблюдается в присутствии тропошша Т+1 и ■полного тропонинового комплекса Т+1+С.

'5. Максимальная активация киназы фосфорилазы происходит при взаимодействии с полностью реконструированным тонким филаментом.

6. Киназа фосфорилазы фосфорилирует связанную с тонкими .филаментами фосфорилазу Ь, тропонины Т и I, а также ряд белков сократительного аппарата с молекулярными массами' 114 и 51-58 кДа.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Земскова М.А., Шур О.А., Сколышева Л.К., ВульФсон II.Л. Регуляция активности киназы фосфорилазы из скелетных мышц кролика

гликогеном. Биохимия, 1989, т.54, вш.4, с.662-668.

2. Земскова М.А., Шур СЛ., Сколышева Л.К., Вульфсон П.Л. Взаимодействие киназы фосфорилазы с белками тонких филаментов скелетных мышц кролика. Биохимия, 1991, т.56, вып.1, с.100-108.

3. Земскова М.А., Шур С.А., Сколышева Л.К., Вульфсон П.Л. Взаимодействие киназы фосфорилазы со структурными белками скелетных мышц. Тезисы X Объединенного симпозиума биохимических обществ СССР - ГДР, Ташкент, 1989, с.32.

4. Шур С.А., Земскова М.А., Вульфсон П.Л., Сколышева Л.К. Роль субъединиц киназы фосфорилазы во взаимодействии с гликогеном. Биохимия, 1989, т.54, ВЫП.6, с.1026-1033.

5. Шур С.А., Земскова М.А., Сколышева Л.К., Вульфсон П.Л. Роль киназы фосфорилазы в процессе функционирования скелетных мышц. Тезисы симпозиального доклада II Всесоюзной конференции по биохимии мышц. Тбилиси, 1989 г с.10-11. .'

6. Shur S.A.,. Zemskova М.А., Skolyshsya L.K., Vulfson P.L. Interaction of phosphorylase kinase .with glycogen and sarcoplasmic reticulum. Abstracts of Nth International congress of Biochemistry, July 10-15, 1938, Prague, Czechoslovakia, p.136.